Forschungseinrichtung Strukturanalyse - mh-hannover.de · CD-, UV/VIS- und Fluoreszenz...
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Forschungsbericht 2015 42 ZENTRALE FORSCHUNGSEINRICHTUNGEN Forschungseinrichtung Strukturanalyse Direktor: Prof. Dr. Dietmar J. Manstein Ansprechpartner: Dr. Roman Fedorov Tel.: 0511/532-3702 • E-Mail: [email protected] • www.mh-hannover.de/structureanalysis.html Tel: 0511/532-3705 • E-Mail: [email protected] Keywords: Myosin, Aktin, Tropomyosin, Troponin, Formin, Dynamin, G-Proteine, Apaf-1, Apoptose, UDP-Glucose-Pyrophosphorylase, 2',5'-Oligoadenylatsynthetase, Peroxidase, Allosterie, Enzymkinetik, Wirkstoffdesign, Röntgenstrukturanalyse, analytische Ultrazentrifugation, Thermophorese, T-Sprung Forschungsprofil Die Arbeiten der Forschungseinrichtung für Strukturanalyse zielen auf ein besseres Verständnis der dynamischen Wechselwirkung von Proteinen und ihren Liganden. Da die Geschwindigkeit der Sequenzierung ganzer Genome die Möglichkeiten der Sequenzierungszentren bei weitem übertrifft die Sequenz zu annotieren und die Funktion der Gen- produkte zu beschreiben, besteht im „postgenomischen Zeitalter“ ein großer Bedarf nach schnellen und effizienten Methoden, die es erlauben sowohl die Struktur wie auch die Funktion neuer Genprodukte experimentell zu bestimmen. Weitere Herausforderungen bei der Bestimmung der Funktion einzelner Genprodukte ergeben sich aus der Tatsache, dass posttranslationale Modifikationen und die Wechselwirkung mit anderen Proteinen, Stoffwechselprodukten und Naturstoffen, die Bestandteile unserer täglichen Nahrung sind, die Funktion vieler Genprodukte in erheblichem Um- fang beeinflussen. Deshalb müssen neue Wege gefunden werden, die neben gentechnischen Verfahren zur gezielten Ausschaltung von Genen, Aufschluss über die Funktion von Genprodukten und die Bedeutung von Wechselwirkun- gen zwischen Proteinen geben können. In diesem Zusammenhang spielt die Wirkstoffforschung in Kombination mit strukturbiologischen Ansätzen und molekularen Simulationsmethoden eine wichtige Rolle. Strukturbiologische Versuchsreihen mit einer Vielzahl von Verbindungen stellen einen wichtigen Teil eines jeden Wirkstoffforschungspro- gramms dar. Der zusätzliche Einsatz molekularer Simulationsmethoden kann die Suche nach neuen Wirkstoffen und die gezielte Verbesserung bekannter Leitstrukturen erleichtern und beschleunigen. Die methodische Schwerpunkte der Forschungseinrichtung bilden, neben der Röntgenkristallstrukturanalyse, Verfahren zur schnellen zeitaufgelösten CD-, UV/VIS- und Fluoreszenz Spektroskopie, die dynamische Differenz-Kalorimetrie (DSC), die optisch erzeugte Thermophorese (Microscale Thermophoresis), die isotherme Titrationskalorimetrie (ITC), Einzelmolekülmikroskopie, hydrodynamische Methoden wie die analytische Ultrazentrifugation mit Absorptions- und Fluoreszenzdetektion und Methoden zur Computermodellierung von Proteindynamik und Enzym-Liganden Wechselwirkungen. In der Lehre sind die wissenschaftlichen Mitarbeiter der Forschungseinrichtung an den Studiengängen Biologie, Biomedizin, Biochemie und an der Ausbildung von Doktoranden im Rahmen der HBRS School of Excellence beteiligt. Ausgewähltes Forschungsprojekt Allosterische Regulation der UDP-Zucker Pyrophosphorylasen als Ausgangspunk zur Entwicklung neuer anti-Parasitärer Therapien UDP-Zucker Pyrophosphorylasen spielen eine zentrale Rolle in der zellulären Kohlenhydratbiosynthese. Als metaboli- sche Schalter unterliegen sie einer umfangreichen Regulierung. Die Aufklärung der katalytischen und regulatorischen Mechanismen dieser Enzyme ist für das grundlegende Verständnis der zellulären Kohlenhydratbiosynthese und ebenso für die Entwicklung von Strategien zur gezielten Blockade dieser Enzyme essentiell. UDP-Zucker Pyrophosphorylasen
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Forschungsbericht 201542
Zentrale Forschungseinrichtungen
Forschungseinrichtung Strukturanalyse
�� Direktor: Prof. Dr. Dietmar J. Manstein �� Ansprechpartner: Dr. Roman Fedorov
Tel.: 0511/532-3702 • E-Mail: [email protected] • www.mh-hannover.de/structureanalysis.html Tel: 0511/532-3705 • E-Mail: [email protected]
�� Keywords: Myosin, Aktin, Tropomyosin, Troponin, Formin, Dynamin, G-Proteine, Apaf-1, Apoptose, UDP-Glucose-Pyrophosphorylase,
2',5'-Oligoadenylatsynthetase, Peroxidase, Allosterie, Enzymkinetik, Wirkstoffdesign, Röntgenstrukturanalyse, analytische
Ultrazentrifugation, Thermophorese, T-Sprung
Forschungsprofil
Die Arbeiten der Forschungseinrichtung für Strukturanalyse zielen auf ein besseres Verständnis der dynamischen Wechselwirkung von Proteinen und ihren Liganden. Da die Geschwindigkeit der Sequenzierung ganzer Genome die Möglichkeiten der Sequenzierungszentren bei weitem übertrifft die Sequenz zu annotieren und die Funktion der Gen-produkte zu beschreiben, besteht im „postgenomischen Zeitalter“ ein großer Bedarf nach schnellen und effizienten Methoden, die es erlauben sowohl die Struktur wie auch die Funktion neuer Genprodukte experimentell zu bestimmen. Weitere Herausforderungen bei der Bestimmung der Funktion einzelner Genprodukte ergeben sich aus der Tatsache, dass posttranslationale Modifikationen und die Wechselwirkung mit anderen Proteinen, Stoffwechselprodukten und Naturstoffen, die Bestandteile unserer täglichen Nahrung sind, die Funktion vieler Genprodukte in erheblichem Um-fang beeinflussen. Deshalb müssen neue Wege gefunden werden, die neben gentechnischen Verfahren zur gezielten Ausschaltung von Genen, Aufschluss über die Funktion von Genprodukten und die Bedeutung von Wechselwirkun-gen zwischen Proteinen geben können. In diesem Zusammenhang spielt die Wirkstoffforschung in Kombination mit strukturbiologischen Ansätzen und molekularen Simulationsmethoden eine wichtige Rolle. Strukturbiologische Versuchsreihen mit einer Vielzahl von Verbindungen stellen einen wichtigen Teil eines jeden Wirkstoffforschungspro-gramms dar. Der zusätzliche Einsatz molekularer Simulationsmethoden kann die Suche nach neuen Wirkstoffen und die gezielte Verbesserung bekannter Leitstrukturen erleichtern und beschleunigen. Die methodische Schwerpunkte der Forschungseinrichtung bilden, neben der Röntgenkristallstrukturanalyse, Verfahren zur schnellen zeitaufgelösten CD-, UV/VIS- und Fluoreszenz Spektroskopie, die dynamische Differenz-Kalorimetrie (DSC), die optisch erzeugte Thermophorese (Microscale Thermophoresis), die isotherme Titrationskalorimetrie (ITC), Einzelmolekülmikroskopie, hydrodynamische Methoden wie die analytische Ultrazentrifugation mit Absorptions- und Fluoreszenzdetektion und Methoden zur Computermodellierung von Proteindynamik und Enzym-Liganden Wechselwirkungen. In der Lehre sind die wissenschaftlichen Mitarbeiter der Forschungseinrichtung an den Studiengängen Biologie, Biomedizin, Biochemie und an der Ausbildung von Doktoranden im Rahmen der HBRS School of Excellence beteiligt.
Ausgewähltes Forschungsprojekt
Allosterische Regulation der UDP-Zucker Pyrophosphorylasen als Ausgangspunk zur Entwicklung neuer anti-Parasitärer TherapienUDP-Zucker Pyrophosphorylasen spielen eine zentrale Rolle in der zellulären Kohlenhydratbiosynthese. Als metaboli-sche Schalter unterliegen sie einer umfangreichen Regulierung. Die Aufklärung der katalytischen und regulatorischen Mechanismen dieser Enzyme ist für das grundlegende Verständnis der zellulären Kohlenhydratbiosynthese und ebenso für die Entwicklung von Strategien zur gezielten Blockade dieser Enzyme essentiell. UDP-Zucker Pyrophosphorylasen
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sind aufgrund ihrer zentralen Position in der Kohlenhydratbiosynthese und Spezies-spezifische Unterschiede auch attraktive Ziele für die Entwicklung neuer Medikamente in eukaryotischen Parasiten. Dieses Projekt verfolgt das Ziel die allosterischen Mechanismen zu beschreiben, welche die UDP-Zucker Pyrophosphorylasen in der Familie der Trypanosomatida regulieren (Abbildung 1).
Abb. 1: Vollständiger enzymatischer Zyklus der Leishmania major UGP (Führing et al., ACS Cat. 2013). Im inneren Kreis: Übersicht der LmUGP Strukturen entlang des Reaktionspfades. Im äußeren Kreis: Zoom auf Aktives Zentrum. Segmente C, D und E zeigen zusätzlich HOMO (blau) und LUMO (grün) Molekülorbitale.
Erhaltende Informationen bilden die Basis für die Identifikation spezifischer Inhibition [Abbildung 2]. Methodisch sollen strukturelle Informationen verschiedener kinetischer Stadien der Enzyme, mit kinetischen und hydrodynami-schen Daten kombiniert werden. Basierend auf diesen Informationen werden spezifische Mutationen eingeführt und auf strukturelle und kinetische Konsequenzen analysiert. Das Arbeitsprogramm basiert auf vorläufigen Ergebnissen unserer Arbeitsgruppe auf diesem Gebiet, die seine Durchführbarkeit und die Effizienz der gewählten experimentellen Ansätze zeigen.
Forschungsbericht 201544
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Originalpublikation:Führing, JI, Cramer JT, Schneider J, Baruch P, Gerardy-Schahn R and Fedorov R. A Quaternary Mechanism Enables the Complex Biological Functions of Octameric Human UDP-glucose Pyrophosphorylase, a Key Enzyme in Cell Metabolism. (2015) Sci. Rep. 5:9618; DOI:10.1038/srep09618.
Führing J, Cramer JT, Routier FH, Lamerz A-C, Baruch P, Gerardy-Schahn R and Fedorov R. Catalytic mechanism and allosteric regulation of UDP-glucose pyrophosphorylase from Leishmania major. (2013) ACS Catalysis. 3:2976-2985.
Führing J, Damerow S, Fedorov R, Schneider J, Münster-Kühnel A-K and Gerardy-Schahn R. Octamerization is essential for enzymatic function of human UDP-glucose pyrophosphorylase. (2013) Glycobiology 23(4): 426–437.
�� Projektleitung: Fedorov, Roman (Dr.); Kooperationspartner: Gerardy-Schahn, Rita (Prof. Dr.), Führing, Jana (Dr.), Cramer, Johannes, Routier, Françoise (Prof. Dr.) Institut für Zelluläre Chemie, MHH; Förderung: HiLF, DFG
Weitere Forschungsprojekte (mit Stichtag 01.12.2015)
Allosterische Regulation der UDP-Zucker Pyrophosphorylasen als Ausgangspunk zur Entwicklung neuer anti-Parasitärer Therapien�� Projektleitung: Fedorov, Roman (Dr.); Kooperationspartner: Gerardy-Schahn, Rita (Prof. Dr.), Führing, Jana (Dr.),
Cramer, Johannes, Routier, Françoise (Prof. Dr.) Institut für Zelluläre Chemie, MHH; Förderung: DFG
Struktur und Funktion der Motordomäne der Typ III Restriktionsendonuklease EcoP15I�� Projektleitung: Alves, Jürgen (Prof. Dr.); Kooperationspartner: Reuter, Monika (PD, Dr.), Charité, Berlin; Förderung:
Land Niedersachsen
Structural Charaterization of UDP-glucose and UDP-sugar pyrophosphorylases�� Projektleitung: Fedorov, Roman (Dr.); Kooperationspartner: Gerardy-Schahn, Rita (Prof. Dr.), Führing, Jana (Dr.),
Routier, Françoise (Prof. Dr.) Institut für Zelluläre Chemie, MHH; Förderung: HILF, MHH
Activation mechanism of 2’-5’-oligoadenylate synthetase and related enzymes�� Projektleitung: Fedorov, Roman (Dr.); Kooperationspartner: Manstein, Dietmar J. (Prof. Dr.), Institute for Biophysical
Chemistry, MHH; Kay-Fedorov, Penelope (Dr.) Institute for Virology, MHH; Nikulin, Alexey (Dr.), Institute of Protein
Abb. 2: Durch mechanistische Analyse rational identifizierte allosterische Inhibitiorbindungsstelle. (Cramer et al., Manuskript in Vorbereitung). (A) “Pocket 1” Moleküloberflachendarstellung. (B) Änderung der enzymatischen Aktivität nach Mutation in “Pocket 1”.
Forschungsbericht 2015 45
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Originalpublikationen
Abstracts2015 wurden 26 Abstracts publiziert.
Research, Russian Academy of Science, 142290 Pushchino, Moscow; Förderung: Land Niedersachsen
Time-resolved characterization of Dye-decolorizing Peroxidases�� Projektleitung: Manstein, Dietmar J. (Prof. Dr.) und Chizhov, Igor (Dr.); Kooperationspartner: Meents, Alke (Dr.),
DESY, Hamburg; Förderung: Land Niedersachsen
