This work has been digitalized and published in 2013 by Verlag Zeitschrift für Naturforschung in cooperation with the Max Planck Society for the Advancement of Science under a Creative Commons Attribution4.0 International License.

Dieses Werk wurde im Jahr 2013 vom Verlag Zeitschrift für Naturforschungin Zusammenarbeit mit der Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung derWissenschaften e.V. digitalisiert und unter folgender Lizenz veröffentlicht:Creative Commons Namensnennung 4.0 Lizenz.

1 2 1 6 G. WEISSENBÖCK, I. FLEING UND H. G. RUPPEL

Untersuchungen zur Lokalisation von Flavonoiden in Piastiden, I

Flavonoide in Etioplasten von Avena sativa L. Experiments on the Localisation of Flavonoids in Plastids, I

Flavonoids in Etioplasts of Avena sativa L.

GOTTFRIED WEISSENBÖCK, INGRID FLEING u n d HANS GEORG RUPPEL

Botanisches Institut der Universität zu Köln

(Z. Naturforsch. 27 b, 1216—1224 [1972] ; eingegangen am 3. Juli 1972)

Flavonoids, etioplasts, prolamellar bodies

Etioplasts aqueously isolated from leaves of etiolated plants of two varieties of Avena sativa contain all the flavonoid compounds of the whole leaf: apigenin-7-methoxy(?)-8-C-rhamnosyl-glucosylgly (u) coside (or -8-C-glucosylrhamnosylgly (u) coside), apigenin-6-C-arabinosylglucoside, apigenin-8-C-glucosylglucoside and in variety 1 a derivative of kaempferol, in variety 2 the flavone-C-glycoside saponaretin. The distribution of these compounds however is different in etioplasts and leaves: in etioplasts of variety 1 the kaempferol-derivative, in those of variety 2 saponaretin is relatively enriched. Presence of flavonoids could also be demonstrated in isolated prolamellar bodies from etioplasts of Avena variety 2.

Untersuchungen an Impatiens balsamina erbrach-ten Hinweise auf eine mögliche Beteiligung von Chloroplasten an der Biosynthese flavonoider Ver-bindungen in grünen Keim- und Laubblättern1_3. In keimenden Impatiens-Samen beginnt die Synthese von Zimtsäure-Derivaten und Flavonoiden bereits am 2. Keimungstag und ist in dieser frühen Kei-mungsphase lichtunabhängig. In der Folge führt Dauerbelichtung zu einer drastischen Flavonoid-akkumulation, die parallel zur Chlorophyllsynthese im jungen Keimling abläuft. Im Gegensatz dazu wird in entsprechenden Dunkelkeimlingen eine nur geringe Flavonoidmenge akkumuliert1. Auch in Ent-wicklung befindlichen Primärblättern von Impatiens steigt der Flavonoidgehalt bei Belichtung stark an (WEISSENBÖCK, unpubl.). Diese Beobachtungen ver-anlaßten uns, isolierte Chloroplasten grüner Impa-fiens-Blätter auf Flavonoide zu analysieren. Nadi wäßrigen und nicht-wäßrigen Isolierungsmethoden wurden Chloroplasten erhalten, die 1 — 2% des Trockengewichtes an flavonoiden Substanzen ent-hielten 2> 3 . A u d i ZAPROMETOV u n d K O L A N K O V A 4 , MONTIES 5 s o w i e OETTMEIER u n d HEUPEL 6 k o n n t e n in isolierten Chloroplasten verschiedener Pflanzen-arten das Vorkommen von Flavonoiden nachweisen. Untersuchungen zur Biosynthese von Zimtsäuren7-10, Flavonoiden4*11 und Stilbenen7 zeigten, daß

Sonderdruckanforderungen an Dr. G. WEISSENBÖCK, Bota-nisches Institut der Universität zu Köln, D-5000 Köln 41, Gyrhofstr. 15.

Chloroplasten am Stoffwechsel phenylpropanoider Verbindungen maßgeblich beteiligt sind. Die durch Lichtinduktion gesteigerte Flavonoidbiosynthese dürfte demnach in sehr engem Zusammenhang mit der Stoffwechselaktivität der Chloroplasten stehen.

Die den Chloroplasten entsprechenden, bei Etiole-ment auftretenden Etioplasten wurden bei dieser Fragestellung bisher kaum untersucht12. Da die Be-lichtung etiolierter Blätter zur Umwandlung der Etioplasten in grüne Chloroplasten führt, wäre ein Vergleich der beiden Piastidentypen hinsichtlich ihres Flavonoidgehaltes von Interesse. Das Vorkommen flavonoider Verbindungen in dem einen oder in bei-den Organellen oder mögliche Unterschiede im Fla-vonoidmuster könnten Hinweise auf eine licht- und/ oder plastidenstrukturabhängige Regulation der Fla-vonoidbiosynthese geben und auf eine physiologi-sche Funktion in diesen Zellkompartimenten hinwei-sen.

Zur Untersuchung dieser Frage eignet sich Avena sativa, da die Etio- und Chloroplastenisolierung aus ca. 10 Tage alten Blättern gut durchführbar und auch gut reproduzierbar ist.

Im 1. Teil unserer Untersuchungen wurden aus etiolierten Blättern Etioplasten isoliert und aus die-sen die im Etioplastenstroma eingebetteten Prolamel-larkörper13 erhalten. In der vorliegenden Arbeit wird über das Vorkommen von Flavonoiden in etio-lierten Blättern, isolierten Etioplasten und Prolamel-larkörpern berichtet.

FLAVONOIDE IN ETIOPLASTEN VON AVENA SATIVA L. 1 2 1 7

Material und Methoden

a) Pflanzenmaterial und Anzuchtbedingungen Avena sativa L. (Sorte 1: „Futter-Weißhafer" und

Sorte 2: „Gelbhafer"), bezogen von der Fa. Oberthür, Köln, wurde in Kulturschalen aus Kunststoff in feuch-ter Einheitserde 8 — 10 Tage bei 23 °C und völliger Dunkelheit herangezogen. Zur Isolierung der Etiopla-sten wurden 15 — 20 cm lange Primärblätter verwendet, die zum Teil noch von Koleoptilen umhüllt waren.

b) Isolierung der Etioplasten und Prolamellarkörper (C. LÜTZ, in Vorbereitung)

Das im Sicherheitslicht (Interferenzfilter, 510 nm, Schott & Gen.) geerntete Blattmaterial wurde unter Zugabe von Medium A (0,4 M Sucrose, 0,025 M Tris-(hydroxymethyl) -aminomethan, 0,01 M MgS04 • 7 H20, 4-10~3M Mercaptoäthanol, 0,1% Ficoll, der pH-Wert wurde mit HCl auf 7,8 eingestellt) in einer Dreiwalzen-mühle homogenisiert. Das Homogenat wurde durch Fil-trieren von groben, unzerstörten Blattresten gereinigt und das Filtrat zur Entfernung von Zellwänden und Kernen 5 min bei 250 g (Stock, Kühlzentrifuge, 4 °C) zentrifugiert. Das anfallende Sediment (Sx) wurde ver-worfen und der Überstand (Ut) 15 min bei 500 g zen-trifugiert. Das Sediment (S2) wurde gesammelt und der Überstand (Ü2) wiederum 10 min bei 750 g zen-trifugiert. Das resultierende Sediment (S3) wurde ebenfalls gesammelt und der Überstand (Ü3) verwor-fen. Die beiden Sedimente (S2, S3) wurden vereinigt und in 400 ml Medium resuspendiert.

Die Suspension, die eine Anreicherung von Etio-plasten darstellt, wurde 10 min bei 1000 g zentrifu-giert. Bei diesem Waschvorgang wurden z. B. Riboso-men und Cytoplasma von der Etioplastenfraktion abge-trennt. Das anfallende Sediment (S4) wurde in 4 ml Medium A resuspendiert: Es stellt die Etioplasten-suspension dar, deren Reinheit licht- und fluoreszenz-mikroskopisch kontrolliert wurde.

Die so erhaltene Etioplastensuspension wurde unter anderem zur Isolierung von Prolamellarkörpern ver-wendet. Zu diesem Zweck wurde die Etioplastensuspen-sion durch Zugabe von Medium A auf ein Volumen von 10 ml gebracht und jeweils 2 ml dieser Suspen-sion auf einen Saccharosegradienten geschichtet. Der Gradient bestand aus einer 13 —60-proz. Saccharose-lösung in Medium A. Die Zonenzentrifugation erfolgte in der Stock-Zentrifuge bei 1800 g und 15 min. Die ge-bandeten Etioplasten wurden nach Anstechen der Zen-trifugenröhrchen aus Nitrozellulose durch Austropfen gesammelt. Die auf diese Weise erhaltene Fraktion hochgereinigter Etioplasten wurde durch Überführen in Wasser osmotisch geschockt. Durch viermaliges Wa-schen in der Ultrazentrifuge (15 min 25000 g), wobei die anfallenden Sedimente aus Membranen jeweils wie-der mit Wasser aufgenommen wurden, konnten die Pro-lamellarkörper-Membranen vom Plastidenstroma ge-trennt werden. Das zum Schluß resultierende Sediment bestand aus gewaschenen Tubuli der Prolamellarkör-per. Es diente als Ausgangsmaterial zur Extraktion von Flavonoiden aus Prolamellarkörpern.

Die Protochlorophyllbestimmungen wurden nach ANDERSON und BOARDMAN 14 durchgeführt.

c) Extraktion der Flavonoide Sowohl vom etiolierten Blattmaterial, wie auch von

der Etioplastensuspension und vom Prolamellarkör-perpräparat wurden wäßrige Extrakte zur Flavonoid-bestimmung hergestellti. Die lyophilisierten Blätter (ca. 10 Gramm) wurden 3-mal mit kochendem Wasser überbrüht, die Lösungen dekantiert und gesammelt.

Die verbliebenen Blattrückstände homogenisierte man mit wenig Wasser mittels „Ultraturrax". Nach kurzem Erhitzen des Homogenats und erneuter Wasser-zugabe blieb dieses 12 h bei 4 °C zur vollständigen Extraktion der Flavonoide stehen, wurde sodann fil-triert und quantitativ ausgewaschen. Die vereinigten Filtrate wurden am Rotavapor bei 45 °C unter Zugabe von wenig Butanol bis fast zur Trockne eingeengt. Der erhaltene Sirup wurde sodann mit einem Überschuß an Methanol dest. versetzt und 12 h bei —18 °C in der Tiefkühltruhe aufbewahrt. Der entstandene Nieder-schlag wurde abfiltriert und intensiv mit Methanol nach-gewaschen, die Lösung eingeengt und in Wasser aufge-nommen. Etioplasten und Prolamellarkörper wurden als Suspension sofort mit reichlich kochendem Wasser ver-setzt und nach dem Abkühlen 12 h bei 4 °C gehalten. Anschließend wurde filtriert, der Rüdestand gut nach-gewaschen und das Filtrat auf 3 — 5 ml am Rotavapo» eingeengt.

Die erhaltenen Flavonoidextrakte wurden anschlio ßend über Polyamidsäulen (20 x 20 cm, Polyamid SC 6V Macherey und Nagel) unter photometrischer Kontrolle mit dem Uvicord I bei 254 nm mit dest. Wasser gerei-nigt. Nach ca. 300 ml Wasserdurchlauf war das Eluat zucker- und proteinfrei und enthielt keine Flavonoide. Zur anschließenden Flavonoidelution verwendete man 100-proz. Methanol.

Die hier durchgeführte Heißwasserextraktion der Flavonoide wurde mit einer Kalt-Methanolextraktion verglichen und für y4t;emz-Flavonoide als qualitativ und quantitativ gleichwertig befunden. Die Heißwasser-extraktion bietet gegenüber einer alkoholischen den großen Vorteil, daß lipophile Komponenten, wie Chlo-rophylle und Lipide kaum mitextrahiert werden und diesbezügliche Reinigungsprozesse wegfallen. d) Isolierung der Flavonoide

Die Anreicherung und Gewinnung der Flavonoide aus den vorgereinigten Extrakten erfolgte durch säulen-und dünnschichtchromatographische Methoden 1 5 , 1 6 . Als Adsorbens für die Säulenchromatographie diente wieder Polyamid SC 6 von Macherey & Nagel. Die Elution begann mit dest. Wasser, dem dann schritt-weise Methanol hinzugefügt wurde. Auf einer 2. Poly-amidsäule erfolgte die weitere Auftrennung der Kom-ponenten mittels Chloroform-Methanolgradienten unter photometrischer Kontrolle am Uvicord I bei 254 nm. Die erhaltenen Fraktionen wurde 1- und 2-dimensional dünnschichtchromatographisch auf Cellulose-DC-Platten (Cellulose „Avicel" für DC von Macherey & Nagel) in geeigneten Laufmitteln (s. Tab. I) analysiert und gereinigt.

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e) Identifizierung

Die Charakterisierung und Identifizierung der Flavo-noide erfolgte durch UV-spektroskopische und dünn-schichtchromatographische Analysen, Behandlung der Chromatogramme mit verschiedenen Sprühreagentien (Tab. I) und durch saure Hydrolyse 16. Hinsichtlich der Spektralanalyse der in dest. Methanol gelösten Flavonoide folgten wir der bei MABRY et al.15 be-schriebenen Methode. Die Identifizierung der Flavonoid-zucker gelang nach saurer Hydrolyse — die Flavonoid-lösung wurde mit einer gleichen Menge 2 N HCl ver-setzt und unter Rückfluß bei 100 °C gehalten — durch Co- und Mischchromatographie mit authentischen Zuk-kern. Es wurde aufsteigend auf mikrokristallinen Cel-luloseplatten („Avicel") mit dem Fließmittel Butanol/ Pyridin/Wasser (3 : 1 : 1, v/v) unter Verwendung der Überlauftechnik 16 chromatographiert. Die Färbung er-folgte mit Anilinphthalat.

f) Quantitative Flavonoidbestimmung

Eine definierte Menge der Flavonoidlösungen wurde auf in den Fließmitteln CEW und 10% E vorgereinigte Cellulose-DC-Platten aufgetragen und in 10% E entwik-«celt; die erhaltenen Substanzzonen wurden mit Metha-iol eluiert und am PMQ II-Spektralphotometer von Zeiss

gemessen. Die Extinktionsmessung erfolgte nach Zu-gabe von 3 Tropfen 5-proz. AlCl3-Lösung in die Küvet-ten beim Al-Chelatmaximum der Flavonoide und wurde an Hand einer Kämpferol-Al-Chelat-Eichkurve in Ge-wichtseinheiten Kämpferoi angegeben.

Ergebnisse

A. Flavonoidanalysen

Am 2-dimensionalen Dünnschichtchromatogramm (DC) der Blattextrakte beider Avena-Sorten sind 3 Flavonoidhauptkomponenten und 1—2 Neben-komponenten nachzuweisen. Im Vergleich dazu zeigt das entsprechende DC der Etioplastenextrakte eben-falls Flavonoide, die auf Grund ihrer chromatogra-phischen Eigenschaften und ihres Fluoreszenz-verhaltens mit den Blattflavonoiden identisch sind (Tab. I ) , aber in sehr unterschiedlichen Men-genverhältnissen vorliegen (Abb. 1) .

Die in dieser Arbeit untersuchten Avena-Sorten 1 und 2 unterscheiden sich durch die Flavonoidkom-ponenten F4 und F5 : Sorte 1 enthält das Flavonoid F4 , das in seinem chromatographischen Verhalten dem in Sorte 2 vorkommenden Flavonoid F5 sehr ähnlich ist (Tab. I) . F4 bzw. F5 ist die in isolierten Etioplasten gegenüber vergleichbaren Blättern jeder Sorte stark angereicherte Komponente. Die Flavo-noide^ und 3 sind in Sorte 1 und 2 identisch und

erscheinen in den Etioplasten schwächer als im Blatt (Abb. 1) .

10

CM

cn 0,5-§ LU o

0,5 1,0

5% E

1,0

LU u

0,5 1,0 5% E -

Abb. 1. Zweidimensionale Dünnschichtchromatogramme (mi-krokristalline Cellulose) von Extrakten etiolierter Blätter (a) und Etioplasten (b) von Avena sativa. Sorte 1: Flavonoid F4 , Sorte 2 : Flavonoid F 5 , Flavonoide F1;2,3 in beiden Sorten

identisch.

Zur Anreicherung der ^vena-Flavonoide wurde der aus etiolierten Blättern der Sorte 2 hergestellte Extrakt säulenchromatographisch an Polyamid im Wasser-Methanol-Gradienten aufgetrennt. Es wurden 3 Flavonoid-Hauptfraktionen erhalten: Fraktion 1 enthielt fast nur das Flavonoid F x , Fraktion 2 die beiden Flavonoide F2 und F3 und die Fraktion 3 das Flavonoid F5 . Die weitere Reinigung erfolgte über eine 2. Polyamidsäule im Chloroform-Methanol-Gra-dienten oder über DC bis zur chromatographischen Reinheit. Die Bande F4 der Sorte 1 wurde durch präparative Dünnschichtchromatographie auf mikro-kristallinen Cellulose-Platten mit den Fließmitteln CEW 3 : 2 und 5% E aus dem Etioplastenextrakt Et 9 rein erhalten.

Das Fluoreszenzverhalten und die UV-Spektral-analyse (Tab. I u. II) der ^fena-Flavonoide läßt

FLAVONOIDE IN ETIOPLASTEN VON AVENA SATIVA L. 1 2 1 9

Tab. I. Eigenschaften der Flavonoide aus etiolierten Blättern und Etioplasten von Avena sativa L. (Sorte 1 und 2) .

hi?F-Werte Farbreaktionen (350 nm) Komponente LM 1 2 3 4 5 6 unb. NHS A1C13 PbAc BR

FI 35 53 75 47 64 d g ggr g g F2 30 52 52 28 61 d hg grg dg gor F3 22 47 52 28 61 d hg grg dg gor F4 (Sorte 1) 31 16 — — — d hgrg grg dg gor F5 (Sorte 2) 35 22 60 34 43 d hg grg dg gor nach Säure-

behandlung * Flhy a + (b) 50/(63) 8/(28) 50/ (50) — 46/(56) 55/ (66) F2hy (20)/35 (8)/22 (42) /60 (17)/34 (8)/43 —

F3hy 20/(35) 8/(22) 42/ (60) 17/(34) 8/ (43) —

Vitexin/Saponaretin (isoliert aus Fagopyrum) 20/35 8/22 42/60 17/34 8/43 40/40

Apigenin (authentisch) — 0 85 35 2 53

Apigenin-7-rhamno-glucosid — — 65 40 42 —

(authentisch)

Fließmittel (mikrokristalline Cellulose-DC) : LM 1 = CEW 3 : 2 (Chloroform/Eisessig/Wasser, 3 : 2, wassergesättigt), LM 2 = 5% E (5% Essigsäure), LM 3 = BEW (Butanol/Eisessig/Wasser, 6 : 1 : 2 ) , LM 6 = CEW 2 : 1 (Chloroform/Eisessig/ Wasser, 2 : 1, wassergesättigt). Fließmittel (Polyamid-DC, nach EGGER17) : LM 4 = E I I (Chloroform/Methanol/Methyläthyl-keton/Acetylaceton, 25 : 10 : 5 : 1), LM 5 = E I (Wasser/Methanol/Methyläthylketon/Acetylaceton, 10 : 3 : 3 : 1), alles v/v. Farbreaktionen (350 nm) : d = absorbierend, ggr = gelbgrün fluoreszierend, grg = grüngelb fluoreszierend, g = gelb fluo-reszierend, hg = hellgelb fluoreszierend, dg = gelblich dunkel fluoreszierend, gor == gelborange fluoreszierend, unb. = un-behandelt. Sprühreagenzien: A1C13 = 10-proz. methanol. Lösung, NHS = Ammoniak-Dämpfe, PbAc = bas. Bleiacetat (methanolisch, ge-sättigt), BR = Benedict's Reagenz (nach REZNIK und EGGER18).

Komponente Produkte der Säurebehandlung * identifiziert als: (vgl. Formelschema)

F,

F2

F3 F4 F5

Flavonoid Apigenin-7-methoxy ( ? ) -8-C-gly (u) cosyl (-6-C-gly) Saponaretin (Vitexin) Vitexin (Saponaretin) Kämpferoi Saponaretin (Vitexin)

Zucker Rhamnose, Glucose

Arabinose Glucose (? )

Apigenin-7-methoxy ( ? ) -8-C-rhamnosylglucosylgly (u) cosid Apigenin-6-C-arabinosylglucosid Apigenin-8-C-glucosylglucosid Kämpferol-3- (glycosid, acyliert ?) Saponaretin

* Nebenprodukte der Säurebehandlung in Klammern.

F l a v o n - o d e r F l a v o n o l d e r i v a t e mit ä h n l i c h e m Sub -st i tut ionsmuster a m F l a v o n o i d - B - R i n g e rwar ten . D i e h R p W e r t e d e r K o m p o n e n t e n F j — F 3 deuten auf Bi -o d e r T r i o s i d e h in , w ä h r e n d F 4 u n d F 5 sich w i e

M o n o g l y c o s i d e verhalten ( T a b . I ) . A u s d e r Li teratur l i egen n u r w e n i g e A n g a b e n

ü b e r das V o r k o m m e n v o n F l a v o n o i d e n in Avena sativa v o r . HARBORNE u n d HALL 1 9 w i e s e n in grü -n e n Blättern d ieser P f lanze 2 F l a v o n o i d e nach, d ie als d i e G l y c o f l a v o n e A p i g e n i n - 8 - C - r h a m n o s y l g I u c o -sid u n d - 8 - C - a r a b i n o s y l h e x o s i d identi f iz iert w u r d e n . MILLS u n d HENDERSON 2 0 berichten ü b e r das V o r -

k o m m e n e ines p - C u m a r o y l - K ä m p f e r o l - T r i o s i d s in et io l ierten J u e n a - K o l e o p t i l e n .

C h a r a k t e r i s i e r u n g d e r F l a v o n o i d e F 1 ? F 2 , F 3 , F 4 u n d F 5

V e r b i n d u n g F j e r g i b t i m V e r g l e i c h mi t den v o n MABRY et al.15 a n g e g e b e n e n D a t e n e inen K u r -venver lau f ähnl i ch e i n e m A p i g e n i n - 7 - g l y c o s i d . D i e Interpre tat i on d e r U V - S p e k t r e n ( T a b . I I ) zeigt f re ies 5 - u n d 4 - H y d r o x y l u n d e ine Subst i tut ion b z w . das F e h l e n des 3 - H y d r o x y l s an . D i e R e a k t i o n mit Na-t r ium-Ace ta t deutet auf e in substituiertes 7 - H y d r o x y l

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hin. 1/2-stdg. saure Hydrolyse von F4 ergibt ein Hy-drolyseprodukt Fihy, dessen 7-OH auch weiterhin substituiert ist und 2 Zuckerkomponenten Rhamnose und Glucose gleicher Farbintensität am DC. In 5-stdg. Säurebehandlung (20-proz. HCl) wurde ver-sucht, den Substituenten der 7-Position abzuspalten, was nicht gelang. Auch konnte keine weitere Hydro-lyse beobachtet werden. Mit zunehmender Hvdro-lysedauer erfolgt jedoch eine Isomerisierung: Die Komponente F^y spaltet in 2 isomere Formen auf, F i h y ( a ) und F lhy(b), die beide in 5-proz. Essigsäure ähnlich den aus Fagopyrum esculentui7i-K.e\mb\äl-tern isolierten C-Glycosylen Vitexin und Saponaretin laufen (vgl. MARGNA et al.21) und deren Spektren nahezu identisch sind (Tab. I u. II ) .

Weitere Säurebehandlung der DC-getrennten und gereinigten Isomeren Fn,y(a) und Fihy(b) ergab eine neuerliche, wechselseitige Isomerisierung. Aus der einen Komponente Fihy(a) entsteht Fjhy(b) und um-gekehrt (in 5 Fließmitteln geprüft). Die native Aus-gangssubstanz Fj dürfte somit ein in 7-Stellung. wahrscheinlich mit einer Methylgruppe substituier-tes (Methoxyleffekt17 in chloroformhaltigen Fließ-mitteln, Tab. I) 5-, 4'-Dihydroxy-C-rhamnosyl-gluco-sylgly (u) cosid darstellen. Bei der sauren Hydrolyse von Fj entsteht nach ca. ] / 2 h Komponente Fihy(a) 5 m i t niedrigeren Rj.-Werten (LM 1, 2, 3, 5, 6 ; Tab. I) als das mit zunehmender Hydrolysezeit gebildete Isomere Fn,y(b), so daß ein 8-C-glycofla-von zu erwarten ist.

Nach den geschilderten Analysedaten wird für die Verbindung Fx ein Apigenin-7-methoxy (?)-8-C-rhamnosylglucosylglycosid (-glucosid ?) oder ein -8-C-glucosylrhamnosylglycosid, ein Flavon-C-Trio-sid also, angenommen.

OH 0

F1 : R,= R2=H, R3=CH3?J R 4 =-C-g ly (u ) -0 -g lu -0 - rha oder - g l y - 0 - rha-0-glu

F2 : R r R3= R4=H ' R2 = - C - g l u - 0 - a r a

F3 : R,= R2=R3=HJ R4= -C-glu-O-glu

: R2=R3=R4=H, R,= - 0 - ( g l y - a c y l "?)

F 5 : R,= R3^ R4=H, R 2 r -C-glu

V e r b i n d u n g F2 u n d F3 : Die UV-Spektral-analyse, saure Hydrolyse und das Fluoreszenzver-halten zeigt ein 5.7.4'-Trihydroxyflavon, ein Api-genin-Derivat an. Bei 1 h saurer Hydrolyse entstehen aus Verbindung F2 zwei weniger polare Komponen-ten, eine Hauptkomponente, die sich bei co- und mischchromatographischem Vergleich in 5 Fließ-mitteln (Tab. I) wie das Saponaretin aus Fago-pyrum escu/en/u/n-Keimblättern 21 verhält und Spu-ren einer Nebenkomponente, die wie Vitexin läuft. Als Zuckerkomponente wurde Arabinose erhalten. Das bei der Säurebehandlung freigesetzte Saponare-tin (Apigenin-6-C-glucosid) isomerisiert zu Vitexin (Apigenin-8-C-glucosid). Verbindung F2 ist somit ein Apigenin-6-C-arabinosylglucosid.

Das UV-Spektrum der Verbindung F3 ist nahezu identisch mit dem der Verbindung F 2 , bei saurer Hydrolyse entsteht aber Vitexin als Hauptkompo-nente und Saponaretin als Nebenkomponente; als Zucker wurde Glucose nachgewiesen. F3 ist demnach ein Apigenin-8-C-glucosylglucosid.

V e r b i n d u n g F4 (y4uena-Sorte 1), die in iso-lierten Etioplasten gegenüber etiolierten Blättern stark angereichert ist, zeigt neben den beiden für Flavone und Flavonole charakteristischen Absorp-tionsmaxima einen zusätzlichen peak bei 307 nm. Fluoreszenzeigenschaften, Spektraldaten und saure Hydrolyse weisen auf ein in 3-Position substituier-tes Flavonol mit freien 5.7.4'-Hydroxylgruppen hin (Tab. I u. II). Durch saure Hydrolyse in 1 N HCl er-folgt die Abspaltung des Substituenten der 3-Stel-lung bereits nadi 5 — 8 min vollständig 22, wobei eine im Tageslicht sichtbare intensive Gelbfärbung der Lösung auftritt. Das mit Essigsäure-Athylester aus-geschüttelte Aglycon F4iiy läuft in 4 verschiedenen Fließmitteln (Co- und Mischchromatographie) iden-tisch mit authentischem Kämpferoi. Auch die Fluo-reszenzeigenschaften stimmen überein (Tab. III) .

Die verbliebene Wasserphase wurde nicht analy-siert. Die unhydrolysierte Komponente F4 läuft in CEW 3 : 2 und 5% E wie Kämpferol-3-glucosid und zeigt große Ähnlichkeit mit dem UV-Spektrum des Astragalins 1(5, der Kurvenverlauf weicht jedoch im Spektralbereich um 290 — 310 nm (Amax. bei 307 nm), wo Zimtsäuren Absorptionsmaxima haben, erheblich ab. Weitere Analysen müssen zeigen, ob hier neben Zuckerkomponente (n) auch eine Zimt-säure substituiert ist. MILLS und HENDERSON 2 0 wie-sen in etiolierten /4i>ena-Koleoptilen ein mit p-Cu-marsäure acyliertes Kämpferol-Triglycosid nach.

FLAVONOIDE IN ETIOPLASTEN VON AVENA SATIVA L. 1 2 2 1

Tab. II. Spektralmaxima der Flavonoide von Avena sativa (Methodik MABRY et al.I5).

Fi Flhy(a) + (b) Flhy(a) Flhy(b)

MeOH 267, 299 + , 330 265, 297 + , 332 266, 296 + , 330 268, 329 NaOMe 247 + , 267, 297 + , 385 241+ ,266 , 298, 386 A1C13 275, 304, 344, 388 272, 301, 344, 385 A1C13/HC1 275, 303, 339, 386 272, 301, 344, 383 NaOAc 267, 292, 386 264, 3 0 0 + ,382 265, 297 + , 387 266, 295 + , 388 NaOAc/H3BOs 267, 2 9 2 + ,342 266, 300 + , 341 266, 296 + , 340 268,337

F2 Fähy F4 F5

MeOH 268, 2 9 9 + ,330 268, 331 264, 295 + , 307, 347 266, 330 NaOMe 276, 320, 393 276, 326, 392 271,310, 322 + , 397 276, 327, 394 A1C13 274, 300, 343, 380 274, 300, 347, 379 270, 301, 347, 393 275, 301, 346, 379 AlClj/HCl 276, 300, 343, 378 276, 298, 339, 379 271, 299, 341, 394 277, 300, 340, 377 NaOAc 275, 304, 3 3 1 + , 3 9 2 274, 299 + , 355 270, 306, 385 276,307, (329), 390 NaOAc/H3BOs 268, 3 0 6 + ,343 269, 3 0 0 + ,341, 404 + 264, 306, 350 270, 341,405 +

MeOH = dest. Methanol, NaOMe = Natriummethylat, A1C13 = Aluminiumchlorid in Methanol, A1C13/HC1 = voriges Spek-trum nach Salzsäurezugabe, NaOAc = Natriumacetat, Na0Ac /H : i B0 3 = voriges Spektrum nach Borsäurezugabe. + = Schul ter, Werte in nm angegeben.

Tab. III. Vergleich der \\Rf Werte und Farbreaktionen des Flavonoid-Aglycons der Komponente F4 mit authentischem Kämpferoi.

Komponente hi?f-Werte Farbreaktionen (350 nm)

LM 6 7 8 4 unb. NHS A1C13 PbAc BR

F4hy 46 52 8 26 g g grg g grg Kämpferoi 46 52 8 26 g g grg g grg

(authentisch)

Fließmittel: LM 6, LM 4 und Sprühreagenzien (Farbreaktionen) wie in Tab. I, LM 7 — Forestal (Eisessig/Wasser/HCl, 30 : 10 : 3) und LM 8 = 15% E (15% Essigsäure) auf mikrokristallinem Cellulose-DC.

V e r b i n d u n g F5 ist die in Etioplasten der Avena-Sorte 2 angereicherte Flavonoidkomponente. Nach chromatographischen (Mischchromatographie in 5 Fließmitteln), fluoreszenzoptischen und spektro-skopischen Analysedaten ist F5 identisch mit dem Apigenin-6-C-glucosid Saponaretin aus Fagopyrum (Tab. I u. II) . F5 ist unhydrolisierbar und isomeri-siert in 2 N HCl, 100 °C, zu Vitexin.

B. Flavonoidgehalt in Blättern und Etioplasten

Zur quantitativen Flavonoidbestimmung und Er-mittlung der Relation zwischen der in isolierten Etio-plasten angereicherten Komponente F4 (Avena-Sorte 1) bzw. F5 (Sorte 2) und den Flavonoiden F^ 2 und 3 (vgl. Abb. 1) wurden die Blatt- und Etioplasten-extrakte mittels 1-dimensionaler Dünnschichtchro-matographie (Fließmittel 10-proz. Essigsäure) in zwei Banden aufgetrennt, die als Bu und A0 bezeich-net sind. Bu ist das Flavonoid F4 = Kämpferol-3-(glycosid, acyliert?) der Sorte 1 bzw. das Flavo-

noid F5 = Saponaretin der Sorte 2. A0 ist ein Ge-misch aus den Flavonoiden F^ g und 3 (in beiden Sorten identisch) : Fx = Apigenin-7-methoxy (? ) -8-C-rhamnosylglucosylglycosid, F2 = Apigenin-6-C-arabinosylglucosid, F3 = Apigenin-8-C-glucosylglu-cosid.

Der aus den photometrisch gemessenen Extink-tionswerten (s. Methodik) für Bu und A0 errechnete Bu/A0-Quotient gibt die starke relative Anreicherung der Flavonoide F4 bzw. F5 in Etioplasten wieder (Abb. 2) : Das B„/A0-Verhältnis ist in Etioplasten um den Faktor 51,5 und 17 (bei Sorte 1, Et 9,10) und um den Faktor 5,6 und 7,2 (bei Sorte 2, Et 14, 15) größer als im vergleichbaren Blatt (BI 9, 10 bzw. 14, 15). Der Flavonoidgehalt (in Mikrogramm pro Gramm Trockengewicht) isolierter Etioplasten (Sorte 2) ist 2,7- und 1,9-mal so groß als im Blatt (Tab. IV) . Dabei beträgt der Anteil des Saponare-tins (F5) am Gesamtflavonoidgehalt in Etioplasten 21 und 24,3%, im Blatt dagegen nur 3,5 und 5,5% (Abb. 3 ) .

1 2 2 2 G. WEISSENBÖCK, I. FLEING UND H. G. RUPPEL

180

n

109

32

n Et 9 BI 9 Et 10 B110 Et 14 B114 Et 15 B115

Abb. 2. Relative Anreicherung der Flavonoid-Bande B u in Etioplasten (Et) gegenüber vergleichbaren Blättern (BI) als Bu/A0-Quotient dargestellt. BU = F4 (Kämpferol-Derivat) in Et 9,10 und BI 9,10 (Sorte 1), B U = F 5 (Saponaretin) in Et 14,15 und BI 14,15 (Sorte 2) , A 0 = F 1 ) 2 ) 3 in beiden Sorten

identisch.

o < TO 8 20-o > a E a £ 10-ü

D CD [ _ _ ] _ EtIA BIIA Et 15 B115

Abb. 3. Anteil der Bande BU = F5 (Saponaretin) am Gesamt-flavonoidgehalt in Blättern und Etioplasten.

Tab. IV. Flavonoid- und Protochlorophyllgehalt in Blättern und Etioplasten von Avena sativa (Sorte 2 ) . (Mikrogramm

pro Gramm Trockengewicht.)

Flavonoid Proto-chlorophyll

A0 B u A 0 + B u

Et 14 116 37 153 366 BI 14 53 3 56 19 Et 15 132 35 167 709 BI 15 86 3,1 89,1 19,5

Abkürzungen: Et = Etioplasten, BI = Blätter, A 0 = Flavo-noide FJ,2.3 , B u = Flavonoid F5 .

Da das gemessene Protochlorophyll (Tab. IV) nur in den Etioplasten lokalisiert ist, kann aus den ermittelten Protochlorophyll- und Flavonoidwerten der auf die Etioplasten entfallende Anteil am Ge-samtblattflavonoid bestimmt werden:

CßrFEt . 1 0 o = FlavonoidET (nach RADUNZ 2 3 )

CBI = Protochlorophyllgehalt der Blätter, C£t = Protochlorophyllgehalt der Etioplasten, Fßi = Fla-vonoidgehalt der Blätter, Fst = Flavonoidgehalt der Etioplasten.

80

c Ol tn -2 6 0 -Q-0 ÜJ c

1 40-c o > 0

1 2 0 -

Abb. 4. Anteil des in isolierten Etioplasten nachweisbaren Blattflavonoids. GF = Gesamtflavonoid ( A 0 + B u ) , BU = F5 (Sa-

ponaretin), A0 = F1,o,3 •

Flavonoid^ bezeichnet den prozentualen Anteil der Blattflavonoide, der in isolierten Etioplasten ent-halten ist. Die Berechnung zeigt (Abb. 4 ) , daß das Saponaretin (F5 = BU) zu 64 bzw. 31% und die Fla-vonoide F1_3 (A0) ZU 11,3 und 4,25% in den Etio-plasten vorliegen. Der Anteil des in Etioplasten nachweisbaren Gesamtflavonoids vom Blatt (GF = Summe F ^ ^ s ) beträgt 5,2 und 14,2%.

C. Flavonoidvorkommen in isolierten Prolamellar-körpern

Um die Frage zu beantworten, ob Flavonoide tat-sächlich innerhalb der Etioplasten lokalisiert sind, wo sie entweder im Plastidenstroma enthalten oder auch an die Prolamellarkörper gebunden sein kön-nen, wurden aus Etioplasten (Sorte 2) Prolamellar-körper isoliert. Diese wurden in gleicher Weise wie Blätter und Etioplasten auf Flavonoide extrahiert und dünnschichtchromatographisch analysiert (vgl. Methodik). Bei der DC-Trennung im Fließmittel 10-proz. Essigsäure konnten mit AlCl3-Sprühreagenz 2 Flavonoidbanden sichtbar gemacht werden, die das gleiche Fluoreszenzverhalten zeigen und im glei-chen Rp-Bereich liegen, wie die bekannten Blatt- und Etioplastenflavonoide Fi> 2 und 3 (h/?f 39, 48 in 10% E) . Im Rp-Bereich der Verbindung F5 ist dagegen kein Flavonoid nachweisbar.

n rn G F G F B u B u A 0 A 0

FLAVONOIDE IN ETIOPLASTEN VON AVENA SATIVA L. 1 2 2 3

Diskussion

Die beobachtete Anreicherung von Flavonoiden in isolierten Etioplasten spricht für eine Lokalisation der Komponenten in den Piastiden. Bei Avena-Sorte 1 ist vor allem das Flavonoid F 4 , ein Kämp-ferol-Derivat, bei Sorte 2 das Flavon-C-glycosid Saponaretin, F s , in den Etioplasten gegenüber etio-lierten Blättern stark angereichert. So wurden 64 bzw. 31% des im gesamten Blatt enthaltenen Saponaretins in den Etioplasten nachgewiesen, wäh-rend die Flavonoide Fj, 2 und 3 zum geringeren Teil zu 11,3 und 4,25% in Etioplasten enthalten sind.

Der in unseren Analysen erbrachte Nachweis von Flavonoiden in Etioplasten schließt die Möglichkeit einer Kontamination der Piastiden durch Zellwand-oder Vakuolenflavonoide nicht völlig aus. Während des Isolierungsvorgangs im wäßrigen Isoliermedium könnten sich Flavonoide adsorptiv an die Etiopla-stenmembran anlagern und nicht mehr auswaschbar sein. Sie wären dann in Etioplastenextrakten nach-weisbar. Hiergegen spricht jedoch die in Etioplasten beobachtete selektive Anreicherung der Flavonoid-komponenten F4 bzw. F5 .

Unsere Annahme, daß es sich bei den in Avena-Etioplasten nachgewiesenen Flavonoiden um etio-plasteneigene Pigmente handelt, wird auch durch den Flavonoidnachweis in Prolamellarkörperpräpa-raten gestützt. Zur Gewinnung der Prolamellarkör-per wurden isolierte Etioplasten nach osmotischem Schock durch mehrfaches Waschen mit dest. Wasser sowohl vom Plastidenstroma, wie auch weitgehend von Primärthylakoiden und Plastidenaußenmembra-nen befreit (C. LÜTZ, in Vorbereitung). Durch diese Waschvorgänge wird die Möglichkeit einer Kontamination durch außerplastidäre Flavonoide ausgeschlossen. Nach unseren bisherigen Unter-suchungen sind die im Prolamellarkörper nachweis-baren Flavonoide mit den Etioplastenflavonoiden identisch. Allerdings konnte die in ganzen Etiopla-sten angereicherte Flavonoidkomponente F5 hier nicht gefunden werden.

Das Vorkommen von Zimtsäurederivaten und Fla-vonoiden in Piastiden wurde auch in Untersuchun-g e n v o n ZAPROMETOV u n d K O L A N K O V A 4 , M O N -TIES 5 , KINDL 7 s o w i e OETTMEIER u n d HEUPEL 6 an Chloroplasten verschiedener Pflanzenarten nachge-wiesen. Aus Chloroplastenpräparationen von Spinat erh ie l ten OETTMEIER u n d HEUPEL 6 zwe i n i e d e r -molekulare Fraktionen — Flavonoidglycoside und

p-Cumarsäurederivate — die mit dem Primärakzep-torkomplex im Photosystem I des photosynthetischen Elektronentransports in Beziehung stehen könnten. Andere Autoren isolierten aus Chloroplasten Co-faktoren der Photophosphorylierung vom Flavontyp ( v g l . D i s k u s s i o n b e i OETTMEIER u n d HEUPEL 6 ) . In eigenen Untersuchungen an Impatiens 2 konnten aus Chloroplasten, die durch eine Isolierungsmethode im organischen Lösungsmittelgemisch gewonnen wur-den, ein hoher Anteil von 1,5 — 2% des Trocken-gewichts an flavonoiden Verbindungen, verschiedene Zimtsäure-Ester und Flavonolglycoside, erhalten werden.

Die Lokalisation von Flavonoiden innerhalb der Etioplasten und Chloroplasten könnte ein Hinweis darauf sein, daß sie auch dort synthetisiert werden. ZAPROMETOV u n d K O L A N K O V A 4 e rh ie l ten durch Untersuchungen an Teekeimlingen Hinweise für die Synthese von Catechinen in Chloroplasten. SATO und Mitarb. 8 - 1 0 setzten mit isolierten Chloroplasten p-Cumarsäure zu Kaffeesäure um. Besonders inter-essant sind die Untersuchungen von KINDL 7, der zeigen konnte, daß signifikante Mengen von p-Cu-marsäure und dem Stilben Hydrangenol in Chloro-plasten von Hydrangea macrophylla vorliegen. Bei der Biosynthese pflanzlicher Stilbene ist — ähnlich wie bei den Flavonoiden — das Zusammenwirken verschiedener Biosynthesewege zur Bildung der bei-den aromatischen Ringe A und B erforderlich. Durch Inkubation isolierter Hydrangea-Chloroplasten mit Tyrosin bzw. p-Cumarsäure, Acetat und verschiede-nen Cofaktoren gelang es, Hydrangenol in vitro zu erhalten. Dabei zeigte sich eine signifikante Kor-relation zwischen der Hydrangenolsynthese und den in den Chloroplasten vorliegenden Ammoniak-Lyase-Aktivitäten (PAL und TAL), beides Schlüssel-enzyme des Phenylpropanstoffwechsels. Chloropla-sten sind also zur Biosynthese aromatischer Systeme aus Acetateinheiten befähigt. Auch KANNANGARA et al.12 konnten zeigen, daß isolierte Gerstenplasti-den unter Einbau markierten Acetats den Aromaten 6-Methylsalicylsäure bilden. Als Synthesemechanis-mus für den aromatischen Ring wird eine Kopf-Schwanz-Kondensation von Acetyl-CoA mit Malo-nyl-CoA — homolog der Biosynthese des Flavo-noid-A-Rings24 — angenommen. Die Syntheseakti-vität isolierter Piastiden ist stark vom Entwicklungs-zustand abhängig: Etioplasten bilden nur wenig 6-Methylsalicylsäure; hingegen steigt die Einbaurate von Acetat und damit die Syntheseaktivität während

1 2 2 4 FLAVONOIDE IN ETIOPLASTEN VON AVENA SATIVA L. 1224

der Thylakoidbildung ergrünender Piastiden stark an. Ausdifferenzierte Chloroplasten zeigen dann keine Aktivität mehr. Diese Untersuchungen 12 las-sen den engen Zusammenhang zwischen der Stoff-wechselaktivität von Piastiden verschiedenen Diffe-renzierungsgrades und der Regulation einzelner Schritte des Sekundärstoffwechselweges deutlich er-kennen.

Ziel unserer weiteren Untersuchungen ist es, zu-nächst das Flavonoidmuster der Etioplasten und

1 G . WEISSENBÖCK U. H . REZNIK, Z . P f l a n z e n p h y s i o l . 6 3 , 1 1 4 [ 1 9 7 0 1 .

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4 M . N . ZAPROMETOV u . S . V . KOLANKOVA. D o k l . A k a d . Nauk. SSR 176, 4703, ref. C. A. 67, 114369r [1967].

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10 M . S A T O , N . K A T O U. M . HASEGAWA, B o t . M a g . T o k y o 8 1 , 356 [1968].

1 1 H . A . STAFFORD, P h y t o c h e m . 8 , 7 4 3 [ 1 9 6 9 ] . 1 2 C . G . K A N N A N G A R A , K . W . HENNINGSEN, P . K . STUMPF U.

D. VON WETTSTEIN, Eur. J. Biochem. 21, 334 [1971]. 13 B. E. S. GUNNING, Protoplasma 60, I I I [1965].

Chloroplasten von Avena sativa aufzuklären und miteinander zu vergleichen und davon ausgehend die Stoffwechselaktivität der Piastiden im Flavonoid-metabolismus, sowie mögliche physiologische Funk-tionen der Plastidenflavonoide zu analysieren.

Fräulein G. SACHS danken wir für die korrekte tech-nische Assistenz.

Diese Arbeit wurde aus Mitteln des Sonderfor-schungsbereichs 74 unterstützt.

14 J. M. ANDERSON u. N. K. BOARDMAN, Aust. J. Biol. Sei. 1 7 , 9 3 [ 1 9 6 4 ] ,

1 5 T . J. M A B R Y , K . R . MARKHAM, a n d M . B . THOMAS, T h e Systematic Identification of Flavonoids. Springer-Verlag. Berlin-Heidelberg-New York 1970.

1 0 D . STRACK U. H . REZNIK, Z . P f l a n z e n p h y s i o l . 6 7 , 1 7 1 [ 1 9 7 2 ] .

1 7 K . EGGER, i n : E . STAHL, D ü n n s c h i c h t c h r o m a t o g r a p h i e . 2. Aufl., S. 655, Springer-Verlag, Berlin-Heidelberg-New York 1967.

1 8 H . REZNIK U. K . EGGER, Z . A n a l y t . C h e m . 1 8 3 , 1 9 6 [ 1 9 6 1 ] .

1 9 J . B . HARBORNE U. E . HALL, P h y t o c h e m . 3 , 4 2 1 [ 1 9 6 4 ] , 2 0 W . L . MILLS U. J. H . M . HENDERSON, P l a n t P h y s i o l . 4 4 .

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