Faltung, Dynamik und strukturelle Evolution der Proteine ... · 1. Heat shock protein 70 (Hsp70) so...
Transcript of Faltung, Dynamik und strukturelle Evolution der Proteine ... · 1. Heat shock protein 70 (Hsp70) so...
Faltung, Dynamik und strukturelle Evolution der Proteine (Voet Kapitel 8)
1. Proteinfaltung: Theorie und Experiment
2. Proteindynamik
3. Strukturelle Evolution
U.Albrecht BC1
U.Albrecht BC1
A. Protein-Renaturierung
Reduktive Denaturierung und oxidative Renaturierungder RNAse A
Denaturierung in 8M HarnstoffDialyse und stehenlassen an Luft100% aktives Enzymkeine zufällige Renaturierung
1/7 x 1/5 x 1/3 x 1/1 = 1/105
native Konformation thermo-dynamisch günstig sein.
U.Albrecht BC1
Wahrscheinlichkeit für korrekte Fal-tung bei Gleichwertigkeit aller SH:
Enzymatische Renaturierung von Disulfid-Brücken
Protein-Disulfid-Isomerase (PDI)
kontinuierliches Öffnen der S-S Brücken. Thermodynamisch günstigste Proteinkonformation bestimmt die bevorzugten S-S Brücken.
U.Albrecht BC1
U.Albrecht BC1
Posttranslationell modifizierte Proteine können sich einer spontanen Renaturierung widersetzen
Primärstruktur von Proinsulin
Insulin wird aus einer AS-Kette gebildet, demProinsulin. Spezifische proteolytische Reaktionführt zur Abspaltung eines ‚internen‘ Peptides(C chain) zwei kettiges Insulin
kann nicht mehrspontan ursprünglicheKonformation einnehmenund andere S-S Brückenausbilden
U.Albrecht BC1
Proteinfaltung wird hauptsächlich durch innere Reste gesteuert
Modifikation von AS an Proteinoberfläche verändern die native Konformationkaum
Mutationen von Oberflächenresten verändern native KonformationkaumAS an Oberfläche evolutionär weniger stark konserviert als innere Reste (hydro-phobe Reste)
Denaturierende Agenzien interagieren mit hydrophoben inneren Resten
Die Proteinfaltung ist ein von hydrophoben Kräften getriebener Prozess
U.Albrecht BC1
B. Faltungsabläufe
Es werden nicht alle möglichen Konfor-mationen ausprobiert (bräuchte Mia von Jahren) Faltung mehrstufiger, koopera-tiver Prozess.
1. zufällige Bildung kurzer Abschnitte von Sekundärstrukturen (α−Helices, β−Falt- blätter) Nuclei für weitere Faltung2. Nuclei wachsen in kooperativer Weise. Helices und Faltblätter gruppieren sich.3. in Multidomänenprot. kommen Domänen zusammen. Molten Globule Hydrophobe Seitenketten sind noch dem Lsm ausgesetzt.4. Kompaktere Tertiärstruktur bildet sich aus kleine konformationelle Anpassungen.5. Untereineheiten kommen zusammen6. konformationlelle Anpassungen führen zu nativer Konformation.
Hypothethscher Faltungsablauf einer dimerenProteins.
U.Albrecht BC1
BPTI faltet sich in geordneter Abfolge in seine native Konformation
Natives BPTI
BPTI = Basic Pancreatic Trypsin Inhibitor
Inaktiviert Trypsin im Pankreas, welcherTrypsin sezerniert. Dadurch wird dieser vor Selbstzerstörung geschützt.
3 Disulfid-Brücken
U.Albrecht BC1BPTI wählt eine begrenzte Anzahl Faltungswege
70 %
30%
U.Albrecht BC1C. Faltungs Hilfsproteine
Hilfsproteine die Faltung von Proteinen erleichtern währendsie synthetisiert werden = Beschleunigung der Faltung1. Protein Disulfid Isomerasen (PDI)2. Peptidyl prolyl cis-trans isomerasen3. Chaperone
PDI (siehe vorher) beschleunigt korrekte S-S Brückenbildungdurch shuffling von Disulfidbrücken.
Ähnliches Enzym in Bacterien = DsbA Protein mit Ähnlichkeitzu thioredoxin.
Schwefel Atom
Molekulare Oberfläche und Ladungsverteilung
90° gedreht
negativ geladene Gruppen
positiv geladene Gruppen
exponiertes Schwefelatom
U.Albrecht BC1Peptidyl prolyl cis-trans isomerasen (PPI)
In globulären Proteinen Xaa-Pro Peptid Bin-dungen in trans Konformation, aber 10% in cisKonformation.Cis Konformation wird durch PPI (auchRotamase genannt) begünstigt
2 Familien von PPI‘s (Immunophiline):
cyclophiline
FK506 binding protein (FKBP)
Diese Proteine haben auch immunsupressiveEigenschaften, die jedoch nichts mit ihren enzymatischen Aktivitäten als Rotamasen zu tun haben.
U.Albrecht BC1
Molekulare Chaperons verhindern falsche Faltung und Agregation von Proteinen
Hydrophobe Regionen haben Tendenz zu agregieren. Solche Agregate können siche ineinem Peptidstrang selber bilden oder zwischen Peptidsträngen. Molekulare Chaperoneverhindern eine solche ungünstigen Assoziationen und kehren sie um. Chaperone bindenan hydrophobe Regionen die Lösungsmittel exponiert sind und verhindern so ungewollteAgregationen. Der genaue Mechanismus ist unbekannt jedoch haben viele Chaperone
ATPase Aktivität. ATP hydro-lyse scheint die Energie fürdie Funktion der Chaperone zu liefern.
E. coli PapD ein molekulares Chaperondas die korrekte Faltung von Pili fördert.
Boomerang Gestalt von PapD
Peptid wird in gestreckter Konformation gehalten
Verankerung des C-Terms anChaperon
U.Albrecht BC1
Verschiedene Klassen von Chaperons
1. Heat shock protein 70 (Hsp70) so benannt da Synthese dieser Proteine er- höht bei angehobener Temperatur. Sie kehren Denaturierung und Agregation in Prokaryoten als auch in Eukaryoten um.
2. Chaperonine (Hsp60, Hsp10) Multisubunit, käfigähnliche Moleküle Erhöhen nicht die Rate der Proteinfaltung sondern erhöhen die Ausbeute an richtig gefalteten Proteinen
Hsp60 Molekül von Rhodobacter spheroidesist aus 14 identischen Untereinheiten.
3. Nucleoplasmine steuern in vivo die Zusammensetzung von der Nucleosomen
U.Albrecht BC1
Reaktionszyklus der E. coli chaperonine GroEL (Hsp60) und GroES (Hsp10)
hydrophobischeBindungsstellen
ATP-abhängige Freisetzung von ungefalteten Proteinenvon den Bindungstellen im GroEL chaperon.
Nucleoplasmine
Nucleosomen werden durch Nucleoplasmine ausden Histoneinheiten zusammengefügt. An Nucleosomenist die DNA aufgewickelt und stellt eine sehr kompakteForm der Verpackung dar.
U.Albrecht BC1
U.Albrecht BC1
C. Vorhersage der Proteinstruktur
Primärstruktur bestimmt Faltung. Theoretisch Berechungen möglich um Struktur zubestimmen, praktisch aber kaum durchführbar Empirische Methoden
1. Chou-Fasman-Schema
Frequenz f = Frequenz mit der ein bestimmter Rest in einer α-Helix auftritt
f = n n n = Anzahl AS eines Typs in α-Helix n = Gesamtzahl der AS dieses Typs im Protein
Tendenz P einer bestimmten AS in einer α-Helix aufzutreten
P = f f f = Durchschnittswert von f für alle 20 AS P > 1 heisst AS mit grösserer als durchschnit-
tlicher Wahrscheinlichkeit in α-Helix
Tendenz P einer bestimmten AS in einem β-Faltblatt aufzutreten analog definiert.
U.Albrecht BC1
Empirische Regeln zu Chou-Fasman-Schema:
1. Vier Helix bildende Reste in sechs aufeinanderfolgenden Resten dienen als Helixnucleus. Helixsegment pflanzt sich in beide Richtungen fort bis der durchschnittliche Wert von P < 1 ist. Ein Pro-Rest nur am N-Term einer Helix.
2. Drei β−Faltblatt bildenden Reste in fünf aufeinanderfolgenden Resten starten ein β−Faltblatt. Pflanzt sich in beide Richtungen fort bis P < 1.
3. Wenn α− und β−bildende Sequenzen überlappen gilt Überlappungsregion als helical wenn P > P α-Helix P > P β−Faltblatt Zuverlässigkeit ist bis zu 80 %
2. Regel von Rose
Umkehrschleifen sind durch ein Hydrophobizitäts-Minimum entlang der Polypeptid-kette charakterisiert. Dies gilt nur wenn die Region nicht gleichzeitig ein helicalerAbschnitt darstellt.
U.Albrecht BC1
Vorhersage von α-Helices, β−Faltblatt Strukturen und β−Schleifen
Faltung, Dynamik und strukturelle Evolution der Proteine (Voet Kapitel 8)
1. Proteinfaltung: Theorie und Experiment
2. Proteindynamik
3. Strukturelle Evolution
U.Albrecht BC1
U.Albrecht BC1
2. Proteindynamik
- Röntgenstruktur liefert zeitlich gemittelte Schnappschüsse der Proetinstruktur- Proteine sind aber flexibel fluktuierende Moleküle, deren strukturelle Mobilität eine funktionelle Signifikanz hat.
3 Arten von ‚Atmungsbewegungen‘:
1. atomare Fluktuationen: vibrationen von individuellen Bindungen 1-100 pm
2. kollektive Bewegungen: Gruppen von kovalent verknüpften Atomen bewegen sich 1-500 pm
3. induzierte Konformationsveränderungen: Atomgruppen und ganze Untereinheiten können können sich nach Stimulus (z.B. O2 an Hämoglobin) bewegen. 50-1000 pm
U.Albrecht BC1
Darstellung der ‚atmenden‘ Bewegungen im Myoglobin, die das Austreten eines gebundenenO2 Moleküls zulassen
O2 Molekül
Häm Gruppe
U.Albrecht BC1Proteine haben mobile Strukturen
Mehrere ‚Schnappschüsse‘ von Myoglobin überlagert
HämHis-Rest
α−Helix
Seitenketten
H-Brücken
Faltung, Dynamik und strukturelle Evolution der Proteine (Voet Kapitel 8)
1. Proteinfaltung: Theorie und Experiment
2. Proteindynamik
3. Strukturelle Evolution
U.Albrecht BC1
U.Albrecht BC1
3. Strukturelle Evolution
Hydrophobe Kräfte sehr wichtig für Faltung. Innere AS können nur konservativ substituiertwerden damit Struktur erhalten bleibt. Konservierung der Proteinstruktur wichtig, nicht Aminosäuresequenz.
A. Struktur des Cytochroms c
Häm Nische wichtig. AS die Häm fixieren sindevolutionär konserviert
Häm
strukturell wichtige AS
U.Albrecht BC1
Primärstruktur verschiedener Cytochrome c
Aminosäuresequenz nicht sehr konserviert. Strukturelemete aber sehr. Kritische Amino-säuren sind konwerviert
U.Albrecht BC1
Dreidimensionale Struktur von Cytochromen c
Struktur ist sehr konserviert im Gegensatz zur Primärstruktur
U.Albrecht BC1
B. Gen-Duplikation
In Multidomän Proteinen können Domänen ähnlich sein. Konvergente Evolution istunwahrscheinlich, Gen-Duplikation und dievergente Evolution eher wahrscheinlich
strukturell ähnliche Domänen von Rhodanase
Redox- Enzyme (Dehydrogenasen) aus 2 verschiednen Domänen: Coenzym bindendeDomäne und Substrat bindende Domäne Funktion aus 2 Einheiten
Genetische Kombination neue Funktion