ExtrazellulExtrazellulääre Kontrolle der Zellteilung, Zellwachstum undre Kontrolle der Zellteilung, Zellwachstum und

ApoptoseApoptose

U. Albrecht

Einzelliger Organismus -> Teilung -> neues Individuum

-> natürliche Selektion begünstigt die Zellen welche:

1) am schnellsten wachsen

2) schlechte Zeiten am besten überleben.

-> Proliferation ist beeinflusst nur von Nährstoffangebot und Sex.

Mehrzellige Organismen -> Selektion nicht auf Ebene jeder Einzelzelle sondern auf dem Zellverband

-> Zellverband unterliegt strikten Kontrollen welche Proliferation verhindern.

-> im adulten Organismus teilen sich Zellen nicht -> in Ruhephase

-> Ausführen spezialisierter Funktionen.

-> Nährstoffe normalerweise im Ueberfluss

-> Zellen müssen gebremst werden nicht zu proliferieren, dagegen würden

Bakterein und Hefen unter diesen Bedingungen prolifereiern.

-> was ist Unterschied in der Regulation?

Für mehrzellige Organismen Nahrung für Zellen alleine nicht genug für Zellteilung

-> Zellen müssen positives Signal von anderen Zellen erhalten.

-> Wachstumsfaktoren

-> binden an Rezeptoren der Zelloberfläche

-> intrazelluläre negative Signale werden übergangen.

Hefe: Zelleproliferiert ausser negatives Signal wird erhalten

Tierzelle: Zelle stopt ausser postives Signal wird erhalten.

U. Albrecht1. Extrazelluläre Kontrolle der Zellteilung, Zellwachstum

U. Albrecht

4 Fragen:

1) Wie ist Säugerzellzykluskontrollsystem

2) Wie ist Proliferation kontrolliert

3) Was sind die Extrazellulären Signale

4) Wie überstimmen diese Signale das intra-

zelluläre Blockiersystem?

U. Albrecht

Regulation des Säugerzellzyklus wird mit kultivierten Zellinien studiert

Säugerzellen teilen sich in Kultur nur etwa 50 mal, dann Zelltod -> senescence

Allerdings: in Kulturen -> wenige Zellen entrinnen Zelltod

-> teilen sich unbegrenzt => Zelllinie

-> sehen aus wie normale Zellen aber Achtung:

Nachteil: Abnormal -> mindestens 1 Mutation

Vorteil: Unlimitiertes Zellmaterial -> standardisiert und genetisch homogen

Wachstumsfaktoren stimulieren die Proliferation von Säugerzellen

Säugerzellen -> Kulturmedium mit Nährstoffen -> wachsen nicht !!

-> + Serum -> Wachstum !

Vergleiche: Hefe keine Nährstoffe -> Zellzyklusarrest

Säugerzellen kein Serum -> Zellzyklus arrest -> G0

Was ist Serum ? -> Wachstumsfaktoren in geringer Konzentration (10-9 - 10-11 M)

Einer der ersten aufgereinigten Wachstumsfaktoren = platelet-derived growth factor

(PDGF)

Platelets sind kleine Zellen ohne Nukleus. Sie

zirkulieren im Blutstrom und helfen die Blut-

gerinnung an geschädigtem Gewebe zu stimulieren.

Dadurch wird übermässiges Bluten verhindert.

Platelets sezernieren auch Faktoren die Heilung

stimulieren.

Im Bild ist ein aufgeschnittenes Platelet (Blutplättchen)

gezeigt um die sekretorischen Vesikel zu zeigen.

Einige dieser Vesikel enthalten den sogenannten

platelet derived growth factor (PDGF).

U. Albrecht

Serum

Plasma

Serum = Ueberstand nach Koagulation

Plasma = Ueberstand ohne Koagulation

Warum dieser Unterschied? Platelets sekretieren ihren Inhalt, wenn sie in den Blood

Clot eingeschlossen werden -> PDGF gelangt ins Serum

U. Albrecht

Mitogene -> Zellteilung Wachstumsfaktoren -> Zellwachstum Survival Factors -> suprimieren Apoptose

U. Albrecht

Wachstumsfaktoren haben spezifische Rezeptoren

Growth

Factor

Receptor

Kombination von mehreren Faktoren

wichtig für viele Zelltypen

Wachstumsfaktoren in geringer Konzentration -> Isolation über Identifikation der DNA

U. Albrecht

Serum Deprivation verhindert Durchgang von G1 Checkpoint

Zellkulturen -> beobachten mit time-lapse Video

-> experimentelle Behandlung -> Effekt

z.B. -> Serum weg für 1 Stunde -> dramatischer Effekt

Videographischer Referenzpunkt: Mitose

gehen in G0 Cycle geht weiter

+ Serum Zellen sind commited

dauert 8 Stunden

3.5 h nach

Mitose Serumentzug

mehr als 3.5 h nach

Mitose Serumentzug

G1 checkpoint ist 3.5 Stunden von Mitose weg!

Wachstumsfaktoren kritisch zwischen Mitose und G1-Checkpoint !

-> wenn Serum entfernt -> Protein Synthese geht runter

weil Protein Synthese inhibitoren (Cycloheximide) in später G2

-> Zellen durch Mitose -> Stop in G1

U. Albrecht

S G2 M G1

3.5 h

Serumentzug

Cycloheximide

G1-Checkpoint Maschinerie ist nötig für G1-S Transition

aber nicht für Mitose

U. Albrecht

Benachbarte Zellen kompetitieren für Wachstumsfaktoren

Zellproliferation muss reguliert weil damit: 1) Anzahl Zellen

2) räumliche Anordnung sichergestellt ist.

Regulation abhängig von: 1) Zell-Zell Interaktionen

2) Kontakt zu extracellulärer Matrix

z.B. Epithel -> Zellen sterben -> müssen ersetzt werden und in Platz passen. Nur Zellen die

in Kontakt sind mit basal lamina proliferieren

-> messen 1) Zelldichte

2) Kontakt zu basal lamina

Meiste Experimente mit Fibroblasten -> nur bedingt übertragbar auf Organe.

Dissozierte Zellen -> kultivieren in Schale -> heften sich an

-> wachsen zu konfluentem Monolayer -> dann Stop

=> zelldichteabhängige Inhibition der Zellteilung

Wounding experiment:

Kontakt Inhibition?

U. Albrecht

U. Albrecht

-> nicht nur Kontakt sondern Menge von Wachstumsfaktoren ist wichtig

Zelldichte abhängige Inhibition -> Fähigkeit der Zelle lokale Wachstumsfaktorkonzentration

zu ändern.

z.B. PDGF -> 10-10M = ca. 1 Molekül in Kugel mit 3 m Durchmesser

Fibroblast hat etwa 105 PDGF Rezeptoren -> kann alles PDGF in der Umgebung

von Kugel mit 150 m Durchm. binden.

eine Zelle kann Umgebung von PDGF befreien -> Kompetition zwischen Zellen

-> viele Zellen -> kein freies PDGF mehr

-> Proliferationsstop.

U. AlbrechtNormale Tierzellen müssen verankert sein um Start zu passieren

Kompetition für Wachstumsfaktoren nicht einziger Einfluss auf Proliferation -> Form der Zelle wichtig!

Fibroblasten und Epithelzellen -> teilen sich nicht wenn in Suspension

Anchorage dependence of cell division

Gut ausgebreitete Zellen -> grössere Oberfläche -> mehr Wachstumsfaktoren und Nahrung -> teilen

sich besser

Focal adhesion point genügt -> Intracelluläre actin filamente + extracelluläre matrix Moleküle

Proliferation ist gekoppelt an die

Organisation des Zytoskelets.

Lamin und Fibronektin -> können als

Wachstumsfaktoren wirken.

Zelle in Zyklus -> M-Phase rund

-> G1 flach

-> attachement und detachement

-> wichtig um neugenerierte Tochter-

zellen in den Zellverband einzu-

betten.

U. Albrecht

Das Studium von Krebszellen offenbahrt Gene wichtig für Zellzykluskontrolle

Externe Einflüsse wie Wachstumsfaktoren und Zellform

-> Wie übersetzt in molekulare Sprache?

Effekte auf

Zellkern und

Proliferation

Wachstumsfaktor

Bindet an Rezeptoren

Studium von Krebs-

zellen die ein Gen

mutiert haben oder

mehrere

können proliferative Gene sein -> Assembly control System

oder antiproliferative Gene -> Disassambly of control System

Mutiertes Gen = Oncogen (gleiches Gen ohne Mutation = Proto-oncogen)

Wenn mutiert = Tumor-suppressor Gene

U. Albrecht

Zellzyklus Progression ist koordiniert mit Zellwachstum in Hefe

In Hefe Nahrungsangebot und Zellgrösse gekoppelt an Zellteilung (siehe vorher)

Wie kann Grösse gemessen werden?

In Hefe möglicherweise über messen von G1 cyclin das parallel zum Wachstum synthetisiert wird. Hypothet.

Cln3 Bindeprotein auf DNA konstant -> von gewisser Grösse an Cln3 frei -> Zellteilung.

Zellwachstum und Zellteilung kann unabhängig reguliert werden in Säuger Zellen

Hefe: Verhältnis Cytoplasma/DNA starr

Säuger: Verschiedene Zelltypen mit spezialisierter Funktion -> Verhältnis Cytoplasma/DNA

variabel

Wie wird dann in Säugerzellen Zellteilung Reguliert?

spezielle Wachstumsfaktoren die entweder Wachstum oder Replikation beeinflussen.

z.B. Neuronen -> können sehr viel wachsen ohne sich zu teilen

-> nerve growth factor (NGF) von zu enervierenden Zellen sezerniert

-> Wachstum des Neurons in die Richtung der sezernierenden Zelle.

Grösse eines Organs: Anzahl Zellen + Grösse der Zellen

Reguliert durch Zellwachstum, Zellteilung und Zelltod (Apoptose)

Moleküle die dies regulieren: Sekretierte Proteine, Zelloberflächen Strukturen, Extrazelluläre

Matrix

Eingeteilt in: 1) Mitogene -> Zellteilung

2) Wachstumsfaktoren -> Zellwachstum

3) Survival Factors -> suprimieren Apoptose

U. Albrecht

Zellen können Teilung verzögern durch Eintritt in Ruhephase

U. Albrecht

Säugerzellen in Kultur -> kein Serum (Growth factors) -> machen Zyklus fertig bis G1,

dann Stop -> G0

G0 -> Protein Synthese reduziert, nur noch ca. 20%

Auch Nahrungsmangel führt zu Stop -> G0

Hefe -> G1 checkpoint -> Start

Säugerzellen -> Nahrung im Ueberfluss -> Wachstumsfaktoren kritisch

-> Eintritt in G0 -> Variabilität in Zellzyklus verschiedener Zelltypen

z.B. Neuronen, Muskelzellen teilen sich nie

Leberzellen ca. 1x im Jahr

Epithelzellen, Darm 2x pro Tag

Diese Angaben aber variabel -> abhängig von Umständen (z.B. Verletzungen)

-> Variation im Zellzyklus in Säugerzellen zwischen M und G1

aber S-Phase bis Mitose sehr konstant (ca 12-24 h)

G1 checkpoint spezifische Kontrolle

Zellteilung: Mitogene stimulieren G1-Cdk und G1/S-Cdk Aktivitäten

U. Albrecht

+ Max -> heterodimer formation to activate target genes.

U. Albrecht

Abnormale Proliferationssignale führen zu Zellzyklusstop oder Zelltod

Krebsfördernde Gene = Onkogene

z.B. Ras, Myc

Mutationen in diesen Genen

->Ueberproliferation

in Experiment jedoch nicht

beobachtet -> Checkpoints -> ab-

normale Proliferation wird erkannt

-> wie dies genau geschieht ist

nicht bekannt. Assoziation mit

p19ARF

Krebs entsteht nur dann, wenn auch Schutzmechanismus inaktiviert wird.

d.h. mehrere Mutationen müssen akkumulieren z.B. in Ras + p53 oder Myc + p19ARF

Zellwachstum: Wachstumsfaktoren stimulieren Zellwachstum

Beispiel für Signaltransduktion von äusserem

Signal zum Zellkern.

1. aktivierte Kinase

2. aktivierte Kinase

early response und

delayed reesponse genes.

U. Albrecht

U. Albrecht

Wahrscheinlichkeit in G0 einzutreten wächst mit der Anzahl von Zellteilungen einer Zelle:

Zellalterung - Senescence

Zellproliferation: 1) Umgebung

2) Langzeitgeschichte der Zelle

Dies gilt für somatische Zellen, Stammzellen sind davon ausgenommen

z.B. Fibroblasten (Mensch) -> embryonal -> 50 Teilungen

40 - Jährig -> 40 Teilungen

80 - Jährig -> 30 Teilungen

Teilungsfähigkeit korreliert mit Alter.

Verschiedene Erklärungen für Zellalterung:

1) Akkumulation von Mutationen (Replikation unpräzise)

2) Mechanismus der vor Krebs schützen soll da alte Zellen sterben

3) Telomere am Ende der Chromosomen werden verkürzt durch jede Zellteilung

Nur in Stammzellen Telomerase welche die Verkürzung repariert.

Alterung der Zelle jedoch nicht strikt vorprogrammiert, da aus derselben Population

einige sich mehr teilen können als andere.

Aufheben der replikativen Zellalterung durch Expression von Telomerase

U. Albrecht

Menschliche Zellen haben ein eingebaute Limitation für Teilung

Fibroblasten teilen sich 25-50 mal -> dann nicht replikativer Zustand

= replikative Senescence

Telomere -> werden bei jeder Replikation verkürzt

-> Telomerase behebt Verkürzung

Aber im Menschen Telomerase in meisten Zellen inaktiviert = Schutz

vor unendlicher Replikation (Krebszellen haben Telomerase re-aktiviert)

2. Programmierter Zelltod - Apoptosis

U. Albrecht

Multizellulärer Organismus -> Kontrolle der Zellteilung und des Zelltodes

-> ungebrauchte Zellen sterben

Entwickelndes Nervensystem: mehr als die Hälfte der Zellen stirbt

Erwachsener Mensch: billionen von Zellen sterben im Knochenmark und im Darm jede Stunde

Wozu ist dieser massive Zelltod gut?

U. Albrecht

Ausbildung der Finger in der entwickelnden Mauspfote durch Apoptose

Die Pfote wurde mit Farbstoff behandlet der

spezifisch Zellen in Apoptose grün färbt.

Die apoptotischen Zellen erscheinen als leuchtend

grüne Punkte zwischen den Fingern.

Dieser Zelltod eliminiert das Gewebe zwischen

den sich entwickelnden Fingern.

1) im entwickelnden Organismus

U. Albrecht

in der Qaulquappe des Frosches stirbt der Schwanz während der

Entwicklung ab

U. Albrecht

entwickelndes Nervensystem:

Regulation der Zellzahl -> Anzahl Nervenzellen = Anzahl Zielzellen

Kompetition der Zellen (Neuronen) für Ueberlebendsfaktoren welche von Ziel-

zellen sezerniert werden.

U. Albrecht

2) im erwachsenen Organismus

Zelltod um Zellteilung auszugleichen damit die Zellzahl konstant bleibt.

-> sonst würden Gewebe und Organe wachsen oder schrumpfen.

Leber -> entfernen eines Teils

-> wächst nach (Proliferation wird angeregt)

-> Behandlung von Ratten mit Pentobarbital

-> induziert Zellwachstum in der Leber

-> Leber vergrössert sich

-> absetzen von Pentobarbital

-> Leber apoptosis -> Ausgangsgrösse

Regulation der Todes und Geburtsrate von Zellen wichtig für mehrzellige

Organismen

U. AlbrechtZelltod - Nekrose oder Apoptose

in Kulturschale im Gewebe

NeKrose:

Zelle platzt und schüttet den

Inhalt in die Umgebung ->

Inflammation dies geschieht z.B.

bei Verletzungen

Apoptose:

Zelle stirbt kontrolliert. Inhalt gelangt nicht in die Umgebung -> Nachbarzellen werden

nicht beschädigt.

Zytoskelet kollabiert, Nuklearmembran löst sich auf, DNA fragmentiert -> Zelloberfläche

verändert sich -> Signal für Phagocytose durch benachbarte Zellen -> Zellinhlat

wird recycliert.

U. Albrecht

U. Albrecht

Maschinerie der Apoptose

Proteolytische Kaskade durch Caspasen

Caspasen = Proteasen mit Cys in aktivem Zentrum

-> spaltet Zielproteine an Asparaginsäure Resten

=> Name Caspasen

Caspasen werden synthetisiert als Procaspasen

aktiviert durch andere Caspasen

=> amplifizierende proteolytische Kettenreaktion

Zielproteine: nukleäre Lamine

DNAsen

=> effizienter Selbstzerstörungsmechanismus

-> vergleichbar einem Zustand im Zellzyklus

-> alles oder nichts Entscheid

-> irreversibel

U. Albrecht

Die Caspase - Kaskade in Apoptosis

Jede Zelle hat Quelle für Selbstzerstörung

in sich in Form der Procaspase

Wie werden sie aktiviert ?

-> Adaptorproteine die initiator Procaspasen

in einen Komplex aggregieren.

2 möglichkeiten der Aktivierung:

1) jede Procaspase kleine Aktivität -> in

Komplex -> reicht um sich gegenseitig

zu aktivieren -> Lawine

2) Aggregation -> Konformationsänderung

-> Aktivierung der Procaspasen

-> Amplifikation des Death Signals

U. Albrecht

Die Aktivierung von Procaspasen kann von aussen induziert werden

Death Rezeptoren: z.B. Fas Killer Lymphocyten -> Fas - Ligand -> binden an Zellen

mit Fas

U. Albrecht

Aktivieren der Apoptose von innen

= intrinsischer Pathway

bei Zellschädigungen oder Stress (z.B. Radikale) -> initiation des Selbstzerstörungsprogramms

-> wichitges Organell in diesem Zusammenhang sind die Mitochondrien.

DNA Beschädigung kann auch Apoptose induzieren -> p53 aktiviert transkription von Genen

deren Produkte das Entrinnen von Cytochrom C aus dem Mitochondrium begünstigen.

=> Bcl-2 family members

U. Albrecht

Bcl-2 = anti-apoptotic

p53 = pro-apoptotic

U. Albrecht

Wie survival Faktoren Apoptose unterdrücken

siehe Neuronale apoptose