Faltung, Dynamik und strukturelle Evolution der Proteine ... 1. Heat shock protein 70 (Hsp70) so...

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  • Faltung, Dynamik und strukturelle Evolution der Proteine (Voet Kapitel 8)

    1. Proteinfaltung: Theorie und Experiment

    2. Proteindynamik

    3. Strukturelle Evolution

    U.Albrecht BC1

  • U.Albrecht BC1

  • A. Protein-Renaturierung

    Reduktive Denaturierung und oxidative Renaturierung der RNAse A

    Denaturierung in 8M Harnstoff Dialyse und stehenlassen an Luft 100% aktives Enzym keine zufällige Renaturierung

    1/7 x 1/5 x 1/3 x 1/1 = 1/105

    native Konformation thermo- dynamisch günstig sein.

    U.Albrecht BC1

    Wahrscheinlichkeit für korrekte Fal- tung bei Gleichwertigkeit aller SH:

  • Enzymatische Renaturierung von Disulfid-Brücken

    Protein-Disulfid-Isomerase (PDI)

    kontinuierliches Öffnen der S-S Brücken. Thermodynamisch günstigste Proteinkonformation bestimmt die bevorzugten S-S Brücken.

    U.Albrecht BC1

  • U.Albrecht BC1

    Posttranslationell modifizierte Proteine können sich einer spontanen Renaturierung widersetzen

    Primärstruktur von Proinsulin

    Insulin wird aus einer AS-Kette gebildet, dem Proinsulin. Spezifische proteolytische Reaktion führt zur Abspaltung eines ‚internen‘ Peptides (C chain) zwei kettiges Insulin

    kann nicht mehr spontan ursprüngliche Konformation einnehmen und andere S-S Brücken ausbilden

  • U.Albrecht BC1

    Proteinfaltung wird hauptsächlich durch innere Reste gesteuert

    Modifikation von AS an Proteinoberfläche verändern die native Konformation kaum

    Mutationen von Oberflächenresten verändern native Konformationkaum AS an Oberfläche evolutionär weniger stark konserviert als innere Reste (hydro- phobe Reste)

    Denaturierende Agenzien interagieren mit hydrophoben inneren Resten

    Die Proteinfaltung ist ein von hydrophoben Kräften getriebener Prozess

  • U.Albrecht BC1

    B. Faltungsabläufe

    Es werden nicht alle möglichen Konfor- mationen ausprobiert (bräuchte Mia von Jahren) Faltung mehrstufiger, koopera- tiver Prozess.

    1. zufällige Bildung kurzer Abschnitte von Sekundärstrukturen (α−Helices, β−Falt- blätter) Nuclei für weitere Faltung 2. Nuclei wachsen in kooperativer Weise. Helices und Faltblätter gruppieren sich. 3. in Multidomänenprot. kommen Domänen zusammen. Molten Globule Hydrophobe Seitenketten sind noch dem Lsm ausgesetzt. 4. Kompaktere Tertiärstruktur bildet sich aus kleine konformationelle Anpassungen. 5. Untereineheiten kommen zusammen 6. konformationlelle Anpassungen führen zu nativer Konformation.

    Hypothethscher Faltungsablauf einer dimeren Proteins.

  • U.Albrecht BC1

    BPTI faltet sich in geordneter Abfolge in seine native Konformation

    Natives BPTI

    BPTI = Basic Pancreatic Trypsin Inhibitor

    Inaktiviert Trypsin im Pankreas, welcher Trypsin sezerniert. Dadurch wird dieser vor Selbstzerstörung geschützt.

    3 Disulfid-Brücken

  • U.Albrecht BC1 BPTI wählt eine begrenzte Anzahl Faltungswege

    70 %

    30%

  • U.Albrecht BC1 C. Faltungs Hilfsproteine

    Hilfsproteine die Faltung von Proteinen erleichtern während sie synthetisiert werden = Beschleunigung der Faltung 1. Protein Disulfid Isomerasen (PDI) 2. Peptidyl prolyl cis-trans isomerasen 3. Chaperone

    PDI (siehe vorher) beschleunigt korrekte S-S Brückenbildung durch shuffling von Disulfidbrücken.

    Ähnliches Enzym in Bacterien = DsbA Protein mit Ähnlichkeit zu thioredoxin.

    Schwefel Atom

    Molekulare Oberfläche und Ladungsverteilung

    90° gedreht

    negativ geladene Gruppen

    positiv geladene Gruppen

    exponiertes Schwefelatom

  • U.Albrecht BC1 Peptidyl prolyl cis-trans isomerasen (PPI)

    In globulären Proteinen Xaa-Pro Peptid Bin- dungen in trans Konformation, aber 10% in cis Konformation. Cis Konformation wird durch PPI (auch Rotamase genannt) begünstigt

    2 Familien von PPI‘s (Immunophiline):

    cyclophiline

    FK506 binding protein (FKBP)

    Diese Proteine haben auch immunsupressive Eigenschaften, die jedoch nichts mit ihren enzymatischen Aktivitäten als Rotamasen zu tun haben.

  • U.Albrecht BC1

    Molekulare Chaperons verhindern falsche Faltung und Agregation von Proteinen

    Hydrophobe Regionen haben Tendenz zu agregieren. Solche Agregate können siche in einem Peptidstrang selber bilden oder zwischen Peptidsträngen. Molekulare Chaperone verhindern eine solche ungünstigen Assoziationen und kehren sie um. Chaperone binden an hydrophobe Regionen die Lösungsmittel exponiert sind und verhindern so ungewollte Agregationen. Der genaue Mechanismus ist unbekannt jedoch haben viele Chaperone

    ATPase Aktivität. ATP hydro- lyse scheint die Energie für die Funktion der Chaperone zu liefern.

    E. coli PapD ein molekulares Chaperon das die korrekte Faltung von Pili fördert.

    Boomerang Gestalt von PapD

    Peptid wird in gestreckter Konformation gehalten

    Verankerung des C-Terms an Chaperon

  • U.Albrecht BC1

    Verschiedene Klassen von Chaperons

    1. Heat shock protein 70 (Hsp70) so benannt da Synthese dieser Proteine er- höht bei angehobener Temperatur. Sie kehren Denaturierung und Agregation in Prokaryoten als auch in Eukaryoten um.

    2. Chaperonine (Hsp60, Hsp10) Multisubunit, käfigähnliche Moleküle Erhöhen nicht die Rate der Proteinfaltung sondern erhöhen die Ausbeute an richtig gefalteten Proteinen

    Hsp60 Molekül von Rhodobacter spheroides ist aus 14 identischen Untereinheiten.

    3. Nucleoplasmine steuern in vivo die Zusammensetzung von der Nucleosomen

  • U.Albrecht BC1

    Reaktionszyklus der E. coli chaperonine GroEL (Hsp60) und GroES (Hsp10)

    hydrophobische Bindungsstellen

    ATP-abhängige Freisetzung von ungefalteten Proteinen von den Bindungstellen im GroEL chaperon.

  • Nucleoplasmine

    Nucleosomen werden durch Nucleoplasmine aus den Histoneinheiten zusammengefügt. An Nucleosomen ist die DNA aufgewickelt und stellt eine sehr kompakte Form der Verpackung dar.

    U.Albrecht BC1

  • U.Albrecht BC1

    C. Vorhersage der Proteinstruktur

    Primärstruktur bestimmt Faltung. Theoretisch Berechungen möglich um Struktur zu bestimmen, praktisch aber kaum durchführbar Empirische Methoden

    1. Chou-Fasman-Schema

    Frequenz f = Frequenz mit der ein bestimmter Rest in einer α-Helix auftritt

    f = n n n = Anzahl AS eines Typs in α-Helix n = Gesamtzahl der AS dieses Typs im Protein

    Tendenz P einer bestimmten AS in einer α-Helix aufzutreten

    P = f f f = Durchschnittswert von f für alle 20 AS P > 1 heisst AS mit grösserer als durchschnit-

    tlicher Wahrscheinlichkeit in α-Helix

    Tendenz P einer bestimmten AS in einem β-Faltblatt aufzutreten analog definiert.

  • U.Albrecht BC1

    Empirische Regeln zu Chou-Fasman-Schema:

    1. Vier Helix bildende Reste in sechs aufeinanderfolgenden Resten dienen als Helixnucleus. Helixsegment pflanzt sich in beide Richtungen fort bis der durchschnittliche Wert von P < 1 ist. Ein Pro-Rest nur am N-Term einer Helix.

    2. Drei β−Faltblatt bildenden Reste in fünf aufeinanderfolgenden Resten starten ein β−Faltblatt. Pflanzt sich in beide Richtungen fort bis P < 1.

    3. Wenn α− und β−bildende Sequenzen überlappen gilt Überlappungsregion als helical wenn P > P α-Helix P > P β−Faltblatt Zuverlässigkeit ist bis zu 80 %

    2. Regel von Rose

    Umkehrschleifen sind durch ein Hydrophobizitäts-Minimum entlang der Polypeptid- kette charakterisiert. Dies gilt nur wenn die Region nicht gleichzeitig ein helicaler Abschnitt darstellt.

  • U.Albrecht BC1

    Vorhersage von α-Helices, β−Faltblatt Strukturen und β−Schleifen

  • Faltung, Dynamik und strukturelle Evolution der Proteine (Voet Kapitel 8)

    1. Proteinfaltung: Theorie und Experiment

    2. Proteindynamik

    3. Strukturelle Evolution

    U.Albrecht BC1

  • U.Albrecht BC1

    2. Proteindynamik

    - Röntgenstruktur liefert zeitlich gemittelte Schnappschüsse der Proetinstruktur - Proteine sind aber flexibel fluktuierende Moleküle, deren strukturelle Mobilität eine funktionelle Signifikanz hat.

    3 Arten von ‚Atmungsbewegungen‘:

    1. atomare Fluktuationen: vibrationen von individuellen Bindungen 1-100 pm

    2. kollektive Bewegungen: Gruppen von kovalent verknüpften Atomen bewegen sich 1-500 pm

    3. induzierte Konformationsveränderungen: Atomgruppen und ganze Untereinheiten können können sich nach Stimulus (z.B. O2 an Hämoglobin) bewegen. 50-1000 pm

  • U.Albrecht BC1

    Darstellung der ‚atmenden‘ Bewegungen im Myoglobin, die das Austreten eines gebundenen O2 Moleküls zulassen

    O2 Molekül

    Häm Gruppe

  • U.Albrecht BC1 Proteine haben mobile Strukturen

    Mehrere ‚Schnappschüsse‘ von Myoglobin überlagert

    HämHis-Rest

    α−Helix

    S