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Fortgeschrittenen - Praktikum Laser-Scanning-Mikroskop Versuchsleiter: Herr Dr. Reyher Autor: Simon Berning Gruppe: 10, Dienstag Daniel Bruns, Simon Berning Versuchsdatum: 27.02.2007

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Fortgeschrittenen - Praktikum

Laser-Scanning-Mikroskop

Versuchsleiter: Herr Dr. ReyherAutor: Simon BerningGruppe: 10, Dienstag

Daniel Bruns, Simon BerningVersuchsdatum: 27.02.2007

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Inhaltsverzeichnis1 Ziele 2

2 Das Laser-Scanning-Mikroskop und seine Fähigkeiten 22.1 Das Lichtmikroskop . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22.2 Aufbau und Funktionsweise des LSM . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22.3 Das konfokale Prinzip . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3

3 Experimentelles 33.1 Vermessung einer Münze . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3

3.1.1 3D-Darstellung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5

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Abbildung 1: Prinzipieller Aufbau eines LSM

1 ZieleIn diesem Versuch geht es darum die Vorteile des konfokalen Prinzips gegenüber der herkömmlichenMikroskopie kennenzulernen. Dafür steht ein Laser-Scanning-Mikroskop (LSM) der Firma Leicazur Verfügung mit dem wir unter Anderem einen Mikrochip oder auch Chloroplasten einer Algegenauer untersuchen werden.

2 Das Laser-Scanning-Mikroskop und seine Fähigkeiten

2.1 Das LichtmikroskopZusätzlich zum LSM befindet sich in dem Gerät noch ein herkömmliches Lichtmikroskop, welchesdabei helfen kann, die zu betrachtende Probe richtig zu positionieren und erste Erkenntnisse überihre Struktur zu gewinnen. Das LSM und das Lichtmikroskop teilen sich den Objektiv-Revolver,der über ein 30-fach und ein 40-fach vergrößerndes Objektiv verfügt. Dabei sind die zwei Standard-Modi, Auflicht- und Durchlicht-Mikroskopie, möglich. Die Probe kann auf einem Kreuztisch in alleRaumrichtungen bewegt werden, in z-Richtung ist dies sogar im Bereich von µm möglich, was fürdie späteren z-Scans wichtig ist.

2.2 Aufbau und Funktionsweise des LSMDer grundsätzliche Aufbau eines LSM ist in Abbildung 1 dargestellt. Zwar besteht ein Laser-Scanning-Mikroskop aus viel mehr Komponenten, aber zum Verständnis des Arbeitsprinzips reichtdie gezeigte Skizze völlig aus.

Beim LSM wird nicht das ganze Objekt auf einmal beleuchtet und abgebildet, sondern die Abbil-dung geschieht durch das sukzessive Abtasten und Abbilden einzelner Punkte des Objektes. Dabeiwird ein Laserstrahl mit Hilfe der Objektivlinse auf einen Punkt auf oder in dem Objekt fokussiert.Der Scan-Spiegel führt diesen Strahl zweilenweise über das Objekt und im Detektor wird dann die

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Abbildung 2: Stern auf einer Zwei-Cent Münze

Intensität des reflektierten oder emittierten Lichts von jedem abgetasteten Punkt gemessen. Dabeisorgt ein Photoelektronen-Multiplier dafür, dass das Signal hinreichend verstärkt wird. Der Clouliegt beim LSM allerdings im konfokalen Prinzip, welches wir nun erläutern wollen.

2.3 Das konfokale PrinzipEs ist bekannt, dass ein Punkt bei einer Abbildung durch ein optisches Gerät immer zu einemgewissen Grad verschmiert. Das führt dazu, dass auch Teile des Objektes beleuchtet werden, dienicht ganz genau im Fokus des Objektives liegen und zu einem unscharfen Bild führen. Um diesenEffekt zu minimieren wird das reflektierte oder emittierte Licht mit einer zweiten Linse gebündelt,bevor es auf den Detektor fällt. In der Brennebene dieser Linse befindet sich die Airy-Blende, dienur Licht durchlässt, was sich zuvor im Fokus des Objektives befunden hat. Dieses Licht befindetsich, im Gegensatz zu dem Licht welches nicht im Fokus des Objektives lag, auch im Fokus derAiry-Blende (vergleiche Abbildung 1). Man spricht daher von einem konjugierten oder konfokalenFokus. Das hat zur Folge, dass während eines Abtastvorganges mit sehr kleiner Blendenöffnung nurIntensitäten von Punkten des Objektes gemessen werden, die sich in der Fokusebene des Objetivesbefinden.Diese Eigenschaft kann man auch gut nutzen um eine 3D-Darstellung eines Objektes zu erstellenindem man viele übereinander liegende Schichten des Objektes aufnimmt und diese dann zu einemBild zusammen fügt.

3 Experimentelles

3.1 Vermessung einer MünzeIm ersten Versuchsteil sollte die Prägung einer Münze vermessen werden um den Umgang mitdem LSM zu erlernen. Dazu wurde diese zunächst auf einen Objektträger gelegt, mit dem Licht-mikroskop vorfokussiert und eine geeignete Stelle für die Vermessung gesucht. Wir haben uns zweiMünzen ausgesucht. Auf einer Zwei-Cent Münze haben wir einen Stern am Rand der Münze undbei einer Zwanzig-Cent Münze die Abbildung von Irland vermessen. Einen Eindruck über die vor-her genannten unscharfen Bereiche bei einem Lichtmikroskopbild gibt Abbildung 2, bei der wir dieObefläche des Sterns scharf gestellt haben. Die unscharfen Bereiche auf der Oberfläche der Münzeliegen nicht im Fokus des Objektives, werden aber dennoch abgebildet.

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Abbildung 3: Stern: Links Sternoberfläche im Fokus, rechts Münzoberfläche

Abbildung 4: Abstand Oberfläche Stern und Münze

Nun haben wir das Mikroskop auf Laserbetrieb umgestellt und den Stern vermessen. Es ist zubemerken, dass lediglich Intensitäten gemessen werden und die Farben aller nachfolgenden Bildernur aus einer ’Colormap’ entspringen bei der jeder Farbwert einer Intensität zugeordnet ist. DieObjekte haben also keineswegs die gezeigte Farbgebung. Als erstes haben wir die Höhe des Sterns,oder mit anderen Worten, die Prägungstiefe der Münze vermessen. Dafür wurde der Fokus erstetwas über die Oberfläche des Sternes gelegt und danach unter die Oberfläche der Münze. DieAufnahmen der beiden Oberflächen im Fokus sind in Abbildung 3 dargestellt.

Das LSM konnte dann viele einzelne Schichtaufnahmen zwischen den beiden Fokuspunkten erstel-len aus denen man die Höhe des Stern bestimmen kann. Dazu haben wir uns in einem Graphen fürzwei Bereiche auf der Bildserie anzeigen lassen, bei welcher Aufnahme die Intensität des gewähl-ten Bereiches maximal wurde. Zu diesem Zeitpunkt muss der Bereich in der Fokusebene gelegenhaben. Mann kann die Höhendifferenz dann einfach ablesen. Die Bereiche und die Graphen sind inAbbildung 4 zu finden.

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Abbildung 5: Vermessung der Spannweite des Sternes

Der Abstand der Maxima beträgt 37.66 ± 2.4µm. Der Fehler kommt durch den Abstand zweierSchichtaufnahmen zustande. Da die Prägehöhe aber von Prägerei zu Prägerei variiert kann hierkein Literaturwert angegeben werden.

Als nächstes haben wir die Spannweite des Sternes an zwei Stellen vermessen. Dazu sind wir wiefolgt vorgegangen:Zuerst haben wir mit Hilfe der Bearbeitungssoftware zwei Linien in einem Bild gezogen. Die eineschnitt zwei Spitzen des Sternes und die Andere zwei Einbuchtungen. Danach kann man sich wiedereinen Graphen anzeigen lassen, der die Intensität an jedem Punkt der Linie widergibt. Die Kantendes Graphen an denen die Intensität sprunghaft zu oder abnimmt kennzeichnen die Kanten desSternes. Die Ergebnisse finden Sie in Abbildung 5.Entlang der blauen Linie hat der Stern eine Ausdehnung von 430± 10µm, entlang der grünen einevon 730±10µm. Hier ist der Fehler durch die maximale Ablesegenauigkeit am Graphen entstanden.

Als letztes haben wir in diesem Teilverusch die Prägung von Irland auf einer Zwanzig-Cent Münzevermessen. Nach Literatur (Atlas) liegt zwischen dem nördlichsten und dem südlichsten PunktIrlands eine Strecke von 428 km. Zwischen dem östlichsten und dem westlichsten eine von 257 km.Die Nord-Süd-Strecke ist also etwa 1.66 mal so lang wie die von Ost nach West. Dieses Strecken-verhältnis haben wir für die Münze geprüft. Die nötigen Aufnahmen der Vermessung finden Sie inAbbildung 6. Dabei ist der linke Graph der der Nord-Süd-Linie

Die Auswertung der Daten steht in Tabelle 7:

Erstaunlicher Weise liegt das Streckenverhältnis recht nah am Verhältnis der realen Strecken.

3.1.1 3D-Darstellung

Aus den z-Scans kann nun noch, wie im Vorfeld erwähnt, eine 3D-Darstellung des Objektes ge-wonnen werden. Dazu dient ein Matlab-Programm, dass Punkte ähnlicher Intensitäten, die nahbei einander liegen zu einer Isofläche zusammenfasst. Dies geschieht auch über mehrere z-Ebenen.Das Resultat für den Stern sehen sie in Abbildung 8.

Man erkennt gut, dass der Stern höher liegt als die Grundfläche der Münze, jedoch befindet sichzwischen den beiden Ebenen eine Lücke. Diese ist aber keinesfalls ein Indiz für eine Fehlstelle in der

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Abbildung 6: Vermessung von Irland auf der Münze

Nord-Süd-Linie Ost-West-Linie VerhältnisRealität 428 km 257 km 1.66Münze 0.9 ±0.01 mm 0.51 ±0.01 mm 1.76 ±0.05

Abbildung 7: Streckenverhältnisse Irland real und auf der Münze

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Abbildung 8: 3D-Darstellung des Sterns

Abbildung 9: Topo-Image des Sterns

Münze, sondern resultiert lediglich daraus, dass an den Kanten des Sterns das Licht so reflektiertwurde, dass keine Intensität mehr gemessen werden konnte. Ergo konnte das Matlab-Programmauch keine Isoflächen bilden.

Zur Veranschaulichung haben wir mit den Bearbeitungstools ein ’Topo-Image’ aus dem z-Scan desSterns erstellt, welches die Höhe einzelner Teile des Bildes widergibt. Der Nullpunkt liegt dabei aufHöhe der unteren Scangrenze. Die gelben Bereiche stehen für hohe, die roten für niedrige Stellen.Ist eine Stelle schwarz, so wurde hier zu wenig Intensität während des z-Scans gemessen und mankann keine Höhe zuordnen. Sie finden das Image in Abbildung 9.