Experimentelle Methoden zur Experimentelle Methoden zur Bestimmung von Protein-Protein Bestimmung von Protein-Protein

WechselwirkungenWechselwirkungen

Presented byPresented by

Stefan NickelsStefan Nickels

(stefan-nickels@arcor.de)(stefan-nickels@arcor.de)

Proseminar: Proseminar: Theoretical Analysis of Protein-Protein Interactions Theoretical Analysis of Protein-Protein Interactions SS04SS04

22

ÜbersichtÜbersicht

EinführungEinführung

3 Arten von experimentellen Methoden3 Arten von experimentellen Methoden Physikalische MethodenPhysikalische Methoden Library basierte MethodenLibrary basierte Methoden Genetische MethodenGenetische Methoden

3 ausgewählte experimentelle Methoden3 ausgewählte experimentelle Methoden FRETFRET NMR chemical shiftsNMR chemical shifts NMR-based protein dockingNMR-based protein docking

ReferenzenReferenzen

DiskussionDiskussion

33

Was will man bestimmen?Was will man bestimmen?

Auffinden von Proteinen, welche mit anderen Auffinden von Proteinen, welche mit anderen wechselwirkenwechselwirken durch meist transiente aber auch persistente Bindungdurch meist transiente aber auch persistente Bindung

Bindungskonstante KBindungskonstante Kii

Thermodynamische GleichgewichtsgrößeThermodynamische Gleichgewichtsgröße Gibt an welcher Anteil des Liganden im Mittel an Protein Gibt an welcher Anteil des Liganden im Mittel an Protein

gebundengebunden

Je kleiner KJe kleiner Kii desto stärker Protein-Ligand Bindung desto stärker Protein-Ligand Bindung

Freie Bindungsenthalpie ∆GFreie Bindungsenthalpie ∆G

44

Physikalische Methoden IPhysikalische Methoden I

MethodikMethodik Bestimmung von Wechselwirkungen unter Zuhilfenahme von Bestimmung von Wechselwirkungen unter Zuhilfenahme von

physiko-chemischen Eigenschaften der physiko-chemischen Eigenschaften der WechselwirkungspartnerWechselwirkungspartner

BeispieleBeispiele Protein Affinity ChromatographyProtein Affinity Chromatography Affinity BlottingAffinity Blotting ImunnoprecipitationImunnoprecipitation Cross-LinkingCross-Linking

55

Physikalische Methoden IIPhysikalische Methoden II

AffinitätschromatographieAffinitätschromatographie Um bindende Liganden zu Um bindende Liganden zu

findenfinden Immobilisierung des Proteins Immobilisierung des Proteins

in der Säule auf einer Matrixin der Säule auf einer Matrix z.B. mittels GST z.B. mittels GST

FusionsproteineFusionsproteine Proteine werden mit GluthationProteine werden mit Gluthation

S-Transferase markiertS-Transferase markiert Dieses bindet an Gluthation-Dieses bindet an Gluthation-

Agarose-MatrixAgarose-Matrix

Zugabe des LigandengemischsZugabe des Ligandengemischs Bindende werden Bindende werden

zurückgehalten, nicht zurückgehalten, nicht bindende fließen durchbindende fließen durch

Komplexe können Komplexe können ausgewaschen werdenausgewaschen werden

66

Library basierte Methoden ILibrary basierte Methoden I

MethodikMethodik Suche nach Bindungspartnern für gewisses Protein inSuche nach Bindungspartnern für gewisses Protein in

Gen-Expressions-BibliothekenGen-Expressions-Bibliotheken VorteileVorteile

Schnelles Screening einer große Menge von möglichen LigandenSchnelles Screening einer große Menge von möglichen Liganden Gensequenzen der Bindungspartner sind sofort verfügbarGensequenzen der Bindungspartner sind sofort verfügbar

NachteilNachteil Müssen i.d.R. mit Biochemischen Methoden verifiziert werdenMüssen i.d.R. mit Biochemischen Methoden verifiziert werden

BeispieleBeispiele Protein ProbingProtein Probing Phage DisplayPhage Display Two-Hybrid SytemTwo-Hybrid Sytem

77

Library basierte Methoden IILibrary basierte Methoden II

Two Hybrid SystemTwo Hybrid System Modularer Aufbau von Modularer Aufbau von

TranskriptionsfaktorenTranskriptionsfaktoren DNA-binding domainDNA-binding domain Activation domainActivation domain Nicht kovalente WW hinreichend Nicht kovalente WW hinreichend

für Funktionfür Funktion

Erstellen von sog. HybridenErstellen von sog. Hybriden Protein X + DNA-binding domainProtein X + DNA-binding domain Protein Y + Activation domainProtein Y + Activation domain

Wechselwirkung von X und YWechselwirkung von X und Y Domänen bilden funktionellen Domänen bilden funktionellen

Aktivator für ReportergenAktivator für Reportergen=> Expression=> Expression

Screening von Activator domain Screening von Activator domain markierten Transkripten einermarkierten Transkripten einercDNA-LibrarycDNA-Library

88

Genetische Methoden IGenetische Methoden I

MethodikMethodik Nicht WW zwischen Proteinen werden bestimmtNicht WW zwischen Proteinen werden bestimmt Sondern WW zwischen Genen werden betrachtetSondern WW zwischen Genen werden betrachtet

In vielen Fällen interagieren dann auch die GenprodukteIn vielen Fällen interagieren dann auch die Genprodukte

Oder Suche nach Gen-Gen-WW um Protein-Protein-WWOder Suche nach Gen-Gen-WW um Protein-Protein-WWzu bestätigenzu bestätigen

BeispieleBeispiele Extragenic SuppressorsExtragenic Suppressors Synthetic Lethal EffectsSynthetic Lethal Effects Overproduction PhenotypesOverproduction Phenotypes Unlinked NoncomplementationUnlinked Noncomplementation

99

Genetische Methoden IIGenetische Methoden II

Extragenic SuppressorsExtragenic Suppressors Suppressormutationen gleichen durch natürliche Mutationen Suppressormutationen gleichen durch natürliche Mutationen

hervorgerufene phenotypische Defekte aushervorgerufene phenotypische Defekte aus Beobachtung:Beobachtung:

Suppressormutationen treten bei Genen auf, deren Genprodukte mit Suppressormutationen treten bei Genen auf, deren Genprodukte mit Genprodukten der mutierten Gene wechselwirkenGenprodukten der mutierten Gene wechselwirken

Aufspürung wegen Suppressormutationen interagierenden Aufspürung wegen Suppressormutationen interagierenden GenproduktenGenproduktendurch z.B.:durch z.B.:

Kontrolle der ZellzyklenKontrolle der Zellzyklen

1010

Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) Microscopy IMicroscopy I

ZielsetzungZielsetzung Beobachtung von Protein-Protein WW bei Abständen > 100 ÅBeobachtung von Protein-Protein WW bei Abständen > 100 Å Betrachtung von Proteinen in Zellen in vivoBetrachtung von Proteinen in Zellen in vivo Proteine müssen mit Flurophoren gelabelt werdenProteine müssen mit Flurophoren gelabelt werden

FRETFRET ““molecular ruler” molecular ruler” Bestimmung von Distanzen zwischen MolekülenBestimmung von Distanzen zwischen Molekülen Viele verschiedene FRET-MethodenViele verschiedene FRET-Methoden Hier:Bestimmung der Interaktion von kolokalisierten Proteinen Hier:Bestimmung der Interaktion von kolokalisierten Proteinen

imimlichtmikroskopisch detektierbaren Bereichlichtmikroskopisch detektierbaren Bereich

Detektion Normalerweise spektroskopischDetektion Normalerweise spektroskopisch Hier lichtmikroskopischHier lichtmikroskopisch

1111

Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) Microscopy IIMicroscopy II

FunktionsprinzipFunktionsprinzip Man macht sich den Effekt des Energie Transfers zwischen zwei Man macht sich den Effekt des Energie Transfers zwischen zwei

bestimmten benachbarten Fluorophorpaaren zu nutzenbestimmten benachbarten Fluorophorpaaren zu nutzen Wird ein Fluorophor (Donor) durch Licht bestimmter Wird ein Fluorophor (Donor) durch Licht bestimmter

Wellenlänge angeregt, so fluoresziert erWellenlänge angeregt, so fluoresziert er In gewissem Abstand zu einem sog. Akzeptor-Fluorophor, In gewissem Abstand zu einem sog. Akzeptor-Fluorophor,

überträgt der Donor Energie (Photon) auf diesen Akzeptorüberträgt der Donor Energie (Photon) auf diesen Akzeptor Durch den Transfer Unterbindung der Fluoreszenz-Resonanz Durch den Transfer Unterbindung der Fluoreszenz-Resonanz

des Donors, stattdessen Fluoreszenz des Akzeptors (Quenching)des Donors, stattdessen Fluoreszenz des Akzeptors (Quenching) Mittels Fluoreszenz-Mikroskopischen Aufnahmen kann die Mittels Fluoreszenz-Mikroskopischen Aufnahmen kann die

Löschung der Fluoreszenz-Resonanz des Donors dokumentiert Löschung der Fluoreszenz-Resonanz des Donors dokumentiert werdenwerden

1212

Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) Microscopy IIIMicroscopy III

Die Effizienz dieses Enegie-Transfers ist abhängig von der Die Effizienz dieses Enegie-Transfers ist abhängig von der Distanz r der beiden FluorophoreDistanz r der beiden Fluorophore

RR00 ist der sog. Förster-Radius ist der sog. Förster-Radius spezifisch für jedes Donor-Akzeptor-Paar, i.d.R. zwischen 10 und 70 spezifisch für jedes Donor-Akzeptor-Paar, i.d.R. zwischen 10 und 70 ÅÅ Maß für den Grad der Überlappung von Donoremission und Maß für den Grad der Überlappung von Donoremission und

AkzeptoranregungsspektrumAkzeptoranregungsspektrum kein FRET bei Abständen > 2Rkein FRET bei Abständen > 2R00

Quantifizierung der Transfer-Effizienz über das Ausmaß der Quantifizierung der Transfer-Effizienz über das Ausmaß der Donor-Emissions-LöschungDonor-Emissions-Löschung

IIDADA = Intensität der Donor Fluoreszenz in Anwesenheit des Akzeptors = Intensität der Donor Fluoreszenz in Anwesenheit des Akzeptors IIDA†DA†= Intensität der D. Fluoreszenz in Anwesenheit von = Intensität der D. Fluoreszenz in Anwesenheit von

photogebleichtem A.photogebleichtem A.

1313

Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) Microscopy IVMicroscopy IV

ExperimentExperiment Untersuchung von WW zwischen Proteinen in der PlasmamembranUntersuchung von WW zwischen Proteinen in der Plasmamembran Fluorophor-PaarFluorophor-Paar

Labeling entweder direkt oder mittels Immun-Fluoreszenz-Labeling entweder direkt oder mittels Immun-Fluoreszenz-MarkierungMarkierung

Hier Transfektion von Kaninchen-Nieren-Zellen mit der 5‘-Hier Transfektion von Kaninchen-Nieren-Zellen mit der 5‘-Nucleotidase aus der Leber von RattenNucleotidase aus der Leber von Ratten

Markierung der Nucleotidasen mit einer Mischung aus Cy3 / Cy5 Markierung der Nucleotidasen mit einer Mischung aus Cy3 / Cy5 markiertenmarkiertenIgG-AntiKörpernIgG-AntiKörpern

RR00 = 53 Å = 53 Å Donor Cy3Donor Cy3 Akzeptor Akzeptor Cy5Cy5

AbsorptionsmaximAbsorptionsmaximumum

550 nm550 nm 650 nm650 nm

EmissionsmaximuEmissionsmaximumm

570 nm570 nm 670 nm670 nm

1414

Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) Microscopy VMicroscopy V

Aufnahme von 4 BildernAufnahme von 4 Bildern Cy3-Emission vor dem BleichenCy3-Emission vor dem Bleichen

Auftreten des FRETAuftreten des FRET Wenig Donor FluoreszenzWenig Donor Fluoreszenz

Cy5-Emission vor dem BleichenCy5-Emission vor dem Bleichen Zur Überprüfung, ob Kolokalisierung Zur Überprüfung, ob Kolokalisierung

mit Cy3 stattgefunden hatmit Cy3 stattgefunden hat

Cy3-Emission nach dem BleichenCy3-Emission nach dem Bleichen Kein FRET mehrKein FRET mehr Donor Fluoreszenz ist stärker (Pfeile)Donor Fluoreszenz ist stärker (Pfeile)

Cy5-Emission nach dem BleichenCy5-Emission nach dem Bleichen Keine Emission wegen vollständiger Keine Emission wegen vollständiger

AusbleichungAusbleichung

DatenanalyseDatenanalyse Nach Hintergrund-Korrektur mittels Aufnahme von unmarkierten Zellen:Nach Hintergrund-Korrektur mittels Aufnahme von unmarkierten Zellen:

Berechnung eines Transfer-Effizienz-BildesBerechnung eines Transfer-Effizienz-Bildes

a= Scaling Factor für die Umrechnung der Pixelwerte in Effizienzwertea= Scaling Factor für die Umrechnung der Pixelwerte in Effizienzwerte

1515

Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) Microscopy VIMicroscopy VI

AuswertungAuswertung Im Beispiel Effizienz-Werte zwischen Im Beispiel Effizienz-Werte zwischen

0 und 40%0 und 40% lassen hier nicht auf spezifische WW lassen hier nicht auf spezifische WW

zwischen den Nucleotidasen zwischen den Nucleotidasen schliessenschliessen

Effizienz hängt ab von der Effizienz hängt ab von der Oberflächendichte der Proteine in Oberflächendichte der Proteine in der Membran (Zufällige Nähe)der Membran (Zufällige Nähe)

FazitFazit Transfer Effizienz reflektiert nicht Transfer Effizienz reflektiert nicht

unbedingt eine spezifische WWunbedingt eine spezifische WW E abhängig von vielen Parametern:E abhängig von vielen Parametern:

Größe des gelabelten ProteinsGröße des gelabelten Proteins Sättigung des Antigens mit Sättigung des Antigens mit

AntikörperAntikörper Orientierung der FluorophoreOrientierung der Fluorophore

Durch systematische Veränderung von experimentellen Parametern können spezifische WW unterschieden Durch systematische Veränderung von experimentellen Parametern können spezifische WW unterschieden werdenwerden

Verhältnis von Donor- zu Akzeptor-MarkierungVerhältnis von Donor- zu Akzeptor-Markierung Gesamtkonzentration von markierten Molekülen Gesamtkonzentration von markierten Molekülen

1616

NMR chemical shift mapping INMR chemical shift mapping I

ZielsetzungZielsetzung Bestimmung von Wechselwirkungen und Interaktionsstellen zwischen Bestimmung von Wechselwirkungen und Interaktionsstellen zwischen

Proteinen mittels zweidimensionaler (Proteinen mittels zweidimensionaler (11H, H, 1515N)-HSQC-NMR-N)-HSQC-NMR-SpektroskopieSpektroskopie

Grundlagen der H-NMR SpektroskopieGrundlagen der H-NMR Spektroskopie Im Magnetfeld: Parallele Ausrichtung von ProtonenkernenIm Magnetfeld: Parallele Ausrichtung von Protonenkernen Erhöhung der Feldstärke => Umorientierung der Kerne, antiparallel Erhöhung der Feldstärke => Umorientierung der Kerne, antiparallel

zum Magnetfeldzum Magnetfeld Hierbei Resonanzphänomen: Absorption von EnergieHierbei Resonanzphänomen: Absorption von Energie

=> NMR-Signal=> NMR-Signal Identifizierung aller Protonen in einem MolekülIdentifizierung aller Protonen in einem Molekül

oder ein Komplex aus Molekülenoder ein Komplex aus Molekülen

1717

NMR chemical shift mapping IINMR chemical shift mapping II

Die chemische VerschiebungDie chemische Verschiebung AbschirmungAbschirmung

Elektronen um den Kern erzeugen Magnetfeld, entgegengesetzt zum äußern Elektronen um den Kern erzeugen Magnetfeld, entgegengesetzt zum äußern Magnetfeld => AbschirmungseffektMagnetfeld => Abschirmungseffekt

Höhere Magnetfeldstärke benötigt um Abschirmung zu umgehenHöhere Magnetfeldstärke benötigt um Abschirmung zu umgehen Signal im niedrigeren Frequenzbereich => diamagnetischSignal im niedrigeren Frequenzbereich => diamagnetisch

EntschirmungEntschirmung z.B. durch elektronegative Bindungspartner (Halogene, O, N)z.B. durch elektronegative Bindungspartner (Halogene, O, N)

diese ziehen die Elektronen zu sichdiese ziehen die Elektronen zu sich Niedrigere Feldstärke benötigtNiedrigere Feldstärke benötigt Signal im höheren Frequenzbereich => paramagnetischSignal im höheren Frequenzbereich => paramagnetisch

Signalverschiebung relativ zu Referenzsignal TMS (Tetramethylsilan)Signalverschiebung relativ zu Referenzsignal TMS (Tetramethylsilan) Alle Protonen in TMS gleiche chem. UmgebungAlle Protonen in TMS gleiche chem. Umgebung

=> nur ein Signal=> nur ein Signal Alle Protonen maximal abgeschirmtAlle Protonen maximal abgeschirmt

1818

NMR chemical shift mapping IIINMR chemical shift mapping III

Die J-KopplungDie J-Kopplung Spin-Spin KopplungSpin-Spin Kopplung

Benachbarte Protonen beeinflussen sich gegenseitig bzgl. lokaler Benachbarte Protonen beeinflussen sich gegenseitig bzgl. lokaler MagnetfeldstärkeMagnetfeldstärke

Je nach Spinrichtung eines benachbarten Protons, Je nach Spinrichtung eines benachbarten Protons, ↑ oder ↓=> Schwächung oder Verstärkung des äußeren Magnetfelds=> Schwächung oder Verstärkung des äußeren Magnetfelds

Da beide Zustände gleichwahrscheinlichDa beide Zustände gleichwahrscheinlich=> Aufspaltung des Signals in Multipletts=> Aufspaltung des Signals in Multipletts

1 benachbartes Proton => 2 Signale1 benachbartes Proton => 2 Signale2 benachbarte Protonen => 3 Signale mit unterschiedlichen Intensitäten2 benachbarte Protonen => 3 Signale mit unterschiedlichen Intensitätenusw.usw.

Kopplungskonstante JKopplungskonstante J Abstand zwischen gekoppelten Signalen in Hz: Kopplungskonstante JAbstand zwischen gekoppelten Signalen in Hz: Kopplungskonstante J Je nach Wert: AbschätzungJe nach Wert: Abschätzung

wie viele Bindungenwie viele Bindungenvoneinander entferntvoneinander entfernt

2 Bindungen, geminal, 2 Bindungen, geminal, 22JJ 3 Bindungen, vicinal, 3 Bindungen, vicinal, 33JJ

1919

NMR chemical shift mapping IVNMR chemical shift mapping IV

((11H, H, 1515N)-HSQC-NMR-SpektroskopieN)-HSQC-NMR-Spektroskopie HSQC = Heteronuclear single quantum coherenceHSQC = Heteronuclear single quantum coherence 2D-NMR2D-NMR

x-Achse: Verschiebung von Hx-Achse: Verschiebung von H y-Achse: Verschiebung von Ny-Achse: Verschiebung von N

Heteronuclear Single quantum:Heteronuclear Single quantum: Bestimmung der Bestimmung der 11J Kopplung zwischen H und NJ Kopplung zwischen H und N

=> direkt verbundene Atome=> direkt verbundene Atome Kreuzpunkte: Kopplung von H und NKreuzpunkte: Kopplung von H und N

Untersuchung von ProteinenUntersuchung von Proteinen Jede Aminosäure außer Prolin:Jede Aminosäure außer Prolin:

Kopplungssignal der AmidgruppeKopplungssignal der Amidgruppe Ebenso AS-Ketten wegen PeptidbindungEbenso AS-Ketten wegen Peptidbindung

WW zwischen ProteinenWW zwischen Proteinen Bindung von Ligand an Bindung von Ligand an 1515N markiertes ProteinN markiertes Protein

=> Änderung der chem. Verschiebungen=> Änderung der chem. Verschiebungen Möglichkeit der Identifizierung der ww. AS beiMöglichkeit der Identifizierung der ww. AS bei

zugewiesenem Spektrumzugewiesenem Spektrum

2020

NMR chemical shift mapping VINMR chemical shift mapping VI

ExperimentExperiment Bacterial phosphoenolpyruvate sugar transport system (PTS)Bacterial phosphoenolpyruvate sugar transport system (PTS)

Teilreaktion:Teilreaktion: Übertragung von PhosphorÜbertragung von Phosphor

Bekannt: Spezifisch für verschiedene SpeziesBekannt: Spezifisch für verschiedene Spezies Betrachtung von B. subtilis und E. coliBetrachtung von B. subtilis und E. coli

große Ähnlichkeit in 3D Strukturgroße Ähnlichkeit in 3D Struktur Homologe WW Homologe WW stark:stark: bsHPR + bsEIIAbsHPR + bsEIIAglcglc ecHPR + ecEIIAecHPR + ecEIIAglcglc

Heterologe WW Heterologe WW stark:stark: ecHPR + bsEIIAecHPR + bsEIIAglcglc

schwach: schwach: bsHPR + ecEIIAbsHPR + ecEIIAglcglc

Fragestellung:Fragestellung: Kann „NMR chemical shift mapping“Kann „NMR chemical shift mapping“

Spezifität der ReaktionenSpezifität der Reaktionenwiderspiegeln?widerspiegeln?

2121

NMR chemical shift mapping VIINMR chemical shift mapping VII

VersuchsdurchführungVersuchsdurchführung Untersuchung von nicht Untersuchung von nicht

phosphorylierten Proteinen phosphorylierten Proteinen umum

Mögliche Rückreaktion Mögliche Rückreaktion auszuschließenauszuschließen

Phosphohydrolysis Phosphohydrolysis auszuschließenauszuschließen

Phosphorylierung hat keinePhosphorylierung hat keinerelevanten Auswirkungen auf relevanten Auswirkungen auf WWWW

4 NMR-Experimente4 NMR-Experimente NMR-Spektren von NMR-Spektren von 1515N-HPR N-HPR

vor (blau) und nach Zugabe vor (blau) und nach Zugabe (rot) von unmarkiertem (rot) von unmarkiertem EIIAEIIAglcglc

A: ecHPR + ecEIIAA: ecHPR + ecEIIAglcglc

B: bsHPR + bsEIIAB: bsHPR + bsEIIAglcglc

C: ecHPR + bsEIIAC: ecHPR + bsEIIAglcglc

D: bsHPR + ecEIIAD: bsHPR + ecEIIAglcglc

2222

NMR chemical shift mapping VIIINMR chemical shift mapping VIII

AuswertungAuswertung Keine VerschiebungKeine Verschiebung

bei bsHPR + ecEIIAbei bsHPR + ecEIIAglcglc (D) (D)=> Überlagerung der Kreuzpunkte=> Überlagerung der Kreuzpunkte=> keine WW=> keine WW

Durch Zuordnung der SpektrenDurch Zuordnung der Spektren=> Identifizierung von ähnlichen=> Identifizierung von ähnlichen

Bindungstellen (schwarz) Bindungstellen (schwarz)

FazitFazit Methode geeignet um spezifische WW zu detektierenMethode geeignet um spezifische WW zu detektieren Trotz hoher Konzentrationen (>200 Trotz hoher Konzentrationen (>200 μμm) von gereinigtem Protein beim) von gereinigtem Protein bei

NMR-Experimenten, keine Verunreinigung der Spektren durch NMR-Experimenten, keine Verunreinigung der Spektren durch unspezifische WWunspezifische WW

2323

Structure prediction of protein-complexes by an Structure prediction of protein-complexes by an NMR-based protein docking algorithm INMR-based protein docking algorithm I

IdeeIdee Protein-Protein Docking ProblemProtein-Protein Docking Problem

Gegeben 3D Struktur von komplexbildenden Proteinen A u. BGegeben 3D Struktur von komplexbildenden Proteinen A u. B Ermittle 3D-Struktur des Komplexes ABErmittle 3D-Struktur des Komplexes AB

Abwandlung: zusätzlich unzugewiesenes experimentelles 1D Abwandlung: zusätzlich unzugewiesenes experimentelles 1D 11H-NMR-H-NMR-Spektrum als InputSpektrum als Input

Verwendung des Rigid Body Docking Algortihmus von Lenhof Verwendung des Rigid Body Docking Algortihmus von Lenhof (1995,1997)(1995,1997)

Generiert Liste möglicher KomplexeGeneriert Liste möglicher Komplexe Bewertung mittels geometrisch energetischer Scoring-FunktionBewertung mittels geometrisch energetischer Scoring-Funktion

ZielZiel Bewertung der Komplexe mittels Neuer Scoring-Funktion, die Daten des Bewertung der Komplexe mittels Neuer Scoring-Funktion, die Daten des

experimentellen H-NMR-Spektrums miteinbeziehtexperimentellen H-NMR-Spektrums miteinbezieht

2424

Structure prediction of protein-complexes by an Structure prediction of protein-complexes by an NMR-based protein docking algorithm IINMR-based protein docking algorithm II

Neue Scoring FunktionNeue Scoring Funktion Berechnet theoretisches H-NMR-Spektrum für jeden möglichen KomplexBerechnet theoretisches H-NMR-Spektrum für jeden möglichen Komplex Abweichung des simulierten Spektrums vom experimentellen SpektrumAbweichung des simulierten Spektrums vom experimentellen Spektrum

=> Bewertung der Komplexe=> Bewertung der Komplexe Berechnung der Chemischen Verschiebung des KomplexesBerechnung der Chemischen Verschiebung des Komplexes Zerlegt Chemische Verschiebung Zerlegt Chemische Verschiebung δδ in 4 Teile: in 4 Teile:

δδRCRC: Random Coil shift: Random Coil shift

δδAA: Magnetic Anisotropy: Magnetic Anisotropy

δδJBJB: Ring current, Ringstromeffekt: Ring current, Ringstromeffekt

δδEFEF: Electric field effect: Electric field effect

2525

Structure prediction of protein-complexes by an Structure prediction of protein-complexes by an NMR-based protein docking algorithm IIINMR-based protein docking algorithm III

δδJBJB - Electric field effect - Electric field effect Einfache chemische Verschiebung aufgrund von umgebenden Einfache chemische Verschiebung aufgrund von umgebenden

ElektronenElektronen Spezifisch für jede Bindung, C-H, N-HSpezifisch für jede Bindung, C-H, N-H

Konstante Konstante εε übernommen von Williamson und Asakura(1993) übernommen von Williamson und Asakura(1993) Elektrisches Feld berechnet mittels Gesetz von CoulombElektrisches Feld berechnet mittels Gesetz von Coulomb Atomladungen aus dem AMBER 94 KraftfeldAtomladungen aus dem AMBER 94 Kraftfeld

(Connell et al. 1995)(Connell et al. 1995)

δδRC RC – Random coil shifts– Random coil shifts Verschiebungen vonVerschiebungen von

nicht definiert gefaltetennicht definiert gefaltetenAs-KettenAs-Ketten

Übernommen ausÜbernommen ausder BRMB Datenbankder BRMB Datenbank

2626

Structure prediction of protein-complexes by an Structure prediction of protein-complexes by an NMR-based protein docking algorithm IVNMR-based protein docking algorithm IV

δδAA – Magnetische Anisotropie der Peptidbindung – Magnetische Anisotropie der Peptidbindung Anisotropieeffekt: Doppelbindungen C=O hat nicht in alle Richtungen Anisotropieeffekt: Doppelbindungen C=O hat nicht in alle Richtungen

die gleiche Elektronenverteilungdie gleiche Elektronenverteilung Oberhalb der Bindungsebene stärker abgeschirmt als in der EbeneOberhalb der Bindungsebene stärker abgeschirmt als in der Ebene

Modelliert nach McConnell (1957) mittels Suszeptibilitäts-Tensor Modelliert nach McConnell (1957) mittels Suszeptibilitäts-Tensor (Matrix)(Matrix)

Kennzeichnet Orientierung eines Protons zur anisotropen BindungKennzeichnet Orientierung eines Protons zur anisotropen Bindung

R: Abstand Proton-Anistropische BindungR: Abstand Proton-Anistropische Bindung NNaa: Avogadrosche Zahl: Avogadrosche Zahl θθii: Winkel zwischen i-Achse und Distanz-Vektor R: Winkel zwischen i-Achse und Distanz-Vektor R ΧΧii: Suszeptibilitätstensor für Carbonylgruppe der Peptidbindung: Suszeptibilitätstensor für Carbonylgruppe der Peptidbindung

2727

Structure prediction of protein-complexes by an Structure prediction of protein-complexes by an NMR-based protein docking algorithm VNMR-based protein docking algorithm V

δδJBJB – Ringstromeffekt – Ringstromeffekt Ebenfalls Anisotropieeffekt: Aromatische Ringsysteme verursachen Ebenfalls Anisotropieeffekt: Aromatische Ringsysteme verursachen

ungleiche Elektronenverteilung durch ungleiche Elektronenverteilung durch ππ-Elektronen-System-Elektronen-System Oberhalb der Ringebene stärkerOberhalb der Ringebene stärker

abgeschirmt als in der Ebeneabgeschirmt als in der Ebene Äußeres Magnetfeld erzeugtÄußeres Magnetfeld erzeugt

Ringstrom im AromatenRingstrom im Aromaten Erzeugt seinerseits entgegenErzeugt seinerseits entgegen

gesetztes Magnetfeldgesetztes Magnetfeld

Modelliert nach Johnson and Bovey (1958):Modelliert nach Johnson and Bovey (1958):

n = Anzahl der n = Anzahl der ππ-Elektronen-Elektronen ee00, m = elektrische Ladung und Masse, m = elektrische Ladung und Masse e = Lichtgeschwindigkeite = Lichtgeschwindigkeit a = Ring Radius (5-Ring 1,182a = Ring Radius (5-Ring 1,182Å ; 6-Ring 1,39ÅÅ ; 6-Ring 1,39Å)) p, z = geben die Position des Kerns relativ zum Ring-Zentrum wiederp, z = geben die Position des Kerns relativ zum Ring-Zentrum wieder K,E = komplett elliptische Integrale K,E = komplett elliptische Integrale

2828

Structure prediction of protein-complexes by an Structure prediction of protein-complexes by an NMR-based protein docking algorithm VINMR-based protein docking algorithm VI

Bestimmung eines theoretischen NMR-SpektrumsBestimmung eines theoretischen NMR-Spektrums Simulation mittels Lorentzschen LinienSimulation mittels Lorentzschen Linien Gesamtspektrum = Linearkombination derGesamtspektrum = Linearkombination der

LorentzlinienLorentzlinien W = LinienbreiteW = Linienbreite

( 0.0032 ppm( 0.0032 ppm22 ) ) PPii = Peakposition = Peakposition

Entfernung der Peaks für austauschbare Protonen (OH, NH), nicht in Entfernung der Peaks für austauschbare Protonen (OH, NH), nicht in wässriger Lösung vorhandenwässriger Lösung vorhanden

Bestimmung der Differenz zwischen experimentellem (SBestimmung der Differenz zwischen experimentellem (Sexpexp) und ) und simuliertem Spektrum (Ssimuliertem Spektrum (Sepxepx) an 5000 verteilten Positionen x) an 5000 verteilten Positionen xii im Bereich im Bereich (-2 bis +12 ppm)(-2 bis +12 ppm)

Normalisierte Werte werden zum Bewerten der Strukturen verwendetNormalisierte Werte werden zum Bewerten der Strukturen verwendet

2929

Structure prediction of protein-complexes by an Structure prediction of protein-complexes by an NMR-based protein docking algorithm VIINMR-based protein docking algorithm VII

Ziele der Integration von NMR-Daten in RBD-AlgorithmenZiele der Integration von NMR-Daten in RBD-Algorithmen Erhöhung der Zuverlässigkeit der RBD-Algorithmen durch neueErhöhung der Zuverlässigkeit der RBD-Algorithmen durch neue

Scoring-FunktionScoring-Funktion Beschleunigung der Strukturaufklärung durch simulierte Beschleunigung der Strukturaufklärung durch simulierte

Verschiebungszuweisungen basierend auf Docking-ResultatenVerschiebungszuweisungen basierend auf Docking-Resultaten

EvaluierungEvaluierung 4 Komplexe4 Komplexe

Calmodulin + CaCalmodulin + Ca2+2+ abhängige Proteinkinaseabhängige Proteinkinase

Calmodulin + Bindungspeptid der CaCalmodulin + Bindungspeptid der Ca2+ 2+ PumpePumpe S100B(S100B(ββββ) + Peptid aus P53 Protein) + Peptid aus P53 Protein Homodimere Untereinheiten von S100B(Homodimere Untereinheiten von S100B(ββββ))

Einzelstrukturen aus PDBEinzelstrukturen aus PDB Generierung der exp. NMR-Spektren aus Shiftzuweisungen der BRMB-Generierung der exp. NMR-Spektren aus Shiftzuweisungen der BRMB-

DatenbankDatenbank

3030

Structure prediction of protein-complexes by an Structure prediction of protein-complexes by an NMR-based protein docking algorithm VIIINMR-based protein docking algorithm VIII

AuswertungAuswertung

Auftragung derAuftragung dermöglichen Komplexemöglichen Komplexe

x-Achse: RMSDx-Achse: RMSDy-Achse: Atom-Kontakty-Achse: Atom-KontaktEnergieEnergie

Beste Ergebnisse linkeBeste Ergebnisse linkeuntere Eckeuntere Ecke

Beste Ergebnisse ohneBeste Ergebnisse ohneAnisotropieshiftAnisotropieshift=> herausgenommen,=> herausgenommen,lokaler Effektlokaler Effekt

S100 S100 dimerdimer

Cal + Cal + PumpPump

S100 S100 + p53+ p53

Cal + Cal + KinaseKinase

3131

Structure prediction of protein-complexes by an Structure prediction of protein-complexes by an NMR-based protein docking algorithm IXNMR-based protein docking algorithm IX

AuswertungAuswertung Calmodulin + CaCalmodulin + Ca2+2+

abhängige Proteinkinaseabhängige Proteinkinase Sehr gutes ErgebnisSehr gutes Ergebnis

Calmodulin + Bindungspeptid der CaCalmodulin + Bindungspeptid der Ca2+ 2+ PumpePumpe Gutes ErgebnisGutes Ergebnis Allerdings falsche Struktur auf Platz 1Allerdings falsche Struktur auf Platz 1

Grund unbekanntGrund unbekannt

S100B(S100B(ββββ) + Peptid aus P53 Protein ) + Peptid aus P53 Protein Gutes ErgebnisGutes Ergebnis verwunderlich, da mit herkömmlichenverwunderlich, da mit herkömmlichen

Scoring-Funktion nicht zu docken Scoring-Funktion nicht zu docken

Untereinheiten von S100B(Untereinheiten von S100B(ββββ)) Gute Trennung zwischen zwischen True und False PositivesGute Trennung zwischen zwischen True und False Positives

FazitFazit Evaluation mit mehr Strukturen benötigtEvaluation mit mehr Strukturen benötigt Weiterer Schritt Voraussage von Komplexstrukturen ohne NMR-Weiterer Schritt Voraussage von Komplexstrukturen ohne NMR-

SpektrumSpektrum Geplant: Integration von mehrdimensionalen NMR-Spektren, welche Geplant: Integration von mehrdimensionalen NMR-Spektren, welche

mehr strukturelle Informationen enthaltenmehr strukturelle Informationen enthalten

S100 S100 + p53+ p53

3232

FazitFazit

Experimentelle Methoden oft sehr spezifischExperimentelle Methoden oft sehr spezifisch dienen zur Verifikation von theoretischen Erkenntnissendienen zur Verifikation von theoretischen Erkenntnissen unabdingbar bei der Evaluation von bioinformatischen unabdingbar bei der Evaluation von bioinformatischen

MethodenMethoden

Nachteile:Nachteile: Erfordern hohes FachwissenErfordern hohes Fachwissen FehleranfälligFehleranfällig Stark abhängig von experimentellen BedingungenStark abhängig von experimentellen Bedingungen Zeit- und KostenintensivZeit- und Kostenintensiv

Ausblick:Ausblick: Kombination von experimentellen Daten und bioinformatischen Kombination von experimentellen Daten und bioinformatischen

Methoden bringt VorteilMethoden bringt Vorteil

3333

ReferenzenReferenzen

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Kenworthy, A.K., (2001) Methods, 24, 289-296.Kenworthy, A.K., (2001) Methods, 24, 289-296. Imaging Protein-Protein Interactions Using Fluorescence Resonance Imaging Protein-Protein Interactions Using Fluorescence Resonance

Energy Transfer Microscopy. Energy Transfer Microscopy.

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Chemical Shift Mapping. Chemical Shift Mapping.

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Docking Algorithm.Docking Algorithm.

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