: FO'RSCHUNGSZENTRUM JOLICH GmbH

Institut für Nuklearchemie

Polymergestützte Synthese von unsymmetrischen n.c.a. e3,75SelSelenoethern

(KFAJ==

zur Markierung von Aminosäuren

Jörn Schmaljohann

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Berichte des Forschungszentrums Jüli(:h ; 3108 ISSN 0944-2952 Institut für Nuklearchemie Jül-3108 D 38.(Diss. Universität Köln)

Zu beziehen durch: Forschungszentrum Jülich GmbH· Zentralbibliothek D-52425 Jülich . Bundesrepublik Deutschland Telefon: 02461/61-61 02 . Telefax: 02461/61-61 03 . Telex: 833556-70 kfa d

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Polymergestützte Synthese von unsymmetrischen n.c.a. [73,75SelSelenoethern zur Markierung von Aminosäuren

Jörn Schmaljohann

Abstract The synthesis of n.c.a. selenium-73/75 labelIed methionine and of a selenoalkylation agent have been performed according to a reaction including a primary, polymer supported alkylation step. The selenium-75 was produced through the 75As(p,n)-process and separated as [15Se l selenium dioxide by thermochromatography. The [75Se lSe 0 2 - s ublimate was dissolved in hydrochloric acid and reduced with sulfur dioxide to obtain elemental n.c.a. selenium-75, which was extracted into benzene. Reaction of the elemental n.c.a. selenium-75 with polymeric bound triphenylphosphine led to the formation of the corresponding [75Se l triphenylphosphinselenide in a nearly quantitative yield. In the primary, heterogenous alkylation step the [75Selmethylselenotriphenylphosphonium salt (TPPSeMeOTf) was formed via methyltriflate as alkylation reagent. The phosphonium salt was hydrolised under alkaline condi tions yielding [75 Sel methylselenide anion (MeSe -) in a radiochemical yield of up to 70%. The asymmetrical [75Selselenoethers were synthesized in homogenous phase through the reaction of the [75Se lMeSe- with propylhalides in radiochemical yields up of to 55%. In the case of n.c.a. [75Selselenomethionine, which was produced for the first time, the secondary alkylation step led to the formation of protected [75Se l selenomethionine by using N-BOC-2-amino-4-bromo-butyric acid ethylester as precursor and [75Se lMeSe- (generated from the polymeric bound [75Se l TPPSeMeOTf) as [75Se l selenation re agent . After acid hydrolysis the selenomethionine was obtained in radiochemical yields of 30%, in a radiochemical purity of about 95%, and with a specific activity >185 GBq/mmol. A selenium-75 labelIed prosthetic group was synthesized in radiochemical yields of 48% by the reaction of l-chloro-3-iodopropane with the [75Selselenation reagent [75Se lMeSe-. This reagent was prepared from the polymeric bound [75Se lTPPSeMeOTf using TBAH. For labelling amino functions via [75Selselenoalkylation the [75Selselenated propyl chloride has to be transfered into the iodide with sodium iodide, which was performed in radiochemical yields of 90%. After the reaction of [75Se l-l-iodo-3- (methylseleno)propane with butylamine or with

~-, O-protected lysine in DMF at [75Se l methylselenopropylated products were radiochemical yields of 95% and 90%, respectively.

80°C obtained

the in

Inhaltsverzeichnis

1. Einleitung

1.1. Bedeutung kurzlebiger Positronenstrahler in

Medizin und Pharmakologie

1.2. Nukleare Eigenschaften und Produktion von Selen-

73 und Selen-75

1.3. Chemische und kinetische Aspekte bei Reaktionen

mit trägerfreien (n.c.a.) Radionukliden

1.4. Methoden zur Radioselenierung organischer

Moleküle

1. 5.

2.

3.

3.1.

Zum Einbau von Selenomethionin in Proteine

Problemstellung

Experimenteller Teil

Bezugsnachweis und Qualität der verwendeten

Chemikalien

3.2. Geräte zur Charakterisierung der dargestellten

Verbindungen

3.3. Darstellung inaktiver Ausgangs- und Referenz­

substanzen

3.4. Radiosynthesen

3.4.1. Produktion von n.c.a. Selen-75

3.4.1.1. Arsentrioxid als Targetmaterial

3.4.1.2. Kupferarsenlegierung als Targetmaterial

3.4.2. Darstellung von elementarem n.c.a. Selen-75

3.4.3. Durchführung der n.c.a. [75Se jSelenierungs-

1

1

6

10

13

19

21

23

23

25

26

36

36

36

37

39

reaktionen 40

3.4.3.1. [75Se jSelenierung des polymergebundenen Tri-

phenylphosphins 40

3.4.3.2. Darstellung von n.c.a. [75Se jSelenomethionin 41

3.4.3.3. Darstellung von [75Se jMethylselenopropyl-

derivaten 44

3.5.

3.5.1.

3.5.2.

3.6.

3.7.

4.

4.1.

4.2.

4.2.1.

4.2.2.

Analytische Verfahren

Radiohochdruckfüssigkeitschromatographie

Radiodünnschichtchromatographie

Bestimmung der spezifischen Aktivität von

[75Se ]Selenomethionin

Bestimmung der radiochemischen Reinheit

Ergebnisse und Diskussion

Targetaufarbeitung

Synthese von n.c.a. [75Se ]Selenoethern

synthesestrategie zur Darstellung von

[75Se ]Selenoethern

Konzept der polymergestützten synthese von

[75Se ]Selenoethern

4.2.2.1. Darstellung des polymergebundenen n.c.a.

[75Se ] Triphenylphosphinselenids

4.2.2.2. Reaktion zum [75Se ]Alkylselenotriphenyl-

phosphoniumsalz (Primäralkylierung)

4.2.2.3. Baseninduzierte Spaltung des [75Se ]Methyl-

46

46

49

50

52

53

53

59

59

61

63

66

selenotriphenylphosphoniumsalzes 72

4.2.2.4. Abhängigkeit der [75Se ]Selenoetherbildung vom

Alkylierungsagens 74

4.3. synthese von n.c.a. [75Se ]Selenomethionin 77

4.3.1. 2-Aminobutyrolacton als Markierungsvorläufer 78

4.3.1.1. Abhängigkeit der radiochemischen Ausbeute an

[75Se ]Selenomethionin von der Base 79

4.3.1.2. Abhängigkeit der radiochemischen [75Se ]Seleno-

methioninausbeute vom Lösungsmittel 82

4.3.1.3. Abhängigkeit der radiochemischen Ausbeute des

[75Se ]Selenomethionins von der Eduktkonzentra-

4.3.2.

tion, Reaktionszeit und Reaktionstemperatur

O-Tosylhomoserinmethylester als Markierungs­

vorläufer

84

86

4.3.2.~. Abhängigkeit der Ausbeute des [75Se ]Seleno­

methioninmethylesters von der Tetrabutyl-

ammoniumhydroxidkonzentration und vom Solvens 88

4.3.2.2. Abhängigkeit der [75Se ]Selenomethioninester-

bildung von der Eduktkonzentration und Reak-

tionszeit 90

4.3.2.3. Hydrolyse des [75Se ]Selenomethioninmethylesters 93

4.3.3. Synthese des [75Se ]Selenomethionins ausgehend

von N-BOC-2-Amino-4-brombuttersäureethylester 95

4.3.3.~. Abhängigkeit der Ausbeute an [75Se ]-N-BOC­

Selenomethioninethylester von der Tetra-

butylammoniumhydroxidkonzentration

4.3.3.2. Abhängigkeit der radiochemischen Ausbeute an

[75Se ]-N-BOC-Selenomethioninethylester von der

Eduktkonzentration

4.3.3.3. Abhängigkeit der radiochemischen Ausbeute an

[75Se ]-N-BOC-Selenomethioninethylester von der

Reaktionszeit

4.3.3.4. Abspaltung der Schutzgruppen des [75Se ]-N-BOC­

Selenomethioninethylesters unter Bildung von

96

98

~oo

[75Se ]Selenomethionin ~O~

4.4. [75Se ]SelenoalkYlierungsagenzien ~05

4.4.~. Synthese von [75Se ]Methylselenopropylderivaten ~05

4.4.2. optimierung der Synthese des [75Se]-~-(Methyl-

seleno)-3-chlorpropans ~09

4.4.3. synthese des [75se]-~-(Methylseleno)-3-iod-

propans ~~3

4.4.4. [75Se ]Selenoalkylierung von Aminoverbindungen ~~5

4.4.4.~. [75Se ]Selenoalkylierung von ~-Butylamin ~~5

4.4.4.2. [75Se ]Selenoalkylierung von Lysin ~~9

5. Zusammenfassung 124

Anhang: Abkürzungsverzeichnis ~28

6. Literatur 130

1. Einleitung

1.1. Bedeutung kurzlebiger positronenstrahler in Medizin und

Pharmakologie

Durch die Entwicklung leistungsfähiger, computergesteuerter

Tomographen gewinnen bildgebende Verfahren der Nuklearmedizin

(Computer-Tomographie (CT), Kernspin-Tomographie (MRI),

Single-Photon-Emission-Tomographie (SPET), Positronen-Emis­

sions-Tomographie (PET» zunehmend an Bedeutung. Während

durch CT und MRI die Morphologie des Gewebes dargestellt

wird, können durch SPET und PET biochemische Prozesse in vivo

er faßt werden. Bei der PET ist im Vergleich zu der SPET eine

Quantifizierung der Radioaktivitätsverteilung möglich. Durch

die Markierung von Biomolekülen und Pharmaka mit kurzlebigen

Positronenstrahlern kann deren verteilung im Organismus

nicht-invasiv mittels PET bildlich dargestellt und die

Kinetik der Radiopharmaka im jeweiligen zielorgan gemessen

werden [1-3].

Dem Zerfall von Positronenstrahlern liegt ein Neutronen­

unterschuß des Radionuklids gegenüber dem stabilen Isotop zu­

grunde. Durch Umwandlung eines Protons in ein Neutron und

gleichzeitiger Emission eines Positrons und eines Neutrinos

können sich diese Atomkerne stabilisieren. Das Positron ver­

liert seine hohe kinetische Energie entlang seines Bremsweges

durch Ionisation und Anregung der umgebenden Materie. Der

Bremsweg beträgt wenige Millimeter in Wasser bzw. Gewebe.

Nach seiner Thermalisierung rekombiniert das Positron mit

einem Elektron. Aus der Rekombination resultieren zwei

y-Quanten von je 511 keV (entsprechend der Ruhemasse eines

Elektrons), die vorwiegend unter einem Winkel von 180· emit­

tiert werden. y-Strahlen dieser Energie können Gewebe leicht

durchdringen und extern detektiert werden. Grundlage der PET

ist die Messung dieser Annihilationsstrahlung. Dies geschieht

durch ringförmig angeordnete NaI(TI)- bzw. BGO-Kristall­

detektoren außerhalb des Körpers. Da pro Zerfall eines

1

Positronenstrahlers zwei y-Quanten winkelkorreliert emittiert

werden, kann durch die Koinzidenzschaltung gegenüberliegender

Detektoren die räumliche verteilung der applizierten Akti­

vität in vivo quantitativerfaßt werden [4]. Zusätzlich kön­

nen durch zeitabhängige Messungen auch schnelle in vivo Kine­

tiken des Pharmakons bestimmt werden. Das räumliche Auf­

lösungsvermögen, welches u. a. von der Positronenenergie des

strahlers abhängig ist, beträgt bei modernen PET-Kameras

3-5mm. Durch die PET können nano- bis picomolare Mengen des

Tracers pro cm3 detektiert werden. Damit ist die Empfindlich­

keit im Vergleich zur NMR-spektroskopie um den Faktor 103-106

größer [3].

Für die medizinische Anwendung ist der Tägergehalt des

Tracers von entscheidender Bedeutung. Dies muß schon bei der

Produktion des Radionuklids beachtet werden. Die Auswahl

einer geeigneten Kernreaktion und Teilchenenergie ermöglicht

bei bekannter Anregungsfunktion die meist trägerfreie (no­

carrier-added, n.c.a.) Darstellung der Positronenstrahler.

Die daraus resultierende hohe spezifische Aktivität bedingt

ein Arbeiten mit kleinsten Massen (ng-I'g). Bei der Appli­

kation solch kleiner Stoffmengen sind meist keine pharmako­

dynamischen Effekte zu erwarten, so daß auch zentralwirksame

oder toxische Substanzen für die PET verwendet werden können.

Ein weiterer Vorteil ist, daß durch einen praktisch träger­

freien Radiotracer eine Beeinflussung des Stoffwechsels nicht

zu erwarten ist [1,5]. Aufgrund der relativ kurzen Halbwerts­

zeiten der verwendeten Positronenstrahler ist die Strahlen­

belastung des Patienten meist geringer als bei einer normalen

Röntgenaufnahme [3]. Dadurch sind auch wiederholungsmessungen

innerhalb kurzer zeitinterwalle prinzipiell möglich. somit

kann die PET auch in der Therapiekontrolle eingesetzt werden.

Die kurzen Halbwertszeiten machen den Einsatz hoher Anfangs­

aktivitäten (im GBq-Bereich) notwendig. Aufgrund der inten­

siven 511keV Annihilationsstrahlung ist deshalb eine aus­

reichende Abschirmung während der Synthese erforderlich, so

daß die Synthesen automatisiert und ferngesteuert in

2

Bleizellen durchgeführt werden müssen. Für eine effiziente

Synthese und Qualitätskontrolle mit solchen kurzlebigen

Radionukliden stehen maximal nur etwa drei Halbwertszeiten

zur Verfügung [6].

Ausgangspunkt für die

biochemische Modelle,

gruppen beinhalten [1]:

Entwicklung von PET-Radiopharmaka sind

die im wesentlichen folgende Stoff-

- Stoffwechselsubstrate oder deren Analoga

- Enzym-Inhibitoren

- Rezeptorbindende Liganden

- Antikörper-Antigen-Systeme

Körpereigene Substanzen und Pharmaka sind im wesentlichen aus

C-, H-, N-, 0-, P- und S-Atomen aufgebaut. Für die Markierung

von Radiopharmaka mit Positronenstrahlern eignen sich somit

die Isotope 11C, 13N, 150 und 30p besonders, da sich mit Aus­

nahme von vernachlässigbaren Isotopieeffekten die bioche­

mischen Eigenschaften der Substanzen nicht ändern. Der Ein­

satz wird aber durch die sehr kurzen Halbwertszeiten (s. Ta­

belle 1.1-1) stark eingeschränkt. Im Fall des 150 sind dies

einfach synthetisierbare Moleküle wie [ 150]02' [150]H20,

[150]C02, [ 150]CO, [ 150]Butanol [7,8]. Auch für 13N resul­

tieren aus der kurzen Halbwertszeit nur wenige Umsetzungsmög­

lichkeiten der Targetprodukte [13N]N2' [13N]N02 -, [13N]N03 -,

[13N]NH3. Eine Möglichkeit ist die Umsetzung von [13N]NH3 zu

Aminosäuren [9,10]. Aufgrund der längeren Halbwertszeit des

11C sind hier auch Mehrstufensynthesen möglich. Die Bestrah­

lungsprodukte ([11C]C02' [11C]CH4' [llC]HCN) können durch

einfache und schnelle Reaktionen zu primären und sekundären

Markierungsvorläufern ([ 11C] CH3I, [llC] COCI2' [llC] Ca rb on­

säuren, [llC]Methyltriflat) umgesetzt werden, so daß sich ein

breites Spektrum von 11c-Markierungmöglichkeiten ergibt [zur

Übersicht siehe 1,12].

3

Tab.1.1-1: Physikalische Eigenschaften der wichtigsten Pos i­

tronenstrahler für PET [1]

Nuklid t% Zerfallsart Eß+ max Baupt-y-Linie

emin] (%) [keV] (re!.%) [keV] (%)

llc 20,3 ß+ (99,8) 960 (100) 511 (199,6)

EC (0,2) 13N 9,96 ß+ (100) 1190 (100) 511 (200) 150 2,03 ß+ (99,9) 1723 (100) 511 (200)

EC (0,1) 18F 109,7 ß+ (96,9) 635 (100) 511 (193,8)

EC (3,1) 30p 2,5 ß+ (100) 3245 (100) 511 (200)

75Br 96 ß+ (75,5) 1740 (82) 286 (91,6)

EC (24,5) 511 (151) 73Se 426 ß+ (65) 1320 (91,3) 511 (130)

EC (35) 361 (97)

Zeitaufwendige Synthesen oder die Messung langsamer Pharmako­

kinetiken erfordern längere Halbwertszeiten des Positronen­

strahlers . Zu diesem Zweck werden für die Markierung soge­

nannte Analogtracer wie 18F, 75Br und 73Se eingesetzt [1].

Der Grundgedanke der Fremdmarkierung ist die ähnliche Sterik,

z.B. eines H- und F-Atoms bzw. einer Methylgruppe und Br. Die

Änderung der chemischen Eigenschaften der markierten Verbin­

dung aufgrund der unterschiedlichen Ladungsverteilung bedingt

aber eine erneute Prüfung der physiologischen und pharmako­

logischen Wirksamkeit des Radiopharmakons. Dennoch hat sich

das 18F zu einem der wichtigsten Markierungsisotope ent­

wickelt. Dieses beruht auf der sehr stabilen Kohlenstoff­

Fluor Bindung und den physikalischen vorteilen des Isotops.

Hier sind die niedrige Positronenenergie des ß+ und die deut­

lich längere Halbwertszeit gegenüber l1C hervorzuheben (siehe

Tab. 1.1-1), so daß die höchste Auflösung erzielt werden kann

und zeitaufwendigere Synthesen oder PET-Messungen möglich

sind.

4

Positronen emittierende Schwefel isotope haben zu kurze Halb­

wertszeiten für PET-Anwendungen «3s). Da Selen und Schwefel

sowohl in ihrer räumlichen Ausdehnung als auch chemisch sehr

ähnlich sind, kann das 73Se hier als Analogtracer für ein

S-Atom eingesetzt werden. Durch die stärkere POlarisierung

der C-Se-Bindung wird jedoch im markierten Molekül eine

Änderung der Ladungsverteilung hervorgerufen. Der Unterschied

ist aber nur geringfügig, so daß das physiologische Verhalten

eines Pharmakons sich durch die Fremdmarkierung häufig nicht

wesentlich ändert. Das Selen-73 kann darüber hinaus zur syn­

these isosterer Verbindungen, z . B. im Austausch gegen eine

CH2-Gruppe, eingesetzt werden.

5

1.2. Nukleare Eigenschaften und Produktion von Se1en-73 und

Se1en-75

Für nuklearmedizinische Anwendungen sind das Selen-73 und Se­

len-75 die beiden relevanten Selenisotope. Tabelle 1.2-1

zeigt ihre wichtigsten nuklearen Eigenschaften. Selen-75 zer­

fällt zu 100% durch Elektroneneinfang (EC), so daß ein Ein­

satz in der PET nicht möglich ist. Eine Forderung an ein

ideales Radionuklid für SPET ist eine dominierende y-Linie in

dem Energiebereich von 100-300keV, so daß Selen-75 aufgrund

der 265keV Haupt-y-linie mit 58% Häufigkeit dort eingesetzt

werden kann. Weil der Patient aber wegen der langen physika­

lischen Halbwertszeit bei einer langsamen Ausscheidungs­

kinetik einer hohen Strahlendosis ausgesetzt würde, wird Se­

len-75 als Markierungsnuklid für Radiopharmaka heute nicht

mehr verwendet. Aufgrund der langen Halbwertszeit und der

niederenergetischen y-Strahlung hat das Selen-75 jedoch Be­

deutung für die Syntheseentwicklung und in vitro-Studien als

Substitut für Selen-73 Verbindungen erlangt, da es trägerfrei

(n.c.a.) am Zyklotron erzeugt werden kann [13].

Tab.1.2-1: Nukleare Eigenschaften von Selen-73 und Selen-75

Nukleare Eigenschaft Se1en-73 Selen-75

Halbwertszeit 7,lh 120d

Zerfallsart ß+ (65) EC (100)

(% Häufigkeit) EC (35)

Haupt-y-linie 511 (130) 265 (58)

[keV] (% HäUfigkeit) 361 (97)

Tochternuklid Arsen-73 Arsen-75

Zerfallsart des EC (tJ, = 80d) stabil

Tochternuklids

6

Selen-73 zerfällt mit einer Halbwertszeit von 7, 1h zu 65%

durch einen ß+-Zerfall und zu 35% durch Ee und ist somit, an­

ders als Selen-75, für PET geeignet. Die vorteile gegenüber

den anderen wichtigen PET-Nukliden sind in der langen Halb­

wertszeit begründet. Durch die Markierung geeigneter MOleküle

könnten Stoffwechsel funktionen mit langsamen Kinetiken (z.B.

Immunreaktionen, proteinsynthese) untersucht werden. Des­

weiteren besteht durch die lange Halbwertszeit die Möglich­

keit, das Radiopharmakon zur medizinische Anwendung an Kli­

niken zu verschicken, die nicht über ein Zyklotron verfügen

(Satellitensystem). Nachteilig bei dem Einsatz von Selen-73-

markierten PET-Pharmaka ist jedoch die begleitende y-Strah­

lung, die durch den Ee-Zerfall des instabilen Tochternuklids

Arsen-73 (100% Ee) und Selen-73 (35% Ee) entsteht. Diese zu­

sätzliche Strahlenbelastung des Patienten ist nicht unbe­

trächtlich [13].

Die wichtigsten Kernreaktionen zur Bildung von Selen-73 und

Selen-75 sind in Tabelle 1.2-2 dargestellt. Die höchsten Aus­

beuten an Selen-75 werden durch die n,y-Reaktion im Kern­

reaktor erzielt. Da durch das Ausgangsmaterial (Target) inak­

tives Selen-74 in großen Mengen zugegen ist, ist sie jedoch

nicht zur Produktion von n.c.a. Selen-75 geeignet. Durch die

beiden Zyklotron-Kernreaktionen läßt sich das Selen-75 n.c.a.

herstellen. Das natürliche Arsen als Targetmaterial ist

monoisotopes Arsen-75, so daß die Kosten niedrig sind [13].

7

Tab. 1. 2 -2: Kernreaktionen für die Bildung von Selen-73 und

Selen-75 [13-15]

Kernreaktion Teilchenenergiebereich max. Ausbeute

Selen-75 MeV bei max. 0- [MBq(mCi)/~Ah]

74Se (n,'Y) crt-~h = 51000 mb GBq (ei)-Bereich

75As (d,2n) 20 ~ 12 1,67 (0,045)

75AS (p,n) 15 ~ 5 2,22 (0,06)

Selen-73

75As (p,3n) 40 ~ 30 1406 (38)

75As (d,4n) 45 ~ 30 651 (17,1)

natGe (3He,xn) 36 ~ 13 37 (1,0)

72Ge (3He,2n) 55 (1,5)

natGe (4He,xn) 28 ~ 13 26 (0,7)

70Ge (4He,n) 126 (3,4)

Die höchsten Ausbeuten für die Produktion von Selen-73 erhält

man über die (p,3n)- bzw. (d,4n)-Reaktionen am Arsen-75. Vor­

aussetzung für diese Kernreaktionen ist aber ein Zyklotron,

welches Protonen bzw. Deuteronen im Energiebereich von 30 bis

40MeV erzeugen kann. Die Anregungsfunktionen der 75As(p,xn)­

Reaktionen (siehe Abbildung 1.2-3) zeigt deutlich, daß bei

höheren Protonenenergien der wirkungsquerschnitt für die

(p, 4n) -Reaktion stark ansteigt. Deshalb nimmt die radionu­

klidische Verunreinigung an Selen-72 besonders oberhalb von

40MeV zu. Im Bereich von 30 bis 40MeV wird vorwiegend Se­

len-73 über die (p,3n)-Reaktion gebildet. Unterhalb von 30MeV

fällt der wirkungsquerschnitt für den (p, 3n) -Prozeß schnell

ab. Unterhalb 25MeV protonenenergie erfolgt fast nur noch die

Bildung des Selen-75

Protonenenergie von

Selen-73 und durch

durch die (p,n)-Kernreaktion. Durch eine

40MeV ist also eine Produktion von

Protonen von 20MeV die Produktion von

8

Selen-75 in hoher Radionuklidreinheit und guten Ausbeuten

gewährleistet. Bei Verwendung eines Kompaktzyklotrons mit

24MeV Protonen (z. B. das JÜlicher CV 28) kann nur n. c. a.

Selen-75 in einer guten Ausbeute erzeugt werden. Selen-73 ist

nur durch die Kernreaktion von Germanium mit 4He-Teilchen

zugänglich. Zur Selen-73 Produktion mit zufriedenstellender

Ausbeute muß hier jedoch teures, angereichertes Germanium-70

(20,5% des natürlichen Germaniums) verwendet werden [13,15).

Deshalb ist die Selen-73 Produktion mit einem größeren

Zyklotron (40MeV Protonen) vorzuziehen.

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o 10 20 30 40 so Incidenl proton energy (MeV)

Abb.1.2-3: Anregungsfunktionen für 75As(p,xn)-Kernreaktionen

[13 )

9

1.3. Chemische und kinetische Aspekte bei Reaktionen mit trä­

qerfreien (n.c.a.l Radionukliden

Die spezifische Aktivität eines Radiopharmakons ist ein ent­

scheidender Parameter für die Anwendung in der Nuklarmedizin.

In diesem Zusammenhang wird zwischen trägerfreien, no carrier

added (n.c.a.) und geträgerten radioaktiven Produkten unter­

schieden. Trägerfreie Synthesen sind prinzipiell nur mit

künstlichen Elementen wie Technetium und Astat realisierbar.

Radioisotope natürlich vorkommender Elemente werden immer

während der Produktion und der synthese durch isotopen Träger

verdünnt. Erfolgt dies ungewollt durch Verunreinigungen der

verwendeten Chemikalien bzw. Reaktionsgefäße oder durch Kon­

takt mit der Atmosphäre, spricht man von einem no carrier

added (n.c.a.) Produkt. Bei einer geträgerten Synthese er­

folgt die gezielte Zugabe des stabilen Isotops. Als nicht­

isotopen Träger bezeichnet man beispielsweise die Verdünnung

von Selen-75 mit Schwefel.

Die spezifische Aktivität As ist die Aktivität A bezogen auf

die Masse m [35]:

= Alm [ Bq I g ]

A ist die Zerfallsrate des radioaktiven Nuklids. Sie hängt

von dessen Stoffmenge und Halbwertszeit Tla ab:

A = -dN/dt = ~ . N = ln2 N/Tla

~ = Zerfallskonstante [S-1] , N = Anzahl der radioaktiven

Atome

Daraus folgt eine Abnahme der spezifischen Aktivität bei län­

geren Halbwertszeiten des Radionuklids.

Für den Einsatz hochtoxischer oder zentralwirksamer Substan­

zen in der Radiopharmazie ist der Trägergehalt ein wichtiges

Kriterium. Da beispielsweise in der Hirnrinde die Rezeptor­

dichte nur im Bereich von prnol/g Hirnprotein liegt, ist bei

10

der Markierung Rezeptor-bindender Liganden

Produkt gefordert, da anderenfalls die

ein trägerarmes

Rezeptorplätze

vorwiegend durch inaktive Moleküle besetzt werden und ein

Nachweis auf grund der Radioaktivität nicht mehr möglich ist.

Bei Radionukliden mit relativ kleinen Halbwertszeiten liegen

die stoffmengen im nanomol-Bereich. Aufgrund der kleinen

Stoffmengen ist ein sehr sorgfältiges Arbeiten erforderlich,

um die Verunreinigung mit isotopen Träger möglichst gering zu

halten. Insbesondere beim Arbeiten mit 11C müssen wegen der

Häufigkeit des 12C besondere Vorsichtsmaßnahmen (z.B. Aus­

schluß von C02) getroffen werden. Trotzdem sind Isotopen­

verdünnungen um den Faktor 10-10000 praktisch unvermeidlich

[1] •

Die Notwendigkeit, hohe spezifische Aktivitäten zu erreichen,

kann aber bei der Synthese erhebliche Probleme bereiten, da

sich normale präparative Umsetzungen nur bedingt auf den Sub­

nanogrammbereich übertragen lassen. So können Adsorptions­

effekte an der Wand des Reaktionsgefäßes oder an Nieder­

schlägen und Staubpartikeln eine große Bedeutung haben. Bei­

spielsweise liegt die Austauschkapazität einer Glasoberfläche

mit ca. 10-10 mol cm-2 in der Größenordnung der Radionuklid­

stoffmenge. Außerdem sind bei n.c.a. Synthesen Nebenreak­

tionen mit dem Lösungsmittel oder mit Verunreinigungen der

verwendeten Chemikalien oder Solventien zu beachten. Da die

Verunreinigungen in Suprapur-Chemikalien oft noch zu hoch

sind, gilt der Reinigung der Reagenzien besondere Aufmerk­

samkeit.

Die kinetischen Beschreibungen makroskopischer präparativer

Synthesen sind meistens auf die Reaktionen mit n.c.a. Radio­

nukliden nicht direkt übertragbar. stöchiometrische Bedin­

gungen sind für die Reaktion zwischen dem radioaktivem Rea­

genz A und dem Edukt B praktisch nicht zu erreichen, vielmehr

ist der Überschuß an B so groß, daß dessen Konzentration im

Verlauf der Reaktion als konstant angesehen werden kann. Die

Konzentration des Eduktes [B] kann demzufolge in die Gleich­

gewichtskonstante mit einbezogen werden.

11

Für die zeitliche Abhängigkeit der Konzentration des

Produktes [P] gilt:

[P] = [AO] . (l-e-k ' ·t) mit k' = k . [B]

k = Geschwindigkeitskonstante ; t = Reaktionszeit

Es handelt sich demnach um eine Reaktionskinetik pseudo er­

ster Ordnung. Wird die Reaktionszeit konstant gehalten und

die Eduktkonzentration [B] variiert, so kann die Reaktions­

zeit in die Gleichgewichtskonstante einbezogen werden und es

ergibt sich für die Beschreibung der Reaktionskinetik:

[P] = [AO] . (l-e-k " [B]) mit k' = k . t

Für den Reaktionsverlauf ist, ebenso wie bei der zeitab­

hängigkeit, eine Kinetik pseudo erster Ordnung zu beobachten.

Mit zunehmender Eduktkonzentration [B] erfolgt also ein expo­

nentieller Anstieg der Produktkonzentration [P]. Die Steigung

dieser Funktion ist abhängig von der tatsächlichen Geschwin­

digkeitskonstanten k und der Reaktionszeit t.

Die chemischen und kinetischen Unterschiede zu makro­

skopischen Synthesen, sowie die kurzen Halbwertszeiten der

Radionuklide erfordern die Beachtung folgender Punkte bei der

Synthese von Radiopharmaka:

• Der Zeitbedarf für Synthese, Reinigung und Qualitäts­

kontrolle sollte nicht größer als etwa drei Halbwerts­

zeiten sein, so daß schnelle Synthesen und Analysen­

methoden (GC, HPLC) Anwendung finden.

• Um Nebenreaktionen und Adsorptionsverluste zu umgehen,

müssen hochreine Chemikalien und Sol ventien sowie geeig­

nete Werkstoffe verwendet werden.

• Die Markierungsreaktion sollte möglichst erst im letzten

Reaktionsschritt erfolgen.

12

1.4. Methoden zur Radiose1enierunq organischer Moleküle

Selen und seine Homologen Schwefel und Tellur unterscheiden

sich in ihren chemischen Eigenschaften nur geringfügig. Für

die Funktionsdiagnostik in der Nuklearmedizin sind die Halb­

wertszeiten der positronenemittierenden Schwefelisotope je­

doch zu kurz. Zur Markierung schwefelhaltiger Biomoleküle

oder Pharmaka bieten sich deshalb die Radioisotope des Selens

als Analogtracer an. Das physiologische Verhalten der Verbin­

dungen wird aufgrund der chemischen Ähnlichkeit normalerweise

kaum beeinflußti die stabilität der Selenverbindungen ist al­

lerdings etwas geringer. Eine Möglichkeit der Markierung mit

Selen ist die Synthese isosterer Verbindungen, wobei das Se­

lenisotop als Substitut für eine CH2-Gruppe eingesetzt wird.

Durch die geänderte Polarität kann jedoch die Biochemie des

Radiopharmakons wesentlich beeinflußt werden. Aufgrund der

stabilsten Oxidationsstufe (-2) in organischen Molekülen ei­

gnet sich die Stoffklasse der Selenoether und seiner Derivate

(z.B. Selenoniumverbindungen) besonders zur Selenmarkierung.

Die Bildung der ebenfalls stabilen Diselenide ist aus

statistischen Gründen bei einer n. c. a.

wahrscheinlich.

Synthese nicht

Obwohl Selen-73 und Selen-75 schon seit längerer Zeit n.c.a.

produz iert werden können (siehe Abschnitt 1.2.), waren syn­

thesen radiopharmazeutisch relevanter Verbindungen bisher nur

unter Zusatz von inaktivem Selen möglich. Bei Verwendung von

Reaktorselen ist der isotope Träger in Form von Selen-74 be­

reits durch das Ausgangmaterial zugegen, ansonsten erfolgt

die Zugabe von natürlichem Selen vor oder nach der Isolierung

des Selen-75 (oder Selen-73) aus dem Target. Ausgangsver­

bindungen für Markierungen sind hauptsächlich [75se] Selenit

und elementares Selen-75 bzw. Selen-73, welche durch chemi­

sche oder biochemische Methoden zu Radioselenopharmaka umge­

setzt werden können.

13

In der präparativen Chemie werden Selenoether meistens durch

Reduktion von elementarem Selen und anschließender Umsetzung

mit einem Alkylierungsagens synthetisiert. Als Reduktions­

mittel wird vorwiegend Natrium oder Natriumborhydrid verwen­

det [16]. Da prinzipiell kein Unterschied zwischen einer

Radiosynthese mit Trägerzusatz und einer inaktiven Synthese

besteht, ist die Reduktion mit Natrium oder Natriumborhydrid

auch bei der Darstellung von symmetrischen [75Se ]Selenoethern

weit verbreitet, so beispielsweise bei der Reduktion von

seleniger Säure und anschließender umsetzung mit RX zur syn­

these von [75Se ]Diaminoalkylselenoether (s.Abb. 1.4-1). MOSE

und PIPSE besitzen einen pKa-Wert in der Größenordnung des

pH-Wertes des Blutes. Dadurch können durch lokale pH-Diffe­

renzen Anreicherungen nach der Passage der Blut-Hirn-Schranke

erreicht werden [18,19]. Disubstituierte Selenoharnstoffe

(s.Abb.1.4-1) werden durch Umsetzung von Carbodiimiden mit

[75Se ]Natriumhydrogenselenid erhalten [17]. Sie können als

Vorläufer zur Darstellung von [75Se ]Selenoethern oder

[75Se ]Selenoestern eingesetzt werden.

75 Se

R 11 R' '-N~N/

Selenoharnstoffe

1

75 seR2 1

MOSE

PIPSE

Abb.1.4-1: Beispiele für Markierungen mit Selen-75 unter

Trägerzusatz

14

Die Synthese unsymmetrischer Selenoether erfolgt in vielen

Fällen durch Reduktion eines symmetrischen Diselenids und der

anschließenden Alkylierung des Alkylselenidanions [161. Da

das Diselenid als Zwischenstufe entsteht, kann dieser Reak­

tionsweg nicht auf eine n.c.a. Synthese übertragen werden.

Ein Beispiel für die Synthese eines unsymmetrischen [75Se 1Se­

lenoethers über ein Diselenid ist das [75Se 1 Selenopergolid

(s. Abb.1.4-2) [201. Das Schwefelanalogon ist ein starker

Dopaminagonist, so daß mit dem Selen-75-markierten Analog­

tracer Untersuchungen an Dopaminrezeptoren durchgeführt wer­

den könnten. Selen-75 markierte Steroide, z.B. [75Se 1-24-

(Isopropylseleno)chol-5-en-3-ol [211 und [75Se 1-6-[(Methyl­

seleno)methy11-19-norcholest-5(10)-en-3-ol [221 (s.Abb. 1.4-2

und 1.4-3), sind aufrund der langen Halbwertszeit für die

Diagnostik von Erkrankungen der Nebennierenrinde geeignet, da

die Szintigramme im Verlauf mehrerer Tage wiederholt werden

müssen [231. Sie werden jedoch wegen der relativ hohen

Strahlendosis kaum noch eingesetzt.

7 10e

N~

HN

Selenopergolid

HO

24-(Isopropylselenol­chol-5-en-3-o1

Abb.1.4-2: Beispiele für die Selen-75 Markierung unsymmetri­

scher Selenoether durch Reduktion eines Diselenids

15

Ebenso zu den Steroiden gehört das Gallensäurederivat

[75Se 1Tauro-23-seleno-25-homocholsäure (s.Abb. 1.4-3) [241,

welches zum Studium der Gallensäureresorption und des entero­

hepatischen Kreislaufes eingesetzt wurde [251.

HO 75 /'

Se

HO OH

/'.. ,NH 75 - '-/ ~ Se 11

o SO H 3

Tauro-23-seleno-25-homocholsäure

6-[(Methylseleno)-methyl]-19-norcholest-5(10)-en-3-o1

Abb.1-4-3: Selen-75 markierte Steroide

Zur Darstellung der Selenoniumverbindungen (als potentielle

Blutflußtracer) [75Se 1Dimethylselenoniumcysteiniodid und

[75Se 1Trimethylselenoniumiodid wird geträgertes [75Se 1Seleno­

cystin mit Natriumborhydrid und Methyliodid umgesetzt [261.

Von den selenanalogen Aminosäuren hatte früher nur das

[75Se 1Selenomethionin eine gewisse nuklear.medizinische Bedeu­

tung erlangt. Es diente zur szintigraphischen Darstellung des

Pankreas, obwohl die lange Halbwertszeit des Selen-75 eine

hohe Strahlenbelastung für den Patienten bedeutete [271.

[75Se 1Selenomethionin und [75Se1Selenocystin lassen sich über

ein biochemisches Verfahren synthetisieren. Dazu werden Hefe­

kulturen mit Selen-75 in For.m von geträgertem [75Se 1Selenit

versetzt. Dadurch wird das Selen in die Proteine der Zellen

eingebaut. [75Se1Selenomethionin kann durch Hydrolyse der

Proteine und anschließende Reinigung in einer radiochemischen

Ausbeute von 20-40% erhalten werden. Die spezifische

16

AktivitMt beträgt 370GBq/mmol, bei einer Synthesedauer von 30

Stunden [28]. Die Übertragung dieser biochemischen Methode

auf das PET-Nuklid Selen-73 ist nicht sinnvoll, da bei einer

Halbwertszeit von 7,1h schon über 95% der Radioaktivität nach

der synthese zerfallen wären. Eine schnellere chemische Syn­

these von [75Se ] Selenomethionin beschrieb 1987 Plenevaux et

al. [29]. Hierbei wird elementares, getrMgertes Selen-75

zuerst mit Methyllithium und dann mit 2-Amino-4-brombutter­

säure (ABB) umgesetzt:

75 Se

MeLi 75 ,

----. H C-SeLl. 3

ABB •

Auf diese Weise dargestelltes [15Se ] Selenomethionin erhMlt

man in einer radiochemischen Ausbeute von 75-80% und einer

spezifischen Aktivität von 370GBqjmmol.

Durch Verwendung von Selen-73 ist auf dem gleichen Reaktions­

weg trägerhaltiges [73Se ]Selenomethionin synthetisiert worden

[30]. Dieses Aminosäureanalogon könnte als Radiopharmakon für

PET eingesetzt werden und eine Alternative zum kurzlebigen

[11C]Methionin darstellen.

Eine seltener angewandte Methode zur Darstellung von Se­

lenoethern ist die Reaktion über Trialkylphosphine [31]:

2 R-X Ph-Se-Se-Ph • 2 Ph-Se ----. 2 Ph-Se·R

2. NaOH

Ausgehend vom 1 mol Diphenylselen.id werden durch Umsetzung

mit Tributylphosphin und Natronlauge 2 mol Phenylselenid­

anionen gebildet. Bei der Reaktion mit einfachen Alkylhalo­

geniden entstehen die Alkylphenylselenoether in einer Aus­

beute von 76-96%.

17

Durch eine ähnliche Reaktionsführung kann der [1SSe] Benzy1-

methylselenoether n.c.a. dargestellt werden [32]. Dazu wurden

die für inaktives Selen bekannten Reaktionen von SeO mit

Triphenylphosphin zum Triphenylphosphinselenid [33] und die

Alkylierung mit Methyltriflat zum Methylselenotripheny1-

phosphoniumtriflat [34] auf die n.c.a. Synthese mit polymer­

gebundenem Triphenylphosphin übertragen. Durch die Einwirkung

von Basen und die Reaktion mit Benzylbromid entsteht derun­

symmetrische Selenoether [7SSe ]Benzylmethylselenoether n.c.a.

in einer radiochemischen Ausbeute von bis zu 69%.

18

1.5. Zum Einbau von Se1enomethionin in Proteine

In den Zellen des Körpers findet ständig ein Aufbau von Pro­

teinen statt, um die benötigten Funktions-, Struktur- und ex­

portablen Proteine (z.B. Sekrete) bereitzustellen. Die ein­

zelnen Grundbausteine der Proteine, die Aminosäuren, werden

hierzu zuerst aus dem Blutplasma in die Zellen transportiert,

wo dann in den Ribosomen die Proteinsynthese erfolgt. Dazu

wird der genetische Code im Zellkern von der DNA auf die

m-RNA übertragen. In den Ribosomen lesen die t-RNAs die Ami­

nosäuresequenz von der m-RNA ab und verknüpfen die Amino­

säuren in der festgelegten Reihenfolge zu einem spezifischen

Protein. Die Anzahl und Struktur der synthetisierten Proteine

ist in den einzelnen Organen (-teilen), bedingt durch deren

jeweilige Funktion, sehr unterschiedlich [36,37].

Die nicht-essentielle Aminosäure Selenomethionin wird eben­

falls in Proteine eingebaut [38]. Hierbei erfolgt die nicht­

spezifische Inkorporation in das Protein anstelle von Methio­

nin. In welchem Maße Selenomethioniri Methionin ersetzen kann,

ist von deren molaren Verhältnis abhängig. Andererseits wurde

auch der Einbau in spezifische Selenoproteine oder Seleno­

proteinuntereinheiten (13 verschiedene Selenoproteine sind

bisher bekannt) beobachtet [39].

Soll die Proteinbiosynthese über den Aminosäureumsatz

beschrieben werden, ist neben dem Transport der Aminosäuren

aus dem Blutplasma in die Zelle ebenfalls zu beachten, daß

Aminosäuren auch an anderen Stoffwechsel vorgängen beteiligt

sind. Werden diese vernachlässigt, was im Einzelfall zu prü­

fen ist, kann ein Drei-Kompartimentmodell für den Amino­

säurestoffwechsel aufgestellt werden. Die drei Kompartimente

erfassen die freie Aminosäure im Blutplasma, die freie Amino­

säure in den Zellen und die in Proteine inkorporierte Amino­

säure [am Beispiel des Methionin s. 40].

Die Proteinsynthese kann

stoffwechsels mittels SPET

durch Erfassung des Aminosäure­

oder PET untersucht werden, wenn

19

entsprechende markierte natürliche Aminosäuren oder ihre Ana­

loga zur Verfügung stehen. Das Pankreas ist ein Organ mit

einer hohen proteinsyntheserate, die aus der Sekretion von

Polypeptiden (z.B. Insulin) resultiert. Deshalb wurde früher

das über eine biochemische synthese dargestellte [75Se ]­

Selenomethionin für die Pankreas-Szintigraphie eingesetzt

[27]. Diese wird aber nur noch selten bei speziellen Fra­

gestellungen durchgeführt, da die Strahlenexposition des

Patienten (aufgrund der langen Halbwertszeit von 120 Tagen)

relativ hoch ist und sich für die pankreasdiagnostik die

Sonographie und Computer-Tomographie als geeigneter erwiesen

haben. Der abweichende Stoffwechsel von Tumorgewebe bewirkt

ebenfalls eine gesteigerte Proteinsynthese und damit einen

hohen Aminosäureumsatz. Dieser läßt sich ebenfalls durch SPET

oder PET erfassen. Insbesondere bei Hirntumoren ist eine gute

Korrelation zum Malignitätsgrad zu erkennen. Eine Abgrenzung

zwischen einern Resttumor und nekrotischem Gewebe ist bei be­

strahlten Hirntumoren oft nur mittels PET möglich [23]. Für

diese Untersuchungen erfolgte die Entwicklung kurzlebiger

meist positronenemittierender Aminosäuren, wie z.B. [18F]-2-

Fluortyrosin [41], [llC]Methionin [42,43], [llC] Tryptophan

[44], [llC]Valin [45], [18F]-p-Flourphenylalanin [46], [llC]­

Leucin [47]. Als Aminosäureanaloga wurde das [73Se ]Seleno­

methionin unter Zusatz von isotopem Träger synthetisiert

[30]. Da die Kinetik der Proteinsynthese relativ langsam ist,

könnte im Vergleich zum [llC]Methionin die Markierung mit

einem langlebigen Positronenstrahler vorteile für zeitauf­

wendige PET-Untersuchungen bringen. Zuerst müssen aber die

Auswirkungen des Trägergehaltes auf die biochemischen Gleich­

gewichte geprüft werden.

20

2. Problemstellung

Von den positronenemittierenden Selennukliden ist nur Se­

len-73 (t"2=7, 1h) als Markierungsisotop für die Positronen­

Emissions-Tomographie (PET) geeignet. Es kann sowohl als Ana­

logtracer für Schwefel eingesetzt werden als auch unter Bil­

dung isosterer Verbindungen eine CH2-Gruppe eines Pharmakons

substituieren. Selen-75-markierte Radiopharmaka wurden früher

in der planaren Szintigraphie und der Single-Photon-Emission­

Tomographie (SPET) eingesetzt, so z.B. [75Se jSelenomethionin

für die Pankreasdiagnostik. Aufgrund der hohen Strahlen­

exposition durch die lange Halbwertszeit, wird Selen-75

jedoch heute fast nur noch für die Entwicklung von Selen-73-

synthesen eingesetzt. Da beide Radionuklide praktisch trä­

gerfrei (n.c.a.) am Zyklotron produziert werden können, ist

die Übertragung einer Selen-75- auf eine Selen-73-synthese

möglich. Für die Untersuchungen sollte deshalb Selen-75

(t"2=120d), das über die Kernreaktion 75As(p,n)75se zugänglich

ist, eingesetzt werden.

ziel der Arbeit ist die Synthese von unsymmetrischen n.c.a.

[73,75Se jSelenoethern, die in der nuklearmedizinischen Funk­

tionsdiagnostik Anwendung finden könnten. Grundlage war ein

synthesekonzept der [75Se jSelenierung unter Zuhilfenahme von

polymergebundenem Triphenylphosphin. Dieses Verfahren bietet

den vorteil gegenüber anderen Selenierungsreaktionen, daß die

Markierungsprodukte praktisch träger frei hergestellt und so

toxische Effekte vermieden werden können.

Für die Markierungsreaktion mit dem Triphenylphosphin sollte

das Selen-75 aus dem Targetmaterial trägerfrei isoliert und

in elementarer Form in ein inertes Solvens überführt werden.

Speziell für die synthese von n.c.a. [75Se jMethylselenoethern

sollten die Reaktionsbedingungen für die Darstellung der

Zwischenstufen [75SejTriphenylphosphinselenid, [75Se jMethyl­

selenotriphenylphosphoniumtriflat und [75Sej Methylselenid un­

tersucht und optimiert werden.

21

Für pharmakokinetische in vivo Untersuchungen des Einbaus von

[73Se jSelenomethionin in Proteine mittels PET sollte die Mar­

kierung dieser Aminosäure mit n.c.a. Selen-75 durchgeführt,

optimiert und das Produkt nach chromatographischer Reinigung

in eine applizierbare Form überführt werden.

Zielgerichtet auf die spätere Markierung pharmakologisch

relevanter Proteine und Antikörper war auch die Synthese

einer Selen-75 markierten prosthetischen Gruppe von Inter­

esse. Zur [75Se jSelenoalkylierung von Aminofunktionen sollte

die [75Se jMethylselenopropylgruppe verwendet werden. Für die

Markierung mit Selen-75 sollte zunächst ein geeigneter Vor­

läufer gesucht werden, der die Darstellung der [75Se jMethyl­

selenopropylgruppe in hohen radiochemischen Ausbeuten ermög­

licht. Im Anschluß daran sollten optimale Bedingungen für die

Umsetzung zu einem Amin-reaktivem [75Se jSelenoalkylierungs­

agens erarbeitet werden. Für die einzelnen Reaktionsschritte

sollten jeweils schnelle chromatographische Trennmethoden

entwickelt werden, um das Produkt in einer hohen radio­

chemischen Reinheit zu isolieren. Im Hinblick auf die

[75Se j Selenoalk;ylierung von Polypeptiden sollte schließlich

die Umsetzung mit geeigneten Modellverbindungen untersucht

werden.

22

3. Experimenteller Teil

3.1. Bezuqsnachweis und Qualität der verwendeten Chemikalien

In Tabelle 3.1-1 sind die verwendeten Chemikalien aufgeführt.

Wasserfreie Lösungsmittel wurden ohne weitere Reinigung und

Trocknung zur Synthese eingesetzt. Die anderen Chemikalien

und Lösungsmittel wurden nach Standardmethoden gereinigt und

getrocknet (siehe z.B. [48]).

Tab.3.1-1: Verzeichnis der für die synthesen verwendeten

Chemikalien

Chemikalie

Aceton

Acetonitril

2-Aminobutyrolacton

Arsentrioxid

Benzol

Benzylbromid

Brompropanol

Na-tert.-Butoxycarbonyl­

Lysinmethylester

1-Butylamin

1-Chlor-3-iodpropan

1,3-Dibrompropan

Dichlorethan

Diethylether

Dimethylformamid

Dimethylsulfoxid

Essigsäure

Ethanol

Ethylacetat

4-Heptanon

Hexamethylphosphorsäure­

triamid

Bromwasserstoff

Hersteller Qualität/Gehalt

Riedel-de-Haen p.a.

Merck f. d. DNA-Synthese

Riedel-de-Haen Chromasolv

Aldrich

Merck

Merck

Aldrich

Fluka

Bachem

99%

p.a.

f.d. Spektroskopie

97%

purum

99%

Merck p.a.

Fluka purum

Aldrich 99%

Merck reinst

Merck reinst

Fluka wasserfrei,purriss

Fluka wasserfrei,purriss

Merck >98,5

Riedel-de-Haen p.a.

Merck p.a.

Fluka purum

Aldrich 99%

Merck

23

Chlorwasserstoff

4-Hydroxypiperidin

Kaliumhydroxid

18-Krone-6

Kryptof iX®2 .2.2.

Methanol

Methylethylketon

Methyllithium

Methyliodid

Natriumcarbonat

Natriumhydrogencarbonat

Natriumhydroxid

Natriumiodid

1,3-Propandiol-di­

O-p-toluolsulfonat

Pyridin

Pyrokohlensäure-di-tert.­

butylester

Salzsäure

Schwefeldioxid

Selen (schwarz)

L-Selenomethionin

Silbertoluolsulfonat

Tetrabutylammonium­

hydroxid

Merck

Fluka

Merck

Fluka

Merck

Riedel-de-Haen

Aldrich

Fluka

Aldrich

Fluka

Merck

Merck

Merck

Aldrich

Merck

Fluka

Riedel-de-Haen

Merck

Merck

Serva

Fluka

Aldrich

Tetrahydrofuran Fluka

Tetramethylammonium- Aldrich

hydroxid

Toluol Merck

Toluolsulfonsäurechlorid Aldrich

Trifluormethansulfon- Fluka

säuremethylester

Triphenylphosphin polymer Fluka

gebunden

Triphenylphosphinselenid Merck

Wasserstoffperoxid Merck

24

>98%

p.a.

>97%

>99%

absolut, p.a.

99+%

1,6M in Ether

99%

wasserfrei, >99,5%

p.a.

p.a.97%

99%

98%

absolut, p.a.

>97%

33% p.a.

>99,98%

>99%

purum

purum

40 Gew.%in H20

wasserfrei,purriss

99%

p.a.

98%

purum

200-400 mesh

98%

30%, reinst

3.2. Geräte zur Charakterisierung der dargestellten Verbin­

dungen

Die Charakterisierung der synthetisierten Ausgangs- und Refe­

renzsubstanzen erfolgte durch 1H-NMR-spektroskopie, IR-spek­

troskopie, teilweise auch durch Schmelzpunktanalyse, Elemen­

taranalyse und Massenspektrometrie. Folgende Geräte wurden

dabei verwendet:

1H-NMR-spektroskopie: Bruker WP 80 (Signale gemessen gegen

TMS als interner Standard, die chemische Verschiebung 0 wurde

in ppm angegeben)

IR-Spektroskopie: Shimadzu IR-440 (gemessen als KBr-Press­

linge)

Schmelzpunktbestimmung: MettIer FP 61

Die Elementaranalysen wurden in der Zentralabteilung für

Chemische Analyse der KFA Jülich durchgeführt.

Die massenspektroskopischen Messungen wurden im Institut 4

für Erdöl und Organische Geochemie der KFA Jülich durch­

geführt.

Die verwendeten chromatographischen Geräten sind in Abschnitt

3.5, Analytische Verfahren, näher beschrieben.

Schmelzpunkte und Siedepunkte sind nicht korrigiert worden.

Kontrolle des Reaktionsverlaufes und der Reinheit der Pro-

dukte erfolgte

(Kieselgel Si-60

teilweise über Dünnschichtchromatographie

auf Aluminium der Firma Merck) .

25

3.3. Darstellung inaktiver Ausgangs- und Referenzsubstanzen

Um die chromatographisch getrennten n.c.a. Selen-75-Frak­

tionen eindeutig zu identifizieren, müssen die chromato­

graphischen Daten der inaktiven Selenverbindungen bekannt

sein. Da die untersuchten Selenverbindungen

ziell nicht erhältlich waren, mußten

teilweise kommer­

sie -teilweise

erstmalig- synthetisiert werden, ebenso die nicht kommerziell

erhältlichen Ausgangsverbindungen.

O-Tosyl-2-amino-4-hydroxybuttersäure (O-Tosylhomoserin) [491

7,2g (40mmol) 2-Aminobutyrolacton Hydrobromid und 11,2g

(40mmol) Silbertosylat werden fein gemörsert, in 150ml DMF

gelöst und 3h unter Argon sonofiziert. Dabei steigt die Tem­

peratur auf 50-60°C an. Danach werden die Silbersalze abfil­

triert und das Lösungsmittel abdestilliert. Der Rückstand

wird in heißem Ethanol gelöst, nochmals filtriert und zum

Auskristallisieren des Produktes über Nacht in der Kälte ste­

hen gelassen. Nach Entfernen des Lösungsmittels erhält man

6,67g (24mmol, 61% Ausbeute) O-Tosylhomoserin.

Fp.: 210°C

1H-NMR-Spektrum (CD30D): 7,2-7.8ppm (Ar,4H); 4,35ppm (t,2H);

4,30ppm (t,lH); 2,65ppm (m,2H);

2,30ppm (s,3H)

IR-Spektrum (als KBr-Pressling): V (N-H) 3425cm-1 ,

Elementaranalyse:

Vas,s(C-H) 3045cm- 1+2975cm- 1+2815cm- 1 ,

V (C=O,COOH) 1730cm- l

C: 45,3% (47,5%,theor.)

H: 5,0% (5,4%)

N: 5,1% (5,3%)

S: 12,4% (12,2%)

26

O-Tosyl-2-amino-4-hydroxybuttersäuremethylester (O-Tosylhomo­

serinmethylester) [in Anlehnung an SOl

2,Og (7,Ommol) O-Tosylhomoserin werden in 100ml absolutem

Methanol gelöst. Nach Einleiten von gasförmigem Chlorwasser­

stoff unter Eisbadkühlung bis zur Sättigung wird die Lösung

über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Danach wird das

Lösungsmittel bei 40·C abdestilliert und der Rückstand über

NaOH getrocknet. Die Reinigung des Produktes erfolgt durch

Säulenchromatographie (Kieselgel-Si60, Eluens: THF 90/

Methanol 10 v/v) .

Ausbeute: 750mg (2,5mmol) 36%

Fp.: 123,5·C

lH-NMR-Spektrum (CD30D): 72-7,8ppm (Ar,4H); 4,20ppm (t,1H);

3,81ppm (s,3H); 3,75ppm (t,3H);

2,35ppm (s,3H), 2,15ppm (m,2H)

IR-Spektrum (als KBr-Pressling): v(N-H) 3390cm- 1 , vas,s(C-H)

3040cm-1 +2950cm- 1 , v(C=O) l741cm- 1

Elementaranalyse: C: 46,5% (46,0%,theor.)

H: 5,6% (5,6%)

N: 5,1% (5,6%)

S: 9,1% (10,3%)

N-BOC-2-AminO-4-brom-buttersäureethylester

2-Amino-4-brom-buttersäureethylester [in Anlehnung an 51J

2,9g (19mmol) fein gemörsertes 2-Aminobutyrolacton Hydro­

bromid werden in 200ml absolutem Ethanol suspendiert. Durch

zweistündiges Einleiten von gasförmigem HBr unter Eiskühlung

entsteht eine klare Lösung, die noch 3h bei Raumtemperatur

gerührt wird. Danach destilliert man das Lösungsmittel bei

27

max. 40°C ab, löst den Rückstand in wenig Ethanol und fil­

triert das nicht umgesetzte 2-Aminobutyrolacton ab. Nach Ent­

fernen des Lösungsmittels beträgt die Ausbeute des zähflüs­

sigen Produktes 4,7g (~6mmol, 84%). Es wird ohne weitere Rei­

nigung für die weitere Umsetzung eingesetzt.

~H-NMR-Spektrum (CD30D): 4,35ppm (q,2H); 4,25ppm (t,~H);

3,65ppm (t,2H); 2,55ppm (m,2H);

~,35ppm (t,3H)

N-BOC-2-Amino-4-brombuttersäureethylester [in Anlehnung an

52]

4,7g (~6mmol) 2-Amino-4-brom-buttersäureethylester werden in

Ethanol gelöst und mit ~3,4g Natriumhydrogencarbonat ver­

setzt. Nach Zugabe von 4,8ml (2~ol) Pyrokohlensäure-di­

tert. -butylester wird 2h sonofiziert. Das Natriumhydrogen­

carbonat filtriert man ab, destilliert das Lösungsmittel ab

und nimmt den Rückstand in Chloroform auf. Nach einer wei­

teren Filtration wird die Chloroformlösung mehrmals mit wäß­

riger KHS04-Lösung ausgeschüttelt und über Na2S04 getrocknet.

3,5g kristallines Produkt (~~ol, 7~% Rohausbeute) erhält

man nach Abdestillieren des Lösungsmittels. Die weitere Rei­

nigung erfolgt durch präparative HPLC (LiChrosorb RP-~8-7,

250x25mm, Eluens: Acetonitril 50/ Wasser 50 0,1% Essigsäure

v/v) .

Die Synthese des L-N-BOC-2-Amino-4-brombuttersäureethylesters

erfolgte auf die gleiche Weise mit L-2-Aminobutyrolacton als

Ausgangssubstanz.

Fp.: 69,5°C

~H-NMR-Spektrum (CDCI3): 5,2ppm (d,~H); 4,40ppm (t,1H);

4,25ppm (q,2H); 3,45ppm (t,2H);

2,30ppm (m,2H); 1,45ppm (a,9H);

~,30ppm (t,3H)

28

IR-Spektrum (als KBr-Pressling): v(N-H) 3365cm- l , Vas,s(C-H)

2975cm- l , V (C=O,Ester) 1747cm- l ,

V (C=O,Amid) 1681cm- 1

Elementaranalyse: C: 42,7% (42,6%,theor.)

H: 6,2% (6,5%)

N: 4,4% (4,5%)

Br: 25,3% (25,8%)

N-BOC-2-Amino-4-iodbuttersäureethylester [in Anlehnung an 531

Eine Lösung aus 310mg (l,Ommol) N-BOC-2-Amino-4-brombutter­

säureethylester und l80mg (1,2mmol) Natriumiodid werden in

Aceton gelöst und mehrere Stunden unter Rückfluß gekocht. Das

Produkt wird nach Entfernen des Acetons in Ether aufgenommen,

die Salze abfiltriert und die etherische Lösung mit wäßriger

Na2S203-Lösung ausgeschüttelt. Nach Trocknung der organischen

Phase mit Na2S04 und Entfernen des Lösungsmittels entstehen

325mg kristalliner N-BOC-2-Amino-4-iodbuttersäureethylester

(0,9mmol, 90% Ausbeute), der ohne weitere Reinigung für die

Radiosynthese eingesetzt wurde.

lH-NMR-Spektrum (CDC13): 5,2ppm (d,lH); 4,30ppm (t,lH);

4,20ppm (q,2H); 3,20ppm (t,2H);

2,30ppm (m,2H); 1,45ppm (s,9H);

1,30ppm (t,3H)

Selenomethioninmethylester [in Anlehnung an 501

30mg (0,15mmol) Selenomethionin in 10ml absolutem Methanol

werden mit gasförmigem Chlorwasserstoff gesättigt und über

Nacht gerührt. Nach Abdestillieren des Methanols erhält man

den Selenomethioninmethyles ter, der aus Methanol umkris tal­

lisiert wird.

29

Ausbeute: 25mg (0, 12mmol) 78%

lH-NMR-Spektrum (CD30D): 4,20ppm (t,lH); 3,85ppm (s,3H),

2,70ppm (t,2H), 2,30ppm (m,2H),

2,00ppm (s,3H)

1-(Methylseleno)-3-propanol [54J

1,04g (13, 2mmol) Selen wird als Suspension in wasserfreiem

THF unter Argon langsam mit 10ml 1,6 M Methyllithiumlösung

versetzt. Nach 10 min Rühren wird das überschüssige Methyl­

lithium mit Ethanol alkoholysiert und 1,15ml (12,7mmol)

l-Brom- 3 -propanol zugegeben. Nach 3h Rühren destilliert man

das Lösungsmittel ab, nimmt den Rückstand in Chloroform auf

und filtriert die Lösung. Nach Entfernen des Lösungsmittel

erhält man 1,82g (11,9mmol, Ausbeute: 93%) Produkt als zähes

Öl, das ohne weitere Reinigung für die weitere Umsetzung ein­

gesetzt wird.

Sdp. 100°C (10Torr)

lH-NMR-Spektrum (CDC13): 3,75ppm (t,2H); 2,65ppm (t,2H),

2,05ppm (m,2H), 2,00ppm (s,3H)

O-Tosyl-l-(methylselenol-3-propanol [54J

1,17g (7,6mmol) 1-(Methylseleno)-3-propanol werden in Pyridin

gelöst und unter Eisbadkühlung 1,50g (7,9mmol) Toluolsulfon­

säurechlorid zugegeben. Nach 4h wird die Lösung auf Eiswasser

gegossen und filtriert. Der Rückstand wird mit Eiswasser

gewaschen und dann in Ether gelöst. Nachdem über Na2S04

getrocknet und das Lösungsmittel abdestilliert worden ist,

erhält man 0,90g (2,96mmol, Ausbeute: 39%) Produkt.

30

1H-NMR-Spektrum (CDCI3): 7,2-7,8ppm (Ar,4H); 4,10ppm (t,2H);

2,55ppm (t,2H); 2,45ppm (s,3H);

2,00ppm (m,2H); 1,90ppm (s,3H)

IR-Spektrum (als KBr-Pressling): vas,s(C-H) 3030cm-1 +2920cm- 1 ,

v(Ar-S03-R) 1356cm- 1 +1174cm- 1

Elementaranalyse: C: 44,5% (43,0%,theor.)

H: 5,4% (5,2%)

S: 10,3% (10,4%)

Se: 24,7%(25,7%)

Massenspektrum (EI): M+-1=307, M+-91, M+-155, M+-171, M+-185,

M+-199, M+-213

1-(Methylseleno)-3-chlorpropan [821

310mg (3, 9mmol) Selen werden als Suspension in wasserfreiem

THF unter Argon mit 2,6ml 1,6M Methyllithiumlösung versetzt.

Nach 10 min Rühren wird das überschüssige Methyllithium mit

Ethanol zerstört, 630JtI (5,9mmol) 1-Chlor-3-iodpropan zuge­

geben und über Nacht gerührt. Nachdem man das Lösungsmi ttel

abdestilliert und den Rückstand in Chloroform aufgenommen

hat, wird nochmals filtriert und das Lösungsmittel entfernt.

Das ölige Produkt setzt man mit 260mg (2,6mmol) 4-Hydroxy­

piperidin in 5ml Acetonitril 15 Minuten bei 80°C um. Nach

Abkühlung auf Raumtemperatur wird die Lösung mit 100JtI Essig­

säure und 10ml Ether versetzt und der ausgefallene Feststoff

über ein Si-60-Bett abfiltriert.

nische Phase chromatographiert

Hexan 60/Essigester 1 v/v).

Zur Reinigung wird die orga­

(Kieselgel Si-60, Eluens:

Das Methyl-(3-chlorpropyl)-

selenid erhält man als öliges Produkt in einer Ausbeute von

28% (183mg, 1,1mmol).

31

Sdp.: 110·C (1,5Torr)

lH-NMR-Spektrum (CDC13): 3,65ppm (t,2H); 2,70ppm (t,2H);

2,15ppm (m,2H); 2,00ppm (s,3H)

IR-Spektrum (als KBr-Pressling): Vas,s(C-H) 2915cm- 1+2850cm- 1 ,

v(C-Cl) 799cm- 1 +654cm- 1

Elementaranalyse: C: 28,2% (28,0%,theor.)

H: 4,2% (4,1%)

Cl: 20,5% (20,7%)

Se: 45,6% (46,0%)

1-(Methylseleno)-3-brompropan

400mg (5,lmmol) Selen wird als Suspension in wasserfreiem THF

unter Argon mit 3,3ml 1,6 M Methyllithiumlösung versetzt.

Nach 10 min Rühren wird das überschüssige Methyllithium mit

Ethanol zerstört und langsam in eine etherische Lösung aus

520~1 (5,lmmol) 1,3-Dibrompropan getropft. Das Lösungsmittel

wird abdestilliert, der Rückstand in Chloroform aufgenoDlIllen,

filtriert und die organische Phase eingeengt. Nach der Reini­

gung durch eine Säulenchromatographie (Kieselgel Si-60,

Eluens: Hexan 20/Essigester 1 v/v) erhält man 0,28g (1,3DlIl1ol,

Ausbeute: 25%) öliges Produkt.

lH-NMR-Spektrum (CDC13): 3,40ppm (t,2H); 2,65ppm (t,2H);

2,10ppm (m,2H); 2,00ppm (s,3H)

1-(Methylseleno)-3-iodpropan

232mg (0,7 6DlIl1ol) O-Tosyl-l-(methylseleno)-3-propanol und

226mg (1,50mmol) Natriumiodid werden 2h in Aceton im Rückfluß

gekocht. Die Lösung wird eingeengt und der Niederschlag bei

Raumtemperatur abfiltriert. Nach Entfernen des Lösungsmittels

32

wird der Rückstand in Ether aufgenommen und mit Natrium­

thiosulfatlösung und Wasser ausgeschüttelt. Die etherische

Phase wird über Na2S04 getrocknet. Nach Entfernen des

Lösungsmittels erhält man das 1-(Methylseleno)-3-iodpropan.

Ausbeute: 165mg (0, 63mmol) 83%

1H-NMR-Spektrum (CDC13): 3,30ppm (t,2H); 2,55ppm (t,2H);

2,10ppm (m,2H); 2,00ppm (s,3H)

Elementaranalyse: C: 18,0% (18,3%,theor.)

H: 3,3% (3,1%)

I: 47,7% (48,2%)

Se: 29,1% (30,0%)

1-CMethylseleno)propyl-butylamin

287mg (0, 93mmol) O-Tosyl-1-(methylseleno)-3-propanol werden

in 3ml wasserfreiem DMF gelöst. Nach Zugabe von 84~1

(0, 85mmol) 1-Butylamin wird 15 min auf 80·C erhitzt. 15ml

Ether werden zugegeben und mit verdünnter Essigsäure (5%ig)

extrahiert. Die wäßrige Phase wird mit Natriumcarbonat alka­

lisiert und das Produkt mit Ether extrahiert. Die Extraktion

mit verdünnter Essigsäure und die Alkalisierung durch Natri­

umcarbonat mit anschließender Überführung in die Etherphase

wird zweimal wiederholt. Danach erfolgt die mehrmalige

Extraktion der etherischen Phase mit Natriumcarbonatlösung

und Wasser und die Trocknung über Na2S04. Nach Entfernen des

Ethers erhält man 90mg (O,42mmol, Ausbeute: 49%) öliges Pro­

dukt.

1H-NMR-Spektrum (CDC13): 2,70ppm (t,2H); 2,55ppm (m,1+2H);

1,95ppm (m,2H); 2,00ppm (s,3H);

1,40ppm (m,2+2+2H); 0,95ppm (m,3H)

33

Elementaranalyse: C: 45,9% (46,2%,theor.)

H: 8,8% (9,2%)

N: 6,3% (6,7%)

Se: 35,9% (37,9%)

~-Acetyl-NB-(3-(methylseleno)-propyl)-lysinmethylester

19lmg (0,80mmol) gemörserter ~-Acetyllysinmethylester werden

in 15ml wasserfreiem Acetonitril gelöst, mit 0,8g wasser­

freiem Natriumcarbonat versetzt und über Nacht bei Raumtem­

peratur gerührt. Die Lösung wird eingeengt und dann fil­

triert. Das Lösungsmittel wird entfernt und der Rückstand in

2ml wasserfreiem DMF aufgenommen. Nach Zugabe von 257mg

(0, 85mmol) O-Tosyl-l-(methylseleno)-3-propanol wird 20 min

bei 80·C gerührt. Danach wird die Lösung mit Ether versetzt

und mit verdünnter Essigsäure (5%ig) extrahiert. Die verein­

igte wäßrige Phase wird mit Natriumcarbonat alkalisiert und

das Produkt mi t Chloroform extrahiert. Die Extraktion mi t

verdünnter Essigsäure und die Alkalisierung durch Natrium­

carbonat, mit anschließender Überführung in die Chloroform­

phase, wird zweimal wiederholt. Danach wird das Chloroform

mehrmals mit Natriumcarbonatlösung und Wasser ausgeschüttelt

und anschließend über Na2S04 getrocknet. Nach Entfernen des

Chloroforms erhält man l35mg (0,40mmol, Ausbeute: 50%) reines

Produkt als zähflüssiges Öl.

lH-NMR-Spektrum (CDC13): 6,35ppm (d,lH); 4,65ppm (t,lH);

3,75ppm (s,3H); 2,60ppm (m,2+2+1H);

2,05ppm (s,3H); 2,00ppm (s,3H),

1,85ppm (m,2+2H), 1,45ppm (m,2+2+2H)

34

IR-Spektrum (als KBr-Pressling): v(N-H) 3280cm-1 , vas,s(C-H)

2920cm-1+2850cm-1 , v(C=O,Ester)

1738cm-1 , v(C=O,Amid) 1651cm-1

Elementaranalyse: C: 45,8% (46,3%,theor.)

H: 7,5% (7,8%)

N: 7,9% (8,3%)

Se: 22,5% (23,4%)

Massenspektrum (EI): M+-1=307, M+-15, M+-95, M+-99, M+-113,

M+-172, M+-201

35

3.4. Radiosynthesen

3.4.1. Produktion von n.c.&. Selen-75

Zur Produktion von n. c. a. Selen-75 wurde die Kernreaktion

75As (p, n) 75Se genutzt. Die Bestrahlungen erfolgten an einem

Niederstromtarget mit Arsentrioxid und einem Hochstromtarget

mit einer Kupfer-Arsen-Legierung als Targetmaterial.

3.4.1.1. Arsentrioxid als Targetmaterial

Bei der Bestrahlung von Arsentrioxid im Niederstromtarget ist

der Strahlstrom der 20MeV Protonen auf 7J1.A begrenzt, da bei

höheren Strahlströmen eine optimale Wärmeabführung durch das

Kühlwasser nicht mehr gewährleistet ist. Die Bestrahlung und

AUfarbei tung des Targets erfolgten in Anlehnung an [13,30].

Dazu wurde 19 Arsentrioxid als Pille in einem Aluminium­

targethalter (s. Abb. 3.4-1) fixiert und mit einer 10J1.m

dicken Aluminiumfolie wasserundurchlässig verklebt.

Das Target wurde fünf Stunden am Kompaktzyklotron CV 28 der

KFA Jülich im externen Strahlrohr mit 20MeV Protonen und 6J1.A

Strahlstrom bestrahlt. Damit beträgt die theoretisch produ­

zierbare Aktivität 64MBq (1,7mCi) [13]. In der Praxis konnten

Ausbeuten von 18,5MBq (O,5J1.Ci) erzielt werden.

Nach der Bestrahlung erfolgte die mechanische Abtrennung der

Arsentrioxidpille von dem Aluminiumtargethalter. Das be­

strahlte Arsentrioxid wurde in 5ml 33%iger Salzsäure und un­

gefähr 600J1.l 30%iger Wasserstoffperoxidlösung, das portions­

weise zugegeben wurde, gelöst. Nach Zerstörung des überschüs­

sigen Wasserstoffperoxids bei 85°C wurde die Salzsäurekonzen­

tration auf 9 molar eingestellt und das [75Se ] Selenit durch

Schwefeldioxid reduziert (s. 3.4.2.).

36

~ max. 7 pA , 20 MeV p+

1 Havar foil 25/lm 2 Distanee holder foil 100pm

3 Cooling water ehannels

4 AI eover foil 10J1ffi

1". 3

.................................. .......... ~.

Target head ,top view (schematic)

Abb.3.4-1: Schema des Niederstromtargets (As203) mit Target­

kopf zur Produktion von Selen-75

3.4.1.2. Kupferarsenlegierung als Targetmaterial [551

Für das Hochstromtarget muß als weniger flüchtige Arsenver­

bindung eine CU3As-Legierung verwendet werden, die schon für

die Produktion von Brom-75 und Brom-77 benutzt wurde [56].

Eine 750~m dicke CU3As-Schicht (Durchmesser 13rnrn, As-Gehalt:

28%) wurde auf einen Targethalter gelötet und mit 20~A 20MeV

Protonen bestrahl t. Dabei entstanden nach 4h 35, 5MBq

(0,96mCi) Selen-75 (>60% des theoretischen Wertes). Nachdem

die kurzlebigen Fremdaktivitäten über Nacht abgeklungen

waren, wurde das Target von dem Targethalter abgelötet und in

die Thermochromatographieapparatur (s. Abb 3.4-2) überführt.

Bei einern 02-Strom von 85ml/min sublimierte bei 660°C zuerst

das natürliche Arsen mit dem Arsen-74 (tlz=17, 8d) als Arsen­

trioxid aus dem Target (A). Dieses schied sich an der kalten

37

Wand des Glasrohres ab (Zone a). Die Zone a wurde zur Reini­

gung vom Arsen in die Mitte des Ofens geschoben (B) und das

[74AS]AS203 bei 750'C durch Sublimation in Zone b weiter­

transportiert. Nachdem das Glasrohr in die ursprüngliche

position zurückgeschoben worden war (C), erfolgte der zweite

Schritt der Thermochromatographie. Durch eine schrittweise

Erhöhung der Temperatur von 900'C auf IIOO'C (7min: 900'C,

15min: IOOO'C, IOmin IIOO'C) kondensierte das n.c.a. Selen-75

in Zone ades Glasrohres (0). Durch 2ml 6N Salzsäure konnten

>98% des sublimierten Selen-75 als [75Se ]Selenit gelöst und

reduziert werden (s. 3.4.2).

Length (cm) ovon 0 5 10 15 20 25 30 W///I/P?i//?/);zw/kffi

(A) -0, zone lal

e'As) AS201

( B)

2 'e

v/7(/z?<z,:'l}/ .. 'cY//2dT/ZZTffi I

(u3As target

:;: 0 ~ f;1.0~ A ~ ~ O+-----r-----r----"r---~~~~~~~~,~_r---

a 0 5 10 15 20 25

oven ,

FrQction num ber

tJ / / // / //227/ // / /????/J7 / / / / / (,j

zone (bI

30

(Cl -0, i zone (cl purified

(0 ) zone (0)

Radioselenium

Abb 3.4-2: Apparatur zur thermochromatographischen Abtrennung

von Selen-75 aus einem CU3As-Target [55]

38

Die Aktivitätsbilanz zeigte, daß sich 85% der Selen-75-

Aktivität in der salz sauren Lösung befanden, 5% im Target und

die restlichen 10% mit dem AS203 in der Zone b verblieben.

Die radiochemische Reinheit des [75Se jSelenits betrug >95%.

Die radionuklidische Reinheit des Selen-75 mit >99% wurde

y-spektrometrisch ermittelt.

3.4.2. Darstellung von elementarem n.c.a. Selen-75

Zur Reduktion der salzsauren [75Se jSelenitlösung wurde Schwe­

feldioxid 10 min bei Raumtemperatur eingeleitet. Die Reaktion

zum elementarem Selen-75 und das Austreiben des überschüs­

sigen Schwefeldioxid erfolgte innerhalb von 20 min bei 85°C.

Zur Untersuchung der Adsorptionsverluste an der Gefäßwand

wurden folgende Gefäßmaterialien für die Reduktion einge­

setzt: Teflon, Polyethylen, Polypropylen, Glas, Quarzglas und

Sigradur (Ergebnisse s. Tab.4.1-2).

Aus der arsenhaItigen Selen-75 Lösung (s. 3.4.1.1.) wurde das

elementare Selen-75 in 5ml Benzol durch einstündiges Schüt­

teln extrahiert. Mitextrahierte ionische Selen-75-Verbin­

dungen konnten durch Zusatz von 3ml Wasser wieder in die wäß­

rige Phase überführt werden (zur Ausbeutebestimmung durch

Dünnschichtchromatographie s. 3.5.2.).

Die salzsaure Lösung des elementaren Selen-75, die vorher

durch eine thermochromatographische Reinigung von Arsen

befreit worden war (s. 3.4.1.2.), wurde hierzu in einen spe­

ziellen Perforator überführt (s. Abb. 3.4-3). Durch Benzol,

das auf grund der Glassinterplatte in fein dispergierter Form

in die salzsaure Lösung gelangte, erfolgte die Extraktion des

elementaren Selen-75 in die organische Phase. Nach 40 Minuten

wurde die wäßrige Phase aus dem System entfernt und das Ben­

zol durch Destillation auf 2-5ml eingeengt. Die konzentrierte

benzolische Lösung des elementaren Selen-75 wurde in ein

Vorrats gefäß überführt und dann bis zum weiteren Gebrauch

39

eingefroren.

erfolgte durch

Die Bestimmung der radiochemischen Ausbeute

Radiodünnschichtchromatographie (s. 3.5.2.).

Benzene removal

Waste removal

Solullon tram thermochroma tography

Fr 11

Magnetlc stirrer

Exhaust

Dimroth cooler

Droppng

, ......... -'ube 0= 4mm

i

Aadioselenium removal

Benzene ~~~I-rlnsing

2S ml benzene

\1/ Ho. ";\TI Abb. 3.4-3: Extraktionsapparatur [55]

100mm

75mm [9 mlJ

3.4.3. Durohführung der n.o.a. r75selselenierungsreaktionen

3.4.3.1. [ 75Se ] Selenierung des polymergebundenen Triphenyl­phosphins

Als Reaktionsgefäß für die [75Se ]Selenierungsreaktionen

diente ein Glasrohr (Länge 25mm, 1D 1,6mm) mit Glassinter­

platte und Luer-Anschlüssen. Das polymergebundene Triphenyl­

phosphin läßt man vor der Reaktion mindestens %h in Toluol

quellen. 10mg Polymer (JO~mol Triphenylphosphin auf einer

Polystyrolmatrix) wurden in das Glasrohr eingefüllt. Zur

40

Reaktion mit dem elementaren Selen-75 wurde die benzolische

Lösung (aus 3.4.2.) mit einem Volumenstrom von 2~I/s mit dem

Polymer in Kontakt gebracht. Anschließend wurde das Selen-75,

welches nicht mit dem Polymer reagiert hatte, durch 2ml

Toluol eluiert und das Eluat radiodünnschichtchromato­

graphisch untersucht. Die eingesetzte Aktivität betrug in der

Regel 300 bis 800MBq.

Zur primären Alkylierung des [75Se l Triphenylphosphinselenids

wurden alternativ O,25mmol Methyltriflat (5min Reaktions­

zeit), Methyliodid (30min) oder Benzylbromid (60min) in 150~1

Toluol auf das Polymer gegeben und anschließend mit 2ml THF

gespült. Für die Optimierungsversuche mittels Methyltriflat

wurde eine Lösung von O,04-0,88mmol in 110~1 Toluol in einem

Zeitbereich von 1 bis 30 Minuten mit dem Polymer umgesetzt.

Für die Synthesen von [75SelSelenomethionin und dem [75Se lSe -

lenoalkylierungsagens wurden 0,25mmol Methyltriflat in 110~1

Toluol bei einer Reaktionszeit von 4 Minuten eingesetzt.

Zur Reaktion

triflats zum

des [75SelMethylselenotriphenylphosphonium­

[75Se lMethylselenidanion wurde das Harz mit

O,20mmol folgender alkalischer Lösungen in Kontakt gebracht:

Tetrabutylammoniumhydroxid in THF, Acetonitril, Methanol oder

DMF ; Tetramethylammoniumhydroxid in THF ; 18-Krone-6-Natri­

umhydroxid und Kryptofix@2. 2.2. -Kaliumhydroxid in THF oder

DMF ; wäßrige NaOH ; 100~1 Wasser (Konzentrationen der Lösun­

gen s. Tab. 4.2-9 in 4.2.2.3.). Die Elution der entstandenen

Produkte erfolgte durch Iml des Lösungsmittels der Base, in

dem meistens das zweite Alkylierungsagens zur Darstellung des

[75SelSelenoethers gelöst war (s.u.).

3.4.3.2. Darstellung von n.c.a. [75SelSelenomethionin

Die Darstellung des [75SelMethylselenotriphenylphosphonium­

triflats erfolgte für alle Reaktionswege wie in 3.4.3.1.

beschrieben. Zur Reaktionskontrolle der Umsetzungen wurde zu

41

verschiedenen Zeitpunkten der Produktlösung ein Aliquot ent­

nommen und HPLchromatographisch untersucht.

2-Aminobutyrolacton als Edukt

Für die Reaktion zum [ 75Se ]Methylselenidanion wurden 0,2mmol

Base mit einem Volumenstrom von 1ml/min auf das Polymer gege­

ben und mit 1ml Methanol, DMF oder HMPA, in dem 0,14mmol 2-

Aminobutyrolacton gelöst waren, gespült (Volumenstrom

1ml/min). Als Basen wurden eingesetzt: 0, 6mol/1 Tetrabutyl­

ammoniumhydroxid in wäßrigem THF oder DMF (10%H20), je

0,1mol/1 Lösungen von 18-Krone-6-Natriumhydroxid, 18-Krone-6-

Kaliumhydroxid, Kryptofix®2. 2.2. -Kaliumhydroxid in THF oder

DMF. Die Reaktionszeit betrug 20 min bei einer Reaktions­

temperatur von 60·C. Bei dem Einsatz von 18-Krone-6-Kalium­

hydroxid als Base wurde die Stoffmenge des 2-Aminobutyro­

lactons bis auf 0,05mmol reduziert und die Reaktionstempera­

tur auf 20·C gesenkt.

O-Tosylhomoserin als Edukt

Das polymergebundene [ 75se]Methylselenotriphenylphosphonium­

triflat (s. 3.4.3.1.) wurde mit 190-250~1 0,27-0,85mol/1

Tetrabutylammoniumhydroxid in wäßrigem THF (10-30%H20) zur

Reaktion gebracht und die Produkte durch eine Lösung von

O-Tosylhomoserin (0,10-0,25mmol) in 1ml Methanol, DMF oder

Wasser von dem Polymer eluiert (Volumenstrom jeweils

1ml/min). Bei Temperaturen zwischen 20 und 70·C wurde die

Reaktion nach 30min beendet.

O-Tosylhomoserinmethylester als Edukt

Zur Darstellung des [ 75s e ]Methylselenidanions wurden 0,5ml

0,10-0,46mol/1 Tetrabutylammoniumhydroxid in wäßrigem THF (4-

18%H20) auf das Polymer aufgegeben und anschließend mit 0,5ml

0,04-0,26mol/1 O-Tosylhomoserinmethylester in Methanol (für

eine Versuchsreihe auch in DMF) eluiert (Volumenstrom

42

1ml/min). Die Reaktion wurde sowohl bei Raumtemperatur als

auch bei 60·C durchgeführt.

Zur Verseifung des [75Se jSelenomethioninmethylesters wurden

0,3ml 6N Salzsäure zugegeben und die Kinetik der Reaktion bei

20, 60 und 100·C untersucht. Zu verschiedenen zeitpunkten

wurden Aliquots entnommen und durch HPLC analysiert. Die Pro­

duktlösung wurde weitgehend eingedampft, der Rückstand in 1ml

Methanol aufgenommen und auf eine neutrale A1203-SEP-PAK Kar­

tusche gegeben. Die Elution der Nebenprodukte erfolgte durch

3ml Methanol, und die des [75Se jSelenomethionins anschließend

durch 4ml destilliertes Wasser. Aliquots der beiden Frak­

tionen wurden HPLchromatographisch analysiert.

N-BOC-2-Amino-4-brombuttersäureethylester als Edukt

Die Freisetzung des [75Se jMethylselenidanions vom Polymer

erfolgte durch 150~1 0,13-1,6mol/l Tetrabutylammoniumhydroxid

in wäßrigem THF (15%H20 bei 0,43mol/l). Anschließend wurde

mit 1001-'1 0,3-1,4mol/l N-BOC-2-Amino-4-brombuttersäure-

ethylester in THF und 1ml THF eluiert (Volumenstrom 1ml/min).

Die Reaktion wurde bei Raumtemperatur durchgeführt.

Die Hydrolyse zum [75Se jSelenomethionin erfolgte nach Zugabe

von 0,2ml 6N Salzsäure bei 60 und 100·C. Der zeitliche Ver­

lauf der Reaktion wurde HPLchromatographisch analysiert.

Für die tierexperimentellen Untersuchungen wurde das chirale

Edukt L-N-BOC-2-Amino-4-brombuttersäureethylester eingesetzt

und nach der Synthese die salzsaure L-[75Se jSelenomethionin­

lösung mit HPLC-Eluens gepuffert. Das Produkt wurde durch

eine präparative HPLC isoliert.

Zur Abtrennung der aktiven und inaktiven Nebenprodukte wurde

die THF-Lösung des [75Se j-N-BOC-Selenomethioninethylesters

mit 0,2mmol 4-Hydroxypiperidin in 2501-'1 Acetonitril versetzt

und 20 Minuten auf 80·C erhitzt. Nach Abkühlen der Lösung

konnte durch Zugabe von 401-'1 Eisessig und 5001-'1 Diethylether

eine Trübung der Lösung beobachtet werden. Die Lösung wurde

43

auf eine Si-60-SEP-PAK Kartusche gegeben und der [75Se j-N­

BOC-Selenomethioninethylester mit 2ml Diethylether eluiert.

Nach der HPLC-Analyse eines Aliquots wurde der Ether durch

einen leichten Argonstrom abgedampft und die Schutzgruppen

durch 6N Salzsäure abgespalten (s.o.).

3.4.3.3. Darstellung von [ 75Se lMethylselenopropylderivaten

Das polymergebundene [75SejMethylselenotriphenylphosphonium­

triflat wurde wie in 3.4.3.1 synthetisiert. Die Freisetzung

des [75Se jMethylselenidanions von dem Polymer erfolgte durch

1301L1 0,35mol/l Tetrabutylammoniumhydroxid in wäßrigem THF.

Direkt danach wurden 0, 1mmol 1, 3-Dibrompropan, Propan-

1,3-diol-di-O-p-tosylat oder 1-Chlor-3-iodpropan in lOOlLl THF

aufgegeben und mit 1ml THF eluiert. Die Reaktion wurde nach

10 min bei Raumtemperatur abgebrochen und ein Aliquot der

Lösung durch HPLC analysiert.

synthese von [75s e J-I-(MethyIseIeno)-3-chlorpropan

Für die weiteren Untersuchungen wurde das 1-Chlor-3-iodpropan

(0, 05-0, 14mmol) und TBAH (23 -4 6lLmol) zusammen in 1501L1 THF

gelöst und mit dem [75SejMethylselenotriphenylphosphonium­

triflat zur Reaktion gebracht. Die Elution der Produkte vom

Polymer erfolgte durch 1ml Ether. Zur Isolierung des Pro­

duktes mittels einer Festphasenfixierung wurde der Ether

durch einen leichten Argonstrom abgedampft und der Rückstand

mit 0,25mmol 4-Hydroxypiperidin in 4001'1 MeCN versetzt.

Innerhalb von 10 bis 15 min bei sO·C reagierte das überschüs­

sige 1-Chlor-3-iodpropan zum N- (3-chlorpropyl) -4-hydroxy­

piperidiniumiodid und konnte durch die Zugabe von 101L1 Eis­

essig und 1ml Ether ausgefällt werden. Die Nebenprodukte wur­

den auf einer Si-60-SEP-PAK Kartusche fixiert und das

[75Se j-1-(Methylseleno)-3-chlorpropan durch 0,5ml Ether

eluiert.

44

Synthese von [75sej-~-(Methylseleno)-3-iodpropan

Nach Abdampfen des Ethers der [75Se ]-1-(Methylseleno)-

3-chlorpropanlösung durch einen leichten Argonstrom erfolgte

die Umsetzung mit 0,17mmol Natriumiodid in 100-250~l Aceton,

Methylethylketon oder 4-Heptanon bei 60, 80 bzw. l20·C. Zu

verschiedenen Zeitpunkten wurden Aliquots entnommen und

HPLchromatographisch untersucht. Überschüssiges Natriumiodid

wurde durch 0,5ml Diethylether ausgefällt und über eine

Si-60-SEP-PAK Kartusche filtriert. Das Produkt wurde durch

2ml Diethylether eluiert und das Solvens durch einen Argon­

strom entfernt.

synthese von [ 75S e j-3-(Methylseleno)propyl-butylamin

Zum [75Se ]-1-(Methylseleno)-3-iodpropan wurden 0,5ml einer

0,3mol/l l-Butylamin in DMSO, DMF, Acetonitril, Dichlorethan

oder Ether zugegeben. Die Reaktion erfolgte bei Temperaturen

zwischen 20 und 80 D C. Zu verschiedenen zeitpunkten wurden

Aliquots für die HPLc-Analyse entnommen.

synthese von [ 75Se j-Na-Acetyl-NS-(3-(methylseleno)propyl)-

lysinmethylester

Die Darstellung des [75Se ]-Na-Acetyl-NB_(3-(methylseleno)­

propyl)-lysinrnethylesters erfolgte durch Zugabe von l30~l

einer 0,19mol/l ~-Acetyl-lysinmethylester in DMF zu dem

[75Se ]-1-(Methylseleno)-3-iodpropan. Die Reaktion wurde bei

50, 80 und 100·C durchgeführt.

45

3.5. Analytische Verfahren

Zur Ermittlung der radiochemischen Ausbeute und Reinheit wer­

den verschiedene Verfahren eingesetzt. Kurze Halbwertszeiten

bedingen eine schnelle Trennung und Charakterisierung. Deswe­

gen kommen vorwiegend Radiogaschromatographie und Radiohoch­

druckflüssigkeitchromatographie sowie Radiodünnschichtchroma­

tographie zum Einsatz.

3.5.1. Radiohochdruckfüssigkeitschromatographie

Die Trennung und Identifizierung der Selen-75 Produkte

erfolgte über RadioHPLC. Das system bestand aus einer HPLC­

Pumpe (Knauer Typ 6400), einem UV-Photometer (Knauer Typ

3060), einem NaI-Bohrlochkristalldetektor und einem Verstär­

kerteil (EG & G ACE Mate™ Amplifier and Bias supply). Die

Probenaufgabe erfolgte über einen Injektionsblock (Rheodyne

Typ7l25) mit einer 200tLl Probenschleife. Hinter der Trenn­

säule war ebenfalls ein Injektionsblock (Rheodyne Typ 7125)

zur Aufgabe eines Aliquots zur Bestimmung der Gesamtaktivität

installiert. Die Aufzeichnung, Auswertung und Verarbeitung

der Meßwerte wurde rechnergestützt über das "Radio-Chromato­

Graphik-System" (Nina, Version 3.4) der Fa. Nuclear Interface

durchgeführt. Die Messung der Radioakti vi tät erfolgte kon­

tinuierlich, und die Detektionswellenlänge des UV-Detektor

betrug 220nm.

Für die Trennungen wurden Säulen mit folgenden stationären

Phasen eingesetzt: LiChrosorb RP-18-7 (250x4), Nucleosil CN

(250x4), LiChrosorb-NH2-7 (250x4), LiChrosorb-NH2-7 (250xl0).

46

Die Trennungen erfolgten durch mobile Phasen aus Methanol

bzw. Acetonitril/Wasser Gemischen, gegebenenfalls in Gegen­

wart eines Puffers. Dazu wurde bidestilliertes Wasser einge­

setzt und die Eluensgemische mit Helium entgast.

Die chromatographischen Bedingungen und Retentionszeiten der

untersuchten Verbindungen sind in Tabellen 3.5-1 bis 3.5-3

aufgeführt.

Tab.3.S-1: k'-Werte der bei Raumtemperatur mittels HPLC an

LiChrosorb RP-18-7 (250x4mm) getrennten Verbindun­

gen (Flow 1ml/min)

Verbindung E1uens k'

Triphenylphosphin MeCN : Wasser

70 . 30 3,90 . Triphenylphosphin- MeCN : Wasser

selenid 70 30 1,86

Selenomethionin 19 SOS, pH 2,5, MeOH:HCl O,lN:

(ZitronensäureO,lN + NaOH O,2N)

37 : 39 : 24 3,00

Selenomethionin- MeOH : PBS-Puffer

methyester 35 : 65 2,67

N-BOC-Selenomethionin- MeCN : Wasser 0,1% HOAc

ethylester 50 : 50 3,98

O-Tosylhomoserin- MeOH : PBS-Puffer

methylester 35 : 65 3,69

N-BOC-2-Amino-4-brom- MeCN : Wasser 0,1% HOAc

buttersäureethylester 50 : 50 3,08

l,3-Dibrompropan MeCN . Wasser 0,1% HOAc . 50 : 50 2,16

l,3-Propandiol-di- MeCN : Wasser 0,1% HOAc

p-toluolsulfonat 60 40 1,53

50 50 4,84

1-Chlor-3-iodpropan MeCN : Wasser 0,1% HOAc

60 : 40 2,10

50 50 4,10

47

l-(Methylseleno)- MeCN : Wasser 0,1% HOAc

3-brompropan 50 : 50 3,49

l-(Methylseleno)- MeCN : Wasser 0,1% HOAc

3-iodpropan 60 : 40 3,29

l-(Methylseleno)- MeCN : Wasser 0,1% HOAc

3 -chlorpropan 60 40 1,86

50 50 3,12

0-Tosyl-1-(Methyl- MeCN . Wasser 0,1% HOAc . seleno)-3-propanol 60 40 2,39

50 50 5,29

l-(Methylseleno)- MeCN : Wasser 0,1% HOAc

3-propanol 60 40 1,24

50 50 2,51

Tab. 3.5-2: k' -Werte der bei Raumtemperatur mittels HPLC an

Lichrosob-NH2-7(250x4mm) getrennten Verbindungen

(Flow 1ml/min)

verbindung E1uens k'

Selenomethionin

77 : 23 3,08

2-Aminobutyrolacton

77 : 23 3,49

Homoserin MeCN

77 :23 2,27

Selenomethionin Q MeCN

80 : 20 5,12

Q Säule: LiChrosorb-NH2-7 (250X10) Flow 5ml/min

48

Tab.3.5-3: k'-Werte der bei Raumtemperatur mittels RPLC an

Nucleosil-CN-5 (250x4mm) getrennten Verbindungen

(Flow 1ml/min)

verbindung

1-Butylamin

(3-(Methylseleno)­

propyl)butylamin

l-(Methylseleno)-

3-iodpropan

Eluens

MeCN 0,05M NR40Ac pR 5,8

90 : 10

MeCN : 0,05M NR40Ac pR 5,8

90 : 10

MeCN : 0,05M NR40AC pR 5,8

90 : 10

Na-Acetyl-NS-(3-(methyl- MeCN : 0,05M NR40AC pR 5,8

seleno)propyl) lysin-

methylester

Na-Acetyl-Iysin-

methylester

Gradient Q

MeCN : 0,05M NH40AC pR 5,8

Gradient Q

k'

2,71

2,18

0,07

2,27

2,10

Q Gradient von 100:0 nach 50:50 von omin bis 5min ; ab 5min

isokratisch 50:50 (Flow 1,5ml/min)

3.5.2. Radiodünnschichtchromatographie

Die Radiodünnschichtchromatographie wurde für die Ausbeute­

bestimmung des elementaren, n.c.a. Selen-75 eingesetzt. Dazu

erfolgte die Aufgabe von 1~1 der benzolischen Lösung auf eine

Silicagel Si60 beschichtete FOlie, die mit Benzol als Lauf­

mittel entwickelt wurde. Das elementare Selen-75 wandert mit

der Laufmittelfront, während ionische Bestandteile am Start­

punkt verbleiben. Zur Quantifizierung der Ausbeute wurde die

Folie in der Mitte durchgeschnitten und die Aktivität die

beiden Hälften im y-counter gezählt.

49

3.6. Bestimmung der spezifischen Aktivität von r 75SelSeleno­

methionin

Die Angabe der spezifischen Aktivität eines Radiopharmakons

ist notwendig, da z . B. bei der Markierung von Rezeptorli­

ganden oder toxischen Substanzen oftmals nur geringste Kon­

zentrationen eingesetzt werden können. Die Ermittlung der

spezifischen Aktivität des [75Se ]Selenomethionins erfolgte

mittels HPLC. Zuerst wurden dazu in einer Verdünnungsreihe

unterschiedliche Mengen an inaktivem Selenomethionin inJ1-

ziert und die Stoffmenge gegen das UV-Integral aufgetragen

(s. Abb. 3.4-4).

~

&:Xl

~ 700 .....

~ &:Xl

t: 500 -.... § -.... 400 :S Q)

Ö t:

:m Q) 200 ..... Q)

'" -00

0 0 -00 200 :m 400 500 500 700 &:Xl ~ ~

Integral

Abb.3.4-4: Eichgerade zur Bestimmung der spezifischen Aktivi­

tät von [75Se ]Selenomethionin (LiChrosorb-NH2-7-

Säule, Eluens: 0, 05M KH2P04/MeCN 22,5/77,5, Flow:

Iml/min, injiziertes Volumen: 40~l, Wellenlänge

des UV-Detektor 220nrn)

Die untere Nachweisgrenze für Selenomethionin betrug 5nmol.

50

Zur Bestimmung der spezifischen Aktivität wurde die salz saure

[75Se jSelenomethioninlösung eingedampft und mit 1501'1 HPLC­

E1uens aufgenommen. Diese Lösung injizierte man auf die HPLC­

säule. Die [75Se jSelenomethioninfraktion wurde gesammelt und

in einem geeichten Ge(Li)-Detektor die absolute Aktivität

bestimmt. Die spezifische Aktivität ergibt sich aus der

bestimmten Aktivitätsmenge und der stoffmenge des Seleno­

methionins. Für das [75Se jSe1enomethionin zeigte der UV-De­

tektor bei n.c.a. synthesen keinen Massenpeak, so daß die

Menge unterhalb der Nachweisgrenze lag. Deshalb kann für die

spezifische Aktivität nur ein Mindestwert angegeben werden:

As > 185GBq/mmol (> 5ci/mmol) (EOS)

für eine injizierte Aktivität von 0,93MBq (25/LCi)

51

3.7. Bestimmung der radiochemischen Reinheit

Die radiochemische Reinheit ist ein wichtiges Qualitätskri­

terium bei allen radiochemischen synthesen. Die radio­

chemische Reinheit ist definiert als der Anteil des markier­

ten Produktes an der Gesamtaktivität der produkthaItigen

Fraktion. Zur Bestimmung der radiochemischen Reinheit wurde

die über ein chromatographisches Verfahren isolierte Fraktion

des Produktes erneut einer Chromatographie unterworfen. Die

zweite Chromatographie erfolgte mit einem HPLC-System, das

andere Trennbedingungen als das ursprüngliche system auf­

weist. Durch die Änderung der Chromatographiebedingungen wer­

den Produkte, die in der vorhergehenden Chromatographie mög­

licherweise die Produktfraktion überlagern, abgetrennt. Im

vorliegenden Fall wurde das [75Se ]Selenomethionin zuerst

durch eine HPLC mit einer NH2-Phase abgetrennt und die radio­

chemische Reinheit dann durch eine reversed-phase Chromato­

graphie geprüft.

Sie betrug für [75Se ]Selenomethionin und [75Se ]-1-(Methylse­

leno) -3-iodpropan >95%, für [75Se ]-1- (Methylseleno) -3-chlor­

propan >90%.

52

4. Ergebnisse und Diskussion

4.1. Targetaufarbeitung

Zur Produktion von Selen-75 wurde die Kernreaktion

75As(p,n)75se ausgewählt. Die Entscheidung für die (p,n)­

Reaktion erfolgte aufgrund der höheren maximalen theoreti­

schen Ausbeute von 2, 8MBq (7 6t1Ci) / tlAh gegenüber 1, 67MBq

(45t1Ci) /tlAh für die (d, 2n) -Reaktion [13]. Die häufig ange­

wandte 74Se (n,y)75Se -Kernreaktion ist naturgemäß für die

Produktion von träger freiem Selen-75 nicht geeignet. Ein

weiterer Vorteil, Selen-75 durch eine protoneninduzierte

Kernreaktion aus Arsen-75 zu erzeugen, besteht darin, daß die

Ergebnisse und Bedingungen der Targetaufbereitung [55] zur

Selen-75 Produktion direkt auf die Produktion von Selen-73

über die 75As(p,3n)-Kernreaktion übertragbar sind.

Bei dem Einsatz eines Niederstromtargets wurde als Target­

material Arsentrioxid verwendet. Bei der Bestrahlung mit

20MeV Protonen ist auf grund der Wärmeabführung bei diesem

Targetsystem der Strahlstrom auf maximal 6t1A begrenzt, so daß

die maximale theoretische Ausbeute nach 5 Stunden Bestrahlung

63,6MBq (1,72mCi) beträgt. Die tatsächlich produzierte Akti­

vität betrug 18,5MBq (0,5mCi), entsprechend 29% des theore­

tischen Wertes [13].

Zur Produktion größerer Selen-75 Aktivitätsmengen sind höhere

Strahlströme notwendig. Als arsenhaltiges Hochstromtarget hat

sich eine Kupfer-Arsen-Legierung schon für die Brom-75 und

Brom-77 Produktion bewährt [56]. Dieses Target wurde mit

17MeV Protonen und Strahlströmen von 20tlA 4 Stunden be­

strahlt. Dabei wurde 35,5MBq (0,96mCi) Selen-75 produziert,

was mehr als 60% des theoretisch berechneten Wertes ent­

spricht. Ein weiterer Vorteil bei diesem Targetmaterial ist

die Möglichkeit der weitgehenden Abtrennung des Arsens durch

eine Thermochromatographie, so daß die weitere chemische

Behandlung des Selen-75 in fast arsenfreier Lösung erfolgen

kann [55].

53

Das angewandte Synthesekonzept einer polymergestützten

[75Se ] selenierungsreaktion erforderte die Isolierung des

Selen-75 aus dem Target und die überführung in eine organi­

sche Lösung sowie dessen Umwandlung in die elementare Form.

Hierzu mußte das Selen-75 aus dem Targetmaterial zuerst in

eine salzsaure [75Se ]Selenitlösung überführt werden.

Das Arsentrioxidtarget wurde dazu in HCI/H202 gelöst:

,,75Se "

75% der Selen-75 Aktivität konnten so in Lösung gebracht wer­

den.

Das Hochstromtarget, bestehend aus der Kupfer-Arsen-

Legierung, wurde zur Abtrennung des Arsens zuerst einer Zwei­

Schritt-Thermochromatographie unterzogen und anschließend die

durch den 02-Strom entstandene [75Se ]Selendioxidzone in Salz­

säure gelöst:

CU3As-Target:

Das Sublimat enthielt 85% der produzierten Selen-75 Aktivi­

tät, 10% waren in der Arsentrioxidzone und 5% im Target ver­

blieben.

Unter diesen Bedingungen liegt das Selen-75 in beiden Fällen

in der Lösung vollständig als [75Se ]Selenit vor ; der analy-

tische Nachweis erfolgte radiopapierchromatographisch

[57,58]. Das Arsen wird durch die Wasserstoffperoxidbehand­

lung zum Arsenat oxidiert [59,60].

54

Der nächste Schritt, die Reduktion der salzsauren

[7SSe ]Selenitlösung mit Schwefeldioxid zum elementaren Se­

len-7S, erfolgte bei 8S 0 C [61]:

40

35-

30-

"" .-< 25-

v-I \. 0 N ~ 20-QJ

lX1

~ 15-.... 0QJ

CI) 10- .---/ "' ... 5- .--. 0 . ,

2 4 6 8 10 l2 14

c (Hel) [mol/I]

Abb.4.1-1: Abhängigkeit der radiochemischen Ausbeute des ele­

mentaren Selen-7S von der Molarität der Salzsäure

während der Reduktion (smin S02 einleiten, 20min

8S o C, Phasenübergang des 7SSe O in Benzol durch 30

min Schütteln)

Die Abhängigkeit der radiochemische Ausbeute des elementaren

Selen-7S von der Salzsäurekonzentration während der Reduktion

wurde ausgehend von der arsenhaItigen Lösung des Nieder­

stromtargets bestimmt (s. Abb. 4.1-1). Die maximale radio­

chemische Ausbeute von 3S% wird erreicht, wenn die HCI-Lösung

etwa 9 molar ist. Bei höheren Salzsäurekonzentrationen tritt

die Konkurrenzreaktion, die Bildung von Selenchloriden [62],

welche nicht von Schwefeldioxid reduziert werden, zunehmend

SS

in den Vordergrund, so daß die radiochemische Ausbeute an

elementarem Selen-75 bei höheren Salzsäurekonzentrationen

abnimmt. Die Abnahme der radiochemischen Ausbeute bei gerin­

geren Salzsäurekonzentrationen könnte zwei Gründe haben: Ent­

weder ist das Reduktionspotential des Schwefeldioxids nicht

mehr ausreichend, um das [75Se ]Selenit zu reduzieren, oder

das in der Lösung befindliche Arsen stört die Reduktion des

[75Se ]Selenits in zunehmenden Maße.

Im Falle der fast arsenfreien [75Se ]Selenitlösung, die nach

Thermochromatographie des Targets und Auflösung des Sublimats

mit 6N HCl erhalten wurde, konnte eine radiochemische Ausbeu­

te von bis zu 77% erzielt werden. Da bei diesem Ergebnis 6N

Salzsäure verwendet wurde, kann die Abnahme der Reduktions­

ausbeute in der arsenhaltigen Lösung sicherlich nicht auf die

verminderte Reduktionskraft des Schwefeldioxides sondern muß

auf die Gegenwart des Arsens zurückgeführt werden. Das n.c.a.

Selen-75 kann bei kleinen Salzsäurekonzentrationen von den

makroskopischen Mengen Arsenat adsorpti v oder in Form eines

Komplexes gebunden werden, so daß es nicht reduziert wird und

demzufolge nicht in die Benzolphase übergeht. Es ist somit

deutlich zu erkennen, daß beim Arbeiten mit praktisch träger­

freien Mengen [75Se ] Selenit die weitgehende Entfernung des

Arsens für die Reaktion unabdingbar ist. Bei der langen Halb­

wertszeit des Selen-75 (120d) ist der etwas größere zeitauf­

wand für die Thermochromatographie (2h gegenüber ~h) vernach­

lässigbar , zurnal beim Hochstromtarget aufgrund des höheren

Strahlstroms (durch Bestrahlung des CU3As-Hochstromtargets)

größere Aktivitätsmengen produziert werden können. Auch in

Hinblick auf die Produktion von Selen-73 (7, Ih) wiegt die

höhere Ausbeute den größeren zeitaufwand auf. weitere Vor­

teile der thermochromatographischen Aufarbeitung sind die

bessere Reproduzierbarkeit und die geringere Strahlenbe­

lastung durch eine einfache Möglichkeit der Automatisierung

der Targetaufbereitung.

56

Zur Untersuchung von Wandverlusten im

[75Se ]Selenitreduktion wurden verschiedene

ausgewählt.

Verlauf der

Gefäßmaterialien

Tab.4.1-2: Aktivitätsbilanz für die Reduktion der salz sauren

[75Se ]Selenitlösung in verschiedenen Gefäßen (6N

Salzsäure, 5min S02 einleiten, 20min auf 85°C

erwärmen)

Gefäß- % RCA % RCA % RCA Anteil 7SSe O

material an der [7SSe l- 7Sse O in der

Gefäßwand Selenit Lösung [%l

Teflon 15±5 8±3 77±5 91

Quarzglas 22±4 8±2 70±4 90

Polyethylen 30±8 9±3 61±8 87

Polypropylen 31±8 9±3 60±8 87

Glas 45±10 5±3 50±10 91

sigradur 50±10 5±3 45±10 90

In Tabelle 4.1-2 sind die Aktivitätsbilanzen für die Reduk­

tion arsenfreier, salzsaurer [75Se ]Selenitlösungen in ver­

schiedenen Reaktionsgefäßen wiedergegeben. Es ist deutlich zu

erkennen, daß für die Reduktion in Teflon mit nur 15% Wand­

verlusten das beste Ergebnis erhalten wurde. Teflon wurde aus

diesem Grund als Material für die Targetaufbereitung einge­

setzt, obwohl auch in Quarzglasgefäßen akzeptable Ergebnisse

erhalten wurden. Die Ausbeuten an elementarem Selen-75 der in

Lösung gebliebenen Aktivität wurde dünnschichtchromatogra­

phisch untersucht. Sie betrug bei allen untersuchten Gefäß­

materialien etwa 90%. Dieses Ergebnis zeigt deutlich, daß die

Reduktion des [75Se ]Selenits zum elementarem Selen-75 mit

einer guten radiochemischen Ausbeute abläuft und unabhängig

57

vom Gefäßmaterial ist. Die Verluste sind deshalb nur durch

Adsorptionseffekte erklärbar.

Für die polymergestützte [75Se ]Selenierung mußte das elemen­

tare Selen-75 in ein inertes, organisches Lösungsmittel über­

führt werden. In Kohlenstoffdisulfid hat elementares Selen

zwar die größte Löslichkeit [63], es wurde jedoch wegen der

möglichen Verunreinigung durch nichtisotopen Träger nicht in

Erwägung gezogen. Elementares Selen ist in begrenztem Maße

sowohl in Tetrachlorkohlenstoff als auch in Benzol löslich

[64,65]. Aufgrund der nachfolgenden Reaktion wurde Benzol

ausgewählt und die Extraktion in einem eigens dafür konzi­

pierten Perforator durchgeführt [55]. Das kontinuierliche

Durchströmen von Benzol in feindispergierter Form durch die

salzsaure Selen-75-Lösung transferierte das elementare Se­

len-75 quantitativ innerhalb von 35 Minuten in die benzo­

lische Phase.

Die y-spektroskopische Untersuchung der benzolischen Selen-75

Lösung nach drei Tagen ergab, daß mehr als 99% der Aktivität

aus Selen-75 bestand. Die radiochemischen Ausbeuten an ele­

mentarem Selen-75 über alle Reaktionsschritte bezogen auf die

produzierte Aktivität im Target betrugen 26±10% beim Arsen­

trioxidtarget und 65±5% bei der Kupfer-Arsen-Legierung.

58

4.2. Synthese von n.c.a. [7SSelSelenoethern

4.2.1. Synthesestrategie zur Darstellung von n.c.a. [7SSe lSe -

lenoethern

Ein geeigneter Weg für die Markierung organischer, pharmako­

logisch wirksamer Substanzen mit Selenisotopen ist die Syn­

these von Selenoethern. Sie werden weder durch verdünnte

Mineralsäuren und konzentrierte Alkalilösungen hydrolysiert

noch durch leichte Oxidations- und Reduktionsmittel chemisch

verändert [66] ; außerdem besitzen sie eine ausreichende in

vivo stabilität [18].

Die erste synthese eines organoselenoethers wurde 1847 von

C.Siemens [67] beschrieben. seitdem sind viele Darstellungs­

methoden von unsymmetrischen Selenoethern entwickelt worden,

deren wichtigste in Schema 4.2-1 zusammengefaßt sind.

Betrachtet man die Synthesevarianten unter dem Aspekt einer

Markierung mit Selen-75, so verkleinert sich die Anzahl der

möglichen Reaktionswege erheblich. Da die [75Se ] Selenoether

träger frei (n.c.a.) synthetisiert werden sollten, kommen

Reaktionen mit POlyselenoverbindungen (I-III) nicht in Frage,

weil die Bildung dieser Verbindungen aus statistischen Grün­

den unter trägerfreien Bedingungen praktisch unmöglich ist.

Die häufig angewendete Darstellung von Selenoethern durch

Reduktion von elementarem Selen (III-V) sind in früheren

Arbeiten [18,30,68] nur unter Zusatz von Selenträger erfolg­

reich gewesen, so daß nach einem anderen Syntheseweg gesucht

wurde. Im Hinblick auf die mögliche Markierung eines breiten

Spektrums von Selenoethern sind die Reaktionswege, die auf

die Darstellung symmetrischer oder aromatischer (VII, VIII)

Selenoether beschränkt sind, außer acht gelassen worden. Bei

vielen Reaktionswegen ist die gezielte Änderung der Oxidati­

onsstufe des Selens unter trägerfreien Bedingungen das größte

Problem, da ohne Zusatz von Träger ein Produktgemisch ent­

steht.

59

Schema.4.2-1: Potentielle Reaktionswege zur Synthese von

Selenoethern

aus Polyselenoverbindungen

II Al2Se3

I Se2Cl2

111 Se

350°C ANa etc. ROR' 2.RX

RHC=CHR' Se2R2

1"d Na etc.

R-Se-R' I;" R-Se-M R-Se-MgX

3.R'X NaOH

Se Se

VIII 2.RX IV

l,R3P RSeCN

ArSeX

VII V

VI Se

aus Monoselenoverbindungen

60

Aus der Reaktion des Selens mit Trialkylphosphinen zum Tri­

alkylphosphinselenid (VI) resultiert ein relativ stabiles

Selenprodukt, bei dem die sukzessive Anlagerung von zwei ver­

schiedenen Alkylierungsmitteln möglich ist. Somit sind unsym­

metrische Selenoether auf diesem Weg auch trägerfrei dar­

stellbar.

4.2.2. Konzept der po1vmergestützten synthese von [ 7SSe l Se­

lenoethern

Zur n. c. a. [7 5Se ] Selenierung können [7 5Se ] Triphenylphosphin­

selenid und [75Se]Tributylphosphinselenid eingesetzt werden.

Bei der verwendung von [75Se]Tributylphosphinselenid müssen

die Reaktionen in einer Schutzgasatmosphäre durchgeführt wer­

den, um die Bildung des Tributylphosphinoxids durch Luft­

sauerstoff zu vermeiden. Da [75Se ]Selenierung mit Triphenyl­

phosphin auch in Anwesenheit von Wasser und Sauerstoff

erfolgreich waren, wurde diese Reaktion für die Synthese aus­

gewählt. Aufgrund der geringeren Reaktivität des [75Se ]Tri­

phenylphosphinselenids gegenüber dem [75 Se] Tributylphosphin­

selenid sind für die weiteren Umsetzungen reaktivere Rea­

genzien notwendig. Die zur Darstellung unsymmetrischer

Selenoether erforderliche Umsetzung mit zwei verschiedenen

Alkylierungsagenzien kann durch die Verwendung des Triphenyl­

phosphins in Form eines Polymerharzes (Triphenylphosphin an

Polystyrol gebunden) problemlos in zwei unabhängigen Reak­

tionsschritten durchgeführt werden. Hierbei ist das Selen-75

nach der primären Alkylierung des [75Se]Triphenylphosphin­

selenids noch kovalent an das Polymer gebunden, so daß über­

schüssiges Alkylierungsmittel ohne SChwierigkeit aus dem

System entfernt werden kann. Die anschließende Sekundär­

alkylierung des Selen-75 ist dann in einem separaten Reak­

tionschritt möglich.

Die Darstellung von n.c.a. [75Se ]Selenoethern aus dem elemen­

tarem Selen-75 über eine Heterogenreaktion erfolgte durch

61

eine Vierstufensynthese (Abb. 4.2-2), die in Anlehnung an die

makroskopische Synthese von Phenylselenoethern aus oiphenyl­

selenid entwickelt wurde [31,32].

>--<'I

75, (0) ;:;e

Benzol

Heterogenreaktion

+

to-~ fh75 x-P-Se

- I 'R Ph

-OH

Homogenreaktion

R = Alkyl

R' = Alkyl

x = Br, I, OTf

Y = Br, I, OTos

Abb.4.2-2: zur

75 -R-Se

R'Y

Darstellung

RX

Ph

+ ~ 1=0 ~~I

Ph

von n.c.a. Reaktionsschema

[75Se ]Selenoethern

phenylphosphin

über polymergebundenes Tri-

Der erste Schritt ist die Addition des elementaren Selen-75

an das polymergebundene Triphenylphosphin zum [75Se ]Tri­

phenylphosphinselenid. Es folgt die primäre Alkylierung (RX)

des Selens unter Bildung des [75Se ]Alkylselenotriphenyl­

phosphoniumions. Durch Einwirkung einer Base wird im dritten

62

Schritt der Synthese das entsprechende [75Se ]Alkylselenid­

anion freigesetzt und durch anschließende Umsetzung mit einem

weiteren Alkylierungsmittel (R'X) in homogener Phase zum

unsymmetrisch alkylierten [75Se ]Selenoether umgewandelt.

4.2.2.1. Darstellung des polymergebundenen n.c.a. [ 75Se ]Tri­

phenylphosphinselenids

Die Reaktion des polymergebundenen Triphenylphosphins mit der

benzolischen Lösung des elementaren Selen-75 (s. 4.1.)

erfolgte bei Raumtemperatur. Da eine quantitative Selen-75

Umsetzung erreicht wird, sind 10mg Polymer für die Reaktion

zum [75Se ] Triphenylphosphinselenid ausreichend. Geringere

Mengen als 10mg sind ungünstiger, da sie zu schlechter repro­

duzierbaren Ergebnisse führen.

Die Untersuchung der radiochemischen Ausbeute des

c75se] Triphenylphosphinselenids (TPPSe) in Abhängigkeit von

der Kontaktzeit der benzolischen Lösung des elementaren

Selen-75 mit dem Polymer (s.Abb. 4.2-3) erfolgte durch dünn­

schichtchromatographische Analyse der von der Reaktionssäule

eluierten Aktivität. Die Volumenströme der benzolischen

Lösung wurden dann in die jeweilige Kontaktzeit auf dem

Polymer umgerechnet.

Bei einer Kontaktzeit von mehr als 30 Sekunden ist ein fast

quantitativer Umsatz (97±2%) des elementaren Selen-75 zum

[75Se ]TPPSe zu beobachten. Bei kürzeren Kontaktzeiten, also

bei Volumenströmen von > 2,5~l/s, wird weniger Aktivität auf

dem Polymer gebunden. Die dünnschichtchromatographische Ana­

lyse des Eluates zeigt, daß es sich um elementares Selen-75

handelt. Bei einer wiederholten Aufgabe der eluierten Lösung

auf das polymergebundene Triphenylphosphin war das Selen-75

unverändert reaktiv, so daß der Grund für die vorherige,

nicht VOllständige Reaktion zum [75Se ]TPPSe ausschließlich in

der zu kurzen Kontaktzeit lag.

63

100

"" ~ QJ

.iJ ::I QJ

.Q

"' ~ 80

J! u "' ..... aJ

.<:1 U 0 .....

60 1:J Cll

0>:;

l-i-I

10 20 30 40 50

Zeit [s) 60 70 80

Abb.4.2-3: Abhängigkeit der radiochemischen Ausbeute (RCA)

des [75Se ]TPPSe von der Kontaktzeit der benzoli­

schen Selen-75 Lösung mit dem Polymer (Die RCA ist

bezogen

Polymer

auf elementares n.c.a. Selen-75

30/Lmol Triphenylphosphin in

vorgequollen; RT)

lOmg

Toluol

Um eine chromatographische Analyse des entstandenen Produktes

durchführen zu können, wurde elementares Selen-75 mit nicht

polymergebundenem Triphenylphosphin (TPP) umgesetzt. Die

HPLC-Analyse der Reaktionslösung ergab, daß sich nur ein

Aktivprodukt gebildet hat, welches aufgrund der Vergleichs­

messung mit dem inaktivem standard dem [75Se )TPPSe zugeordnet

werden kann. Dieses Ergebnis und die Resultate der nachfol­

genden Untersuchungen lassen den Schluß zu, daß die auf dem

Polymer gebundene Aktivität ausschließlich [75Se )TPPSe ist.

Der in benzolischer Lösung noch enthaltene ionische Anteil

des Selen-75, vermutlich [75Se )Selenit (~8%), wird nicht auf

dem polymer fixiert, sondern vollständig eluiert. Durch die

64

Reaktion des elementaren Selen-75 zum [75Se ]TPPSe wird nicht­

elementares Selen-75, das eventuell die nachfolgenden Reak­

tionschritte stört, automatisch entfernt. Das gebundene

Selen-75 liegt also in einer chemisch eindeutigen Form vor.

Aus der Änderung der radiochemischen Ausbeute an [75Se ]TPPSe

als Funktion der Kontaktzeit kann die relative Geschwindig­

keitskonstante k' ermittelt werden. Die zur Berechnung benö­

tigte Akti vi tätskonzentration des Produktes zur Zeit t P (t)

kann mit dem Anteil des [75Se ]TPPSe an der Gesamtaktivität AO

gleichgesetzt werden. Dem Wert AO entspricht die eingesetzte

Gesamtmenge an elementarem Selen-75. Eine Auftragung von

In(AO/(AO-P(t))) gegen die Kontaktzeit t sollte bei der

erwarteten Reaktionskinetik pseudo-erster Ordnung

(s. Abschnitt 1. 3) eine Gerade ergeben, deren steigung der

relativen Geschwindigkeitskonstanten k' entspricht. Dazu wUr­

den nur die Zeiten bis 30s berücksichtigt, bei denen ein

Anwachsen der radiochemischen Ausbeute zu beobachten ist

(s.Abb 4.2-3). Für die relative Geschwindigkeitskonstante k'

dieser Reaktion pseudo-erster Ordnung ergibt sich ein Wert

von 0,22 s-l (aus Abb. 4.2.-4)

Die relativ schnelle Reaktionskinetik weicht stark von der

makroskopischen Umsetzung des (nicht polymergebundenem) TPP

mi t elementarem Selen bei Raumtemperatur ab [33]. Die Reak­

tionszeit beträgt dort 24 stunden, was vermutlich auf die

unterschiedliche Modifikation des elementaren Selens zurück­

zuführen ist. Bei der makroskopischen Umsetzung liegt norma­

lerweise das Selen in Form oligomerer Einheiten als Ses-Ringe

oder Se-Ketten vor, die bei der Reaktion mit dem TPP erst

gespalten und dann schrittweise abgebaut werden. Da unter

n.c.a. Bedingungen die Wahrscheinlichkeit der Bildung von

Selenoligomeren sehr gering ist, liegt das [75Se ]Selen in

einer reaktiveren Form (wahrscheinlich atomar) vor, die eine

schnelle Addition an das TPP ermöglicht, so daß der im Falle

des natürlichen Selens notwendige energieaufwendige Abbau der

oligomeren Se-Einheiten entfällt.

65

4,0

3,5

3,0

'" ,:p 2,5

"-5' s:: 2,0

.... 1,5

1,0 20 22 24

•

26

Zeit [5)

•

28 30 32

Abb.4.2-4: Auftragung von ln(Ao/(AO-P(t») gegen die Kontakt­

zeit t zur Ermittlung der relativen Geschwindig­

keitskonstanten k' für die Bildung von [75Se ]Tri­

phenylphosphinselenid.

4.2.2.2. Reaktion zum [ 75SelAlkylselenotriphenylphosphonium­

salz (primäralkylierung)

Zur Untersuchung der primären Alkylierung des Selens wurde

das [75Se]Triphenylphosphinselenid (TPPSe) mit verschiedenen

Alkylierungsagenzien (Tabelle 4.2-5) in Toluol bei Raumtempe­

ratur umgesetzt. Da eine direkte Ausbeutebestimmung des ge­

bildeten n.c.a. [75SejAlkylselenotriphenylphosphoniumions auf

dem Polymer nicht möglich war, wurde nach der Reaktion das

Polymer zur Entfernung des überschüssigen Alkylierungsmittels

gewaschen. Das Selen-75 wurde dann durch O,3ml O,6mol/l

Tetrabutylammoniurnhydroxidlösung in Form des [75Se ]Alkyl­

selenidanions von dem Polymer gelöst. Es konnte gezeigt

66

werden, daß die vom Polymer als [75Se ]Methylselenidanion

freigesetzte Aktivität, dargestellt durch Reaktion von

[ 75Se]Methylselenotriphenylphosphoniumtriflat mit Tetrabutyl­

ammoniumhydroxid, fast vOllständig mit Benzylbromid zum

[75Se ]Benzylmethylselenoether umgesetzt wird [32]. Aus diesem

Grund entspricht die radiochemische Ausbeute des [75Se ]Alkyl­

selenotriphenylphosphoniumsalzes der eluierten Aktivitäts­

menge.

Tab.4.2-5: Radiochemische Sättigungsausbeute der primären AI­

kylierung für verschiedene Alkylierungsmittel (Die

RCA ist bezogen auf das eingesetzte elementare

Selen-75; 10mg Polymer '" 30~mol Triphenylphosphin,

O,25mmol Alkylierungsmittel in Toluol; RT)

% RCA rel. Alky- % Neben- % Neben-

RX [Ph3P75seR]+ X- lierunqs- produkt 1 produkt 2

kraft [69,70]

Benzyl- 47±5 1 40±10 12±5

bromid

Methyl- 50±5 1,6 37±9 13±7

iodid

Methyl- 70±6 2,5*106 1S±7 10±4

triflat

1: Aktivität, die nach der Reaktion des [Ph3P75SeR]+ X- mit

dem Tetrabutylammoniumhydroxid nicht vom Polymer eluiert

werden konnte.

2: Aktivität eines Selen-75 Nebenproduktes, das sich auf grund

einer Nebenreaktion des Alkylierungsmittels mit dem

[75Se]Triphenylphosphinselenid zu einem nicht polymer­

gebundenen Selen-75 Nebenprodukt gebildet hat und somit

vor dem Einwirken des Tetrabutylammoniumhydroxides vom

Polymer eluiert werden konnte.

67

wie erwartet, ist die radiochemische Ausbeute des alkylierten

[75Se JTPPse mit Methyltriflat gegenüber den Alkylhalogeniden

viel höher, da die Triflatgruppe aufgrund ihrer sehr guten

Nukleofugie die höchste relative Alkylierungskraft besitzt

[70J. Im Vergleich zu der 96%igen Ausbeute bei der makrosko­

pischen Umsetzung von nicht polymer gebundenem TPPSe mit

Methyltriflat [71J bildet sich bei der Reaktion von Methyl­

triflat mit polymergebundenem n.c.a. [75Se JTPPSe nur 70%

[75seJMethylselenotriphenylphosphoniumtriflat. Für diese Dis­

krepanz können einerseits Reaktionen mit dem Polymer in Frage

kommen, andererseits ist es beim trägerfreien Arbeiten mög­

lich, daß durch den großen Überschuß an Methyltriflat Neben­

reaktionen an Bedeutung gewinnen, die bei einer äquimolaren

Umsetzung kaum auftreten.

Der Einsatz von Benzylbromid und Methyliodid führt, wie

erwartet, zu den gleichen Ausbeuten, da beide eine ähnliche

Alkylierungskraft besitzen. Der etwas höheren Nukleofugie des

Iods gegenüber Brom wirkt entgegen, daß der Benzylrest den

Übergangszustand etwas besser stabilisieren kann, so daß sich

die beiden Effekte in etwa aufheben.

Die weiteren Arbeiten wurden mit Methyltriflat als primärem

Alkylierungsmittel durchgeführt, da die Verwendung dieses

Methylierungsmittels folgende vorteile bietet:

• höchste radiochemische Ausbeuten in kurzer Reaktionszeit,

• Bildung der Methylselenogruppe als Voraussetzung für die

Selenomethioninsynthese,

• Bildung einer sterisch kleinen Gruppe (der Methylseleno­

gruppe) bei der Markierung über die Einführung einer

prosthetischen Gruppe.

Darüber hinaus wird das Alkylselenotriphenylphosphoniumion

durch das schwach nukleophile Trifluormethansulfonation sta­

bilisiert [72J. Zur optimierung der radiochemischen Ausbeute

der primären Alkylierung wurden die Kontaktzeit und Methyl­

triflatmenge variiert.

68

Die Abhängigkeit der radiochemischen Ausbeute des [75Se ]Me­

thylselenotriphenylphosphoniumtriflates (TPPSeMeOTf) von der

Methyltriflatmenge zeigt anfangs erwartungsgemäß etwa eine

Reaktionskinetik pseudo-erster Ordnung (Abb. 4.2.-6). Das

Plateau von etwa 70% wird bei einer Methyltriflatmenge von

etwa 0,20mmol (in 110~1 Toluol) erreicht. Durch eine Erhöhung

der Stoffmenge bis 0,5mmol (in 110~1 Toluol) bleibt die

radiochemische Ausbeute an [75Se ]TPPSeMeOTf zunächst unverän­

dert. Da die freien Triphenylphosphingruppen, die nicht sele­

niert sind, bevorzugt alkyliert werden [73], reagieren diese

zuerst mit Methyltriflat. Aufgrund dieser Konkurrenzreaktion

zum Methyltriphenylphosphoniumtriflat ist die Stoffmenge des

Methyltriflats direkt von der gewählten Menge an Polymer ab­

hängig und sollte ca. das 6-fache der Triphenylphosphinmenge

80

"" 70 Q) ...., ::l 60 Q)

..Q !I)

.§! 50

Q) .c: 40 u !I)

"ffi 30 .c: u 0 20 :a m ~ 10

° 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0

Methyltriflat [rrmoll

Abb.4.2-6: Abhängigkeit der radiochemischen Ausbeute der pri­

mären Alkylierung von der Methyltriflatmenge (Die

RCA ist bezogen auf elementares n.c.a. Selen-75;

10mg Polymer""30~mol Triphenylphosphin, Methyltri­

flat in 110~1 Toluol; 5min; RT)

69

betragen. Die langsame Abnahme der radiochemischen Ausbeute

bei größeren Methyltriflatmengen ist auf Nebenreaktionen des

Methyltriflates mit dem gebildeten [75Se jTPPSeMeOTf zurück­

zuführen.

Die Zeitabhängigkeit der radiochemischen Ausbeute zeigt eben­

falls anfangs die erwartete Kinetik pseudo-erster Ordnung

(Abb. 4.2-7). Eine Mindestreaktionszei t von etwa 4 Minuten

ist notwendig, um die maximale radiochemische Ausbeute von

70% des [75Se jTPPSeMeOTf zu erzielen. Im Bereich zwischen 4

und 15 Minuten verändert sich die Ausbeute innerhalb der Feh­

lergrenzen nicht. Bei längeren Reaktionszeiten (>15 Minuten)

kommt es durch Nebenreaktionen des überschüssigen Methyl­

triflates zur Bildung von Nebenprodukten, so daß die radio­

chemische Ausbeute in der gleichen Weise abnimmt wie beim

Einsatz größerer Methyltriflatmengen.

80

oe

'" 70

.jJ ::1

'" 60 .Q

'" ::1 50 ..:

'" .c: u 40

'" ..... 30 I'i

'" .c: u 20 0 ..... "0 1\1 10 ,,;

0 0 5 10 15 20 25 30 35

Zeit [min]

Abh.4.2-7: Abhängigkeit der radiochemischen Ausbeute der pri­

mären Alkylierung mit Methyltriflat von der

Reaktionszeit (Die RCA ist bezogen auf elementares

Selen-75j 10mg Polymer~30~mol Triphenylphosphin,

0,25mmol Methyltriflat, 110~1 Toluol; RT)

70

Zur Berechnung der relativen Geschwindigkeitkonstanten k'

wurde wiederum In (Aol (AO-P» gegen die Reaktionszeit bis

4min aufgetragen (AO=Anfangsaktivität an [75Se jTriphenyl­

phosphinselenid = 100% i P=radiochemische Ausbeute an

[75SejMethylselenotriphenylphosphoniumtriflat in % zum zeit­

punkt t i zur weiteren Erläuterung s. 4.2.2.1.).

Für die Reaktionsgeschwindigkeitskonstante der Bildung des

[75Se jTPPSeMeOTf aus dem [75Se jTPPSe mit Methyltriflat ergibt

sich aus der Steigung der Geraden in Abbildung 4.2-8 ein Wert

von 0,304 s-1.

1,4

1,2

1,0

Il< 0,8 I ~ ..... 0,6 .t: >:l rl 0,4

0,2

0,0

° 1 2 3 4 5

Zeit [minj

Abb.4.2-a: Auftragung von In(AOI (AO-P(t») gegen die Reak­

tionszeit t zur Ermittlung der relativen Geschwin­

digkeitskonstanten k' für die Bildung von [75Se j­

Methylselenotriphenylphosphoniumtriflat

71

".2.2.3. Baseninduzierte spaltung des [75se]Methylselenotri­

phenylphosphoniumsalzes

Für die Bildung des deprotonierten [75Se ]Methylselenidanions

([75se]CH3Se-) als nukleophiles Teilchen aus dem poly­

mergebundenen [75Se]Methylselenotriphenylphosphoniumtriflat

([75Se ]TPPSeMeOTf) ist die umsetzung mit Hydroxiden notwen­

dig. Neben ihren basischen Eigenschaften sind die Hydroxid­

ionen aber auch nukleophil, so daß es zu Konkurrenzreaktionen

mit dem zweiten Alkylierungsmittel kommt. Die Freisetzung des

Selens als [75Se ] CH3Se- vom Polymer wurde anhand verschie­

dener Basen (s. Tab 4.2-9) untersucht. In früheren Versuchen

[32] wurde ein

polymergebundenem

fast quantitativer Umsatz der (von

[75Se ] TPPSeMeOTf) eluierten Aktivität zum

[75Se ]Benzylmethylselenoethers erzielt. Somit ist die freige­

setzte Aktivität indirekt als [75se]CH3se- identifiziert wor­

den und kann der radiochemischen Ausbeute an [75se]CH3Se­

gleichgesetzt werden.

Die höchste radiochemische

[75Se ]Methylselenidanion wurde

Ausbeute von

durch Einwirken

70% an

von 0,3-

0, 6mol/ I Tetrabutylammoniumhydroxid (TBAH) in THF erreicht.

Mit Tetramethylammoniumhydroxid und Alkalihydroxid-Kryptofix@

2.2.2 bzw. Kronenether-Komplexen war die Ausbeute zwar nie­

driger, für weitere Reaktionen jedoch noch akzeptabel. Die

Kronenether- bzw. Kryptand-komplexierten Alkalihydroxide

haben eine schlechtere Löslichkeit in THF als die Tetraalkyl­

ammoniumhydroxide, so daß vermutlich durch die geringere

Hydroxidionenkonzentration die radiochemische Ausbeute ab­

nimmt. Der Zusammenhang zwischen radiochemischer Ausbeute und

Hydroxidionenkonzentration zeigt sich auch darin, daß bei

Verwendung von Tetramethylammoniumhydroxid- bzw. TBAH-Lösun­

gen mit einem Gehalt <0,3mol/1 [75se]CH3se- lediglich mit 58

bzw. 45%iger Ausbeute gebildet wird.

72

Tab.4.2-9: Bildung des [75Se jMethylselenidanions aus

[75Se jTPPSeMeOTf in Abhängigkeit von der Base (Die

RCA ist bezogen auf elementares Selen-75; 10mg

Polymer~30~mol Triphenylphosphin, 0,25mmol Methyl­

triflat in 110~l Toluol, 5min, RT, 0,20mmol Base)

Base % RCA % Neben- % Neben-

[7Sse]CH3Se- produkt 1 produkt 2

TBAH 0,3-0,6M in THF 70±6 18±7 10M

TBAH 0,3-0,6M 67±6 22±6 10±4

in MeCN, MeOH

TBAH 0,3-0,6M in DMF 53±10 38±9 9±5

TBAH <0,2M in THF 45±8 44±9 12±5

TMAH 0,25M in THF 58±7 30±7 11±4

KOH/Kryptofix@2.2.2 57±8 30±7 12±5

O,lM in THF

NaOH /18-Krone-6 65±7 25±8 10±4

O,lM in THF

KOH/Kryptofix@2.2.2 47±11 42±12 11±4

O,lM in DMF

NaOH/18-Krone-6 43±12 46±11 9±4

O,lM in DMF

1,5M wäßrige NaOH 47+8 43+7 9+4

Wasser 45±9 45±10 11±4

1: Aktivität, die nach der Reaktion des [Ph3p75SeRj+ X- mit

dem Tetrabutylammoniumhydroxid nicht vom Polymer eluiert

werden konnte.

2: Aktivität eines Selen-75 Nebenproduktes, das sich auf grund

einer Nebenreaktion des Alkylierungsmittels mit dem

[75SejTriphenylphosphinselenid zu einem nicht polymerge­

bundenen Selen-75 Nebenprodukt gebildet hat und somit vor

dem Einwirken des Tetrabutylammoniumhydroxides von dem

Polymer eluiert werden konnte.

73

Während sich die radiochemischen Ausbeuten in Acetonitril

oder Methanol im Vergleich zu THF als Lösungsmi ttel kaum

ändern, ist beim Einsatz von DMF eine Abnahme der radioche­

mischen Ausbeute um bis zu 20% zu beobachten. Das gleichzei­

tig veränderte Quellverhalten des Polymers weist auf eine

unerwünschte Wechselwirkung

mer hin, so daß DMF als

anwendbar ist. Wird für die

zwischen Lösungsmittel und poly­

Lösungsmittel nur eingeschränkt

Bildung des [75selCH3se- wäßrige

Natronlauge oder reines Wasser eingesetzt, so ist ein deut­

licher Abfall der Ausbeute zu erkennen, der wahrscheinlich

auf das stark wäßrige Milieu zurückzuführen ist. Zusätzlich

ist aufgrund der fehlenden Phasentransfereigenschaften

(gegenüber Tetraalkylammoniumionen oder den Alkalimetallkom­

plexen) eine erhöhte Nebenproduktbildung bei der Reaktion des

[75SelCH3se- mit dem zweiten Alkylierungsmittel zu beobach­

ten.

Da von den ausgewählten Basen mit TBAH auf grund der hohen

Basizität, der guten Löslichkeit in organischen Solventien

und der Phasentransfereigenschaften die höchsten radio­

chemischen Ausbeuten an [75selCH3se- erreicht werden, ist

TBAH die Base der Wahl, wenn nicht im Hinblick auf die nach­

folgenden Schritte eine andere Base günstiger erscheint.

Die Menge der Base richtet sich nach dem eingesetzten Edukt

für die zweite Alkylierung. Da in einigen Fällen 40~mol aus­

reichend waren, kann dieser Wert als Mindestmenge angesehen

werden. Er muß aber in Abhängigkeit von der Reaktivität des

zweiten Alkylierungsmittels erneut optimiert werden.

4.2.2.4. Abhängigkeit der [ 7SSe ] selenoetherbildung vom Alky­

lierungsagens

Der 4. Reaktionsschritt ist die Umsetzung des [75Se lMe­

thylselenidanions ([75selCH3Se-) mit einem zweiten Alky­

lierungsagens zum unsymmetrischen· [75SelSelenoether. Die

Reaktionen wurden in homogener Lösung bei Raumtemperatur in

74

THF oder Ether als Lösungsmittel durchgeführt. Die Reaktion

des [75SelMethylselenotriphenylphosphoniumtriflats ([75Se l­

TPPSeMeOTf) zum [75Se lMethylselenidanion ([75selCH3se-) mit

anschließender Alkylierung erfolgte als Eintopfreaktion durch

130~1 einer O,35mol/l Tetrabutylammoniumhydroxidlösung (in

wäßrigem THF) in Gegenwart von O,10mmol Alkylierungsagens (in

100~1 THF).

Tab.4.2-10: Radiochemische Ausbeute an [75Se lMethylpropyl­

selenoether bei der Umsetzung des [75selCH3Se­

mit Propylderivaten (Die RCA ist bezogen auf

n.c.a. [75Se lTPPseMeOTfj 130~1 O,35mol/l TBAH in

wäßrigem THF, O,10mmol Edukt in 100~1 THF,

Elution mit 1ml THFj 1minj RT)

Edukt PropX X=Br X=I X=OTos

RCA [tl 78±5 76±3 81±5

Bei der Untersuchung von propylderivaten zeigte sich inner­

halb der Fehlergrenze kein Unterschied in der Reaktivität des

Brom- (78%), Iod- (76%) und O-Tosylderivates (81%) (Die RCA

ist bezogen auf n.c.a. [75Se lTPPseMeOTf). Die hohe Reakti­

vität des [75selCH3se- wird auch durch die relativ schnelle

Reaktionsgeschwindigkeit deutlich: Das [75SelCH3se- reagiert

innerhalb einer 1 Minute zum Produkt. Diese hohe Reaktivität

erfordert eine Derivatisierung anderer funktioneller Gruppen

des Alkylierungsagens. Zur Vermeidung unerwünschter Neben­

reaktionen des sehr reaktiven [75selCH3se- sollte das zweite

Alkylierungsmittel gleichzeitig mit der Base auf das polymer­

gebundene [75Se lTPPSeMeOTf gegeben werden, so daß das gebil­

dete [75selCH3se- sofort zum gewünschten Produkt weiterrea­

gieren kann. Im Falle der zeitversetzten Reagenzzugabe bildet

sich mit einer radiochemischen Ausbeute von bis zu 75% ein

nicht erwünschtes Aktivprodukt. In einem Blindversuch, der

ohne Zugabe eines zweiten Alkylierungsmittels durchgeführt

75

wurde, betrug die Ausbeute dieses polaren Aktivproduktes,

dessen Retentionszeit bei der HPLchromatographischen Unter­

suchung identisch mit der des Dimethylselenoethers ist, sogar

88%. Obwohl das System frei von Methyltriflat war, scheint

das [75se]CH3Se- somit einer zweiten Methylierung zu

unterliegen. Da das Methyltriphenylphosphoniumion die einzige

mögliche Methylquelle ist, könnte folgender Mechanismus für

die Methylübertragung verantwortlich sein:

TPPI

Abb.4.2-11: Hypothetischer Reaktionsmechanismus der uner­

wünschten Bildung des Dimethylselenoethers

76

4.3. synthese von n.c.a. [75selSeienomethionin

Die beiden bisher wichtigsten Methoden zur Synthese von

[75Se ]Selenomethionin sind ein biochemisches Verfahren [28]

und die Umsetzung von elementarem Selen mit Methyllithium und

2-Amino-4-brombuttersäure [29]. Da die Synthesen jeweils nur

mit Trägerzusatz erfolgreich waren und das biochemische Ver­

fahren aufgrund der langen Reaktionszeit nicht für eine

Selen-73 Markierung geeignet ist, wurde die neue polymer­

gestützte [75Se ]Selenierung zur Darstellung von n.c.a.

[75Se ]Selenoethern auf die Synthese von n.c.a. [75Se ]Seleno­

methionin angewendet.

Elementares n.c.a. Selen-75 wurde auf polymergebundenem

Triphenylphosphin über die Zwischenstufe [75Se ]Triphenyl­

phosphinselenid zum [75Se]Methylselenotriphenylphosphonium­

triflat umgesetzt und anschließend durch Hydroxidionen als

[75Se ]Methylselenidanion wieder von dem Polymerharz freige­

setzt (siehe 4.2.). Für die nachfolgende Reaktion zum [75Se ]­

Selenomethionin sind zwei unterschiedliche Synthesestrategien

untersucht worden: Der nukleophile Angriff des [75Se ]Me­

thylselenidanions am 2-Aminobutyrolacton, bei dem sich das

[75Se ]Selenomethionin durch Spaltung des Lactonringes bildet,

und die Umsetzungen des anionischen [75Se ]Methylselenids mit

O-Tosylhomoserin, O-Tosylhomoserinmethylester oder N-BOC-2-

Amino-4-brombuttersäureethylester unter Phasentransferbedin­

gungen. Die optimierungen wurden mit dem Racemat des

jeweiligen Eduktes durchgeführt. Nur im Falle des N-BOC-

2-Amino-4-brombuttersäureethylesters wurde für die tierex­

perimentellen Untersuchungen der chirale Markierungsvorläufer

eingesetzt.

77

4.3.1. 2-Aminobutyrolacton als Markierunqsvorläufer

Die synthese des [ 75s e ]Selenomethionin erfolgte durch Umset­

zung des trägerfreien [ 75s e ]Methylselenidanions (CH3Se-" das

durch Hydroxidionen vom polymergebundenen [ 75s e ]Methylseleno­

triphenylphosphoniumtriflat freigesetzt wurde, mit 2-Amino­

butyrolacton.

75 (0) Se

Benzol

Ph J + I 75 fo-~ P--Se ÖTf - I 'eH

Ph -.!.

OH 75 -----~ H C-Se 3

Methyltriflat ~

Abb.4.3-1: Reaktionsschema zur Darstellung von [75Se ]Seleno­

methionin mit 2-Aminobutyrolacton als Markierungs­

vorläufer

Für die nukleophile Lactonspaltung kommen zwei positionen in

Frage: das carbinolische Kohlenstoffatom sowie die Keto­

funktion. Nach der HSAB-Theorie ist der carboxylische Kohlen­

stoff eine harte und der carbinolische Kohlenstoff eine wei­

che Säure. Alkylselenidanionen sollten als sehr weiche Basen

78

deshalb hauptsächlich am carbinolischen Kohlenstoffatom an­

greifen und somit gleichzeitig die Säure freisetzen und aus

der Alkoholkomponete den Selenoether bilden. Die Nukleophilie

der Alkylselenidanionen als ein entscheidender Parameter kann

aufgrund des kleinen Ionisierungspotentials und der hohen

Polarisierbarkeit für die Reaktion als ausreichend hoch ange­

sehen werden. Dies wird durch die mit guten Ausbeuten ablau­

fende makroskopische Umsetzung von Natriumphenylselenid mit

Butyrolacton bestätigt [74]. Da hierbei ausschließlich der

Angriff am carbinolischen Kohlenstoffatom beobachtet wird,

kann dies auch für die trägerfreie Reaktion des [75se]CH3Se­

mit dem 2-Aminobutyrolacton postuliert werden.

4.3.1.1. Abhängigkeit der radiochemischen Ausbeute an [75Se l­Selenomethionin von der Base

Der Einfluß unterschiedlicher Kationen (Anionenaktivatoren)

auf die Nukleophilie des [75Se ]Methylselenidanions ([75Se ]­

CH3Se-) wurde in verschiedenen Lösungsmitteln untersucht. Die

Anionenaktivatoren wurden als Hydroxide eingesetzt, die

primär die Freisetzung des [75se]CH3Se- von dem Polymer

bewirken. In homogener Phase erfolgt dann die Reaktion zum

n.c.a. [75Se ]Selenomethionin.

Tabelle 4.3-2 zeigt die radiochemischen Ausbeuten des

[75Se ]Selenomethionins für die unterschiedlichen, in THF ge­

lösten Anionenaktivator-Hydroxid-Komplexe, wobei das 2-Amino­

butyrolacton jeweils in Methanol gelöst wurde.

Durch Tetrabutylammoniumhydroxid (TBAH) konnten 70% des ele­

mentaren Selen-75 als [75se]CH3se- vom Polymer gelöst werden;

die nachfolgende Reaktion mit dem 2-Aminobutyrolacton führte

jedoch lediglich zu einer 2%igen radiochemischen Ausbeute an

[75Se )Selenomethionin.

79

Tab. 4.3-2: Radiochemische Ausbeuten an [75Se ] Selenomethionin

und [15Se ]Methylselenidanion für verschiedene Ba­

sen (Die RCA ist bezogen auf elementares Selen-75;

Reaktion zum [75Se ] Methylselenotriphenylphospho­

niumtriflat siehe 4.2., 0,2mmol Base unterschied­

licher Konzentration in THF, 1ml 0,14mol/1 2-Ami­

nobutyrolacton in Methanol; 20min; 60 0 C)

Base % RCA % RCA % Seleno-

(Konzentration) Seleno- CH3se- methionin in

methionin * Lösunq ** TBAH 2±1 70±5 3±1,5

(0,6mol/l)

NaOH/18-Krone-6 11±4 63±7 18±40

(O,lmol/l)

KOH/18-Krone-6 10±4 60±7 17±4

(O,lmol/l)

KOH/Kryptofix@222 9±4 57±8 17±4

*:

**.

(O,lmol/l)

bezogen auf Anfangsaktivität an elementarem Selen-75

bezogen auf gebildetes [75se]CH3Se-, das vom Polymer elu­

iert wurde

Zur steigerung der Ausbeute wurden Alkalihydroxide, komple­

xiert mit Kronenethern bzw. dem Kryptanden Kryptofix@2.2.2.,

als Hydroxidbasen eingesetzt. Durch die Komplexbildung haben

die Alkalihydroxide in aprotischen, organischen Solventien

eine relativ hohe Löslichkeit. Außerdem wird die Nukleophilie

des Anions [75se]CH3Se- deutlich erhöht. Die radiochemischen

Ausbeuten für die Basen 18-Krone-6/Natriumhydroxid, 18-Krone-

6/Kaliumhydroxid und Kryptofix@2.2.2/Kaliumhydroxid sind

auf grund nur geringer Unterschiede in der Reaktivität der

Kronenether- und Kryptofix-Komplexe innerhalb der Fehler­

grenze gleich groß. Im folgenden wird deshalb stellvertretend

80

für diese drei der 18-Krone-6-Ka1iumhydroxid-Komplex be­

trachtet.

Im Vergleich zu den mit TBAH erhaltenen radiochemischen Aus­

beuten an [75Se ] Selenomethionin konnte durch Verwendung von

18-Krone-6/Kaliumhydroxid der Wert von 2% auf 10% gesteigert

werden. Diese Änderung der radiochemischen Ausbeute ist im

wesentlichen auf zwei Effekte zurückführen: die geringere

Reaktivität der Base gegenüber dem polymergebundenem [75Se ]­

Methylselenotriphenylphosphoniumtriflat ([75Se ]TPPSeMeOTf)

und die Aktivierung des CH3Se- durch das Kation. Die Reakti­

vität der Base gegenüber dem [75Se ]TPPSeMeOTf wird durch die

radiochemische Ausbeute an [75se]CH3Se-, welche der eluierten

Aktivität entspricht, ausgedrückt (siehe Abschnitt 4.2.). Die

Abnahme der radiochemischen Ausbeute an [15se]CH3Se- von 70

auf 60% beim Wechsel von TBAH zu 18-Krone-6/Kaliumhydroxid

weist auf eine verminderte Reaktivität gegenüber dem

[75Se ]TPPSeMeOTf hin. Ursache ist die niedrigere Hydroxid­

ionenkonzentration, die aus der geringeren Löslichkeit des

18-Krone-6-Kaliumhydroxid-Komplexes in THF resultiert. Obwohl

die Reaktivität des 18-Krone-6-Kaliumhydroxid-Komplexes ge­

genüber dem Polymer abnimmt, steigt die radiochemische Aus­

beute bezogen auf elementares Selen-75 auf den fünf fachen

Wert an. Der Einfluß der unterschiedlichen Kationen auf die

Nukleophilie des [75se]CH3Se- wird durch den Anteil des

[75Se ]Selenomethionins an der Aktivität in der Lösung ausge­

drückt, da erst nach der Bildung des [75se]CH3se- in homoge­

ner Phase die Reaktion mit 2-Aminobutyrolacton erfolgt. Die

Ausbeute an [75Se ]Selenomethionin in Lösung ist beim 18-Kro­

ne-6-Kaliumhydroxid-Komplex sogar sechsmal höher als die für

TBAH. Dieser Wert drückt die höhere Nukleophilie des CH3Se-,

das in Verbindung mit Kalium-18-Krone-6 als unsolvatisiertes

I nacktes I Anion vorliegt, gegenüber dem 2-Aminobutyro­

lactonring aus. Mit Tetrabutylammonium als Gegenion ist die

Nukleophilie des [75se]CH3Se- durch die Solvatation vermin­

dert und somit die Ausbeute an [75Se ]Selenomethionin wesent­

lich geringer.

81

stellt man der träger freien synthese des [75Se ]Seleno­

methionins die makroskopische Synthese durch Umsetzung von

Natriumphenylselenid und 18-Krone-6 mit Butyrolacton gegen­

über, so führt die Lactonöffnung dort zu einer chemischen

Ausbeute von 85% 4- (Phenylseleno) -buttersäure [74]. Da die

Nukleophilie des CH3Se- gegenüber dem Phenylselenidanion

erhöht ist, sollten die radiochemischen Ausbeuten für die

Umsetzung mit dem n.c.a. CH3se- in der gleichen Größenordnung

liegen. Die Ursache für die geringe Ausbeute bei der n. c. a.

Synthese (17%) ist möglicherweise auf zwei konkurrierende Re­

aktionswege des [75se]CH3Se- zurückzuführen, nämlich die Bil­

dung des [75Se ]Selenomethionins und die des polaren Selen-75

Nebenproduktes. Unter den gewählten Bedingungen reagiert das

n.c.a. [75se]CH3Se- bevorzugt zum polaren Selen-75 Neben­

produkt, da die Bildung des [75Se ]Selenomethionins vermutlich

eine langsamere Kinetik besitzt. Bei der makroskopischen

Umsetzung spielt diese Nebenreaktion eine untergeordnete

Rolle.

4.3.1.2. Abhängigkeit der radiochemischen [ 7SSe ]Selenomethio­

ninausbeute vom Lösungsmittel

Die öffnung des Lactonringes ist eine SN2-Reaktion, so daß

zur Stabilisierung des Übergangs zustandes solche Reaktionen

bevorzugt in polaren, aprotischen Solventien hoher Lösungs­

mittelpolarität durchgeführt werden. Da bei makroskopischen

Umsetzungen von Natriumphenylselenid mit Butyrolacton in DMF

und HMPA auch in Abwesenheit von Kronenether-Komplexen gute

Ausbeuten erreicht worden sind [75,76], wurden für die n.c.a.

Synthese des [75Se ]Selenomethionin mit 2-Aminobutyrolacton

als Markierungsvorläufer diese beiden Lösungsmittel ausge­

wählt. Als Basen wurden TBAH, 18-Krone-6/Natriumhydroxid, 18-

Krone-6/Kaliumhydroxid und Kryptofix®2. 2.2. /Kaliumhydroxid

eingesetzt (Reaktionsbedingungen s.Tab 4.3-2) •

82

Werden die Base und das 2-Aminobutyrolacton in DMF gelöst, so

ist in keinem Fall [7SSelSelenomethionin eindeutig nachzuwei­

sen. Dieses kann nicht auf die jeweilige Base zurückgeführt

werden, sondern ist vermutlich auf eine spezifische Wechsel­

wirkung des DMF's mit dem Polymer zurückzuführen.

Zur weiteren Untersuchung wurde die Base (wie in 4.3.1.1.) in

THF gelöst und nur das 2-Aminobutyrolacton in DMF. Bei den

Alkalihydroxid-Kronenether- bzw. Krytofix-Komplexen war eine

innerhalb der Fehlergrenze identische radiochemische Ausbeute

von 3% zu beobachten, in Gegenwart von TBAH bildete sich

jedoch kein [7SSe l Selenomethionin. Im Vergleich zu den Aus­

beuten in Methanol (als Lösungsmittel des 2-Aminobutyro­

lactons) ist aber immer noch ein drastischer Abfall der

radiochemischen Ausbeute festzustellen. Da die Abnahme wie­

derum bei allen verwendeten Basen zu beobachten ist, ist

dieses auf das DMF als Lösungsmittel des 2-Aminobutyrolactons

zurückzuführen und nicht auf die unterschiedlichen Kationen.

Durch den Wechsel von einem pro tischen zu einem aprotischen

Lösungsmittel wäre eigentlich ein Anstieg der radiochemischen

Ausbeute zu erwarten. Beobachtet wurde aber eine Abnahme der

Ausbeute an [7SSe l Selenomethionin, entsprechend einer ver­

mehrten Nebenproduktbildung. Wird das 2-Aminobutyrolacton in

HMPA, ein sehr potentes Lösungsmittel für SN2-Reaktionen,

gelöst, nimmt die Nebenproduktbildung ebenso wie bei DMF zu.

Aprotische, polare

Nebenproduktbildung

Lösungsmittel beschleunigen also die

stärker als die Reaktion zum [1SSel Se-

lenomethionin und sind somit für die Reaktion ungeeignet. Die

günstigste Kombination der Lösungmittel für die Reaktion ist

somit THF als O,lmol/l 18-Krone-6-Kaliumhydroxidlösung und

Methanol als O,14mol/l 2-Aminobutyrolactonlösung.

83

4.3.1.3. Abhängigkeit der radiochemischen Ausbeute des

[75Se ]Selenomethionins von der Eduktkonzentration,

Reaktionszeit und Reaktionstemperatur

Die nachfolgenden Untersuchungen dienten der optimierung der

Synthese des [75Se )Selenomethionin mit 2-Arninobutyrolacton

als Markierungsvorläufer. Zunächst wurde die Konzentration

des Eduktes 2-Arninobutyrolacton variiert. Es sollte vor allem

versucht werden, die Markierungsvorläufermenge zu verringern,

um eine leichtere Abtrennung des Produktes aus dem Reaktions­

gemisch zu ermöglichen. Das Ergebnis ist in Tabelle 4.3-3

dargestellt. Die Synthesen wurden mit 2ml einer O,lmol/l

18-Krone-6-Kaliumhydroxidlösung in THF und lml Methanol als

Lösungsmittel des 2-Arninobutyrolactons durchgeführt. Die Re­

aktionstemperatur betrug 60·C und die Reaktionszeit 20 min.

Tab.4.3-3: Abhängigkeit der radiochemischen Ausbeute an

[75Se ]Selenomethionin von der Konzentration des

2-Arninobutyrolactons (Die RCA ist bezogen auf ele­

mentares n.c.a. Selen-75 ; 2ml einer O,lmol/l

18-Krone-6-Kaliumhydroxidlösung in THF, lml metha­

nolische 2-Arninobutyrolactonlösung; 20min; 60·Cl

2-Aminobutyrolacton [mol/1] 0,05 0,09 0,11 0,14

Radiochemische Ausbeute [%] 6±2 9±4 11±4 10±4

Die Abhängigkeit der radiochemischen Ausbeute von der Konzen­

tration des 2-Arninobutyrolactons zeigt, daß die maximale Aus­

beute von etwa 11% bei O,llmol/l 2-Arninobutyrolacton erreicht

wird. Die weitere Erhöhung der 2-Arninobutyrolactonkonzen­

tration führt zu keiner Zunahme der Ausbeute an [75Se ] Se­

lenomethionin. Die Verringerung auf <0,09mol/l bewirkt jedoch

eine Abnahme der radiochemischen Ausbeute, so daß die

84

optimale 2-Aminobutyrolactonkonzentration im Bereich von

O,10-0,12mol/l liegt.

Schließlich wurde die Reaktion hinsichtlich der Reaktionszeit

und Reaktionstemperatur optimiert. Zu diesem Zweck wurde die

Kinetik für die Bildung des [75Se ]Selenomethionins bei Raum­

temperatur und 60·C ermittelt. Das Ergebnis ist in Abbildung

4.3-4 zusammengefaßt.

14

"" a 12 ..... a 0 ..... 10 .c .., ~ 8 a Q) rl Q) 6

'" ~ Q)

",'" 4 "'-'

t'J 2 a:

5 10 15 20 25

Zeit emin]

Abb.4.3-4: Abhängigkeit der radiochemischen Ausbeute an

[75Se ]Selenomethionin von zeit und Temperatur (Die

RCA ist bezogen auf elementares n.c.a. Selen-75 ;

2ml einer O,1mol/l 18-Krone-6-Kaliumhydroxid in

THF, 1ml O,12mol/l 2-Aminobutyrolacton in

Methanol)

Es ist zu erkennen, daß erwartungsgemäß eine Reaktionskinetik

pseudo-erster Ordnung vorliegt und bei beiden Reaktions­

temperaturen eine maximale radiochemische Ausbeute von 11%

erreicht wird. Die apparente Reaktionskinetik ist für beide

Temperaturen nicht wesentlich verschieden. Das Maximum der

radiochemischen [75Se ]Selenomethioninausbeute ist bei 20·C

85

nach etwa l2min und bei einer Reaktionstemperatur von 60·e

nach 10min erreicht. Die Ausbeute wird somit durch die Tempe­

raturerhöhung innerhalb der Fehlergrenze nicht erhöht.

4.3.2. O-Tosylhomoserinmethylester als Markierungsvorläufer

Um eine höhere radiochemische Ausbeute an n.c.a. [75Se ]Se­

lenomethionin zu erhalten, sollte die [75Se ]Methylselenierung

von Buttersäurederivaten untersucht werden. Zuerst wurde die

nicht veresterte 2-Amino-4-0-tosylbuttersäure (O-Tosylhomo­

serin) als Markierungsvorläufer eingesetzt. Die Darstellung

des polymergebundenen [75Se]Methylselenotriphenylphosphonium­

triflats erfolgte unter den in 4.2. optimierten Bedingungen

mit einer Ausbeute von 70%. Die Aktivität wurde dann als

[75Se ]Methylselenidanion durch Tetrabutylammoniumhydroxid vom

Polymer freigesetzt und in verschiedenen Lösungsmitteln (Me­

thanol, DMF, Wasser) mit dem Markierungsvorläufer umgesetzt.

Eine Bildung von [75Se ]Selenomethionin war sowohl durch Än­

derung der O-Tosylhomoserinkonzentration (0,10-0,25mmol/l),

als auch durch unterschiedliche Tetrabutylammoniumhydroxid­

konzentrationen (0,27-0,86M) im untersuchten Temperaturbe­

reich (20-70·C) nicht zu beobachten. Die Auswirkung einer Er­

höhung der Nukleophilie des [75Se ]Methylselenidanions durch

Anionenaktivatoren (z.B. der l8-Krone-6-Kalium-Komplex) oder

ein Austausch des Tosylrestes durch eine bessere Abgangs­

gruppe (z.B. Triflat) wurde nicht untersucht, da auf grund

früherer Arbeiten [32] bekannt war, daß die Reaktivität des

[75Se ]Methylselenidanions für die nukleophile Substitution

des Tosylates ausreichend hoch ist. Die Ursache für die

unterbliebene [75Se ]Methylselenierung ist möglicherweise auf

eine basisch induzierte, intramolekulare Umsetzung des Eduk­

tes zum 2-Aminobutyrolacton zurückzuführen. Andererseits ist

auch die Bildung eines Ionenpaares zwischen dem [75Se ]Methyl­

selenidanion und der Aminofunktion des Markierungsvorläufers

denkbar, so daß eine SUbstitution des Tosylatrestes

86

verhindert wird. Im Falle der Bildung des 2-Aminobutyro­

lactons ist die Reaktivität des [75Se lTetrabutylammonium­

methylselenids zu gering (siehe 4.3.1.), um den Lactonring

zum [75SelSelenomethionin zu öffnen.

Zur Vermeidung der intramolekularen Reaktion des Markierungs­

vorläufers zum Lacton, wurde der veresterte Vorläufer 2-Ami­

no-4-0-tosylbuttersäuremethylester (O-Tosylhomoserinmethyles­

ter) für die Synthese eingesetzt. Die Reaktion zum

[75Se l Selenomethionin mit O-Tosylhomoserinmethylester als

Edukt erfolgte nach dem in Abbildung 4.3-5 dargestellten

Reaktionsschema. Das polymergebundene [75Se lMethylselenotri­

phenylphosphoniumtriflat ([ 75Se lTPPSeMeOTf) wurde in einer

radiochemischen Ausbeute von 70% aus elementaren Selen-75

erhalten (s. Abschnitt 4.2.).

15 (0) Se f-o-

Ph

'I '\ /

- "­Ph Benzol to-r "s,

Ph

jh +

to-' p_15se J-_ I ' OTf Ph eH3

TBAH 75

---~ H3C-Se

Methyltriflat ~

Abb.4.3-5: Reaktionsschema zur Darstellung von [75SelSeleno­

methionin mit O-Tosylhomoserinmethylester als Mar­

kierungsvorläufer.

87

Im folgenden sind die radiochemischen Ausbeuten an [75Se ]­

Selenomethioninmethylester auf das gebildete [75Se ]TPPSeMeOTf

bezogen. Durch Tetrabutylammoniumhydroxid (TBAH) erfolgte die

Elution des [75Se ]Methylselenidanions ([75se]CH3se-), welches

mit dem O-Tosylhomoserinmethylester zum [75Se ]Selenomethio­

ninmethylester reagierte. Das [75Se ]Selenomethionin wurde

durch anschließende saure Hydrolyse gebildet.

4.3.2.1. Abhängigkeit der Ausbeute des [ 75Se ]Selenomethionin­

methylesters von der Tetrabutylammoniumhydroxidkon­

zentration und vom Solvens

Als wichtiger Parameter wurde für die Optimierung der radio­

chemischen Ausbeute zuerst die Tetrabutylammoniumhydroxid­

konzentration (TBAH) untersucht. Die Hydroxidionen sind für

die Bildung des deprotonierten [75Se ]Methylselenidanions

(CH3Se-) als nukleophiles Teilchen aus dem polymergebundenen

[75Se ]TPPSeMeOTf notwendig. Gleichzeitig sind die Hydroxid­

ionen aber auch selber nukleophil, so daß es zu Konkurrenz­

reaktionen kommt, die z.B. die Eduktmenge drastisch reduzie­

ren können.

Abbildung 4.3-6 zeigt ein Maximum der radiochemischen Ausbeu­

te von 50% [75Se ]Selenomethioninmethylester (bezogen auf

[75Se ]TPPSeMeOTf) bei einer Konzentration von O,3lmol/l TBAH.

Im Bereich von O,lO-O,30mol/l TBAH wird durch die zunehmende

Hydroxidionenkonzentration mehr [75Se]CH3se- aus dem [75Se ]­

TPPSeMeOTf gebildet, welches anschließend mit dem 0-

Tosylhomoserinmethylester zum [75Se ]Selenomethioninmethyl­

ester reagiert. Bei TBAH-Konzentrationen oberhalb 0, 34mol/l

fällt die radiochemische Ausbeute an [75Se ]Selenomethionin­

methylester ab. Da aufgrund der ansteigenden Hydroxidionen­

konzentration die Hydrolyse des Eduktes zum Homoserin-

methyle ster bzw. Homoserin signifikant

[75se]CH3se- zu einer

zunimmt, führt die

vermehrten Bildung Freisetzung des

eines Selen-75

der ionischer

markierten Nebenproduktes,

Verbindungen entspricht.

88

dessen Polarität

Eine strukturelle

Zuordnung dieses unerwünschten, polaren Aktivproduktes war

jedoch bisher nicht möglich.

'" 60

55 k CI) 50 .... '" 45 CI) <:

• .-1 40 <: 0

35 • .-1 .<:: .... 30 ~ 0 25 <: CI) 20 rl CI)

15 Ul

hl 10

5

0 0,05 0,10 0,15 0,20 0,25 0,30 0,35 0,40

C (TBAH) [mol/I]

Abb.4.3-6: Abhängigkeit der radiochemischen

[75Se]Selenomethioninmethylester von

zentration (Die RCA ist bezogen

[75Se ] TPPSeMeOTf i TBAH in O,5ml

0,45 0,50

Ausbeute an

der TBAH-Kon­

auf n. c. a.

wäßrigem THF,

O,5ml O,20moljl O-Tosylhomoserinmethylester in

Methanol; 15 mini RT)

Der [75Se lMethylselenierung liegt ein SN2-Reaktionsmechanis­

mus zugrunde. In polaren, aprotischen Sol ventien mit hoher

Lösungsmittelpolarität sollte daher eine Erhöhung der radio­

chemischen Ausbeute erwartet werden. Aus diesem Grund wurde

der Markierungsvorläufer in DMF gelöst. Die Freisetzung des

[75Se lCH3se- vom Polymer erfolgte durch O,31mol/1 TBAH in

THF, da in DMF (als Lösungsmittel des TBAH) die Ausbeute des

89

[75Se lMethylselenierungsagens [75selCH3se- abnimmt (s. Ab­

schnitt 4.2.). Die erwartete Ausbeuteerhöhung konnte jedoch

bei Verwendung von DMF nicht beobachtet werden, sondern ein

drastischer Abfall auf 4±3% [75SelSelenomethioninmethylester.

Die Erhöhung der Reaktiontemperatur auf 60·C hatte ebenso

keinen Einfluß auf die Ausbeute. Die Reaktion zum sehr

polaren Selen-75 Nebenprodukt entsprach dabei der Abnahme der

Produktbildung. Offensichtlich wird die Konkurrenzreaktion

des [75selCH3se-, d.h. die Bildung des sehr polaren Selen-75

Produktes, durch DMF als Lösungsmittel stärker begünstigt als

die Reaktion zum [75SelSelenomethioninmethylester. DMF ist

als Lösungsmittel für die Reaktion des [75selCH3Se- mit dem

O-Tosylhomoserinmethylester ungeeignet, so daß die Sekundär­

alkylierung zum [75SelSelenomethioninmethylester im folgenden

in THF!Methanol durchgeführt wurde.

4.3.2.2. Abhängigkeit der [75selSelenomethioninmethylester­

bildung von der Eduktkonzentration und Reaktionszeit

Die Optimierung der radiochemischen Ausbeute des [75Se lSe -

lenomethioninmethylesters hinsichtlich der O-Tosylhomoserin­

methylesterkonzentration ist in Abbildung 4.3-7 dargestellt.

Es zeigte sich, daß die Konzentration der methanolischen 0-

Tosylhomoserinmethylesterlösung mindestens 0,l8mol!1 betragen

muß, um den Sättigungsbereich der radiochemische Ausbeute

(bezogen auf n.c.a. [75Se lTPPSeMeOTf) von 50% [75SelSeleno­

methioninmethylester zu erreichen. Diese relativ hohe Edukt­

konzentration resultiert aus der zur Markierung konkur­

rierenden Hydrolyse des Eduktes durch das TBAH. Dadurch kommt

es bei niedrigen Eduktkonzentrationen zur vermehrten Bildung

des sehr polaren Selen-75 markierten Nebenproduktes aus dem

e5Sel CH3Se-.

90

60

dI' 55

... 50 CI)

45 ..., ., CI) 40 s:: ..... 35 s:: 0

30 ..... ..c: ..., CI)

25

E 20 0 s:: CI) 15 .... CI) 10

'" ~ 5

~ 0 0,00 0,05 0,10 0,15 0,20 0,25 0,30

c(O-Tosylhomoserinmethylester) [molli]

Abb.4.3-7: Abhängigkeit der radiochemischen Ausbeute an

[75Se ]Selenomethioninmethylester von der O-Tosyl­

homoserinmethylesterkonzentration (Die RCA ist

bezogen auf n.c.a. [75Se ]TPPSeMeOTf i Reaktionsbe­

dingungen s. Abb. 4.3-6)

Zur weiteren Optimierung der Reaktion wurden die Parameter

Temperatur und Zeit untersucht. Das Ergebnis ist in Abbildung

4.3-8 zusammengefaßt.

Die sättigungsausbeute der [75 Se] Selenomethioninmethylester­

bildung von 50% (bezogen auf n. c. a. [75Se ] TPPSeMeOTf) wird

bei Raumtemperatur nach etwa 10 min erreicht.

Reaktionszeit nimmt die Menge des gebildeten

Bei längerer

[75Se ]Seleno-

methioninmethylesters langsam zugunsten des [75Se ]Seleno­

methionin ab. Ursache hierfür ist die basisch katalysierte

Hydrolyse des Selen-75 markierten Methylesters zur freien

Säure. Betrachtet man die Summe aus gebildetem [75Se ]Seleno­

methioninmethylester und [75Se ]Selenomethionin als Produkt

der Umsetzung von [75se]CH3Se- mit dem O-Tosylhomoserin­

methylester , so ist für die Reaktion erwartungsgemäß eine

Kinetik pseudo-erster Ordnung zu erkennen.

91

60

55 ~

dP 50

<ll 45 .jJ ::s 40 <ll .0 UJ J5 .§l <ll

JO

.g 25 UJ -g <ll

20

.g 15 0

10 B &! 5

0 0

RT

60·C

[75Selselenomethioninmethylester

[75SelSelenomethionin

10 20

Zeit [min]

60·C

RT

JO 40

Abb.4.3-8: Abhängigkeit der radiochemischen Ausbeute an

[75Se ]Selenomethioninmethylester von der Reakti­

onszeit (Die RCA ist bezogen auf n.c.a.

[75Se ]TPPSeMeOTf ; Reaktionsbedingungen siehe Abb.

4.3-6)

Bei einer Temperatur von 60°C ist die maximale radiochemische

Ausbeute des [75Se ]Selenomethioninmethylesters im Vergleich

zur Raumtemperatur praktisch unverändert. Die Ausbeute an

[15Se ]Selenomethioninmethylester ist demzufolge zwischen 20

und 60°C praktisch temperaturunabhängig. Die Geschwindigkeit

der Hydrolyse zum [75Se ]Selenomethionin nimmt hingegen bei

60°C etwa um den Faktor 2 zu.

Eine Steigerung der radiochemischen Ausbeute durch eine

nukleofugere Abgangsgruppe, z.B. einer Triflatgruppe, ist

nicht zu erwarten, da sich bei der Markierung von einfachen

Alkylderivaten mit Brom, Iod oder Tosylat als Abgangsgruppe

keine Unterschiede in der Reaktivität gegenüber dem

92

[75se]CH3se- gezeigt haben (siehe 4.2.2.4.). Daß die Nukleo­

philie des [75Se]CH3se- in THF/MeOH für diese SN2-Reaktion

ausreichend hoch ist, zeigt sich auch in der trägerhaltigen

Synthese des [75Se ]Selenomethionins von Plenevaux et. ale

[29], der mit dem entsprechenden Bromderivat in THF/EtOH

radiochemische Ausbeuten von 80% erhalten konnte.

4.3.2.3. Hydrolyse des [75selSelenomethioninmethylesters

Der [75Se ]Selenomethioninmethylester wurde sauer hydroly­

siert, um eine mögliche Racemisierung im Verlauf einer alka­

lischen Verseifung zu vermeiden. In Abbildung 4.3-9 ist die

Verseifung durch 6mol/l Salzsäure für 20, 60 und 100°C

dargestellt.

100

"" <! ..... <! 80 0 .....

.<::

.j.J <1J Ei 60 0 <! <1J

r-i <1J

40 '" <1J

on'" ~~

..: 20

~

0 0 20 40 60 80 100

Zeit [min]

Abb.4.3-9: zeit- und Temperaturabhängigkeit der radiochemi­

schen Ausbeute an [75Se ]Selenomethionin durch sau­

re Hydrolyse des [75Se ]Selenomethioninmethylesters

(Die RCA ist bezogen auf n.c.a. [75Se ]se­

lenomethioninmethylester ; bei t=o Zugabe von

0,3ml 6mol/l Salzsäure)

93

Eine deutliche Steigerung der Hydrolysegeschwindigkeit zum

[75Se ]Selenomethionin ist bei höherer Reaktionstemperatur zu

erkennen. Die Sättigungsausbeute von 85% ist bei Raumtempe­

ratur nach 70 Minuten, bei 60·C nach 45 Minuten und bei ~OO·C

nach 25 Minuten erreicht. Dieses entspricht einer radioche­

mischen Ausbeute an [75Se ]Selenomethionin von 30% bezogen auf

eingesetztes elementares Selen-75.

Versuch der Reinigung des [ 75Se ]Seleno11let;hionin durch Fest;­

phasenfixierung

Zur Vermeidung einer zeitaufwendigen HPLC-Trennung zur Rei­

nigung des Produktes wurde versucht, das n.c.a. [75se ]se­

lenomethionin durch eine Festphasenfixierung aus dem Reak­

tionsgemisch zu isolieren. Dazu wurde die salzsaure Lösung

fast zur Trockne eingedampft, der Rückstand mit Methanol

aufgenommen und die methanolische Lösung auf eine neutrale

AI203-SEP-PAK Kartusche aufgegeben. In Analogie zu der Tren­

nung von [35S]HOmocysteinthiolacton und [35S]Methionin [77]

sollten die Nebenprodukte durch weiteres Methanol eluiert

werden und das Produkt auf der Kartusche fixiert bleiben. Die

anschließende Elution des [75Se ]Selenomethionins erfolgte

durch destilliertes Wasser. Die HPLchromatographische Unter­

suchung zeigte jedoch, daß sowohl [75Se ]Selenomethionin im

Methanol nachzuweisen war, als auch im wäßrigen Eluat aktive

und inaktive Nebenprodukte enthalten waren. Diese Festphasen­

fixierung ist somit für die Abtrennung des [75Se ]Seleno­

methionins von den Nebenprodukten nicht geeignet. Es wurde

deshalb eine HPLC-Abtrennung durchgeführt.

94

4.3.3. synthese des [75SelSelenomethionins ausgehend von

N-BOC-2-Amino-4-brombuttersäureethylester

Der N-BOC-2-Amino-4-brombuttersäureethylester ist auf grund

seiner gröBeren Lipophilie im Vergleich zum O-Tosylhomoserin­

methylester auch in unpolaren, aprotischen Lösungsmitteln wie

THF oder Ether gut löslich. Da hierdurch die Verwendung pro­

tischer Solventien wie Methanol vermieden werden kann, wurde

eine weitere steigerung der radiochemischen Ausbeute an

[75Se jSelenomethionin erwartet. Zusätzlich können hydrophile,

aktive und inaktive Nebenprodukte durch eine Festphasenfixie­

rung einfach und schnell abgetrennt werden.

Die Synthese des [75Se jSelenomethionins erfolgte gemäß dem in

Abb. 4.3-10 dargestellten Reaktionsschema. Das polymerge­

bundene n.c.a. [75SejMethylselenotriphenylphosphoniumtriflat

'I '\ / 75, (0)

::;e • f-o-

Ph

- "­Ph Benzol

fo-' lh 75 J~ - r-s~ OTf Ph eH3

TBAH

•

Abb.4.3-10: Reaktionsschema zur

[75Se jSelenomethionin

Methyltriflat •

Darstellung des n.c.a.

mit N-BOC-2-Amino-4-brom-

buttersäureethylester als Markierungsvorläufer

95

([75Se ] TPPSeMeOTf) wurde in der herkömmlichen Weise (s. Ab­

schnitt 4.2.) synthetisiert. Durch Tetrabutylammoniumhydroxid

(TBAH) konnte das [75Se ]Methylselenidanion ([75se]CH3se-) vom

Polymer freigesetzt werden und durch Reaktion mit dem N-BOC-

2-Amino-4-brombuttersäureethylester (BABBE) den [75Se ]-N-BOC­

Selenomethioninethylester bilden. Das n.c.a. [75Se ]Seleno­

methionin entsteht durch sauer katalysierte Abspaltung der

BOC-Gruppe und nachfolgende Verseifung des Esters.

Die nachfolgenden Untersuchungen dienten zur optimierung der

Synthese des [75Se ] -N-BOC-Selenomethioninethylesters hin­

sichtlich der eingesetzten TBAH-, Eduktkonzentration sowie

der Reaktionszeit. Zusätzlich wurde die zeit- und Temperatur­

abhängigkeit der Abspaltung der Schutzgruppen untersucht.

4.3.3.1. Abhängigkeit der Ausbeute an [ 75Se l-N-Boc-seleno-

methioninethylester von der Tetrabutylammonium-

hydroxidkonzentration

Das durch TBAH freigesetzte [75se]CH3se- reagierte entweder

zum [75Se ]-N-BOC-Selenomethioninethylester (N-BOC-SeMetEt)

oder zu einem sehr polaren Selen-75 Nebenprodukt nicht be­

kannter Struktur, das unter den gewählten Chromatographiebe­

dingungen mit dem Totvolumen eluiert wird. Die radio­

chemischen Ausbeuten des Produktes sowie des Nebenproduktes

in Abhängigkeit von der TBAH-Konzentration sind in Abbildung

4.3-11 dargestellt. Die [75Se ]-N-BOC-SeMetEt-Bildung erreicht

ihr Maximum von 57% (bezogen auf n.c.a. [75Se ] TPPSeMeOTf) bei

einer TBAH-Konzentration von O,43mol/l. Die deutliche Minde­

rung der Ausbeute an [75Se ]-N-BOC-SeMetEt bei TBAH-Konzentra­

tionen unterhalb von 0,40mol/l ist auf die geringere Ausbeute

an freigesetztem [75se)CH3Se- zurückzuführen. Die Ursache

hierfür ist die nicht vollständige Reaktion des polymergebun­

denen [75Se )TPPSeMeOTf [75se]CH3se- bei TBAH-Mengen <60Jlmol

(gelöst in 150Jll THF) . Von dem nicht umgesetzten

96

70,----------------------------------------------,

'" 60 ~

Q) ..., ~ 50

.g ~ 40

Q)

f1 30

"' .... ~ 20

o .... ~ 10

• es se)-N-BX!-selE!lC1lethionirester o polares selen-75-Produkt

0+--r-,--r-,--r-,--r-~~_.~--r_~_r~--r_4 0,0 0,2 0,4 0,6 O,B 1,0 1,2 1,4 1,6

c (Tetrabutylammoniumhydroxid) [mol/I]

Abb.4.3-11: Abhängigkeit der radiochemischen Ausbeute der

Selen-75 Produkte von der TBAH-Konzentration (Die

RCA ist bezogen auf n.c.a. [75Se]TPPSeMeOTfi TBAH

in 150JLI wäßrigem THF, 100JLl l,30mol/l BABBE in

THF, Elution mit 1ml THF, 15 min, RT)

[75Se ]TPPSeMeOTf konnte durch eine nachfolgende zweite Umset­

zung mit TBAH das [75se]CH3se- vom Polymer freigesetzt wer­

den. Dieses zeigt, daß das [75Se]TPPSeMeOTf noch chemisch

'intakt' war. Werden TBAH-Konzentrationen >O,47mol/l für die

Synthese eingesetzt, so nimmt die Ausbeute an [75Se ]-N-BOC­

SeMetEt im Gegensatz zu der von [75se]CH3Se- ab. Gleichzeitig

wird mit zunehmender Hydroxidionenkonzentration die langsame

Zersetzung des BABBE zum N-BOC-Homoserinethylester beobach­

tet, so daß die [75Se ]Methylselenierung auf grund der Edukt­

hydrolyse nur noch in geringerem Maße ablaufen kann. Das

[75se]CH3Se- reagiert unter diesen Bedingungen bevorzugt zu

einem polaren Selen-75 Nebenprodukt, so daß die radio­

chemische Ausbeute an [75Se ]-N-BOC-SeMetEt bei TBAH-Kon­

zentrationen >O,4mol/l langsam wieder abfällt. Im Vergleich

97

zum O-Tosylhomoserinmethylester (siehe 4.3.2.) ist wegen der

höheren Stabilität des Bromderivates eine deutlich langsamere

Hydrolyse des BABBE zu erkennen.

wird der Markierungsvorläufer zeitversetzt zugegeben, so

steigt die Ausbeute des polaren Selen-75 Nebenproduktes zuun­

gunsten der [75Se l-N-Boc-seMetEt-Bildung stark an. Die Reak­

tion zum polaren Selen-75 markierten Nebenprodukt erfolgt

offensichtlich sofort nach der Bildung des [75selCH3se- aus

dem [75SelMethylselenotriphenylphosphoniumion. Deshalb ist es

notwendig, daß der Markierungsvorläufer direkt bei der

Bildung des [75SelCH3se- anwesend ist, damit die Reaktions­

wahrscheinlichkeit zwischen dem [75selCH3Se- und dem Butter­

säurederivat und somit die Bildung des [75Se l-N-BoC-SeMetEt

bevorzugt wird.

Die Optimierungsuntersuchungen zeigen, daß die TBAH-Konzen­

tration zwischen 0,40 und 0,45mol/l (in 1501'1 THF) betragen

sollte, so daß das [75Se lTPPSeMeOTf vOllständig zum

[75selCH3se- reagiert und darüber hinaus das eingesetzte

Edukt nur in geringem Maße hydrolysiert wird.

4.3.3.2. Abhängigkeit der radiochemischen Ausbeute an [ 758e ]­

N-BOC-Se1enomethioninethy1ester von der Eduktkonzen­

tration

Der Einfluß der Abgangsgruppe des Markierungsvorläufers wurde

anhand des N-BOC-2-Amino-4-iod-buttersäureethylesters unter­

sucht. Da Iod im Vergleich zum Brom eine bessere Abgangs­

gruppe für eine SN2-Reaktion ist, wurde eine Zunahme der Aus­

beute der [75SelMethylselenierung erwartet. Dies konnte

jedoch nicht beobachtet werden. Die Reaktivität des

c?5selCH3se- ist offenbar so hoch, daß eine Veränderung der

Ausbeute durch Variation der Abgangsgruppen Iod und Brom nur

gering ist. Da jedoch daS Bromderivat eine höhere Hydrolyse­

stabilität aufweist, wurde für die weiteren Untersuchungen

auf den Einsatz der Iodverbindung verzichtet.

98

Zur einfacheren Isolierung der trägerfreien Menge des [75Se l­

N-BOC-SeMetEt ist die Minimierung der Eduktstoffmenge ohne

Minderung der radiochemischen Ausbeute zweckmäßig. Die Abhän­

gigkeit der radiochemischen Ausbeute von der BABBE-Konzen­

tration ist in Abbildung 4.3-12 dargestell t. Sie zeigt in

etwa den für eine Reaktion pseudo erster Ordnung erwarteten

Reaktionsverlauf. Um die Sättigungsausbeute von 57% [75Se l-N­

BOC-SeMetEt zu erreichen, kann die Eduktkonzentration unter

den gewählten Reaktionsbedingungen auf O,90mol/l begrenzt

werden. Geringere Eduktkonzentrationen führen zu einer Ver­

minderung der radiochemischen Ausbeute an [75Se l-N-BOC­

SeMetEt. Demgegenüber bleibt die radiochemische Ausbeute bei

höheren Eduktkonzentrationen bis 1,4mol/l unverändert.

70

"" 60 1-1 QJ ....,

'" QJ 50 ~

"a 0 40 "n

.<:1 ...., QJ

Ö ~

30 QJ rl QJ

20 Ul I

U 0 I<l 10 :I:

~ 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4

c (N-Boc-2-Amino-4-brombuttersäureester) [mol/ll

Abb. 4. 3-12: Abhängigkeit der radiochemischen Ausbeute an

[75Se l-N-BOc-Selenomethioninethylester von der

BABBE-Konzentration (Die RCA sind bezogen auf

n.c.a. [75SelTPPSeMeOTfi 150J.Ll O,43mol/l TBAH in

wäßrigem THF, BABBE in 100J.Ll THF, sonstige Reak­

tionsbedingungen s. Abb. 4.3-11)

99

4.3.3.3. Abhängigkeit der radiochemischen Ausbeute an [ 75Se ]­

N-BOC-Selenomethioninethylester von der Reaktions­

zeit

Die nachfolgende Untersuchung diente der Optimierung des

r7 5Se]-N-BOC-SeMetEt hinsichtlich der Reaktionszeit. wie

Abbildung 4.3-13 zeigt, hat die Reaktion des [75se]CH3Se- mit

dem BABBE nach 10 Minuten das Maximum der radiochemische Aus­

beute von 57% [75Se ]-N-BOC-SeMetEt erreicht. Eine längere

Reaktionszeit fUhrt zu einer allmählichen Abnahme der [75Se ]­

N-BOC-SeMetEt-Konzentration, die durch eine alkalische Ver­

seifung des Esters verursacht wird.

70

"" ~ ~ 60 Q) ...., III

~ 50 0'-; 1'1 0

0'-; 40 .J:l ....,

§ 30 Q) ..... Q) 20 Ul I

8 p:J 10 I Z

~ 0 0 10 20 30 40 50 60

Zeit [rnin]

Abb. 4.3-13: Abhängigkeit der radiochemischen Ausbeute an

[75Se ]-N-BOC-selenomethioninethy1ester von der

Reaktionzeit (Die RCA sind bezogen auf n.c.a.

[75Se ]TPPSeMeOTf ; 1501'1 0,43mo1/1 TBAH in wäß­

rigem THF, 1001'1 1,30mo1/l BABBE in THF, sonstige

Reaktionsbedingungen s. Abb. 4.3-11)

100

Eine Temperaturerhöhung auf 70·C bewirkt keine meßbare Verän­

derung des Maximums der radiochemischen Ausbeute an [75Se l-N­

BOC-SeMetEt, die Verseifung des Produktes wird jedoch durch

die Temperaturerhöhung etwa um den Faktor 2 beschleunigt.

4.3.3.4. Abspaltung der Schutzgruppen des [7SSe lN-Boc-seleno­

metbioninetbylesters unter Bildung von [7SselSeleno­

metbionin

Um das freie [75SelSelenomethionin zu erhalten, muß die BOC­

Gruppe abgespalten und der Ester verseift werden. Zur Vermei­

dung einer möglichen Racemisierung im Verlauf einer alkali­

schen Verseifung wurde der [75Se l-N-Boc-seMetEt sauer

hydrolysiert i gleichzeitig erfolgt die acidolytische Abspal­

tung der BOC-Gruppe. Die Zeitabhängigkeit der Schutzgruppen­

abspaltung des [75Se l-N-BoC-SeMetEt durch 6mol/l Salzsäure

ist in Abbildung 4.3-14 für 60 und 100·C dargestellt.

100

"" BO <: .... <: 0 .... 60 .<: +J ., 5 <: 40 ., .... ., tIl

..: ~

20

0 0 10 20 30 40 SO 60 70

Zeit [min]

Abb.4.3-14: zeit- und Temperaturabhängigkeit der Schutzgrup­

penabspaltung unter Bildung von [75SelSeleno­

methionin in Gegenwart von 6mol/l Salzsäure (Die

RCA ist bezogen auf n.c.a. [75Se l-N-BOc-seMetEt)

101

85% des [75Se l -N-BOC-Selenomethioninethylesters konnten bei

60·C nach 50 Minuten und bei 100·C nach 27 Minuten zum

[75SelSelenomethionin umgesetzt werden. Durch die Temperatur­

steigerung ist somit eine Zunahme der Hydrolysegeschwindig­

keit um fast das Doppelte festzustellen. Bei längerer Reak­

tionszeit, insbesondere bei 100·C, wurde eine langsame Zer­

setzung des Produktes beobachtet. Wurde die Lösung nach 30

Minuten auf Raumtemperatur abgekühlt, so waren nach 24 Stun­

den kaum weitere Zersetzungprodukte (Zunahme <1%) zu

beobachten.

Im Reaktionschema 4.3-15 sind die einzelnen Schritte zur Syn­

these des n.c.a. [75SelSelenomethionins hinsichtlich ihres

Zeitaufwandes und ihrer radiochemischen Ausbeute zusammen-

gefaßt. Ausgehend vom

Lösung läßt sich der

elementaren Selen-75 in benzolischer

[75Se l-N-BOC-Selenomethioninethylester

innerhalb von 25 Minuten in einer radiochemischen Ausbeute

von etwa 40% (bezogen auf elementares n.c.a. Selen-75) syn­

thetisieren. Daraus ergibt sich nach der Entschützung eine

radiochemische Ausbeute an n. c .a. [75Se l Selenomethionin von

34% bei einer Gesamtreaktionszeit von 60 Minuten. Für die

tierexperimentellen Untersuchungen wurde die Synthese mit dem

chiralen Markierungsvorläufer L-N-BOC-2-Amino-4-brombutter­

säureethylester durchgeführt. Das n. c.a. [75Se l Selenomethio­

nin hatte· nach der HPLC-Reinigung eine radiochemische Rein­

heit von über 95%. Da die Trägermenge an Selenomethionin un­

terhalb der Nachweisgrenze lag, kann für die spezifische

Aktivität nur ein Mindestwert von 185GBq/mmol (=5Ci/mmol)

angegeben werden. Die eingesetzte Aktivität betrug 0,93MBq

(25/LCi) .

102

Schema4.3-1S: Fließschema zur Darstellung von n.c.a. [75Se ]­

Selenomethionin mit N-BOC-2-AminO-4-brombutter­

säureethylester als Markierungsvorläufer

zeit

t=Omin

t=5min

t=12min

t=15min

t=25min

t=60rnin

75Se O in Benzol

I I I polymergebundenes Triphenylphosphin

I .J,

Ph3p75Se

I I I Methyltriflat I .J,

[Ph3P75seCH3]+ -OTf

I I I Tetrabutylamrnoniurnhydroxid I .J,

I I

RCA

100%

97%±2

70%±5

I N-BOC-2-AminO-4-brombuttersäureethylester

I .J,

N-BOC-[75Se ]Selenornethioninethylester

I I I 6N HCl (aq.) I

.J,

[75Se ]Selenomethionin

103

40±5%

34±5%

Reinigung des Produktes über Festphasenfixierung

Zur Umgehung der zeitaufwendigen HPLC wurde untersucht, ob

eine Reinigung mittels SEP-PAK Kartuschen durchführbar ist.

Dazu wurde nach der nukleophilen Substitution der im Über­

schuß eingesetzte, lipophile Markierungsvorläufer mit 4-Hy­

droxy-Piperidin umgesetzt:

OH

NHBOC

Br~coocH3 1. MeCN, 80·C, 20ffiin,6 Br

NHBOC ___________________ N_H--.. HO~N~COOCH3 2.Essigsaure,Ether

Nach Zugabe von Essigsäure und Ether konnte die entstandene

ionische Verbindung mit anderen hydrophilen Nebenprodukten

und Reagenzien (z.B. TBAH) auf einer Si-60-SEP-PAK Kartusche

fixiert werden. Durch Diethylether wurde der [75Se j-N-BOC-Se-

lenomethioninethylester

Abdampfen des Ethers

methionin umgesetzt.

von der Kartusche eluiert und nach

durch Salzsäure zum [75Se jSeleno-

Die HPLchromatographische Untersuchung der ether ischen Phase

ergab, daß der [75Se j-N-BOC-Selenomethioninethylester zu 95%

von der Kartusche eluiert werden konnte. Zusätzlich wurden in

der Lösung noch 10% polare Selen-75 Produkte nachgewiesen.

Der BABBE wurde zu über 90% durch die Kartusche abgetrennt.

104

4.4. r7SSelselenoalkylierungsagenzien

Im Hinblick auf eine Markierung von Proteinen und Peptiden

mit dem längerlebigen PET-Radioisotop Selen-73 sollte eine

Selen-75 markierte, prosthetische Gruppe synthetisiert wer­

den, die eine direkte Ankopplung an ein Protein oder peptid

via Alkylierung einer Aminofunktion ermöglicht. Dazu wurde

auf der Basis eines Selenoethers die Synthese eines n. c. a.

[75Se jSelenoalkylierungsagens entwickelt. Da kurze spacer für

ein unverändertes in vive Verhalten des Proteins von Vorteil

sind, wurde der [75Sej Methylselenopropylrest als prostheti­

sehe Gruppe ausgewählt.

4.4.1. synthese von r7SselMethylselenopropylderivaten

Die synthese von [15Se jMethylselenopropylderivaten erfolgte

durch Markierung eines bifunktionellen Propanderivates, so

daß im Eduktmolekül die Abgangsgruppe sowohl für die Markie­

rung mit Selen-75 als auch für die Umsetzung mit der Amino­

gruppe vorgebildet ist. Zur Ermittlung des geeigneten Eduktes

für die Synthese wurden 1,3-Dibrompropan, 1,3-Propandiol-di­

p-toluolsulfonat und 1-Chlor-3-iodpropan als Markierungsvor­

läufer eingesetzt.

Das Reaktionsschema zur Synthese der [75Se jSelenoalkylie­

rungsagenzien ist in Abbildung 4.4-1 dargestellt. Das n.c.a.

[75Se jMethylselenidanion ([75sejCH3Se-) wurde durch die in

Abschnitt 4.2. beschriebenen Bedingungen in einer radioche­

mischen Ausbeute von 70% gewonnen. Analog zur Synthese des

[75Se jSelenomethionins erfolgte die Umsetzung des

[75SejCH3Se- mit dem bifunktionellen Propanderivat in Gegen­

wart von Tetrabutylammoniumhydroxid (TBAH) in THF.

105

75, (0) ::;e

Benzol to-r '~e Ph

Methyltriflat ~

TBAH

HC~Se~X 3

X~y

x = Br, OTos, Cl

Y = Br, OTos, I

Abb. 4.4-1: Reaktionsschema zur Darstellung der c?5se JMethyl­

selenopropylderivate

Tabelle 4.4-2 zeigt die radiochemische Ausbeute der entstan­

denen Selen-75 Produkte für die Markierungsvorläufer l,3-Di­

brompropan (BrPropBr), l,3-Propandiol-di-o-p-toluolsulfonat

(TosOPropOTos) und 1-Chlor-3-iodpropan (IPropCl). Betrachtet

man die Selen-75 Produktverteilung ausgehend von BrPropBr, so

ist die radiochemische Ausbeute an [75Se J-1-(Methylseleno)-

3-brompropan 36%, an [75Se J-1-(Methylseleno)-3-prOpanol

(CH375sepropOH) 43% und an unbekanntem, polaren Nebenprodukt

21%. Es wird also vorwiegend der markierte Alkohol

[75seJCH375sepropOH gebildet, der infolge der Hydrolyse des

Alkylbromids durch das Tetrabutylammoniumhydroxid (TBAH) ent­

steht. Es konnte nicht eindeutig geklärt werden, ob das Edukt

BrPropBr oder das [75Se J -1- (Methylseleno) -3-brompropan durch

die Hydroxidionen angegriffen wird. Prinzipiell sind beide

Reaktionsalternativen möglich.

106

Tab.4.4-2: Selen-75 produktverteilung bei der Synthese von

[75Se jMethylselenopropylderivaten mit verschieden­

en Edukten (Die RCA ist bezogen auf n.c.a.

[ 75SejMethylselenotriphenylphosphoniumtriflat;

130~1 0,35mol/l TBAH in wäßrigem THF, 100~1

1,omol/l Edukt in THF gelöst, Elution mit 1ml THF;

10 mini RT)

RCA RCA RCA

Edukt Produkt [%j Methylseleno- unbekanntes,

CH375se(CH2)3X propanol [%j polares Neben-

produkt [%j

1,3-Dibrom- 36±6 43±6 21±5

propan (X=Br)

1,3-Propandiol- 21±6 47±6 30±6

ditosylat (X=OTos)

1-Chlor- 65±5 12±4 22±5

3-iodpropan (X=CI)

Für das TosOPropOTos als Markierungsvorläufer wurde aufgrund

der hohen Nukleofugie der Tosylatgruppe eine Zunahme der Mar-

kierungsausbeute erwartet.

chemische Ausbeute von

Gemessen wurde jedoch eine radio­

lediglich 21% [75Sej-O-Tosyl-l-

(methylseleno)-3-propanol, bei

Ausbeute an [75sejCH375SepropOH

len-75 Nebenproduktes auf 30%.

Tosylgruppe ist offenbar von

gleichzeitiger Zunahme der

auf 47% und des polaren Se­

Die höhere Reaktivität der

einer verstärkten Hydrolyse

begleitet. Demzufolge kommt es zu einer Verschiebung der Aus­

beute vom Produkt zugunsten des [75SejCH375SepropOH. Die im

Vergleich zu BrPropBr als Edukt geringere Bildung der

[75Se jMethylseienopropylverbindungen (68%= [75Se jCH375Se -

PropOTos + [75SejCH375sepropOH entsprechend 79% bei BrPropBr)

ist durch eine Abnahme der Eduktkonzentration zu erklären,

107

die aus der vollständigen Hydrolyse des TosOPropOTos

resultiert. Dadurch steigt die Ausbeute des polaren Selen-75

Nebenproduktes von 21% (bei BrPropBr als Edukt) auf 30% an.

Durch die Bildung des Hydrolyseproduktes [75se]CH375sepropOH

bei Verwendung

TosOPropOTos war

der Markierungsvorläufer BrPropBr und

die Ausbeute an [75 Se] Selenoalkylierungs-

agens relativ niedrig. Zur steigerung der Ausbeute wurde des­

halb 1-Chlor-3-iodpropan (IPropCI) als Edukt eingesetzt.

Einerseits besitzt es durch das Iod eine gute Abgangsgruppe

für die Reaktion mit dem [75se]CH3Se-, andererseits hat das

resultierende Produkt eine ausreichende Stabilität gegenüber

der Hydrolyse durch das TBAH. Desweiteren besteht die Mög­

lichkeit, das Edukt nach der Reaktion relativ einfach durch

Festphasenextraktion abzutrennen. Wie aus Tabelle 4.4-2 zu

entnehmen ist, läßt sich das [75Se ]-1-(Methylseleno)-3-chlor­

propan (CH375sepropCI) in einer radiochemischen Ausbeute von

65% synthetisieren. Das [75se]CH375sepropOH entsteht nur in

einer Ausbeute von 12%. Da das Chloratom im Produktmolekül

relativ stabil gegenüber der Hydrolyse durch TBAH ist, ist

folgender Reaktionsweg für die Bildung des methylselenierten

Propanols wahrscheinlich: Das IPropCI wird durch das TBAH zum

1-Chlor-3-propanol hydrolysiert, und anschließend erfolgt die

Substitution des Chlors durch das reaktive [75se]CH3se-. Auf­

grund der befriedigenden radiochemischen Ausbeute im Falle

von IPropCI wurden die optimierungsversuche auf der Basis

dieses Eduktes durchgeführt.

108

4.4.2. optimierung der synthese des r75sel-l-CMethylseleno)-

3-ohlorpropans

Nachfolgend wird die optimierung der Synthese des [75Se ]-

1-(Methylseleno)-3-chlorpropans (CH375sepropCl) ausgehend von

[75Se ] Methylselenid (CH3Se-) und 1-Chlor-3-iodpropan

(IPropCl) beschrieben.

Abhängigkei~ von der Eduktkonzen~ra~ion und Reaktionszeit

Für die Abtrennung des Produktes sind die eingesetzten Edukt­

mengen von entscheidender Bedeutung. Aus diesem Grund wurde

zunächst die Abhängigkeit der radiochemischen Ausbeute von

der IPropCl-Konzentration untersucht. Das Ergebnis der Unter­

suchung ist in Abbildung 4.4-3 dargestellt.

70 dP

., 60 ...,

'" ., 50 .Q .,

,'il 40 .,

.<:: 0 ., 30 ..... '" .,

.<:: 20 0

° ..... "0 10

'" 0::

0 0,2

[75 Se ]Methylselenochlorpropan

[15 Se] Methylselenopropanol

°------0----------,0 ----0 0,4 0,6 0,8

c (1-Chlor-3-iod-propan) [mol/l] 1,0

Abb.4.4-3: Abhängigkeit der radiochemischen Ausbeute an

[75se]CH375SepropCl von der Eduktkonzentration

(Die RCA ist bezogen auf n.c.a. [75Se ]Methyl­

selenotriphenylphosphoniumtriflat; 150~l wäßriges

THF mit IPropcl und 0,31mol/l TBAH, Elution mit

1ml Ether; 10 mini RT)

109

Es zeigt annähernd den für eine Reaktion pseudo-erster

Ordnung erwarteten Reaktionsverlauf. Die radiochemische Aus­

beute erreicht bei einer Eduktkonzentration von 0,60moljl

eine Sättigung von 65%.

Die radiochemische Ausbeute des Nebenproduktes [15Se ]­

l-(Methylseleno)-J-propanol (CHJ 75seprOPOH) nimmt mit zuneh­

mender IPropCI-Konzentration von 16 auf 7% geringfügig ab. Es

wird vermutet (s. 4.4.1.), daß das [75se]CH375sepropOH haupt­

sächlich durch die Reaktion des [75Se]CH3se- mit dem hydroly­

sierten Edukt 1-Chlor-3-propanol entsteht. Das Ergebnis

unterstützt diese Vermutung, da mit zunehmender IPropCI-Kon­

zentration und gleichbleibender Hydroxidionenkonzentration

die Reaktionswahrscheinlichkeit des [75Se ]CHJse- mit einem

I intakten I IPropCI steigt und somit die Ausbeute an

[75se]CH375SepropOH abnimmt.

Die Untersuchung der Reaktion hinsichtlich der zeit ergab,

daß sich die Selen-75 Produkt zusammensetzung zwischen 30s und

1h nicht ändert. Diese offensichtlich schnelle Umsetzung des

n.c.a. [75Se]CH3Se- verdeutlicht eindrucksvoll dessen hohe

Nukleophilie nach der Bildung aus dem [75Se ]Methylselenotri­

phenylphosphoniumtriflat. Aus diesem Grund sollte, um eine

hohe radiochemische Ausbeute zu erhalten, das Edukt während

der Freisetzung des CH3Se- vom Polymer zugegen sein. Aufgrund

der kurzen Reaktionzeit von 30s wurde auf eine weitere Unter­

suchung der Kinetik verzichtet.

Optimierung der Tetrabuty~ammoniumhydroxidkonzentration

Als weiterer Parameter interessierte die Abhängigkeit der

radiochemischen Ausbeute an [75se]CH375SePropCI von der TBAH­

Konzentration. Zu diesem Zweck wurden 0,15-0, 31molj I TBAH­

Lösungen auf das polymergebundene [75Se ]Methylselenotri­

phenylphosphoniumtriflat gegeben. Das Ergebnis nach der

anschließenden Reaktion mit dem IPropCI ist in Abbildung

4.4-4 dargestellt.

110

80

"" 70

(!) .j.J 60

'" (!)

~! ! [75SelCH3sepropCl

.0 III 50 ~ (!) 40

.<:: u III

30 .... El

[75 Sel cH,SepropOH

f ~ Y ~

(!) .<:: 20 u 0 .... " 10 !l!

0 0,10 0,15 0,20 0,25 0,30 0,35

c (TBAH) [mol/I]

Abb.4.4-4: Abhängigkeit der radiochemischen Ausbeute an

r75Se]CH375SepropCl von der TBAH-Konzentration

(Die RCA ist bezogen auf n.c.a. [75Se ]Me­

thylselenotriphenylphosphoniumtriflatj 150~1 wäß­

riges THF mit TBAH und 0,60mol/l IPropCl, Elution

mit 1ml Etherj 10minj RT)

Die Abhängigkeit für die Bildung des [75se]CH375sepropCl

zeigt ein flaches Maximum von 70% bei O,21mol/l TBAH. Bei

TBAH-Konzentrationen über O,25mol/l nimmt die radiochemische

Ausbeute zugunsten des [75se]CH375sepropOH ab, bedingt durch

partielle alkalische Hydrolyse des IPropCl zum 1-Chlor-3-pro­

panol. Je höher die TBAH-Konzentration ist, desto größer ist

die gebildete Menge des 1-Chlor-3-propanols und damit auch

der Produktanteil des [75Se ] CH3 75Se propOH. Die Abnahme der

radiochemischen Ausbeute auf 63% [75se]CH375SepropCl bei

O,15mol/l TBAH ist auf

[75se]CH3se- zurückzuführen.

eine niedrigere Ausbeute an

Da alle Triphenylphosphinfunk-

tionen des Polymers mit Hydroxidionen zum Triphenylphosphin­

oxid reagieren, ist die Stoffmenge des TBAH zu gering, um das

111

[75SejMethylselenotriphenylphosphoniumtriflat quantitativ in

das [75sejCH3Se- umzusetzen.

Reinigung des Produktes über Festphasenfixierung

Um eine zeitaufwendige HPLchromatographische Reinigung des

[75sejCH375sepropCI zu vermeiden, wurde eine Methode ent­

wickelt, die eine Abtrennung des überschüssigen Eduktes durch

Festphasenextraktion ermöglicht. Dazu wurde das IPropCI, des­

sen Polarität nur geringfügig von der des [75sejCH375sepropCI

verschieden ist, mit 4-Hydroxypiperidin zum N- (3-Chlorpro­

pyl)-4-hydroxypiperidiniumiodid umgesetzt:

I~Cl 2.Essigsäure,Ether

Das [75sejCH375sepropCI reagiert nicht mit dem 4-Hydroxypi­

peridin. Die Derivatisierung des Eduktes zu einer ionischen

Verbindung ermöglicht die Fixierung auf einer Si-60-SEP-PAK

Kartusche. Gleichzeitig werden die anderen ionischen und

polaren Nebenprodukte (aktive wie inaktive, z.B. TBAH,

[75sejCH375sepropOH) ebenfalls aus dem Solvens extrahiert.

Die Wechselwirkung des unpolaren [75sejCH375sepropCI mit der

Si-60-Festphase ist so gering, daß durch Elution mit Ether

90% des synthetisierten Produktes freigesetzt werden konnten.

Die Lösung enthielt als radiochemische Verunreinigung nur

noch [75sejCH375sepropOH (0-10%), das bei diesem Reinigungs­

verfahren nicht vollständig abgetrennt wird. Darüber hinaus

enthält die Produktlösung noch etwa 0-5% der eingesetzten

Eduktmenge , die jedoch die nachfolgenden Reaktionen nicht

beeinträchtigt.

112

4.4.3. Synthese des r75sel-l-(Methylselenol-3-iodpropans

Das [ 75S e ] CH375sePropCl war für eine Alkylierung von Aminen

nicht ausreichend reaktiv (siehe 4.4.4.1.), so daß das Chlor­

atom durch eine bessere Abgangsgruppe substituiert werden

mußte. Zu diesem Zweck wurde in einer Finkelstein-Reaktion

[78] durch einen Chlor-lod-Austausch das [75se]CH375SepropCI

in das [75Se ]-1-(Methylseleno)-3-iodpropan überführt:

Nal

Die Umsetzung mit Natriumiodid wurde in Methylethylketon

(MEK), Aceton und 4-Heptanon durchgeführt, da Natriumiodid in

diesen Ketonen löslich ist, so daß die Reaktion in homogener

Phase abläuft.

Die zeitabhängigkeit der Bildung des [75Se ]-1-(Methylseleno)-

3-iodpropans (CH375sepropl) aus dem [75Se ] CH3 75sePropCI ist

in Abbildung 4.4-5 für verschiedene Ketone als Lösungsmittel

dargestellt. Die Lösungen wurden jeweils mit Natriumiodid

gesättigt und auf die angegebene Temperatur erhitzt. Der Ver­

gleich der Reaktionskinetiken von Aceton und MEK zeigt eine

deutliche Zunahme der Reaktionsgeschwindigkeit um einen

Faktor von etwa 2. So haben sich nach 40 Minuten in Aceton

erst 53% des [75se]CH375sePropCI umgesetzt, in MEK ist da­

gegen schon zu 88% [75se]CH375sepropI entstanden. Die chemi­

schen und physikalischen Eigenschaften, insbesondere die

Polarität von Aceton und MEK, sind, abgesehen von den

siedepunkten, nicht wesentlich verschieden. Die Umsetzung zum

[75se]CH375sepropI in MEK wird somit hauptsächlich durch die

höhere Reaktionstemperatur beschleunigt. Für die Reaktion in

dem noch höher siedenden 4-Heptanon (Kp :143°C) wurde deshalb

113

100,-------------------~--~------------------~

80 ~

"" H 60 g. ... p., llJ

[J) 40 4-Heptanon 120'C "' <-

p:: .... U

~ 20

O~~--~-r--r-~-,--~-r--r-.-~--.-~--r-~ o 20 40 60 80 100 120 140

Zeit [minj

Abb.4.4-5: Abhängigkeit der

[75sejCH375sepropI

Reaktionszeit (Die

[75sejCH375sepropCl;

rad,iochemischen Ausbeute an

vom Lösungsmittel und der

RCA ist bezogen auf n.c.a.

25mg Natriumiodid, 100-200J'1

des jeweiligen Lösungsmittels)

eine weitere Steigerung der Reaktionsgeschwindigkeit erwar­

tet. Beobachtet wurde aber ein langsamerer Anstieg der Aus­

beute des [75sejCH375SepropI im Vergleich zu MEK und Aceton.

Aufgrund des geringen Umsatzes wurde die Reaktion nach 60

Minuten abgebrochen. Da unpolare Lösungsmittel unvorteilhaft

für nukleophile Substitutionsreaktionen sind, ist die Ursache

für die geringere Reaktionsgeschwindigkeit in 4-Heptanon im

wesentlichen der große Polaritätsunterschied gegenüber MEK

und Aceton. Die höhere Reaktionstemperatur kann den Effekt

der geringeren Polarität nicht ausgleichen, so daß die

Kinetik langsamer ist als in Aceton.

114

somit ist MEK das geeignetste der drei gewählten Lösungsmit­

tel, da es eine höhere Reaktionstemperatur als Aceton zuläßt

und aufgrund ähnlicher Polarität die nukleophile Substitution

im gleichen Maße fördert. Für den Chlor-lod-Austausch mit

Natriumiodid wird die maximale radiochemische Ausbeute von

90% an [75sejCH375SePropl in MEK nach 50 Minuten bei SO·C

erreicht.

Zur Reinigung des [75sejCH375sepropl wurde das Natriumiodid

durch Zugabe von Ether ausgefällt und durch nachfolgende Fil­

tration über eine Si-60-SEP-PAK Kartusche abgetrennt. Die

Verluste an [75sejCH375sepropl durch die Kartuschentrennung

betrugen 10% bei einer radiochemischen Reinheit von >95%.

Makroskopische Verunreinigungen wurden bei der HPLC-Analyse

nicht beobachtet.

4.4.4. r7SselSelenoalkylierunq von Aminoverbindunqen

4.4.4.1. [7SSelSelenoalkylierung von 1-Butylamin

Grundlegende untersuchungen zur [75Se jSelenoalkylierung wur­

den zunächst am Beispiel eines primären Amins durchgeführt,

die als Basis zur [75SejSelenoalkylierung von Aminosäureana­

loga dienen. Aufgrund der N&-Aminofunktion des Lysins als

mögliche funktionelle Gruppe zur Alkylierung von Polypeptiden

wurde das I-Butylamin als Modellamin ausgewählt:

H~ 2 H;'Se~NH~

3

Unsetzungen von I-Butylamin und [75Se jCH375sepropCI führten

zu keiner nennenswerten Bildung von [75Sej -3-(Methyl­

seleno)propyl-butylamin «5%). Aus diesem Grund wurde durch

115

den Chlor-lod-Austausch aus dem [75se]CH375sepropCl das

reaktivere [75Se ]-1-(Methylseleno)-3-iodpropan (CH375sepropI)

dargestellt. Bei

[75se]CH375SepropI

der Untersuchung der

mit dem l-Butylamin

Reaktion des

interessierten

insbesondere die drei wichtigen Reaktionsparameter Tempera­

tur, zeit und Lösungsmittel.

100 .. " . ~ 80 .... '" ... " .Q I 60

~ Po 0

" '" 40 ~

'" ~

~ ~

01 U 20

hl o 20

D

40 60

Zeit [min]

• • ... D

" + x

DMF 80'C DMSO 80'C MeCN 80'C DMF RT MeCN RT

C1CH2CH2Cl 80'C Ether 40'C

80 100

Abb.4.4-6: Abhängigkeit der radiochemischen Ausbeute an

[75Se ]-3-(Methylseleno)propyl-butylamin vom Lö­

sungsmittel, der zeit und Temperatur (Die RCA ist

bezogen auf eingesetztes n.c.a.[75se]CH375sepropli

O,5ml O,30mol/l l-Butylamin)

Abbildung 4.4-6

mischen Ausbeute

(CH375sepropNHBu)

zeigt die Zeitabhängigkeit der radioche­

an [ 75Se ]-3-(Methylseleno)propyl-butylamin

für die Reaktion des [75se]CH375sepropI mit

l-Butylamin. Die umsetzungen erfolgten bei SO·C in aproti­

schen Lösungsmitteln stark unterschiedlicher Polarität. Wegen

des niedrigen Siedepunktes des Ethers wurde diese Reaktion

bei 40·C durchgeführt. Desweiteren wurden für DMF und

116

Acetonitril als Lösungrnittel zusätzlich die Kinetiken bei

Raumtemperatur gemessen. Der [75Se ]Selenoalkylierung liegt in

aprotischen Lösungsmitteln ein SN2-Reaktionsmechanismus zu­

grunde. In Lösungsmitteln hoher Polarität wurden daher beson­

ders hohe radiochemische Ausbeuten an [75se]-CH375sePropNHBu

erwartet. So konnte in den sehr polaren Lösungsmitteln DMSO

und DMF bei 80°C die Sättigungsausbeute von 95% bereits nach

5 Minuten erreicht werden, während in den unpolaren Lösungs­

mitteln Dichlorethan und Ether nach einer Stunde weniger als

30% CH375sepropNHBU entstanden.

Für die Ermittlung der Geschwindigkeitskonstanten wurde

ln (AO/(AO-P» (siehe Abschnitt 4.2.2.1.) gegen die Reak­

tionszeit aufgetragen. Für eine Reaktion pseudo-erster Ord­

nung ergibt sich eine Gerade, aus deren Steigung die relative

Geschwindigkeitskonstante k' ermittelt werden kann. Abbildung

4.4-7 zeigt diese Auftragung für die Reaktion des

4

x Ether 40°C + C1CH,CH,Cl 80'C

• r::MF soGe 3 0 I:MF RT

• IMSO BOlOe ... MeCN soGe 0 " MeCN RT

• Lys lOOGe

'" • " Lys soGe

~ 2 m Lys 50 Ge

... ...... 0 e 0

a 1 .-f

0

0 20 40 60 80 100

Zeit emin]

Abb.4.4-7: Ermittlung der Geschwindigkeitkonstanten für die

Reaktion von [75se]CH375sepropI mit I-Butylamin

(in verschiedenen Solventien) und Na-Acetyl-lysin­

methylester (in DMF bei verschiedenen Tempera­

turen)

117

[75se]CH375sePropI mit dem 1-Butylamin in den verschiedenen

Sol ventien. Die berechneten k' -Werte sind in Tabelle 4.4-8

aUfgeführt. Zusätzlich sind in Abbildung 4.4-7 die Werte für

die Reaktion zwischen dem [75se]CH375sepropI und NCI.-Acetyl­

lysinmethylester (s. Abschnitt 4.4.4.2.) und die zugehörigen

Regressionsgeraden eingezeichnet.

Ein Vergleich zwischen den radiochemischen Ausbeuten an

r?5se]CH375SePrOpNHBU nach 20 Minuten, der Dielektrizitäts­

konstante und dem Dipolmoment ist in Tabelle 4.4-8 für die

verschiedenen Solventien dargestellt. Zusätzlich ist die

relative Geschwindigkeitskonstante k' aufgeführt. Die Dielek­

trizitätskonstante und das Dipolmoment sind ein Maß für die

Polarität des Lösungsmittels.

Tab.4.4-8: Dielektrizitätskonstante

Dipolmoment :

6 [79,80]

J.t [81]

rel. Geschwindigkeitskonst. k' (s. Abb.4.4-7)

RCA nach 20 Minuten Reaktionszeit

Lösungsmittel 6 J.t [D] RCA [%] k' [min-1 ]

Ether 40·C 4 8±5 0,00095

Dichlorethan 80·C 6 19±6 0,00212

Acetonitril 80·C 37 3,92 73±6 0,03486

DMF 80·C 37 3,86 95±4 0,76233

DMSO 80·C 47 3,90 95±5 0,64867

Acetonitril RT 37 3,92 31±6 0,0156

DMF RT 37 3,86 53±6 0,0285

Es ist deutlich zu erkennen, daß Solventien hoher Polarität

die [75Se ]Selenoalkylierung begünstigen. Bei dem Vergleich

von DMF und Acetonitril als Lösungsmittel wäre aber bei etwa

gleicher Polarität eine ähnliche radiochemische Ausbeute zu

erwarten gewesen. Die Ausbeuten sind aber sowohl bei 80·C als

118

auch bei Raumtemperatur in DMF mehr als 20% höher als in

Acetonitril. Dies wird auch durch die wesentlich höhere

Geschwindigkeitskonstante ausgedrückt. Der Unterschied ist

auf eine spezifische Wechselwirkung zwischen Edukten und

Lösungsmittel zurückzuführen, welche unabhängig von der Pola­

rität des Lösungsmittels ist.

Für die Bildung des eSSe] CH3 7SSe PropNHBu in DMF und Aceto­

nitril ist ein ausgeprägter Einfluß der Temperatur auf die

Reaktionsgeschwindigkeit festzustellen, so wird die Reaktion

durch Erhöhung der Temperatur von 20·C auf SO·C um den Faktor

27 (DMF) bzw. 2,3 (Acetonitril) beschleunigt. Werden die

Geschwindigkeitskonstanten für DMF und Acetonitril bei Raum­

temperatur mit denen für Dichlorethan (SO·C) und Ether (40·C)

verglichen, so zeigt sich deutlich, daß die Polarität des

Lösungsmittels einen größeren Einfluß auf die eSSe]Seleno­

alkylierung hat als die Temperatur.

4.4.4.2. [75selSelenoalkylierung von Lysin

Die s-Aminofunktion der Aminosäure Lysin ist eine mögliche

nukleophile Gruppe in Peptiden und Proteinen, die durch

[7SSe ]Selenoalkylierung markiert werden kann. Um ausschließ­

lich die Reaktion der s-ständigen Aminofunktion zu unter­

suchen, wurde das Na-geschützte Lysin Na-Acetyl-lysinmethyl­

ester für die Synthese eingesetzt:

75 /Se~I Hp

________________ --.~ RN

Hc:::se~ 3

119

o

Die Untersuchungen wurden in DMF als Lösungsmittel durchge­

führt, da es bei der [7 S Se j Selenoalkylierung von Butylamin

die besten Ergebnisse erbrachte.

100

90

"" 80 ~ .....

70 ~ ....:I I 60 ~ 8' 50

'"' p., 40 (1J UJ

"' <- JO

5' ~ 20

~ 10

0 0 10 20 JO 40 50 60 70 80 90 100

Zeit [min]

Abb.4.4-9: zeit- und Temperaturabhängigkeit der radiochemi­

schen Ausbeute von [7SSe j-Na-Acetyl-NE_(3-(methyl­

seleno)propyl)-lysinmethylester (Die RCA ist be­

zogen auf eingesetztes n.c.a. [7SsejCH37SsepropIi,

2S~mol Na-Acetyl-lysinmethylester in 130~l DMF)

Die Zeitabhängigkeit der radiochemischen Ausbeute an

[7SSe j-Na-Acetyl-NE_(3-(methylseleno)propyl)-lysinmethylester

(NE_CH3 7Sseprop-Na-Ac-LyS-OCH3) bei SO, 80 und 100·C ist in

Abbildung 4.4-9 dargestellt. Die Kurven zeigen deutlich die

erwartete Kinetik pseudo erster Ordnung. Nach 10min bei 100·C

reagierten bereits 8S% des eingesetzten [75sejCH375sepropI

zum Produkt. Insbesondere im Temperaturbereich zwischen 50

und 80·C ist eine deutliche steigerung der Reaktions­

geschwindigkeit zu beobachten. So wird der [75Se j-NE­

CH37Sseprop-Na-AC-LyS-OCH3 bei einer Temperaturerhöhung von

120

50 auf SO·C etwa um den Faktor 3,5 schneller gebildet,

während die Kinetik bei lOO·C etwa doppelt so schnell ist als

bei SO·C. Im Vergleich zur Reaktion von [75selCH375sepropI

mit l-Butylamin wird die maximale radiochemische Ausbeute bei

SO·C etwa 35 Minuten später erreicht. Zur Verdeutlichung sind

in Tabelle 4.4-l0 die relativen Geschwindigkeitskonstanten

für die umsetzung von [75selCH375sepropI mit dem N<1-Acetyl­

lysinmethylester angegeben. Sie sind aus den Steigungen der

Geraden in Abbildung 4.4-7 ermittelt worden. Zusätzlich wurde

der Wert für die Synthese des [75selCH375sepropNHBu in DMF

bei SO·C eingetragen. Die k'-Werte zeigen eindrucksvoll die

Steigerung der Reaktionsgeschwindigkeit durch die Tempe­

raturerhöhung. Wird der Wert bei So·c mit dem bei der Umset­

zung mit l-Butylamin verglichen, so ist ein groBer Unter­

schied in der Umsatzrate festzustellen. Dennoch handelt es

sieh um eine relativ schnelle Reaktion, da bei lOO·C bereits

nach l5 Minuten eine radiochemische Ausbeute an [75Se1 - NB­

CH375seProp-N<1-Ac-Lys-OCH3 von 90% erhalten wurde.

Tab.4.4-10: Relative Geschwindigkeitskonstanten k'

tion zwischen [75Se l CH3 75sePropI und

der Reak­

N<1-Acetyl-

lysinmethylester bzw. l-Butylamin für verschie­

dene Reaktionstemperaturen in DMF

Temperatur [OC] k' [min-1 ]

50 O,Olll

SO 0,0629

lOO 0,2l17

SO (l-Butylamin) 0,76233

Im Reaktionsschema 4.4-11 sind die einzelnen Reaktions­

schritte für die [75se JSelenoalkylierung von Aminen mit der

[75se J-1-Methylselenopropylgruppe als prosthetische Gruppe

zusammengefaBt. Es sind die jeweiligen radiochemischen Aus­

beuten und der Zeitbedarf dargestellt.

121

Schema 4.4-11: Reaktionsschema zur Synthese des [75Se ]Seleno­

alkylierungsagens und dessen Umsetzung mit

Zeit

Omin

Smin

12min

16min

3Smin

8Smin

1-Butylamin und Na-Acetyl-lysinmethylester RCA

~- Ph 3P 1 75 se (O)

{-Ph 3P=75 se

1 Methyltriflat

OTf

~ + 75

-Ph P-Se -eH 3 3

j TBAH

I~Cl

H C~Se~Cl 3

Derivatisierung des Eduktes

SEP-PAK-Kartuschentrennung

Abdampfen des Ethers

NaI/MEK/80°C

75 ~ H C-Se I

3

SEP-PAK-Kartuschentrennung

Abdampfen des Ethers

97±2%

70±S%

48±S%

42±6%

38±7%

33±7%

lOOmin 1-----L-----.1 l-Butylamin/DMF/80°C N-Ac-Lys-OMe/DMF/100oC

lOSmin

l1Smin

75 ~ H C/Se~NH~

3

HN 75 I

H C-Se~ 3

122

32±7%

HAc

O'CH I 3

° 30±7%

Das [75se]CH375sepropI konnte innerhalb von 85 Minuten in

einer radiochemischen Ausbeute von 38% (bezogen auf das ein­

gesetzte elementare Selen-75) synthetisiert werden. Die

anschließende Umsetzung mit 1-Butylamin erfolgte mit einer

Ausbeute von 95%, so daß die radiochemische Ausbeute über

alle schritte 32% innerhalb von 105 Minuten beträgt. Für die

Markierung von WOC-Acetyl-lysinmethylester am seitenketten­

stickstoff sind zusätzlich 10 Minuten notwendig, um eine

radiochemische Ausbeute von 30% bezogen auf das eingesetzte

elementare Selen-75 zu erreichen.

Durch die Synthese des [15se]CH375sepropI steht somit eine

Selen-75 markierte, prosthetische Gruppe zur Verfügung, die

via Alkylierung an eine Aminofunktion gekoppelt werden kann.

Die Umsetzungen mit 1-Butylamin und Na.-Acetyl-lysinmethyl­

ester erfolgten mit hohen radiochemischen Ausbeuten, so daß

auch radiopharmazeutisch relevante Aminosäuren, polypeptide

oder Antikörper markiert werden können, wenn sie freie Amino­

funktionen außerhalb der pharmakophoren Gruppe besitzen. Des­

weiteren besteht die Möglichkeit, durch Ankopplung des

[75se]CH375SePropI an anderen nukleophilen Gruppen, z.B. SH­

oder OH-Funktionen, potentielle Radiopharmaka zu markieren.

123

5. Zusammenfassung

Der Positronenstrahler Selen-73 ist aufgrund seiner relativ

langen Halbwertszeit von 7,lh ein geeignetes Radionuklid zur

Markierung von PET-Radiopharmaka, die sich durch eine relativ

langsame in vivo Kinetik auszeichnen wie z.B. Antikörper oder

deren Fragmente. Zur EntwiCklung von Markierungssynthesen

wurde trägerfrei (n.c.a.) prOduziertes Selen-75 (EC, T~=120d)

als Modellradionuklid eingesetzt. Die Darstellung von Selen-

75-markierten, unsymmetrischen Selenoethern erfolgte über

eine zweistufige Synthese beginnend mit einer Heterogenreak­

tion an polymergebundenem Triphenylphosphin und nachfolgender

Sekundäralkylierung in homogener Phase. Als potentielle Ra­

diotracer wurden Synthesen zur Darstellung von n. c.a.

[73,75Se jSelenomethionin, [73,75Se jMethylselenopropylderivaten

und Selen-73/75 markiertem Lysin entwickelt.

Die trägerfreie Produktion des Selen-75 erfolgte über die

75As(p,n)75Se Kernreaktion mit 20MeV Protonen am Jülicher

CV 28 Zyklotron. Bei Verwendung eines Niederstromtargets

diente Arsentrioxid als Targetmaterial. Nach der Bestrahlung

wurde das Selen-75 in HCl/H202 gelöst und das [75Se jSelenit

durch Schwefeldioxid zu elementarem Selen-75 reduziert. Das

n.c.a. Selen-75 wurde durch Benzol extrahiert. Zur Produktion

größerer Aktivitätsmengen wurde ein HOChstromtarget mit einer

Kupfer-Arsen-Legierung (Cu3As) als Targetmaterial eingesetzt.

Das Selen-75 konnte durch Thermochromatographie fast quanti­

tativ vom Arsen abgetrennt werden. Durch Reduktion der salz­

sauren [75Se jSelenitlösung mit Schwefeldioxid und Extraktion

des elementaren, n.c.a. Selen-75 mit Benzol wurde eine radio­

chemische Ausbeute von 65% erreicht.

Für die Selenierungsreaktion wurde im ersten heterogenen

Reaktionschritt das in Benzol gelöste elementare n.c.a.

Selen-75 mit dem polymergebundenem Triphenylphosphin zum

[75SejTriphenylphosphinselenid umgesetzt. Die Addition zum

[75SejPhosphinselenid erfolgte mit einer radiochemischen

124

Ausbeute von > 97% bei einer Verweilzeit von ~30s. Die Alky­

lierung zum [75SejAlkylselenotriphenylphosphoniumsalz wurde

mit verschiedenen Alkylierungsagenzien (Benzylbromid, Methyl­

iodid und Methyltriflat) untersucht. Die höchste radioche­

mische Ausbeute konnte mit Methyltriflat in Toluol erhalten

werden. Hierbei bildet sich das [75Se jMethylselenotriphenyl­

phosphoniumtriflat bereits bei Raumtemperatur innerhalb von 4

Minuten zu 70%. Zur Freisetzung von [75Se jMethylselenid unter

Phasentransferbedingungen in THF-Lösung konnten mit Tetra­

butylammoniumhydroxid als Base radiochemische Ausbeuten von

70% erreicht werden. Die Darstellung unsymmetrischer Seleno­

ether wurde durch Umsetzung des [75Se jMethylselenidanions mit

Brom-, Iod- oder O-Tosylpropan in THF untersucht. Innerhalb

von einer Minute bildete sich [75Se jMethylselenopropan mit

einer für alle drei Edukte identischen radiochemischen Aus­

beute von 55±G%.

Im Hinblick auf die radiopharmazeutische Verwendung von

n.c.a. [73Se jSelenomethionin für die PET-Diagnostik konnte

die selenanaloge Aminosäure auf der Basis des Synthesekonzep­

tes zur Herstellung unsymmetrischer [75Se j Selenoether erst­

mals trägerfrei mit Selen-75 markiert werden. Hierzu wurden

zwei Synthesewege optimiert. Im ersten Fall wurde das über

polymergebundenes [75SejMethylselenotriphenylphosphoniumtri­

flat dargestellte [75Se jMethylselenid mit 2-Aminobutyrolacton

als Edukt unter nukleophiler Lactonspaltung zum [75Se jSeleno­

methionin umgesetzt. Unter optimierten Bedingungen konnte in

Gegenwart von Natiumhydroxid-1.8-Krone-G bei GO·C in THF/Me­

thanol nach 1.0 min eine radiochemische Ausbeute von 1.1.% (be­

zogen auf eingesetztes elementares Selen-75) erhalten werden.

Im zweiten Falle wurde die Synthese durch eine nukleophile

Austauschreaktion mit O-Tosylhomoserinmethylester als Edukt

durchgeführt. Die Umsetzung des polymergebundenen [75Se jMe­

thylselenotriphenylphosphoniumtriflats mit dem Edukt in THF/

Methanol bei 20·C führte nach 1.0 min zu einer radiochemischen

Ausbeute von 35% [75SejSelenomethioninmethylester (bezogen

auf eingesetztes elementares Selen-75). Nach saurer Hydrolyse

1.25

konnte das n.c.a. [75selSelenomethionin in einer

radiochemischen Ausbeute von 30% erhalten werden. Alternativ

zum O-Tosylhomoserin wurde der nukleophile

N-BOC-2-Amino-4-brombuttersäureethylester

Austausch auch an

untersucht. Nach

Freisetzung des [75Se lMethylselenidanions durch Tetrabutyl­

ammoniumhydroxid konnte in THF innerhalb von 10 Minuten eine

radiochemische Ausbeute von 40% [75Se l-N-BOC-Selenomethionin­

ethylester (bezogen auf eingesetztes elementares Selen-75)

erreicht werden. Nach säurekatalysierter Schutzgruppenabspal­

tung betrug die radiochemische Ausbeute des n.c.a. [75Se lSe -

lenomethionins 34%. Die Reinigung des Produktes erfolgte ent­

weder durch eine Festphasenfixierung der Nebenprodukte im An­

schluß an die [75Se l Methylselenierung oder durch HPLC nach

dem Abspalten der Schutzgruppen. Die radiochemische Reinheit

des [75SelSelenomethionin war >95% bei einer spezifischen

Aktivität von >185GBq/mmol.

Zur Markierung von Proteinen durch Selenoalkylierung einer

Aminofunktion mittels einer prosthetischen Gruppe wurde eine

Synthese von [75Se lMethylselenopropylderivaten entwickelt.

Durch [75Se lMethylselenierung bifunktioneller Alkane wie 1,3-

Dibrompropan, 1-Chlor-3-iodpropan, 1,3-Propandiol-di-tosylat

konnten verschiedene n.c.a. [75Se lMethylselenopropylderivate

hergestellt werden. Die höchste Ausbeute wurde durch Umset­

zung von 1-Chlor-3-iodpropan mit [75Se lMethylselenid in Ge­

genwart von Tetrabutylammoniumhydroxid in THF erhalten. Das

[75Se l-1-(Methylseleno)-3-chlorpropan bildete sich bei Raum­

temperatur innerhalb von 30 Sekunden in einer radiochemischen

Ausbeute von 48% (bezogen auf eingesetztes elementares Selen-

75). Nach der Isolierung des Produktes durch eine Festphasen­

fixierung betrug die radiochemische Reinheit >90%. Zur Me­

thylselenopropylierung von Aminen ist die Nukleofugie des

[75Se l-1-(Methylseleno)-3-chlorpropans zu niedrig, so daß

durch einen Chlor für Iod Austausch das reaktivere

[75Se l-1-(Methylseleno)-3-iodpropan synthetisiert werden muß­

te. Eine radiochemische Ausbeute von 90% (bezogen auf ein­

gesetztes [75Se l-l-(Methylseleno)-3-chlorpropan) konnte bei

126

80°C nach 50 min in Methylethylketon erreicht werden. Die

radiochemische Reinheit war >95%.

Zur Untersuchung der [75SelSelenoalkylierung freier Amino­

funktionen in Peptiden oder Proteinen wurden 1-Butylamin und

Lysin als Modellsubstanzen für die Umsetzung mit dem [75Se l­

Methylselenopropylderivat ausgewählt. Ausgehend vom [75Se l-1-

(Methylseleno)-3-iodpropan reagierte 1-Butylamin in DMF oder

DMSO innerhalb von 5 min bei 80°C mit einer radio chemischen

Ausbeute von 95% zum n.c.a. [75Se l-3- (Methylseleno)propyl­

butylamin (bezogen auf eingesetztes [75Se l -1- (Methylseleno)-

3-iodpropan) .

Zur selektiven Markierung der Aminoseitenkette des Lysins

wurde der N«-Acetyllysinmethylester eingesetzt. In DMF führte

die Umsetzung mit [75Se l-1-(Methylseleno)-3-iodpropan bei

100°C nach 15 min zu einer radio chemischen Ausbeute von 90%

[75Se l-N«-Acetyl-NE-(3-(methylseleno)propyl)lysinmethylester.

Hiermit steht eine effiziente Methode für die Markierung von

Aminosäureanaloga zur Verfügung, die auf die Markierung von

Peptiden bzw. Proteinen über tagen werden kann. Damit wird das

Spektrum der bisher eingesetzten 18F-Alkylierung und 18F-ACy­

lierung von Biomolekülen um einen längerlebigen Tracer

erweitert.

Zur Identifizierung der trägerfrei markierten Produkte wurde

folgende Substanzen erstmals mit inaktivem Selen syntheti­

siert und spektroskopisch analysiert: 1-(Methylseleno)-3-

brompropan, 1-(Methylseleno)-3-iodpropan, 3-(Methylseleno)­

propyl-butylamin, N«-Acetyl-NE_(3-(methylseleno)propyl)lysin­

methylester.

127

Anhang

Abkürzungsverzeichnis

BABBE

BOC

BrPropBr

CH3Se­

CH375SePropCl

CH375SePropI

CH375SepropNHBu

CH375SepropOH

DK

DMF

DMSO

EC

EI

EtOH

Fp.

HMPA

lH-NMR

HPLC

HSAB

IPropCl

IR

l8-Krone-6

Kryptofix 2.2.2

MeCN

MEK

Methyltriflat

N-BOC-SeMetEt

NE_CH375seprop-

Wl-Ac-Lys- OCH3

n.c.a.

N-BOC-2-Amino-4-brombuttersäureethyl­

ester

tert.Butylcarbonyl

l,3-Dibrompropan

Methylselenidanion

[75Se l-l-(Methylseleno)-3-chlorpropan

[75Se l-l-(Methylseleno)-3-iodpropan

[75Se l-3-(Methylseleno)propyl­

butylamin

[75Se l-l-(Methylseleno)-3-propanol

Dielektizitätskonstante

N,N,-Dimethylformamid

Dimethylsulfoxid

Electron capture (Elektroneneinfang)

Elektronenstoßionisation

Ethanol

Schmelzpunkt

Hexamethylphosporsäuretriamid

Protonenresonanz-Spektroskopie

High Pressure Liquid Chromatographie

Hard and soft acids and bases

l-Chlor-3-iodpropan

Infrarot-Spektroskopie

1,4,7,lO,13,16-Hexaoxocyclooctadecan

4,7,13,16,21,24-Hexaoxo-l,lO-diaza­

bicyclo[8.8.81hexacosan

Acetonitril

Methylethylketon

Trifluormethansulfonsäuremethy1ester

N-BOC-Selenomethioninethylester

[75Se l-Wl-Acetyl-NE-(3-(methylseleno)­

propyl)-lysinmethylester

no carrier added (ohne Trägerzusatz)

128

PET

RCA

RP

RT

TBAH

THF

TMAH

TosOPropOTos

TPP

TPPSe

TPPSeMeOTf

E

jJ.

cr

Positronen Emissions Tomographie

radiochemische Ausbeute

Reversed Phase

Raumtemperatur

Tetrabutylammoniumhydroxid

Tetrahydrofuran

Tetramethylammoniumhydroxid

1,3-Propandiol-di-O-p-toluolsulfonat

Triphenylphosphin

Triphenylphosphinselenid

Methylselenotriphenylphosphonium­

triflat

Dielektizitätskonstante

Dipolmoment

wirkungsquerschnitt

129

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Danksagung:

Herrn Prof. Dr. G. Stöcklin danke ich für die interessante

Themenstellung und die begleitenden Diskussionen.

Mein besonderer Dank gilt Herrn Dr. K. Hamacher für die Be­

treuung, die wertvollen Ratschläge und zahlreichen Diskus­

sionen.

Ebenfalls schulde ich den Herren Dr. M. Holschbach und

Diplom. ehem. H.-J. Wester für weitere Anregungen Dank.

Desweiteren danke ich Herrn W. Wutz und Herrn D. Unterlugauer

für die Durchführung der tierexperimentellen Untersuchungen

und spektroskopischen Messungen. Nicht zuletzt gilt mein Dank

auch allen Mi tarbei tern und Komili tonen des Instituts für

Nuklearchemie, die mir immer hilfreich mit Rat und Tat zur

Seite gestanden haben.

, FORSCHUNGSZENTRUM JÜLlCH GmbH ==============~F~====

Jül-31GS September 1995 ISSN 0944-2952