Funktionelle Charakterisierung neu identifizierter Defekte...

Aus dem Zentrum für Innere Medizin

des Fachbereichs Medizin der Philipps-Universität Marburg

Klinik für Innere Medizin, Kardiologie

Direktor: Prof. Dr. B. Maisch

Arbeitsgruppe Präventive Kardiologie: Prof. Dr. J. R. Schaefer

In Zusammenarbeit mit dem Universitätsklinikum Gießen und Marburg GmbH,

Standort Marburg

Funktionelle Charakterisierung neu identifizierter Defekte des

LDL-Rezeptors und von Apolipoprotein B-100

Inaugural-Dissertation

zur Erlangung des Doktorgrades der Humanbiologie

(Dr. rer. physiol.)

dem Fachbereich Humanmedizin

der Philipps-Universität Marburg

vorgelegt

von

Muhidien Soufi

aus Marburg

Marburg 2008

Angenommen vom Fachbereich Humanmedizin der Philipps-Universität Marburg

am: 09.06.2008

Gedruckt mit Genehmigung des Fachbereichs.

Dekan: Prof. Dr. M. Rothmund

Referent: Prof. Dr. J.R. Schaefer

Korreferent: Prof. Dr. K-H. Grzeschik

Inhaltsverzeichnis I

Inhaltsverzeichnis

1. Einleitung

1.1 Atherosklerose und Koronare Herzkrankheit (KHK)____________________ 1

1.1.1 Die Bedeutung der Atherosklerose___________________________________1

1.1.2 Risikofaktoren für die Entstehung von KHK ___________________________2

1.1.3 Die Hyperlipidämie als bedeutender KHK- Risikofaktor _________________2

1.1.4 Die Pathogenese und Manifestation der Atherosklerose __________________3

1.2 Stoffwechsel der Apolipoproteine _____________________________________4

1.2.1 Aufbau und physikochemische Eigenschaften von Lipoproteinen __________4

1.2.2 Klassifikation und Funktionen der Apolipoproteine _____________________6

1.2.3 Enzyme und zelluläre Transporterproteine im Lipoproteinstoffwechsel ______8

1.3 Zentrale Rezeptoren des Lipoproteinstoffwechsels ______________________10

1.3.1 Die LDL- Rezeptor- Superfamilie __________________________________10

1.3.2 Der HDL- Scavenger Rezeptor B- I (SCARB1) _______________________14

1.3.3 Die Makrophagen Scavenger Rezeptoren Typ I und II (SR- A I/II) ________15

1.4 Die zelluläre Cholesterinhomöostase __________________________________15

1.4.1 Intrazelluläre Synthese von Cholesterin______________________________16

1.4.2 Die zelluläre Aufnahme von LDL über den LDL- Rezeptorstoffwechselweg_17

1.4.3 Transkriptionelle Kontrolle der intrazellulären Cholesterinbiosynthese _____19

1.5 Stoffwechsel der Lipoproteine _______________________________________23

1.5.1 Der exogene Weg (Chylomikronen- Stoffwechselweg)__________________23

1.5.2 Der endogene Weg (VLDL- LDL- Stoffwechselweg) ____________________ 26

1.5.3 Der reverse Cholesterintransport (HDL- Stoffwechselweg) ______________29

1.6 Störungen des Lipidstoffwechsels ____________________________________32

Inhaltsverzeichnis II

1.6.1 Einteilung der Lipidstoffwechselstörungen ___________________________32

1.6.2 Diagnostik von Lipidstoffwechselstörungen und Risikobeurteilung ________34

1.7 Monogenetische autosomal dominant vererbte Lipidstoffwechselstörungen _36

1.7.1 Die Familiäre Hypercholesterinämie (FH)____________________________36

1.7.2 Der LDL- Rezeptor Pathway und die Pathogenese der FH _______________37

1.7.3 Auswirkungen von LDLR- Mutationen auf den Lipidstoffwechsel bei FH___40

1.7.4 Das Familiär defekte Apolipoprotein B-100 (FDB)_____________________41

1.7.5 Struktur des Apolipoprotein B- Gens und Funktion von ApoB- 100________43

1.7.6 Bisher bekannte ApoB- Defekte und ihre Auswirkung auf

den Lipidstoffwechsel____________________________________________44

1.7.7 Mutationen im Gen der neuronalen Apoptosis regulierten Konvertase

(PCSK 9) _____________________________________________________46

1.8 Monogenetische autosomal rezessiv vererbte Lipidstoffwechselstörungen ___47

1.8.1 Apolipoprotein E und der ApoE- Polymorphismus _____________________47

1.8.2 Die Autosomal Rezessive Hypercholesterinämie (ARH) ________________50

1.8.3 Die autosomal rezessiv vererbte Phytosterolemie (Sitosterolämie) _________51

1.9 Aufgabenstellung und Zielsetzung der Arbeit __________________________53

2. Material und Methoden ___________________________ 55

2.1 Material _________________________________________________________55

2.1.1 Geräte ________________________________________________________55

2.1.2 Chemikalien und Biochemikalien __________________________________56

2.1.3 Enzyme _______________________________________________________59

2.1.4 Kommerzielle Reaktionssysteme ___________________________________59

2.1.5 Oligonukleotide ________________________________________________59

Inhaltsverzeichnis III

2.1.6 Kulturmedien/Seren _____________________________________________59

2.1.7 Verbrauchsmaterialien ___________________________________________60

2.1.8 Antikörper_____________________________________________________61

2.1.9 Standardpuffer und Lösungen _____________________________________62

2.1.10 Verwendete DNA und Proteinstandards _____________________________63

2.2 Molekularbiologische Arbeitsmethoden _______________________________64

2.2.1 Isolierung von DNA aus Vollblut___________________________________64

2.2.2 Isolierung von RNA aus kultivierten adherenten Zellen _________________65

2.2.3 Photometrische Konzentrationsbestimmung von DNA und RNA__________66

2.2.4 DNA- Hydrolyse mit Restriktionsendonukleasen ______________________66

2.2.5 Agarose- Gelelektrophorese zur Auftrennung von DNA/RNA- Molekülen __67

2.2.6 Polyacrylamid- Gelelektrophorese zur Auftrennung von DNA- Fragmenten _67

2.2.7 Isolierung von DNA- Fragmenten aus Agarosegelen ___________________69

2.2.8 Amplifikation von DNA mit der Polymerase Kettenreaktion (PCR)________69

2.2.9 Quantitative Untersuchung der Genexpression mittels Real- Time RT/PCR _71

2.2.10 Denaturierende Gradientengel Elektrophorese (DGGE)_________________72

2.2.11 Sequenzierung von PCR- amplifizierter DNA ________________________74

2.3 Proteinbiochemische Methoden ______________________________________75

2.3.1 In vivo- Kinetikuntersuchungen von Kontroll- und Patientenproben _______75

2.3.2 Auswahl der Isotope für in vivo- Kinetikuntersuchungen ________________75

2.3.3 Studienprotokoll und Durchführung der in vivo- Kinetikuntersuchungen____77

2.3.4 Gewinnung des Plasmas für die nachfolgenden Experimente _____________78

2.3.5 Isolierung der freien Plasmaaminosäuren_____________________________78

Inhaltsverzeichnis IV

2.3.5 Isolierung der einzelnen Lipoproteinfraktionen mittels sequentieller-

Ultrazentrifugation ______________________________________________79

2.3.7 Dichtelösungen und Zentrifugationsbedingungen zur Isolierung

der Lipoproteine ________________________________________________79

2.3.8 Isolierung der VLDL- Fraktion ____________________________________80

2.3.9 Isolierung der IDL- Fraktion ______________________________________81

2.3.10 Isolierung der LDL- Fraktion _____________________________________81

2.3.11 Isolierung der HDL- Fraktion _____________________________________82

2.3.12 Lipidologische Labordiagnostik ___________________________________82

2.3.13 Entsalzung von Proteinproben mittels Dialyse ________________________83

2.3.14 Delipidierung von isolierten Lipoproteinfraktionen ____________________84

2.3.15 Bestimmung der Proteinkonzentration nach Bradford __________________86

2.3.16 SDS- Polyacrylamid- Gelelektrophorese (SDS- PAGE)_________________87

2.3.17 Coomassie- Blau- Färbung von Proteingelen _________________________90

2.3.18 Immunblot von Proteinen ________________________________________90

2.3.19 Isolierung von Proteinbanden aus SDS- Gelen und Protein- Hydrolyse_____92

2.3.20 Isolierung der Aminosäuren über Ionenaustauscherchromatografie________93

2.3.21 Derivatisierung der Aminosäuren für die GC/MS______________________94

2.3.22 Gaschromatografie/Massenspektrometrie (GC/MS)____________________95

2.3.23 Datenauswertung ______________________________________________100

2.4. Zellbiologische Methoden _________________________________________102

2.4.1 Verwendete Zellen und Kulturbedingungen _________________________102

2.4.2 Einfrieren und Auftauen von Zellen________________________________102

2.4.3 Fluoreszenzmarkierung von Lipoproteinpartikeln mit DiI_______________103

Inhaltsverzeichnis V

2.4.4 Herstellen von Lipoprotein defizientem Serum (LPDS) für die Zellkultur __104

2.4.5 Bindungs- und Aufnahmestudien mit DiI- markierten Lipoproteinen

in Zellkultur __________________________________________________104

2.4.6 Konfokale Laser Scanning Mikroskopie (LSM) ______________________107

2.4.7 Konfokale Mikroskopie der zellulären Aufnahme von DiI- LDL _________107

2.4.8 Immunfluoreszenz- Mikroskopie zur zellulären Lokalisation von Proteinen 108

2.4.9 Subzelluläre Fraktionierung von Zellen für Immunblot- Experimente _____109

3. Ergebnisse _____________________________________ 110

3.1 Mutationsanalyse mittels denaturierender Gradientengel- Elektrophorese

(DGGE)_________________________________________________________110

3.1.1 Prinzip und Theorie der DGGE ___________________________________110

3.1.2 Konstruktion eines Elektrophorese- Systems für das Screening

mit der denaturierenden Gradientengel Elektrophorese (DGGE) _________113

3.1.3 Schmelzkurven für die Untersuchungen des ApoB- 100 und

LDL- Rezeptorgens ____________________________________________114

3.1.4 Auswahl und Sequenzen der Oligonukleotide für die

DGGE- Untersuchungen ________________________________________116

3.3 Detektion von ApoB- Mutationen bei Patienten aus dem Kollektiv

der Marburger Präventions- Allianz durch DGGE- Screening __________119

3.3.1 Identifizierung einer neuen ApoB- Mutation: ApoB- H3543YMarburg ______119

3.3.2 Untersuchungen des LDL- Rezeptorgens und ApoE- Genotypisierung

bei den Trägern von ApoB- H3543YMarburg _____________________________________ 120

3.3.3 Haplotypanalyse der ApoB- H3543YMarburg- Träger ___________________122

3.3.4 Lipidparameter, Klinik und Prävalenz von ApoB- H3543YMarburg ________125

Inhaltsverzeichnis VI

3.4 Untersuchungen des LDL- Rezeptorgens bei Patienten mit

Familiärer Hypercholesterinämie (FH)_______________________________127

3.4.1 Erstmalige Beschreibung von homozygoter Familiärer-

Hypercholesterinämie (FH) bei eineiigen Zwillingen __________________127

3.4.2 Nachweis einer neuen LDL- Rezeptor Mutation: FH- W556RMarburg ______129

3.4.3 FH- W556RMarburg verändert die Struktur eines hochkonservierten

YWVD- Repeats im ß- Propeller- Motif des LDL- Rezeptors____________131

3.4.4 Unterschiedliche LDL- Cholesterinspiegel bei identischer LDLR- Mutation,

aber unterschiedlichem Geschlecht („Gender Specific Cholesterol“) _____132

3.4.5 Die DGGE und LDLR- Haplotypanalysen zeigen, dass beide FH- Familien

nicht direkt miteinander verwandt sind _____________________________135

3.4.6 ApoE- Genotypisierungen der beiden FH- W556RMarburg- Familien _______139

3.5 Funktionelle Charakterisierung von ApoB- H3543YMarburg

und FH- W556RMarburg in vitro mit Zellkultur- Experimenten ___________140

3.5.1 Aufnahme und Bindung von: Wildtyp, ApoB- H3543YMarburg

und ApoB- R3500Q- DiI- LDL in kultivierten HeLa- Zellen ____________141

3.5.2 Die Aufnahme und Bindung von ApoB- H3543YMarburg DiI- LDL

in kultivierten HeLa- Zellen ist deutlich reduziert ____________________145

3.6 DiI- LDL- Aufnahme- Kinetiken mit FH- W556RMarburg- Fibroblasten ____145

3.6.1 Fibroblasten der homozygot betroffenen FH- W556RMarburg- Zwillinge

nehmen praktisch kein DiI- LDL mehr auf __________________________148


3.7 Untersuchungen der zellulären DiI- LDL- Aufnahme von

ApoB- H3543YMarburg und FH- W556RMarburg mit konfokaler Mikroskopie _150

3.7.1 Konfokale Mikroskopie der Aufnahme von: Wildtyp, ApoB- H3543YMarburg

und ApoB- R3500Q- DiI- LDL in HeLa- Zellen ______________________150

3.7.2 In der konfokalen Mikroskopie zeigte sich keine DiI- LDL- Aufnahme

in Fibroblasten der homozygot betroffenen FH- W556RMarburg- Zwillinge__152

3.7.3 Immunfluoreszensanalysen von Wildtyp und FH- W556RMarburg-

Fibroblasten mit konfokaler Mikroskopie ___________________________154

3.7.4 Auf der Zelloberfläche von Fibroblasten der FH- W556RMarburg- Zwillinge

lässt sich kein LDL- Rezeptor mehr nachweisen______________________155

3.8 Untersuchung der Expression von Genen des Cholesterinstoffwechsels in

FH- W556RMarburg - Fibroblasten mit Real- Time- RT/PCR _____________157

3.8.1 Die relative Expression zentraler Gene der Cholesterinbiosynthese

in homozygoten FH- W556RMarburg- Fibroblasten ist deutlich erhöht ______159

3.8.2 Die Expression von SCARB1, aber nicht ABCA1, ist in homozygoten

FH- W556RMarburg- Fibroblasten deutlich erhöht ______________________162

3.9 In vivo Turnover- Untersuchung von ApoB- H3543YMarburg

und FH- W556RMarburg mittels stabiler Isotopentechnik ________________164

3.9.1 Isolierung und Aufreinigung der Lipoproteinfraktionen von Kontroll-,

ApoB- H3543YMarburg- und FH- W556RMarburg- Patienten für die

GC/MS- Messungen ____________________________________________165

3.9.2 Ergebnisse der in vivo Kinetikuntersuchung von Kontroll-,

ApoB- H3543YMarburg- und FH- W556RMarburg- Patienten_______________167

3.9.3 Tracer/Tracee- Ratios der freien Plasmaaminosäuren __________________167

Inhaltsverzeichnis II

3.9.4 In vivo Turnover von VLDL ApoB- 100 ___________________________168

3.9.5 In vivo Turnover von LDL ApoB- 100 ____________________________169

3.10 Varia: Ergebnisse weiterer genetischer Studien mit dem Kollektiv

der Marburger Präventions- Allianz _______________________________171

3.10.1 Identifikation der ApoA5 S19W- Mutation als Kofaktor für die Ausbildung

von Hyperlipidämie bei Patienten mit dem Phänotyp ApoE 2/2 _________171

3.10.2 Einfluss von Osteoprotegerin (OPG)- Polymorphismen auf die

koronare Herzkrankheit (KHK) __________________________________171

3.10.3 Promotor- Mutationen der Cytochrome P- 450 Epoxygenase (CYP2J2)

bei Patienten mit koronarer Herzkrankheit (KHK) ___________________171

3.10.4 Untersuchungen des Gens der endothelialen NO- Synthase (eNOS)

bei Patienten mit KHK _________________________________________172

3.10.5 Untersuchungen von Apolipoprotein E (ApoE) bei Patienten

mit Hypertriglyzeridämie _______________________________________173

4. Diskussion ____________________________________________175

4.1 ApoB- H3543YMarburg und FH- W556RMarburg- zwei neue, häufig

vorkommende Defekte in zentralen Proteinen des Lipidstoffwechsels ____175

4.1.1 ApoB- H3543YMarburg und FH- W556RMarburg- funktionell relevante Defekte,

die über unterschiedliche Mechanismen wirken ______________________181

4.1.2 Die relative Expression zentraler Gene der Cholesterinbiosynthese

in homozygoten FH- W556RMarburg- Fibroblasten ist deutlich erhöht______187


4.1.3 Die mRNA- und Proteinspiegel von SCARB1 in homozygoten und

Heterozygoten FH- W556RMarburg- Fibroblasten sind erhöht, aber die

Expression von ABCA1 unterscheidet sich deutlich___________________189

4.1.4 In vivo Kinetik- Untersuchungen mit ApoB- H3543YMarburg- und

FH W556RMarburg- Patienten zeigen einen verzögerten

LDL ApoB- 100 Turnover ______________________________________194

4.1.5 Therapie von Patienten mit ApoB- H3543YMarburg- und FH- W556RMarburg _ 195

5. Zusammenfassung _____________________________________198

6. Literaturverzeichnis____________________________________200

7. Anhang ______________________________________________233

7.1 Abkürzungsverzeichnis ________________________________________233

7.2 Lebenslauf __________________________________________________235

7.3 Verzeichnis der akademischen Lehrer_____________________________236

7.4 Danksagung ________________________________________________237

7.5 Publikationen________________________________________________238

7.6 Ehrenwörtliche Erklärung ______________________________________242

1. Einleitung 1

1. Einleitung

1.1 Atherosklerose und Koronare Herzkrankheit (KHK)

1.1.1 Die Bedeutung der Atherosklerose

Die Atherosklerose und ihre Folgen sind heute für nahezu 50% der Todesfälle in den

westlichen Industrienationen verantwortlich (Schaefer 1998). Die Atherosklerose ist

nicht nur eine eigenständige Krankheit der Arterien, sondern manifestiert sich auch in

unterschiedlichen Formen. Am bedeutendsten sind die zerebrovaskuläre Manifestation

(Schlaganfall), sowie die kardiale Manifestation der Atherosklerose in Form der

koronaren Herzerkrankung (KHK). In Deutschland beruhen ca. 30% aller Todesfälle auf

einer KHK, wobei fast die Hälfte der Betroffenen durch einen akuten Myokardinfarkt

zu Tode kommt, während die andere Hälfte durch die chronischen Folgen der KHK

verstirbt (Niederstadt und Stierle 1999).

1.1.2 Risikofaktoren für die Entstehung von KHK

Das heute gültige Risikofaktorenkonzept der koronaren Herzerkrankung basiert auf den

Daten großangelegter epidemiologischer Studien (Castelli et al. 1987; Assmann und

Schulte 1988; Assmann et al. 2002). Besonders hervorzuheben sind hierbei zwei große

Studien, die über Jahrzehnte hinweg prospektiv begünstigende Faktoren für die

Entstehung von Herz- Kreislauf- Erkrankungen untersucht haben. Die in den USA in

einer amerikanischen Kleinstadt seit 1948 laufende Framingham-Studie (Castelli 1982)

beobachtete über Jahrzehnte hinweg mehr als 5200 Männer und Frauen im Alter von 30

bis 62 Jahren und identifizierte folgende kardiovaskuläre Risikofaktoren: männliches

Geschlecht, hohes Lebensalter, familiäre Belastung für das Auftreten von KHK,

Hypercholesterinämie, erniedrigte HDL- Cholesterinwerte, Nikotinabusus, arterielle

Hypertonie, Diabetes mellitus, körperliche Inaktivität, sowie Adipositas (Castelli 1982;

Castelli 1984; Castelli et al. 1987). In der unter der Leitung von Prof. Assmann am

Atheroskleroseforschungs- Institut in Münster seit 1979 laufenden „Prospective

Cardiovaskuläre Münster- Studie“ (PROCAM) (Assmann und Schulte 1986) mit über

18000 eingeschlossenen Personen konnte der potenzierende Effekt von

Einzelrisikofaktoren aufgezeigt werden (Assmann und Schulte 1988). Im Rahmen von

PROCAM wurde unter anderem die Inzidenz der koronaren Herzkrankheit in einer

Gruppe von 2815 Männern im Alter zwischen 40 und 65 Jahren ohne kardiale

Vorgeschichte untersucht. In einer Beobachtungsperiode von 4 Jahren wurden 73

1. Einleitung 2

koronare Ereignisse festgestellt, von denen 21 tödlich verliefen. In der Gruppe ohne

Risikofaktoren war die Infarktinzidenz mit 6/1000 relativ niedrig. Bei Vorhandensein

eines Risikofaktors wie z.B. Bluthochdruck oder Diabetes lag das Risiko für ein

koronares Ereignis bei 14/1000. Die Infarktrate bei der Kombination

Diabetes/Bluthochdruck lag bei 48/1000. Das alleinige Vorhandensein des

Risikofaktors Hyperlipidämie resultierte in einer Inzidenz von 96/1000, kamen

zusätzlich eine Hypertonie und/oder ein Diabetes mellitus hinzu, so erhöhte sich die

Infarkt- Inzidenz auf 114/1000 Personen. Die Daten von PROCAM wurden mittels

eines neuronalen Netzwerks generiert (Assmann et al. 2002) und ermöglichen heute

eine individuelle Risikostratifizierung durch den PROCAM- SCORE (abrufbar unter:

www.chd-taskforce.de).

1.1.3 Die Hyperlipidämie als bedeutender KHK- Risikofaktor

Die Bedeutung von Fettstoffwechselstörungen als kardiovaskuärer Risikofaktor

konnte- wie bereits oben kurz erwähnt- in großen epidemiologischen Studien wie der

Framingham Study (Kannel et al. 1971), der PROCAM- Studie, dem Multiple Risk

Factor Intervention Trial (Stamler et al. 1986) und der Withehall Study (Davey Smith et

al. 1998) aufgezeigt werden. All diese Studien fanden eine positive Korrelation

zwischen der Höhe des Serumcholesterins und dem Auftreten einer koronaren

Herzerkrankung. Besonders die Daten von PROCAM über einen Beobachtungszeitraum

von 4 Jahren zeigten, dass bei alleinigem Vorliegen einer Hyperlipidämie die Inzidenz,

ein kardiovaskuläres Ereignis zu erleiden, etwa 6-7 mal höher liegt (Castelli et al. 1987;

Assmann und Schulte 1988; Assmann et al. 2002) als bei alleinigem Vorliegen der

Risikofaktoren Bluthochdruck bzw. Diabetes mellitus, was eindrucksvoll den

Stellenwert der Hyperlipidämie als herausragendsten kardiovaskulären Risikofaktor

verdeutlicht. Diese Beobachtungen bestätigten sich nicht nur aus den primär erhobenen

Daten über die Ätiologie der Atherosklerose und damit verbunden der KHK, sondern

stützen sich auch auf die gesicherten Daten großangelegter Interventionsstudien mit

lipidsenkenden Medikamenten (insbesondere HMG- CoA- Reduktase- Inhibitoren) und

den Verlauf einer bereits manifesten Lipidstoffwechselstörung. Solche Studien wie z.B.

die „Scandinavian Simvastatin Survival Study (4 S- Studie) (Kjekshus und Pedersen

1995; Pedersen et al. 1998), die „Cholesterol and Recurrent Event Study“ (CARE-

Studie) (Sacks et al. 1996), sowie die „West of Scotland Coronary Prevention Study“

http://www.chd-taskforce.de

1. Einleitung 3

(WOS- Studie) (Shepherd et al. 1995) konnten zeigen, dass eine medikamentöse

Senkung z.B. des atherogenen LDL- Cholesterins die Gesamtmortalität und die KHK-

Mortalität sowohl bei gesunden, als auch bei erkrankten Personen im Vergleich zur

Placebogruppe signifikant senkt. Mehr noch, die PROVE-IT&TNT (Pravastatin or

Atorvastatin Evaluation and Infection Therapy und Treatment to new Targets) Studien

legen nahe, dass je niedriger das LDL (< 70mg/dl), desto geringer ist das Infarktrisiko

(Salam 2004; Fitchett et al. 2006; Deedwania et al. 2006).

1.1.4 Die Pathogenese und Manifestation der Atherosklerose

Die Enstehung der Atherosklerose ist ein komplexer Vorgang, der durch eine vielseitige

Wechselwirkung zwischen modifizierten Lipoproteinen, Endothelzellen, glatten

Muskelzellen der Intima der Arterien, Blutplättchen, Monozyten/Makrophagen sowie

Wachstumsfaktoren und Zytokinen charakterisiert ist (Libby 2000). Der initiale Prozess

beeinhaltet die Formation von atherosklerotischen Läsionen, welche zu einer Verengung

der großen und mittelgroßen Arterien, des systemischen Kreislaufs, insbesondere der

Aorta und ihren Ästen, der Koronararterien und Karotiden führt. Das von den beiden

amerikanischen Biochemikern Michael S. Brown und Joseph L. Goldstein konzipierte

Modell der Lipidhypothese als Ursache für die Entstehung von atherosklerotischen

Plaques (Goldstein und Brown 1977; Mahley et al. 1979) postuliert, dass modifizierte

Lipoproteine intermediärer und geringer Dichte (IDL und LDL) abhängig von ihrer

Plasmakonzentration in den subendothelialen Raum eindringen können und dort

oxidativ modifiziert werden (Steinberg 1981; Steinberg 1987). Diese modifizierten

oxidierten LDL- Partikel werden nun nicht mehr über den eigentlichen Abbauweg der

IDL und LDL, den sog. LDL- Rezeptorstoffwechselweg (siehe Punkt 1.7.2 dieser

Arbeit) abgebaut, sondern unreguliert von Monozyten/Makrophagen über die

Scavenger- Rezeptoren Typ- A-I und II aufgenommen (Krieger und Herz 1994; Stary

1995). Als Folge dieser unkontrollierten LDL- Aufnahme transformieren die

Makrophagen zu sog. isolierten Schaumzellen, welche Wachstumsfaktoren sezernieren,

die zu einer Migration und Proliferation von glatten Muskelzellen führen. Im weiteren

Verlauf bilden sich “fatty streaks”(Akkumulationen von Makrophagen und Schichten

von Schaumzellen mit lipidbeladenen glatten Muskelzellen) aus. Mit dem Fortschreiten

der Entwicklung dieser Läsionen bilden sich schließlich Präatherome, die dann zur

Ausbildung von komplizierten Plaques und Atheromen führen (Stary 1995).

1. Einleitung 4

Letztendlich bewirkt die Ruptur eines solchen Plaques dann eine Aktivierung der

Gerinnungskaskade über die es zum thrombotischen Verschluss des Gefäßes mit einer

abrupten Reduktion des koronaren Blutflusses kommt. In Abbildung 1 ist die

Entstehung eines atherosklerotischen Plaques nach dem Modell der Lipidhypothese

dargestellt. Die von uns vorgestellte Marburger Hypothese der Atherogenese sieht des

weiteren die Abhängigkeit des Energiestoffwechsels des Herzens von Fettsäuren als

einen wesentlichen Faktor dafür, dass gerade das Herz Opfer der Atherosklerose wird.

(Schaefer et al. 2005).

Abbildung 1: Entstehung eines atherosklerotischen Plaques nach dem Modell der

Lipidhypothese von Brown und Goldstein (Brown und Goldstein 1983).

1.2 Stoffwechsel der Apolipoproteine

1.2.1 Aufbau und physikochemische Eigenschaften von Lipoproteinen

Lipide zirkulieren wegen ihrer Wasserunlöslichkeit im Plasma nicht in freiem Zustand,

wodurch der Transport von exogenen und endogenen Lipiden im menschlichen

Organismus in Form von großmolekularen Komplexen aus Lipiden und Proteinen

(Lipoproteinen) erfolgen muss. Lipoproteine besitzen einen charakteristischen Aufbau

mit einem Kern, der aus unpolaren Lipiden besteht (Cholesterinestern und

Triglyzeriden), während man an der Oberfläche Phospholipide, freies unverestertes

Cholesterin und die Apoproteine findet. Strukturell findet man in den Apoproteinen sich

Media mit glatten Muskelzellen

LDLMakrophage

Wachstumsfaktoren

Proliferation von glatten Muskelzellen

Ox.LDL

Atherosklerotischer Plaque

Endothelzellen

Angelockte MonozytenÜberangebot an LDL Gefäßlumen

Schaumzellen

Subendothelialer Raum

1. Einleitung 5

wiederholende Repeats aus sog. amphipathischen -helices, die eine Interaktion sowohl

mit den hydrophoben Core- Lipiden und der wässrigen Umgebung des Plasmas

ermöglichen, wodurch ein Transport der Lipide erst möglich wird. Neben der

Stabilisierung der Lipidkomplexe besitzen die Apoproteine weitere spezifische

Funktionen im Lipidstoffwechsel, wie z.B. die Aktivierung und Inhibierung von

Schlüsselenzymen des Lipidstoffwechsels, die Bindung an spezifische

Lipoproteinrezeptoren und Interaktion mit anderen Lipoproteinen. Aufgrund ihrer

unterschiedlichen physikochemischen Eigenschaften (Dichte, Ladung und chemische

Zusammensetzung) lassen sich die Lipoproteine in verschiedene Klassen einteilen und

auftrennen. Zu den wichtigsten Auftrennungsverfahren zählen die präparative

Ultrazentrifugation (Gofman et al. 1949; Gofman et al. 1954) Immunoaffinitätssäulen

und die Lipoprotein-Gelelektrophorese (Seidel et al. 1973; Neubeck et al. 1977). In den

Tabellen 1 und 2 sind die Kompositionen der einzelnen Lipoproteinfraktionen

dargestellt.

Tabelle 1: Eigenschaften der Plasmalipoproteine.

Lipoprotein Dichte (g/ml) Elektrophorese

(Mobilität)

Größe (nm) Apoproteine

Chylomikronen < 0,95 Keine 75 - 1200 A-I, A-IV, B-48

VLDL 0,95 - 1,006 prä- ß 30 - 80B-100, C-I, C-II, C-III,

E, A-V

IDL 1,006 - 1,019 slow prä- ß 25 - 35 B-100, C-III, E

LDL 1,019 - 1,063 beta 18 - 25 B-100

HDL2 1,063 - 1,125 alpha 9 - 12

HDL3 1,125 - 1,210 alpha 5 - 9

A-I, A-II, A-IV,A-V,

C-I,C-II, Apo M, C-III,E

Lp(a) 1,040 - 1,090 slow prä- ß 25 - 30 B-100, (a)

1. Einleitung 6

Tabelle 2: Lipidkomposition der Plasmalipoproteine.

Lipoprotein Cholesterin PhospholipideApolipo-proteine

TriglyzerideCholesterin-

Ester

Chylomikronen 2 % 7 % 2 % 86 % 3 %

VLDL 7 % 18 % 8 % 55 % 12 %

IDL 9 % 19 % 19 % 23 % 29 %

LDL 8 % 22 % 22 % 6 % 42 %

HDL2 5 % 33 % 40 % 5 % 17 %

HDL3 4 % 35 % 55 % 3 % 13 %

1.2.2 Klassifikation und Funktionen der Apolipoproteine

Wie bereits unter Punkt 1.2.1 erwähnt, sind die Apolipoproteine der funktionell

wichtigste Bestandteil aller Lipoproteinpartikel, die neben der Stabilisierung der

Lipidkomplexe weitere wichtige Funktionen im Lipidstoffwechsel übernehmen: 1.

Strukturfunktionen (z.B. ApoB). 2. Rezeptorbindung (z.B. ApoB- 100 und ApoE). 3.

Kofaktorfunktion zur Aktivierung/Inhibierung von Schlüsselenzymen des

Lipidstoffwechsels (z.B. Apo C-II und ApoC-III). Die Nomenklatur der

Apolipoproteine erfolgt alphabetisch nach Alaupovic in apo A, B, C etc. (Alaupovic et

al. 1972), der die Lipoproteinfamilien nach der Hauptkomponente ihres Proteinanteils

einteilte. In den meisten Lipoproteinen finden sich jedoch mehrere

Apolipoproteinklassen oder Kombinationen aus zwei oder mehr Apolipoprotein-

Klassen. Damit existiert eine große Anzahl an Lipoproteinen, die sich hinsichtlich ihrer

Lipid- und Proteinkomposition unterscheiden. Da es sich beim Lipidtransportsystem um

ein sehr dynamisches System handelt, bei dem die Apoproteinzusammensetzung durch

den Transfer von Lipiden und Apoproteinen ständig moduliert wird, stellt diese

Definition der Lipoprotein- Familien nur einen vorübergehenden Zustand dar. Die

wichtigsten Apolipoproteine und ihre speziellen Funktionen im Lipidstoffwechsel sowie

ihr Vorkommen sind in Tabelle 3 dargestellt.

1. Einleitung 7

Tabelle 3: Charakteristika humaner Apolipoproteine (Schneider et al. 1996).

Apolipo-

proteinChromosom

Mw.

(KDa)

Plasma-

Menge

(mg/dl)

VorkommenOrt der

SynthheseFunktion

A-I 11 28, 5 120- 140 HDL, CMLeber,

Darm

Aktivierung der LCAT. Bindung an SCARB1 und den HDL-Rezeptor.

A-II 1 17 35 - 50 HDL Leber Aktivierung der Hepat. Triglyzeridlipase.

A-IV 11 46 < 5 HDL, CM DarmAktivierung der LCAT. Bindung an den HDL-Rezeptor ?

A-V 11 38 < 2 VLDL, HDL Leber Aktivierung der Hepat.Triglyzeridlipase.

B-100 2 550 70 - 90 CM,VLDL, IDL, LDL

Leber Hauptligand des LDL-Rezeptors.

B-48 2 265 < 5 CM, VLDL Darm Strukturprotein der CM. Bindung an LRP.

C-I 19 6,5 5 - 8 HDL,CM, VLDL

Leber Aktivierung der LCAT.

C-II 19 8,8 3 - 7 HDL,CM, VLDL

Leber Aktivierung der LPL.

C-III 11 8,9 10 - 12 HDL,CM, VLDL

Leber Inhibitor der LPL

D 3 29 8 - 10 HDL LeberAktivierung und Stabilisierung der LCAT.

E 19 34 3 - 5 HDL,IDL CM,VLDL

Leber Ligand des LDL/VLDL-Rezeptors und LRP.

(a) 6 350-900 variabel HDL,LDL Lp(a)

Leber Funktion noch unklar.

M6 13 < 2 HDL, VLDL

Leber,

NiereBildung von pre-ß-HDL,Cholesterinefflux.

J 8 70 7-10 HDL, VLDLGehirn,

Leber,

Funktion nicht genau bekannt. Mitwirkung bei zellulärer Apoptose.

1. Einleitung 8

1.2.3 Enzyme und zelluläre Transporterproteine im Lipoproteinstoffwechsel

Bei der Verstoffwechselung der Lipoproteine spielen neben den Apolipoproteinen, die

als Kofaktoren und Rezeptorliganden fungieren, noch verschiedene plasmatische und

intrazelluläre Enzyme sowie spezifische zelluläre Lipidtransporter eine bedeutende

Rolle. In den Tabellen 4 und 5 sind die wichtigsten Vertreter dieser Proteine sowie

Krankheitsbilder, die durch Defekte in diesen Proteinen entstehen, kurz aufgelistet. Eine

detaillierte Beschreibung ihrer spezifischen Funktionen im Lipidstoffwechsel erfolgt in

den nachfolgenden Abschnitten dieser Arbeit.

Tabelle 4: Plasmatische und zellassoziierte Enzyme des Lipoproteinstoffwechsels und

deren Funktionen (Schaefer 1998).

Enzym Funktion im Lipidstoffwechsel Defekt (Krankheitsbild)

Lipoproteinlipase

(endothelassoziierte LPL)

Hydrolyse von Triglyzeriden aus

VLDL und Chylomikronen.

Hyperlipoproteinämie Typ I.

(Bürger- Grütz Syndrom).

Hyperlipoproteinämie Typ V

(Bassen- Kornzweig Syndrom).

HepatischeTriglyzeridlipase

(leberassoziierte HTGL)

Hydrolyse von Triglyzeriden und

Phospholipiden aus IDL und

HDL.

Familiäre HTGL- Defizienz.

Gemischte Hyperlipidämie wie bei

Typ- III Hyperlipoproteinämie nach

Fredrickson.

Endotheliale Lipase (EL)

Hydrolyse von Phospholipiden

und Triglyzeriden aus HDL.

Wichtige Funktion im HDL-

Katabolismus.

Bisher kein eigenständiges

Krankheitsbild bekannt. Seltene

SNPs zeigten Einfluss auf HDL-

Spiegel.

1. Einleitung 9

Tabelle 4: Plasmatische und zellassoziierte Enzyme des Lipoproteinstoffwechsels und

deren Funktionen (Fortsetzung).

Enzym Funktion im Lipidstoffwechsel Defekt (Krankheitsbild)

Lezithin- Cholesterin- Acyl-

Transferase (LCAT)

Veresterung von Cholesterin

(Bereitstellung von >80% der

Cholesterinester).

Fish eyes disease: Korneatrübung,

sehr niedrigte HDL- Plasmapiegel

(<10%), ApoA-I (<15%).

Cholesterinestertransfer-

Protein (CETP)

Cholesterinestertransfer von HDL

zu VLDL und LDL im Austausch

gegen Triglyzeride aus VLDL,

IDL.

Hyperalphalipoproteinämie mit

stark erhöhten HDL Plasmawerten.

Phospholipidtransfer- Protein

(PLTP)

Transfer von Phospholipiden aus

HDL zu VLDL/IDL und

umgekehrt.

Kein eigenständiges Krankheitsbild

bekannt Erniedrigte HDLSpiegel in

PLTP knockout Mäusen.

Tabelle 5: Intrazelluläre Enzyme und Transporterproteine des Lipoproteinstoffwechsels

und deren Funktionen.

Protein Funktion im Lipidstoffwechsel Defekt (Krankheitsbild)

Acyl- CoA- Cholesterin-

Acyltransferase (ACAT)

Intrazelluläre Veresterung von

Cholesterin aus freiem Cholesterin

und Oleat (Cholesterinoleat).


bekannt. Assoziation mit Athero-

sklerose und Alzheimer Krankheit in

knock out Mäusen gezeigt.

HMG- CoA- Reduktase

(HMGCR)

Schlüsselenzym der intrazellulären

de- novo- Synthese von Cholesterin

(Umwandlung von HMG- CoA zu

Mevalonat).


bekannt Zwei seltene nicht-

codierende SNPs zeigten Einfluss auf

Therapie mit Pravastatin.

1. Einleitung 10

Tabelle 5: Intrazelluläre Enzyme und Transporterproteine des Lipoproteinstoffwechsels

und deren Funktionen (Fortsetzung).

Protein Funktion im Lipidstoffwechsel Defekt (Krankheitsbild)

ATP- bindender

Kassettentransporter 1

(ABCA1)

Ausschleusung von überschüssigem

unveresterten Cholesterin aus Zellen

zur Übertragung auf Pre ß- HDL.

Tangier Disease mit extrem ernied-

rigten ApoA-I (< 3%) und HDL-

Plasmaspiegeln (0-5%).

Nieman Pick disease

like- protein 1

(NPC1L1)

Aktiver Transport von über die

Nahrung aufgenommenen Cholesterin

in die Enterozyten des Darms.


bekannt Seltene Mutationen führen

zu Therapieresistenz gegen

Ezetemibe.

ATP- bindender

Kassettentransporter 5

bzw. 8 (ABCA5/8)

Ausschleusung von überschüssigem

Cholesterin und pflanzlichen

Sterolkörpern aus den Enterozyten des

Darms zur Ausscheidung.

Defekte führen zu Phytosterolämie

und Sitosterolämie (Akkumulation

von pflanzlischen Sterolen).

1.3 Zentrale Rezeptoren des Lipoproteinstoffwechsels

1.3.1 Die LDL- Rezeptor- Superfamilie

Struktur und Funktion der Mitglieder der LDL- Rezeptorfamilie

Der LDL- Rezeptor ist ein 839 Aminosäuren großes Protein und Mitglied einer Familie

mit sechs weiteren integralen Membranproteinen aus der sog. LDL- Rezeptor-

Genfamilie (Brown et al. 1997; Sappington und Raikhel 1998). Das Gen des LDL-

Rezeptors umfasst 45 Kb, liegt auf Chromosom 19p13.1-13.3 und besteht aus 18

Exonen (Sudhof et al. 1985). Der LDL- Rezeptor kommt in unterschiedlicher Anzahl

auf nahezu allen Zelltypen vor. Alle Mitglieder der LDL- Rezeptorfamilie besitzen

einen charakteristischen modularen Aufbau aus vier bis fünf unterschiedlichen

Domänen, die ihrerseits wiederum eine große Homologie zu Proteinen anderer

Genfamilien aufweisen, was auf eine Evolution der LDL- Rezeptor- Genfamilie durch

sog. Exon- shuffling hindeutet (Sudhof et al. 1985; Russell et al. 1986; Wessel 1995).

Im Nachfolgenden sollen der modulare Aufbau des LDL- Rezeptors und die

1. Einleitung 11

Charakteristika der einzelnen Domänen sowie ihre Rolle bei der Rezeptoraktivität kurz

dargestellt werden:

Modul 1: Die ligandenbindende- Domäne

Die Ligandenbindungsdomäne des LDL- Rezeptors wird von den Exonen 2-6 codiert

und setzt sich aus 292 Aminosäuren zusammen, die in sieben sich wiederholenden

Schleifen (repeats) mit ca. 40 Aminosäuren zusammengefasst sind. Innerhalb jedes

Repeats findet man sechs Cystein- Moleküle, welche über Ausbildung von drei

Disulfidbindungen für den Aufbau der Tertiärstruktur der Bindungsdomäne

verantwortlich sind. Ursprünglich wurde vermutet, dass hierdurch negativ geladene

Aminosäurereste an der Oberfläche der Repeats exponiert werden und diese mit positiv

geladenen oberflächenexponierten Aminosäureresten der Liganden Apolipoprotein B-

100 und Apolipoprotein E interagieren, wodurch die Bindung der Liganden an den

Rezeptor ermöglicht wird (Schneider et al. 1982; Schneider et al. 1985). Erst die

kristallografische Untersuchung des Repeats 5 konnte zeigen, dass die negativ

geladenen Aminosäurereste durch ein zentrales Ca2+ Ion im Inneren des Repeats

komplexiert sind und nicht für die Ligandenbindung bereit stehen (Brown et al. 1997;

Fass et al. 1997). Das heute gültige Konzept der Bindung von Apolipoprotein B-100

und Apolipoprotein E an den Rezeptor postuliert, dass die Repeats 4 und 5 eine

hydrophobe Tasche ausbilden und mit positiv geladenen amphiphatischen Helices in

Apolipoprotein B-100 (site B) (Boren et al. 1998; Boren et al. 2001), Apolipoprotein E

(ApoE binding domain) (Innerarity et al. 1987; Wilson et al. 1991) in Wechselwirkung

treten und so die Bindung ermöglichen.

Modul 2: Die YWTD- Domäne und EGF- Precursor- Repeats

Die zweite extrazelluläre Domäne des LDL- Rezeptors umfasst 411 Aminosäuren und

wird von den Exonen 7-14 codiert. Diese Region ist zu 35% identisch mit der des

Vorläufermoleküls des epidermalen Wachstumsfaktors (EGF) (Russell et al. 1986).

Strukturell besteht sie aus zwei EGF- Repeats (Repeat A und B), gefolgt von einer

YWTD- Domäne und einem weiteren EGF- Repeat (repeat C) (Stenflo et al. 1988).

Diese Domäne vermittelt die pH- abhängige Dissoziation des Rezeptor- Liganden-

Komplexes im sauren Milieu des Endosoms (Davis et al. 1987; Innerarity 2002). Die

zentrale Rolle spielt hierbei die YWTD- Domäne, die durch kristallografische

Untersuchungen entdeckt wurde. Sie setzt sich aus sechs YWTD- Repeats zusammen,

1. Einleitung 12

die eine ß- Propeller Struktur (six bladed propeller structure) (Springer 1998; Jeon et al.

2001) ausbilden. Dieser ß- Propeller interagiert im Endosom bei einem pH von 6 durch

Ausbildung von Histidin- Salzbrücken und hydrophoben Wechselwirkungen spezifisch

mit den Ligandenbindungsrepeats 4 und 5 und führt so zur Freisetzung des via

Apolipoprotein B-100 und Apolipoprotein E an den Rezeptor gebundenen LDL-

Komplexes (Innerarity 2002).

Modul 3: Die O- glykosidische- Domäne

Die dritte Domäne des LDL- Rezeptors wird von Exon 15 codiert und ist ebenfalls

extrazellulär lokalisiert. Sie besteht aus 58 Aminosäuren und ist reich an Serin und

Threoninresten, von denen ein Großteil glykosiliert ist (Cummings et al. 1983).

Während man dieser Domäne früher für die Rezeptoraktivität keine notwendige

Funktion zusprach (Schneider 1989), geht man heute davon aus, dass diese Domäne

eine hydrophile Pufferzone ausbildet, welche den gebundenen LDL- Komplex von der

Lipiddoppelschicht der Plasmamembran fernhält.

Modul 4: Die Transmembrane- Domäne

Das Exon 16 und ein Teil von Exon 17 codieren für die transmembrane- Domäne des

LDL- Rezeptors. Diese besteht aus einer Sequenz von 22 hydrophoben Aminosäuren,

die den LDL- Rezeptor in der Lipiddoppelschicht der Plasmamembran verankern

(Russell et al. 1984).

Modul 5: Die cytoplasmatische- Domäne

Die cytoplasmatische- Domäne des Rezeptors wird von Exon 17 und 18 codiert und

besteht aus 50 Aminosäuren, die als Konsensus- Aminosäuresequenz ein sog. NPxY-

Motif (Asp.-Pro.-x-Tyr. wobei x = jede beliebige Aminosäure) enthält. Dieses Motif

interagiert spezifisch mit dem ARH1- Protein (He et al. 2002; Cohen et al. 2003) (siehe

Punkt 1.8.3 dieser Arbeit) und ermöglicht hierdurch die Verankerung und

Internalisierung des Rezeptor- Liganden- Komplexes in den coated pits. Wie bereits

oben erwähnt, beträgt die Gesamtlänge des LDL- Rezeptormoleküls 839 Aminosäuren

(Yamamoto et al. 1984). Das Molekulargewicht des reifen vollständig prozessierten

humanen LDL- Rezeptors liegt bei ca. 160 KDa bzw. bei 120 KDa für das nicht

prozessierte Präkursormolekül (Beisiegel et al. 1982; Schneider et al. 1982; Daniel et al.

1983; Hui et al. 1986). In Abbildung 2 ist die Struktur der Mitglieder der LDL-

Rezeptorfamilie sowie der Aufbau des LDL- Rezeptorgens dargestellt.

1. Einleitung 13

Abbildung 2: Darstellung der modularen Struktur der Mitglieder der LDL- Rezeptorfamilie und

Aufbau des LDL- Rezeptorgens mit seinen 18 Exonen, die für die individuellen Module

codieren.

= LDLR repeats mit Ca2+ Ion (Bindung)

= EGF repeats

= ß-Propeller (6xYWTD repeats )

= O-gebundene Zucker

= Transmembrane Domäne

= NpxY-Motif

COOH COOH COOH COOH COOH

LDL-Rezeptor

VLDL-Rezeptor

Neuro/ApoE/LR8B

LRP MegalinGP 330

NH2 NH2 NH2

NH2NH2

SRE

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18

5´ 3´

Promotor

Modul 1:

Modul 2:

Modul 3:

Modul 4:

Modul 5:

Modul 6:

1. Einleitung 14

1.3.2 Der HDL- Scavenger Rezeptor Typ B- I (SCARB1)

Struktur und Funktion von SCARB1

Der Scavenger Rezeptor B- I (SCARB1) ist ein Membranprotein mit einem

Molekulargewicht von 80 KDa, welches die selektive Cholesterinaufnahme in Zellen

katalysiert. Das Gen von SCARB1 umfasst 75 Kb, ist auf Chromosom 12q 24.31

lokalisiert und setzt sich aus 13 Exonen zusammen (Cao et al. 1997). SCARB1 weist

eine sehr große Aminosäure und cDNA- Homologie zur CD36- Rezeptorfamilie auf

(Acton et al. 1996). Strukturell besteht SCARB1 aus zwei kurzen N- und C- terminalen

intrazellulär lokalisierten Domänen, zwei transmembranen Regionen und einer großen

extrazellulär lokalisierten Schleife, über welche die Lipoproteinbindung und

Cholesterinaufnahme erfolgt (Cao et al. 1997; Rigotti et al. 2003). SCARB1 ist der erste

identifizierte HDL- Rezeptor überhaupt (Acton et al. 1996) und wird hauptsächlich in

der Leber und in Zellen exprimiert, die eine hohe Steoidbiosynthese aufweisen

(Nebennierenrinde, Ovarien, Testes und Makrophagen) (Landschulz et al. 1996; von

Eckardstein et al. 2001). Neben HDL als Hauptliganden bindet SCARB1 auch

modifiziertes und natives LDL und vermittelt auch hier die Cholesterinaufnahme in die

Zelle (Krieger 1999; Rigotti et al. 2003). Die zentrale Rolle von SCARB1 als HDL-

Rezeptor beim reversen Cholesterintransport (siehe Punkt 1.5.3 dieser Arbeit) besteht in

der selektiven Aufnahme von Cholesterinestern aus HDL in die Leber. Anders als beim

LDL- Rezeptorstoffwechselweg erfolgt hierbei jedoch keine Internalisierung und

endosomale Degradation des HDL- Partikels, sondern ein direkter Influx von

Cholesterinestern in die Zelle. Es konnte gezeigt werden, dass SCARB1 in der

Zellmembran in Caveolae lokalisiert ist und man vermutet, dass SCARB1 gemeinsam

mit weiteren Komponenten der Caveolae (z.B. Caveolin- 1) einen hydrophoben Tunnel

ausbildet, über den der Influx von Lipiden in die Zelle stattfindet (Williams et al. 1999;

Graf et al. 1999). Neben der selektiven Aufnahme von Cholesterinestern aus HDL in die

Zellen vermittelt SCARB1 auch den Efflux von Cholesterin aus Zellen. Generell lässt

sich sagen, dass der von SCARB1 vermittelte zelluläre Netto- Influx/Efflux von

Cholesterin über die Aktivität der extrazellulären Lipidtransfer- Enzyme (LCAT, CETP,

PLTP) und die intrazellulären Enzyme der Cholesterinhomöostase reguliert wird

(Czarnecka und Yokoyama 1995; Ji et al. 1997). Die Expression von SCARB1 in der

Leber und peripheren Zellen wird durch den Transkriptionsfaktor SREBP-2 reguliert

1. Einleitung 15

(Treguier et al. 2004). Cholesterin und Östrogene erniedrigen die Expression von

SCARB1, während mehrfach ungesättigte Fettsäuren diese erhöhen (Krieger 1999;

Trigatti et al. 2000). Die zentrale Bedeutung von SCARB1 für den HDL- Stoffwechsel

und in der Pathogenese der Atherosklerose konnte auch in Experimenten mit SCARB1-

knockout und transgenen Mäusen gezeigt werden. Hier zeigte sich, dass SCARB1-

knockout- Tiere trotz hoher HDL- Plasmaspiegel eine massive Atherosklerose

entwickelten. Bei transgenen Tieren, die SCARB1 überexpremieren kommt es trotz

niedriger HDL- Plasmaspiegel nicht zur Ausbildung von atherosklerotischen Läsionen

(Rigotti et al. 1997; Trigatti et al. 1999).

1.3.3 Die Makrophagen Scavenger Rezeptoren Typ I und II (SR- A I/II)

Struktur und Funktion von SR- A I /II

Erste wichtige Erkenntnisse über die Bedeutung der Makrophagen Scavenger

Rezeptoren im Lipidstoffwechsel und ihrer Mitwirkung bei der Entstehung von

atherosklerotischen Plaques, wurden im Labor von Goldstein und Brown an der

Southwestern University in Dallas/Texas gewonnen (Goldstein et al. 1979). Sie konnten

zeigen, dass nicht der LDL- Rezeptorstoffwechselweg (siehe Punkte 1.1.4 und 1.7.3) für

die massive Akkumulation von Cholesterin in die subendothelialen Makrophagen

verantwortlich ist, sondern eine weitere Klasse von Multiliganden- Rezeptoren, die über

Endozytose LDL- Cholesterin aufnehmen können, die sog. Makrophagen- Scavenger-

Rezeptoren- Typ I und II (SR- A I/II) (Brown et al. 1979; Brown und Goldstein 1983).

Die beiden Rezeptor- Isoformen SR- A I/II werden von einem einzelnen Gen, das 85 Kb

umfasst und auf Chromosom 8p22 liegt, codiert und durch alternatives Spleißen der SR-

A- mRNA generiert (Freeman 1994). Strukturell handelt es sich um homotrimerische

integrale Membranproteine mit einem Molekulargewicht von 222-260 KDa, die sich aus

sechs Domänen zusammensetzen (N- terminale zytoplasmatische Domäne,

transmembranöse- Domäne, spacer- Domäne, - helicale coiled coil- Domäne,

Kollagen- homologe Domäne, cysteinreiche C- terminale Domäne) (Kodama et al.

1990; Krieger und Herz 1994; Krieger 1998). Ein wesentlicher Unterschied zum LDL-

Rezeptor besteht in der Ligandenspezifität der Makrophagen Scavenger Rezeptoren Typ

I und II. Während der LDL- Rezeptor native LDL- Partikel selektiv über Apolipoprotein

B und E bindet, binden SR- A I/II- Rezeptoren eine Vielzahl von polyanionischen

1. Einleitung 16

Liganden über die extrazellulären Kollagen und cysteinreichen Domänen, aber kein

natives LDL. Erst chemisch modifizierte LDL- Partikel (z.B. oxidiertes/acetyliertes

LDL) werden über den “Scavenger pathway” via SR- A I/II- Rezeptoren massiv in die

Zellen aufgenommen. Ein weiterer wichtiger Unterschied zum LDL- Rezeptorweg

besteht darin, dass die Expression der Makrophagen Scavenger Rezeptoren Typ I/II

nicht der Feedback Regulation durch den zellulären Cholesteringehalt unterliegt und

dieser LDL- Aufnahmeweg daher nicht saturierbar ist, was die zentrale Bedeutung des

„Scavenger pathways” in pathologischer Stoffwechselsituation mit erhöhten LDL-

Cholesterinspiegeln und seine Rolle bei der Transformation von Makrophagen zu

Schaumzellen als eines der initialen Ereignisse bei der Formation von

atherosklerotischen Läsionen verdeutlicht (Linton und Fazio 2001).

1.4 Die zelluläre Cholesterinhomöostase

1.4.1 Intrazelluläre Synthese von Cholesterin

Cholesterin ist ein wichtiges Molekül, das der Körper zum Aufbau von Zellmembranen

und zur Synthese von Steroidhormonen und Gallensäuren benötigt. Die de novo

Biosynthese von Cholesterin findet praktisch in allen Körperzellen (v.a. Leber und

Darm) statt und ist ein komplexer Prozess, der mit der Kondensation von drei

Molekülen Acetyl- CoA zu Mevalonat (C6) beginnt. Dieser Schritt der

Cholesterinbiosynthese ist der geschwindigkeitsregulierende und wird durch das Enzym

HMG- 3- Hydroxy- 3- methylglutaryl- CoA- Reduktase katalysiert. An diesem Schritt

der Cholesterinbiosynthese wirken cholesterinsenkende Medikamente (Statine) über

eine reversible Inhibition der HMG- CoA- Reduktase. Aus dem Zwischenprodukt

Mevalonat entsteht nach Phosphorilierung und Abspaltung von CO2 und H20

Isopentenyldiphosphat (C5). Im weiteren Verlauf der Synthese kondensieren 6 Moleküle

Isopentenyldiphosphat (Isopren) zu Squalen (C30), welches nach Oxidation zu

Lanosterin zyklisiert wird. Durch oxidative Entfernung dreier Methylgruppen und

Umlagerung der Doppelbindungen entsteht aus Squalen das Endprodukt Cholesterin

(C27), das intrazellulär in Form von Cholesterinestern gespeichert wird. In Abbildung 3

ist der Ablauf der intrazellulären Cholesterinbiosynthese mit den einzelnen

Reaktionsschritten dargestellt.

1. Einleitung 17

Abbildung 3: Ablauf der intrazellulären Cholesterinbiosynthese. Eine detaillierte Erklärung

findet sich im Text.

1.4.2 Die zelluläre Aufnahme von LDL- Cholesterin über den LDL-

Rezeptorstoffwechselweg

Unsere heutigen Kenntnisse über die genauen Mechanismen der zellulären

Cholesterinhomöostase stammen im wesentlichen aus den von Brown und Goldstein in

den 70er Jahren durchgeführten Experimenten an Fibroblasten in Zellkultur. Sie

konnten- wie oben bereits erwähnt- zeigen, dass prinzipiell jede Zelle zur de novo-

Synthese von Cholesterin in der Lage ist und dass diese de novo- Synthese durch eine

externe Zufuhr und Aufnahme von Plasma- LDL- Cholesterin gehemmt wird (Brown et

al. 1973; Brown und Goldstein 1974). Auf der Basis ihrer Beobachtungen postulierten

sie damals einen rezeptorvermittelten Aufnahmeweg von LDL- Cholesterin und

entdeckten 1974 auf Fibroblasten den LDL- Rezeptor (ApoB/E- Rezeptor) (Goldstein

und Brown 1974; Brown und Goldstein 1986). Neben Apolipoprotein B-100 als

Hauptligand der LDL bindet der LDL- Rezeptor auch Apo E- haltige Lipoproteine

(VLDL und IDL), wodurch VLDL und IDL mit LDL um die Rezeptorbindung

konkurrieren und so ebenfalls aus der Zirkulation entfernt werden können. Der Prozess

der rezeptorvermittelten Endocytose von LDL- Partikeln beginnt mit der Synthese der

LDL- Rezeptoren im Endoplasmatischen Retikulum (ER). Nach erfolgter korrekter

Faltung der 120 KDa LDL- Rezeptor- Präkursormoleküle, welche durch molekulare

3,3-Dimetyl PP

Geranyl PP

Acetyl CoA HMG CoA

Mevalonat 5-PP Mevalonat Isopentyl PP

Farnesyl PPSqualenLanosterin

Cholesterin

HMG CoA ReduktaseStatine

1. Einleitung 18

Chaperone (Bu et al. 1995; Jorgensen et al. 2003) kontrolliert wird, gelangen diese in

den Golgi- Apparat, wo durch postranslationale Modifikationen (N und G-

Glykosylierungen) die reifen 160 KDa Formen der LDL- Rezeptoren entstehen

(Tolleshaug et al. 1982). Diese LDLR sammeln sich danach in hoher Dichte über ein

Clathrin- assoziiertes Protein in mit Clathrin ausgekleideten coated pits

(Stachelsaumgrübchen) an der Zelloberfläche an. Nach Bindung der LDL- Partikel über

die Rezeptorbindungstelle site B in ApoB- 100 (Boren et al. 1998), werden die coated

pits internalisiert (Anderson et al. 1977). Für die Internalisierung wird in Leberzellen

das ARH1- Protein benötigt, das über eine sogenannte PDZ- Domäne spezifisch an die

NPxY- Domäne des LDL- Rezeptors bindet und erst dadurch die Internalisierung des

Komplexes ermöglicht (He et al. 2002; Michaely et al. 2004). Aus den coated pits

entstehen anschließend coated vesicles, diese wiederum verschmelzen nach Degradation

der Clathrinhülle zu Endosomen, in denen es durch einen Einstrom von Protonen (H+)

zum Absinken des pH- Wertes auf ca. 6 kommt, was zur Dissoziation von Rezeptor-

und LDL- Partikeln führt (Davis et al. 1987; Brown et al. 1997; Innerarity 2002).

Während der Rezeptor in Vesikeln verpackt wieder an die Zelloberfläche gelangt und

erneut in den coated pits gebunden wird (Rezeptor- Recycling), fusionieren die im

Kompartiment verbleibenden LDL- Partikel mit primären Lysosomen zum sekundären

Lysosom, in dem der Proteinanteil der LDL, das ApoB- 100, proteolytisch gespalten

wird. Die dabei frei werdenden Cholesterinester werden zu Cholesterin hydrolisiert und

stehen der Zelle zur Synthese von Membranbausteinen, Steroidhormonen und in der

Leber zur Produktion von Gallensäuren zur Verfügung. Neben dieser Verwendung

greift das frei gesetzte Cholesterin regulatorisch in den Zellmetabolismus ein und

reguliert über mehrere Stellglieder die intrazelluläre Cholesterinhomöostase (Brown et

al. 1973; Brown und Goldstein 1986). Zum einen werden die Transkriptionsraten der 3-

Hydroxy- 3- Methylglutaryl- CoA- Reduktase (HMGCR) (Brown und Goldstein 1999;

Horton et al. 2002) und des LDL- Rezeptors gesenkt, und zum anderen die Acyl-CoA-

Cholesterin- Acyltransferase (ACAT) aktiviert und das freie Cholesterin zu

Cholesterinestern metabolisiert und intrazellulär gespeichert. Über diese Regulation

wird gewährleistet, dass bei hohen intrazellulären Cholesterinkonzentrationen die

zelluläre de novo- Cholesterinbiosynthese inhibiert wird. In Abbildung 4 sind die

1. Einleitung 19

zellulären Vorgänge bei der Aufnahme von LDL über den LDL-

Rezeptorstoffwechselweg („LDL- receptor pathway”) grafisch dargestellt.

Abbildung 4: Ablauf der rezeptorvermittelten Endozytose von LDL über den „LDL- receptor-

pathway” adaptiert nach Brown und Goldstein (Goldstein und Brown 1989). Eine detaillierte

Erklärung findet sich im Text.

1.4.3 Transkriptionelle Kontrolle der intrazellulären Cholesterinbiosynthese

Wie bereits oben erwähnt, greift das über den LDL- Rezeptorstoffwechselweg

extrazellulär aufgenommene und freigesetzte Cholesterin regulatorisch in den

Zellmetabolismus ein und reguliert über mehrere Stellglieder die intrazelluläre

Cholesterinhämoästase. Die transkriptionelle Kontrolle der Gene, die in der

Cholesterinbiosynthese ein zentrale Rolle spielen, erfolgt über spezifische DNA-

Sequenzen im Promotor dieser Gene durch sog. „sterol- regulatory elements“ (SRE´s).

Diese SRE´s finden sich in den Promotoren des LDL- Rezeptors, der HMG- CoA-

Synthase und HMG- CoA- Reduktase, der ACAT sowie in den Genen weiterer

Rezeptoren und Transporter des Lipidstoffwechsels wie z. B. SCARB1, ABCA1 und

PCSK9 (Brown und Goldstein 1997; Amemiya-Kudo et al. 2002; Wong et al. 2006).

Cholesterin-ester

ApoB-100

H + ARH

Coatedvesicle

EndosomLysosom

Cholesterinester

EndoplasmatischesRetikulum

Golgi- Komplex

LDLR (120KDa)

LDLR (160KDa)

ACAT

Cholesterin

Vesikel

LDL-Rezeptor HMG-CoA- Reduktase

ARH

Proteolyse

LDL

site B

Coated pit

1. Einleitung 20

Der Promotor des LDL- Rezeptorgens beinhaltet in der Region -200 Bp stromaufwärts

vom ATG Startcodon neben zwei AT- reichen Sequenzen (TATA-Boxen) drei

homologe GC- reiche Wiederholungen aus 16 Basenpaaren ( GC- rich „Repeats 1-3“).

Während die Repeats 1 und 3 Bindungstellen für den ubiquitären Transkriptionsfaktor

Sp1 aufweisen, beinhaltet das Repeat 2 als spezifische Bindungstelle ein „sterol

regulatory element“ (SRE) aus 10 Bp, welches die Konsensus- Sequenz 5´

TCACCCCACT 3´ beinhaltet. An dieses SRE binden als Transkriptionsfaktoren

spezifisch zwei „sterol- regulatory element binding proteins“ (SREBP1 und 2) (Mehta

et al. 1991; Hua et al. 1993; Brown und Goldstein 1999). Die Vorläufer der SREBP-

Proteine bestehen aus einer C- terminalen regulatorischen Domäne (Reg) und einer N-

terminalen Transkriptionsfaktor Domäne (bHLH-zip) und sind in der Membran des

Endoplasmatischen Retikulums in einem Komplex mit einem weiteren Protein, dem

„SREBP cleavage- activating protein“ (SCAP) eingebettet (Brown et al. 2002; Adams

et al. 2003). Die Interaktion zwischen beiden Proteinen erfolgt über die regulatorische

Domäne (Reg) in SREBP und eine WD- Domäne (Tryptophan- Asparaginsäure- Motif)

in SCAP (Nohturfft et al. 1998; Horton et al. 2002). Das SCAP- Protein besitzt als

zusätzliche regulatorische Proteinbindungstelle eine sterol sensing Domäne (SSD), an

die bei hohen intrazellulären Cholesterinkonzentrationen zwei regulatorische Proteine

INSIG 1 und 2 (INSIG = Insulin induced genes 1 bzw. 2 Proteine) (Yabe et al. 2002;

Yang et al. 2002) binden und über diese Interaktion eine Prozessierung der SREBP-

Vorläufer-Proteine im Golgi- Apparat verhindern (Loewen und Levine 2002; Rawson

2003). Sterol sensing Domänen finden sich in einer Vielzahl von Proteinen, die eine

Rolle beim Cholesterinstoffwechsel spielen (z. B. HMG- CoA- Reduktase, NPC1,

NPC1L1). Die genauen Funktionen der sterol sensing Domänen im

Cholesterinmetabolismus und die regulatorischen Mechanismen sind bisher nicht

vollständig aufgeklärt. Kommt es zu einem intrazellulären Cholesterinmangel, so

dissoziieren die INSIG- Proteine von der SSD von SCAP ab und der SREBP/SCAP-

Komplex wandert zum Golgi- Apparat. Dort werden die SREBP- Vorläufer in einem

bisher nicht genau bekannten sterolsensitiven Schritt proteolytisch an einer spezifischen

Stelle (site-1) durch eine spezifische site- 1 Protease (Nohturfft et al. 1998; Rawson

2003) geschnitten, wodurch die C- terminale regulatorische Domäne (Reg) abgespalten

wird. In einem nachfolgenden zweitem proteolytischen Schritt spaltet dann die site- 2-

1. Einleitung 21

Protease (S2P) spezifisch an site- 2 die N- terminale Transkriptionsfaktor- Domäne

(bHLH-zip) ab und generiert so die reifen SREBP- Proteine. Diese wandern

anschließend in den Zellkern und aktivieren dort über Bindung an die SRE´s in den

Promotoren der Gene für den LDL- Rezeptor und weiterer Enzyme der

Cholesterinbiosynthese die Transkription dieser Gene (Sakai und Rawson 2001;

Rawson 2003). Als Folge kommt es zu einer Steigerung der extrazellulären

Cholesterinaufnahme über den LDL- Rezeptor und zu einer vermehrten intrazellulären

Cholesterinbiosynthese. Über diesen dualen Mechanismus wird eine Zunahme der

intrazellulären Cholesterinkonzentration gewährleistet. Erreicht die intrazelluläre

Cholesterinkonzentration einen bestimmten Schwellenwert, so wird durch die erneute

Bindung von INSIG 1 und 2 an SCAP eine weitere Prozessierung der SREBP-

Vorläufer- Proteine blockiert und dadurch die LDL- Rezeptor- und Cholesterinsynthese

gedrosselt. Parallel dazu inhibieren die SREBP- Proteine über einen Feedback-

Mechanismus eine weitere Synthese von SREBP- Vorläufer- Proteinen (Brown und

Goldstein 1997; Goldstein et al. 2002). Das so gewonnene Cholesterin wird durch die

Aktivität der ACAT zu Cholesterinestern umgewandelt und intrazellulär gespeichert.

Überschüssiges nicht verestertes Cholesterin wird anschließend in einem aktiven

Prozess via ABCA1- Transporter aus der Zelle hinaus transportiert und auf HDL

übertragen. Neben der vorrangig durch INSIG 1 induzierten, cholesterinabhängigen

konvergenten Feedback- Inhibition der SREBP- Prozessierung am Endoplasmatischen

Retikulum (ER), wird die transkriptionelle Aktivität und Stabilität der SREBP-

Transkriptionsfaktoren durch eine Kaskade von Phosphorilierungs und

Ubiquitinierungsprozessen gesteuert (Sundqvist und Ericsson 2003; Gong et al. 2006).

Durch das komplexe Zusammenwirken dieser Regulationsmechanismen wird

sichergestellt, dass es nicht zu einer zellulären Überladung mit Cholesterin kommt.

Abbildung 5 zeigt einen Überblick über den Mechanismus der Prozessierung der

SREBP- Vorläufer- Proteine zu aktiven Transkriptionsfaktoren und ihre Funktion bei

der Regulation der intrazellulären Cholesterinbiosynthese.

1. Einleitung 22

Abbildung 5: Mechanismus der INSIG 1 gesteuerten Prozessierung des am Endoplasmatischen

Retikulum lokalisierten SREBP/SCAP- Komplexes zu aktiven SREBP- Transkriptionsfaktoren

und deren Funktion bei der Transaktivierung/Reprimierung zentraler Gene der intrazellulären

Cholesterinbiosynthese unter verschiedenen physiologischen Bedingungen. Neben der

cholesterinabhängigen konvergenten Feedback- Inhibition durch INSIG 1 am ER, wird die

transkriptionelle Aktivität und Stabilität der SREBP- Transkriptionsfaktoren durch

Phosphorilierungs- und Ubiquitinierungsprozesse gesteuert (Eine genaue Erklärung findet sich

im Text unter Punkt 1.4.3).

S1P

S2P

LDL-Rezeptor +HMG-CoA-Reduktase +HMG-CoA-Synthase +SCARB1 +ABCA1+/-PCSK9 +SREBP-1/2

bHLH

Nukleus

ER

Golgi

WDReg SSDbHLHWDReg SSD

SREBP SCAP

bHLH

WDReg SSDbHLH

SRE

bHLH

Regulierte Gene:

INSIG1 1

Hohes intrazelluläres CholesterinNiedriges intrazelluläres Cholesterin

SREBP SCAP

SREBP SCAP

1. Einleitung 23

1.5 Stoffwechsel der Lipoproteine

Grundsätzlich lässt sich der Stoffwechsel der Plasmalipoproteine in drei verschiedene

Systeme unterteilen (Schneider et al. 1996; Schaefer 1998). Man unterscheidet ein

exogenes System, über das der Transport von mit der Nahrung aufgenommenen Lipiden

bewerkstelligt wird (Chylomikronen- Stoffwechselweg) sowie ein zweites, endogenes

System, das der Verstoffwechselung von Lipoproteinen hepatischen Ursprungs dient

(VLDL- LDL- Stoffwechselweg). Das dritte System schließlich umfasst den reversen

Cholesterintransport (HDL- Stoffwechselweg) und dient dem Rücktransport von

Cholesterin aus den peripheren Zellen zurück zur Leber. Über die Leber kann dieses

Cholesterin dann endgültig über Gallensäuren und hepatisches Cholesterin

ausgeschieden werden. Nachfolgend sollen diese drei Systeme im Detail beschrieben

werden.

1.5.1 Der exogene Lipidstoffwechselweg (Chylomikronen- Stoffwechselweg)

Die mit der Nahrung aufgenommenen Triglyceride werden zunächst durch die

Pankreaslipasen in Fettsäuren und Mono- bzw. Diglyceride aufgespalten. Die

Resorption dieser Lipide in Form gemischter Mizellen (bestehend aus: Gallensäuren,

Phospholipiden, Cholesterin, Diglyceriden und Fettsäuren) erfolgt durch die

Enterozyten des Dünndarms über einen passiven Transportmechanismus. Die

Resorption des mit der Nahrung aufgenommenen Cholesterins (Chol) in die

Enterozyten erfolgt ebenfalls in Form von Mizellen. Hierbei wird das mizelläre

Cholesterin jedoch durch einen aktiven Transport über das NPC1L1- Protein in die

Zellen aufgenommen. Dieser Aufnahmeweg von Cholesterin in die Darmzellen wurde

erst kürzlich entdeckt (Altmann et al. 2004; Davis, Jr. et al. 2004). Interessanterweise

besitzt das NPC1L1- Protein wie die HMG- CoA- Reduktase und das SCAP- Protein

eine Sterol Sensing Domäne (SSD), was auf eine Regulation der Aktivität von NPC1L1

durch Sterole schließen lässt (Loewen und Levine 2002). Nach Aufnahme der Lipide in

die Darmzellen erfolgt eine intrazelluläre Resynthese der Triglyzeride und eine

Veresterung des Cholesterins durch die ACAT. Überschüssiges Cholesterin und über

die Nahrung aufgenommene und resorbierte pflanzliche Sterole in den Enterozyten

werden über die ATP- bindenden Kassettentransporter ABCA5 und ABCA8 wieder

zurück in das Darmlumen befördert und dann endgültig ausgeschieden (Lee et al. 2001;

Graf et al. 2003). Das Assembling der Chylomikronen aus: Triglyzeriden (TG),

1. Einleitung 24

Cholesterinstern (CE), Phospholipiden (PL) sowie den Proteinkomponenten ApoA-I,

ApoB- 48 und ApoA-IV erfolgt anschließend unter Mitwirkung von Mikrosomalem

Transferprotein (MTP) in den Enterozyten des Darms. Die reifen Chylomikronen

werden daraufhin an die Lymphe abgegeben und gelangen über den Ductus thoracicus

in den Blutkreislauf. Nach ihrer Sekretion nehmen die Chylomikronen zusätzlich die

Apolipoproteine C II und E aus HDL- Partikeln auf und binden anschließend an die

über Proteoglykane an Endothelzellen gebundene Lipoproteinlipase (LPL), in deren

unmittelbarer Nachbarschaft sich der VLDL- Rezeptor (VLDLR) befindet (Oka et al.

1994). Die Hydrolyse der Triglyzeride aus den Chylomikronen in freie Fettsäuren und

MAG erfolgt nach Bindung an den extrazellulären Komplex aus Lipoproteinlipase und

VLDL- Rezeptor (Beisiegel und Heeren 1997; Tacken et al. 2001). Hierbei interagiert

Apo C II als Kofaktor mit der LPL, während ApoE die spezifische Bindung an den

VLDL- Rezeptor vermittelt. Obwohl der VLDLR als Mitglied der LDL-

Rezeptorfamilie ein NPxY-Motif aufweist und somit ein internalisierender Rezeptor ist,

nimmt man heute an, dass bei der Triglyzeridhydrolyse aus den Chylomikronen keine

Internalisierung stattfindet, sondern vielmehr ein zellulärer Flux von freien Fettsäuren

und MAG´s stattfindet, über den diese dann an das Fettgewebe und die Muskulatur,

wegen der Acidität der Fettsäuren durch membrangebundene Fatty Acid Binding

Proteins (FABP 1+2), translokalisiert werden (Glatz und Storch 2001; Tacken et al.

2001; Goudriaan et al. 2004). Im Verlauf des lipolytischen Prozesses verlieren die

Chylomikronen ca. 80-90 % ihres Triglyzeridanteils und nehmen vermehrt ApoE aus

HDL- Partikeln auf, während die Phospholipide und die Apolipoproteine ApoA-I und

A-IV in den HDL- Pool gelangen. Als Endprodukt dieses Stoffwechselweges finden

sich Chylomikronen- Remnants, die letztendlich über rezeptorvermittelte Endozytose

via ApoE- Bindung an den LDLR und das LDL- related Protein (LRP) in die Leber

aufgenommen werden. Die Abbildung 6 gibt einen Überblick über den Chylomikronen-

Stoffwechselweg.

1. Einleitung 25

Abbildung 6: Grafische Darstellung des exogenen Lipidtransportsystems (Stoffwechselweg der

Chylomikronen). Abkürzungen: CE = Cholesterinester, TG = Triglyzeride, PL = Phospholipide,

FABP = Fatty Acid Binding Protein FS = Freie Fettsäuren, LPL = Lipoproteinlipase, ACAT =

Acyl- Coa- Cholesterin- Acyltransferase, VLDLR= Very Low Density Lipoprotein Rezeptor,

MTP = Mikrosomales Transfer Protein, LRP = LDL Related Protein, NPC1L1 = Nieman Pick

disease like protein 1, ABCA= ATP- bindender Kassettentransporter 5 bzw. 8, Apo =

Apolipoprotein.

NPC1L1Chol

Chol ACAT

TG

PL

PL ApoB-48

Apo-A IV

Apo-C IIApoE

TG

FS FSFS Endothelzelle

Energiestoffw./MuskelzellenFettspeicherung/Fettzellen

FS

PL

ApoB-48

ApoE

LeberLDL-Rezeptor +LRP

Chylomikron

Chylomikron

Chylomikron-Remnant

TGPL

Chol

Chol

Ausscheidung

Gallensäuren (GS)

TG

PLCE

ABCA5ABCA 8

GS

GS

MTP

Lipide aus NahrungEnterozyt

DarmChylomikron

FABP

ApoB-48

Apo-A IV

Apo-C II

TG PLCE

ApoB-48

Apo-A IV

Apo-C II

TG PLCE

CE

CE VLDLR LPL

Gallensäuren+Pankreaslipase

1. Einleitung 26

1.5.2 Der endogene Lipidstoffwechselweg (VLDL- LDL- Stoffwechselweg)

Der endogene Stoffwechselweg dient der Versorgung der peripheren Gewebe mit

Triglyzeriden und Cholesterin und beginnt mit dem Zusammenbau (Assembling)

triglyzeridreicher VLDL in der Leber. Hierbei wird ApoB, welches mit der Membran

des ER assoziert ist, in einem schrittweisen Prozess mit Lipiden (vornehmlich

Triglyzeriden) komplexiert. Dieser Triglyzeridtransfer wird unter Mitwirkung von

Mikrosomalem Transferprotein (MTP) (Davis et al. 1989; Davis und Hui 2001) und

wahrscheinlich auch Apo A5 katalysiert (Pennacchio et al. 2001; van der Vliet et al.

2001; Pennacchio und Rubin 2003). Die so entstandenen VLDL- Präkursormoleküle

werden daraufhin durch Glykosylierung und Einlagerung von Phospholipiden am

Golgi- Apparat in ihre reife Form umgewandelt und als sekretorische Vesikeln

abgegeben (Millar und Packard 1998). Zusätzlich zu je einem Molekül ApoB- 100

enthalten die reifen VLDL auch einen geringen Anteil der Apoliproteine E, C und Apo -

A5. Im weiteren Verlauf nehmen die VLDL zusätzlich die Apolipoproteine C-I, C-II, C-

III sowie ApoE aus dem HDL-Pool auf. Während die Apolipoproteine Apo C-II und

ApoE als Kofaktoren bei der LPL vermittelten Hydrolyse der Triglyzeride aus den

VLDL fungieren (siehe Punkt 1.8.1 dieser Arbeit), verhindern Apo C-I und Apo C-III

eine vorzeitige Entfernung der VLDL aus der Zirkulation. Durch die weitere

schrittweise Triglyzerid- Hydrolyse in den VLDL dissoziieren die Apo C- haltigen

Apoproteine von den VLDL ab und gelangen wieder in den HDL- Pool. Es entstehen

ApoB- 100 und ApoE enthaltende VLDL- Remnants, die reich an Cholesterinestern

sind. Diese VLDL- Remnants können daraufhin über zwei Stoffwechselwege

katabolisiert werden. Zum einen können sie direkt über eine ApoE- Bindung an den

LDLR und das LRP über den LDL- Rezeptorstoffwechselweg in die Leber

aufgenommen werden (Kowal et al. 1989; Willnow et al. 1992) oder zum anderen über

die Zwischenstufe IDL (auch ß- VLDL genannt) in LDL umgewandelt werden

(Schneider et al. 1996; Schaefer 1998). Bei dieser Konversion verlieren die VLDL-

Remnants ihren ApoE- Anteil und nehmen unter Mitwirkung von CETP und PLTP

Cholesterinester aus den HDL auf. Im Gegenzug werden noch in den Partikeln

vorhandene Triglyzeride unter Mitwirkung der hepatischen Triglyzeridlipase (HTGL)

hydrolisiert. Neuerdings gibt es Hinweise darauf, dass Apo A5 bei diesem Vorgang eine

Rolle spielt (Schaap et al. 2004). In der aus diesem Lipidtransfer resultierenden LDL-

1. Einleitung 27

Fraktion ist ApoB- 100 die alleinige Proteinkomponente und fungiert als Ligand des

LDL- Rezeptors. Etwa zwei Drittel der entstandenen LDL werden LDL-

rezeptorvermittelt in die Leber sowie in periphere Gewebe aufgenommen, der Rest wird

unspezifisch über Scavenger- Rezeptoren aufgenommen bzw. via CETP- vermitteltem

Transfer von HDL- Cholesterin auf LDL über den LDLR- Pathway aus der Zirkulation

entfernt. In den Zellen kann das Cholesterin dann als Membranbaustein und zur

Synthese von Steroidhormonen verwendet oder in Form von Cholesterinestern

gespeichert werden (siehe auch Punkte 1.2.6.2 und 1.2.6.3 dieser Arbeit). Innerhalb der

LDL existieren verschiedene Subklassen (LDL 1-6) , die sich hinsichtlich Größe, Dichte

und ihrer Bindungsaffinität an den LDL- Rezeptor unterscheiden. Die kleinen und

dichten LDL- Moleküle, die sog. small dense LDL, haben eine geringere Affinität zum

LDL- Rezeptor und werden schlechter aus der Zirkulation entfernt (Marz et al. 1993;

Superko 2000). Als Folge ihrer verlängerten Plasmaverweildauer können sie leichter

oxidiert werden und vermehrt über die Makrophagen- Scavenger Rezeptoren

aufgenommen werden, was ihnen ein sehr hohes atherogenes Potenzial verleiht (siehe

auch Abschnitt 1.1.4. Die Pathogenese und Manifestation der Atherosklerose) (Linton

und Fazio 2001). Die Abbildung 7 zeigt einen Überblick des endogenen

Stoffwechselweges (VLDL- LDL- Stoffwechselweg).

1. Einleitung 28

Abbildung 7: Grafische Darstellung des endogenen Lipidstoffwechselsystems (VLDL- LDL-

Stoffwechselweg) zur Versorgung der peripheren Zellen mit Cholesterin. Abkürzungen: CE =

Cholesterinester, TG = Triglyzeride, PL = Phospholipide, FS = Freie Fettsäuren, FABP = Fatty

Acid Binding Protein, VLDL = Very Low Density Lipoprotein, IDL = Intermediate Density

Lipoprotein, LDL = Low Density Lipoprotein, LPL = Lipoproteinlipase, VLDLR = Very Low

Density Lipoprotein Rezeptor, LRP = LDL Related Protein, MTP = Mikrosomales Transfer

Protein, Apo = Apolipoprotein.

Leber

LDL-Rezeptor +LRP

PL

ApoB-100

ApoE

MTPApoB-100ApoA5

ApoE

TGCE

PL

VLDL-Assembling

PLApo-C II

ApoB-100

ApoE

TG TGCEPL

VLDL

TG

Sekretion

TG PL

CE

ApoB-100

Apo-C II

LPLVLDLRApoE

FS FSFS Endothelzelle

EnergiestoffwechselFettspeicherung

MuskelzellenFettzellen

FS

VLDL

CECE

TG

PLApo-C II

ApoB-100

ApoE

TGCEPL

CE

IDL

PLApoB-100TG

PLCE

CE

CE

Zellversorgung

ApoB-100

TG PLCECE

CE

LDL-Clearance

LDL

IDL-Clearance

LDL-Rezeptor

ApoA5

ApoA5

FABP

CECECE

CE

LDL-Rezeptor

ApoB-100

PLTG

Periphere Zelle

PLCE

CECE

TG

PLCE

CECE

TG

TG

1. Einleitung 29

1.5.3 Der reverse Cholesterintransport (HDL- Stoffwechselweg)

Der Rücktransport von überschüssigem Cholesterin aus den peripheren Geweben

zurück zur Leber, wo der weitere Abbau entweder direkt oder nach Umwandlung zu

Gallensäuren erfolgt, wird als „reverse cholesterol transport“ bezeichnet und durch die

Lipoproteine hoher Dichte (HDL) bewerkstelligt (von Eckardstein et al. 2001; Rigotti et

al. 2003; Fredenrich und Bayer 2003). Bei den HDL handelt es sich um eine heterogene

Klasse von Lipoproteinen im Dichtebereich von 1,063-1,21 g/ml, von denen die meisten

als Hauptproteinkomponente das Apolipoprotein A-I besitzen. Die einzelnen HDL-

Subfraktionen unterscheiden sich hinsichtlich ihrer Komposition an Lipiden,

Apolipoproteinen, Enzymen und Lipidtransferproteinen voneinander und können

generell in zwei Klassen unterteilt werden. Man unterscheidet zwischen lipidarmen

naszenten ApoAI- haltigen HDL (ß- - HDL), die aus den

ß- HDL entstehen. Bei den ß- HDL handelt es sich um diskoidale Partikel, die über drei

unterschiedliche Wege gebildet werden können. Zum einen können sie als Vorläufer der

HDL im Darm und in der Leber gebildet werden und zum anderen beim Prozess der

Lipolyse triglyzeridreicher Lipoproteine (Chylomikronen und VLDL) entstehen (siehe

auch Punkte 1.3.1 und 1.3.2). Ein dritter Weg schließlich besteht in der Interkonversion

von HDL2 zu HDL3 - HDL unter Mitwirkung von PLTP und

CETP. Der Efflux von unverestertem Cholesterin aus der Zellmembran peripherer

Zellen kann über passive Diffusionsmechanismen wie z.B. durch Bindung an Albumin,

Phospholipid- Vesikeln oder Cyclodextrine erfolgen (von Eckardstein et al. 2001),

jedoch ist diese Abgabe ein sehr langsamer ineffizienter Prozess und umfasst nicht das

veresterte Cholesterin im Zytosol der Zellen. Erst über die Bindung lipidarmer ß- HDL-

Partikel wird ein effektiver Efflux von zytosolischem Cholesterin und auch

Phospholipiden aus den Zellen vermittelt. Die treibende Kraft in diesem Prozess ist der

in der Zellmembran lokalisierte ATP- bindende Kassettentransporter 1 (ABCA1) (Rust

et al. 1999; Schmitz et al. 2001). Mittels dieses Transporters können die im Zytosol

lokalisierten Cholesterinester freigesetzt werden und auf ß- HDL- Partikel übertragen

werden (von Eckardstein et al. 2001). ABCA1 wird in vielen Zellen (z.B. Hepatozyten

und Enterozyten) expremiert und spielt wahrscheinlich eine entscheidende Rolle in der

hepatischen und intestinalen Entstehung von HDL. Die Expression von ABCA1 wird

durch die Transkriptionsfaktoren Leber- X- Rezeptor und Retionoid- X- Rezeptor

1. Einleitung 30

(LXR/RXR) reguliert, deren Liganden Oxysteroide bzw. Retinoide sind. Neben

LXR/RXR kontrolliert auch SREBP-2 sowohl positv als auch negativ die Expression

von ABCA1 in einem ligandenabhängigen Prozess. Bei niedrigen intrazellulären

Spiegeln an LXR/RXR- Liganden reprimiert SREBP-2 durch Bindung an das E-Box-

Element im ABCA- Promotor die Transkription von ABCA1. Sind die intrazellulären

Spiegel an LXR/RXR-Liganden hoch, so wird durch Dissoziation/Degradation von

SREBP-2 vom E-Box- Element die reprimierende Wirkung aufgehoben und die

Expression von ABCA1 aktiviert (Zeng et al. 2004; Wong et al. 2006). Die genauen

zellulären Mechanismen der SREBP-2- vermittelten Regulation von ABCA1 sind bisher

noch nicht vollständig aufgeklärt. Bei der Tangier- Krankheit kommt es durch Defekte

von ABCA1 zu einem verminderten Lipidefflux auf ApoA-I, was zur Abwesenheit

lipidreicher HDL im Plasma führt (Rust et al. 1999; Schmitz et al. 2001). Neben

ABCA1 und SCARB1 (siehe Punkt 1.3.2) als zentrale Modulatoren des reversen

Cholesterin Transports, wird vermutet, dass es einen weiteren bisher nicht

identifizierten zellulären Rezeptor für die Bindung von Apo AI gibt, der bei der

Freisetzung von Cholesterinestern aus den zellulären Kompartimenten und beim

Cholesterinefflux mitwirkt. Nach dem ABCA1- vermittelten Transfer von freiem

Cholesterin auf die ß- HDL wird dieses durch das Enzym LCAT verestert und in den

hydrophoben Kern der HDL- Partikel eingebaut, woraus aus diesem - HDL

in Form von HDL2- Partikeln entstehen. Der weitere Transport der HDL2-

Cholesterinester kann anschließend über zwei Wege erfolgen. Zum einen können die

HDL2- Partikel unter Mitwirkung von Cholesterinester- Transferprotein (CETP) und

Phospholipid- Transferprotein (PLTP) die Cholesterinester im Austausch gegen

Triglyzeride an ApoB- haltige Lipoproteine abgeben (VLDL, IDL), diese werden dann

entweder über den LDL- Rezeptor aus der Zirkulation entfernt oder zu LDL konvertiert,

über das die Zellen dann wiederum Cholesterin aufnehmen können. Die Triglyzeride

der HDL2- Partikel werden anschließend durch die HTGL hydrolisiert, während die

Phospholipide der HDL mit großer Wahrscheinlichkeit durch eine weitere Lipase, der

endothelialen Lipase (EL) hydrolisiert werden. Aus diesem Prozess entstehen dann

wieder kleine, dichte HDL3- Partikel (Interkonversion von HDL2 in HDL3), die dann für

eine erneute Cholesterinaufnahme aus peripheren Zellen zur Verfügung stehen. Der

zweite Weg, den die HDL2- Partikel gehen können, besteht in der direkten Aufnahme

1. Einleitung 31

über den Scavenger Rezeptor B- I (SCARB1) in die Leber, wo letztlich dann die

Ausscheidung des Cholesterins über die Galle erfolgt. In der nachfolgenden Abbildung

8 ist der HDL- vermittelte reverse Cholesterintransport schematisch dargestellt.

Abbildung 8: Reverser Cholesterintransport und Stoffwechselweg der HDL. Eine detaillierte

Beschreibung des Stoffwechsels der HDL findet sich im Text (siehe Punkt 1.3.3). Abkürzungen:

CE = Cholesterinester, TG = Triglyzeride, PL = Phospholipide, LPL = Lipoproteinlipase,

HTGL = Hepatische Triglyzerid Lipase, CETP = Cholesterinestertransferprotein, PLTP =

Phospholipid Transfer Protein, LCAT = Lezithin- Cholesterin- Acetyltransferase, SCARB1 =

Scavenger Rezeptor B- I, ABCA 1 = ATP- bindender Kassettentransporter 1, Apo =

Apolipoprotein.

ApoE

ApoC

ApoB100LPL

ApoE

ApoC

ApoB100

IDL LDL

LeberSCARB1

CECECE

CE

Periphere Zelle

HDL-Rezeptor

ABCA1

Preß-HDL

A-I

CE

CE

CETPPLTP

ApoC+ECETGPL

LCATT

A-I

A-ICE

CE

ApoE

VLDL

LDL-Rezeptor

LDL-Rezeptor

HDL 3

HDL 2

CE

ApoB100CE

CE 1.1.1.1.1.1.1.1.1 CE

CE

TG

TG

TG

HTGL

1. Einleitung 32

1.6 Störungen des Lipidstoffwechsels

1.6.1 Einteilung der Lipidstoffwechselstörungen

Wie bereits in Abschnitt 1.1 dieser Arbeit erwähnt, sind Fettstoffwechselstörungen eine

wesentliche Ursache für die Entstehung von atherosklerotischen kardiovaskulären

Erkrankungen und ihrer Komplikationen. Es handelt sich um eine sehr heterogene

Gruppe von Stoffwechselstörungen, die sich generell in primäre und sekundäre

Hyperlipidämien einteilen lassen. Bei sekündären Hyperlipidämien sind

Grunderkrankungen des endokrinologischen, nephrologischen oder hepatischen

Systems wie z.B. Hypothyreose, Niereninsuffiziens und Hepatitis die Ursache für

Dyslipidämien. In den häufigsten Fällen findet man bei Patienten mit

Fettstoffwechselstörungen jedoch eine primäre Hyperlipidämie, welche nach der

klassischen Einteilung nach Fredrickson in fünf phänotypische Formen unterteilt wird.

Die von Fredrickson vorgeschlagene Einteilung basiert auf der Erhöhung von

Chylomikronen, VLDL und LDL oder der Kombinationen dieser Laborparameter und

beschreibt die verschiedenen Formen der Hyperlipoproteinämie. Sie berücksichtigt aber

nicht die heutigen molekulargenetischen Erkenntnisse und deren Einfluss auf die

metabolischen Vorgänge, weswegen man die primären Hyperlipidämien heutzutage

eher genetisch/metabolisch klassifiziert. Dabei werden die Hyperlipidämien nach ihrer

Prävalenz und hinsichtlich ihres Risikopotenzials für koronare Ereignisse eingeteilt. In

den Tabellen 6-8 sind die Klassifizierung der primären Hyperlipidämien nach

Fredrickson (Fredrickson 1993) sowie die genetisch/metabolische Einteilung der

primären Hyperlipidämien und deren Ursachen aufgelistet.

1. Einleitung 33

Tabelle 6: Klassifizierung der primären Hyperlipidämien nach Fredrickson

(Fredrickson 1993).

Phänotyp Chylom. VLDL IDL LDL Chol TG Plasma

I ++ ↓ ↑ ↑↑ Aufrahmend;

Unterstand klar

IIa normal ↑↑ ↑↑ normal Klar

IIb ↑↑ normal

oder ↑

↑↑ ↑↑ ↑↑ Trüb

III + ↑ ↑↑ ↓ ↑↑ ↑↑ trüb

IV ↑↑ normal

oder ↓

↑ ↑↑ trüb

V ++ ↑↑ ↓ ↑(↑) ↑↑ Aufrahmend;

Unterstand trüb

Tabelle 7: Genetisch/metabolische Einteilung der primären Hyperlipidämien.

Primäre Hyperlipidämie Phänotyp Koronares Risiko Pankreatitis Risiko

Gewöhnliche

Hypercholesterinämie

IIa ++++ - -

Familiäre kombinierte

Hyperlipidämie

IIa, IIb, IV ++ -

Familiäre Hypercholesterinämie IIa, IIb ++++ --

Remnant Hyperlipidämie III +++ ?

Familiäre Hypertriglyzeridämie IV, V ? ++

Chylomikronämie I, V - +++

1. Einleitung 34

Tabelle 8: Genetische und metabolische Ursachen der primären Hyperlipidämien.

Primäre Hyperlipidämie Ursache Metabolische Erscheinungsform

Gewöhnliche


multiple genetische und

Umwelteinflüsse.

LDL-Überproduktion und

verminderter LDL- Katabolismus.

Familiäre kombinierte


unbekannt Überproduktion von ApoB- 100,

VLDL und/oder LDL.

Familiäre


Mutationen, die zu einer

beeinträchtigten Rezeptor-

Funktion führen.

Gestörter LDL- Abbau und LDL-

Überproduktion.

Remnant Hyperlipidämie Nicht funktionelle Apo E- und

ApoA-V Isoformen

(E2/S19W). Genetische

erworbene Störung des

VLDL/LDL Metabolismus.

Gestörte Konversion von VLDL zu

LDL, Überproduktion von IDL.

Familiäre

Hypertriglyzeridämie

unbekannt VLDL- Überproduktion und/oder

verminderter VLDL-Katabolismus.

Chylomikronämie- Syndrom Lipoprotein Lipase- oder Apo

C-II-Deffizienz.

Beeinträchtigter Chylomikronen-

Abbau.

1.6.2 Diagnostik von Lipidstoffwechselstörungen und Risikobeurteilung

Die laborchemische Diagnostik von Lipidstoffwechselstörungen wird normalerweise in

drei Stufen durchgeführt (Schaefer et al. 2000). Als Basisuntersuchung werden hierbei

das Gesamtcholesterin, das HDL- Cholesterin und die Triglyzeride bestimmt. Des

weiteren sollte das Lipoprotein(a) (Lp(a)) bestimmt werden, welches sich aus LDL mit

einem apo(a) Anteil zusammensetzt. Apo(a) besitzt eine große strukturelle Homologie

zu Plasminogen. Lp(a) lässt sich zwar therapeutisch kaum beeinflussen, ist aber für die

Risikobeurteilung und die Notwendigkeit einer medikamentösen Lipidtherapie von

Bedeutung. Durch die Friedewald- Formel lässt sich dann das LDL- Cholesterin

berechnen (wenn die Triglyzeride einen Wert von 350 mg/dl nicht überschreiten): LDL-

Cholesterin = Gesamt- Chol. – HDL- Chol. – Triglyzeride / 5 (Friedewald et al. 1972).

Finden sich bei diesen Untersuchungen Auffälligkeiten, so erfolgt bei Bedarf in einem

zweiten Schritt dann die erweiterte Speziallipid- Diagnostik, welche die Bestimmungen

der Apolipoproteine, Enzyme und Rezeptoren des Lipidstoffwechsels umfasst

(Schneider et al. 1996; Schaefer 1998; Soufi et al. 1999). Bei schweren

1. Einleitung 35

Lipidstoffwechselstörungen wird als dritte Stufe der Untersuchungen dann eine

ausführliche Familienuntersuchung durchgeführt, um gefährdete Personen frühzeitig zu

identifizieren und optimal therapieren zu können. Ein eindeutiger Risikoschwellenwert

für Cholesterin (Chol.) oder für Triglyzeride lässt sich aufgrund der großen Streubreite

der Normalwerte in der Normalpopulation nicht eindeutig festlegen, so dass die

alleinige Betrachtung des Gesamtcholesterinwertes für die Risikoeinschätzung nicht

ausreichend ist. Vielmehr müssen wegen der unterschiedlichen Atherogenität der

einzelnen Lipoproteinklassen diese alle mit in die Beurteilung des kardiovaskulären

Risikos mit einbezogen werden. Hypercholesterinämien, die aus erhöhten HDL-

Cholesterinspiegeln resultieren (Hyperalphalipoproteinämien), stellen z.B. kein

erhöhtes Risiko für koronare Herzkrankheit dar, da HDL als Schutzfaktor vasoprotektiv

wirkt. Generell sollte das LDL- Cholesterin nach NCETP- Empfehlungen (National

Cholesterol Education Program“ der USA, „Adult Treatment Panel III“ (ATP III)) bei

Personen ohne weitere zusätzliche Riskofaktoren einen Wert von 160 mg/dl und

150mg/dl für Triglyzeride nicht überschreiten (Brewer, Jr. 2002). Bei Patienten mit

einem zusätzlichen Risikofaktor wie: z.B. hohes Lp(a), Rauchen, Hypertonus, HDL-

Cholesterinwerte < 40 mg/dl, Diabetes oder familiäre Prädisposition für KHK sollten

die LDL- Cholesterinwerte bei < 130 mg/dl liegen. Bei Personen, die bereits ein

kardiovaskuläres Ereignis hatten und auch schon bei Diabetikern ohne KHK, liegt der

Zielwert für das LDL- Cholesterin neuerdings bei 100 mg/dl. Bei Patienten mit KHK

und Diabetes Mellitus gilt der Zielwert LDL- Cholesterin < 70 mg/dl. Diese Werte

entstammen internationalen Empfehlungen aus dem „National Cholesterol Education

Program“ der USA, „Adult Treatment Panel III“ (ATP III) (Brewer, Jr. 2002) und der

International Task Force For Prevention Of Coronary Heart Disease (Grundy et al.

1997). Hier konnte durch langjährige Beobachtungen gezeigt werden, dass das 10-

Jahres Risiko für eine nochmalige oder erste Manifestation der KHK in der höchsten

Risikogruppe bei > 20% lag. Für die mittlere Risikogruppe (ein zusätzlicher

Risikofaktor) betrug das Risiko 10-20% und für die untere Gruppe (kein Risikofaktor)

lag das 10- Jahres- Risiko bei < 10%.

1. Einleitung 36

1.7 Monogenetische autosomal dominant vererbte Lipidstoffwechselstörungen

1.7.1 Die Familiäre Hypercholesterinämie (FH)

Bei der familiären Hypercholesterinämie (FH) ist das LDL- Cholesterin um das 2-

6fache des Normalwertes erhöht. Als Folge dieser Erhöhung kommt es zur Ablagerung

dieses Cholesterins in Sehnen, Haut und um die Augen (Sehnenxanthome, Xanthome,

Arcus lipoides und Xanthelasmen). Neben diesen eher ästhetischen Störungen, kommt

es aber auch zu Lipidablagerungen in den Arterien, insbesondere in den

Koronararterien, was zur Ausbildung einer frühzeitigen Atherosklerose führt. FH wird

autosomal dominant vererbt und ist mit einer Heterozygotenfrequenz von ca. 1:250-

1:500 und einer Homozygotenfrequenz von ca. 1:1000000 eine der häufigsten

monogenetisch vererbten Stoffwechselerkrankungen (Goldstein und Brown 1989;

Austin et al. 2004). Bei heterozygot betroffenen Patienten findet man im 3.-4.

Lebensjahrzehnt Xanthelasmen und Sehnenxanthome u. U. eines Arcus lipoides cornea

(Einlagerung von Cholesterin in die Hornhaut des Auges), sowie eine koronare

Herzkrankheit. Frauen sind durch den protektiven Effekt des Östrogens später betroffen.

Bei heterozygoter FH liegen die Cholesterinwerte zwischen 300-600 mg/dl. Das HDL-

Cholesterin ist häufig erniedrigt und die Triglyzeride normal. Bei homozygoten

Patienten manifestieren sich schwere Xanthome, Aortenklappenstenosen und eine rasch

voranschreitende Atherosklerose aller Gefäße, insbesondere der Koronarien und

Caratoiden aufgrund des „gene dosage effect“ schon vor dem 10. Lebensjahr. Die

Cholesterinspiegel von Betroffenen liegen bei 600 bis maximal 1200 mg/dl. Die

Lebenserwartung unbehandelter homozygoter Patienten liegt unter 20 Jahren, wobei

Todesfälle bereits im 7. Lebensjahr beschrieben wurden. Die Abbildung 9 zeigt die

charakteristischen phänotypischen Merkmale der FH bei Patienten mit homozygoter

familiärer Hypercholesterinämie (FH).

1. Einleitung 37

Abbildung 9: Phänotypische Merkmale der homozygoten Familiären Hypercholesterinämie

(FH). Die Bilder zeigen Sehnenxanthome an den Strecksehnen von Ellenbogen/Knien, einen

Arcus lipoides cornea (Einlagerung von Cholesterin in die Hornhaut des Auges), sowie

Xanthelasmen mit gelblich tuberösen und eruptiven Ablagerungen von Cholesterin in der Haut.

1.7.2 Der LDL- Rezeptor Pathway und die Pathogenese der FH

Unsere heutigen Erkenntnisse über die biochemischen und molekulargenetischen

Ursachen von FH entstammen der detaillierten Erforschung des LDLR- pathways durch

die beiden amerikanischen Biochemiker Michael S. Brown und Joseph L. Goldstein, sie

entdeckten 1974 den LDL- Rezeptor auf der Zelloberfläche von humanen Fibroblasten

und konnten nachweisen, dass Defekte dieses Rezeptors die Ursache für FH darstellen.

(Brown und Goldstein 1974; Brown und Goldstein 1986). Für ihre herausragenden

Arbeiten erhielten sie 1985 den Nobelpreis für Medizin (Brown und Goldstein 1985;

Brown und Goldstein 1996). Wie bereits unter Punkt 1.2.5.3 dieser Arbeit erwähnt, wird

die Transkription des LDLR- Gens durch einen Feedback- Mechanismus gesteuert, der

den Cholesteringehalt der Zelle konstant hält. Ist in der Umgebung LDL verfügbar, so

nehmen Zellen Cholesterin über den LDLR auf und unterdrücken die endogene

zelluläre Cholesterinbiosynthese. Das über den LDLR aufgenommene Cholesterin

1. Einleitung 38

hemmt dann die Transkription des LDLR und der HMG- CoA- Reduktase, wodurch die

Zelle vor einer Überladung mit Cholesterin geschützt wird. Goldstein und Brown

konnten zeigen, dass es bei FH durch Defekte im LDL- Rezeptor zu einer

Unterbrechung oder Behinderung des „LDL receptor pathways“ an verschiedenen

Stellen kommt (Goldstein und Brown 1979; Hobbs et al. 1990; Hobbs et al. 1992).

Aufgrund der abnormen Eigenschaften der mutierten Rezeptoren unterteilten sie die

Defekte in fünf Klassen:

Klasse 1 Mutationen (Null Allele): In den Zellen lässt sich kein LDLR- Protein

nachweisen. Diese Mutationen umfassen größere Gendeletionen und Punktmutationen

des LDLR- Promotors, so dass keine Transkription mehr stattfinden kann (Hobbs et al.

1988). In anderen Fällen entstehen mRNA´s mit abnormer Länge, welche entweder

selbst rapide abgebaut werden, oder deren Genprodukte aufgrund vorzeitiger Stopp-

Codons sofort intrazellulär degradiert werden.

Klasse 2 Mutationen (Transportdefekte Allele): Bei diesen Mutationen ist die LDL-

Rezeptor- Synthese normal, aber die Rezeptoren erreichen die Zellmembran nicht, da

ihr Transport vom Endoplasmatischen Retikulum zum Golgi- Apparat komplett

blockiert oder verlangsamt ist. Man unterscheidet Klasse 2A und 2B Transportdefekte.

Klasse 2A Allele produzieren Rezeptoren, die das ER aufgrund inkorrekter Faltung der

120 KDa LDL- Rezeptor- Präkursormoleküle nicht verlassen können, sodass keine

reifen 160 KDa Formen der Rezeptoren entstehen (Tolleshaug et al. 1982; Goldstein

und Brown 1985). Diese LDL- Rezeptoren werden rapide im ER abgebaut. Bei Klasse

2B Defekten gelangt ein Teil der Rezeptoren aus dem ER (sog. „leaky receptors“), der

Transport zum Golgi- Apparat ist jedoch verzögert, was zu einer Rezeptordefizienz an

der Zelloberfläche führt.

Klasse 3 Mutationen (Bindungsdefekte Allele): Die LDL- Rezeptoren erreichen zwar

die Zellmembran, sind aber nicht in der Lage, LDL zu binden. Viele dieser Mutationen

umfassen die Repeats 4 und 5 des LDL- Rezeptors, die eine zentrale Rolle bei der

Bindung der Liganden ApoB- 100 und Apo E spielen (Hobbs et al. 1986).

Klasse 4 Mutationen (Internalisierungsdefekte Allele): Die LDL- Rezeptoren

erreichen die Zelloberfläche, binden LDL, aber können sich nicht in clathrin coated pits

anreichern, sodass keine Endozytose stattfinden kann. Diese Mutationen betreffen die

cytoplasmatische und transmembrane Domäne des LDL- Rezeptors (Goldstein und

1. Einleitung 39

Brown 1989). In einigen seltenen Fällen ist die Konsensus- Aminosäuresequenz des

NPxY- Motif (wobei x = jede beliebige Aminosäure) betroffen (Davis et al. 1986).

Dieses Motif interagiert spezifisch mit dem ARH1- Protein und ermöglicht hierdurch

die Verankerung und Internalisierung des Rezeptor- Liganden- Komplexes in den

coated pits (Soutar et al. 2003) (siehe auch Punkt 1.8.2 dieser Arbeit).

Klasse 5 Mutationen (Recyclingdefekte Allele): Die Rezeptoren binden die LDL und

internalisieren diese auch. Es findet jedoch keine Dissoziation des Rezeptor- Liganden-

Komplexes im sauren Milieu des Endosoms statt, was zur intrazelullären Degradation

der Rezeptoren führt, sodass diese nicht mehr an die Zelloberfläche zurück gelangen

können, um erneut LDL zu binden (Miyake et al. 1989). In Abbildung 10 sind die

unterschiedlichen LDLR- Defekte nach der Klassifikation von Brown, Goldstein und

Hobbs in Form einer Übersichtsgrafik dargestellt.

Abbildung 10: Klassifikation der unterschiedlichen LDL- Rezeptordefekte, die zur familiären

Hypercholesterinämie (FH) führen (Hobbs et al. 1990).

Eine eindeutige Zuordnung der FH zu einer bestimmten Klasse von LDL- Rezeptor-

Defekten ist in den meisten Fällen nicht möglich, da viele Mutationen des LDL-

Rezeptor- Genlokus Rezeptoren produzieren, die mehrere funktionelle Defekte

aufweisen. Ein Beispiel hierfür sind z.B. Klasse 2B Defekte, bei denen der Rezeptor

zwar die Zelloberfläche erreicht, aber trotzdem den Liganden nicht mehr binden kann

Class INo Synthesis

ER GolgiKlasse II-Defekt:Kein Transport

Klasse III-Defekt:Keine Bindung

Coated Pit

Klasse IV-Defekt:Keine Internalisierung

Klasse V-Defekt:Kein Recycling

Klasse I-Defekt:Keine Synthese

mRNA

LDL

LDL

LDL

LDL

LDL

LDL

LDL

LDL

1. Einleitung 40

(Goldstein und Brown 1989; Hobbs et al. 1990). Bisher sind weltweit über 700

Mutationen des LDL- Rezeptorgens bekannt, die FH verursachen. Die meisten FH

Allele tragen Punktmutationen, kleine Insertionen oder Deletionen, während große

Rearrangements im LDL- Rezeptorgen eher seltener sind. Der Nachweis von LDLR-

Mutationen und Polymorphismen auf DNA- Ebene erfolgt mit molekularbiologischen

Verfahren wie „single strand conformational polymorphismus“ (SSCP) und

denaturierender Gradientengel Elektrophorese (DGGE) (Leren et al. 1993; Nissen et al.

1996; Soufi et al. 2002), durch die Mutationen schnell und effizient nachgewiesen

werden können. Eine exzellente Übersicht über die meisten FH- Allele findet sich in

zwei LDL- Rezeptor- Mutationsdatenbanken, die unter http://www.ucl.ac.uk/fh/, und

http://www.umd.necker.fr abrufbar sind und ständig aktualisiert werden. Neben einer

detaillierten Beschreibung der FH- verursachenden Mutationen und ihrer funktionellen

Relevanz, sind dort auch Ergebnisse aus populationsgenetischen Studien aufgeführt.

1.7.3 Auswirkungen von LDLR- Mutationen auf den Lipidstoffwechsel bei FH

Die Zellen von FH- Heterozygoten exprimieren bei gleicher extrazellulärer LDL-

Cholesterin- Konzentration nur halb soviel funktionelle LDL- Rezeptoren wie normale

Zellen. Das normale LDLR- Allel wird bei FH nicht dazu stimuliert, den Defekt des

mutierten Allels durch eine vermehrte Bildung von noch intaktem LDL- Rezeptor zu

kompensieren. Statt dessen wird das intrazelluläre Cholesterin- Defizit durch eine

gesteigerte Synthese von Cholesterin ausgeglichen. Die Folge für den Organismus ist

eine erhöhte Plasma LDL- Konzentration, die bereits dann auftritt, wenn nur ein

mutiertes Allel vorliegt (dominanter Phänotyp) (Goldstein und Brown 1989). Im

normalen Zustand sezerniert die Leber über den endogenen Kreislauf VLDL, welche

Triglyzeride zu Fettgewebe und Muskulatur transportieren. Durch Hydrolyse der

Triglyzeride entstehen aus den VLDL intermediate- density Lipoproteine (IDL), von

denen ein Teil ApoE- vermittelt über LDL- Rezeptoren abgebaut wird. Aus den

verbleibenden IDL entstehen die LDL, von denen etwa 60-80% über LDL- Rezeptoren

in der Leber aus der Zirkulation entfernt werden (Verweildauer ca. 2,5 Tage). Bei

heterozygoter FH akkumulieren LDL einerseits durch verminderte LDL-Endozytose,

und zusätzlich entsteht mehr LDL aus der Vorstufe IDL, da die IDL selbst nur verzögert

abgebaut werden, wodurch es zu einem massiven LDL- Cholesterinanstieg kommt. Die

Ausprägung von FH- Mutationen kann in Bezug auf Klinik, Laborwerte und

http://www.ucl.ac.uk/fh/

http://www.umd.necker.fr

1. Einleitung 41

Ansprechen auf eine lipidsenkende Therapie stark variieren (Genotyp/Phänotyp-

Korrelation) (Soutar 1992; Soutar 1998; Austin et al. 2004). Ein Grund für diese

Varianz liegt in der Restaktivität der mutierten LDL- Rezeptoren. Ein Beispiel hierfür

sind spezielle Klasse 3 Bindungsdefekte, bei denen die ApoE- vermittelte clearance von

IDL stark eingeschränkt sein kann, was zu einer vermehrten LDL- Produktion aus den

nicht aufgenommenen IDL führt und zu einem massiverem LDL- Anstieg führt als z.B.

bei einem Klasse 3 Defekt, bei dem noch eine Restbindung von ApoE/B möglich ist.

Homozygote FH- Patienten sind aufgrund des „gene dosage effect“ wesentlich schwerer

betroffen, jedoch korreliert auch hier die Schwere der Hyperlipoproteinämie mit der

Restaktivität des LDL- Rezeptors. In den meisten Fällen tragen Homozygote FH-

Patienten meist zwei verschiedene FH Allele und sind somit „compound Heterozygote“

(Häufigkeit ca. 1:1000000), wohingegen eine Homozygotie für dasselbe FH- Allel

(„true homozygous“) extrem selten ist (etwa 1: 100000000). In homozygoten FH-

Patienten ohne Restaktivität der mutierten LDL-Rezeptoren steigt die

Plasmaverweildauer der LDL, verglichen mit der Norm, von 2,5 auf 6 Tage (Shepherd

und Packard 1989). Bei diesen Patienten wird praktisch das gesamte LDL über den

LDL- Rezeptor unabhängigen Weg durch die Makrophagen Scavenger Rezeptoren (SR-

AI/II) aufgenommen, was zur frühzeitigen Manifestation einer schwersten

Atherosklerose führt, die unbehandelt vor dem 20. Lebensjahr letal verläuft.

1.7.4 Das Familiär defekte Apolipoprotein B- 100 (FDB)

Eine weitere monogenetisch vererbte Lipidstoffwechselstörung, die einem autosomal

dominanten Vererbungsmodus folgt, ist das „Familiär defekte ApoB“ (FDB). Anders

als bei FH ist hier jedoch nicht der Rezeptor betroffen, sondern der Ligand, das Apo B-

100 defekt (Vrablik et al. 2001; Whitfield et al. 2004). Als Folge dieses Defektes

kommt es zu einer reduzierten Bindung von ApoB- 100 an den LDL- Rezeptor und zu

einem Anstieg der Plasma LDL- Konzentration bei FDB- Patienten, der jedoch

moderater ist als FH- Patienten. Die Erstbeschreibung des „Familiär defekten

Apolipoprotein B-100“ (FDB) erfolgte 1986 durch Vega et al. Er fand in einer Gruppe

von hypercholesterinämischen Patienten mit Ausschluss- FH 5 Patienten, bei welchen

die fraktionelle Katabolismusrate (FCR) von körpereigenem LDL im Vergleich zu

injiziertem LDL gesunder Patienten signifikant erniedrigt war (Vega und Grundy 1986).

Innerarity et al. konnten 1987 durch Bindungsstudien an kultivierten Fibroblasten

1. Einleitung 42

zeigen, dass die Bindung von LDL eines dieser Patienten um ca 70% reduziert war und

propagierten den Namen „Familiär defektes ApoB- 100“ für dieses Krankheitsbild

(Innerarity et al. 1987). Die Aufklärung des Defektes auf Genebene erfolgte 1989 durch

Soria et al. (Soria et al. 1989). Sie identifizierten eine G-A Punktmutation in Position

10708 in Exon 26 des Apo B- Gens. Als Folge dieser Mutation kommt es zu einem

CGG nach CAG Basenaustausch in Codon 3500 der ApoB mRNA, der zu einer

Substitution von Glutamin nach Arginin führt, wodurch die Bindungsseite des Apo B-

100 indirekt verändert wird. Genetische Studien zur Prävalenz von FDB in

verschiedenen kaukasischen Populationen ermittelten eine Heterozygotenfrequenz von

1:200-1:250, wobei die höchsten Frequenzen für die Schweiz und Polen sowie für das

Rhein/Main Gebiet in Deutschland beschrieben wurden (1:200-1:250) (Fisher et al.

2000; Horvath und Ganev 2001). Das Auftreten von FDB in homozygoter Form liegt

ähnlich wie bei FH bei ca. 1:1000000 (Goldstein und Brown 2001; Vrablik et al. 2001;

Austin et al. 2004). Da nahezu alle bisher beschriebenen FDB- Mutationsträger

europäischen Ursprungs sind, nimmt man an, dass die meisten R3500Q-

Mutationsträger von einem gemeinsamen Vorfahren abstammen, der vor ca. 7000

Jahren in Europa lebte.

Klinisch findet man bei FDB- Patienten eine moderate bis stark ausgeprägte

Hypercholesterinämie, Xanthome der Haut, einen Arcus corneae und das Auftreten von

frühzeitiger Atherosklerose. Verglichen mit FH sind die Werte für Gesamt- und LDL-

Cholesterin heterozygoter FDB- Patienten geringer und die Streubreite der Messwerte

ist wesentlich größer (Miserez und Keller 1995). Bisher sind vier homozygote FDB-

Patienten beschrieben worden. Bei diesen Patienten waren die Gesamt- und LDL-

Cholesterinwerte verglichen mit der 6- bis 10- fachen Erhöhung bei FH- Homozygoten

nur geringfügig erhöht und lagen im Bereich von heterozygoten FH- Patienten

(Gallagher und Myant 1995). Eine Erklärung hierfür liegt in der noch völlig intakten

LDLR-Aktivität und in der verbliebenen restlichen Bindungsaffinität des mutierten

LDL von 13,4-14,7% der normalen LDL- Affinität, was auch den milderen Phänotyp

gegenüber FH erklärt. Schaefer et al. konnten in einer in vivo Kinetik Studie bei einem

homozygoten FDB- Patienten zeigen, dass die Funktion des defekten ApoB durch Apo

E nahezu vollkommen kompensiert werden kann und die atherogenen

Lipoproteinpartikel durch diesen „rescue mechanism“ über den LDL- Rezeptor aus der

1. Einleitung 43

Zirkulation entfernt werden können (Schaefer et al. 1997). Es konnte des weiteren

gezeigt werden, dass die Produktion und der Katabolismus der vasoprotektiven HDL

bei diesem Patienten gesteigert waren (Schaefer et al. 1999). Diese Befunde wurden in

der Folge von Pietzsch et al. bestätigt (Pietzsch et al. 2000). Differentialdiagnostisch

sind die gleichen Überlegungen wie bei der FH wichtig. Der direkte Nachweis der

FDB- Mutationen erfolgt durch spezifische PCR- Amplifikation der Codon Region

3456-3553 des ApoB- 100- Gens und anschließende DGGE oder RFLP-Analyse. Bisher

wurden weltweit vier FDB verursachende ApoB- 100 Mutationen beschrieben

(R3500Q, R3500W, R3531C und R3480W). Alle verändern die Proteinstruktur von

ApoB in einem Bereich von nur 51 Aminosäuren in der carboxyterminalen modulator

site von ApoB-100. Diese Befunde lassen vermuten, dass es noch weitere bisher

unentdeckte Mutationen in dieser Region von ApoB- 100 gibt die zu FDB führen

können. Ein Teil dieser Arbeit beschäftigt sich daher mit einem großangelegten

genetischen Screening dieser Region von ApoB- 100 in Patienten mit und ohne KHK.

1.7.5 Struktur des Apolipoprotein B- Gens und Funktion von ApoB- 100

Das Gen für ApoB liegt auf Chromosom 2p23 - p24 (Knott et al. 1985). Es ist 45 kb

lang und besteht aus 28 Introns und 29 Exons, wobei das Exon 26 mit 7572 Bp am

größten ist und das bisher größte im menschlichen Genom identifizierte Exon ist. Apo-

B- 100 kommt als Strukturprotein neben anderen Apoproteinen noch in VLDL, IDL und

Lp(a) vor. In der LDL ist ApoB- 100 das einzige Apoprotein und dient als Ligand für

den LDLR. Es setzt sich aus 4536 Aminosäuren zusammen und ist mit 550 KDa eines

der größten Proteine im menschlichen Plasma. Durch elektronenmikroskopische

Untersuchungen und Bindungsstudien mit trunkierten ApoB- Molekülen in Mäusen

identifizierten Boren et al. die Bindungsdomäne für den LDL- Rezeptor (Boren et al.

1998). Diese Bindungsstelle („B- site“) ist in der Umgebung der Aminosäuren 3359 -

3369 lokalisiert und nahezu identisch mit der ApoE- Bindungsstelle zum LDLR. In

ihren Experimenten fanden sie heraus, dass ApoB- 100 eine ringförmige Struktur

aufweist (Chatterton et al. 1995), und dass die ersten 89% des Moleküls den LDL-

Partikel gürtelförmig umrunden, während die 11% am carboxylterminalen Ende

bogenförmig den Gürtel überqueren (Boren et al. 1998). Sie postulierten darauf ein

Modell, bei dem das carboxyterminale Ende des ApoB- 100 als negativer Modulator der

LDL- Rezeptorbindung fungiert und die Bindung der VLDL an den LDL- Rezeptor

1. Einleitung 44

verhindert. Erst durch die Lipolyse der VLDL und Umwandlung zu kleineren LDL-

Partikeln ändert das ApoB- 100 Molekül seine Konformation und erlaubt so eine

Bindung über die „B- site“ an den LDL- Rezeptor. In Aminosäureaustausch-

Experimenten konnten sie des Weiteren zeigen, dass die Überquerung des

carboxyterminalen Gürtels an Position 3500 des ApoB- 100 durch die spezifische

Interaktion von Arginin 3500 mit Tryptophan 4369 hervorgerufen wird und essentiell

für die Bindung an den LDLR ist. Beim Krankheitsbild des FDB ist diese Interaktion

gestört, sodass die „B- site“ partiell vom carboxyterminalen Gürtel überlagert wird, was

zu einer reduzierten Rezeptorbindung und zu einer Akkumulation von LDL im Plasma

führt (Boren et al. 2001).

1.7.6 Bisher bekannte Apo B- Defekte und ihre Auswirkung auf den

Lipidstoffwechsel

Weltweit wurden bisher vier FDB verursachende Mutationen im Exon 26 des ApoB-

100- Gen beschrieben. Alle führen zum Verlust von positiv geladenen Aminosäuren

(Arginin) in der carboxyterminalen modulator site von ApoB- 100, die durch

ungeladene substitutiert werden (Glutamin, Cystein, Tryptophan). Im Folgenden sollen

diese Mutationen bezüglich ihrer Häufigkeit in der Bevölkerung und funktionellen

Konsequenzen näher beschrieben werden.

Die Arginin 3500 Glutamin- Mutation (R3500Q): Die R3500Q ist die erste und

bestbeschriebene FDB- Mutation (Soria et al. 1989). Sie resultiert aus einer Guanin

Adenin Basensubstitution im Nukleotid 10708 im Codon 3500 des ApoB- Gens, der

einen Aminosäurenaustausch Arginin (CGG)

kann Glutamin 3500 nicht mehr mit Tryptophan 4369 interagieren, und es kommt zu

einer Maskierung der für die LDL- Rezeptorbindung wesentlichen „B- site“ des Apo B-

100 (Boren et al. 2001). Das Verhältnis von defekten zu normalen LDL- Partikeln im

Plasma heterozygoter Patienten beträgt 70/30, wodurch es zu einer stark reduzierten (-

40-80%) LDL- Bindung an den LDLR kommt .

Große genetische Untersuchungen ermittelten eine Prävalenz von 0,08% für die

R3500Q- Mutation in der Normalpopulation. Bei Trägern der Mutation lagen die

Gesamt- und LDL- Cholesterinwerte im Vergleich zur Normalbevölkerung

durchschnittlich um 100 bzw. 82 mg/dl höher. Das Risiko an einer KHK zu erkranken

war sieben mal größer als in der Normalbevölkerung, auch das Risiko an pAVK und

1. Einleitung 45

Hypertonie zu erkranken, war erhöht (Tybjaerg-Hansen et al. 1998). Eine mögliche

Erklärung für das im Verhältnis zur moderaten Cholesterinerhöhung deutlich gesteigerte

KHK- Risiko ist die vermehrte Anzahl modifizierter LDL- Partikel und die verlängerte

„residence time“ (RT= Plasmaverweildauer) dieser Partikel bei FDB (Schaefer et al.

1997; Pietzsch et al. 2000). Pietzsch et al. konnten in einer weiteren in vivo-

Turnoverstudie mit 5 heterozygoten FDB- Patienten zeigen, dass der im Vergleich zu

heterozygoten FH- Patienten moderate Anstieg der LDL- Plasmawerte durch einen

Anstieg der fraktionellen Katabolismusrate (FCR) der LDL- Vorstufen und eine

verminderte Konversion von IDL zu LDL bedingt war (Pietzsch et al. 1996). Die

Plasmaverweildauer von mutiertem IDL- ApoB- 100 war signifikant verkürzt, die von

LDL- ApoB- 100 verlängert. Die FCR für LDL- ApoB- 100 betrug 32 % der normalen

Kontrollen, die FCR für VLDL unterschied sich dagegen nicht.

Die Arginin 3500 Tryptophan- Mutation (R3500W): Gaffney et al. fanden in einer

Untersuchung mit 907 hyperlipämischen Patienten bei zwei Patienten eine unabhängige

Mutation im Codon 3500 des ApoB- Gens, bei der Arginin 3500 durch Tryptophan

ausgetauscht ist (Gaffney et al. 1995). Auch hier fand sich eine verminderte

Rezeptoraffinität, die jedoch nicht so stark war wie bei der R3500Q Mutation,

wahrscheinlich weil Tryptophan 3500 besser mit Tryptophan 4369 interagieren kann als

Glutamin 3500 (Boren et al. 2001). Die R3500W Mutation hat in der asiatischen

Population eine ähnlich hohe Frequenz wie R3500Q in Europa (Choong et al. 1997).

Eine sehr hohe Prävalenz wurde bei Patienten mit Hypercholesterinämie in China

beschrieben (2,7%) (Choong et al. 1997; Tai et al. 1998). In Europa scheint die

R3500W Mutation eher selten vorzukommen. In einer dänischen Studie mit 9255

Probanden konnte kein Träger der R3500W Mutation identifiziert werden. (Tybjaerg-

Hansen et al. 1998).

Die Arginin 3531 Cystein- Mutation (R3531C): In einer Studie mit 1560 Probanden

identifizierten Pullinger et al. 1995 durch SSCP- Screening von DNA- Proben eine

dritte ApoB- Mutation (R3531C). Sie resultiert aus einer Cytosin

Basensubstitution im Nukleotid 10800 im Codon 3531 des ApoB- Gens, die zu einem

Aminosäurenaustausch Arginin (CGC)

mutierten LDL mit Fibroblasten zeigten eine um 40% reduzierte Bindung von R3531C-

LDL verglichen mit normalen LDL. Die Gesamt- und LDL- Cholesterinwerte lagen um

1. Einleitung 46

51 und 36 mg/dl höher als bei Kontrollen (Pullinger et al. 1999). In einer zweiten Studie

mit 4130 vorselektierten Patienten mit Fettstoffwechselstörungen fanden Pullinger et al.

11 R3531C- Mutationsträger, was einer Prävalenz von 1 in 375 entspricht. Tybjaerg-

Hansen et al. fanden in einer Studie mit 9255 dänischen Patienten die R3531C-

Mutation in einer Häufigkeit von 0,08%. Sie konnten keine signifikante Erhöhung von

Gesamt- und LDL- Cholesterin feststellen (Tybjaerg-Hansen et al. 1998). Die Mutation

war nicht mit einem erhöhten KHK- Risiko assoziiert. Rabes et al. fanden in einer

Untersuchung einer französischen Familie 10 heterozygote R3531C- Mutanten. Nur 4

von 10 hatten erhöhte Gesamt- und LDL- Cholesterinwerte, bei diesen vier Probanden

konnte gleichzeitig eine Mutation im LDL- Rezeptorgen (LDLR P644L) festgestellt

werden (Rabes et al. 2000). Die unterschiedlichen Ergebnisse sprechen für eine variable

Expression des Phänotyps dieser Mutation, die durch andere genetische Faktoren wie

den ApoE- Phänotyp und anderen Stoffwechselstörungen moduliert wird.

Die Arginin 3480 Tryptophan- Mutation R3480W: Die ApoB- R3480W- Mutation

wurde von Boren in einer Untersuchung von 2500 hypercholesterinämischen Patienten

in den USA bei einem Patienten identifiziert. Klinisch zeigte sich eine milde Form der

Hypercholesterinämie und eine reduzierte Bindung an den LDL- Rezeptor. Daten für

die Prävalenz dieser Mutation in Europa liegen bisher noch nicht vor (Boren et al.

2001). ApoB- H3543RMarburg wird im Rahmen dieser Arbeit erstmals entdeckt und in

Kapitel 3.3 dieser Arbeit ausführlich beschrieben.

1.7.7 Mutationen im Gen der neuronalen Apoptosis regulierten Konvertase

(PCSK 9)

Vor kurzem konnte der molekulare Defekt für eine weitere Form von autosomal

dominant vererbter Hypercholesterinämie entdeckt werden. Die Patienten unterscheiden

sich klinisch nicht von heterozygoten FH- oder FDB- Trägern, jedoch seggregiert die

Krankheit nicht mit dem LDLR und dem ApoB- Gen (Damgaard et al. 2004). Das

krankheitsauslösende Gen PCSK9 codiert die neurale apoptosis regulierte Konvertase

(NARC-1) und ist Mitglied der Proteinase K- Familie von Subtilasen (Abifadel et al.

2003). Das PCSK9 Gen befindet sich auf Chromosom 12, umfasst 34 Kb und setzt sich

aus 12 Exonen zusammen, die für ein 60 KDa Protein codieren. PCSK9 ist wie das

LDLR- Gen ein SREBP-2 reguliertes Gen, das cholesterinabhängig induziert wird, im

Gegensatz zu anderen SREBP-2 regulierten Genen resultiert eine Überexpression von

1. Einleitung 47

PCSK9 jedoch nicht in einer gesteigerten zellulären Cholesterinbiosynthese/LDL-

Aufnahme, sondern führt paradoxerweise zu einer Degradation des zellulären LDLR-

Proteins, was zu einen Anstieg der Plasma LDL- Konzentration und damit verbunden zu

einem erhöhten Atheroskleroserisiko führt. Eine direkte Interaktion zwischen LDLR

und PCSK9 konnte bisher noch nicht nachgewiesen werden, was auf ein bisher nicht

identifiziertes zelluläres Modulator/Adapterprotein hindeuted. Im Rahmen von

genetischen Screeningstudien in unterschiedlichen Populationen konnten schon einige

PCSK9 Mutationen, die zu einer Hyper- bzw. Hypocholesterinämie führen, identifiziert

werden. (Timms et al. 2004; Leren 2004). Je nach Aminosäureaustausch im PCSK9-

Protein wurden sog. „loss of function“ (Hypocholesterinämie) oder „gain of function“

Mutationen, die zu einer Hypercholesterinämie führen, identifiziert.

1.8 Monogenetische autosomal rezessiv vererbte Lipidstoffwechselstörungen

1.8.1 Apolipoprotein E und der ApoE- Polymorphismus

ApoE ist ein 299 Aminosäuren großes Glykoprotein, das reich an Argininresten ist.

Hauptsyntheseorte von ApoE sind die Leber, Niere und Milz. Das Gen von ApoE- Gen

umfasst 3,7 kb, besteht aus 4 Exonen und ist cytogenetisch auf Chromosom 19

lokalisiert. Röntgenstrukturdaten von ApoE ergaben, dass die aminoterminale Region

von ApoE aus vier -Helices besteht und Helix 4 die Bindungsstelle für den LDL-

Rezeptor beinhaltet (Aminosäuren 136- 150), die eine große Homologie zur Apo B-

Bindungstelle (B- site) aufweist (Wilson et al. 1991; Boren et al. 1998). Wie bereits in

den vorherigen Kapiteln dieser Arbeit erwähnt, kommt ApoE in Chylomikronen VLDL,

IDL und HDL vor (Schneider et al. 1996; Schaefer 1998). Es vermittelt die

Lipoproteinaufnahme in die Leber, stimuliert die VLDL- Produktion, moduliert die

Hydrolyse der VLDL- und Chylomikronen- Triglyzeride und reguliert durch Bindung

an das LRP und den LDL- Rezeptor den Katabolismus der VLDL und Chylomikronen

Remnants. Zudem wirkt ApoE bei der Regeneration des peripheren Nervengewebes und

bei der Immunregulation mit (Mahley und Rall, Jr. 2000). In der Bevölkerung existiert

ein Polymorphismus des ApoE, der durch drei unterschiedliche ApoE-

Jr. 2000). Diese codieren für sechs unterschiedliche ApoE- Phänotypen, drei

homozygote (E 2/2, E 3/3, E 4/4) und drei heterozygote (E 2/3, E 2/4, E 3/4). Die

1. Einleitung 48

- Allel codiert und kommt mit 77,3% am häufigsten

in der Bevölkerung vor. Die Allele om

- Allel durch den Austausch von Aminosäuren an 2 unterschiedlichen

Positionen, die aus Punktmutationen im ApoE- Gen resultieren (Utermann et al. 1982;

Rall und Mahley 1992). Bei ApoE 4 findet sich in Position 112 Arginin anstelle von

Cystein und bei ApoE 2 in Position 158 Cystein statt Arginin. Der Apo E-

Polymorphismus beeinflusst sowohl den endogenen, als auch den exogenen

-,

LDL-Cholesterin-, Apo B- und höheren Triglyzerid-Werten assoziiert. ApoE 2 zeigt

praktisch keine Bindung an den LDL- Rezeptor und das LRP (Bindungsaffinität etwa 1

% verglichen mit ApoE 3 und 4). Die bei ApoE 2- Trägern niedrigen Gesamt- und

LDL- Cholesterinspiegel lassen sich zum einen durch eine verringerte Konversion

VLDL- IDL in LDL und zum anderen durch eine gesteigerte LDL-Rezeptorsynthese in

der Leber erklären. Da die Leber die ApoE 2- Chylomikronen nicht aufnehmen kann,

erfolgt kompensatorisch eine Aktivierung der LDLR- Synthese in der Leber, über diese

LDL- Rezeptoren können dann vermehrt LDL- Partikel via ApoB-100 aufgenommen

werden und der Plasma LDL- Spiegel sinkt. Eine besonders schwere Form der

Hyperlipoproteinämie, bei der Homozygotie für ApoE 2 eine Rolle spielt, ist der Typ III

Hyperlipoproteinämie nach Fredrickson. Bei Patienten mit Typ III

Hyperlipoproteinämie sind Cholesterin und Triglyzeride gleichermaßen erhöht,

wodurch diese Patienten ein sehr hohes Risiko haben, frühzeitig eine Atherosklerose zu

entwickeln (Utermann 1985; Utermann 1986; Mahley et al. 1999). Für die Ausbildung

einer Typ III Hyperlipoproteinämie sind noch weitere zusätzliche Faktoren notwendig

(Diabetis, Insulinresistenz, Hypothyreose), da die meisten ApoE 2/2 Träger (ca. 90%)

normolipämisch sind, sodass der ApoE 2/2 Genotyp für sich alleine nicht zwingend die

Ursache für eine Hypertriglyzeridämie zu sein scheint, sondern vielmehr weitere

Kofaktoren involviert sind, die in Kombination mit dem ApoE 2- Allel erst zur

Ausprägung einer Hypertriglyzeridämie führen (Mahley et al. 1999; Mahley und Rall,

Jr. 2000). Ein solcher relevanter Faktor scheint Apolipoprotein A5 zu sein, welches

kürzlich entdeckt wurde und ausschließlich in der Leber expremiert wird (van der Vliet

et al. 2001). In Studien mit transgenen und knockout- Mäusen konnte gezeigt werden,

dass ApoA5 die Plasma- Triglyzeridkonzentrationen moduliert (Pennacchio et al. 2001;

1. Einleitung 49

Talmud et al. 2002; Pennacchio und Rubin 2003). Der exakte Mechanismus der ApoA5

vermittelten TG- Senkung und die möglichen Interaktionen mit Apo E und

Lipoproteinlipase (LPL) bei der Hydrolyse triglyzeridreicher Lipoproteine sind bisher

nicht genau aufgeklärt. Aktuelle Daten postulieren jedoch, dass Apolipoprotein A5

einerseits die Produktion triglyzeridreicher Lipoproteine (VLDL) reduziert und

andererseits die Lipoproteinlipaseaktivität stimuliert (Schaap et al. 2004). In einer

Studie mit hypertriglyzeridämischen Patienten aus dem Kollektiv der Marburger

Präventions-Allianz konnten wir zeigen, dass ApoA5 einen wesentlichen Kofaktor für

die Hyperlipoproteinämie bei ApoE 2/2 darstellt. Bei 7 hypertriglyzeridämischen ApoE-

2/2-Trägern zeigten immerhin 6 dieser Patienten zusätzlich ein heterozygote ApoA5

S19W-Mutation (Schaefer et al. 2004). Dieser Befund ist insofern von Bedeutung, da

ApoE 2/2 in der Normalbevölkerung mit einer Häufigkeit von 0,6% vorkommt und nur

10% dieser Apo E 2/2 Träger eine Hypertriglyzeridämie entwickeln. Intersessanterweise

liegt die Frequenz von ApoA5 S19W in der Normalbevölkerung bei 10,9% (Talmud et

al. 2002), was der Häufigkeit der durch ApoE 2/2 induzierten Hypertriglyzeridämie

entspricht. Wir folgern aus diesen Daten, dass ApoA5 ein wichtiger Kofaktor (wenn

nicht gar der wichtigste Faktor) für die Ausprägung einer Hypertriglyzeridämie bei Apo

E2/2 Trägern ist. Im Gegensatz zu ApoE 2 -Allel häufiger in

hypercholesterinämischen Patienten gefunden (Mahley und Rall, Jr. 2000). ApoE 4

führt zu einem beschleunigten Umbau der VLDL in LDL und einer schnelleren

Chylomikronenelimination aus dem Plasma. Die Anzahl der LDL- Rezeptoren auf den

Hepatozyten sinkt kompensatorisch ab, wodurch das Plasma- LDL ansteigt. Personen

mit ApoE4- Phänotyp haben ein erhöhtes Risiko für Atherosklerose und early onset

Alzheimer- Krankheit. In einer Studie mit FH- Patienten konnte gezeigt werden, dass

das E 4- Allel in FH- Patienten nahezu doppelt so häufig vorkommt als in der

Normalpopulation (Duly et al. 1997). Andere Untersuchungen haben gezeigt (Davignon

et al. 1988), dass der ApoE- Polymorphismus bei ca. 10% der interindividuellen

Unterschiede der Serumcholesterinspiegel in verschiedenen Populationen

verantwortlich ist. Unabhängig vom Apo E- Polymorphismus können Veränderungen in

der Plasmamenge von ApoE 20-40% der Variationen der Plasmakonzentrationen von

Triglyzeriden und VLDL- Cholesterin bedingen (Mahley et al. 1999). Studien mit

Trägern der R3500Q- Mutation (FDB) haben gezeigt, dass bei FDB- Patienten eine Apo

1. Einleitung 50

E- bedingte Variabilität der Lipidwerte zu finden ist (Manke et al. 1993). Bei FDB

Patienten spielt ApoE eine zentrale Rolle, da es als hochaffiner Ligand des LDLR hier

einen „rescue shuttle“ generiert, der die defekte Bindung des ApoB durch eine

vermehrte Aufnahme der LDL- Vorstufen via ApoE in die Zelle kompensiert (Schaefer

et al. 1997). Dieser Mechanismus erklärt auch die moderateren LDL-

Plasmacholesterinspiegel bei FDB im Vergleich zu FH.

1.8.2 Die Autosomal Rezessive Hypercholesterinämie (ARH)

Die autosomale rezessiv vererbte Hypercholesterinämie wurde erstmals bei einer

Familie libanesischen Ursprungs beschrieben, bei der vier betroffene Nachkommen die

klassischen Zeichen einer homozygoten Familiären Hypercholesterinämie (FH)

aufwiesen (Garcia et al. 2001). Neben ausgeprägten Xanthomen an den Strecksehnen

fanden sich LDL- Plasmacholesterinwerte, die zwischen denen von heterozygoten und

homozygoten FH- Patienten lagen. Eine Untersuchung der Aufnahme und Bindung von

LDL in kultivierten Fibroblasten dieser Patienten zeigte keine Auffälligkeiten, und es

fand sich keine Segregation mit dem LDLR und dem ApoB- Gen. Weitere

Familienuntersuchungen im Mittelmeerraum (Türkei, Sardinien, Syrien) identifizierten

zusätzliche Fälle dieses Krankheitsbildes, bei denen Aufnahme und Bindung von LDL

in den Fibroblasten der Betroffenen ebenfalls völlig normal waren (Arca et al. 2002; Al

Kateb et al. 2003; Soutar et al. 2003). Die Plasma LDL- clearance- Rate war jedoch

genau so niedrig wie bei homozygoter FH, und es fand sich auch bei diesen Fällen keine

Segregation mit dem LDLR und dem ApoB- Gen, sodass man diese Form der

Hypercholesterinämie als Autosomal Rezessive Hypercholesterinämie (ARH)

klassifizierte. Der zugrundeliegende molekulare Defekt der Krankheit konnte 2001

aufgeklärt werden und wird durch Mutationen im Gen des ARH1- Proteins

hervorgerufen, welches sich auf Chromosom 1 befindet. Das Gen von ARH1 umfasst

45 Kb und besteht aus 16 Exonen, die für ein 20 KDa Protein codieren (Soutar et al.

2003). Durch Untersuchungen mit Lymphozyten von ARH- Patienten konnte

nachgewiesen werden, dass ARH1 ein Adapterprotein ist, welches der LDLR für die

Internalisierung des LDLR/LDL- Komplexes benötigt (Garcia et al. 2001; He et al.

2002; Soutar et al. 2003). In diesem Prozess interagiert ARH1 spezifisch über eine

Phosphotyrosin- Bindungsdomäne (PTBD) mit dem NPxY- Motif des LDLR und

ermöglicht hierdurch die Verankerung und Internalisierung des Rezeptor- Liganden-

1. Einleitung 51

Komplexes in den coated pits (Mishra et al. 2002). Interssanterweise benötigen nur die

Lymphozyten und Hepatozyten das ARH1- Protein für die Internalisierung des

Rezeptor- Liganden- Komplexes, nicht aber- wie bereits oben erwähnt- die

Fibroblasten. Man nimmt an, dass in Fibroblasten die Funktion des ARH1- Proteins

durch ein anderes Mitglied aus der Familie der Adapterproteine kompensatorisch

übernommen wird, und dass dieser kompensatorische Weg in Hepatozyten und

Lymphozyten nicht funktioniert. Da ca. 75% der Plasma- LDL über den LDLR pathway

in der Leber katabolisiert werden, erklärt dies auch, warum die in ARH beobachteten

LDL- Plasmacholesterinwerte zwischen denen von heterozygoten und homozygoten

FH- Patienten liegen. Anders als bei FH, wo der LDLR in allen Zellen defekt ist, ist bei

ARH also noch eine partielle LDL- clearance über einen funktionierenden LDLR in den

Fibroblasten möglich. Phänotypisch weisen Patienten mit ARH Xanthome auf und

besitzen ein sehr hohes Risiko, frühzeitig an Atherosklerose zu erkranken. Bisher

konnte die ARH erst in zehn Fällen ausschließlich im Mittelmeerraum (mediterrane

Hypercholesterinämie) nachgewiesen werden (Arca et al. 2002; Al Kateb et al. 2003;

Barbagallo et al. 2003), sodass diese Form der Hypercholesterinämie mit einer

Prävalenz 1-5 : 106 eher selten zu sein scheint.

1.8.3 Die autosomal rezessiv vererbte Phytosterolemie (Sitosterolämie)

Eine weitere monogenetisch vererbte Lipidstoffwechselstörung, die einem autosomal

rezessiven Vererbungsmodus folgt und sehr selten auftritt (Prävalenz 1-5:106), ist die

Sitosterolämie. Das Krankheitsbild wurde erstmals 1974 von Bhattacharyya und Connor

beschrieben (Bhattacharyya und Connor 1974). Die betroffenen Patienten wiesen stark

ausgeprägte Xanthome auf und hatten 50- fach erhöhte Plasmawerte für das

hauptsächlich im Plasma vorkommende pflanzliche Sterol Sitosterol. Der Gesamtanteil

der über die Nahrung eines Nicht- Vegetariers aufgenommenen Sterole besteht zu 60%

aus Sterolen, die dem tierischen Cholesterin entstammen und zu 40% aus pflanzlichen

Sterolen (Sitosterol, Campesterol etc.). Beide werden über das im Darm lokalisierte

NPC1L1- Transporterprotein in die Enterozyten des Dünndarms aufgenommen

(Altmann et al. 2004; Davis, Jr. et al. 2004). Beim gesunden Menschen werden

normalerweise etwa 50-60% des über die Enterozyten resorbierten Cholesterins

modifiziert und intrazellulär behalten, wohingegen nur 1% der aufgenommenen

pflanzlichen Sterole intrazellulär gespeichert werden und der Rest wieder aktiv aus den

1. Einleitung 52

Enterozyten in das Darmlumen heraus transportiert wird und über Faecas ausgeschieden

wird. Der Rücktransport von überschüssigem Cholesterin und pflanzlichen Sterolen aus

den Enterozyten heraus wird durch die Transporterproteine ABCA5 und ABCA8

bewerkstelligt. Die Gene beider Proteine liegen auf Chromosom 2p21, umfassen jeweils

56 Kb und bestehen aus 35 Exonen, die für zwei Transmembranproteine von 160 KDa

codieren (Lu et al. 2001). Beim Krankheitsbild der Sitosterolämie ist der

Rücktransportmechanismus von überschüssigem Cholesterin und pflanzlichen Sterolen

aus den Enterozyten heraus durch Mutationen in ABCA5/ABCA8 gestört, und es

kommt primär zu einer intrazellulären Akkumulation von Cholesterin, was sekundär

dann über eine verringerte LDLR- Aktivität in einem Anstieg der Plasma- LDL

resultiert (Hubacek et al. 2001; Heimer et al. 2002). Phänotypisch kann eine

Sitosterolämie einer homozygoten FH sehr ähnlich sein. Neben ausgeprägten

Xanthomen findet man bei den Patienten LDL- Plasmaspiegel > 500 mg/dl sowie ein

frühzeitiges Risiko für die Ausbildung von atherosklerotischen Läsionen.

1. Einleitung 53

1.9 Aufgabenstellung und Zielsetzung der Arbeit

Die Atherosklerose und ihre Folgen sind heute für nahezu 50% der Todesfälle in den

westlichen Industrienationen verantwortlich. In großen epidemiologischen Studien

konnte die Bedeutung von Fettstoffwechselstörungen, insbesondere die Rolle der

Hypercholesterinämie, als zentraler kardiovaskulärer Risikofaktor in der Pathogenese

der Atherosklerose aufgezeigt werden. Die von Prof. Dr. J. R. Schaefer und Prof. B.

Maisch 1998 in der Klinik für Kardiologie in Marburg gegründete Marburger

Präventions- Allianz versteht sich als ein multimodales Konzept zur Prävention der

KHK. Im Rahmen dieses mittlerweile in Deutschland größten koronarangiografierten

und risikostratifizierten Kollektivs werden seit 1998 von jedem Patienten, der sich in

der Klinik für Kardiologie in Marburg einer Herzkatheteruntersuchung unterzieht und

sich dazu bereit erklärt hat, Blut zur allgemeinen und speziellen Aufarbeitung

abgenommen. Neben den Standardparametern des lipidologischen Risikoprofils

(LDL/HDL- Cholesterin, Triglyzeride etc.), wird zusammen mit den weiteren klinischen

Daten so ein umfassendes kardiovaskuläres Risikoprofil des Patienten erstellt und

computergestützt mit dem Koronarbefund abgeglichen. In der ausführlichen klinischen

Datenbank liegen mittlerweile die Daten von mehr als 5000 Patienten in anonymisierter

Form vor. Ein Votum zur Durchführung von Studien mit diesem Kollektiv, welches auf

der Basis der Helsinki- Deklaration von 1975 in der revidierten Form von 1996 beruht,

wurde durch die Ethikkomission der Philipps-Universität-Marburg (Aktenzeichen

Studie: 10/03) erteilt.

Das Ziel der hier vorliegenden Arbeit war es, in einem ersten Schritt ein

molekulargenetisches Nachweissystem zu entwickeln, welches ein sicheres Screening

von Mutationen und Polymorphismen in relevanten Kandidatengenen, die bei der

Pathogenese der Atherosklerose eine Rolle spielen, aufzubauen. Hierzu sollte eine

Apparatur konzeptioniert werden, die einen Nachweis von Mutationen mit der Technik

der Denaturierenden Gradientengel Elektrophorese (DGGE) ermöglicht. In einem

zweiten Schritt sollte danach die Hypercholesterinämie als ein zentraler Faktor für die

Pathogenese der Atherosklerose untersucht werden. In einer DGGE- basierten

Screening- Studie sollten erstmals bei 1000 konsekutiv gesammelten Patienten der

Marburger Präventions- Allianz der Einfluss und die Prävalenz von Mutationen in

einem bestimmten Bereich des ApoB- 100- Gens, der für die Bindung von ApoB- 100

1. Einleitung 54

an den LDL- Rezeptor relevant ist, untersucht werden. Zusätzlich sollten im Rahmen

dieses Screenings extrem seltene und schon in frühester Kindheit schwerstmanifestierte

Formen der Familiären Hypercholesterinämie (FH), die durch Defekte im LDL-

Rezeptor entstehen, aufgeklärt werden. Im dritten Teil dieser Arbeit schließlich sollte

die funktionelle Relevanz von identifizierten Mutationen auf den Lipidstoffwechsel in

vitro als auch in vivo mittels stabiler Isotopentechnik genauer untersucht werden.

2. Material und Methoden 55

2. Material und Methoden

2.1 Material

2.1.1 Geräte

Agarosegeldokumentations- System, Intas (Göttingen)

Agarosegelkammern, BioRad (München)

Aquariumpumpe, Roth (Karlsruhe)

Autoklaven, MMM (München)

Bunsenbrenner, Roth (Karlsruhe)

DNA- Sequencer ABI- Prism 310, Applied Biosystems (Werrington, UK)

Drehschieber Vakuumpumpe vaccubrand Typ RD 4, Brand (Reutlingen)

Gaschromatograf/Tandem- Massenspektrometer MAT TSQ 700, Finnigan (USA)

Gradientenmischer, BioRad (München)

Heizblöcke Thermomixer 5436, Eppendorf (Hamburg)

Heizrührgerät Ikamag RCT, Bachhofer (Reutlingen)

Inkubatoren, Heraeus (Osterode)

Konfokales Lasermikroskop LSM 510, Zeiss (Jena)

Kühlfalle „Refridgerated Condensation Trap RT 100, Savant (Frankreich)

Lichtmikroskop Typ IM35, Zeiss (Jena)

Magnetrührer Ikamag Reo, Bachhofer (Reutlingen)

Nephelometer Modell- 100, Behring (Marburg)

PCR- Heizblock MJ Research, Corbett Research, Sidney (USA)

Peristaltische Pumpe, Amersham (Freiburg)

pH- Meter Modell 761, Knick (Berlin)

Photometer Spektrophotometer DU 640, Beckmann (München)

Pipetten P2, P20, P200, P1000, Gilson (Middleton, USA)

Pipetten P10, P20, P250, P1000, Eppendorf (Hamburg)

Protein- Minigel- Apparaturen- Mini- Protean II, BioRad (München)

Protein- Gel- Apparaturen Protean II, BioRad (München)

Quickseal- Tube- Sealer, Beckmann (München)

Quickseal- Tube- Spacers, Beckmann (München)

Quickseal- Tube- Slicer, Beckmann (München)

Real Time PCR- Heizblock (I- Cycler), BioRad (München)


Reinstwasseranlage MilliRo 30plus, Millipore (Eschborn)

Schüttelgeräte Reax 2000, Heidolph (Kelheim).

Spannungsgeräte:

- Modell Power Pac 300, BioRad (München)

- Modell Power Pac 3000, BioRad (München)

Speed-Vac Konzentrator SVC 100, Savant (Frankreich)

Spektralfluorometer (Model LS- 5 Fa. Perkin-Elmer, Langen)

Sterilbank, BDK (Sonnenbühl)

Stickstofftank XLC-2 30, MVE (New Prague, USA)

Tischschüttler 3020, GFL (Burgwedel)

Thermoelement 2219 Multitemp, LKB (Schweden)

UV- Illuminatoren (254 nm und 365 nm), Bachhofer (Reutlingen)

Waagen:

-AE163, Mettler- Toledo (Gießen);

-Typ 1412, Sartorius (Göttingen)

Wasserbäder 1086, GFL (Burgwedel)

Zentrifugen:

-Sorvall RC- 5C plus, DuPont (Bad Homburg);

-J6- MC und L8- 80M, Beckmann (München);

-5417 und 5417R, Eppendorf (Hamburg)

-Ultrazentrifuge Modell L8-55M Beckmann, (München)

Zentrifugenrotoren:

-Rotor RH 24-18, Savant (Frankreich)

-50.3 Ti.- Rotor, Beckmann (München)

-50.4 Ti.- Rotor, Beckmann (München)

2.1.2 Chemikalien und Biochemikalien

Acrylamid, Serva (Heidelberg)

30% Acrylamid:Bisacrylamid (37,5:1), Roth (Karlsruhe)

30% Acrylamid:Bisacrylamid (29:1), BioRad (München)

Agarose GTG, Biozym (Hess- Oldendorf)

Ammoniumacetat, Merck (Darmstadt)

Ammoniumhydrogencarbonat, Merck (Darmstadt)


Ammoniumperoxodisulfat (APS), Merck (Darmstadt)

Ammoniumsulfat, Merck (Darmstadt)

Aprotinin, Sigma (Taufkirchen)

Borsäure, Merck (Darmstadt)

Bradford- Reagenzlösung, BioRad (München)

Bromphenolblau, Merck (Darmstadt)

Calciumchlorid, Merck (Darmstadt)

Coomassie- Blau R- 250, Sigma (Taufkirchen)

Deuterium markiertes Leuzin (3D- Leuzin), MSD (USA)

DiI (1,1´-dioctadecyl-3,3,3´,3´-tetramethylindocarbocyaninperchlorate),

Sigma (Taufkirchen)

Dimethylsulfoxid (DMSO), Merck (Darmstadt)

Di- Natriumhydrogenphosphat, Merck (Darmstadt)

Dithiothreitol (DTT), Sigma (Taufkirchen)

dNTP`s (desoxyribonukleotidtriphosphate: dATP, dGTP, dCTP, dTTP),

Roth (Karlsruhe)

Essigsäure, Roth (Karlsruhe)

Ethanol (EtOH), Riedel- de- Haen (Seelze)

Ethidiumbromid (EtBr), Sigma (Taufkirchen)

Ethylacetat, Merck (Darmstadt)

Ethylendiamintetraacetat (EDTA), Merck (Darmstadt)

Fiquoll-Paque, Amersham (Freiburg)

Formaldehyd, Sigma (Taufkirchen)

Formamid (deionisiert), Roth (Karlsruhe)

Gentamycinsulfat, Gibco (Eggenstein)

Glukose, Gibco (Eggenstein)

Glycerin, Merck (Darmstadt)

Glycin, Roth (Karlsruhe)

Hepes, Sigma (Taufkirchen)

Isopropanol, Riedel- de- Haen (Seelze)

Kaliumacetat, Merck (Darmstadt)

Kaliumbromid, Merck (Darmstadt)


Kaliumchlorid, Merck (Darmstadt)

Kaliumdihydrogenphosphat, Merck (Darmstadt)

Kaliumphosphat, Merck (Darmstadt)

Lithiumchlorid, Sigma (Taufkirchen)

Leupeptin, Roth (Karlsruhe)

Magnesiumchlorid, Merck (Darmstadt)

Magnesiumsulfat, Merck (Darmstadt)

Methanol (MeOH), Riedel- de- Haen (Seelze)

2-Mercaptoethanol, Merck (Darmstadt)

Natriumacetat, Merck (Darmstadt)

Natriumchlorid, Merck (Darmstadt)

Natriumdodecylsulfat, (SDS) Roth (Karlsruhe)

Natriumhydroxid, Merck (Darmstadt)

Mounting- Medium, Vector Shield (USA)

Oligonukleotid dT- Primer, Gibco (Eggenstein)

Phenol (in TE äquilibriert), Roth (Karlsruhe)

Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF), Serva (Heidelberg)

Phosphate buffered saline (PBS),Gibco (Eggenstein)

Polyvinylpyrolidon (PVP), Sigma (Taufkirchen)

Rinderserumalbumin (BSA), Sigma (Taufkirchen)

Saccharose, Merck (Darmstadt)

Salzsäure (37%), Riedel- de- Haen (Seelze)

Streptomycin, Sigma (Taufkirchen)

SYBR- green- Fluoreszenz- Farbstoff, BioRad (München)

TEMED (N,N,N`,N`-Tetramethylethylendiamin), BioRad (München)

Tris, Roth (Karlsruhe)

Trizol- Reagent, Gibco (Eggenstein)

Triton-X- 100, Sigma (Taufkirchen)

Trypsin/EDTA- Lösung, Gibco (Eggenstein)

Xylencyanol, Sigma (Taufkirchen)


2.1.3 Enzyme

Platinium Taq DNA- Polymerase, Gibco (Eggenstein)

Restriktionsendonukleasen (Bezugsquellen):

-NEB (Schwalbach)

-Roche (Mannheim)

-Sigma (Taufkirchen)

-Stratagene (Heidelberg)

Rnase Inhibitor, Promega (Mannheim)

2.1.4 Kommerzielle Reaktionssysteme

Aminosäuren- Derivatisierungs- Kit (HFBA- IBA amino acid derivatization kit),

bestehend aus: Heptafluorobuttersäureanhydrid (HFBA), Isobutanol, Acetyl- Chlorid,

Alltech, (USA)

Enzymatischer Assay- Kit zur Quantifizierung von: Gesamtcholesterin,

HDL- Cholesterin und Triglyzeriden, Roche (Mannheim)

Nephelometrie Standard- Kit zur Quantifizierung der Apolipoproteine:

A-I, ApoB, ApoE, und Lipoprotein(a), Behring (Marburg)

Quiaex II Gel extraction Kit, Quiagen (Hilden)

Qiagen RNeasy Purification Kit, (Qiagen, Hilden)

Quiagen One step RT/PCR Kit, Quiagen (Hilden)

Big dye terminator ® Sequencing Kit, Applied Biosystems (Werrington, UK)

2.1.5 Oligonukleotide

Alle in dieser Arbeit verwendeten Oligonukleotide wurden über die Firmen Roth

(Karlsruhe) und Invitrogen (Karlsruhe) bezogen. Eine detaillierte Sequenzangabe

erfolgt im Ergebnisteil.

2.1.6 Kulturmedien/Seren

DMEM- Medium, Biochrom (Berlin)

Fötales Kälberserum (FCS), Biochrom (Berlin)

Lipoprotein defizientes Serum (LPDS), (Eigene Präparation)


2.1.7 Verbrauchsmaterialien

Deckgläser (Poly- L- Lysin beschichtet), Sigma (Taufkirchen)

Dialyseschläuche (Spectra/Por, molecular weight cut off 6000 -8000),

Serva (Heidelberg)

Dialyseschlauch- Klemmen (Spectra/Por Closures), Spectrum medical industries (USA)

Einweg Plastik- Pasteur- Pipetten, Sarstedt (Nümbrecht)

Einweg- Skalpelle, Finnigan (USA)

Eppendorf- Reaktionsgefäße (2,0/1,5 ml), Eppendorf (Hamburg)

Einweg- Sterilfilter (0,45 µm), Schleicher&Schuell (Dassel)

Filterpapier (Whatman 3MM), Schleicher&Schuell (Dassel)

Glasröhrchen mit Schraubverschluss und Teflondichtung

(Vials Typ I, temperaturbeständig bis 1500C), NeoLab (Heidelberg)

Ionenaustauschersäulen (Prefilled Poly- Prep Columns AG- 50W- X8),

BioRad (München)

Kanülen, Microlance 2,19 G 1,5 (USA)

Nitrozellulosemembran (0,45 µm), Schleicher&Schuell (Dassel)

Objektträger, Sigma (Taufkirchen)

PCR- Reaktionsgefäße (0,2/0,5ml),Biozym (Hess.- Oldendorf)

PCR- Platten (48- Well), Biozym (Hess.- Oldendorf)

Probengefäße für GC/MS (Combo- Pack), Ass- Chemicals (USA)

Röhrchen- Polypropylen mit Schraubverschluss (15 ml), Sarstedt (Nümbrecht)

Röhrchen mit Stopfverschluss- Polypropylen (5 ml), Sarstedt (Nümbrecht)

Ultrazentrifugationsröhrchen, Beckmann (München)

Zellkultur- Einweg- Plastikmaterialien (Bezugsquellen):

-Nunc (Dänemark)

-Falcon (Heidelberg)

-Greiner (Bad Homburg)


2.1.8 Antikörper

Nachfolgend eine Auflistung der im Rahmen dieser Arbeit verwendeten Antikörper.

Primärantikörper:

Anti-human LDL-Rezeptor (IgG- C-7):

Monoklonaler Antikörper aus Maus gerichtet gegen ein Epitop der ligandenbindenden-

Domäne des humanen LDL- Rezeptors (Fa. Acris, Hiddenhausen).

Anti-human LDLR (polyclonal antibody)

Polyklonaler Antikörper aus Kaninchen gerichtet gegen ein Epitop der EGF- Domäne

des humanen LDL- Rezeptors (Fa. Acris, Hidenhausen).

Anti-human SCARB1( polyclonal antibody)

Polyklonaler Antikörper aus Ziege gerichtet gegen ein Epitop im N- Terminus des

humanen scavenger receptors type B I (Fa. Santa Cruz, Heidelberg).

Anti-human Na+/K+- ATPase (polyclonal antibody)

Polyklonaler Antikörper aus Ziege gerichtet gegen die 35 KDa Unterheit der humanen

Natrium/Kalium ATPase (Fa. Santa Cruz, Heidelberg).

Sekundärantikörper:

Anti- Maus IgG (H+L) FITC:

Affinitätsgereinigter, polyklonaler Antikörper aus Kaninchen gegen Maus- IgG,

gekoppelt an Fluoreszeinisothiozyanatisomer I (Fa. DAKO, Hamburg).

Anti- Maus IgG (H+L)TRITC:

Affinitätsgereinigter, polyklonaler Antikörper aus Kaninchen gegen Maus- IgG,

gekoppelt an Tetramethylrhodaminisozyanat (Fa. DAKO, Hamburg).

Anti- Kaninchen IgG (H+L) Peroxidase :

Affinitätsgereinigter, polyklonaler Antikörper aus Ziege gegen Kaninchen- IgG,

gekoppelt an Peroxidase (Fa. Santa Cruz, Heidelberg).

Anti- Ziege IgG (H+L) Peroxidase :

Affinitätsgereinigter, polyklonaler Antikörper aus Kaninchen gegen Ziege- IgG,

gekoppelt an Peroxidase (Fa. Santa Cruz, Heidelberg).


2.1.9 Standardpuffer und Lösungen

Nachfolgend eine Auflistung der im Rahmen dieser Arbeit häufig verwendeten

Lösungen und Puffer.

50 x TAE- Puffer :

Tris: 242,0 g

Eisessig: 57,1 ml

EDTA(0,5 M; pH 8): 100,0 ml

H2O (bidest.): auf 1000 ml

10 x PBS- Puffer (pH 7,3):

NaCl: 80,0 g

KCl: 2,0 g

KH2PO4: 2,0 g

Na2HPO4: 11,5 g


1x TE- Puffer (pH 7,5) :

Tris: 121,1 g

EDTA: 0,09 g


6x DNA/RNA- Auftragspuffer:

Bromphenolblau: 0,25 g

Xylencyanol: 0,25 g

EDTA: 1,21 g

Glycerin: 30,0 ml


10% Ammoniumperoxodisulfat (APS) :

10 g APS mit H2O (bidest.) auf 100 ml.

70% Ethanol:

700 ml Ethanol p.A mit H2O (bidest.) auf 1000 ml.


2.1.10 Verwendete DNA und Proteinstandards

DNA- Längenstandards:

Proteinstandards:

SDS- PAGE

Broad Range Standards

(Fa.BioRad,München)

Apolipoprotein A-I

Purified (HDL)

(Fa.Calbiochem,Darmstadt)

Aprotinin

34,3 KDaApo E

28,3 KDaApo A-I

6,5KDa

14,4 KDa

45,0 KDa

66,2 KDa

116,2 KDa KDAa

200,0 KDa KKdaKDAa

97,4 KDa

31,0 KDa

21,5 KDa

Myosin

ß-Galactosidase

Phosporylase B

Serum Albumin

Ovalbumin

Trypsin Inhibitor

Lysozym

Carbon Anhydrase Inhibitor

Protein:

Apolipoprotein E

Purified (VLDL)

(Fa.Calbiochem,Darmstadt)

-DNA-Hind III-Marker

(Fa.Roche,Mannheim)

pUC 18 Msp I- Marker

(Fa.Sigma,Taufkirchen)

PCR- Markers

(Fa.Promega,Mannheim)

23130 Bp

9460 Bp

6557 Bp

2027 Bp2322 Bp

564 Bp

125 Bp

242 Bp

147 Bp

1000 Bp

750 Bp

500 Bp

300 Bp

150 Bp

50 Bp

110 Bp

502 Bp489 Bp

190 Bp

89 Bp67 Bp

404 Bp353 Bp

4361 Bp


2.2 Molekularbiologische Arbeitsmethoden

2.2.1 Isolierung von DNA aus Vollblut

Für die Isolierung von DNA aus Vollblut wurde im Rahmen dieser Arbeit ein neues

Verfahren entwickelt, welches die schnelle Isolierung von DNA aus einer großen

Anzahl von klinischen Proben ermöglicht. Die Zusammensetzungen der Lösungen für

dieses Verfahren waren wie folgt:

Äquilibriertes mit TE- Puffer (pH 8,0) überschichtetes Phenol:

Isopropanol (2-Propanol) p. A :

70% Ethanol:

DNA- Isolations- Stammlösung:

3M Guanidiniumisothyoycyanat : 70,80 g

2M Lithium Chlorid: 4,20 g

3M Harnstoff: 9,00 g

30mM Tris- HCl (pH 7,0): 0,20 g

15mM EDTA: 0,28 g

0.5% SDS: 0,25 g

Triton X- 100 (w/v): 0,10 g

ß- Mercaptoethanol (w/v): 0,25 g

H2O (bidest.): auf 200ml

Diese Lösung wurde über Nacht auf einem Magnetrührer gemischt und anschließend

durch Papierfilter (Schleicher&Schüll) filtriert und bis zur weiteren Verwendung als

Stammlösung bei RT (250C) aufbewahrt.

DNA- Isolations- Lösung (Arbeitslösung):

3 Volumen DNA- Isolations- Stammlösung: 300ml

1 Volumen äquilibriertes Phenol: 100ml

Isolierung der DNA

Jeweils 200µl Vollblut wurden mit 600µl DNA- Isolations- Lösung versetzt und für 10

Sek auf einem Vortexgerät geschüttelt. Anschließend wurde für 30 Sek. bei 13000 rpm


9460 23130

M 1 2 3 4 5Bp

6557

2027 2322

4361

in einer Eppendorf- Zentrifuge abzentrifugiert und der wässrige Überstand mit der DNA

in ein neues Eppendorfgefäß überführt. Nach Zugabe von 1ml Isopropanol wurde

vorsichtig gemischt und abermals für 1 Min. bei 13000 rpm abzentrifugiert. Der

Überstand wurde vorsichtig mit einer Wasserstrahlpumpe abgesaugt und das Pellet mit

800µl einer 70% Ethanol- Lösung gewaschen. Nach einer weiteren kurzen

Zentrifugation wurde der Überstand verworfen und die isolierte DNA für 3 Min. an der

Luft getrocknet, anschließend in 500µl sterilem H2O (bidest.) aufgenommen und zur

weiteren Verwendung bei- 200C aufbewahrt. Die Integrität der mit diesem Verfahren

gewonnenen DNA wurde durch Auftrennung in einem analytischen 1% Agarosegel

überprüft (Abbildung 11).

Abbildung 11: Auftrennung von aus Vollblut isolierter DNA des im Rahmen dieser Arbeit neu

entwickelten Verfahrens in - DNA- Hind III- Marker ).

2.2.2 Isolierung von RNA aus kultivierten adherenten Zellen

Qualitativ hochwertige RNA aus kultivierten adherenten Zellen konnte mit Hilfe des

,,Qiagen RNeasy Purification Kit‘‘ (Qiagen, Hilden) präpariert werden. Für eine

Standard- RNA- Präparation wurden ca.1.5 - 2 x 106 Zellen verwendet. Nach

Trypsinisierung wurden die Zellen bei 1000 x g und RT abzentrifugiert und der

Überstand an Medium abgesaugt. Die pelletierten Zellen wurden anschließend jeweils 2

mal mit 2ml sterilem 1x PBS- Puffer gewaschen und das Zellpellet sofort in Lysis-

Puffer lysiert. Die Aufreinigung der RNA über Qiagen- Säulen erfolgte nach den

Angaben des Herstellers. Abschließend wurde die RNA in 50µl sterilem DEPC- H2O

von den Quiagen- Säulen eluiert und für weitere Anwendungen entweder sofort


eingesetzt oder bei -800C aufbewahrt. Die Integrität der gewonnenen RNA wurde durch

Auftrennung in einem analytischen Agarosegel überprüft.

2.2.3 Photometrische Konzentrationsbestimmung von DNA und RNA

Zur Konzentrationsmessung von DNA und RNA wurden die DNA/RNA-Lösungen 1:50

in 200µl H2O verdünnt und die Konzentration bei einer Wellenlänge von 260nm

(OD260) spektralphotometrisch bestimmt. DNA und RNA weisen bei einer Wellenlänge

von 260nm ein Absorptionsmaximum auf. Bei doppelsträngiger DNA wird bei einer

OD260 = 1,0 eine DNA- Konzentration von 50µg/ml zugrunde gelegt, für

einzelsträngige RNA ergibt sich eine Konzentration von 33 µg/ml.

Formel: C =

C= Konzentration in mM/l

k= Verdünnungsfaktor

ε= Extinktionskoeffizient in mM-1 cm-1

d= Küvettenschichtdicke in cm

Wurde bei einer Wellenlänge von 280nm ein weiteres Absorptionsmaximum gemessen,

deutete dies auf die Anwesenheit von Proteinen in der Lösung hin. Der Quotient aus den

Absorptionskoeffizienten, bei 260nm und 280nm, gab Aufschluss über die Reinheit

einer DNA/RNA- Präparation. Bei reinen DNA/RNA- Lösungen liegt der Quotient bei

ungefähr 2. Niedrigere Werte sind ein Hinweis auf Verunreinigungen durch Proteine.

2.2.4 DNA- Hydrolyse mit Restriktionsendonukleasen

Restriktionsenzyme spalten DNA durch Hydrolyse des Desoxyribose- Phosphat-

Rückgrats an spezifischen Erkennungssequenzen. Endonukleasen vom Typ II erkennen

spezifische, pallindromische DNA- Sequenzen aus 4-8 Nukleotiden und schneiden diese

in Anwesenheit von MgCl2. Für die Restriktion wurden für analytische Zwecke 0,2–1

ätzen) bzw. 2µg (bei präparativen Ansätzen) der DNA

eingesetzt und mit der jeweils benötigten Restriktionsendonuklease unter den vom

Hersteller empfohlenen Bedingungen gespalten. Waren Restriktionen mit zwei

Enzymen gleichzeitig nötig, so wurde ebenfalls nach Angaben des Herstellers verfahren

und der jeweils für beide Restriktionsendonukleasen günstigste Reaktionspuffer

OD260 x k

ε x d


gewählt. Das Reaktionsvolumen für die Restriktion betrug 30- -1U Enzym

ändige Spaltung der DNA wurde in der Regel nach

12 Stunden Inkubationszeit (Restriktion von PCR- Produkten) erreicht.

2.2.5 Agarose- Gelelektrophorese zur Auftrennung von DNA/RNA- Molekülen

Die Auftrennung von DNA/RNA- Molekülen zu analytischen und präparativen

Zwecken wurde in horizontalen Agarosegelen in Flachgelapparaturen durchgeführt.

Dabei erlaubt die negative Ladung der DNA/RNA- Moleküle deren Wanderung im

elektrischen Feld. Die Konzentration an Agarose im Gel richtete sich nach der Größe

der aufzutrennenden DNA- und RNA- Moleküle und lag zwischen 1% und 3% (w/v).

Vor dem Auftragen wurden die Proben mit 1/6 Vol. 6x DNA- Auftragspuffer (Loading

buffer) versetzt. Zusätzlich wurde auf dem Gel eine bekannte Referenz (DNA-

Längenstandard) aufgetragen, um das Molekulargewicht der aufgetrennten Fragmente

zu bestimmen. Die Elektrophorese erfolgte in 1x TAE- Puffer bei einer Spannung von 5

V/cm. Das in die DNA- und RNA- Moleküle interkalierte EtBr wurde anschließend zur

Visualisierung der Fragmente unter UV- Licht zur Fluoreszenz gebracht. Zur Agarose-

Gelelektrophorese wurden folgende Puffer und Lösungen verwendet:

Agarosegel:

Agarose: x mg

50xTAE- Puffer: 600µl

EtBr (10mg/ml) 2µl

H2O (bidest.): auf 30ml

1 x TAE- Laufpuffer: 10ml 50xTAE- Puffer mit H2O auf 500ml

6x DNA- Auftragspuffer: 0,25% (w/v) Bromphenolblau

0,25% (w/v) Xylencyanol

30% (v/v) Glycerin

50mM EDTA

2.2.6 Polyacrylamid- Gelelektrophorese zur Auftrennung von DNA- Fragmenten

Die Auftrennung von DNA- Fragmenten aus Restriktionsanalysen im Größenbereich

20-200 Bp erfolgte in vertikalen Minigel- Apparaturen in 1mm dicken 5 x 10cm großen


Gelen (BioRad, München). Die Konzentration an Acrylamid/Bisacrylamid (29:1) im

Gel richtete sich nach der Größe der aufzutrennenden DNA- Fragmente und lag

zwischen 10% und 15%. Nach Zugabe von 1/100 Volumen TEMED und 1/10 Volumen

10%iger Ammoniumpersulfatlösung und Polymerisation der Gele wurden die

Fragmente elektrophoretisch aufgetrennt.Vor der Auftragung wurden die Proben mit 1/6

Vol. 6x DNA- Auftragspuffer versetzt. Zusätzlich wurde auf dem Gel eine bekannte

Referenz (DNA- Längenstandard) aufgetragen, um das Molekulargewicht der

aufgetrennten Fragmente zu bestimmen. Die Elektrophorese erfolgte in 1x TAE- Puffer

bei einer Spannung von 100 Volt über einen Zeitraum von 2-3 Stunden. Nach

Beendigung der Elektrophorese wurden die Gele für 10 Min. in 1x TAE/EtBr- Puffer

(0,5µg EtBr/ml) gefärbt und anschließend für 5 min in H20 entfärbt. Das in die DNA-

Fragmente interkalierte EtBr wurde anschließend- zur Visualisierung der Fragmente -

unter UV- Licht zur Fluoreszenz gebracht. Zur Auftrennung von DNA- Fragmenten

mittels Polyacrylamid- Gelelektrophorese wurden folgende Puffer und Lösungen

verwendet:

Polyacrylamidgel:

40% Acryrylamid/Bisacrylamid (29:1): x ml

50xTAE- Puffer: 200 µl


TEMED (N,N,N`,N`-Tetramethylethylendiamin)

10%Ammoniumperoxodisulfat (APS)

1 x TAE- Laufpuffer: 10 ml 50xTAE- Puffer mit H2O auf 500 ml.



30% (v/v) Glycerin

50 mM EDTA


2.2.7 Isolierung von DNA- Fragmenten aus Agarosegelen

Zur Aufreinigung von DNA- Fragmenten wurden 1/5 eines Restriktionsansatzes, je

nach Fragmentgröße, auf ein Agarosegel mit einer Konzentration von 1-2% aufgetragen

und elektrophoretisch aufgetrennt. Unter UV- Licht der Wellenlänge

(langwelliges UV- Licht) wurden die entsprechenden DNA- Fragmente mit Hilfe eines

Skalpells aus dem Gel ausgeschnitten und mit dem Qiaex II Gel extraction kit (Qiagen,

Hilden) nach den Angaben des Herstellers aufgereinigt.

2.2.8 Amplifikation von DNA- Fragmenten mit der Polymerase- Kettenreaktion

(PCR)

Die Polymerase- Kettenreaktion (PCR) führt zu exponentieller Vermehrung eines DNA-

Abschnittes zwischen zwei an den komplementären Strängen anhybridisierten Oligo-

desoxyribonukleotiden (Saiki et al. 1985; Mullis und Faloona 1987; Saiki et al. 1988).

Im Rahmen dieser Arbeit wurden PCR- Reaktionen für Restriktions-, Mutations- und

Sequenzierungs- Experimente verwendet. Bei allen Amplifikationen wurde dabei die

Platinium Taq DNA- Polymerase (Invitrogen, Karlsruhe) benutzt, da sie wegen ihrer

„Hot Start- Aktivierung“ ein Vorpipettieren einer großen Anzahl an PCR- Reaktions-

Ansätzen ermöglicht. Die typische Zusammensetzung eines PCR- Ansatzes war wie

folgt:

PCR- Mix (1fach): 100 ng Template- DNA (genomische)

10 pmol Vorwärts- Oligodesoxyribonukleotid

10 pmol Rückwärts- Oligodesoxyribonukleotid

5 µl 10x Taq- Polymerase- Puffer mit 1,5 mM MgCl2

0,4 µl 25 mM dNTP- Mix

0,2 µl Taq-P olymerase (5 U/µl)

H2O (bidest.) auf 50 µl

25 mM dNTP- Mix: 25 mM dGTP

25 mM dATP

25 mM dTTP

25 mM dCTP


Die PCR- Reaktion wurde in einem MJ-Research PTC- 200 PCR- Thermocycler

(Biozym, Hess. Oldendorf) entsprechend der programmierten Temperaturen für

Strangtrennung (Denaturierung), Oligonukleotid- Hybridisierung und

Strangverlängerung (Elongation) durchgeführt. In der Regel wurden hierzu folgende

Bedingungen gewählt:

Denaturierung: 940C 30 Sek.

Hybridisierung: 600C 60 Sek.

Elongation: 720C 60 Sek.

(25-35 Zyklen)

Abschließend erfolgte ein einzelner Zyklus zur Vervollständigung aller Stränge unter

folgenden Bedingungen :



Elongation: 720C 5 Min.

Für spezielle Experimente wie Denaturierende Gradientengel Elektrophorese (DGGE)

wurde ein Denaturierungs/Renaturierungs- Programm unter folgenden Bedingungen

durchgeführt:

Denaturierung: 940C 5 Min.

Inkubation: 650C 30 Min.


Inkubation: 40C hold

Nach Beendigung der Reaktion wurde ein 5µl- Aliquot des Produktes zur Kontrolle

auf einem Agarosegel analysiert.


2.2.9 Quantitative Untersuchung der Genexpression mittels Real- Time RT/PCR

Die Technik der Real- Time RT/PCR (Higuchi et al. 1993; Pfaffl 2001) ermöglicht es,

in einem Reaktionsansatz die tatsächliche und relative Expression von Genen unter

unterschiedlichen Bedingungen zu bestimmen. Hierbei wird über den signifikanten

Einbau eines Fluoreszenz- Farbstoffes (z.B. SYBR- green) die Menge aus cDNA

generiertem PCR- Produkt in Echtzeit bestimmt. Durch den Vergleich mit einem

konstant expremierten „house keeping gene“ (zB. ß- Aktin, Na+K+- ATPase oder

GAPDH), dessen Expression unter verschiedenen Stimuli immer konstant bleibt, lässt

sich dann ermitteln, ob die Transkription des untersuchten Gens ansteigt oder abfällt.

Die Präparation der RNA für die Untersuchungen mit der Real- Time RT/PCR erfolgte

wie unter Punkt 2.2.2 beschrieben aus kultivierten Zellen mit Hilfe des ,,Qiagen RNeasy

Purification Kit‘‘(Fa.Qiagen,Hilden) nach den Anweisungen des Herstellers. Als

Referenz „house keeping gene“ für alle Untersuchungen und Berechnungen der

Induktion/Repression der Transkription der untersuchten Gene diente das GAPDH-Gen.

Ein einzelner Ansatz für ein Real- Time RT/PCR- Experiment setzte sich wie folgt

zusammen:

RT/PCR-Mix (1fach): 500 ng RNA (DNAse- verdaut)

2,5 pmol Vorwärts- Oligodesoxyribonukleotid

2,5 pmol Rückwärts- Oligodesoxyribonukleotid

2,5 µl SYBR -green ( Fa Biorad,München

5,0 µl Q- Solution (Fa. Quiagen,Hilden)

5,0 µl RT/PCR Puffer (Fa. Quiagen,Hilden)

1,0 µl 10 mM dNTP- Mischung

1,0 µl One step RT/PCR Enzymmix ,

(Fa. Quiagen,Hilden)

H2O (bidest.) auf 25 µl

Die Real- Time RT/PCR-Reaktionen wurden in einem Real- Time PCR- Thermocycler

(I- Cycler, Fa. Biorad, München) durchgeführt. In der Regel wurden hierzu die

nachfolgenden Bedingungen gewählt:


cDNA- Synthese-Reaktion:


Denaturierung: 950C 15 Min.

(1 Zyklus)

Im Anschluss erfolgte aus der so synthetisierten cDNA direkt die PCR- Amplifikation

der zu untersuchenden Gene. Hierzu wurde das folgende Programm verwendet:



Elongation: 720C 60 Sek.

(47 Zyklen)

Nach Beendigung der PCR- Reaktionen wurde ein 2,5 µl- Aliquot des Produktes auf

einem Agarosegel zur Kontrolle analysiert und anschließend die RT/PCR- Daten

Computer gestützt ausgewertet (siehe auch Punkt 3.8 Ergebnisteil dieser Arbeit).

2.2.10 Denaturierende Gradientengel Elektrophorese (DGGE)

Zum Nachweis von neuen Mutationen in bestimmten Genbereichen gibt es eine

Vielzahl von Verfahren, z.B. Single Strand Conformation Polymorphism (SSCP),

Heteroduplex- Analyse oder Chemical Mismatch Cleavage (CMC), welche sich

hinsichtlich Sensitivität und Praktikabilität unterscheiden. Im Rahmen dieser Arbeit

wurde die Technik der Denaturierenden Gradientengel Elektrophorese (DGGE)

verwendet, da sie die höchst- mögliche Sensitivität aller Mutations-Nachweis-

Verfahren besitzt (Myers et al. 1985; Nollau und Wagener 1997). Diese Technik basiert

auf dem Prinzip, dass DNA- Fragmente, die sich in ihrer Nukleotid- Zusammensetzung

unterscheiden, unterschiedlich weit in Polyacrylamidgelen mit einem linearen

Denaturans- Gradienten aus Harnstoff/Formamid wandern (Myers et al. 1985; Sheffield

et al. 1989). Zum Nachweis von Mutationen in DNA- Fragmenten mit Denaturierender

Gradientengel Elektrophorese (DGGE) wurden folgende Puffer und Lösungen

verwendet:


Denaturans- Stammlösung 0% :

40% Acryrylamid/Bisacrylamid (37,5:1): 22,5 ml

50xTAE- Puffer: 2,0 ml


Denaturans- Stammlösung 100% :

40% Acryrylamid/Bisacrylamid (37,5:1): 22,5 ml

50xTAE- Puffer: 2,0 ml

Formamid p.A(deionisiert): 40,0 ml

Harnstoff (Ultra Qualität): 42,0 g


N,N,N`,N`- Tetramethylethylendiamin (TEMED)

10%Ammoniumperoxodisulfat (APS)

1 x TAE- Laufpuffer: 120 ml 50xTAE- Puffer mit H2O auf 6000 ml.

Diese Lösungen wurden durch 0,45µl Filter (Schleicher&Schüll,Dassel) filtriert und

anschließend für 10 Min. in einer Vakuumflasche entgast. Bis zur weiteren Verwendung

erfolgte die Lagerung der Stammlösungen dann bei 40C in einer braunen Flasche über

einen Zeitraum von maximal 1 Monat.



30% (v/v) Glycerin

50 µM EDTA

Herstellen von DGGE- Gelen und Gelelektrophorese von PCR- amplifizierter

DNA

Zum Herstellen von linearen denaturierenden Gradientengelen wurden jeweils 15 ml

100% und 0% Denaturans- Stammlösung mit 1/100 Volumen TEMED und 1/10

Volumen 10%iger Ammoniumpersulfatlösung versetzt. Die rechnerisch auf das

Gelvolumen genau aufeinander abgestimmten Lösungen wurden in einen


Gradientenmischer gegeben und von dort über eine peristaltische Pumpe mit einer

Pumpgeschwindigkeit von 5ml/Min. in die Gelkammer geleitet. Dabei wurde der

hochkonzentrierten Gel- Lösung im vorderen Gefäß des Gradientenmischers

kontinuierlich niederkonzentrierte Lösung zugemischt, sodass die Konzentration an

Denaturans in der Gelkammer linear von unten nach oben abnahm. Für die

Elektrophorese wurden jeweils 5µl PCR- Produkt mit 1/6 Vol. 6x DNA- Auftragspuffer

versetzt und auf das Gel aufgetragen. Die Elektrophorese erfolgte in einer eigens für die

DGGE speziell umgebauten Elektrophorese- Einheit (siehe Punkt 3.1 Ergebnisse dieser

Arbeit), bei einer konstanten Temperatur von 600C in 1x TAE- Puffer über einen

Zeitraum von 5 Stunden und einer Spannung von 120 Volt. Nach Beendigung der

Elektrophorese wurden die Gele für 10 Min. in 1x TAE/EtBr- Puffer (0,5µg EtBr/ml)

gefärbt und anschließend für 5 Min. in H20 entfärbt. Das in die DNA- Fragmente

interkalierte EtBr wurde anschließend zur Visualisierung der Fragmente unter UV-

Licht zur Fluoreszenz gebracht.

2.2.11 Sequenzierung von PCR- amplifizierter DNA

Zur Sequenzierung von aufgereinigten PCR- Produkten wurden diese zuerst mittels

PCR amplifiziert. Der Reaktionsansatz enthielt neben der DNA- Polymerase und den

Sequenzier- Primern (Vorwärts- Oligodesoxyribonukleotid bzw. Rückwärts-

Oligodesoxyribonukleotid) zusätzlich mit Fluoreszenz- Farbstoff- markierte

Didesoxynukleotide (Big Dye Terminator ddntp´s), die eine vorzeitige Termination

der DNA- Synthese bewirken, wenn sie durch die Polymerase in den wachsenden DNA-

Strang eingebaut werden. Alle bei der Big Dye Terminator- Sequenzierung

verwendeten Chemikalien und Reaktionsgefäße waren frei von Fluoreszenz und

entsprachen den höchstmöglichen Reinheitsgraden. Zur Sequenzierung von PCR-

Produkten wurden folgende Puffer und Lösungen verwendet:

3M Natriumacetat pH 4,6 in H20 (reinst):

96% Ethanol p.A (Ultra- Qualität):

70%Ethanol: 70 ml 96% Ethanol p.A mit H2O (reinst) auf 100 ml


Reaktionsansatz:

Premix (ABI- Big Dye Terminator): 2µl

Aufgereinigtes PCR- Produkt: 50ng

Sequenzier- Primer (10pmol): 2µl

H2O (reinst): auf 10µl

Nach der PCR wurden zu 2

Natriumacetat hinzugegeben und gemischt. Nach Überführung in ein 0,5ml Eppendorf-

Reaktionsgefäß erfolgte die Zugabe von 55 ür 15 Min.

bei 13000 rpm und RT in einer Eppendorf- Zentrifuge abzentrifugiert. Der Überstand

anschließend erneut zentrifugiert und der Überstand wiederum abgenommen. Das Pellet

Template Supression

Reagent, ABI) resuspendiert. Nach einer zweiminütigen Inkubation bei 900C wurde der

Reaktionsansatz sofort auf Eis gestellt und für 10 Min. abgekühlt. Abschließend wurde

der Ansatz in Sequencer- Reaktionsgefäße überführt und der eigentliche

Sequenzierungslauf in einem ABI Prism 310- DNA-Sequencer (Applied Biosystems,

Foster City, CA, USA) durchgeführt.

2.3 Proteinbiochemische Methoden

2.3.1 In vivo- Kinetikuntersuchungen von Kontroll- und Patientenproben

Der Einfluss von neu identifizierten Defekten des LDL- Rezeptors und des Haupt-

Liganden dieses Rezeptors (Apolipoprotein B-100) auf die in vivo- Situation des

Lipoproteinstoffwechsels wurde im Rahmen einer in vivo- Kinetikuntersuchung im

Vergleich mit Normalprobanden untersucht. Das Studienprotokoll für diese

Untersuchungen wurde von der Ethikkomission der Philipps- Universität Marburg

genehmigt, und jeder Teilnehmer wurde im „informed consent“ genau über die

Untersuchungen aufgeklärt. Eine detaillierte Beschreibung von Normalkollektiv und

Patientenproben erfolgt im Ergebnisteil.

2.3.2 Auswahl der Isotope für in vivo- Kinetikuntersuchungen

Zur Untersuchung der Verstoffwechselung eines menschlichen Proteins können für

Isotopenuntersuchungen grundsätzlich alle in Proteinen vorkommenden Isotope


eingesetzt werden. Isotope eines Elements unterscheiden sich gegenüber den natürlich

vorkommenden Elementen lediglich in der Anzahl der Neutronen im Atomkern und

besitzen dadurch veränderte physikalische Eigenschaften, ansonsten sind sie jedoch

vollkommen chemisch inert. Die Auswahlkriterien für den Einsatz eines bestimmten

Isotops umfassen im Wesentlichen Faktoren wie: 1) Verfügbarkeit des entsprechenden

Tracers. 2) Die Stabilität der Interaktion zwischen Isotop und dem zu detektierenden

Molekül. 3) Applikationsweise und Anreicherung des Tracermaterials im zu

untersuchenden Molekül. 4) Das verwendete Detektionsverfahren zum Nachweis des

Isotops.

Bei den im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten Untersuchungen wurde als

Traceraminosäure 3fach markiertes Deuterium L- Leucin (5,5,5,-2 H3- L- Leucin)

verwendet. Aufgrund der vergleichsweise hohen Anreicherung in Apolipoproteinen

(11,6 % im ApoB- 100, 37 Mol pro Mol Apo A-I) besitzt diese Traceraminosäure auch

bei geringer Gesamtproteinmenge eine hohe Sensitivität im Tracernachweis. Weitere

Kriterien für die Auswahl von (5,5,5,- 2H3- L- Leucin) waren zum Einen, dass L- Leuzin

eine der 10 essentiellen Aminosäuren ist und somit die Plasmakonzentration dieser

Aminosäure unabhängig von endogenen Synthesewegen ist und ihre Zufuhr über die

Nahrungsaufnahme kontrolliert werden kann; zum Zweiten, dass L- Leuzin als

essentielle Aminosäure in relativ niedrigem Plasmaspiegel vorliegt, was aufgrund der

geringen Poolgröße eine niedrigere Tracergabe im Vergleich zur Verwendung von

endogen synthetisierten, nicht-essentiellen Aminosäuren ermöglicht. Des Weiteren ist

die 3fach- Markierung der Aminosäure L- Leuzin mit Deuterium chemisch stabil und

hat sich bereits in anderen Arbeiten bewährt (Colby und McCaman 1979; Schaefer et al.

1997). Nach Qualitätskontrolle (Reinheit > 99,9%) wurden die markierten Aminosäuren

durch die Klinikumsapotheke der Philipps-Universität Marburg in physiologischer

Kochsalz- Lösung aufgenommen, steril filtriert und autoklaviert. Nach abschließender

Testung auf Sterilität und Pyrogenfreiheit wurden sie zur Injektion für in vivo-

Kinetikuntersuchungen verwendet. In Abbildung 12 ist die Strukturformel von (5,5,5,-2H3- L- Leuzin) dargestellt.


Abbildung 12: Strukturformel der Traceraminosäure von [5,5,5-2H3]-L- Leuzin. Die

Sterne markieren die Positionen, an denen die Wasserstoffatome des Leuzins gegen

Deuterium ausgetauscht sind.

2.3.3 Studienprotokoll und Durchführung der in vivo- Kinetikuntersuchungen

Etwa 6 Wochen vor Studienbeginn wurden bei den Patienten, die unter Lipidsenker-

Therapie standen, alle lipidsenkenden Medikamente abgesetzt („wash out Phase“). Des

Weiteren wurden die Patienten angewiesen, 3 Tage vor dem Studientag eine Diät in

Form einer isokalorischen Standardkost einzuhalten. Diese Standardkost enthielt 30

kcal pro kg und setzte sich zusammen aus 20% Eiweiß, 30% Fett, 50% Kohlenhydraten

und max. 300 mg Cholesterin pro Tag. Am Studientag erschienen die Patienten

nüchtern (nach 10- stündiger Nahrungskarenz). Der Studientag selbst verlief unter

Fastenbedingungen, wobei es jedoch erlaubt war, Trinkwasser in beliebiger Menge zu

konsumieren. Die Probanden erhielten in jede Ellenbeuge eine Venenverweilkanüle.

Über den ersten Zugang erfolgte die Tracerapplikation, über den zweiten die

zahlreichen Blutentnahmen. Zu Studienbeginn gegen 8:00 Uhr erhielten die Probanden

eine Bolus- Injektion von 10µmol (5,5,5- D3)- L- Leucin/kg Körpergewicht (KG),

gefolgt von einer konstanten Infusion mittels Infusomat von 10 µmol/kg KG des

Tracers (Cohn et al. 1990; Schaefer et al. 1990). Während der gesamten Studiendauer

von 12 Std. erfolgten nach einem festen Zeitschema insgesamt 18 Blutentnahmen von

jeweils 20 ml EDTA- Blut/Zeitpunkt. Die erste Blutentnahme erfolgte zum Zeitpunk t=

C

C

CH 2

CHH 3C

C

O O

D *

D *D *

-

HH 3N +


0 (vor Bolusgabe), anschließend erfolgten nach Bolus-Gabe und konstanter

Tracerapplikation weitere Blutentnahmen zu den Zeitpunkten: t= 10, 20, 30, 40, 60, 90

Min., und ab Zeitpunkt t=120 Min. beginnend, wurde jeweils stündlich Blut

entnommen.

2.3.4 Gewinnung des Plasmas für die nachfolgenden Experimente

Es wurden pro Zeitpunkt jeweils zwei 10 ml EDTA- Monovetten (mit Kalium EDTA

zur Gerinnungshemmung, Fa. Sarstedt, Nümbrecht) entnommen und diese für 20 Min.

bei 40C und 4000 rpm in einem Laborfuge- Modell GL (Fa. Heraeus, Hanau)

abzentrifugiert. Der Plasmaüberstand wurde vorsichtig mit einer Pasteur- Pipette

abgenommen und in 15 ml Plastikröhrchen (Fa. Sarstedt, Nümbrecht) überführt. Um

eine vorzeitige Degradation der Apolipoproteine zu vermeiden, wurde dem Plasma der

folgende Konservator nach Alaupovic (1µl/ml Plasma) zugesetzt (Alaupovic et al.

1972) :

Alaupovic- Konservator:

Gluthation (reduziert): 5,0 g

EDTA: 2,5 g

- Aminocapronsäure (13,0 g in 90 ml H20 bidest.): 90 ml

Chloramphenicol: (0,2 g in 10 ml Ethanol p.A) 10 ml

Vgesamt: 100 ml

Für die weiterführenden Experimente wurden von jeder Plasma-Probe 1ml zur

Bestimmung der Konzentrationen von Cholesterin, Triglyzeriden, ApoA-I und ApoB-

100 entnommen und in 1ml Eppendorfgefäße überführt. Weitere 750µl- Probe wurde

zur Isolierung der freien Plasmaaminosäuren entnommen. Zur Aufarbeitung der

Lipoproteinfraktionen mittels Ultrazentrifugation wurden 6 ml jeder Probe benötigt, das

restliche Plasma wurde bei -200C eingefroren und der Zellunterstand (buffy coat) für die

molekularbiologischen Untersuchungen verwendet.

2.3.5 Isolierung der freien Plasmaaminosäuren

Für die Berechnung der Kinetik ist wesentlich, dass auf Aminosäure-Ebene ein Steady

State besteht. Hierzu müssen die freien Aminosäuren aus dem Plasma isoliert werden,

um sie anschließend einer Bestimmung mittels Gaschromatografie und


Massenspektrometrie (siehe Punkt 3.8 Ergebnisse dieser Arbeit) zuzuführen. Zu diesem

Zweck wurden jeweils 750µl des Probenplasmas mit 1,5 ml 50%iger Essigsäure

gründlich gemischt und anschließend über Kationenaustauschersäulen (siehe Punkt

2.3.21) gegeben. Die so gewonnenen Proben wurden dann- wie unter Punkt 2.3.22

näher beschrieben- derivatisiert. Die quantitative Bestimmung der Isotopenanreicherung

erfolgte schließlich mit Hilfe der Gaschromatographie und Massenspektrometrie (siehe

Punkt 2.3.23).

2.3.6 Isolierung der einzelnen Lipoproteinfraktionen mittels sequentieller

Ultrazentrifugation

Die sequentielle präparative Ultrazentrifugation ermöglicht die Auftrennung der

einzelnen Lipoproteinfraktionen in mehreren aufeinander folgenden

Zentrifugationsschritten (Gofman et al. 1949; Havel et al. 1955). Das Prinzip basiert auf

den unterschiedlichen Fluktuations- und Sedimentationseigenschaften der

verschiedenen Plasmabestandteile im Schwerefeld der Zentrifuge. Die Plasmaproteine

mit der geringsten Dichte flottieren nach oben und können so nach jedem

Zentrifugationsschritt aus dem Überstand entnommen werden. Der Unterstand wird im

darauf folgenden Schritt mit einer vorgeschriebenen Menge Dichtelösung auf den

Dichtebereich der nächstfolgenden Lipoproteinfraktion gebracht, und es wird erneut

zentrifugiert, sodass schrittweise die verschiedenen Lipoproteinklassen nacheinander

isoliert werden können. In Tabelle 9 sind die verschiedenen Dichtefraktionen der

Lipoproteine aufgeführt:

Tabelle 9: Dichtefraktionen der Lipoproteine.

Lipoproteinfraktionen Dichtebereich in g/ml

Chylomikronen ,VLDL < 1,006

IDL 1,006-1,019

LDL 1,019-1,063

HDL 1,063-1,210

2.3.7 Dichtelösungen und Zentrifugationsbedingungen zur Isolierung der

Lipoproteine


Alle Zentrifugationen wurden in einer Ultrazentrifuge Modell L8- 55M mit einem 50.4

Ti.- Rotor (Fa. Beckmann, USA) unter Hochvakuum durchgeführt. Als

Zentrifugationsgefäße dienten Quickseal- Röhrchen (Beckmann Quickseal System),

welche in Kombination mit der entsprechenden Schneidevorrichtung („Tube Slicer“)

benutzt wurden. Die Zentrifugationsbedingungen zur Isolierung der einzelnen

Lipoproteinfraktionen sind in Tabelle 10 dargestellt. Es wurden folgende

Dichtelösungen verwendet:

KBr- Stammlösung: (d=1,350 g/ml)

0,9% NaCl- Lösung: (d=1,006 g/ml)

KBr- Dichtelösung I: (d=1,019 g/ml)

KBr- Dichtelösung II: (d=1,063 g/ml)

KBr- Dichtelösung III: (d=1,210 g/ml)

Tabelle 10: Zentrifugationsbedingungen zur Isolierung der Lipoproteinfraktionen.

Lipoproteinfraktion Laufzeit/h Umdrehungszahl/min Temp/OC

VLDL 18 49000 4

IDL 18 49000 4

LDL 24 49000 4

HDL 48 49000 4

2.3.8 Isolierung der VLDL- Fraktion

Die Quickseal Zentrifugenröhrchen wurden mit einer Spritzennadel (Microlance 2,19 G

1,5, USA) mit exakt 6 ml Plasma befüllt und mit Hilfe von Metallkappen mit dem

Quickseal Tube Sealer (Fa.Beckmann,USA) zugeschweißt. Die Röhrchen wurden

anschließend in den auf 40C vorgekühlten Festwinkelrotor 50.3 Ti. (Fa.Beckmann,USA)

symetrisch eingesetzt und mittels Quickseal tube spacers (Fa.Beckmann,USA)

stabilisiert. Der Rotor wurde fest verschlossen und die Proben nach den in Tabelle 10

angegebenen Bedingungen zentrifugiert. Nach der Zentrifugation wurden die Röhrchen

vorsichtig (ohne Erschütterung) mit einer Pinzette aus dem Rotor entnommen und der

Überstand mittels einer Schneidevorrichtung vom farblich klar unterscheidbaren

Unterstand getrennt. Das Volumen des gewonnenen VLDL- Überstandes wurde in 15

ml Röhrchen (Fa. Sarstedt, Nümbrecht) überführt und mit Dichtelösung d=1,006 g/ml


wieder auf ein Volumen von 6 ml gebracht. Von diesem Ansatz wurden 500µl

entnommen und zur Bestimmung von Apolipoproteinen, Cholesterin und Triglyzeriden

verwendet. Das übrige Material wurde bis zur weiteren Bearbeitung bei 4 °C

aufbewahrt. Der gewonnene Unterstand wurde zur IDL- Isolierung eingesetzt.

2.3.9 Isolierung der IDL- Fraktion

Der VLDL- Unterstand wurde mit einer Spritzennadel aus der unteren Hälfte des

Röhrchens entnommen und das Röhrchen mit Kaliumbromid- Dichtelösung d=1,006

g/ml gespült. Sowohl Spüllösung als auch Unterstand wurden in neue

Zentrifugenröhrchen überführt, und das Volumen wurde durch Zugabe von

Dichtelösung d=1,006 g/ml auf 5 ml gebracht. Zum Dichtewechsel VLDL nach IDL

(d=1,019 g/ml) wurde zu den Proben 188,6µl Kaliumbromid- Stammlösung (d=1,35)

zugegeben. Die Proben wurden gemischt mit Dichtelösung d=1,019 g/ml, wiederum auf

ein Volumen von 6 ml aufgefüllt, anschließend verschweißt, in den Rotor gestellt und

unter den in Tabelle 10. angegebenen Bedingungen zentrifugiert. Nach Zentrifugation

wurde der visuell unterscheidbare Überstand wiederum geschnitten, mit Spritze und

Kanüle sorgfältig nach Nachspülen mit Dichtelösung d=1,019 g/ml in ein 15 ml

Röhrchen überführt und auf ein Volumen von 6 ml aufgefüllt. Von diesem Ansatz

wurden wie bei der VLDL- Fraktion 500µl entnommen und zur Bestimmung von

Apolipoproteinen, Cholesterin und Triglyzeriden verwendet, der Rest wurde bis zur

weiteren Bearbeitung bei 40C aufbewahrt. Aus dem Unterstand erfolgte die Gewinnung

der LDL- Fraktion.

2.3.10 Isolierung der LDL- Fraktion

Der IDL- Unterstand wurde wie bei der VLDL- Fraktion durch Spülen mit

Kaliumbromid- Dichtelösung d=1,019 g/ml gewonnen und auf ein Volumen von 5 ml

aufgefüllt. Nach Überführung in ein neues Zentrifugenröhrchen wurde die Dichte durch

Zugabe von 740,8µl KBr- Stammlösung (d=1,35 g/ml) auf die Dichte der LDL von

d=1,063 g/ml eingestellt und mit Dichtelösung d=1,063 g/ml auf 6 ml aufgefüllt.

Anschließend erfolgte die Zentrifugation zur Gewinnung der LDL- Fraktion. Nach

Zentrifugation wurden Über- und Unterstand mittels Schneidevorrichtung voneinander

getrennt, der Überstand nach Entnahme von 500µl Probe zur Cholesterin-, Triglyzerid-

und Apolipoproteinbestimmung bei 40C gelagert und der Unterstand zur HDL-

Isolierung weiter verwendet.


2.3.11 Isolierung der HDL- Fraktion

Im letzten Zentrifugationsschritt erfolgte die Isolierung der HDL- Fraktion. Hierbei

wurde der LDL- Unterstand in ein neues Zentrifugenröhrchen überführt, und es wurde

mit Kaliumbromid- Dichtelösung d=1,063 g/ml auf ein Volumen von 5 ml aufgefüllt.

Nach Zugabe von 1,18 g Kaliumbromid wurden die Röhrchen verschlossen, das

Kaliumbromid durch Schütteln in Lösung und die Probendichte hierdurch auf d=1,21

g/ml gebracht. Anschließend wurden die Proben mit Dichtelösung d=1,21 g/ml auf ein

Volumen von 6 ml gebracht, in Quickseal- Röhrchen überführt, und es erfolgte die

Zentrifugation zur Gewinnung der HDL- Fraktion. Nach Zentrifugation wurden Über-

und Unterstand durch Schneiden von einander getrennt und mit Dichtelösung d=1,21

g/ml auf ein Volumen von jeweils 5 ml gebracht. Aus dem HDL- Überstand wurden

500µl zur Bestimmung von Apo A-I und HDL- Cholesterin entnommen und der Rest

der Probe bis zur weiteren Aufarbeitung bei 40C gelagert. Der Unterstand wurde bei -

200C tief gefroren.

2.3.12 Lipidologische Labordiagnostik

Bestimmung von Gesamtcholesterin, HDL- Cholesterin und Triglyzeriden

Die Quantifizierung der Plasmakonzentrationen von Gesamtcholesterin, HDL-

Cholesterin und Triglyzeriden erfolgte durch kommerziell erhältliche enzymatische

Assays (Fa. Roche, Mannheim). Es wurde die CHO- PAD- Methode (Aufenanger et al.

1988) zur Cholesterin- Messung und die GPO- PAP- Methode für die

Triglyzeridbestimmungen verwendet (Zoppi 1985). Zur Ermittlung der Plasma-

Cholesterinkonzentration wurden jeweils 10µl Probandenserum eingesetzt. Die

Cholesterinbestimmung aus den UZ- isolierten Lipoproteinfraktionen erfolgte aus

jeweils 100µl der VLDL und IDL- Fraktionen und je 20µl der LDL und HDL-

Fraktionen. Zur Triglyzeridbestimmung betrug das eingesetzte Probenvolumen 10µl für

das Serum, 50µl für die VLDL- Fraktionen und jeweils 100µl für die IDL-, LDL- und

HDL- Fraktionen.

Messung der Apolipoproteine Apo A-I, Apo B, Apo E und Lp(a) durch

Nephelometrie

Die Nephelometrie ist ein immunologisches Verfahren zur Protein- Quantifizierung.

Hierbei bilden sich spezifische, gegen das zu quantifizierende Protein gerichtete,

Antisera, Antigen- Antikörper- Komplexe in der Probe aus, durch die anschließend ein


geschickter Lichtstrahl gestreut wird. Die Intensität des Streulichts wird von einem

Photodetektor erfasst und gegen einen Referenz-Standard quantifiziert. Die

quantitativen Bestimmungen von Apolipoprotein A-I und Apolipoprotein B-100 wurden

mit einem Behring Nephelometer Modell- 100 (Fa.Behring, Marburg) bestimmt.

Hierfür wurden die entsprechenden Testschemata (Siedel et al. 1988) sowie die

entsprechenden kommerziell erhältlichen Antisera, Standards, Kontrollen und Puffer der

Fa. Behring eingesetzt. Es wurde 200µl Probenvolumen eingesetzt. Gegen eine mit

bekanntem Proteingehalt generierte Eichgerade ermittelte das Gerät vollautomatisch den

Apo A-I- Gehalt der Serum- und HDL- Proben sowie den ApoB- 100- Gehalt der

Serum-, VLDL-, IDL- und LDL- Proben. Die Bestimmung der Lipoprotein (a)-

Konzentration erfolgte analog. Hierfür wurden die entsprechenden Testschemata sowie

kommerziell erhältliche Antisera, Standards, Kontrollen und Puffer der Fa. Behring

eingesetzt (N- Latex Lp(a) Reagenz, N Lp(a) Kontrolle SY, N Lp(a) Standard SY, Fa.

Behring, Marburg). Mit dem Test können Lp(a)- Konzentrationen zwischen 10 bis etwa

160 mg/dl gemessen werden.

2.3.13 Entsalzung von Proteinproben mittels Dialyse

Durch die verwendeten KBr- Dichtelösungen bei den Ultrazentrifugationsschritten

steigt der Salzgehalt in den Proben so hoch an, dass eine saubere Proteinauftrennung in

der Gelelektrophorese nicht mehr gewährleistet ist. Daher wurden die Proben vor der

weiteren Aufarbeitung gegen eine Ammoniumhydrogencarbonat-Lösung dialysiert. Das

Prinzip der Dialyse besteht in einem Konzentrationsgefälle zwischen zwei durch eine

semipermeable Membran getrennte Räume. Abhängig von der Porengröße der

Membran (cut off) können kleinere Teile einer Lösung durch die Membran hindurch

diffundieren, während größere Moleküle (Proteine, DNA) in den Dialyseschläuchen

zurück gehalten werden. Zur Entsalzung wurden die isolierten Lipoproteinfraktionen in

Dialyseschläuche (Spectra/Por, molecular weight cut off 6000-8000, Durchmesser 14,6

mm, Fa. Serva, Heidelberg) eingefüllt und mit Klemmen (Spectra/Por Closures, Fa.

Spectrum medical industries,USA) verschlossen. Jeweils zehn dieser Schläuche wurden

in ein Plastik- Bechergefäß gehängt, das mit 5 l einer 10 mM

Ammoniumhydrogencarbonat- Lösung gefüllt war. Die Dialyse erfolgte über einen

Zeitraum von 24 Std. unter ständiger Durchmischung mittels eines Magnetrührers bei

einer Temperatur von 40C in einem Kühlraum. Insgesamt wurde die


Ammoniumhydrogencarbonat- Lösung während dieser Zeit dreimal gewechselt, um ein

ständiges Konzentrationsgefälle zu gewährleisten. Nach der Dialyse wurden die Proben

mit Einweg- Plastik- Pasteur- Pipetten in 15 ml Röhrchen (Fa. Sarstedt, Nümbrecht)

überführt und zur weiteren Bearbeitung bei 40C gelagert oder für eine spätere

Aufarbeitung bei -200C eingefroren.

Dialyse- Stammlösung:

1M Ammoniumhydrogencarbonat: 79,06 g


Dialyse- Lösung:

Dialyse-Stammlösung: 50 ml

H2O (bidest.): 4950 ml

Vgesamt: 5000 ml

2.3.14 Delipidierung von isolierten Lipoproteinfraktionen

Durch den extrem hohen Lipidanteil in den isolierten Proben wird die

Proteinauftrennung mittels Gelelektrophorese empfindlich gestört. Es kommt durch die

Lipide zur Ausbildung eines Lipidfilms im Gel („lipid smearing“) und damit verbunden

zu einer veränderten Mobilität der Proteine in der SDS- Gelelektrophorese. Um dieses

zu verhindern, muss das Delipidierungsverfahren eine vollständige Elimination der

Lipide bei maximaler Schonung der Apolipoproteine gegen die verwendeten

denaturierenden Substanzen gewährleisten. Nach der Delipidierung werden die Proben

in SDS- Probenpuffer aufgenommen. Hier ist darauf zu achten, dass sich die Proben

vollständig im Probenpuffer auflösen, da vor allem bei den extrem großen ApoB-

Molekülen eine starke Tendenz zur Konglomeratbildung besteht. Zur Delipidierung

wurden folgende Lösungen verwendet:

Ethanol/Ether- Gemisch (3:1):

Ethanol p.A: 300 ml

Diethylether p.A 100 ml

V gesamt: 400 ml


Delipidierung von VLDL

Aufgrund des relativ geringen Proteingehalts der VLDL- Fraktion mussten im

Vergleich zu den anderen Fraktionen größere Volumina verwendet werden. Hierzu

wurden jeweils 3,5 ml der dialysierten VLDL- Proben in 4,5 ml Polypropylen-

Spitzröhrchen (Fa. Sarstedt, Nümbrecht) gefüllt und für 12 Stunden unter schonenden

Bedingungen (Programm „drying rate low“) in einer Speed- Vac ankonzentriert. Die

Speed- Vac ist eine Tischzentrifuge mit integriertem Heizblock, an die eine

Vakuumpumpe angeschlossen ist (Speed Vac, bestehend aus: Konzentrator Speed- Vac

SVC 100, Rotor RH 24-18, Kühlfalle „Refridgerated Condensation Trap“ RT 100,

Drehschieber Vakuumpumpe vaccubrand Typ RD 4, Fa. Brand, Reutlingen). Das

VLDL- Probenvolumen wurde auf ca. 1 ml eingeengt und anschließend mit 3 ml eines

Ethanol/Ether- Gemischs (Volumenverhältnis Ethanol/Diethylether 3:1) gemischt und

bei -200C für 18 Stunden inkubiert. Danach wurden die Proben bei 40C und 4000 rpm

für 20 Min. abzentrifugiert (Laborfuge GL, Fa. Heraeus Christ) und der Überstand

vorsichtig mit einer Wasserstrahlpumpe auf ein Restvolumen von ca. 0,5 ml abgesaugt.

Das VLDL- Pellet im Probenröhrchen wurde daraufhin in einem Kältebad aus Methanol

und Trockeneis mit einem Homogenisatorstempel zerkleinert. Anschließend erfolgte ein

weiterer Delipidierungsschritt, bei dem das zerkleinerte Pellet mit 3,5 ml Ethanol/Ether

gemischt wurde und für 1 Stunde bei -200C inkubiert wurde. Nach erneuter

Zentrifugation und Absaugen des Überstandes wurde das Pellet abermals im Kältebad

zerkleinert. Zur vollständigen Delipidierung wurde das VLDL- Pellet mit 3 ml

Diethylether gemischt und nochmals für eine Stunde bei -200C inkubiert. Danach wurde

erneut zentrifugiert, der Überstand komplett abgesaugt und das Pellet in 170µl SDS-

Probenpuffer gelöst. Um ein Aufsteigen der Proben aus den Geltaschen zu vermeiden,

wurde der noch in der Probe verbliebene Ether durch eine 20- minütige Begasung mit

Stickstoff entfernt. Die Proben wurden im nachfolgenden Schritt in der SDS-

Gelelektrophorese aufgetrennt.

Delipidierung von IDL

Die Delipidierung sowie die weitere Bearbeitung der IDL- Fraktionen entspricht der

Vorgehensweise der unten beschriebenen LDL- Aufarbeitung.


Delipidierung von LDL

Der hohe Gehalt an hochmolekularem Apolipoprotein B-100 gestaltet die LDL-

Delipidierung schwieriger als die der anderen isolierten Lipoprotein- Partikel.

Besonders bei Proben, die über einen längeren Zeitraum bei -200C tiefgefroren waren,

kann es problematisch werden, das hochmolekulare ApoB- 100 durch Delipidierung mit

Ethanol/Ether wieder in Lösung zu bringen. Eine möglichst zeitnahe Delipidierung der

isolierten LDL ist daher von Bedeutung. Da die LDL einen höheren

Apolipoproteingehalt haben als VLDL, wurden für die Delipidierung 0,5 ml der

dialysierten LDL- Proben verwendet. Die Proben wurden in 4,5 ml

Polypropylenröhrchen überführt und 3.5 ml Ethanol/Ether hinzugegeben. Die Proben

wurden analog zur VLDL- Aufarbeitung bei -200C inkubiert, abzentrifugiert, der

Überstand mit der Wasserstrahlpumpe abgesaugt und dann das Pellet mit dem

Homogenisatorstempel zerkleinert. Dieser Delipidierung- Schritt wurde zweimal

wiederholt. Danach wurde das Pellet in 3 ml Diethylether aufgenommen, für eine

Stunde bei -200C inkubiert, abzentrifugiert, der Überstand abgesaugt und das Pellet

zerkleinert. Die Probe wurde daraufhin in 170µl SDS- Probenpuffer aufgenommen und

zur Entfernung des noch verbliebenen Ethers für 20 Min. mit Stickstoff bedampft.

Delipidierung von HDL

Zur Delipidierung der HDL- Proben wurde jeweils 1 ml der dialysierten HDL-

Fraktionen verwendet. Im Vergleich zur LDL- Aufarbeitung ist nur ein Delipidierungs-

Schritt mit einer Inkubation bei -200C über Nacht für eine saubere Proteinauftrennung

in der SDS- Gelelektrophorese erforderlich. Ansonsten war der Ablauf identisch mit

dem Protokoll der LDL- Isolierung .

2.3.15 Bestimmung der Proteinkonzentration nach Bradford

Die Proteinkonzentration in Lösung wurde durch die Bradford- Methode bestimmt

(Bradford 1976). Die Messung basiert auf der Absorptionsänderung des gebundenen

Farbstoffes Coomassie- Brilliant- Blau bei einer Wellenlänge von = 595nm im

Vergleich zum ungebundenen Farbstoff, in Abhängigkeit zur Proteinkonzentration. Der

Farbstoff bindet dabei an basische (Ausnahme Arginin) und aromatische

Aminosäurereste. Als Referenz der gemessenen Proteinkonzentration der Probe diente

die Eichkurve eines Standardproteins, in aller Regel BSA verschiedener bekannter

Konzentrationen (1, 2, 5, 10, 20 und 30µg). Zur Bestimmung der Proteinkonzentration


wurde eine im Handel erhältliche, konzentrierte Bradford- Reagenzlösung (Fa.BioRad,

München) 1:5 mit 0,9% NaCl- Lösung verdünnt. Jeweils 1 ml dieser verdünnten

Farbstofflösung wurde mit 20µl der Proteinprobe unbekannter Konzentration vermischt

und die optische Dichte bei der Wellenlänge

Messwert wurde anschließend mit den Daten der Eichkurve verglichen und über diese

die Proteinkonzentration ermittelt.

2.3.16 SDS- Polyacrylamid- Gelelektrophorese (SDS- PAGE)

Die elektrophoretische Auftrennung von Proteinen erfolgte unter denaturierenden

Bedingungen durch die diskontinuierliche, eindimensionale SDS- Polyacrylamid- Gel-

elektrophorese nach Laemmli (Laemmli 1970). Polyacrylamid als Trägermedium besitzt

den Vorteil, dass es chemisch inert ist und zudem die Porengröße des Gels durch

unterschiedliche Konzentrationen von Acrylamid und Bisacrylamid leicht variiert

werden kann. Durch Zusatz von SDS zum Proteingemisch werden praktisch alle

nichtkovalenten Wechselwirkungen in den nativen Proteinen zerstört. Ferner wird ein

SDS/Protein- Komplex gebildet, dessen stark negative Ladung dem Molekulargewicht

des Proteins ungefähr proportional ist. Die Wanderungsgeschwindigkeit in SDS-

haltigen Gelen ist somit alleine durch das Molekulargewicht eines unmodifizierten

Proteins und durch den Vernetzungsgrad des Gels bestimmt. Zur Aufarbeitung der UZ-

isolierten Lipoproteinfraktionen aus den in vivo- Kinetik-Untersuchungen wurden für

präparative Zwecke spezielle SDS- Gradientengele verwendet, die eine optimale

Auftrennung der Lipoproteine über einen breiten Molekulargewichtsbereich

ermöglichen. Die Elektrophorese für präparative Zwecke erfolgte in einem “Protean II

xi Vertical- Electrophoresis System“ (Fa. BioRad, München) in 20 x 15cm x 1,5mm

Gelen. Für analytische Zwecke wurden die Proteine entsprechend in SDS- Mini-

Gradientengelen in einer Mini- Gelapparatur (Fa. BioRad, München) aufgetrennt.

Herstellung der SDS- Gele und benötigte Gellösungen

Für die Herstellung der SDS- Gele wurden die Polyacrylamid- Gellösungen zwischen

zwei durch Sandwichklammern zusammengehaltene, auf einer Gummidichtung

stehende Glasplatten, eingefüllt. Die Zusammensetzung der verschiedenen Gellösungen

für die SDS- Gradientengelelektrophorese (zur Herstellung von zwei Gradientengelen)

war wie folgt:


3,5% Vorlaufgel:

45% Acrylamid: 1,4 ml

1,6% Bisacrylamid: 1,4 ml

0,5M Tris/HCl (pH 6,8): 5,0 ml

4% SDS- Lösung: 1,0 ml

H2O (bidest.): 10,8 ml

TEMED: 30,0 µl

0,56% APS: 1,4 ml

5% Trenngel I:



1,5M Tris/HCl (pH 8,8): 7,0 ml



TEMED: 50,0 µl

0,56% APS: 2,1 ml.

15% Trenngel II:



1,5M Tris/HCl (pH 8,8): 15,0 ml



TEMED: 80,0 µl

0,56% APS: 3,2 ml

Zum Herstellen der Gele wurde die 15%ige Gellösung bis zu einer Höhe von 9 cm in

die Kammern gefüllt und anschließend vorsichtig mit 5%iger Gellösung bis zu einer

Höhe von ca. 12,5 cm überschichtet, sodass sich an der Übergangszone ein

Dichtegradient bildete. Die Gellösungen wurden mit H2O (bidest.) überschichtet, um

eine saubere obere Gelabschlussgrenze herzustellen. Nach einer Polymerisationszeit


von 45 Minuten wurde das Wasser vollständig entfernt und das Trenngel mit

Sammelgel (3,5%) überschichtet. In das Sammelgel wurde der Probenkamm

eingebracht und nach Polymerisation wieder entfernt. Die Probentaschen wurden mit

H2O (bidest.) gespült, um noch nicht polymerisierte Lösungsreste zu entfernen.

Gelelektrophorese der aufgearbeiteten Protein- Proben

Die Elektrophoresekammer wurde mit 4 l auf 40C vorgekühlten 1x SDS- Laufpuffer

gefüllt und die Gelkammer eingesetzt. Anschließend wurde das Gel mit jeweils 150µl

Protein- Probe (in SDS- Probenauftrags- Puffer) beladen. Alle Luftblasen, welche den

Gellauf negativ beeinflussen könnten, wurden entfernt. Zur genauen Lokalisation der

Proteinbanden wurde auf jedes Gel ein Protein- Standard (Broad- Range- Standard, Fa

BioRad, München) aufgetragen. Zusätzlich wurden zur Identifizierung der relevanten

Proteine aus den VLDL und HDL- Fraktionen Apolipoprotein- Standards (ApoA-I/

ApoE- Standard, Fa. Calbiochem, Darmstadt) aufgetragen. Anschließend erfolgte die

Elektrophorese bei einer konstanten Spannung von 600V und einer Stromstärke von

60mA über einen Zeitraum von 15 Stunden.

1x SDS- Laufpuffer:

Tris: 30,0 g

Glycin: 144,0 g

SDS: 5,0 g

H2O (bidest.): auf 5000 ml.

1x SDS- Probenauftrags- Puffer:

0,5 M Tris (pH 6.8): 6,0 ml

SDS (4%): 7,0 ml

Glycerin (89%): 8,4 ml

DTT: 0,3 g

Bromphenolblau: 0,03 g



2.3.17 Coomassie- Blau- Färbung von Proteingelen

Zur Anfärbung der durch Polyacrylamid- Gelelektrophorese aufgetrennten Proteine

wurde das Verfahren der Coomassie- Blau- Färbung angewendet. Das Polyacrylamidgel

wurde hierzu etwa 60 Min. bei RT auf einem Tischschüttler bei 60 Upm in Färbelösung

geschwenkt, anschließend die Färbelösung entfernt und das Gel mit mit H2O (bidest.)

gespült. Zur Visualisierung der Proteinbanden wurde das Gel jeweils 3 Mal für 15 Min.

in Entfärbelösung inkubiert.

Färbelösung:

Methanol p.A: 500 ml

Essigsäure (100 %) 50 ml

Coomassie- Blau R- 250: 1,0 g


Entfärbelösung:

Ethanol p.A: 1250 ml

Essigsäure (100%): 500 ml


2.3.18 Immunblot von Proteinen

Zum Nachweis von auf Träger- Membranen immobilisierten Proteinen mit spezifischen

Antikörpern, wurden Immunblot- Experimente durchgeführt. Hierzu wurden die

Proteine zunächst in 8% oder 10%- igen SDS- Polyacrylamidgelen in einer Mini-

Gelapparatur (Fa. BioRad, München) aufgetrennt und anschließend auf eine Membran

übertragen. Als Trägermaterial wurde eine PVDF- Membran (Immobilon P, Fa.

Millipore, Bad Nauheim) verwendet. Zum Transfer der Proteine wurde die elektrische

Ladung der SDS- denaturierten Proteine genutzt (Elektro- Blot). Die Gele wurden

zunächst für 15 Min. in Kathodenpuffer (25mM Tris- HCl; pH 9,4, 40mM Glycin, 20%

(v/v) Methanol) äquilibriert. Anschließend wurden jeweils 2 Blatt Whatman- Papier in

Anodenpuffer 1 (30mM Tris- HCl; pH 10,4, 10% (v/v) Methanol) und Anodenpuffer 2

(25mM Tris- HCl; pH 10,4, 10% (v/v) Methanol) getränkt. Die Membran wurde für 15

Sek. mit Methanol benetzt, danach für 2 Min. mit H2O gewaschen und anschließend für


5 Min. in Anodenpuffer 2 äquilibriert. Nach Äquilibrierung wurde der Blot

folgendermaßen in einer ,,Semidry“- Blot-Apparatur (Fa. Biometra, Bad Nauheim)

geschichtet: Anode: 2 Blatt Whatman getränkt mit Anodenpuffer 1 – 1 Blatt Whatman

getränkt mit Anodenpuffer 2 – Membran – Gel. Kathode: 3 Blatt Whatman getränkt mit

Kathodenpuffer. Innerhalb dieser Anordnung hatten Membran, Filterpapier und Gel

exakt die gleiche Größe, um Seitenströme zu verhindern. Der Transfer erfolgte bei

2,5mA/cm2 für 90 Min. Die Protein- Übertragung wurde durch reversible Färbung der

Membran mit verdünnter Ponceau- Rot- Lösung (Fa. Sigma, Taufkirchen) überprüft.

Alle nachfolgenden Schritte wurden in TBS- Lösungen durchgeführt. Zunächst wurden

freie Bindungskapazitäten mit 5% (w/v) Milchpulver für 60 Min. bei RT abgesättigt.

Die Inkubation mit dem ersten Antikörper erfolgte in TBS- Lösung für 1 Stunde bei RT

bzw. über Nacht bei 40C. Ungebundener Antikörper wurde durch 3- maliges Waschen

der Membran mit 0,5% (w/v) Milchpulver, 0,02% (v/v) Tween bei RT entfernt. Die

Detektion des ersten Antikörpers erfolgte mit einem gegen den ersten Antikörper

gerichteten, HRP- gekoppelten Sekundärantikörper. Nach 1 Stunde Inkubation bei RT

wurde der Blot 3 Mal mit PBS- Lösung gewaschen. Die Identifikation der vom

Antikörper erkannten Proteine erfolgte über die Umsetzung eines Substrates durch das

Enzym HRP (,,Horse Radish Peroxidase‘‘), wobei ein leuchtendes Produkt ,,enhanced

chemiluminescence‘‘(ECL) entsteht, das über Autoradiografie mit der ECL- Technik

der Fa. Millipore, Bad Nauheim, exakt nach den Angaben des Herstellers nachgewiesen

wurde.

Kathodenpuffer (pH 9,4):

Tris: 0,57 g

Glycin : 4,50 g



Anodenpuffer 1 (pH 10,4):

Tris: 0,57 g

Glycin : 4,50 g




Anodenpuffer 2 (pH 10,4):

Tris: 0,57 g

Glycin : 4,50 g



Blockingpuffer (pH 7,4,):

Tris: 0,57 g

NaCl : 4,50 g

Milchpulver: 2,50 g

Tween-20: 100 µl


2.3.19 Isolierung von Proteinbanden aus SDS- Gelen und Protein- Hydrolyse

Für die späteren Untersuchungen der Proteine durch Gaschromatografie- Quadrupolen-

Massenspektrometrie (GC/MS) war es erforderlich, die relevanten Proteinbanden aus

den gefärbten SDS- Gradientengelen zu isolieren. Vor dem Ausschneiden der

jeweiligen Banden wurde jedes Gel durch Einscannen mit einem Flachbett-Scanner in

digitaler Form dokumentiert.

Folgende Proteinbanden wurden isoliert:

• VLDL- Gele: ApoB- 100, ApoE

• LDL- Gele: ApoB- 100

• HDL- Gele: Apo A-I, Apo (a)

Die Proteinbanden wurden zu diesem Zweck mit Einmalskalpellen (Disposable Scalpel

sterile, Fa. Finnigan USA) aus den Gelen ausgeschnitten und in Glasröhrchen (Vials

Typ I mit Schraubverschluss und Teflondichtung, temperaturbeständig bis 1500C, Fa.

NeoLab, Heidelberg) überführt. Neben den relevanten Proteinbanden wurde zudem ein

proteinfreies Gelstück, welches als Leerwert (sog. „Blank“) diente, ausgeschnitten, um

mögliche Leucin- Kontaminationen der Gelmatrix in der späteren statistischen

Auswertung zu berücksichtigen. Danach wurden die Gelbanden für 24 Std. bei 600C im

Heizschrank getrocknet und in verschlossenen Glasröhrchen bei RT zwischen gelagert

oder direkt hydrolisiert.


Da die GC/MS- Einheit eine Auswertung hochmolekularer Eiweiße nicht erlaubt,

mussten die getrockneten Protein-Proben durch Hydrolyse in ihre einzelnen

Aminosäurebestandteile aufgespalten werden. Ein wesentlicher Vorteil einer Hydrolyse

des Proteins liegt im Sensitivitätsgewinn für die GC/MS, da die Traceranreicherung

(Ratio: markierte Aminosäure/nicht markierte Aminosäure) hierbei wesentlich höher ist

als in Relation zur Gesamtproteinmasse. Zur Aufspaltung der Peptidbindungen wurden

zu den getrockneten Protein- Banden jeweils 3 ml Hydrolyse- Lösung gegeben und die

Proben kurz mit Stickstoff bedampft, um den Sauerstoff zu entfernen. Die Glasröhrchen

(Vials Typ I mit Schraubverschluss und Teflondichtung, temperaturbeständig bis 1500C,

Fa. Neo Lab, Heidelberg), wurden anschließend sofort verschlossen und für 24 Std. bei

1100C im Heizblock inkubiert. Nach der Hydrolyse wurden die Proben aus dem

Heizblock genommen und bei RT abgekühlt. Danach wurde zum Entfernen der

verbliebenen Gelmatrix kurz abzentrifugiert und der Überstand mittels Einmalpipetten

in 5 ml Polypropylen- Röhrchen (Fa. Sarstedt, Nümbrecht) überführt und danach der

Salzsäureüberstand durch Eintrocknen in der Speed- Vac entfernt.

Hydrolyse- Lösung:

6 N HCl- Lösung: 999,5 ml

ß- Mercaptoethanol: 500,0 µl

V gesamt: 1000 ml.

2.3.20 Isolierung der Aminosäuren über Ionenaustauscherchromatografie

Um das Hydrolysat von noch verbliebenen Gelmatrix-Resten und anderen

Verunreinigungen zu befreien, wurden die hydrolysierten Proben über

Kationenaustauscherchromatografie aufgereinigt. Das Prinzip dieser Methode basiert

darauf, dass die Aminosäuren im sauren Milieu in Kationenform vorliegen und an die

negativ geladenen Sulfonsäuregruppen (R-SO3--) des Säulenmaterials binden können,

während neutrale und negativ geladene Moleküle nicht binden können (Wolfe 1984).

Das Eluieren der gebundenen Aminosäuren erfolgt dann im basischen Milieu durch

Spülung mit Ammoniaklösung. In diesem Milieu besitzen die Aminosäuren eine

negative Nettoladung und werden von den NH4- Ionen aus der Sulfonsäurebindung

verdrängt. Im Rahmen dieser Arbeit wurden kommerziell erhältliche


Ionenaustauschersäulen (Prefilled Poly- Prep Columns AG- 50W- X8, Fa. BioRad,

München) verwendet, die mit einer Kunstharz- Matrix gefüllt waren, an die

Sulfonsäurereste kovalent gekoppelt waren.

Kationenaustauscherchromatografie der hydrolisierten Proteine

Um eine durch das Säulenmaterial bedingte Kontamination auszuschließen, wurden

diese vor dem Probenauftrag vorbehandelt. Zu diesem Zweck wurden die Ausgänge der

Fertigsäulen geöffnet und die enthaltene Pufferlösung aus den Säulen heraus gelassen.

Anschließend wurden die Säulen mit 4 ml einer 8% Ammoniaklösung voreluiert,

danach mit 10 ml H2O (bidest.) durchgespült und schließlich mit 50% Essigsäure

wieder äquilibriert. Die hydrolysierten Proben wurden mit 3 ml einer 50%

Essigsäurelösung vollständig in Lösung gebracht und auf die Säulen aufgetragen.

Anschließend wurden die Säulen zuerst mit 10 ml H2O (bidest.) nachgespült und

schließlich die Aminosäuren von der Säulenmatrix mit 4 ml 8% Ammoniaklösung

eluiert. Das Eluat wurde in Glasröhrchen aufgefangen und diese bis zur weiteren

Aufarbeitung bei -200C eingefroren.

Kationenaustauscherchromatografie der freien Plasmaaminosäuren

Die Vorbehandlung der Säulen erfolgte wie oben beschrieben. Jeweils 700µl der freien

Plasmaaminosäuren wurden mit 1,4 ml 50% Essigsäure gemischt und über die

äquilibrierten Säulen gegeben. Die Elution von den Säulen erfolgte wie bei den

hydrolysierten Proben. Das Eluat wurde in Glasröhrchen bis zur weiteren Aufarbeitung

bei -20 0C eingefroren.

2.3.21 Derivatisierung der Aminosäuren für die GC/MS

Der Derivatisierungsprozess der Aminosäuren zu Heptafluorobuturylisopropylestern ist

die chemische Umwandlung der Aminosäuren in eine flüchtige und thermisch stabile

Form für die gaschromatografische und massenspektrometrische Detektion. Durch die

Umwandlung sind zudem Rückschlüsse auf funktionelle Gruppen, eine spezifische

Massenverschiebung und eine verbesserte Steuerung der Fragmentierungsrichtung

möglich. Das im Rahmen dieser Arbeit angewandte Derivatisierungsverfahren hat sich

bereits in mehreren Untersuchungen für die Aminosäuren Phenylalanin, Tyrosin

(MacKenzie und Tenaschuk 1974; Ford et al. 1985; Schweer et al. 1996; Schaefer et al.

1997), bewährt. Für die Derivatisierung der Aminosäuren wurde ein kommerziell

erhältlicher „Derivatisierungs- Kit“, bestehend aus: Heptafluoro- buttersäureanhydrid


(HFBA), Isobutanol und Acetyl- Chlorid (HFBA- IBA amino acid derivatization kit, Fa.

Alltech, USA.), verwendt. Zu diesem Zweck wurde unter Kühlung auf Eis durch

schrittweise Zugabe von 2,5 ml Acetyl- Chlorid zu 5 ml Isobutanol eine Isobutanol-

HCl- Lösung hergestellt. Die mit Ammoniaklösung eluierten Proben aus 2.2.19 wurden

in der Speed Vac lyophilisiert und anschließend mit 400µl Isobutanol- HCl- Lösung

versetzt und für 1 Std. bei 1100C im Heizblock inkubiert. Nach Abkühlen auf RT

wurden die Proben in der Speed Vac eingetrocknet und mit je 200µl Ethylacetat (99,8

%, Fa. Merck. Darmstadt) und 150µl HFBA gemischt und für 10 Min. bei 1500C im

Heizblock inkubiert. Nach erneutem Abkühlen wurden die Proben in der Speed Vac

lyophilisiert und daraufhin in definierten Mengen an Ethylacetat gelöst (VLDL 30µl,

IDL-, LDL-, HDL jeweils 50µl, freie Plasmaaminosäuren 100µl), die sich nach der

Konzentration der tracermarkierten Aminosäuren in den einzelnen

Lipoproteinfraktionen richteten. Die gelösten Proben wurden in speziell für die GC/MS-

Analytik vorgesehene Probengefäße (Combo- Pack, Fa. Ass- Chem, USA) überführt,

mit gummierten Metalldeckeln verschlossen und bis zur GC/MS- Analyse bei -200C

aufbewahrt.

2.3.22 Gaschromatografie / Massenspektrometrie (GC/MS)

Die Bestimmung der Isotopenanreicherung in den aufgearbeiteten Studienproben

erfolgte mittels kombinierter, gaschromatografischer/massenspektrometrischer Analyse

(GC/MS- MS) der Heptafluorobuturylisopropylester- Derivate der Aminosäuren

(Schweer et al. 1996). Da komplexe organische Substanzgemische durch ihr

massenspektrometrisches Verhalten nicht immer eindeutig zu unterscheiden sind,

erfolgte im ersten Schritt zuerst eine gaschromatografische (GC) Auftrennung. Im

zweiten Schritt erfolgte dann die Ionisierung der Zielionen in der Ionisationskammer

und deren massenspektrometrische Analyse mittels Triple- Stage- Quadrupole-

Massenspektrometrie (MS). Durch dieses extrem sensitive Verfahren ist es möglich,

selbst kleinste Traceranreicherungen zu bestimmen. Experimente mit

Verdünnungsreihen haben gezeigt, dass sich die markierte Aminosäure bis zu einer

Menge von 5-10pg/20ng unmarkierter Aminosäure nachweisen ließ (Schweer et al.

1996). Besonders Proteine mit einem sehr langsamen Turnover wie z.B. Apolipoprotein

A-I und ApoB- 100 (Fraktionelle Katabolismusrate (FCR) <1%) können mit diesem

Verfahren gut erfasst werden. Die Bezeichnung Tracer/Tracee beschreibt das Verhältnis


(markierte Aminosäure/unmarkierte Aminosäure) und wird vereinfacht auch als

Anreicherung bezeichnet. Die Vermessungen erfolgten mit einem Finnigan MAT TSQ

700 Gaschromatograf/Tandem-Massenspektrometer.

Gaschromatografie (GC)

Das Prinzip der Chromatografie basiert auf der Auftrennung eines Stoffgemisches (sog.

mobile Phase) durch unterschiedliche Absorption an ein Trägermaterial (sog. stationäre

Phase). In der Gaschromatografie liegt das aufzutrennende Stoffgemisch (mobile Phase)

im gasförmigen Zustand vor und wird mit Hilfe eines inerten Trägergases durch die

stationäre Phase geleitet. Diese besteht aus einem mit nicht flüchtiger Flüssigkeit

getränktem porösen Trägerstoff (Gas- Liquid- Chromatografie,GLC). Während des

Säulendurchlaufs verteilen sich die Probenbestandteile in einer für sie charakteristischen

Weise zwischen beiden Phasen, sodass es zu einer unterschiedlich schnellen Elution

kommt. Die Geschwindigkeit des Transports hängt hierbei von der Löslichkeit des

Gases in der Flüssigkeit ab (Adams 1974). Als Chromatografiesäulen dienten

Quarzkapillarsysteme mit einer Länge von bis zu 15 m, diese weisen eine sehr hohe

Sensitivität und Spezifität bei der Probentrennung auf. Als Trägergas wurde Helium

verwendet. Die Temperaturkontrolle der Säulen erfolgte über einen Ofen, welcher über

ein speziell auf die aufzutrennende Probe abgestimmtes Temperaturprotokoll das

Elutionsprofil festlegte. Zur Ermittlung der Anreicherung kamen hochsensitive

Flammenionisationsdetektoren oder Elektronen- Einfang- Detektoren zum Einsatz.

Über dieses Verfahren gelang eine Separation weitgehend reiner Einzelsubstanzen,

welche anschließend in der angeschlossenen Ionisationskammer durch

Elektronenbeschuss geladen und massenspektrometrisch analysiert wurden. Die

eingesetzte Menge an Probe (je nach Protein 0,5-2µl) wurde voll automatisch vom

Gerät mit einer Hamiltonspritze aus den Probengefäßen entnommen.


Tabelle 11: Charakteristika der verwendeten Gaschromatografie.

Merkmale Eigenschaften

Quarzkapillarsäule Länge 15 m,

Innendurchmesser 0,25 mm

Filmdicke 0,25 mm

(J&W- DB %, Fa. Analyt, Mühlheim)

Trägergas Helium

Gasdruck 70 kPa

Injektionstemperatur 2400C

Temperaturprogramm Anfangstemperatur 900C für 1 Min.

Erhöhung um 100C/Min. bis 1800C

Erhöhung um 300C/Min. bis 2800C

nach 2 Min. Abkühlen auf Ausgangstemperatur

Massenspektrometrie (MS)

Für die massenspektrometrische Analyse der gaschromatografisch aufgetrennten Proben

wurden die Proben zunächst ionisiert und anschließend in ein elektrischens Feld

geleitet. Hierbei ist das Verhalten der geladenen Teilchen im elektrischen Feld vom

Verhältnis Masse/Ladung (m/z) abhängig. Bei identischer Ladung der Teilchen erfolgt

eine Auftrennung entsprechend ihrer Masse.

Zur Anwendung kam ein Quadrupol- Tandem-Massenspektrometer, das aus folgenden

Komponenten aufgebaut war:

• Ionisierungskammer

• Trennvorrichtung (Quadrupole)

• Detektor

Ionisierungskammer

Die Applikation der Proben in die Ionisationskammer erfolgte über einen

drucktrennenden Gasseparator.

Die Ionisierung der Probenmoleküle kann entweder durch Elektronenbeschuss

(„Electron Impact“, „EI“) oder chemische Ionisierung („Chemical Ionisation“, „CI“)

erfolgen.

Bei der „EI“ erfolgt die Ionisierung der Moleküle durch einen von einer Glühelektrode

generierten hochenergetischen Elektronenstrahl. Die Elektronen reagieren hierbei unter


Ionenbildung mit den Probenmolekülen. Durch den hochenergetischen

Elektronenbeschuss entstehen Molekülfragmente aus dem Muttermolekül. Über diese

für jedes Molekül charakteristischen Fragmentierungsmuster können auch unbekannte

Moleküle mit Hilfe von Fragmentbibliotheken identifiziert werden. Es ist darüber

hinaus auch möglich, unspezifische Kontaminationen des Probenmaterials zu

identifizieren, indem man den gesamten Massenbereich der kontaminierten Proben

vermisst (sog. Full- Scan) und durch die Fragmentierungsmuster Rückschlüsse auf die

Quelle der Verunreinigung ziehen kann. Ein Nachteil dieses Verfahrens ist, dass durch

die ausgeprägte Fragmentierung ein Sensitivitätsverlust entstehen kann, da ein

schwaches Signal durch die Fragmentierung zu mehreren noch schwächeren Signalen

wird und letztlich einzelne Signale gar nicht mehr messbar sind.

Die Technik der „CI“ stellt das schonendere Verfahren dar. Hierbei werden ionisierende

Hilfsgase (z.B. Methan, Ammoniak) verwendet, die durch Ladungsaustausch oder

Ionen-Molekül-Reaktionen die zu untersuchenden Probenmoleküle in positiv („Positive

Ion Chemical Ionization, PICI) oder negativ („Negative Ion Chemical Ionization“,

NICI) geladene Ionen überführen. Ein wesentlicher Vorteil dieses Verfahrens im

Vergleich zur „EI“ ist der geringere Einsatz an Energiemengen und damit verbunden

eine minimale Fragmentierung der Probenmoleküle, was in einer Sensitivitätssteigerung

resultiert. Aufgrund dieser Vorteile wurde im Rahmen dieser wissenschaftlichen Arbeit

das „NICI“- Verfahren zur massenspektrometrischen Analyse verwendet (Garland et al.

1979; Wolfe 1984). Als Hilfsgas wurde Methan eingesetzt.

Trennvorrichtung (Quadrupole)

Als Analysator wurde ein Quadrupole- System benutzt, das aus vier in den Eckpunkten

eines Quadrats parallel zueinander angeordneten 20 cm langen Stabelektroden besteht,

die elektrisch miteinander verbunden sind. An diese Elektroden wird eine konstante

Gleichspannung angelegt, die von einem oszillierenden Wechselstromfeld überlagert

wird, woraus ein Hochfrequenzfeld resultiert, welches die aus der Ionenquelle

kommenden Ionen auf eine oszillierende Flugbahn zwischen den Stabelektronen

zwingt. Die elektromagnetischen Wechselfelder versetzen die Ionen dabei in eine

senkrecht zur Fortbewegungsrichtung stehende Schwingung. Durch diese

Flugbewegung können nur Ionen mit einem bestimmten Masse/Ladungs- Verhältnis

(m/z) die Quadrupole passieren, alle anderen prallen an den Stabelektroden ab und


werden eliminiert. Über eine Variation der Gleich- und Wechselstromfelder lassen sich

gezielt Ionen mit einem bestimmten Masse/Ladungs- Verhältnis (m/z) herausfiltern. Die

entsprechenden Parameter der relevanten Zielmoleküle dieser Arbeit waren für das

Mutterion des D3-markierten L- Leuzin m/z = 366 und für das Mutterion des

unmarkierten L- Leuzin m/z = 363.

Nach Durchlauf der ersten Quadrupole-Einheit wurden Ionen eines bestimmten m/z-

Verhältnisses in einer Argon- Kollisionszelle einer „Collision- Induced- Dissociation“

„CID“) unterzogen. Durch Kollision des Stoßgases Argon mit den beiden Mutterionen

kam es zur gemeinsamen Aufspaltung in Fragmentionen, in dieser Studie in

Fragmentionen mit einem m/z = 280,1.

Die entstandenen Fragmentionen wurden anschließend der zweiten Quadrupole- Einheit

zugeführt und dort über einen Detektor registriert. Die Zuordnung zum jeweiligen

Mutterion erfolgte anhand des Entstehungszeitpunktes der Peaks. Durch diesen zweiten

MS-Schritt wurde die Spezifität des Verfahrens verbessert. Kontaminationen mit

identischen m/z- Verhältnissen wie die der Zielionen, welche in der ersten Messung

noch miterfasst wurden, werden in der zweiten Messung aufgrund des unterschiedlichen

Fragmentierungsmusters eliminiert.

Detektor

Über einen Sekundärionenverfielfacher wurden die Ionenströme registriert und über

eine zusätzliche Verstärkung an einen Oszillographen weitergeleitet. Die Peaks wurden

anschließend mit Hilfe einer speziellen Computer- Software automatisch oder manuell

ausgewertet. In Tabelle 12 und Abbildung 13 sind die technischen Eigenschaften und

der Aufbau des Quadrupol- Tandem- Massenspektrometers aufgezeigt.

Tabelle 12: Charakteristika der Massenspektrometrieeinheit.

Merkmale Eigenschaften

Temperatur der Ionenquelle 1500C

Elektronenenergie 70 eV

Emissionsstromstärke 0,4 mA

Sekundärionenvervielfacher 1400 V

Gasdruck des Methans 50 Pa

Kollisionsgasdruck des Argons 0,2 Pa

Kollisionsenergie 10 eV


Abbildung 13: Aufbau der im Rahmen dieser Arbeit verwendeten Quadrupol- Tandem-

Massenspektrometrieeinheit.

2.3.23 Datenauswertung

Aus den Ergebnissen der GC/MS- Messungen wurden die Anreicherungen der

jeweiligen Proben ermittelt. Diese werden entweder vereinfacht als

Isotopenanreicherung E oder korrekter als Tracer/Tracee- Verhältnis angegeben

(Cobelli et al. 1987; Cobelli et al. 1992). Die Isotopenanreicherung E gibt die relative

Anreicherung des stabilen Isotopes über dem der natürlich vorkommenden

Anreicherung wieder. Die Anreicherung E ist definiert als:

E = q/(Q+q) – qN/(QN+qN)

Q ist definiert als Masse des unmarkierten Hauptisotopes (in diesem Falle 1H) und q als

Masse des Tracerisotopes (hier 3H). qN/(QN+qN) entspricht der natürlich

vorkommenden Isotopenanreicherung vor der Tracergabe (sog. „Natural Abundance“).

Bei der massen-spektrometrischen Bestimmung der Isotopenverhältnisse („Isotope

Ratio“) wird das Verhältnis (R) von Tracer zu Tracee üblicherweise angegeben als:

R = q/Q

So kann die obige Gleichung umgeformt werden in:

E = R/(1+R) – RN/(1+RN)

Cobelli et al. weisen darauf hin, dass bei Studien mit stabiler Isotopentechnik im

Vergleich zu Studien mit radioaktivem Tracermaterial verhältnismäßig viel Material in

das zu untersuchende System eingebracht wird (Cobelli et al. 1992). Mehrere


Arbeitsgruppen schlagen daher vor, die Isotopenanreicherung E durch das tatsächliche

Tracer/Tracee- Verhältnis zu ersetzen (Colby und McCaman 1979; Buckley et al. 1985).

Es gilt:

Tracermasse/Traceemasse = Z(t) = (QI(t)+qI(t))/(QN(t)+qN(t))

Das Verhältnis Z(t) von Tracer/Tracee kann unter Kenntnis der Isotopenanreicherung E

auch bestimmt werden durch:

Z(t) = E(t)/(EI-E(t)

EI entspricht dem infundiertem Tracermaterial über der natürlichen Anreicherung des

Tracers („Natural Abundance“). Für 3D- Leucin liegt diese bei ca. 99,5%. Obige

Gleichung wurde in dieser Studie zur Berechnung der Tracer/Tracee-Werte

(Anreicherung) verwendet.

Die Werte wurden für die in dieser Arbeit relevanten Apolipoproteine errechnet und

gegen die Zeit (t) aufgetragen. Mittels linearer Regression wurde die Steigung der

Kurve berechnet.

Die mittlere Verweildauer („Resident Time“) der Zielproteine entspricht dem Quotient

aus Plateauanreicherung des Präkursors und der Steigung der Tracer/Tracee- Kurve. Die

fraktionelle Katabolismusrate (FCR) errechnet sich aus dem Kehrwert der mittleren

Verweildauer.

Geht man von dem Vorliegen konstanter Plasmaspiegel („Steady State“) der

Zielproteine aus, so wird der pro Zeiteinheit katabolisierte Teil des Plasmapools in

gleicher Zeit durch eine äquivalente Menge neu synthetisierten Materials ersetzt. Im

„Steady State“ ist die fraktionelle Katabolismusrate (FCR) und die fraktionelle

Syntheserate (FSR) gleich groß (FCR=FSR).

Die Produktionsrate (PR) wurde wie folgt berechnet:

PR = (FSR x C x V)/KG

C entspricht dem Plasmavolumen des Zielproteins, KG dem Körpergewicht und V dem

Plasmavolumen (hier als 4% des KG angenommen) (Schaefer et al. 1997).


2.4. Zellbiologische Methoden

2.4.1 Verwendete Zellen und Kulturbedingungen

Folgende Zellen wurden im Rahmen dieser Arbeit eingesetzt:

HeLa: Epithelienartige Adenocarcinoma- Zellen, Mensch, Gebärmutter (ATCC, CCL-

2, Rockville, MD)

Fibroblasten: Primärkulturen aus Haut- Biopsien, Mensch.

Die Kultivierung eukaryontischer Zellen erfolgte in Dulbecco’s Modified Eagle

Medium (DMEM), supplementiert mit 10% fötalem Rinderserum (FCS), 2 mM L-

Glutamin, MEM Vitaminen, nichtessentiellen Aminosäuren, 100 U/ml Penicillin und

100µg/ml Streptomycin. Die Zellkulturen wurden in einem Inkubationsschrank in einer

wasserdampfgesättigten Atmosphäre bei 370C und 5% CO2 inkubiert. Alle zwei bis drei

Tage wurden die Zellen passagiert. Als physiologische Lösung wurde in allen

Zellkultur- Experimenten 1x PBS- Puffer eingesetzt

2.4.2 Einfrieren und Auftauen von Zellen

Zur dauerhaften Aufbewahrung wurden die Zellen in einem Gemisch aus DMEM-

Medium, 10% FCS und 10% DMSO in flüssigen Stickstoff tiefgefroren. Aus 10

Kulturschalen (Durchmesser 94mm) von 50% konfluenten, adherenten Zellen, wurden

5x2ml Einfrier- Aliquots hergestellt. Dazu wurden die Zellen zuerst trypsinisiert und

anschließend durch resuspendieren in einer 10ml Pipette vereinzelt und in 50ml Falcon

Röhrchen vereinigt. Nach Abzentrifugieren bei 200g und 40C wurden die Zellen mit den

entsprechenden Mengen Medium, DMSO und FCS versetzt. Die Einfrier- Aliquots

wurden zunächst für zwei Stunden bei 4°C inkubiert, bevor sie für 24 h bei -800C

schonend heruntergekühlt wurden, um dann letztendlich in flüssigen Stickstoff

dauergelagert zu werden.

Beim Auftauen wurden die Zellen so kurz wie nur möglich im Einfriermedium

belassen. Die Kryoröhrchen mit den eingefrorenen Zellen wurden dazu im 370C warmen

Wasserbad aufgetaut und anschließend sofort in ein vorbereitetes, mit DMEM-

Komplettmedium gefülltes Falcon Röhrchen, überführt. Nach Abzentrifugieren des

Mediums bei 200 g und 40C für 5 Min. wurden die Zellen in frischem Medium auf die

Zellkulturschalen ausgesät.


2.4.3 Fluoreszenzmarkierung von Lipoproteinpartikeln mit DiI

Zur Fluoreszenzmarkierung von UZ- isolierten Lipoproteinpartikeln (VLDL, LDL,

HDL) für Bindungs und Aufnahmestudien in kultivierten Zellen, wurde der Farbstoff

1,1´- dioctadecyl- 3,3,3´,3´- tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI) verwendet.

DiI lagert sich ähnlich wie Phospholipide mit seinen polaren Gruppen in die Oberfläche

der Lipoproteine ein, beeinflusst dabei aber nicht die Bindungseigenschaften der

Lipoproteine (Rezeptor- Liganden). Wesentliche Vorteile gegenüber klassischen,

radioaktiven Markierungsverfahren von Lipoproteinen mit I125 liegen zudem in den

Kosten der Markierung und darüber hinaus darin, dass sich die zelluläre Aufnahme bzw.

Bindung der Lipoproteine in der konfokalen Laser Scanning Mikroskopie (LSM)

aufgrund der sehr hohen Fluoreszenz des Farbstoffs gut darstellen lässt. Zur Markierung

von Lipoproteinen mit DiI wurden diese wie unter Punkt 2.3.10 beschrieben über

sequentielle Ultrazentrifugation isoliert und anschließend gegen 5 l 1x Markierungs-

Puffer dialysiert, hierbei wurde der Puffer zur vollständigen Entsalzung insgesamt 4x

gewechselt. Danach wurden die Lipoproteine mittels 0,45µM Filter (Fa.

Schleicher&Schüll, Dassel) steril filtriert und die Proteinmenge durch Bradford- Assay

bestimmt. Jeweils 4,5 mg Lipoprotein wurden in ein 15 ml Röhrchen (Fa. Sarstedt,

Nümbrecht) überführt und zur Vermeidung oxidativer Prozesse mit 12µl einer 0.1M

Ascorbinsäure- Lösung versetzt und daraufhin mit 0,9% NaCl- Lösung auf ein

Volumen von insgesamt 12 ml gebracht. Anschließend wurden die Lipoproteine unter

vorsichtigem Schwenken mit jeweils 90µl DiI- Lösung (15 mg DiI gelöst in 1ml

DMSO) vermischt, danach mit Stickstoff bedampft und für 18 Stunden bei 370C unter

Lichtabschluss in einem Wasserbad mit Schüttler inkubiert (Teupser et al. 1996). Nach

der Markierung wurde der nicht eingebaute DiI- Farbstoff entfernt. Zu diesem Zweck

wurden die markierten Lipoproteine mittels Ultrazentrifugation im entsprechenden

Dichtebereich rezentrifugiert, isoliert und unter mehrmaligem Wechseln des Puffers

gegen 0,9% NaCl- Lösung dialysiert. Die markierten Lipoproteine wurden daraufhin

erneut mittels 0,45µM Filter steril filtriert und die Proteinmenge über Bradford- Assay

bestimmt. Bis zur weiteren Verwendung für Bindungs und Aufnahmestudien in

kultivierten Zellen wurden die Lipoproteine bei 40C unter sterilen Bedingungen und

Lichtabschluss aufbewahrt.


1x Markierungs- Puffer (pH 7,4):

Tris: 30,0 g

NaCl: 144,0 g

EDTA: 5,0 g


2.4.4 Herstellen von Lipoprotein defizientem Serum (LPDS) für die Zellkultur

Für die Herstellung von humanem Lipoprotein defizientem Serum (LPDS) für

Zellkultur-Experimente wurde der Unterstand der HDL- Fraktion aus 2.3.11.

(Probendichte d=1,21g/ml) aufgearbeitet. Dieser Unterstand beinhaltet nach der

Isolierung der HDL- Fraktion keine Lipoproteine mehr und kann in Zellbindungs- und

Aufnahmestudien in kultivierten Zellen verwendet werden. Kultiviert man die Zellen

über einen Zeitraum von 48 Stunden in DMEM-Medium welches anstelle von 10%

fötalem Rinderserum (FCS) mit 10% LPDS supplementiert wird, so erfolgt aufgrund

der Lipoproteindefizienz ein Aushungern der Zellen. Dieses führt zu einer

Hochregulation der Genexpression der Rezeptoren für die Aufnahme von Lipoproteinen

(vornehmlich LDL- Rezeptoren) siehe Punkt 1.4.3 dieser Arbeit. Inkubiert man diese

Zellen dann mit Fluoreszenz- markierten Lipoproteinen (z.B. DiI- LDL), so kann

spektrofluorometrisch quantitativ die zelluläre Aufnahme und Bindung dieser

Lipoproteine ermittelt werden. Zur Herstellung von LPDS wurde der Unterstand der

HDL- Fraktion mit 0,9% NaCl- Lösung auf ein Volumen von 5 ml gebracht

(Ausgangsmenge des eingesetzten Plasmas für die sequentielle Ultrazentrifugation), in

Dialyse- Schläuche überführt und anschließend unter mehrmaligem Wechseln des

Puffers gegen 0,9% NaCl- Lösung dialysiert. Das entsalzte LPDS wurde daraufhin

mittels 0,45µM Filter steril filtriert und bis zur weiteren Verwendung bei -200C

aufbewahrt.

2.4.5 Bindungs und Aufnahmestudien mit DiI-markierten Lipoproteinen in

Zellkultur

Zur quantitativen Bestimmung der zellulären Aufnahme und Bindung von DiI-

markierten Lipoproteinen, wurde zuerst die spezifische Fluoreszenz-Intensität in Units

(U) der markierten DiI- Lipoprotein- Präparationen ermittelt. Hierzu wurden

unterschiedliche Mengen des Farbstoffs DiI (0-100ng) in 1ml Zell- Lysis- Reagent

gelöst und anschließend die Fluoreszenz- Intensität FI(U) bei einer Exzitations-


Wellenlänge von 525nm und Emissions-Wellenlänge von 565nm in einem

Spektralfluorometer (Model LS- 5 Fa. Perkin- Elmer, Langen) bestimmt. Aus der

Standardkurve wurde danach die FI(U) pro ng DiI ermittelt. Für die Bestimmung der FI

der DiI- Lipoproteine wurden unterschiedliche Proteinmengen (0, 5, 10, 20, 50, 100,

200, 400, 600 800, 1000, 1200, 1400ng) in 1ml Zell- Lysis- Reagent gelöst und aus der

Standardkurve die FI(U)/ng DiI- Lipoprotein ermittelt. Aus beiden Messungen wurde

anschließend der Einbau (ng DiI/µg Lipoprotein) errechnet, dieser lag in der Regel

zwischen 30-50ng DiI/µg Lipoprotein. Für die Messung der Aufnahme und Bindung

von DiI- LDL in humanen Fibroblasten und HeLa- Zellen wurden Zellen die sich

zwischen Passage 5-10 befanden, in 35- mm Zellkulturschalen ausgesät und für 72

Stunden in DMEM- Medium mit 10% FCS inkubiert. Anschließend wurden die Zellen

3x mit 2 ml PBS gewaschen und für weitere 48 Stunden in DMEM- Medium mit 10 %

LPDS inkubiert. Nach erneutem 3- maligen Waschen mit 2 ml PBS erfolgte zur

Bestimmung der zellulären DiI- LDL- Aufnahme eine 5-stündige Inkubation bei 370C

mit unteschiedlichen Mengen an DiI- LDL (0, 5, 10, 20, 50, 100µg in DMEM mit 10%

LPDS). Die spezifische Aufnahme wurde bei einer Menge von 10µg DiI- LDL mit

einem 50fachen Überschuss an unmarkiertem LDL ermittelt. Zur Messung der DiI-

LDL- Bindung wurden die Zellen für 2 Stunden bei 40C mit 0, 5, 10, 20 und 50µg DiI-

LDL inkubiert, hierbei wurde auschließlich vorgekühltes DMEM- Medium und PBS

verwendet. Die Messung der spezifischen Bindung erfolgte bei einer Menge von 20µg

DiI- LDL unter Kompetition mit einem 50fachen Überschuss an unmarkiertem LDL.

Nach den Inkubationen wurde das Medium abgesaugt und die Zellen insgesamt 4 x mit

2 ml PBS gewaschen, die Lyse der Zellen erfolgte anschließend durch Zugabe von 1 ml

Zell- Lysis- Puffer unter Lichtabschluss durch eine 1- stündige Inkubation bei RT auf

einem Schüttler.

Zell- Lysis- Puffer:

NaOH: 30,0 g

SDS: 144,0 g



Berechnung der zellulär aufgenommenen/gebundenen Menge an DiI- LDL

Nach dem Lysieren der Zellen erfolgte die Bestimmung der

aufgenommenen/gebundenen Menge an DiI- LDL. Hierzu wurden jeweils 200µl Zell-

Lysat aus den jeweiligen Ansätzen in eine speziell für Fluoreszenz- Messungen

geeignete, weiße 96 Well- Platte pipettiert und anschließend die Fluoreszenz- Intensität

FI(U) bei einer Exzitations- Wellenlänge von 525nm und Emissions- Wellenlänge von

565nm in einem Spektralfluorometer (Model LS- 5 Fa. Perkin- Elmer, Langen)

gemessen. Zur Korrektur der „Background“- Fluoreszenz wurde eine Zell- Lysis-

Präparation ohne Inkubation mit DiI- LDL als Leerwert verwendet. Parallel zur

Messung der FI(U) wurde zudem aus allen Ansätzen die Proteinmenge über Bradford-

Assay bestimmt. Die Berechnung der zellulären DiI- LDL- Aufnahme/Bindung (ng

LDL- Protein/mg Zellprotein) setzte sich aus folgenden gemessenen Werten zusammen:

1. DiI- Label: FI(U)/ng DiI- LDL aus Standardkurve.

2. Zellprotein (mg/ml) aus Leerwert.

3. Zellprotein (mg/ml) aus Ansatz.

4. FI(U)/ml gemessen aus Leerwert.

5. FI(U)/ml gemessen aus Ansatz.

Zunächst erfolgt die Korrektur der Background- Fluoreszenz:

FI (U)/ml Ansatz - FI (U)/ml Leerwert = FI (U)/ml korr.

Aus dem gemessenen Zellprotein (mg/ml)Ansatz lässt sich dann die FI/mg Zellprotein

berechnen:

FI (U)/ml korr.: Zellprotein (mg/ml) Ansatz = FI (U)/mg Zellprotein Ansatz

Nach Abzug des analog berechneten Zellprotein- Leerwerts (FI(U)/mg Zellprotein)

erhält man den „Background“- korrigierten Wert des Ansatzes:

FI (U)/ mg Zellprotein korr.

Über die aus der Standardkurve bestimmte Menge des DiI- Labels FI(U)/ng DiI- LDL

lässt sich anschließend die aufgenommene/gebundene Menge an LDL- Protein im

Ansatz berechnen:

DiI- Label FI (U)/ng DiI- LDL : FI(U) /mg Zellprotein korr.= ng DiI- LDL/mg

Zellprotein


Die so ermittelten Daten wurden anschließend mit Scatchard- Plot- Analyse

ausgewertet und über diese die maximale Bindung/Aufnahme (Vmax ) und die Km

ermittelt (Teupser et al. 1996).

2.4.6 Konfokale Laser Scanning Mikroskopie (LSM)

Die konfokale Mikroskopie ermöglicht die Darstellung der Proteinexpression und die

genaue intrazelluläre Lokalisierung von Proteinen in einzelnen, intakten Zellen. Analog

dazu lässt sich auch die Aufnahme und Bindung von Fluoreszenz- markierten Proteinen

z.B. DiI- LDL darstellen. Bei der Immunofluoreszenz- Analyse erfolgt die Detektion

des zu untersuchenden Proteins über Inkubation mit einem spezifischen Primär-

Antikörper, der gegen das nachzuweisende Protein gerichtet ist. Im zweiten Schritt

erfolgt dann eine Inkubation mit einem Fluoreszenzfarbstoff- konjugierten

Sekundärantikörper (FITC bzw. TRITC markiert), welcher dann den an das Protein

gebundenen Primär- Antikörper erkennt. In dieser Arbeit wurde die konfokale

Mikroskopie eingesetzt, um die intrazelluläre Lokalisation des LDL- Rezeptors, sowie

die Aufnahme/Bindung von DiI- markiertem LDL zu analysieren. Die Aufnahmen mit

der konfokalen Laser Scanning Mikroskopie wurden in Zusammenarbeit mit Dr. Birgit

Hufnagel (Institut für Pharmazie, Abteilung Prof. Krieglstein, Philipps- Universität

Marburg) mit einem Zeiss 510 Konfokalem Laser Scanning Mikroskop unter

Verwendung eines Argon- Lasers (Zeiss Lasertechnik GmbH, Jena) erstellt. Hierbei

wurden die Bilder elektronisch vergrößert, um eine kleine Gruppe von Zellen darstellen

zu können. Jedes Bild stellte einen optischen Schnitt dar, welcher die Mitte zwischen

Zelloberfläche und Boden des Objektträgers repräsentierte

2.4.7 Konfokale Mikroskopie der zellulären Aufnahme von DiI- LDL

Für die Darstellung der zellulären Aufnahme von DiI- LDL in humanen Fibroblasten

und HeLa- Zellen mittels konfokaler Mikroskopie, wurden Zellen zwischen Passage 5-

10 in 35-mm Zellkulturschalen ausgesät, die mit sterilen Deckgläschen versehen waren.

Die Inkubation der Zellen erfolgte über einen Zeitraum von 72 Stunden in DMEM-

Medium mit 10% FCS, bis eine ausreichende Anzahl von Zellen auf den Deckgläschen

angewachsen war. Anschließend wurden die Zellen jeweils 3x mit 2 ml PBS gewaschen

und danach für weitere 48 Stunden in DMEM- Medium mit 10 % LPDS inkubiert. Die

spezifische Aufnahme an DiI- LDL wurde durch eine 5- stündige Inkubation bei 370C

mit 10µg DiI- LDL (in DMEM- Medium mit 10% LPDS) unter einem 50fachem


Überschuss an unmarkiertem LDL ermittelt. Nach der Inkubation wurde das Medium

abgesaugt und die Zellen jeweils 3 x mit 2 ml PBS gewaschen, um nicht- adhärente

Zellen zu entfernen. Abschließend wurden die Zellen auf den Deckgläschen mit 25µl

„Mounting“- Medium (Vector Laboratories, USA) überschichtet und vorsichtig auf

einen Objekträger aufgelegt. Die Ränder der beiden Glasplatten wurden mit Nagellack

abgedichtet und die Zellen daraufhin wie unter Punkt 2.4.6 beschrieben mit einem

konfokalen Lasermikroskop analysiert.

2.4.8 Immunfluoreszenz- Mikroskopie zur zellulären Lokalisation von Proteinen

Zum Nachweis von intra/extrazellulär- lokalisiertem LDL- Rezeptor- Protein wurde

eine spezielle- Doppel- Immunfluoreszenz- Färbe- Technik verwendet (Jensen et al.

1997). Die Kultivierung von humanen Fibroblasten erfolgte zu diesem Zweck genau

wie unter Punkt 2.4.1 beschrieben auf sterilen Deckgläschen. Nach 3 x Waschen mit

jeweils 1 ml PBS wurden die Zellen mit 5µg/ml des monoklonalen LDLR- Primär-

Antikörpers (Maus Anti- LDL- Rezeptor IgG- C7, Fa.Acris, Bad Nauheim) für 10 Min.

bei 40C inkubiert und danach mit 2 ml PBS (1% BSA) in einem Kühlarbeitzplatz bei

40C gewaschen. Der Nachweis von an der Zelloberfläche lokalisiertem LDL- Rezeptor

erfolgte durch eine 10- minütige Inkubation bei 40C mit 27µg/ml

Fluoresceinisothiocyanat (FITC) konjugierten Antikörper (gerichtet gegen den

primären Antikörper). Nach Waschen mit jeweils 2 x 1 ml PBS (1% BSA) erfolgte die

Fixation der Zellen durch Inkubation in 1 ml 4% Formaldehyd/PBS- Lösung für 15

Min. bei RT. Die fixierten Zellen wurden daraufhin zur Lokalistion von intrazellulärem

LDL-Rezeptor direkt weiterverwendet. Hierzu wurden die Zellen zunächst durch eine

15- minütige Inkubation in 1 ml 70% Ethanol/PBS- Lösung permeabilisiert und

anschließend erneut mit monoklonalem LDLR- Primär- Antikörper (1,25µg in 1 ml

PBS/BSA) für 30 Min. bei RT inkubiert. Nach Waschen mit 2 ml PBS/BSA erfolgte die

intrazelluläre Lokalisation des LDL- Rezeptors durch eine 30- minütige Inkubation bei

370C mit Tetramethylrhodaminisozyanat (TRITC)- konjugierten Sekundär- Antikörper

(8µg/ml). Zum Abschluss wurden die Zellen auf den Deckgläschen jeweils 3 x mit 1 ml

PBS gewaschen und danach, um ein zu schnelles Ausbleichen der Fluoreszenzfarbstoffe

zu verhindern, mit 25µl „Mounting“- Medium überschichtet die Ränder der beiden

Glasplatten mit Nagellack abgedichtet und anschließend genau wie unter Punkt 2.3.6.

beschrieben mit der konfokalen Lasermikroskopie untersucht.


2.4.9 Subzelluläre Fraktionierung von Zellen für Immunblot- Experimente

Für die Darstellung von in zellulären Membranen lokalisierten Proteinen (zB. LDL-

Rezeptor, SCARB1, Na+/K+- ATPase) in Imunblot- Experimenten wurden subzelluläre

Fraktionierungen aus kultivierten humanen Fibroblasten mit dem Qproteome Cell

Compartment Kit (Fa. Quiagen, Hilden) durchgeführt. Humane Fibroblasten Zellen die

sich zwischen Passage 5-10 befanden, wurden in 35- mm Zellkulturschalen ausgesät

und für 72 Stunden in DMEM- Medium mit 10 % FCS inkubiert. Nach 2maligem

Waschen der Zellen mit 2 ml eisgekühltem PBS wurden die einzelnen zellulären

Kompartmente mit den jeweiligen Proteinbestandteilen (Zytosolische Proteine, Plasma

und ER-Membranproteine, Nukleare Proteine und Proteine des Zytoskeletts), exakt

nach den vorgegebenen Anweisungen des Herstellers isoliert. Zur Ankonzentrierung

und Entsalzung der isolierten Proteine wurden anschließend jeweils 500µl der Lysate

mit 4 Volumen (V/V) eiskalter Acetonlösung versetzt, für 2 Stunden bei 40C inkubiert

und die Proteine durch eine 20minütige Zentrifugation bei 13000 rpm pelletiert. Nach

Abnahme des Überstandes wurden die Proteinpellets direkt in 100µl SDS- Probenpuffer

aufgenommen und anschließend die Proteinmenge in Lösung mit dem C- BXTM

Protein- assay (Fa. G- Biosciences, St. Louis, USA) bestimmt. Dieser Proteinassay

erlaubt eine genaue Bestimmung der isolierten Proteinmenge in einem linearen Bereich

von 0-50µg in der Gegenwart von interferierenden Detergentien (z.B. Chaps, Harnstoff

und SDS), die mit der Bradford- Methode nicht möglich ist. Zur Quantifizierung der

Proteinmengen aus den isolierten Mebranfraktionen für Immunblot-Experimente

wurden jeweils 10µl gelöstes Protein eingesetzt und die Proteinmenge in den Fraktionen

exakt nach den vorgegebenen Anweisungen des Herstellers nach Messung der optischen

Dichte bei einer Wellenlänge Für die nachfolgenden Immunblot –

Experimente wurden jeweils 8 µg Protein eingesetzt.

3. Ergebnisse 110

3. Ergebnisse

3.1 Mutationsanalyse mittels denaturierender Gradientengel- Elektrophorese

(DGGE)

3.1.1 Prinzip und Theorie der DGGE

Die denaturierende Gradienten- Gelelektrophorese (DGGE) ist eine physikochemische

Methode zur Separation von doppelsträngiger DNA, durch die es möglich ist, DNA-

Fragmente aufzutrennen, die sich in ihrer Nukleotidkomposition unterscheiden (Fischer

und Lerman 1980). Die Seperation der DNA- Fragmente wird durch ihr

unterschiedliches Schmelzverhalten in linearen denaturierenden Gradientengelen

bewirkt. Jedes DNA- Fragment besitzt spezifische Bereiche, sogenannte

Schmelzdomänen („melting domains“), in die es aufschmilzt, wenn man die Temperatur

oder die Konzentration an einem chemischen Denaturans erhöht. Die

Schmelztemperatur (Tm) der einzelnen Domänen eines DNA- Fragments ist dabei

abhängig von der Nukleotidkomposition und kann bis zu 0,1-10C zwischen zwei

Fragmenten, die sich in nur einem Nukleotid voneinander unterscheiden, variieren. In

der Praxis werden die DNA- Moleküle in einem Polyacrylamidgel mit einem linear

ansteigenden Gradienten an chemischen Denaturans aufgetrennt und wandern so lange,

bis sie eine Konzentration an Denaturans erreicht haben, an dem ihre niedrigste

Schmelzdomäne aufschmilzt (Seperation des DNA- Doppelstranges). Die nun partiell

geschmolzenen Fragmente ändern ihre Molekülstruktur („branched structure

Formation“), wodurch die Mobilität der Moleküle im Gel abrupt reduziert wird und die

Unterschiede durch einen „mobility shift“ im Gel sichtbar werden. Fragmente mit

unterschiedlichen Mutationen (Substitutionen, Transitionen, Deletionen und

Insertionen) wandern im Vergleich zum Wildtyp- DNA- Fragment unterschiedlich weit

innerhalb des Gradienten bis zu ihrem jeweiligem Schmelzpunkt und können so leicht

identifiziert werden. In der Regel schmelzen die meisten DNA- Fragmente in einem

Temperaturbereich, der zwischen 68-840C liegt. Um diese Temperaturen experimentell

herstellen zu können, wird die Elektrophorese bei einer konstanten Temperatur von

600C durchgeführt. Die noch fehlende und benötigte Temperatur zum Aufschmelzen der

DNA- Moleküle wird durch einen linearen chemischen Denaturierungsgradienten,

bestehend aus Harnstoff und Formamid, geschaffen (100% Denaturans- Lösung = 7 M

3. Ergebnisse 111

Harnstoff; 40%- deionisiertes Formamid). Hierbei entsprechen 3% an Denaturans-

Lösung einer Temperatur von ca. 10C. Ideale DGGE- Bedingungen setzen voraus, dass

sich die DNA- Doppelstränge nicht vollständig voneinander getrennt haben und die zu

untersuchende Region mit Mutationen sich im Bereich der niedrigsten Schmelzdomäne

befindet. Bei Fragmenten, die mehrere Schmelzdomänen aufweisen, kann es passieren,

dass nicht alle Domänen erfasst werden, da ihre höchsten Schmelzdomänen erst dann

erfassbar sind, wenn beide DNA- Stränge schon vollständig voneinander separiert sind,

sodass Mutationen in den höchsten Schmelzdomänen nicht nachgewiesen werden

können. Um dieses Problem zu lösen, fügt man mittels PCR eine sogenannte 30-60

Basenpaare lange GC- Klammer („GC- clamp“) in die zu untersuchenden DNA-

Fragmente ein. (Myers et al. 1985). Hierzu wird einer der verwendeten PCR-Primer mit

dem GC- clamp versehen, sodass dieser anschließend im Verlauf der PCR in das PCR-

Produkt mit eingebaut wird (Sheffield et al. 1989). Hierdurch ist es möglich, auch

Mutationen in den höher schmelzenden Domänen eines DNA- Fragments zu erfassen.

Um die optimalen DGGE- Parameter (Elektrophoresezeit, Gradientenauswahl) für das

jeweilige Fragment zu definieren, muss das Schmelzverhalten des Fragments untersucht

werden. Dies kann über zwei unterschiedliche Methoden ermittelt werden. Mit Hilfe

eines Computerprogramms (WINMeltTM, Fa. BioRad, München) kann man anhand der

Nukleotidsequenz des zu untersuchenden DNA- Fragments die Anzahl der

Schmelzdomänen und deren Schmelzpunkt theoretisch ermitteln. Der Vorteil dieser

Methode liegt daran, dass man den GC- clamp gezielt an ein bestimmtes Ende des

Fragments anhängen kann (5' oder 3' Ende), sodass man im optimalen Fall eine einzelne

Schmelzdomäne generieren kann, die eine Erfassung aller Mutationen gewährleistet

(Lerman und Silverstein 1987). Eine zweite experimentelle Möglichkeit besteht in der

Gelelektrophorese des zu untersuchenden Fragments in einem linearen Gradienten an

Denaturans (0-100%). Hierbei wird das Fragment im Gegensatz zum Parallel- Gel

rechtwinklig (perpendikulär) zu einem Denaturans- Gradienten über einen Zeitraum von

5 Stunden aufgetrennt. Der Probenauftrag erfolgt hierbei über eine einzige das Gel

umfassende Probentasche. Fragmente auf der niedrigen Seite des Gradienten wandern

sehr weit ins Gel hinein, da die geringe Denaturans- Konzentration sie nicht

aufschmelzen lässt, während Fragmente auf der hohen Seite des Gradienten nur eine

kurze Strecke bis zur Aufschmelzung im Gel zurücklegen. Im intermediären

3. Ergebnisse 112

Konzentrationsbereich werden durch ein bedingtes Schmelzen der Fragmente

Übergangszustände sichtbar. Durch Anfärben der Gele mit Ethidiumbromid erhält man

eine Kurve, welche die Anzahl der Schmelzdomänen und deren Schmelzbereich

anzeigt. Der Vorteil dieser Methode im Vergleich zur theoretischen Ermittlung besteht

darin, dass man das tatsächliche Schmelzverhalten des Fragments erfasst und anhand

dieser Kurve die optimalen Gradienten- Bedingungen für die Auftrennung der

Fragmente im parallelen Gradientengel genau bestimmen kann (Myers et al. 1985). In

der Regel unterscheiden sich die theoretisch und experimentell ermittelten Parameter

jedoch nur geringfügig voneinander, sodass die computergestützte Bestimmung des

Schmelzverhaltens das praktikablere Verfahren darstellt. In der Abbildung 14 ist das

Prinzip der denaturierenden Gradientengel- Elektrophorese (DGGE) zum Nachweis von

DNA- Mutationen grafisch dargestellt.

Abbildung 14: Prinzip der denaturierenden Gradientengel- Elektrophorese (DGGE). In der

perpendikulären DGGE ermittelt man den Schmelzbereich der Fragmente (In diesem Beispiel

z.B. 30-70%). Dieser wird dann zur Auftrennung der DNA- Fragmente in der parallelen DGGE

verwendet. Bei Vorhandensein einer heterozygoten Mutation ergeben sich auf dem Gel vier

Banden (jeweils zwei Heteroduplexe und Homoduplexe).

100%

Elek

troph

orese

0% Denaturans

Schmelzbereich

30%- 70%

WT.-DNA

Mut.-DNA

DNA -Doppelstrang

DNA-Partiell-geschmolzen

30%

70%

Heteroduplex 1

Heteroduplex 2

Mut.-Homoduplex

WT.-Homoduplex

Wt Mut Het.

5´-3´

3´-5´

5´-3´

3´-5´

5´-3´

3´-5´

5´-3´

3´-5´

Den

aturan

s

Perpendikuläre DGGE Parallele DGGE

3. Ergebnisse 113

3.1.2 Konstruktion eines Elektrophorese- Systems für das Screening mit der

DGGE

Da konventionelle Elektrophorese- Systeme für die Untersuchungen mit der

denaturierenden Gradientengel- Elektrophorese relativ teuer in der Anschaffung sind

(Preis ca. 8000-12000 €) und in den meisten Fällen einen großen Probendurchsatz nicht

immer gewährleisten können, wurde im Rahmen dieser Arbeit durch den Umbau einer

Standard- Elektrophoresekammer (Protean II System, Fa. BioRad, München) ein

Elektrophorese- System für die Untersuchungen mit der DGGE konstruiert. Hierbei

wurde die zentrale Kühleinheit mit Löchern versehen und die Zu- und Abläufe der

Kühleinheit mit hitzebeständigem Silikon abgedichtet, um einen Stromfluss innerhalb

des Systems zu gewährleisten. In den Puffertank wurde jeweils ein neuer Zu- und

Ablauf eingebaut. Der Zulauf der Kammer wurde über einen Silikonschlauch mit dem

Einlass einer Pumpe (Pumpvolmen: 30L/Minute) verbunden und der Ablauf der

Kammer über einen zweiten Silikonschlauch mit einer Glasspirale verbunden, die in

einem regulierbaren Thermoelement (Temperaturbereich. 4-950C) untergebracht war.

Von dieser Glasspirale führte ein dritter Schlauch zum Auslass der Pumpe, sodass ein

geschlossener Kreislauf hergestellt wurde, über den das Puffersystem geheizt und

gekühlt werden konnte. Um pH- Unterschiede des Elektrophorese- Puffers in der oberen

und unteren Pufferkammer während der 5- stündigen Elektrophorese bei 600C zu

vermeiden, wurde ein zweites Pumpsystem eingebaut, das eine konstante Zirkulation

von Ober- und Unterpuffer gewährleistete. Abbildung 15 zeigt die umgebaute Protean

II- Elektrophorese- Apparatur, mit der alle DGGE- Untersuchungen in dieser Arbeit

durchgeführt wurden.

3. Ergebnisse 114

Abbildung 15: Aufbau der selbst umgebauten Elektrophorese- Apparatur, mit der alle DGGE-

Untersuchungen im Rahmen dieser Arbeit durchgeführt wurden.

3.1.3 Schmelzkurven für die Untersuchungen des ApoB- 100 und LDL-

Rezeptorgens

Um den Einfluss von neuen Mutationen, die zur Hypercholesterinämie führen und bei

der Pathogenese der Atherosklerose eine mögliche Rolle spielen, aufzuklären, sollte

zunächst ein spezifischer Bereich in Exon 26 des ApoB- 100- Gens mit der DGGE auf

Mutationen untersucht werden. Es handelte sich um die für die Bindung an den LDL-

Rezeptor essentielle Region der carboxyterminalen Modulator site von ApoB- 100

(Aminosäuren 3448-3561) (Boren et al. 1998; Boren et al. 2001). Diese Region wird

von den Nukleotiden 10551-10893 des ApoB- 100- Gens codiert (Genbank Accession

Nr: NM_ 000384). Weltweit existieren bisher erst vier beschriebene Mutationen in

dieser Region, die über eine reduzierte ApoB- 100- Bindung an den LDL- Rezeptor zur

Hypercholesterinämie führen und bei der Pathogenese der Atherosklerose mitwirken.

Ein zweites Gen, das im Cholesterinstoffwechsel eine zentrale Rolle spielt und im

Rahmen des DGGE- Screenings bei extrem seltenen und schwersten Formen der

Familiären Hypercholesterinämie (FH) untersucht wurde, war das LDL- Rezeptorgen

Heizsystem

Pufferpumpe I

Pufferpumpe II

Gelkammer

3. Ergebnisse 115

(Genbank Accession Nr: NM_000527). Hierzu wurden Primer ausgewählt, die das

gesamte LDL- Rezeptorgen inklusive der „splice sites“ (Exon/Intron- Übergänge) und

der in den Introns lokalisierten Bindungsstellen für Proteinkomplexe des Spliceosoms

(U1/U2 und U4/5 SnRNP´s), umfassten. Zusätzlich wurde der LDL- Rezeptor-

Promotor (Region -252 bis +1) mit den für die transkriptionelle Kontrolle der LDL-

Rezeptor- Genexpression relevanten regulatorischen Sequenzen (TATA- Boxen, Sp1-

Bindungstellen, Sterol regulatory elements (SRE´s)) untersucht. Zunächst wurden mit

dem Computerprogramm WINMeltTM Schmelzkurven für die Untersuchungen der

einzelnen Fragmente des ApoB- 100 und des LDL- Rezeptorgens generiert. Abbildung

16 zeigt die Schmelzkurve des hierzu ausgewählten ApoB- 100 DNA- Fragments,

sowie repräsentativ die Schmelzkurve des DNA- Fragments von Exon 12 des LDL-

Rezeptors als eines der verwendeten Fragmente für die DGGE- Untersuchungen.

1 80

159

238

317

396

20.0

40.0

60.0

80.0

100.0

120.0

Sequence position (bp)

Mel

ting

tem

pera

ture

(°C

)

GC- clamp(50 bp)

CgcccgccgcgccccgcgcccgTcccgccgcccccgcccgcggcCccccgGGAGCAGTTGACCACAAGCTTAGCTTGGAAAGCCTCACCTCTTACTTTTCCATTGAGTCATCTACCAAAGGAGATGTCAAGGGTTCGGTTCTTTCTCGGGAATATTCAGGAACTATTGCTAGTGAGGCCAACACTTACTTGAATTCCAAGAGCACACGGTCTTCAGTGAAGCTGCAGGGCACTTCCAAAATTGATGATATCTGGAACCTTGAAGTAAAAGAAAATTTTGCTGGAGAAGCCACACTCCAACGCATATATTCCCTCTGGGAGCACAGTACGAAAAACCACTTACAGCTAGAGGGCCTCTTTTTCACCAACGGAGAACATACAAGCAAAGCCACC

ApoB (Exon 26)

3. Ergebnisse 116

Sequence position (bp)

1 70 139 208 277 34620.0

40.0

60.0

80.0

100.0

120.0

Mel

ting

tem

pera

ture

(°C

)

GC- clamp(50 bp)

Abbildung 16: Mit WINMeltTM ermittelte Schmelzkurven des ausgewählten ApoB- 100-

Fragments, sowie repräsentativ die Schmelzkurve von Exon 12 des LDL- Rezeptorgens. Die

roten Buchstaben markieren den GC- clamp. Fettgedruckte Buchstaben zeigen die codierenden

Bereiche und normal gedruckte die Intron- Sequenzen der Fragmente.

3.1.4 Auswahl und Sequenzen der Oligonukleotide für die DGGE-Untersuchungen.

Die Auswahl der Oligonukleotid- Sequenzen für die PCR- Amplifikationen erfolgte im

Wesentlichen an den von Nissen et al. publizierten Sequenzen zur DGGE-

Untersuchung des ApoB- 100 und LDL- Rezeptorgens (Nissen et al. 1996). Ein

Unterschied bestand in der Länge der verwendeten 5´ terminalen GC- Klammer, die in

unserem Fall 50 Bp betrug und für alle Primer mit GC- clamps verwendet wurde. Aus

den mit WINMeltTM ermittelten Schmelzkurven ergab sich, dass alle Fragmente in

einem Temperaturbereich von 68-750C schmelzen, sodass für die Untersuchungen ein

linearer Denaturans- Gradient von 30-78% zur Auftrennung aller Fragmente verwendet

wurde. In der Tabelle 13 sind die Daten aller verwendeten DGGE- Primer aufgelistet.

ggccctcaggaccctctgggactggcatcagcacgtgacctctccttatccacttgtgtgtctagATCTCCTCAGTGGCCGCCTCTACTGGGTTGACTCCAAACTTCACTCCATCTCAAGCATCGATGTCAACGGGGGCAACCGGAAGACCATCTTGGAGGATGAAAAGAGGCTGGCCCACCCCTTCTCCTTGGCCGTCTTTGAGgtgtggcttacgtacgagatgcaagcacttaggtggcggatagacacagactatagatcactcaagccaagatgaacgcagaaaactcgcccgccgcgccccgcgcccgTcccgccgcccccgcccgcggccccccg

LDLR (Exon 12)

3. Ergebnisse 117

Tabelle 13: Oligonukleotid- Sequenzen für die Amplifikationen des ApoB- 100 und

LDL- Rezeptorgens und die codierenden Regionen der jeweiligen PCR- Produkte.

NameVorwärts-Primer

(5´- 3´)Rückwärts-Primer

(5´-3´)

Fragment ( Bp)

Codierende Region

ApoB- Gen (Exon 26)

aGGAGCAGTTGACCACAAGCTTAGC

GGTGGCTTTGCTTGTATGTTCTCC

382Aminosäure-Region

(3448- 3561)

LDL-Rezeptor (Promotor)

aAGGACTGGAGTGGGAATCAGAGC

TGCTGTGTCCTAGGAAACCC

252Region: -252 bis + 1

LDL-Rezeptor (Exon 1)

aTTGAAATGCGAAATGACGTGGCG

CTGGCGCCTGGAGCAAGC

256Signalpeptid


aCGTGGTCAGTTTCTGATTCTGGCG

ATAAATGCATATCATGCCCAAAGG

253Modul1:(Repeat1)

Ligandenbindung


aTCGGCCTCAGTGGGTCTTTC

ACTCCCCAGGACTCAGATAGGC

268Modul 1: (Repeat 2) Ligandenbindung

LDL-Rezeptor (Exon 4, 3´)

aACTGCGGCAGCGTCCCCGGC

GGCTGCAGGTGGAGCTGTTGC

297 Modul 1: (Repeat 3) Ligandenbindung

LDL-Rezeptor (Exon 4, 5´)

aACCTGTGGTCCCGCCAGC

CCAGGGACAGGTGATAGGACG

345Modul 1: (Repeats- 4 und 5) Ligandenbindung


aGGCCCTGCTTGTTTTCTCTGG

AGCAGCAAGGCACAGAGAATGG



aACGAAACTGAGGCTCAGACACACC

GCTCCCCACAAACTCTGCAAGC



aAGAGTGACCAGTCTGCATCCCTGG

TTGGTTGCCATGTCAGGAAGC

253Modul 2: EGF-Repeat


aTCCCCACCAAGCCTCTTTCTCTC

CCACCCGCCGCCTTCC

222Modul 2: EGF-Repeat


aCTGACCTCGCTCCCCGGACC

GGCTGCAGGCAGGGGCGACG

278Modul 2: EGF-Repeat + (YWTD Repeats 1 und 2)

3. Ergebnisse 118

Tabelle 13 (Fortzetzung): Oligonukleotid- Sequenzen für die Amplifikationen des

ApoB- 100 und LDL- Rezeptorgens und die codierenden Regionen der jeweiligen PCR-

Produkte.


GCAGTGAGATGAGGGCTCCTGG

aCCTGCAGCCCTCAGCGTCG

349Modul 2: EGF-Repeat + (YWTD Repeat 3)


aGGATCCTCCCCCGCCCTC

TGGCTGGGACGGCTGTCC

239Modul 2 EGF-Repeat + (YWTD Repeat 4)


GGCCCTCAGGCCCTCTGG

aCCGAGTTTTCTGCGTTCATCTT

336

Modul 2: EGF-Repeat + (YWTD Repeat 5)


aGTCATCTTCCTTGCTGCCTG

CACAAGGAGGTTTCAAGGTTGG

264 Modul 2: EGF-Repeat + (YWTD repeat 6)


aTCTCGTTCCTGCCCTGACTCC

GACACAGGACGCAGAAACAAGG

274

Modul 2: EGF-Repeat


aGGCACGTGGCACTCAGAAGACG

aGTGTGGTGGCGGGCCCAGTC

288

Modul 3: O-gebundene Zucker


aCTCCATTTCTTGGTGGCCTTCC

CATAGCGGGAGGGCTGTGACCTGG

239

Modul 4: Trans-membrane Domäne


aGGGCAGCTGTGTGACAGAGCG

CATGGCTCTGGCTTTCTAGAGAGG

279

Modul 4 + 5: Trans-membrane + cyto-plasmatische-Domäne


aCCTGAGTGCTGGACTGATAGTTTCC

AAGGCCGGCGAGGTCTCAGG

190

Modul 5: Cyto-plasmatische -Domäne

a 50-Bp GC- clamp: CGCCCGCCGCCGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGTCCCGCCGCCCCCGCCCG.

Zur Validierung des DGGE- Mutationsscreening- Systems wurden durch gezielte PCR-

Mutagenese Mutationen in Kontrollfragmente eingeführt. Diese wurden in

Etablierungsexperimenten als Positivkontrollen zur Überprüfung der Detektionskraft

des Systems verwendet Im weiteren Verlauf der Untersuchungen dienten dann

identifizierte Polymorphismen in den Exonen der LDLR und ApoB- 100- Gene als,

interne Positivkontrollen für die Mutationsanalysen (siehe auch Punkt 3.4.5 dieser

Arbeit).

3. Ergebnisse 119

3.3 Detektion von heterozygoten ApoB- Mutationen bei Patienten aus dem

Kollektiv der Marburger Präventions- Allianz durch DGGE- Screening

Für die DGGE- Untersuchungen von Exon 26 des ApoB- 100- Gens wurde die DNA

von 1000 konsekutiv gesammelten Patientenproben aus dem Kollektiv der Marburger-

Präventions- Allianz, wie unter Material und Methoden beschrieben, isoliert und

anschließend mittels PCR amplifiziert. Das DGGE- Screening erfolgte in 38-75%

linearen denaturierenden Gradientengelen, die mit Hilfe eines Gradientenmischers

hergestellt wurden. Nach einer Elektrophoresezeit von 5 Stunden bei 600C wurden die

Gele mit Ethidiumbromid gefärbt, unter UV- Licht betrachtet und ausgewertet. Von den

1000 initial gescreenten Patienten waren 853 Proben auswertbar. Bei fünf Patienten

konnte ein auffälliges DGGE- Bandenmuster nachgewiesen werden, das auf eine

heterozygote Mutation hinwies. In Abbildung 17 ist das mit Ethidiumbromid gefärbte

DGGE- Gel mit den identifizierten Mutationsträgern dargestellt.

Abbildung 17: Nachweis von auffälligen heterozygoten DGGE- Bandenmustern bei fünf

Patientenproben aus dem Kollektiv der Marburger Präventions- Allianz (Bahnen: 1-5). K =

Kontrolle (Wildtyp- ApoB- 100- DNA).

3.3.1 Identifizierung einer neuen ApoB- Mutation: ApoB- H3543YMarburg (ApoB-

Marburg)

Zum Nachweis des zugrundeliegenden Defekts auf DNA- Ebene bei den mittels DGGE-

Untersuchung identifizierten heterozygoten Mutationsträgern wurden jeweils 30µl PCR-

Produkt der jeweiligen Patienten über ein Agarosegel aufgereinigt, mit dem Big Dye

Terminator- Sequenzierungs- Kit sequenziert und der Sequenzierungslauf in einem

ABI Prism 310 DNA- Sequencer durchgeführt. Die Sequenzierungreaktionen der fünf

Probanden identifizierten bei einer Patientin die bekannte ApoB- R3500Q- Mutation

(R3500Q) und bei den anderen vier Patienten eine noch nicht beschriebene

Basensubstitution von C nach T an Nukleotidposition 10836 in Codon 3543 des ApoB-

Heteroduplex- Banden

Mut. Homoduplex- Bande

WT. Homoduplex- Bande

1 2 3 K 4 5

3. Ergebnisse 120

Gens (Abbildung 18 A). Als Folge dieses Basenaustausches wurde die basische

Aminosäure Histidin (Codon: CAC) durch die ungeladene Aminosäure Tyrosin (Codon:

TAC) substituiert (ApoB- H3543Y). Dadurch kam es bei der neuen ApoB- Marburg-

Mutation genau wie bei allen anderen weltweit bisher identifizierten FDB- ähnlichen

ApoB- Mutationen zum Verlust einer postiven Ladung im carboxyterminalen

Modulatorelement von ApoB- 100, über das die Bindung an den LDL- Rezeptor

ermöglicht wird (Abbildung 18 B) (Boren et al. 1998; Soufi et al. 2004).

A.

B.

Abbildung 18: A. Nachweis einer neuen ApoB- Mutation (ApoB- H3543Y) bei vier Patienten

aus dem Kollektiv der Marburger Präventions- Allianz durch Sequenzierung. B. Die Mutation

bewirkt genau wie bei allen anderen weltweit bisher identifizierten FDB- ähnlichen- ApoB-

Defekten den Verlust einer postiven Ladung im carboxyterminalen Modulatorelement von

ApoB- 100.

3.3.2 Untersuchungen des LDL- Rezeptorgens und ApoE- Genotypisierung bei den

Trägern von ApoB- H3543YMarburg

Um eine Beeinflussung des exogenen und endogenen Cholesterintransportes durch

zusätzliche Defekte im LDL- Rezeptor und dessen Ligand ApoE auszuschließen, wurde

das LDL- Rezeptorgen bei den fünf gefundenen Patienten mit ApoB- Defekt mittels

C10836T

ApoB- H3543YMarburgWildtyp- ApoB- 100

NH2 COOH

R3500W

R3500QR3480W R3531C H3543Y

carboxyterminales Modulatorelement

3. Ergebnisse 121

Std. H3543Y H3543Y R3500Q H3543Y H3543Y

404

501489

353

242

190

147

110 89

67

Bp

72 Bp

56 Bp

91 Bp

48 Bp

ApoE: 3/3 3/3 3/3 3/4 3/4

DGGE untersucht und eine ApoE- Genotypisierung durchgeführt. Die DGGE-

Untersuchungen des LDL- Rezeptorgens erfolgten genau wie unter Punkt 3.3

beschrieben. Für die ApoE- Genotypisierungen wurden jeweils 10ng Patienten- DNA

mit den Primerpaaren: ApoE (Vorwärts) 5´ -ATAAATATAAAATATAAATAACAGA

ATTCGCCCCGGCCTGGTACAC-3´ und ApoE (Rückwärts) 5´-TAAGCTTGGCAC

GGCTGTCCAAGGA-3´ - wie unter Material und Methoden beschrieben- mittels PCR

amplifiziert und anschließend 15µl des Reaktionsansatzes mit 5 Units (U)

Restriktionsendonuklease Cfo I für 12 Stunden bei 370C verdaut. Nach Auftrennung der

Fragmente in einem 14% Polyacrylamidgel und Färbung mit Ethidiumbromid, wurden

die ApoE- Genotypen ermittelt. In den Untersuchungen des LDL-Rezeptorgens fanden

sich bis auf vorbeschriebene frequente Polymorphismen in den Exonen: 2 (SfaN I), 10

(G/A), 12 (Hinc II) und 13 (Ava II) keine weiteren synonymen DNA- Mutationen. Die

ApoE- Genotypisierungen ergaben bei den Trägern von ApoB- H3543Y- Marburg je

zweimal den ApoE- Genotypen 3/3 und 3/4. Bei der Patientin mit der FDB-Mutation

(R3500Q) fand sich der ApoE- Genotyp 3/3. Somit konnte bei allen Patienten eine

Beeinflussung des exogenen/endogenen Cholesterintransportes durch zusätzliche

Mutationen im LDL- Rezeptor und den ApoE- Polymorphismus ausgeschlossen

werden. In Abbildung 19 sind die Ergebnisse der ApoE- Genotypisierungen aufgezeigt.

Abbildung 19: Ermittelte ApoE- Genotypen der Träger von ApoB- H3543YMarburg nach

Auftrennung der Fragmente in einem 14% Polyacrylamidgel. Es wurden je zweimal die ApoE-

Genotypen 3/3 und 3/4 nachgewiesen. Bei der Patientin mit der R3500Q- Mutation fand sich

der ApoE- Genotyp 3/3.

3. Ergebnisse 122

3.3.3 Haplotypanalyse der ApoB- H3543YMarburg - Träger

Die Tatsache, dass ApoB- H3543YMarburg im Kollektiv der Marburger Präventions-

Allianz sehr viel häufiger gefunden wurde als die klassische FDB- Mutation (R3500Q),

welche in den publizierten Daten als die am häufigst vorkommende in kaukasischen

Populationen beschrieben wurde (Fisher et al. 2000; Horvath und Ganev 2001),

veranlasste uns dazu, herauszufinden, ob der neue ApoB- Marburg- Defekt mit einem

individuellen Haplotyp assoziert ist. Eine weitere Frage, die durch die Haplotypanalyse

abgeklärt werden sollte, war, ob zwischen den Mutationsträgern ein mögliches

Verwandtschaftsverhältnis bestand, welches die Häufigkeit von ApoB- H3543Y- Marburg

im untersuchten Kollektiv erklären könnte. Obwohl ein direkter Verwandtschaftsgrad

schon aus den anamnestischen Daten formell nicht ersichtlich war, weil zwei der

Patienten aus anderen Regionen Deutschlands stammten, sollte dieses durch eine

zusätzliche Haplotyp- Untersuchung abgeklärt werden. Hierzu wurden vier polymorphe

Marker in Exon 26 von ApoB, sowie ein 15 Bp TA(n)- polymorphes Nukleotid- Repeat

(3´HVR) in der 3´ Region des ApoB- Gens untersucht (Pullinger et al. 1992; Choong et

al. 1999). Zur detaillierten Untersuchung und Absicherung des Haplotyps wurden des

weiteren die Schwester und der Bruder von einem der ApoB- H3543Y- Träger (Patient

4) untersucht. Diese beiden Geschwister waren ebenso wie der Indexpatient

heterozygote Träger der ApoB- H3543Y- Mutation (Abbildung 20 A). Die ApoB-

Haplotyp- Untersuchung erfolgte anhand der von Pullinger et al. publizierten Methode

(Pullinger et al. 1992). Jeweils 15µl der PCR- Produkte von den ApoB-

Mutationsträgern und einer gesunden Kontrollperson wurden mit 5 U der

Restriktionsendonukleasen: Xba I, Xsp I, Msp I sowie EcoR I für 12 Stunden bei 370C

verdaut und anschließend nach Auftrennung der Spaltprodukte in einem 2% Agarosegel

die individuellen Haplotypen ermittelt (Abbildung 20 B). Die Bestimmung der Anzahl

an 15 Bp TA(n)- Nukleotid- Repeats in der 3´ Region des ApoB- Gens der Patienten

erfolgte durch Sequenzierung und Auftrennung der PCR- Produkte in einem 2%-

Agarosegel (Abbildung 20 C). In Tabelle 14 sind alle Daten der ApoB- Haplotyp-

Untersuchungen der identifizierten Mutationsträger zusammengefasst.

3. Ergebnisse 123

A.

B.Haplotypanalyse der ApoB- H3543YMarburg - Patienten:

Exon 26 (Xba I)

+/- +/- +/- +/+ +/- +/- +/- -/-

ApoB- H3543YMarburg - Familie

Exon 26 (Msp I)

Exon 26 (Xsp I)

Exon 26 (EcoR I)

H3543Y* H3543Y* H3543Y* H3543Y H3543Y H3543Y Kontr. R3500Q

+/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+

+/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+

+/- +/- +/- +/+ +/+ +/+ +/+ +/+

1 2 3 4

1 2 3 4 5 6 7

I.

II.

#

1

III.

#

#

2

#* * *

Stammbaum der untersuchten ApoB- H3543YMarburg - Familie:

3. Ergebnisse 124

C.

Abbildung 20: Haplotypanalyse der ApoB- H3543YMarburg und R3500Q- Patienten, sowie einer

Kontrollperson (Kontr.). A. Stammbaum der Familie von einem der identifizierten Träger von

ApoB- H3543YMarburg (Patient 4). Zur Untersuchung und Absicherung des Haplotyps wurden

die ebenfalls heterozygot betroffene Schwester und der Bruder des Patienten in die Analyse mit

einbezogen (*). Ein # markiert Mitglieder der Familie, die an KHK litten und an den Folgen

dieser verstorben sind. B. Darstellung der ermittelten ApoB- Haplotypen in einem 2%

Agarosegel nach Verdau mit den Restriktionsendonukleasen: Xba I, Xsp I, Msp I sowie EcoR I.

Ein + symbolisiert das Vorhandensein und ein - die Abwesenheit der entsprechenden

Schnittstellen. C. Untersuchung der polymorphen Nukleotid- Repeats in der 3´ Region des

ApoB- Gens (3´HVR) der Patienten. Die Zahlen geben die Anzahl an 15 Bp TA- Nukleotid-

Repeats an.

Tabelle 14: Zusammenfassung der ApoB- Haplotypanlysen und ermittelter Konsensus-

Haplotyp der ApoB- H3543YMarburg - Mutationsträger.

Patient/Mutation Mutation Xba I Msp I Xsp I EcoR I 3´HVR

1* (H3543Y) +/- +/- +/+ +/+ +/- 37/35

2* (H3543Y) +/- +/- +/+ +/+ +/- 37/35

3* (H3543Y) +/- +/- +/+ +/+ +/- 37/35

4 (H3543Y) +/- +/+ +/+ +/+ +/+ 35/29

5 (H3543Y) +/- +/- +/+ +/+ +/+ 35/29

6 (H3543Y) +/- +/- +/+ +/+ +/+ 35/29

7 (Wildtyp) -/- +/- +/+ +/+ +/+ 37/35

8 (R3500Q) +/- -/- +/+ +/+ +/+ 49/49

Konsensus- Haplotyp (H3543Y) + + + + + 35

ApoB - 3´ HVR-Repeat- Untersuchung: (Anzahl der 15 BpTA(n)- Repeats)

Std. H3543Y* H3543Y* H3543Y* H3543Y H3543Y H3543Y Kontr. R3500Q

1000

750

500

Bp

37/35 37/35 37/35 35/29 35/29 35/29 37/35 49/49

3. Ergebnisse 125

Aus den Daten der Haplotyp- Untersuchungen ging hervor, dass ApoB- H3543YMarburg

einen eigenständigen Konsensus-Haplotyp aufwies: Xba I +, Msp I +, Xsp I +, EcoR I +

und 3´HVR 35, der sich von den bisher beschriebenen Haplotypen der anderen

publizierten ApoB- Mutationen unterschied (Wenham et al. 1997; Fisher et al. 1999).

Ein direktes Verwandschaftsverhälnis der Träger von ApoB- H3543YMarburg war

ebenfalls unwahrscheinlich, da bei einigen der Patienten Unterschiede hinsichtlich des

Vorhandenseins bzw. der Abwesenheit der polymorphen Schnittstellen nachzuweisen

waren (Tabelle 14). Bei der identifizierten Patientin mit der ApoB- R3500Q- Mutation

fand sich der für diese Mutation in kaukasischen Populationen sehr häufig beschriebene

Haplotyp: Xba I -, Msp I +, Xsp I +, EcoR I + und 3´HVR 49 (Ludwig und McCarthy

1990).

3.3.4 Lipidparameter, Klinik und Prävalenz von ApoB- H3543YMarburg

Die Lipidwerte der ApoB- H3543YMarburg- Patienten unterschieden sich von denen des

übrigen Studienkollektivs. Die Werte für Gesamtcholesterin (+ 100 mg/dl), LDL-

Cholesterin (+ 65 mg/dl), Triglyzeride (+ 170 mg/dl) sowie ApoB- 100 (+ 55 mg/dl)

waren, verglichen mit dem übrigen Studienkollektiv, deutlich erhöht. Die Werte für das

HDL- Cholesterin (- 2 mg/dl) und Apo A-I (+ 35 mg/dl) lagen im Normbereich.

Verglichen mit anderen FDB- Kollektiven waren die Werte für Gesamtcholesterin

(GC), LDL- Cholesterin (LDL- C) und ApoB im untersuchten Kollektiv niedriger. Die

Mittelwerte für GC. und LDL- C. der ApoB- H3543YMarburg- Patienten, waren

verglichen mit denen der R3500Q- Mutation, nur moderat erhöht (Miserez und Keller

1995) und lagen im Bereich publizierter Werte für R3500W und R3531C (Gaffney et al.

1995; Gaffney et al. 2002). Wie bei den anderen FDB- Mutationen, fand sich eine große

Variabilität der Klinik- und Lipidparameter der einzelnen Patienten (Gaffney et al.

1995). Durch die ApoE- Genotypisierungen und Untersuchung des LDL- Rezeptorgens

konnte eine Beeinflussung der Lipidwerte und des Lipidstoffwechsels durch zusätzliche

Defekte in diesen Genen ausgeschlossen werden. Klinisch fand sich bei drei der vier

gefundenen ApoB- H3543Y- Mutationsträger eine angiografisch gesicherte koronare

Herzerkrankung, nur bei dem jüngsten Patienten (Alter 42 Jahre) konnte eine KHK

ausgeschlossen werden. Die Anamnese ergab, dass alle vier Patienten eine positive

Familien- Anamnese für Hyperlipidämie und frühzeitige KHK hatten. Bei keinem der

Patienten fanden sich Xanthome der Sehnen, Xanthelasmen oder ein Arcus lipoides. Die

3. Ergebnisse 126

neue ApoB- H3543YMarburg- Mutation wurde bei insgesamt 4 Patienten in einer aus

Deutschland stammenden Population von 853 konsekutiv gesammelten und

koronarangiografierten Patienten der Marburger Präventions- Allianz gefunden,

wohingegen die klassische FDB- Mutation (R3500Q) nur einmal detektiert wurde.

Damit ist ApoB- H3543YMarburg mit einer Häufigkeit von 0,48% eine in Deutschland

sehr häufig vorkommende ApoB- Mutation, wenn nicht sogar die häufigste FDB-

ähnliche Mutation in Deutschland, wenn man sie mit der Häufigkeit für die ApoB-

R3500Q- Mutation (Prävalenz: 0,12%) im untersuchten Kollektiv vergleicht (Soufi et

al. 2004). In der Tabelle 15 sind die ermittelten Lipidparameter und klinischen Daten

aller identifizierten ApoB- Mutationsträger zusammengefasst.

Tabelle 15: Zusammenfassung des ermittelten Lipidpstatus und klinische Daten aller

identifizierten ApoB- Mutationsträger aus dem Kollektiv der Marburger Präventions-

Allianz. Die Patienten waren ohne lipidsenkende Medikation. Patient Nr. 4 ist kurz nach

der Untersuchung an den Folgen seiner KHK verstorben. n.b = nicht bestimmt.

Patient (Mutation) Alter GC

(mg/dl)

Tgl.

(mg/dl)

HDL- C

(mg/dl)

LDL- C

(mg/dl)

ApoB

(mg/dl)

Lp(a)

(mg/dl)

ApoE KHK

1. (H3543Y) 69 270 145 60 181 145 < 10 3/4 1- Gefäß

2. (H3543Y) 49 279 341 36 174 140 < 10 3/4 2- Gefäß

3. (H3543Y) 42 217 166 17 167 n.b. < 10 3/3 keine

4. (H3543Y) 64 220 235 43 130 129 85 3/3 3- Gefäß

5. (R3500Q) 61 300 95 41 240 190 < 10 3/3 1- Gefäß

3. Ergebnisse 127

3.4 Untersuchungen des LDL- Rezeptorgens bei familiärer Hypercholesterinämie

(FH)

Neben den Defekten des ApoB als eine der Ursachen für die Entstehung von

Hypercholesterinämien und Manifestation einer frühzeitigen Atherosklerose bewirken

Defekte im LDL- Rezeptor schwerste Formen der familiären Hypercholesterinämie

(FH). Die Inzidenz für die autosomal dominant vererbte Erkrankung liegt bei 1:250-

1:500 für Heterozygotie und ca. 1:1000000 für Homozygotie. Die Cholesterinspiegel

von betroffenen Patienten liegen bei 300-600 mg/dl (Heterozygote) und 600-1200 mg/dl

(Homozygote). Bei homozygoten Patienten findet man phänotypisch neben der

Ausbildung von schweren tuberösen Sehnenxanthomen und Xanthelasmen der Haut

eine rasch voranschreitende Atherosklerose der Koronarien, die sich bereits vor dem 10.

Lebensjahr manifestiert. Die Lebenserwartung unbehandelter homozygoter FH-

Patienten liegt unter 20 Jahren. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurden die molekularen

Ursachen von extrem seltenen Formen der familiären Hypercholesterinämie, die sich

schon in frühester Kindheit manifestieren, untersucht.

3.4.1 Erstmalige Beschreibung von homozygoter familiärer Hypercholesterinämie

(FH) bei eineiigen Zwillingen

Kasuistik und Lipidparameter der FH- Familie

Im Rahmen einer Untersuchung stellte sich Ende 1999 in der Stoffwechselambulanz der

Universitätskinderklinik der Philipps-Universität Marburg zur Abklärung von

gelblichen tuberösen Ablagerungen in der Haut und an den Strecksehnen von

Ellenbogen und Knien, eine türkische Familie mit einem 3- jährigem eineiigen

männlichen Zwillingspaar vor. Die von Prof. Dr. Juergen Schaefer durchgeführte

Konsilliaruntersuchung diagnostizierte eine homozygote familiäre Hyper-

cholesterinämie (FH) bei den Kindern (Abbildung 21). Die Familienanamnese ergab ein

consanguines Verwandtschaftsverhältnis 1. Grades der beiden 36 und 30 Jahre alten

Eltern der Kinder. Phänotypisch zeigten sich bei den Eltern keine Merkmale einer FH.

Die lipidologische Labordiagnostik der Familie ermittelte bei den Kindern ein

Gesamtcholesterin, das bei 1260/1160 mg/dl lag und ein LDL- Cholesterin von

1192/1093 mg/dl, was dem 12fachen des Normwerts entsprach. Die Triglyzeride waren

mit 275/260 mg/dl ebenfalls erhöht und das HDL- Cholesterin mit 13/15 mg/dl stark

3. Ergebnisse 128

erniedrigt, zusätzlich fand sich bei den Zwillingen ein mit 84/75 mg/dl deutlich erhöhtes

Lp(a). Bei den Eltern waren die Werte für Gesamtcholesterin mit 355 mg/dl (Vater) und

290 mg/dl (Mutter) ebenfalls erhöht. Das LDL- Cholesterin betrug 307/220 mg/dl, und

das HDL- Cholesterin war beim Vater mit 29 mg/dl erniedrigt, während es bei der

Mutter mit 58 mg/dl im Normbereich lag. Beide Eltern hatten zudem ein mit 130 bzw.

46 mg/dl deutlich erhöhtes Lp(a). Tabelle 16 zeigt den kompletten ermittelten

Lipidstatus der türkischen FH- Familie.

Abbildung 21: Phänotypische Merkmale der weltweit erstmals bei einem 3- jährigem

türkischen eineiigen männlichen Zwillingspaar identifizierten homozygoten familiären

Hypercholesterinämie (FH). Die Bilder zeigen gelbliche tuberöse und eruptive Ablagerungen

von Cholesterin in der Haut und an den Strecksehnen von Ellenbogen/Knien bei den Kindern.

3. Ergebnisse 129

Tabelle 16: Zusammenfassung des ermittelten Lipidstatus der türkischen FH- Familie.

Patient Alter GC

(mg/dl)

Tgl.

(mg/dl)

HDL- C

(mg/dl)

LDL- C

(mg/dl)

ApoB

(mg/dl)

Lp(a)

(mg/dl)

Vater 36 355 95 29 307 238 130

Zwilling 1 3 1260 275 13 1192 792 84

Zwilling 2 3 1160 260 15 1093 658 75

Mutter 30 290 60 58 220 179 46

Zur Aufklärung der molekularen Ursache der familiären Hypercholesterinämie (FH) bei

der türkischen Familie wurde ein komplettes Familien- Screening des LDL-

Rezeptorgens mittels DGGE durchgeführt.

3.4.2 Nachweis einer neuen LDL- Rezeptor Mutation: FH- W556RMarburg

Das Familien- Screening des LDL- Rezeptorgens mittels DGGE führte zur Detektion

einer homozygoten Mutation in Exon 12 des LDL- Rezeptorgens bei den Zwillingen.

Beide Eltern waren aufgrund des consanguinen Verwandtschaftsverhältnisses- wie zu

erwarten- heterozygote Träger der Mutation (Abbildung 22 A). Die

Sequenzierungreaktionen identifizierten eine Basensubstitution von T nach C in cDNA-

Position 1729 des LDL- Rezeptors. Als Folge dieses Basenaustausches wurde die

hydrophobe ungeladene Aminosäure Trypthophan 556 im LDL- Rezeptor (Codon:

CCG) durch die positiv geladene hydrophile Aminosäure Arginin (Codon: TCG)

substituiert (FH- W556R). Zusätzlich zur Mutation FH- W556RMarburg konnte durch die

DNA- Sequenzierung bei den Zwillingen der Exon 12 Hinc II- Polymorphismus in

homozygoter Form identifiziert werden, die beiden Eltern waren heterozygote Träger

des Polymorphismus (Abbildung 22 B). Eine Untersuchung der DNA- Sequenz von

Exon 12 der Familie mit dem Computerprogramm BioEdit- Sequence Alignment Editor

(Free Download unter: ftp://iubio.bio.indiana.edu/molbio/seqpup/) ergab, dass durch

die Mutation eine Schnittstelle für die Restriktionsendonuklease Nci I entstand, über die

FH- W556RMarburg durch PCR- RFLP- Analyse zusätzlich verifiziert wurde (Abbildung

22 C).

ftp://iubio.bio.indiana.edu/molbio/seqpup/

3. Ergebnisse 130

A.

B.

C.

Abbildung 22: A. Nachweis einer Mutation in Exon 12 des LDL- Rezeptorgens mittels DGGE.

Die Eltern (V, M) sind heterozygote Träger für dieselbe Mutation und haben den Defekt

homozygot auf beide Kinder vererbt (Z 1, Z 2). Beide Eltern sind zusätzlich heterozygote

Träger des Exon 12- LDLR- Hinc II- Polymorphismus. K1= Wildtyp- LDLR mit Hinc II-

Polymorphismus (heterozygot). K2= Wildtyp- LDLR ohne Hinc II- Polymorphismus. K3=

Wildtyp- LDLR mit Hinc II- Polymorphismus (homozygot). B. Sequenzierungreaktionen von

Exon 12 und Nachweis einer neuen T/C Basensubstitution in cDNA- Position 1729 des LDL-

Rezeptors.C. Verifizierung der Mutation FH- W556R auf DNA- Ebene durch Verdau mit Nci I.

Sequenzierung: FH- Marburg- LDLR (Exon 12)

T1729C (homozygot) W556RT1729C (heterozygot) W556R

V Z 1 Z 2 M K 1 K 2 K 3

Heteroduplex- Banden

Mut. Homoduplex- BandeWT. Homoduplex- Bande

DGGE: FH- Marburg- LDLR (Exon 12)

PCR- RFLP: LDLR (Exon 12) Nci I

1000

Bp

750

500

300

150

5095 Bp

345 Bp

250 Bp

Std. K 1 V Z 1 Z 2 M K 2

3. Ergebnisse 131

3.4.3 FH- W556RMarburg verändert die Struktur eines hochkonservierten YWVD-

Repeats im ß-Propeller- Motif des LDL- Rezeptors

Eine Untersuchung der strukturellen Auswirkung von FH- W556RMarburg ergab, dass die

Mutation das fünfte von sechs hochkonservierten YWTD- Repeats des LDL- Rezeptors

betraf, das Bestandteil der YWTD- Domäne des ß- Propeller- Motifs („six bladed

propeller structure“) ist (Jeon et al. 2001). Wie bereits in Punkt 1.3.1 dieser Arbeit

erwähnt, spielt die YWTD- Domäne eine wichtige Rolle bei der pH- abhängigen

Dissoziation des Rezeptor- Liganden- Komplexes im sauren Milieu des Endosoms

(Innerarity 2002). Alle bisher beschriebenen FH- Mutationen, die

Aminosäuresubstitutionen in den sechs YWTD- Repeats bewirkten, produzierten LDL-

Rezeptoren, bei denen der Transport vom endoplasmatischen Retikulum (ER) zum

Golgi Apparat komplett blockiert ist (Klasse 2A LDLR- Transportdefekte). Aufgrund

inkorrekter Faltung der 120 KDa LDL- Rezeptor- Präkursormoleküle werden diese

Rezeptoren rapide im ER abgebaut, was zu einer Rezeptordefizienz an der

Zelloberfläche führt (Goldstein und Brown 1989; Hobbs et al. 1990) Im fünften

YWVD- Repeat des LDL- Rezeptors wurde bereits eine Mutation in Dänemark

beschrieben, welche die Aminosäure Tryptophan 556 betraf und zu FH führte. Bei

dieser Mutation wurde Tryptophan 556 durch Serin substituiert (W556S), jedoch wurde

diese Mutation bisher nur in heterozygoter Form nachgewiesen (Jensen et al. 1997).

FH- W556RMarburg ist somit weltweit die erste tatsächliche homozygote Mutation („true

homozygous“) im fünften YWVD- Repeat des LDL- Rezeptors, die bei eineiigen

Zwillingen identifiziert werden konnte. In Abbildung 23 ist die Auswirkung von FH-

W556RMarburg auf die Struktur der YWTD- Domäne des LDL- Rezeptors grafisch

dargestellt.

3. Ergebnisse 132

Abbildung 23: Auswirkung von FH- W556RMarburg auf die Struktur des LDL- Rezeptors. Die

Mutation betrifft das fünfte von sechs hochkonservierten YWTD- Repeats der YWTD- Domäne

des ß- Propeller- Motifs. Alle FH- Mutationen, die Aminosäuresubstitutionen in den sechs

YWTD- Repeats bewirken, produzierten Klasse 2A- LDL- Rezeptoren, bei denen der Transport

vom Endoplasmatischen Retikulum (ER) zum Golgi- Apparat komplett blockiert ist.

3.4.4 Unterschiedliche LDL- Cholesterinspiegel bei identischer Mutation, aber

unterschiedlichem Geschlecht ( „Gender Specific Cholesterol“ )

Kasuistik und molekulargenetische Untersuchung einer weiteren FH- Familie

Zur Aufklärung der molekulargenetischen Ursache einer homozygoten familiären

Hypercholesterinämie (FH) übersandte uns die Abteilung Innere Medizin des

Zentralkrankenhauses links der Weser in Bremen (Direktor: Prof. Dr. G. Klose) die

LDL- Rezeptor- YWTD- Domäne (ß- Propeller- Motif)

COOH

LDL- Rezeptor

NH2 Wildtyp- LDLR

YWTD 3(Ex. 10)

YWTD 4(Ex.11 )

YWVD 5(Ex. 12)

FWTD 6(Ex.13)

YWSD 2(Ex. 9)

FFTN 1(Ex. 9)

YWTD 3

YWTD 4

FWTD 6YWSD 2

FFTN 1

FH- W556RMarburg

= LDLR- Repeats mit Ca2+ Ion (Bindung)

= EGF- Repeats

= ß-Propeller- Motif (6xYWTD- Repeats )

= O- gebundene Zucker

= Transmembrane Domäne

= NPxY-Motif

YRVD 5

3. Ergebnisse 133

Blutproben einer libanesischen Familie mit zwei Töchtern. An äußerlichen Merkmalen

fanden sich bei der Indexpatientin, einem 4 jährigen Mädchen, genau wie bei den

Kindern der türkischen FH- Familie, schwere tuberöse Sehnenxanthome und

Xanthelasmen der Haut. Die Familienanamnese ergab, wie bei der türkischen Familie

aus Marburg, ein consanguines Verwandtschaftsverhältnis 1. Grades der beiden 24 und

20 Jahre alten Eltern des Mädchens. Phänotypisch zeigten sich bei den Eltern und einer

weiteren 2- jährigen Tochter keine Merkmale einer FH. Die lipidologische

Labordiagnostik der Familie ermittelte bei der Indexpatientin ein Gesamtcholesterin,

das bei 797 mg/dl lag und ein LDL- Cholesterin von 723 mg/dl. Die Triglyzeride und

das HDL- Cholesterin waren mit 108 bzw. 52 mg/dl normal. Das Lp(a) des Mädchens

war, anders als bei der Marburger Familie, nicht erhöht. Bei den Eltern und der

Schwester des Kindes waren die Werte für Gesamtcholesterin mit: 290 mg/dl (Vater),

234 mg/dl (Mutter) und 344 mg/dl Schwester erhöht. Die Werte für das LDL-

Cholesterin lagen bei 227/190 mg/dl (Vater/Mutter) und 287 mg/dl bei der Schwester.

Das HDL- Cholesterin lag bei Mutter und Vater bei 41/35 mg/dl und bei der jüngeren

Schwester bei 43 mg/dl. Tabelle 17 fasst den ermittelten Lipidstatus der libanesischen

FH- Familie zusammen.

Tabelle 17: Zusammenfassung des ermittelten Lipidstatus der libanesischen FH-

Familie.

Patient Alter GC

mg/dl

Tgl.

mg/dl

HDL- C

mg/dl

LDL- C

mg/dl

ApoB

mg/dl

Lp(a)

mg/dl

Vater 24 290 110 34 227 171 < 10

Tochter 1 4 797 108 52 723 495 < 10

Tochter 2 2 344 70 43 287 246 < 10

Mutter 20 234 48 41 190 156 < 10

Die Untersuchungen des LDL- Rezeptorgens mittels DGGE und die

Sequenzierungreaktionen identifizierten bei der Indexpatientin- genau wie bei der

Marburger FH- Familie- die W556R- Mutation in homozygoter Form als Ursache der

familiären Hypercholesterinämie (FH). Beide Eltern und die Schwester waren

heterozygote Träger der Mutation (Abbildung 24 A). Neben FH- W556RMarburg konnte

wie bei den türkischen Kindern zusätzlich der Exon 12 Hinc II- Polymorphismus in

3. Ergebnisse 134

homozygoter Form nachgewiesen werden. Anders als bei den Eltern der türkischen FH-

Familie aus Marburg, waren die Eltern und die Schwester des Kindes jedoch auch

homozygote Träger dieses Polymorphismus (Abbildung 24 B). Aus den

Untersuchungen und dem Lipidstatus geht hervor, dass trotz identischer LDL-Rezeptor-

Mutation die LDL- Cholesterinwerte bei dem homozygot betroffenen 4- jährigen

Mädchen aus der libanesichen Familie deutlich niedriger lagen, als bei den türkischen

Jungen. Zudem fand sich auch ein deutlich höheres HDL- Cholesterin bei dem

Mädchen. Ein Vergleich der männlichen und weiblichen Familienmitglieder aus beiden

Familien zeigt, dass weibliche Mutationsträger bei Diagnose (unter keiner

medikamentösen Therapie) niedrigere LDL- und höhere HDL- Plasmaspiegel hatten.

Dies lässt auf eine eventuelle geschlechtsspezifische Ausprägung des Phänotyps bei

FH- W556R schließen. In mehreren Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass

Östrogene und Androgene die Transkription einer Vielzahl von Genen des

Lipidstoffwechsels (z.B. LDLR, VLDLR, SCARB1, ABCA1 und ApoA-I) beeinflussen

(Wu und von Eckardstein 2003; Schmitz und Langmann 2005). Diese Modulation der

Genexpression erfolgt sowohl über direkte Mechanismen (Bindung von aktivierten

Hormonrezeptoren an Hormone responsive elements (HREs)) in den Promotoren dieser

Gene, als auch über indirekte Mechanismen, durch Interaktion von aktivierten

Hormonrezeptoren mit Transkriptionsfaktoren des Transkriptionskomplexes ohne

vorherige Bindung an HREs (Harnish et al. 1998; Sattler et al. 2005). Als Folge dieser

Prozesse kommt es dann zu einer unterschiedlich starken hormonabhängigen

Transaktivierung dieser Gene bei Männern und Frauen, was zu einer heterogenen

Ausprägung des Phänotyps bei FH, trotz Vorliegen einer identischen LDLR- Mutation,

führen könnte (siehe auch Punkt 4. Diskussion dieser Arbeit).

A. DGGE: FH- Familie- Libanon- LDLR (Exon 12)

V T 1 T 2 M K 1 K 2 K 3

Heteroduplex-Banden

Mut. Homoduplex-BandeWT. Homoduplex-Bande

3. Ergebnisse 135

B.

Abbildung 24: Erneuter Nachweis von FH- W556RMarburg bei einer FH- Familie aus dem

Libanon. A. DGGE von Exon 12 der FH- Familie. Die Eltern (V, M) sind heterozygote Träger

der Mutation und haben den Defekt homozygot bzw. heterozygot auf die Töchter (T1, T2)

vererbt. K1-K3: Wt- LDLR- Kontrollen. B. Erneuter Nachweis von FH- W556RMarburg durch

DNA- Sequenzierung von Exon 12.

3.4.5 Die DGGE und LDLR- Haplotypanalysen zeigen, dass beide FH-Familien

nicht direkt miteinander verwandt sind.

Die Tatsache, dass eine homozygote FH mit einer Inzidenz von 1:1000000 sehr selten

vorkommt und FH- W556RMarburg bei zwei Familien gleichzeitig gefunden wurde, legte

nahe, dass eine direkte Verwandtschaft zwischen beiden FH- Familien bestand. Aus den

Daten der Anamnese beider Familien ging hervor, dass weder die libanesische Familie,

noch die türkische Familie direkte Verwandte in der Türkei bzw. im Libanon hatten.

Um abzuklären, ob doch ein direktes mögliches Verwandtschaftsverhältnis bestand,

wurden die generierten molekulargenetischen Daten der DGGE- Untersuchungen

(Abbildung 25), sowie der DNA- Sequenzierungen beider Familien und der

untersuchten Kontrollpersonen direkt miteinander verglichen (Abbildung 26).

Zusätzlich wurde durch die Untersuchung fünf polymorpher Marker des LDL-

Rezeptorgens (SfaN I: Exon 2, Stu I: Exon 8, Hinc II: Exon 12, Ava II: Exon 13 und

FH- W556RMarburg/Libanon (hom.)

FH- W556RMarburg/Libanon (het.) Hinc II T/C-Polymorphismus

T1729C C/C

C/CT1729C

3. Ergebnisse 136

Pvu I: Exon 18) ermittelt, mit welchem LDLR- Haplotyp FH- W556RMarburg

coseggregiert (Abbildung 27). In der Tabelle 18 sind alle Daten der LDLR-

Haplotypanalysen der identifizierten FH- W556RMarburg- Familien zusammengefasst.

Abbildung 25: Vergleich der DGGE- Analysen von Exon 12 des LDL- Rezeptorgens der

identifizierten FH- W556RMarburg- Familien. Die Bandenmuster der heterozygot betroffenen

Eltern in beiden Familien unterscheiden sich deutlich voneinander. Während die Eltern der

türkischen Kinder heterozygote Träger des Hinc II- Polymorphismus sind (siehe Vergleich der

Bandenmuster von V, M mit den Kontrollen K1, K2), sind die Eltern der libanesischen Familie

homozygote Träger des Polymorphismus (siehe Vergleich der Bandenmuster von V, M, T2 mit

den Kontrollen K1, K3). Im Gegensatz dazu ist die Migration der DNA- Bande mit der

Mutation bei allen betroffenen Familienmitgliedern gleich. Abkürzungen: V= Vater, M=

Mutter, Z1/Z2= Zwilling 1 bzw. 2, T1/T2= Tochter 1 bzw. 2, K1= Wildtyp- LDLR mit Hinc II-

Polymorphismus (heterozygot). K2= Wildtyp- LDLR ohne Hinc II- Polymorphismus. K3=

Wildtyp- LDLR mit Hinc II- Polymorphismus (homozygot).

V Z 1 Z 2 M K 1 K 2 K 3 V T 1 T 2 M K 1 K 3 K 2

FH- W556RMarburg/Türkei FH- W556RMarburg/Libanon

3. Ergebnisse 137

Vergleich der DNA- Sequenzierungen beider FH- Familien und der Kontrollen

Abbildung 26: Vergleich der DNA- Sequenzierungen von Exon 12 des LDL- Rezeptorgens der

identifizierten FH- W556RMarburg- Familien und der Kontrollen. Die heterozygot betroffenen

Patienten in beiden Familien unterscheiden sich hinsichtlich des Hinc II- Polymorphismus

voneinander. Die Eltern der türkischen Kinder sind heterozygote Träger des Polymorphismus

(T/C), wohingegen alle Mitglieder der libanesischen Familie homozygote C/C- Träger dieses

Polymorphismus sind (V, M, T1). Die homozygote LDLR- Mutation T1729C (FH-

W556RMarburg) der Kinder aus beiden Familien (Z1/2 und T1) wird gekoppelt mit dem Hinc II-

C- Allel vererbt. Abkürzungen: V= Vater, M= Mutter, Z1/Z2= Zwilling 1 bzw. 2, T1/T2=

Tochter 1 bzw. 2, K1-3= Wildtyp- LDLR- Kontrollen.

Hinc II T/C- Polymorphismus

LDLRYWVD-Repeat 5

T/TWT:T/T

WT:T/T

WT:T/T T/C

C/C

FH-W556RMarburg/Türkei

(Het.)Mut:T/C

FH-W556RMarburg/Libanon

(Het.)

FH-W556RMarburg/Türkei/Libanon

(Hom.)

T/C

C/CMut: T/C

C/CMut: C/C

Wildtyp- LDLRExon 12 (Kontrollen 1- 3)

Z1/2 und T1:

V, M, T2:

V, M:

K1:

K2:

K3:

3. Ergebnisse 138

LDLR- Haplotypen der identifizierten FH- W556RMarburg- Familien

Abbildung 27: LDLR- Haplotypanalyse der beiden FH- W556RMarburg- Familien. Zur

Bestimmung der Haplotypen wurden jeweils 15µl der für die DGGE- Untersuchungen

verwendeten PCR- Produkte von allen FH- W556RMarburg- Mutationsträgern und den

Kontrollpersonen (K1-3) mit 5 U der Restriktionsendonukleasen: SfaN I, Stu I, Ava II und Nco

I für 12 Stunden bei 370C verdaut und anschließend nach Auftrennung der Spaltprodukte in

einem 2% Agarosegel die individuellen Haplotypen ermittelt. Ein + symbolisiert das

Vorhandensein und ein - die Abwesenheit der entsprechenden Schnittstellen.

Tabelle 18: Zusammenfassung der LDLR- Haplotypanalysen der beiden FH-

W556RMarburg- Familien.

LDLR- Polymorphismus V Z1 Z2 M V T1 T2 M K1 K2 K3

SfaN I (Exon 2) +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+

Stu I (Exon 8) +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ -/- +/+

Hinc II (Exon 12) +/- +/+ +/+ +/- +/+ +/+ +/+ +/+ +/- -/- +/+

Ava II (Exon 13) +/- -/- -/- +/- -/- -/- -/- -/- +/- -/- +/+

Nco I (Exon18) -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/-

LDLR (W556R) Konsensus +/- +/+ +/+ +/- +/- +/+ +/- +/- -/- -/- -/-

Exon 2 (SfaN I)

+/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+

+/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ -/- +/+

+/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+

+/- -/- -/- +/- -/- -/- -/- -/- +/- -/- +/+

Std. V Z 1 Z 2 M V T 1 T 2 M K 1 K 2 K 3

FH-W556RMarburg/Türkei FH-W556RMarburg/Libanon

Exon 8 (Stu I)

Exon 13 (Ava II)

Exon 18 (Nco I)

3. Ergebnisse 139

Aus den Daten der Haplotyp- Untersuchungen geht hervor, dass FH- W556RMarburg den

Konsensus- Haplotypen: SfaN I +, Stu I +, Hinc II + Ava II - und Nco I - aufweist. Ein

direktes Verwandschaftsverhältnis 1. Grades zwischen beiden FH- Familien kann

formell ausgeschlossen werden, da die heterozygot betroffenen Familienmitglieder aus

beiden Familien sich hinsichtlich des Vorhandenseins bzw. der Abwesenheit der

polymorphen Schnittstellen in den LDLR- Exonen 12 und 13 voneinander

unterscheiden und somit das Wildtyp- LDLR- Allel in beiden Familien mit einem

unterschiedlichen Haplotyp seggregiert.

3.4.6 ApoE- Genotypisierungen der beiden FH- W556RMarburg- Familien

Um eine Beeinflussung des exogenen und endogenen Cholesterintransportes durch

einen zusätzlichen Defekt im Liganden ApoE des LDL- Rezeptors auszuschließen,

wurde bei den identifizierten FH- W556RMarburg- Familien eine Genotypisierung des

ApoE durchgeführt. Die ApoE- Genotypisierungen wurden genau wie unter Punkt 3.3.2

beschrieben durchgeführt. Nach Verdau der PCR- Produkte mit 5 U

Restriktionsendonuklease Cfo I für 12 Stunden bei 370C, wurden die Fragmente in

einem 14% Polyacrylamidgel aufgetrennt und nach anschließender Färbung mit

Ethidiumbromid die ApoE- Genotypen ermittelt. Die Untersuchungen ermittelten bei

allen Familienmitgliedern der türkischen FH- Familie den ApoE- Genotypen 3/3. Bei

der libanesischen Familie waren der Vater und die homozygot betroffene Tochter

Träger des ApoE- Genotyps 3/4. Die Mutter und die zweite Tochter wiesen den

Genotyp ApoE 3/3 auf. Aus den Daten geht hervor, dass die Mutation FH-

W556RMarburg gemeinsam mit dem ApoE 3- Allel vererbt wird. Somit kann bei allen

betroffenen FH- Patienten eine Beeinflussung des exogenen/endogenen

Cholesterintransportes durch zusätzliche bindungsrelevante Mutationen an den

Positionen 142 und 158 von ApoE ausgeschlossen werden. In Abbildung 28 sind die

Ergebnisse der ApoE- Genotypisierungen dargestellt.

3. Ergebnisse 140

Abbildung 28: Ermittelte ApoE- Genotypen der beiden FH- W556RMarburg- Familien. In der

türkischen Familie sind alle Familienmitglieder Träger des ApoE 3/3- Genotyps. In der

libanesischen Familie sind der Vater (V) und die homozygot betroffene Tochter (T1) Träger von

ApoE 3/4, die Mutter (M) und zweite Tochter (T2) besitzen den ApoE- Genotyp 3/3.

3.5 Funktionelle Charakterisierung von ApoB- H3543YMarburg und FH-

W556RMarburg in vitro mit Zellkultur- Experimenten

Die molekulargenetischen Untersuchungen haben ergeben, dass die

Aminosäuresubstitutionen in ApoB- H3543YMarburg, und FH- W556RMarburg funktionell

wichtige Regionen in beiden Proteinen betreffen. Bei ApoB- H3543YMarburg kam es

genau wie bei allen anderen weltweit bisher identifizierten ApoB- Mutationen zum

Verlust einer positiven Ladung im carboxyterminalen Modulatorelement von ApoB-

100, über das die Bindung an den LDL- Rezeptor ermöglicht wird (Boren et al. 2001;

Soufi et al. 2004). Die Mutation bei FH- W556RMarburg betraf das fünfte

hochkonservierte YWVD- Repeat im LDL- Rezeptor, das Bestandteil der YWTD-

Domäne des ß- Propeller- Motifs („six bladed propeller structure“) ist und eine wichtige

Rolle bei der pH- abhängigen Dissoziation des Rezeptor- Liganden- Komplexes spielt

(Innereraty 2002; Jeon et al. 2001; Springer et al. 1998). Um die funktionellen

Auswirkungen der beiden neu identifizierten Defekte zu untersuchen, wurden zunächst

Bindungs und Aufnahmestudien mit fluoreszenzmarkierten DiI (1,1´-dioctadecyl-

3,3,3´,3´- tetramethylindocarbocyanine- perchlorate)- LDL- Partikeln in kultivierten

HeLa- Zellen und Fibroblasten durchgeführt.

Std. V Z 1 Z 2 M

FH-W556RMarburg/Türkei FH-W556RMarburg/Libanon

Std. V T 1 T 2 M

ApoE: 3/3 3/3 3/3 3/3 3/4 3/3 3/4 3/3

501489

353

242

190

147

110 89

67

Bp

404

72 Bp56 Bp

91 Bp

48 Bp

3. Ergebnisse 141

3.5.1 Aufnahme und Bindung von: Wildtyp, ApoB- H3543YMarburg- und ApoB-

R3500Q- DiI- LDL in kultivierten HeLa- Zellen

Die Untersuchungen der Aufnahme- und Bindungs- Kinetiken von ApoB-

H3543YMarburg- LDL erfolgten im direkten Vergleich mit ApoB- R3500Q- und

Wildtyp- LDL in kultivierten HeLa- Zellen. Hierzu wurden die LDL- Fraktionen der

entsprechenden Probanden- wie unter „Material und Methoden“ beschrieben- in parallel

durchgeführten Experimenten über sequentielle Ultrazentrifugation isoliert und

anschließend mit dem Fluoreszenz- Farbstoff DiI markiert. Zur quantitativen

Bestimmung der zellulären DiI- LDL- Aufnahme wurden Zellen, die sich zwischen

Passage 5-10 befanden, in 35- mm Zellkulturschalen ausgesät und für 72 Stunden in

DMEM- Medium mit 10% FCS inkubiert. Anschließend wurden die Zellen mit PBS

gewaschen und für weitere 48 Stunden in DMEM- Medium mit 10% LPDS

(Lipoprotein Defizientem Serum) inkubiert, um eine maximale Hochregulation der

LDL- Rezeptor- Genexpression zu erreichen. Nach erneutem Waschen mit PBS erfolgte

die Bestimmung der zellulären DiI- LDL- Aufnahme durch eine 5- stündige Inkubation

bei 370C mit unterschiedlichen Mengen an DiI- LDL (0, 5, 10, 20, 50, 100µg in

DMEM- Medium mit 10% LPDS). Die spezifische Aufnahme wurde bei einer Menge

von 10µg DiI- LDL mit einem 50fachen Überschuss an unmarkiertem LDL und nach

Subtraktion der Background- Fluoreszenz ermittelt. Für die Messungen der zellulären

DiI- LDL- Bindung wurde analog verfahren. Hierzu wurden die Zellen für 2 Stunden

bei 40C mit: 0, 5, 10, 20 und 50µg DiI- LDL inkubiert, wobei ausschließlich

vorgekühltes DMEM- Medium und PBS verwendet wurde. Die Messung der

spezifischen Bindung erfolgte bei einer Menge von 20µg DiI- LDL unter Kompetition

mit einem 50fachen Überschuss an unmarkiertem LDL. Nach den Inkubationen wurden

die Zellen durch eine 1- stündige Inkubation bei RT auf einem Schüttler in 1 ml Zell-

Lysis- Puffer und unter Lichtabschluss lysiert. Die Bestimmung der

aufgenommenen/gebundenen Menge an DiI- LDL erfolgte mit 200µl Zell- Lysat aus

den jeweiligen Ansätzen nach Messung der Fluoreszenz- Intensität (FI) bei

Exzitations/Emissions-Wellenlängen von 525/565nm in einem Spektralfluorometer

(Model LS- 5 Fa. Perkin- Elmer, Langen). Parallel zur Messung der FI (U) wurde

zudem aus allen Ansätzen die Proteinmenge über Bradford- Assay bestimmt. Die

Berechnung der zellulären DiI- LDL- Aufnahme/Bindung (ng LDL- Protein/mg

3. Ergebnisse 142

Zellprotein) erfolgte nach der unter Material und Methoden angegebenen Formel (siehe

Punkt 2.4.5 dieser Arbeit). In den Abbildungen 29 und 30 sind die Kurven der

Aufnahme- und Bindungs- Kinetiken von: Wildtyp, ApoB- H3543YMarburg, und ApoB-

R3500Q- DiI- LDL in HeLa- Zellen mit den Standardabweichungen (+/-SD) vom

Mittelwert der in Doppelbestimmungen durchgeführten Experimente aufgezeigt (A).

Die Bestimmung der halbmaximalen Aufnahme-/Bindungsgeschwindigkeit (Km) und

der maximalen zellulären Aufnahme-/Bindungskapazitäten (Vmax) der einzelnen DiI-

LDL- Präparationen erfolgte durch Scatchard- Plot- Analyse der ermittelten Daten (B).

Die ermittelten Km- und Vmax- Werte aller Aufnahme- und Bindungsexperimente sind in

den Tabellen 19 und 20 zusammengefasst.

A. B.

0

2000

4000

6000

8000

10000

0 20 40 60 80 100 120

DiI-LDL (µg)

DiI

-LD

L (

ng/

mg

Zel

lpro

tein

)

R2 = 0,994

0

200

400

600

800

1000

0 2000 4000 6000 8000 10000 12000

DiI-LDL (Gebunden)

DiI

-LD

L (

Geb

un

den

/Fre

i)

Wildtyp-DiI- LDL (5h, 370C)

Zelluläre Aufnahme von: Wildtyp, ApoB- H3543YMarburg und ApoB- R3500Q- DiI- LDL

0

2000

4000

6000

8000

0 20 40 60 80 100 120

DiI-LDL (µg)

DiI

-LD

L (

ng/

mg

Zel

lpro

tein

)

R2 = 0,9949

0

200

400

600

800

1000

0 2000 4000 6000 8000

DiI-LDL (Gebunden)

DiI

-LD

L (

Geb

un

den

/Fre

i)

ApoB- H3543YMarburg DiI- LDL (5h, 370C)

3. Ergebnisse 143

0

2000

4000

6000

8000

0 20 40 60 80 100 120

DiI-LDL (µg)

DiI

-LD

L (

ng/

mg

Zel

lpro

tein

)

R2 = 0,9976

0

200

400

600

800

1000

0 2000 4000 6000

DiI-LDL (Gebunden)

DiI

-LD

L (

Geb

un

den

/Fre

i)

ApoB- R3500Q DiI- LDL (5h, 370C)

A. B.

Abbildung 29: Aufnahme- Kinetiken von: Wildtyp, ApoB- H3543YMarburg, und ApoB- R3500Q-

DiI- LDL in HeLa- Zellen (Inkubation für 5h bei 370C). A. Aufgetragen sind die Daten der

Mittelwerte aus jeweils 2 Experimenten (+/- SD). B. Scatchard- Plot- Analyse zur Bestimmung

der halbmaximalen Aufnahme-/Bindungsgeschwindigkeit (Km) und der maximalen zellulären

Aufnahme (Vmax) der einzelnen DiI- LDL- Präparationen.

A. B.

A. B.

Zelluläre Bindung von: Wildtyp, ApoB- H3543YMarburg und ApoB- R3500Q- DiI- LDL

0

250

500

750

1000

1250

1500

0 10 20 30 40 50 60

DiI-LDL (µg)

DiI

-LD

L (

ng/

mg

Zel

lpro

tein

)

R2 = 0,998

0

200

400

600

800

0 250 500 750 1000 1250 1500

DiI-LDL (Gebunden)

DiI

-LD

L (

Geb

un

den

/Fre

i)

Wildtyp- DiI- LDL (2h, 40C)

0

250

500

750

1000

0 10 20 30 40 50 60

DiI-LDL (µg)

DiI

-LD

L (

ng/

mg

Zel

lpro

tein

)

R2 = 0,9993

0

100

200

300

400

500

0 250 500 750 1000

DiI-LDL (Gebunden)

DiI

-LD

L (

Geb

un

den

/Fre

i)

ApoB- H3543YMarburg DiI- LDL (2h, 370C)

3. Ergebnisse 144

A. B.

Abbildung 30: Darstellung der Bindungs- Kinetiken und Scatchard- Plot- Analyse von:

Wildtyp, ApoB- H3543YMarburg, und ApoB- R3500Q- DiI- LDL in HeLa- Zellen (Inkubation für

2h bei 40C).

Tabelle 19: Zusammenfassung der errechneten Daten (Vmax, Km , Aufnahme- Verlust)

der Experimente zur Aufnahme von: Wildtyp, ApoB- H3543YMarburg, und ApoB-

R3500Q- DiI- LDL in HeLa- Zellen.

Patient/ApoB- Mutation

Aufnahme

Vmax (370C)

( ng DiI-LDL/mg Zellprotein/5h )

Aufnahme

KM (370C)

(µg DiI-LDL/ml)

Verlust Aufnahme

vs.

Kontrolle (%)

Kontrolle (WT.- ApoB) 9915 11,2 100%

Patient 1 (H3543Y het.) 6866 8,7 -31%

Patient 2 (R3500Q het.) 5427 6,6 -45%

Tabelle 20: Zusammenfassung der ermittelten Daten (Bmax, Km , Bindungs- Verlust) der

Experimente zur Bindung von: Wildtyp, ApoB- H3543YMarburg, und ApoB- R3500Q-

DiI- LDL in HeLa- Zellen.

Patient/ApoB- Mutation

Bindung

Bmax (40C)


Bindung

KM (40C)

(µg DiI-LDL/ml)

Verlust Bindung

vs.

Kontrolle (%)

Kontrolle (WT.- ApoB) 1381 2,3 100%

Patient 1 (H3543Y het.) 889 2,0 -35%

Patient 2 (R3500Q het.) 825 2,3 -40%

0

250

500

750

1000

0 10 20 30 40 50 60

DiI-LDL (µg)

DiI

-LD

L (

ng/

mg

Zel

lpro

tein

)

R2 = 0,9944

0

100

200

300

400

0 250 500 750 1000

DiI-LDL (Gebunden)

DiI

-LD

L (

Geb

un

den

/Fre

i)

ApoB- R3500Q DiI- LDL (2h, 370C)

3. Ergebnisse 145

3.5.2 Die Aufnahme und Bindung von ApoB- H3543YMarburg DiI- LDL in

kultivierten HeLa- Zellen ist deutlich reduziert.

Die Ergebnisse der Untersuchungen zur Aufnahme und Bindung von ApoB-

H3543YMarburg DiI- LDL in HeLa- Zellen im direkten Vergleich mit Wildtyp und

ApoB- R3500Q- LDL haben gezeigt, dass das LDL von ApoB- H3543YMarburg-

Patienten deutlich schlechter über den LDL- Rezeptor internalisiert wird und auch

schlechter an diesen bindet. Aus den Aufnahme- Studien ergab sich eine maximale

Aufnahme (Vmax) von 6,8µg DiI- LDL/mg Zellprotein für das LDL von heterozygoten

Trägern der ApoB- H3543YMarburg- Mutation. Verglichen mit der Aufnahme des

Wildtyp- LDL (9,9µg/mg Zellprotein) resultiert dieses in einer um 31% reduzierten

zellulären LDL- Aufnahme. Gleiches findet sich auch in den Untersuchungen der

Bindung. Hier betrugen die ermittelten Werte an zellulär gebundenem DiI- LDL 0,88µg

mg/Zellprotein, was gegenüber dem Wildtyp (1,38µg/mg Zellprotein) eine um 35%

verringerte Bindung bedeutet (Tabellen 19 und 20). Der Vergleich mit den parallel

ermittelten Daten für das LDL der ApoB- R3500Q- Mutationsträgerin zeigt, dass

ApoB- H3543YMarburg LDL eine höhere zelluläre Aufnahme-/Bindungskapazität

aufweist. Ein Abgleich mit den in der Literatur beschriebenen Aufnahme- und

Bindungskapazitäten für ApoB- R3500Q- LDL (-40-70% Verlust für Aufnahme und

Bindung) (Innerarity et al. 1987; Fisher et al. 1999) deckt sich mit den von uns

ermittelten Daten für die ApoB- R3500Q- Mutation (in unserem Fall: 40-45%).

Gleiches gilt auch für die publizierten Vmax- und Km- Werte von Wildtyp- Dil- LDL

(Teupser et al. 1996), sodass die ermittelten Daten der Kinetiken verlässlich erscheinen.

3.6 DiI- LDL- Aufnahme- Kinetiken mit FH- W556RMarburg - Fibroblasten

Für die Untersuchungen der funktionellen Auswirkung der LDL- Rezeptor Mutation

FH-W556RMarburg auf die DiI- LDL Aufnahme und Bindung in vitro wurde genau wie

bei den Aufnahme- und Bindungsstudien zur Charakterisierung von ApoB-

H3543YMarburg verfahren. Anders als bei diesen Experimenten wurden jedoch nicht

HeLa- Zellen, sondern Fibroblasten der Patienten verwendet, da hier nicht der Ligand

(ApoB), sondern der Rezeptor defekt ist. Hierzu wurden zunächst Primärkulturen aus

Haut- Biopsien der betroffenenen FH- W556RMarburg- Patienten zur Etablierung einer

stabilen Fibroblasten- Kultur angelegt und- wie unter „Material und Methoden“

3. Ergebnisse 146

beschrieben- kultiviert. Zur quantitativen Bestimmung der zellulären DiI- LDL-

Aufnahme wurden Fibroblasten zwischen Passage 5-10 in 35- mm Zellkulturschalen

ausgesät und für 72 Stunden in DMEM- Medium mit 10% FCS inkubiert. Danach

wurden die Zellen zur maximalen Stimulation der LDL- Rezeptor- Genexpression für

weitere 48 Stunden in DMEM- Medium mit 10 % LPDS inkubiert. Nach Waschen der

Zellen mit PBS erfolgte die Bestimmung der zellulären DiI- LDL- Aufnahme genau wie

bei den Untersuchungen der ApoB- H3543YMarburg- Mutation. In Abbildung 31 sind die

Daten der DiI- LDL- Aufnahme- Kinetik von FH- W556RMarburg- Fibroblasten

dargestellt. Tabelle 21 fasst die ermittelten Km- und Vmax- Werte der Aufnahme- Experi-

mente zusammen.

A. B.

A. B.

0

2000

4000

6000

8000

10000

12000

0 20 40 60 80 100 120

DiI-LDL (µg)

DiI

-LD

L (

ng/

mg

Zel

lpro

tein

)

R2 = 0,9521

0

200

400

600

800

1000

0 2000 4000 6000 8000 10000 12000

DiI-LDL (Gebunden)

DiI

-LD

L (

Geb

un

den

/Fre

i)

Wildtyp- Fibroblasten (5h, 370C)

Zelluläre DiI- LDL- Aufnahme von Wildtyp und FH- W556RMarburg - Fibroblasten

R2 = 0,9851

0

200

400

600

0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000

DiI-LDL (Gebunden)

DiI

-LD

L (

Geb

un

den

/Fre

i)

0

2000

4000

6000

8000

0 20 40 60 80 100 120

DiI-LDL (µg)

DiI

-LD

L (

ng/

mg

Zel

lpro

tein

)

FH- W556RMarburg - Vater (het.)

3. Ergebnisse 147

A. B.

A. B.

A. B.

Abbildung 31: DiI- LDL- Aufnahme- Kinetiken mit: Wildtyp, heterozygoten FH- W556RMarburg

(Vater/Mutter) und Fibroblasten der homozygot betroffenen Zwillinge (Inkubation für 5h bei

370C). A. Aufgetragen sind die Daten der Mittelwerte aus jeweils 2 Experimenten (+/- SD). B.

Scatchard- Plot- Analyse zur Bestimmung der halbmaximalen Aufnahmegeschwindigkeit (Km)

und maximalen zellulären DiI- LDL- Aufnahme (Vmax) von Fibroblasten.

0

200

400

600

800

0 20 40 60 80 100 120

DiI-LDL (µg)

DiI

-LD

L (

ng/

mg

Zel

lpro

tein

)

R2 = 0,9802

0

20

40

60

0 200 400 600 800

DiI-LDL (Gebunden)

DiI

-LD

L (

Geb

un

den

/Fre

i)

FH- W556RMarburg - Zwilling 1 (hom.)

FH- W556RMarburg - Mutter (het.)

0

2000

4000

6000

0 20 40 60 80 100 120

DiI-LDL (µg)

DiI

-LD

L (

ng/

mg

Zel

lpro

tein

)

R2 = 0,9505

0

200

400

600

800

0 1000 2000 3000 4000 5000

DiI-LDL (Gebunden)

DiI

-LD

L (

Geb

un

den

/Fre

i)

FH- W556RMarburg - Zwilling 2 (hom.)

0

200

400

600

0 20 40 60 80 100 120

DiI-LDL (µg)

DiI

-LD

L (

ng/

mg

Zel

lpro

tein

)

R2 = 0,9558

0

10

20

30

0 100 200 300 400 500 600

DiI-LDL (Gebunden)

DiI

-LD

L (

Geb

un

den

/Fre

i)

3. Ergebnisse 148

Tabelle 21: Zusammenfassung der errechneten Daten (Vmax, Km , Aufnahme- Verlust)

der Experimente zur Aufnahme von DiI- LDL in Wildtyp und FH- W556RMarburg–

Fibroblasten.

Patient/LDLR-Mutation

Aufnahme

Vmax(370C)

(ng DiI-LDL/mg Zellprotein/5h )

Aufnahme

KM(370C)

(µg DiI-LDL/ml)

Verlust Aufnahme

vs.

Kontrolle (%)

Vater (W556R het.) 6238 11,8 -42%

Zwilling 1 (W556R hom.) 533 20,4 -95%

Zwilling 2 (W556R hom.) 729 14,6 -93%

Mutter (W556R het.) 4293 8,8 -60%

Kontrolle (Wt.- LDLR) 10840 12,2 100%

3.6.1 Fibroblasten der homozygot betroffenen FH- W556RMarburg- Zwillinge

nehmen praktisch kein DiI- LDL mehr auf

Die Ergebnisse der Untersuchungen zur Aufnahme von Wildtyp- DiI- LDL mit FH-

W556RMarburg- Fibroblasten haben gezeigt, dass bei den homozygot betroffenen

Zwillingen praktisch kein LDL mehr aufgenommen wird. Die maximale DiI- Aufnahme

(Vmax) lag bei 0,53 bzw. 0,72 DiI- LDL/mg Zellprotein. Verglichen mit der Aufnahme

von Wildtyp- Fibroblasten (10,8µg DiI- LDL/mg Zellprotein) bedeutete dies eine um

95-93% reduzierte zelluläre LDL- Aufnahme. Die beiden heterozygot betroffenen

Eltern wiesen maximale Aufnahmen von 6,2 (Vater) bzw. 4,2µg (Mutter) DiI- LDL/mg

Zellprotein auf, was einen Aufnahme- Verlust von 42 bzw. 60% bedeutete. Da die

Daten gezeigt haben, dass die noch verbliebene LDL- Restaufnahme bei den Kindern

durch unspezifische Mechanismen erfolgte, wurde auf eine zusätzliche komplette

Untersuchung der Bindungs- Kinetik verzichtet. Statt dessen wurde die maximale

Bindung für 2 Stunden bei 40C unter Inkubation mit 20µg DiI- LDL bei 50facher

Kompetition mit unmarkiertem LDL bestimmt. Die ermittelten Daten dieser Messungen

sind in Abbildung 32 dargestellt. In der Tabelle 22 sind die Ergebnisse der

Untersuchungen und die Bindungskapazitäten von Wildtyp und FH- W556RMarburg -

Fibroblasten zusammengefasst.

3. Ergebnisse 149

Abbildung 32: Bindung von DiI- LDL an Wildtyp und FH- W556RMarburg- Fibroblasten.

Gezeigt sind die ermittelten Daten der maximalen Bindung (2 Stunden bei 40C) mit 20µg DiI-

LDL unter 50facher Kompetition mit unmarkiertem LDL aus Doppelbestimmungen (+/- SD).

Tabelle 22: Zusammenfassung der Daten zur zellulären DiI- LDL- Bindung von

Wildtyp und FH- W556RMarburg- Fibroblasten.

Patient/LDLR-Mutation

Bindung (40C)

20µg DiI-LDL/ml

(Kompetition 50fach)


Verlust Bindung

vs.

Kontrolle (%)

Vater (W556R het.) 113 -54%

Zwilling 1 (W556R hom.) 23 -90%

Zwilling 2 (W556R hom.) 36 -85%

Mutter (W556R het.) 148 -40%

Kontrolle (Wildtyp- LDLR) 249 100%

Die Ergebnisse der Untersuchungen zur Bindung von DiI- LDL an FH- W556RMarburg –

Fibroblasten haben gezeigt, dass auch die Bindung bei den homozygot betroffenen

Zwillingen mit -90% bzw. -85% extrem stark reduziert war. Die Bindungen der

heterozygot betroffenen Eltern waren um 54% bzw. 40% reduziert. Bei der noch

verbliebenen Restbindung der Kinder handelt es sich um unspezifische Bindung von

DiI- LDL an die Fibroblasten- Zellmembran, die durch die Waschschritte nicht entfernt

werden konnte.

0

50

100

150

200

250

300

Vater Zwilling 1 Zwilling 2 Mutter Kontrolle

DiI

-LD

L (

ng/

mg

Zel

lpro

tein

)

Bindung von Wildtyp und FH- W556RMarburg- Fibroblasten

3. Ergebnisse 150

3.7 Untersuchungen der zellulären DiI- LDL- Aufnahme von ApoB- H3543YMarburg

und FH- W556RMarburg mit konfokaler Mikroskopie

Um die Daten der DiI- LDL Aufnahmekinetiken von ApoB- H3543YMarburg und FH-

W556RMarburg zusätzlich zu verifizieren, wurden Experimente zur Darstellung der

zellulären Aufnahme von DiI- LDL mittels konfokaler Mikroskopie durchgeführt.

Hierzu wurden HeLa-Zellen und humane Fibroblasten, die sich zwischen Passage 5-10

befanden, in 35- mm Zellkulturschalen ausgesät, die mit sterilen Deckgläschen versehen

waren. Die Inkubation der Zellen erfolgte zunächst über einen Zeitraum von 72 Stunden

in DMEM- Medium mit 10% FCS bis eine ausreichende Anzahl von Zellen auf den

Deckgläschen angewachsen war. Anschließend wurden die Zellen, wie unter „Material

und Methoden“ beschrieben, mit PBS gewaschen und danach für weitere 48 Stunden

zur maximalen Hochregulierung der LDL- Rezeptor- Genexpression in DMEM-

Medium mit 10% LPDS inkubiert. Die spezifische DiI- LDL- Aufnahme wurde durch

eine 5-stündige Inkubation bei 370C mit 10µg- DiI- LDL unter Kompetition mit einem

50fachem Überschuss an unmarkiertem LDL ermittelt. Nach der Inkubation wurde das

Medium abgesaugt und die Zellen jeweils 3 x mit 2 ml PBS gewaschen, um nicht-

adhärente Zellen zu entfernen. Abschließend wurden die Zellen auf den Deckgläschen

mit 25µl „Mounting“- Medium (Vector Laboratories, USA) überschichtet, auf einen

Objekträger aufgelegt und die Ränder der beiden Glasplatten mit Nagellack versiegelt.

Die Darstellung der Zellen erfolgte daraufhin, wie unter „Material und Methoden“

beschrieben, mit einem Zeiss 510 Konfokalem Laser Scanning Mikroskop unter

Verwendung eines Argon-Lasers (Zeiss Lasertechnik GmbH, Jena) bei Exzitations- und

Emissions- Wellenlängen von 525 bzw. 565nm. Hierbei wurden die Bilder elektronisch

vergrößert, um eine kleine Gruppe von Zellen darstellen zu können.

3.7.1 Konfokale Mikroskopie der Aufnahme von: Wildtyp, ApoB- H3543YMarburg

und ApoB- R3500Q- DiI- LDL in HeLa- Zellen

Die Untersuchung der Aufnahme von ApoB- H3543YMarburg DiI -LDL in kultivierten

HeLa- Zellen mit konfokaler Mikroskopie erfolgte im direktem Vergleich mit ApoB-

R3500Q- und Wildtyp- DiI- LDL. Hierzu wurden jeweils 10µg der unter Punkt 3.5

verwendeten DiI- LDL Präparationen verwendet und die spezifische DiI- LDL-

Aufnahme nach einer 5- stündigen Inkubation bei 370C unter Kompetition mit einem

3. Ergebnisse 151

50fachen Überschuss an unmarkiertem LDL mit konfokaler Mikroskopie dargestellt.

Abbildung 33 zeigt die Bilder der konfokalen Mikroskopie.

Abbildung 33: Konfokale Mikroskopie der Aufnahme von Wildtyp, ApoB- H3543YMarburg und

ApoB- R3500Q- DiI- LDL in HeLa- Zellen. Die Bilder zeigen die Aufnahme von

fluoreszenzmarkiertem DiI- LDL- bei Exzitations- und Emissions- Wellenlängen von 525 bzw.

565nm, sowie zur Darstellung der Zellen ohne Fluoreszenz die Durchlicht- Aufnahme.

Aus den Untersuchungen der konfokalen Mikroskopie ging hervor, dass die Aufnahme

von ApoB- H3543YMarburg und ApoB- R3500Q- DiI- LDL in HeLa- Zellen im

Vergleich zu Wildtyp- DiI- LDL deutlich reduziert war. Diese Ergebnisse bestätigten

die unter Punkt 3.5.1 in den Aufnahme- Kinetik- Experimenten gefundenen Daten der

Em. 525/Ex. 565

Konfokale Mikroskopie der Aufnahme von DiI- LDL in HeLa- Zellen

ApoB- WT.- LDL:

ApoB-H3543Y- LDL :

Durchlicht

ApoB-R3500Q- LDL :

3. Ergebnisse 152

reduzierten zellulären Aufnahmekapazitäten für ApoB- H3543YMarburg und ApoB-

R3500Q- LDL. Unter Kompetition mit einem 50fachem Überschuss an unmarkiertem

Wildtyp- LDL zeigte sich, dass ApoB- H3543YMarburg genau wie ApoB- R3500Q ein

funktionell relevanter Defekt war, der zu einer reduzierten spezifischen zellulären LDL-

Aufnahme in vitro führte.

3.7.2 In der konfokalen Mikroskopie zeigte sich keine DiI- LDL- Aufnahme in

Fibroblasten der homozygot betroffenen FH- W556RMarburg - Zwillinge

Die Untersuchungen der Aufnahme- Kinetik von Wildtyp- DiI- LDL mit FH-

W556RMarburg- Fibroblasten, haben gezeigt, dass bei den homozygot betroffenen

Zwillingen praktisch keine LDL- Aufnahme mehr erfolgte. Um diese Daten zusätzlich

zu bestätigen, wurden Experimente mit konfokaler Mikroskopie durchgeführt. Hierzu

erfolgten die Inkubationen von Wildtyp, heterozygoten, sowie homozygoten FH-

W556RMarburg- Fibroblasten, genau wie bei den Untersuchungen von ApoB-

H3543YMarburg beschrieben. Die Darstellung der spezifischen LDL- Aufnahme erfolgte

nach 5 stündiger Inkubation bei 370C mit 10µg- Wildtyp- DiI- LDL unter Kompetition

mit einem 50fachem Überschuss an unmarkiertem LDL. Aus den ermittelten Daten ging

klar hervor, dass FH- W556RMarburg- Fibroblasten der homozygot betroffenen Kinder

kein DiI- LDL mehr aufnahmen. In den Bildern der konfokalen Mikroskopie zeigte sich

lediglich eine ganz schwach nachweisbare Fluoreszenz, die auf eine LDL- Aufnahme

durch unspezifische Mechanismen oder alternative, jedoch nicht effiziente zelluläre

LDL- Transportwege zurückzuführen war. Bei den Fibroblasten des Vaters zeigte sich

eine relativ starke zelluläre DiI- LDL- Aufnahme, die durch den noch intakten Wildtyp-

LDL- Rezeptor hervorgerufen wurde, dessen Expression zusätzlich durch die

Inkubation der Fibroblasten in LPDS- Medium noch verstärkt wurde. Die stärkste DiI-

LDL- Aufnahme erfolgte- wie zu erwarten- bei den Wildtyp- Fibroblasten, hier zeigte

sich eine sehr deutlich nachweisbare Fluoreszenzfärbung im Zytoplasma der Zellen. Die

Untersuchungen mit der konfokalen Mikroskopie legten nahe, dass bei den Fibroblasten

der homozygoten FH- W556RMarburg- Kinder praktisch kein funktioneller LDL-

Rezeptor mehr an der Zelloberfläche vorhanden war, was in Kombination mit den

gefundenen Daten der molekulargenetischen Untersuchungen einen Defekt vom Typ:

Klasse 2 implizierte. In der Abbildung 34 sind die Bilder der konfokalen Mikroskopie

zur zellulären Aufnahme von DiI- LDL aufgezeigt.

3. Ergebnisse 153

Abbildung 34: Konfokale Mikroskopie zur Darstellung der zellulären Aufnahme von Wildtyp-

DiI- LDL in Wildtyp, heterzygoten und homozygoten FH- W556RMarburg- Fibroblasten. Die

Bilder zeigen die Aufnahme von fluoreszenzmarkiertem DiI- LDL- bei verwendeten

Exzitations- und Emissions- Wellenlängen von 525 bzw. 565nm, sowie zur Darstellung der

Zellen ohne Fluoreszenz die Durchlicht- Aufnahme.

Wildtyp- Zellen:

FH- W556R (het):

Em. 525/Ex. 565 Durchlicht

FH- W556R (hom):

Konfokale Mikroskopie der Aufnahme von DiI- LDL in Fibroblasten

3. Ergebnisse 154

3.7.3 Immunfluoreszenzanalysen von Wildtyp und FH- W556RMarburg-

Fibroblasten mit konfokaler Mikroskopie

Die Ergebnisse der unter Punkt. 3.7.2 durchgeführten Untersuchungen mit konfokaler

Mikroskopie ließen vermuten, dass die Fibroblasten der homozygoten FH-

W556RMarburg- Kinder keine funktionellen LDL- Rezeptoren mehr auf der

Zelloberfläche aufwiesen, was auf einen Klasse- 2 A LDLR- Defekt hindeutete. Um die

intra- bzw. extrazelluläre Lokalisation des LDL- Rezeptorproteins in FH- W556RMarburg-

Fibroblasten zu untersuchen, wurden Immunfluoreszenzanalysen mit konfokaler

Mikroskopie durchgeführt. Hierbei wurde eine Doppel- Immunfluoreszenz- Färbe-

technik verwendet (Jensen et al. 1997). Die Kultivierung der Fibroblasten erfolgte zu

diesem Zweck genau wie unter Punkt 3.7 beschrieben auf sterilen Deckgläschen in

DMEM- Medium mit 10% LPDS, um eine maximale Anzahl von zellulären LDL-

Rezeptoren zu erhalten. Nach Waschen mit PBS wurden die Zellen mit 5µg/ml

monoklonalem LDLR- Primär- Antikörper (Maus Anti- humaner- LDL- Rezeptor IgG-

C7, Fa. Acris, Bad Nauheim) für 10 Min. bei 40C inkubiert und danach in einem

Kühlarbeitsplatz bei 40C mit PBS gewaschen. Der Nachweis von an der Zelloberfläche

lokalisiertem LDL- Rezeptorprotein erfolgte durch eine 10- minütige Inkubation bei

40C mit 27µg/ml Rabbit- Anti- Maus- Fluoresceinisothiocyanat (FITC)- konjugiertem

Sekundär- Antikörper. Nach erneutem Waschen mit PBS wurden die Zellen durch

Inkubation in 1 ml 4% Formaldehyd/PBS- Lösung bei RT fixiert. Zur Lokalisation von

intrazellulärem LDL- Rezeptorprotein erfolgte eine 15- minütige Permeabilisierung der

Zellen in 70% Ethanol/PBS- Lösung und anschließende erneute Inkubation mit

monoklonalem LDLR- Primär- Antikörper (1,25µg) für 30 Min. bei RT. Nach Waschen

mit PBS/BSA erfolgte die intrazelluläre Lokalisation des LDL- Rezeptors durch eine

30-minütige Inkubation bei 370C mit Tetramethylrhodaminisothiocyanat (TRITC)-

konjugiertem Sekundär- Antikörper (8µg/ml). Abschließend wurden die Zellen auf den

Deckgläschen mit 25µl „Mounting“- Medium (Vector Laboratories, USA)

überschichtet, auf einen Objekträger aufgelegt und die Ränder der beiden Glasplatten

mit Nagellack versiegelt. Der Nachweis von intra-/extrazellulär lokalisiertem LDL-

Rezeptorprotein erfolgte daraufhin wie unter Punkt 3.7 beschrieben mit einem Zeiss

510 Konfokalem Laser Scanning Mikroskop unter Verwendung eines Argon-Lasers

3. Ergebnisse 155

(Zeiss Lasertechnik GmbH, Jena), bei Exzitations und Emissions- Wellenlängen von

488/530nm (FITC) bzw. 540/570nm (TRITC).

3.7.4 Auf der Zelloberfläche von Fibroblasten der FH- W556RMarburg- Zwillinge

lässt sich kein LDL- Rezeptor mehr nachweisen

Die Untersuchungen zur intra- bzw. extrazellulären Lokalisation des LDL-

Rezeptorproteins in FH- W556RMarburg- Fibroblasten mit Doppel-

Immunfluoreszenzanalyse ergaben, dass die Fibroblasten der Kinder keine LDL-

Rezeptoren an der Zelloberfläche aufwiesen. In der FITC- Färbung zur Lokalisation des

membrangebundenen LDL- Rezeptors zeigte sich lediglich eine minimale grüne

Hintergrund- Färbung, die auf unspezifische Antikörperbindung zurückzuführen war.

Im Gegensatz dazu war in der TRITC- Färbung zum intrazellulären Nachweis des LDL-

Rezeptors in den Zellen eine sehr starke Anfärbung sichtbar. Bei den Wildtyp-

Fibroblasten ließen sich- wie zu erwarten- LDL- Rezeptoren sowohl extrazellulär als

auch intrazellulär nachweisen. Gleiches fand sich auch in der konfokalen Mikroskopie

der Fibroblasten des heterozygot betroffenen Vaters. Die Immunfluoreszenz-

Untersuchungen mit konfokaler Mikroskopie bestätigten somit die Vermutung, dass es

sich bei FH- W556RMarburg um einen LDL- Rezeptor- Defekt vom Typ: Klasse 2 A

handelte, der zu einem kompletten Verlust des Transports von intaktem Rezeptor zur

Zelloberfläche führte. Zur weiteren Verifizierung dieses Befundes wurde eine

Westernblot- Analyse mit Membranproteinextrakten aus FH- W556RMarburg-

Fibroblasten durchgeführt. Bei Wildtyp und heterozygoten FH- W556RMarburg-

Fibroblasten ließ sich die 160 KDa Bande des vollständig prozessierten LDL- Rezeptors

nachweisen. In homozygoten Zellen hingegen zeigte sich nur die 120 KDa Proteinbande

des unprozessierten LDL- Rezeptors, was einen Defekt vom Typ: Klasse 2 A bestätigte,

der zu einem kompletten Verlust des LDLR- Transports vom Endoplasmatischen

Retikulum zum Golgi- Apparat führt. Ein weiterer Befund der Westernblot-Experimente

war, dass der defekte W556R in heterozygoten FH- Fibroblasten einem schnellen

turnover unterliegt (schneller Abbau durch molekulare Chaperone des ER), da sich trotz

48 stündiger Inkubation unter Steroldepletion keine 120 KDa- LDL- Rezeptoren in

diesen Zellen nachweisen ließen. In den Abbildungen 35 und 36 sind die Ergebnisse der

Immunfluoreszenz und Westernblot- Untersuchungen mit FH- W556RMarburg-

Fibroblasten dargestellt.

3. Ergebnisse 156

Abbildung 35: Konfokale Mikroskopie zum Nachweis des LDL- Rezeptors in Wildtyp und

FH- W556RMarburg- Fibroblasten mittels Immunfluoreszenzanalyse. Die Bilder zeigen

extrazellulär (FITC- markierter- Sekundärantikörper) und intrazellulär lokalisierten (TRITC-

markierter- Sekundärantikörper) LDL- Rezeptor und die Überlagerung (FITC/TRITC) aus

beiden Aufnahmen.

Immunfluoreszenzanalyse des LDL- Rezeptors mit konfokaler Mikroskopie

FITC Em. 488/Ex. 530

Wildtyp-Zellen:

FH- W556R (Het):

FH- W556R (Hom):

LDL- Rezeptor(Zelloberfläche)

LDL- Rezeptor(Intrazellulär)

Überlagerung(Extra/intrazellulär)

FITC/TRITCTRITC Em. 540/Ex. 570

3. Ergebnisse 157

Abbildung 36: Nachweis des LDL- Rezeptors aus Wildtyp und FH- W556RMarburg- Fibroblasten

durch Westernblot-Analyse. In Membranextrakten von Wildtyp und heterozygoten FH-

W556RMarburg- Fibroblasten lässt sich die 160 KDa Bande des vollständig prozessierten LDL-

Rezeptors nachweisen. In homozygoten Zellen hingegen ist nur die 120 KDa Proteinbande des

unprozessierten LDL- Rezeptors nachweisbar, was einen Defekt vom Typ: Klasse 2 A eindeutig

bestätigt. M=Marker (Biotinilierter Protein Standard, Fa Santa Cruz, Heidelberg).

3.8 Untersuchung der Expression von Genen des Cholesterinstoffwechsels in FH-

W556RMarburg- Fibroblasten mit Real- Time- RT/PCR

Zur Untersuchung der Expression von Genen, die bei der Aufnahme, Transport und

Regulation der intrazellulären Cholesterinbiosynthese ein zentrale Rolle spielen (siehe

Punkt 1.4.3 dieser Arbeit: Transkriptionelle Kontrolle der intrazellulären

Cholesterinbiosynthese) und zur Erfassung der unterschiedlichen Aktivierung dieser

Gene in heterozygoten und homozygoten FH- W556RMarburg- Fibroblasten, wurden

Untersuchungen mit quantitativer Real- Time RT/PCR durchgeführt. Insgesamt wurden

die Expressionen von 8 Genen untersucht, diese umfassten: 1. LDLR (LDL- Rezeptor);

Westernblot (LDL- Rezeptor)

M WT. Hom. Het.

160 KDa

120 KDa

KDa

200

140

100

60

80

50

3. Ergebnisse 158

2. SCARB1 (scavenger receptor class B type I); 3. ABCA1, (ATP- binding cassette

transporter 1); 4. HMGCR, (HMG- CoA- Reduktase); 5. SREBP-1a (Sterol regulatory

element- binding protein 1a); 6. SREBP-2 (Sterol regulatory element- binding protein

2); 7. INSIG-1 (Insulin induced gene 1); 8. SCAP (SREBP cleavage- activating

protein), sowie dem konstitutiv expremierten housekeeping gene GAPDH,

(Glyceraldehyde- 3- Phosphat- Dehydrogenase). In der Tabelle 23 sind die

Oligonukleotid- Sequenzen für die Amplifikationen der untersuchten Gene

zusammengefasst.

Tabelle 23: Oligonukleotid- Sequenzen (Alle Primerpaare Exon- übergreifend) für die

Amplifikationen der mittels Real- Time- RT/PCR untersuchten Gene.

Gen/Genbank Acc.Nr. Vorwärts- Primer 5´-3´ Rückwärts- Primer 5´ 3´ Fragment (Bp)

LDLR(NM_000527)

TGGAGTGAAGTTTGGAGTCAAC

GACTCTGTCCTGGGCACTGTCT

280

SCARB1(NM_005505)

GGCGGCCACATTTGCCCAG

CCCTGAAGCTCATCATGACCTT

330

ABCA1NM_005502)

AACAGTTTGTGGCCCTTTTG

AGTTCCAGGCTGGGGTACTT

156

HMGCR(NM_000859)

ACAAGAATTTAGTGGGCTCTG C

CTTGAACACCTAGCATCTGCA

273

SREBP-1a (NM_004176)

TGCATTGAGAGTGAAGACCAGT

TCTAAGAGATGTTCCCGGAAT

267

SREBP-2 (NM_004599)

AAGGTCAAAGATGAGCCAGACT

CATAAGAGAAGAGTAGGCATC

242

INSIG 1 (NM_005542)

TAACCACGCCAGTGCTAAATTG

GCTAACTGTCGTCCTATGTT

279

SCAP(NM_012235)

CCATGGGCTCCTCTGTGCTCC

AGCACCAACACATTCTCTAAC

256

GAPDH (NM_002046)

TCATTGACCTCAACTACATGG

AAATGAGCCCCAGCCTTCTCC

226

Die Untersuchungen mit der Real- Time RT/PCR erfolgten, wie unter „Material und

Methoden“ beschrieben mit isolierter Gesamt- RNA aus Wildtyp, heterozygoten und

homozygoten FH- W556RMarburg- Fibroblasten, die unter Standard- Kulturbedingungen

(DMEM- Medium mit 10% FCS) gehalten wurden. Als Referenz- „house keeping

gene“ für die in dreifachen Ansätzen durchgeführten Real- Time RT/PCR - Reaktionen

und Berechnungen des Abfalls/Anstiegs der Expressionen der untersuchten Gene (+/-

SD) diente das GAPDH- Gen. Zur Berechnung der Expressionen der untersuchten Gene

3. Ergebnisse 159

wurde zunächst die gemessene Fluoreszenz (Exzitations/Emissionswellenlängen

490/530nm von SYBR- green) im entstandenen GAPDH- PCR- Produkt (Ct- GAP) von

der Fluoreszenz des PCR- Produktes des untersuchten Gens (CtUnt.Gen) subtrahiert: Ct

Unt.Gen -Ct GAP Unt.Gen -

Wert des untersuchten Gens bei der Kontrolle Unt.Gen/Kontrolle), dessen Expression

gleich 1 gesetzt wurde, subtrahiert Unt.Gen - Unt.Gen/Kontrolle Unt.Gen). Der

berechnete Wert für den spezifischen Anstieg/Abfall der Expression des untersuchten

Gens Unt.Gen) wurde anschließend in die von Pfaffl et al. beschriebene Formel:

Ratio= 2- (Pfaffl 2001) eingesetzt und hierüber die Ratio (Relativer

Expressionsanstieg/Abfall vs. Kontrolle) des untersuchten Gens ermittelt.

3.8.1 Die relative Expression zentraler Gene der Cholesterinbiosynthese in FH-

W556RMarburg – Fibroblasten ist deutlich erhöht

Aus den Experimenten der Real- Time RT/PCR mit isolierter Gesamt- RNA aus

Wildtyp, heterozygoten und homozygoten FH- W556RMarburg- Fibroblasten ging hervor,

dass die relativen Expressionen von sechs der acht untersuchten zentralen Gene der

Cholesterinbiosynthese in homozygoten und heterozygoten FH- W556RMarburg-

Fibroblasten signifikant erhöht bzw. erniedrigt waren. Es ergaben sich folgende relative

Expressionsanstiege in homozygoten Zellen: LDL- Rezeptor (4,17fach ), SREBP-2

(6,3fach), SREBP-1a (1,85 fach) INSIG 1 (2,55fach), sowie HMG- CoA- Reduktase

(1,73fach). Die Genexpression von SCAP war im Vergleich zur Kontrolle nicht

signifikant erhöht. In heterozygoten Fibroblasten zeigten sich ebenfalls

Expressionsanstiege in diesen Genen. Diese waren z.T. für einige Gene deutlich

geringer, was darauf hinwies, dass in diesen Zellen der Cholesterinbedarf über die noch

vorhandene intakte Kopie des LDL- Rezeptors zusätzlich gedeckt wurde. In

homozygoten Fibroblasten war dies trotz erhöhter LDLR- Genexpression wegen des

Fehlens funktioneller LDL- Rezeptoren nicht mehr möglich. Hier zeigte sich eine starke

Aktivierung/Inhibierung der Expression von Genen, deren Genprodukte die

intrazelluläre de novo Synthese von Cholesterin, die Aufnahme von Cholesterin über

kollaterale Pathways, sowie die Abgabe von überschüssigen zellulären Cholesterin,

steuern. Diese Aktivierung/Inhibierung erfolgte im Wesentlichen durch den SREBP-2-

Transkriptionsfaktor als zentralen Schlüsselregulator dieser Gene (siehe auch Punkt 4.

Diskussion dieser Arbeit). In Abbildung 37 sind exemplarisch die Kurven eines der

3. Ergebnisse 160

Real- Time RT/PCR- Experimente zur Bestimmung der relativen Genexpression in

Fibroblasten am Beispiel des LDL- Rezeptors aufgezeigt. Die Abbildung 38 zeigt die

Diagramme mit den ermittelten Ratios der untersuchten Gene in Wildtyp, heterozygoten

und homozygoten FH- W556RMarburg- Fibroblasten. In Tabelle 24 sind die Daten aller

Experimente zusammengefasst.

Real Time RT/PCR von GAPDH und LDL- Rezeptor aus Fibroblasten

Schmelzkurven der Real Time RT/PCR- Produkte von GAPDH und LDL- Rezeptor

Abbildung 37: Ergebnisse der Real-Time- PCR- Experimente von GAPDH und LDL- Rezeptor

aus Wildtyp und FH- W556RMarburg- Fibroblasten. Die Kurven zeigen den zeitlichen Verlauf

des SYBR- green- Einbaus in die PCR- Produkte. Vordere Kurven: GAPDH (Zyklen 17-19).

Hintere Kurven: LDL- Rezeptor (Zyklen 31-33). Schmelzkurven der entstandenen spezifischen

GAPDH (vorderer Peak) und LDL- Rezeptor (hinterer Peak)- PCR- Produkte. Es sind keine

zusätzlichen unspezifischen Amplifikate vorhanden.

3. Ergebnisse 161

Ratios der Real-Time- RT/PCR- Experimente in Wildtyp und FH- W556RMarburg –

Fibroblasten

Abbildung 38: Grafische Darstellungen der normalisierten mRNA- Expressionen von acht

zentralen Genen der Cholesterinbiosynthese die mit Real- Time RT/PCR untersucht wurden.

Signifikante Unterschiede (p < 0.001 bzw. p < 0.05) der Genexpressionen von FH-

W556RMarburg- Fibroblasten gegenüber Wildtyp, sowie von homozygoten gegenüber

heterozygoten FH W556RMarburg- Fibroblasten sind mit *, ** und # gekennzeichnet.

0

2

4

6

8

LDLR HMGCR SREBP-1a SREBP-2 INSIG1 SCAP

Nor

mal

isie

rte

mR

NA

Exp

ress

ion

Wildtyp

FH-W556R het.

FH-W556R hom.

∗

∗ p < 0.05 vs. WT

** p < 0.001 vs. WT

# p <0.05 Hom. vs. Het.

** #

* #

**

∗

**

** #

** #

0

1

2

3

4

5

SCARB1 ABCA1

Nor

mal

isie

rte

mR

NA

Exp

ress

ion

Wildtyp

FH-W556R het.

FH-W556R hom. * #

** #

*

*

∗ p < 0.05 vs. WT

** p < 0.001 vs. WT

# p < 0.05 Hom. vs. Het.

3. Ergebnisse 162

Tabelle 24: Zusammenfassung der ermittelten normalisierten mRNA- Expresssionen

der untersuchten Gene aus den Real- Time RT/PCR Experimenten mit Fibroblasten.

Relative Zunahme der mRNA-Expression

vs. Kontrolle (Ratio)

Untersuchtes Gen der Cholesterinbiosynthese Fibroblasten

(W556R het.)

Fibroblasten

(W556R hom.)

LDL- Rezeptor (LDLR) +2,28 fach +4,17 fach

Scavenger receptor class B type I (SCARB1) +2,15 fach +3,93 fach

ATP-binding cassette transporter 1 (ABCA1) +1,42 fach -4,34 fach

HMG- CoA- Reduktase (HMGCR) +2,42 fach +1,73 fach

Sterol regulatory element-binding protein (SREBP-2) +3,76 fach +6,29 fach

Sterol regulatory element-binding protein 1a (SREBP-1a) +2,08 fach +1,85 fach

Insulin induced gene 1 (INSIG 1) +3,76 fach +2,55 fach

SREBP cleavage activating protein (SCAP) +0,88 fach +0,79 fach

3.8.2 Die Expression von SCARB1 aber nicht ABCA1 ist in homozygoten FH-

W556RMarburg - Fibroblasten deutlich erhöht

Neben dem gemessenen Anstieg der Expressionen von LDL- Rezeptor, SREBP-2

INSIG 1, HMG- CoA- Reduktase und SREBP-1a war interessanterweise auch eine

deutlich erhöhte Expression und Translation von SCARB1, sowohl in heterozygoten als

auch in homozygoten FH- W556RMarburg- Fibroblasten zu beobachten (+ 2,19 bzw.

3,93fach). Dieses deutet stark darauf hin, dass SCARB1 einen kollateralen Bypass-

Pathway darstellt, über den FH- W556RMarburg- Fibroblasten Cholesterinester

unabhängig vom LDLR- Pathway aufnehmen können. Dieses nicht- lysosomale

Cholesterin wird über die Bindung von HDL und LDL an SCARB1 in die Zelle

eingeschleust und steht den metabolischen Pools der Zelle dann direkt zur Verfügung

(Xie et al. 2006). Im Gegensatz zu SCARB1 war die Genexpression des

Cholesterintransporters ABCA1 in homozygoten FH- W556RMarburg- Fibroblasten

dramatisch erniedrigt (- 4,34fach), was darauf hinweist, dass die intrazellulären

Cholesterinspiegel, trotz der Aktivierung des SCARB1- Pathways und der HMGCR

induzierten intrazellulären de novo Synthese von Cholesterin, nicht ausreichen, um

genügend LXR- Liganden für eine Aktivierung der ABCA1 Gen- Transkription zu

generieren. In heterozygoten Fibroblasten hingegen kann Cholesterin sowohl über de

3. Ergebnisse 163

novo Synthese, die Aufnahme über die noch vorhandenen Kopie des intakten LDL-

Rezeptors, als auch via SCARB1 aufgenommen werden. In diesen Zellen sind die

intrazellulären Cholesterinspiegel hoch genug, um genügend LXR- Liganden für eine

Aktivierung der ABCA1 Gen- Transkription zu generieren, was dazu führt, dass

überschüssiges unverestertes Cholesterin via ABCA1 aus der Zelle augeschleust wird.

(siehe auch Punkt 4. Diskussion dieser Arbeit). Abbildung 39 zeigt die gesteigerte

SCARB1- Proteinsynthese in FH- W556RMarburg- Fibroblasten in einer Westernblot-

Analyse.

Abbildung 39: Westernblot- Analyse von SCARB1 aus isolierten Membranproteinextrakten

von Wildtyp und FH- W556RMarburg- Fibroblasten. Es zeigt sich eine deutlich gesteigerte

Proteinsynthese von SCARB1 in heterozygoten und homozygoten FH- W556RMarburg-

Fibroblasten (Na+/K+ - ATPase = housekeeping Membranprotein; Natrium Kalium ATPase).

Westernblot (SCARB1)

WT. Het. Hom. KDa

84

47

SCARB1

Na+/K+ - ATPase

3. Ergebnisse 164

3.9 In vivo Turnover- Untersuchung von ApoB- H3543YMarburg und FH-

W556RMarburg mittels stabiler Isotopentechnik

Zur detaillierten Erfassung der metabolischen und klinischen Auswirkungen der neu

identifizierten Mutationen ApoB- H3543YMarburg und FH- W556RMarburg auf den

Lipidstoffwechsel in vivo wurden mit je einem Träger der ApoB- H3543YMarburg -

Mutation (Patient, dessen ApoB- H3543YMarburg LDL in den Zellkulturexperimenten

verwendet wurde), sowie dem heterozygot betroffenen Vater der FH- W556RMarburg –

Zwillinge und 6 gesunden Normalprobanden, eine in vivo Turnover- Untersuchung zur

Verstoffwechselung des VLDL und LDL- ApoB- 100 mittels stabiler Isotopentechnik

durchgeführt. Als Tracer- Aminosäure für den Einbau in neu synthetisierte Proteine

wurde die dreifach mit Deuterium (3- D) markierte essentielle Aminosäure L- Leucin

verwendet (Fa. MSD, USA). Da es sich um eine am Menschen durchgeführte Studie

handelte, wurde ein detailliertes Studienprotokoll erstellt, das von der lokalen

Ethikkommission auf der Basis der Helsinki- Deklaration von 1975 in der revidierten

Form von 1996 genehmigt wurde (Ethikkomission der Philipps-Universität-Marburg,

Aktenzeichen Studie: 10/03). Zusätzlich wurde jeder Studien-Teilnehmer im „informed

conset“ ausführlich über die Untersuchung aufgeklärt. Nach einer Medikamenten-wash-

out-Phase von 6 Wochen erhielten die Probanden drei Tage vor Studienbeginn eine

isokalorische Standardkost mit einem Energiegehalt von 30 kcal pro kg Körpergewicht

(20% Eiweiß, 30% Fett, 50% Kohlenhydrate und maximal 300 mg Cholesterin pro

Tag). Die Studie selbst wurde unter „Nüchtern-Bedingungen“ durchgeführt. Während

der Studie durften die Probanden lediglich Trinkwasser zu sich nehmen. Sie erhielten in

jede Ellenbeuge eine Venenverweilkanüle. Über den ersten Zugang erfolgte die

Tracerapplikation, über den zweiten die Blutentnahmen. Zu Studienbeginn erfolgte eine

Bolus- Injektion von 10 mmol (5,5,5- D3)- L- Leucin/kg Körpergewicht (KG), gefolgt

von einer konstanten Infusion über einen Infusomat von 10 µmol/kg (KG) des Tracers

(Cohn et al. 1990). Während der gesamten Studiendauer von 12 Stunden. erfolgten nach

festem Zeitschema insgesamt 18 Blutentnahmen von jeweils 20 ml EDTA-Blut pro

Zeitpunkt: 1. Blutentnahme zum Zeitpunkt 0, vor Bolusgabe: in den ersten 40 Min. alle

10 Min.; nach 60 Min. und 90 Min., beginnend mit der 2. Stunde, jeweils stündlich. In

der Tabelle 25 sind die Lipoproteinprofile der untersuchten Probanden nach

Durchführung der Studie dargestellt.

3. Ergebnisse 165

Tabelle 25: Lipoproteinprofile der 6 untersuchten männlichen Kontrollpersonen, sowie

der heterozygoten ApoB- H3543YMarburg und FH- W556RMarburg- Mutationsträger. Die

Tabelle zeigt die ermittelten Mittelwerte der 18 Blutentnahmen nach durchgeführter

Studie.

Patient AlterGC

mg/dl

Tgl.

mg/dl

HDL-C

mg/dl

LDL-C

mg/dl

ApoA-I

mg/dl

ApoB

mg/dl

Kontrolle 1 36 138 97 34 85 108 74

Kontrolle 2 30 190 45 35 147 142 111

Kontrolle 3 28 140 53 37 92 137 85

Kontrolle 4 26 161 39 44 109 143 90

Kontrolle 5 26 136 36 47 82 142 80

Kontrolle 6 26 127 26 50 72 157 66

MW ± SD 29 ± 3,6 149 ± 21,1 49 ± 22,3 41 ± 6,1 98 ± 24,7 138 ± 14,8 84 ± 14,1

ApoB H3543YMarburg

49 192 94 44 129 143 105

FH- W556RMarburg 36 279 341 36 174 129 140

3.9.1 Isolierung und Aufreinigung der Lipoproteinfraktionen von Kontroll-, ApoB-

H3543YMarburg - und FH- W556RMarburg - Patienten für die GC/MS- Messungen

Für die in vivo- Kinetikuntersuchungen wurden direkt nach Abschluss der Studie die

einzelnen Lipoproteinfraktionen (VLDL, IDL, LDL und HDL) aus den 18 gewonnenen

Plasmaproben der Probanden- wie unter Material und Methoden beschrieben- über

sequentielle Ultrazentrifugation isoliert. Nach Dialyse und Delipidierung der einzelnen

Fraktionen wurden diese in SDS- Probenpuffer aufgenommen und die Lipoproteine in

5-15 % präparativen SDS- Gradientengelen aufgetrennt, in Commassie- Lösung gefärbt,

anschließend entfärbt und folgende Proteinbanden der einzelnen Fraktionen

ausgeschnitten. VLDL: ApoB- 100 und ApoE, LDL: ApoB- 100, HDL: Apo A-I.

Zusätzlich wurde ein Gelstück ohne Protein als Negativ- Kontrolle (Blank) mit

ausgeschnitten. Nach Hydrolyse der entsprechenden Proteinbanden und Isolierung der

Aminosäuren über Kationenaustauschersäulen wurden die Proben derivatisiert, in

Etylacetat gelöst und die Isotopenanreicherung- wie unter „Material und Methoden“

3. Ergebnisse 166

beschrieben- mittels GC/MS- Messung bestimmt. Zur Berechnung der Kinetiken der

Apolipoproteine wurde in parallelen Ansätzen die Menge an freien Plasmaaminosäuren

von jedem Messzeitpunkt bestimmt. Hierzu wurden die freien Aminosäuren mittels

Kationenaustauschersäulen aus dem Plasma isoliert, derivatisiert und durch GC/MS

quantifiziert. Abbildung 40 zeigt ein SDS- Polyacrylamidgel der aufgetrennten

Lipoproteine.

SDS- Polyacrylamidgel zur Auftrennung der Lipoproteine

Abbildung 40: SDS- Gradientengel (5-15%) zur Auftrennung der mittels sequentieller

Ultrazentrifugation isolierten Apoproteine (ApoB- 100, ApoE und Apo A-I) aus VLDL, IDL,

LDL und HDL. Zur besseren Identifikation wurde aufgereinigtes (Fa. Calbiochem, Darmstadt)

ApoE und Apo A-I mit aufgetragen. Std= Broad Range Proteinstandard (Fa. BioRad,

München).

VLDL IDL LDL HDL ApoE Apo A-I Std.

ApoB- 100

ApoE

Apo A-I

Albumin

200

116

97

66

45

31

21

KDa

3. Ergebnisse 167

3.9.2 Ergebnisse der in vivo- Kinetikuntersuchung von Kontroll-, ApoB-

H3543YMarburg - und FH- W556RMarburg - Patienten

3.9.3 Tracer/Tracee- Ratios der freien Plasmaaminosäuren

Der Plateauwert der freien Plasmaaminosäuren wurde bei allen Probanden nach circa 30

Minuten erreicht und war während der gesamten Infusionszeit nahezu konstant. Bei den

Kontrollen lag er im Mittel bei 7,0% ± 0,9, für den ApoB- H3543YMarburg- Patient bei

8,5% ± 0,85 und für den Träger von FH- W556RMarburg bei 6,5% ± 0,68. Diese Werte

sind vergleichbar mit den bisher in der Literatur beschriebenen FAA- Anreicherungen

(Cohn et al. 1990; Schaefer et al. 1992; Fisher et al. 1997; Venkatakrishnan et al. 1997).

Die Abbildung 41 zeigt das Tracer/Tracee- Verhältnis wahrend der Infusionsdauer.

Abbildung 41: Grafische Darstellung des Tracer/Tracee- Verhältnis (%) der freien

Plasmaaminosäuren während der Infusionszeit von 12 Stunden. Kontrollen (rote Kurve +/-SD),

ApoB- H3543YMarburg- Patient (blaue Kurve) sowie FH- W556RMarburg- Patient (grüne Kurve).

Freie Plasmaaminosäuren

0,01

0,10

1,00

10,00

100,00

0 2 4 6 8 10 12 14

Zeit/h

Tra

cer/

Tra

cee

%

3. Ergebnisse 168

3.9.4 In vivo Turnover von VLDL ApoB- 100

Da VLDL ApoB- 100 vergleichsweise schnell verstoffwechselt wird, erreichten alle

Normalprobanden einen stabilen VLDL ApoB- 100- Plateauwert der Tracer/Tracee-

Anreicherung nach ca. 6 bis 7 Stunden. Ebenso zeigte sich eine hohe Korrelation

zwischen Traceranreicherung der freien Plasmaaminosäuren und dem Plateauwert der

VLDL ApoB- 100- Fraktion bei den Kontrollen (MW: FAA 7,8% ± SD 0,9; MW:

VLDL ApoB- 100 7,0%, ± SD 1,0) (Cummings et al. 1995). Abbildung 42 zeigt die

Darstellung des Tracer/Tracee- Verhältnis von VLDL ApoB-100 (%) während der

Infusionszeit von 12 Stunden bei den heterozygot betroffenen ApoB- H3543YMarburg

(blaue Kurve) und FH- W556RMarburg- Patienten (grüne Kurve), sowie dem

Kontrollkollektiv (rote Kurve ± SD).

Abbildung 42: Grafische Darstellung des Tracer/Tracee- Verhältnis von VLDL ApoB- 100 (%)

während der Infusionszeit von 12 Stunden. Kontrollen (rote Kurve +/-SD), ApoB-

H3543YMarburg -Patient (blaue Kurve) und FH- W556RMarburg (grüne Kurve).

VLDL ApoB-100

0

1

2

3

4

5

6

7

0 2 4 6 8 10 12 14

Zeit/h

Tra

cer/

Tra

cee

%

3. Ergebnisse 169

LDL ApoB-100

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

0 2 4 6 8 10 12 14

Zeit/h

Tra

cer/

Tra

cee

%3.9.5 In vivo Turnover von LDL ApoB- 100

Wie zu erwarten erreichte keiner der Normalprobanden, als auch der ApoB-

H3543YMarburg FH- W556RMarburg- Patienten einen Plateauwert für das nur langsam

verstoffwechselte LDL ApoB- 100. Zur Berechnung der Kinetikwerte wurden daher die

Plateaus des VLDL ApoB- 100 verwendet. In der Abbildung 43 sind die in vivo-

Kinetikdaten des LDL ApoB- 100 von allen Probanden aufgezeigt. In der Tabelle 26

sind die ermittelten Kinetikdaten für: Fraktionelle Katabolismusrate (FCR),

Plasmaverweildauer (RT), Poolgröße, sowie Produktionsrate (PR) von LDL ApoB- 100

zusammengefasst.

Abbildung 43: Grafische Darstellung des Tracer/Tracee- Verhältnis von LDL ApoB- 100 (%)

während der Infusionszeit von 12 Stunden. ApoB- H3543YMarburg- Patient (blaue kurve) FH-

W556RMarburg - Patient (grüne Kurve) und Kontrollkollektiv ± SD (rote Kurve).

3. Ergebnisse 170

Tabelle 26: Kinetik- Daten des LDL ApoB- 100 von ApoB- H3543YMarburg, FH-

W556RMarburg und der Kontrollen. FCR ist die fraktionelle Katabolismusrate in Tagen,

RT ist die Verweildauer im Plasma (Residence Time), Pool das gesamte Apo B- 100 im

Plasma in mg/L. PR die ApoB- 100- Produktionsrate in mg pro kg proTag. MW=

Mittelwerte der 6 Normalprobanden ± SD.

LDL- ApoB-100

Proband FCR RT Pool PR

Kontrolle 1 0,39 2,53 68 10,7

Kontrolle 2 0,40 2,50 107 17,1

Kontrolle 3 0,25 4,00 82 8,2

Kontrolle 4 0,25 4,00 88 8,8

Kontrolle 5 0,36 2,80 78 11,2

Kontrolle 6 0,50 2,00 64 12,8

MW ± SD 0,36 ± 0,1 2,97 ± 0,8 81,2 ± 15,5 11,5 ± 3,2

ApoB- H3543YMarburg 0,10 10 140 5,6

FH- W556RMarburg 0,19 5,3 169,0 13,0

Die FCR und die PR der Normalprobanden lagen im Bereich publizierter Werte

vergleichbarer Normalkollektive anderer Arbeitsgruppen (Cohn et al. 1990; Pietzsch et

al. 1996; Schaefer 1997). Beim ApoB- H3543YMarburg- Träger war die FCR von LDL-

ApoB- 100 mit 0,1 Pools/Tag versus 0,36 bei den Kontrollen deutlich verzögert, dies

entsprach einer Reduktion von -28%. Die RT war mit 10 Tagen vs. 2,97 bei den

Kontrollen um das dreifache verlängert. Für die Produktionsrate ergab sich eine

Reduktion von 5,6 mg/kg x d vs. 11,5 mg/kg x d, was einer Senkung der PR auf 49%

des Normalen entsprach. Bei FH- W556RMarburg ergab sich für LDL ApoB- 100 eine

FCR von 0,19, was einer Reduktion auf 47% des Normwertes entsprach. Die

„Residence Time“ war mit 5,3 auf das 1,8fache verlängert. Die Produktionsrate (PR)

war beim FH- W556RMarburg- Träger um 13% erhöht und betrug 13 mg/kg x d

gegenüber einem Mittelwert von 11,5 in der Kontrollgruppe.

3. Ergebnisse 171

3.9.10 Varia: Ergebnisse weiterer genetischer Studien mit dem Kollektiv der

Marburger Präventions- Allianz

Neben den detaillierten funktionellen Charakterisierungen von ApoB- H3543YMarburg

und FH- W556RMarburg, die im Rahmen dieser Arbeit erfolgten, wurden eine Reihe

weiterer Studien zur Identifizierung von Mutationen/Polymorphismen in

Kandidatengenen, die bei Lipidstoffwechselstörungen und koronarer Herzkrankheit eine

Rolle spielen, durchgeführt. Hierzu wurden Patienten der Marburger- Präventions-

Allianz je nach Fragestellung entweder konsekutiv oder auf der Basis vorhandener

kardiovaskulärer Risikofaktoren ausgewählt. In den folgenden Abschnitten sind die

Ergebnisse dieser Untersuchungen kurz zusammengefasst.

3.9.10.1 Identifikation der ApoA5 S19W- Mutation als Kofaktor für die

Ausbildung von Hyperlipidämie bei Patienten mit dem Phänotyp ApoE 2/2

In einer DGGE- Mutationsscreening-Studie des kompletten ApoA5- Gens mit 170

hypertriglyzeridämischen Patienten aus dem Kollektiv der Marburger Präventions-

Allianz konnten wir zeigen, dass ApoA5 einen wesentlichen Kofaktor für die

Hyperlipoproteinämie bei ApoE 2/2 darstellt. Apolipoprotein A5 wird in der Leber

expremiert und senkt die Plasma- Triglyzeridspiegel, indem es die Produktion

triglyzeridreicher Lipoproteine (VLDL) in der Leber reduziert und die Aktivität der

Lipoproteinlipase stimuliert. Wir konnten zeigen, dass bei 7 identifizierten

hypertriglyzeridämischen ApoE 2/2- Trägern zusätzlich die heterozygote ApoA5

S19W- Mutation vorlag. Dieser Befund ist insofern von Bedeutung, da ApoE 2/2 in der

Normalbevölkerung mit einer Häufigkeit von 0,6% vorkommt und nur 10% dieser Apo-

E 2/2- Träger eine Hypertriglyzeridämie entwickeln. Intersessanterweise liegt die

Frequenz von ApoA5 S19W in der Normalbevölkerung bei 10,9%, was der Häufigkeit

der durch ApoE 2/2 induzierten Hypertriglyzeridämie entspricht (Schaefer et al. 2004).

3.9.10.2 Einfluss von Osteoprotegerin (OPG) Polymorphismen auf die koronare

Herzkrankheit (KHK)

In dieser Studie wurde das komplette Osteoprotegerin- Gen bei 468 konsekutiv

gesammelten Patienten der Marburger Präventions- Allianz mit und ohne koronararer

Herzkrankheit, mittels DGGE- Mutationsscreening untersucht. Osteoprotegerin (OPG)

antagonisiert den Nuclear Faktor- Kappa B- Liganden (RANKL), der ein zentraler

3. Ergebnisse 172

Regulator des Osteoklastenstoffwechsels ist. Studien mit OPG- defizienten Tieren

zeigten eine starke Osteoporose und arterielle Kalzifizierung in diesen Tieren. Im

DGGE- Screening wurden 5 Basensubstitutionen im Promotor (-149 T-->C, -163 A--

>G, -209 G-->A, -245 T-->G, -950 T-->C), eine in Exon 1 (1181 G-->C), sowie eine in

Intron 4 (6890 A-->C) identifiziert. Träger der Genotypen -950 TC/ 1181 GC und -950

CC/1181 CC hatten ein signifikant höheres KHK- Risiko. Außerdem zeigte sich eine

signifikante Korrelation des C- Allels mit den Serum- OPG- Spiegeln. Unsere Studie

zeigte, dass genetische Variationen an den Positionen -950 und 1181 zu einem erhöhten

Risiko für KHK führen (Soufi et al. 2004).

3.9.10.3 Promotor-Mutationen der Cytochrome P 450- epoxygenase (CYP2J2) bei

Patienten mit koronare Herzkrankheit (KHK)

In einer case- control- Studie mit 534 Patienten aus den Kollektiven der Marburger

Präventions- Allianz und dem Universitätsklinikum der Ruhr- Universität Bochum,

wurde der Einfluss von Mutationen im Cytochrom P450- Gen (CYP2J) auf die koronare

Herzkrankheit untersucht. CYP2J2 wird in Endothelzellen expremiert und metabolisiert

Arachidonsäure zu Epoxyeicanoidsäuren (EETs). EETs sind potente Vasodilatatoren

und inhibieren die vaskuläre Inflammation. Es konnte eine funktionell relevante

Mutation (-50 G/T) im Promotor von CYP2J identifiziert werden. Träger der Mutation

hatten signifikant erniedrigte EET- Spiegel und ein erhöhtes Risiko für KHK (Spiecker

et al. 2004).

3.9.10.4 Untersuchungen des Gens der endothelialen NO- Synthase (eNOS) bei

Patienten mit KHK

Im Rahmen einer DGGE- Mutationsscreening- Studie wurden konsekutiv jeweils 795

Patienten aus dem Kollektiv der Marburger Präventions- Allianz auf Mutationen in 8

unterschiedlichen Regionen des Gens der endothelialen NO- Synthase (eNOS), die für

konservierte Regionen der eNOS codieren, untersucht. Die endotheliale

Stickstoffmonoxid- Synthase (eNOS) ist in den Zellen der Gefäßwand lokalisiert und

katalysiert die Bildung von NO aus dem Substrat L- Arginin, was zu einer Aktivierung

der Guanylatzyklase und Bildung von zyklischem Guanosin- monophosphat (cGMP)

führt, über das der Tonus der glatten Muskelzellen reguliert wird. Es konnte eine bisher

unbeschriebene heterozygote Mutation C1463T im eNOS- Gen, die zu einer

3. Ergebnisse 173

Substitution der Aminosäure Thr488Ilein der Calmodulin- bindenden Domäne von

eNOS führt identifiziert werden. Thr 488 ist einer von drei konservierten

Threoninresten, die reziprok phosphoriliert/dephosphoriliert werden und die Aktivität

der eNOS unter verschiedenen physiologischen Gegebenheiten modulieren. Beim

Mutationsträger handelte es sich um einen 49- jährigen Patienten mit einer 2- Gefäß-

KHK, der neben einer positiven Familienanamnese eine Neigung zu Vasospasmen

aufwies, was auf eine funktionelle Relevanz der Mutation schließen lässt. Zusätzlich

zum Screening auf neue eNOS- Mutationen wurde der vorbeschriebenen eNOS-

Polymorphismus Glu298Asp untersucht, dessen Assoziation hinsichtlich KHK

kontrovers diskutiert wird. Unsere Untersuchungen ergaben, dass dieser

Polymorphismus in Deutschland keine Assoziation mit KHK zeigte, was im Einklang

mit den Ergebnissen einer weiteren Studie aus Deutschland steht, in der bei 3250

untersuchten koronarangiographierten Patienten ebenfalls kein Zusammenhang von

eNOS Glu298Asp mit KHK gefunden wurde (Gardemann et al. 2002). Unsere

Mutationsanalyse der eNOS konnte zeigen, dass funktionelle Domänen der eNOS einen

hohen Konservierungsgrad aufweisen, was die enorme Bedeutung der eNOS für den

Nitric Oxide Pathway aufzeigt (Soufi M, Imhof M, Sattler AM, Rafat M, Maisch B, und

Schaefer JR. Mutationsscreening der endothelialen NO- Synthase (eNOS). (2002). 108.

Jahrestagung der Deutschen Gesellschaft für Innere Medizin (DGIM) in Wiesbaden 1.

Posterpreis in der Sektion Angiologie).

3.9.10.5 Untersuchungen von Apolipoprotein E (ApoE) bei Patienten mit

Hypertriglyzeridämie

In dieser Studie wurde Apolipoprotein E (ApoE), bei 130 Patienten mit

Hypertriglyzeridämie sowohl molekulargenetisch mittels direkter Sequenzierung des

ApoE- Gens, als auch auf Proteinebene durch isoelektrische Fokussierung (IEF)

untersucht. ApoE erfüllt wesentliche Aufgaben bei der Verstoffwechselung der

Chylomikronen und VLDL und ist Ligand von LDL- Rezeptor, VLDL- Rezeptor und

LRP (LDL- Rezeptor- related Protein). Die Studie identifizierte bei einem Patienten mit

ausgeprägter Hypertriglyzeridämie (Tgl. 510 mg/dl) gleichzeitig zwei heterozygote

Basensubstitutionen in Exon 1 (T3100C) und Exon 4 (C3371T), welche zu zwei

Aminosäuresubstitutionen Leu28Pro und Leu141Met in ApoE führen. Neben der bereits

vorbeschriebenen Mutation Leu28Pro (Orth et al. 1999), liegt die neue zusätzlich

3. Ergebnisse 174

identifizierte Mutation Leu141Met innerhalb der LDL- Rezeptor- Bindungsregion von

Apo E (AS 136-150). Mutationen in diesem Bereich bewirken eine verminderte

Bindung von ApoE an den LDL- Rezeptor und führen über diesen Mechanismus zu

Hyperlipidämien. Am häufigsten betroffen sind positiv geladene Aminosäuren in dieser

Region (Arg; His; Lys 136-150). Neben den positiv geladenen Aminosäuren spielen

auch Leuzine für die Stabilisierung der Bindungsregion eine wichtige Rolle. Aufgrund

des deutlich ausgeprägten Phänotyps ist es naheliegend, dass es durch den zusätzlichen

Aminosäureaustausch zu einer gestörten Bindung von ApoE an den LDL- Rezeptor und

somit zu einem verzögerten Abbau triglyzeridhaltiger Partikel kommt. (Soufi M,

Hackler R, Sattler AM, Maisch B, und Schaefer JR. Nachweis einer neuen Variante des

Apolipoprotein E (Leu141Met) bei einem Patienten mit therapierefraktärer

Hyperlipidämie. (2001). 107. Jahrestagung der Deutschen Gesellschaft für Innere

Medizin (DGIM) in Wiesbaden 1. Posterpreis in der Sektion Endokrinologie).

4. Diskussion 175

4. Diskussion

4.1 ApoB- H3543YMarburg und FH- W556RMarburg zwei neue, häufig vorkommende

Defekte in zentralen Proteinen des Lipidstoffwechsels

ApoB- 100 ist die alleinige Proteinkomponente der atherogenen LDL und spielt als

Ligand des LDL- Rezeptors eine zentrale Rolle bei der rezeptorvermittelten „clearance“

dieser Lipoproteinpartikel aus der Zirkulation. Etwa zwei Drittel der entstandenen LDL

werden in die Leber sowie in periphere Gewebe aufgenommen, der Rest wird

unspezifisch über Scavanger- Rezeptoren aufgenommen. In den Zellen wird das LDL-

Cholesterin dann als wichtiger Membranbaustein und zur Synthese von

Steroidhormonen verwendet oder in Form von Cholesterinestern gespeichert. Störungen

in der Verstoffwechselung und Akkumulation von LDL sind nach heutigen

Erkenntnissen einer der Haupt- Pathomechanismen für die Ausbildung von kardialer

und zerebrovaskulärer Atherosklerose; Krankheiten, die heute für nahezu 50% der

Todesfälle in den westlichen Industrienationen verantwortlich sind (Schaefer 1998), was

durch große prospektive epidemiologische (Framingham- Study und PROCAM- Studie)

(Castelli 1982; Assmann et al. 2002) sowie einer Vielzahl von geographischen

Assoziations- Studien belegt werden konnte. Eine der genetischen Ursachen für einen

verzögerten LDL- Katabolismus und ein erhöhtes Atheroskleroserisiko sind Mutationen

des ApoB- 100 (Vrablik et al. 2001; Whitfield et al. 2004), die autosomal dominant

vererbt werden. Als Folge dieser Defekte kommt es zu einer reduzierten Bindung von

Apo B- 100 an den LDL- Rezeptor und zu einem Anstieg der Plasma- LDL-

Konzentration bei den betroffenen Patienten. Weltweit wurden bisher vier Apo B- 100 -

Defekte (ApoB- R3500Q, ApoB- R3500W, ApoB- R3531C und ApoB- R3480W)

beschrieben, die zu einem veränderten LDL- Katabolismus führen (Soria et al. 1989;

Pullinger et al. 1995; Gaffney et al. 1995). Die im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten

genetischen DGGE- Screening- Studien mit 853 konsekutiv gesammelten Proben aus

dem koronarangiografierten Patienten- Kollektiv der Marburger Präventions- Allianz

(Schaefer et al. 2000) führten zur Detektion eines weiteren bisher unbekannten ApoB-

100- Defektes (ApoB- H3543YMarburg) in einer aus Deutschland stammenden Population

(Soufi et al. 2004). Im untersuchten Kollektiv konnte diese Mutation bei insgesamt vier

Patienten nachgewiesen werden. Bisherige Untersuchungen über die Häufigkeiten der

4. Diskussion 176

bisher identifizierten vier ApoB- 100 Defekte in unterschiedlichen kaukasischen

Populationen, ergaben für die R3500Q- Mutation Prävalenzen, die bei 1:500 bis 1:1000

in der Normalpopulation lagen (Tybjaerg-Hansen et al. 1990; Innerarity et al. 1990;

Tybjaerg-Hansen et al. 1998). Vereinzelt fanden sich in einigen vorselektionierten

Populationen (Patienten mit Typ II a Hypercholestrinämie) jedoch auch höhere

Prävalenzen, die bei 1:250 (Schweiz) (Miserez und Keller 1995; Miserez und Muller

2000), sowie 1:114 im Rhein- Main- Gebiet (Fisher et al. 2000) lagen, was

wahrscheinlich auf ein sampling Bias in diesen Kollektiven zurückzuführen ist.

Ähnliche Häufigkeiten fanden sich auch für die ApoB- R3531- Mutation in

vorselektionierten Populationen aus Kliniken mit Lipidstoffwechselambulanzen. Hier

wurden die höchsten Prävalenzen mit 1: 206-1:1000 in Großbritannien und Frankreich

ermittelt (Rabes et al. 1997; Pullinger et al. 1999). Die dritte bisher beschriebene

Mutante R3500W scheint in Europa weniger häufig zu sein (Tybjaerg-Hansen et al.

1998), stattdessen besitzt die Mutation in asiatischen Populationen eine annähernd hohe

Prävalenz wie R3500Q in Europa (Choong et al. 1997; Tai et al. 1998). Die ApoB-

R3480W- Mutation wurde von Boren bisher lediglich bei einem Patienten in einer

Untersuchung von 2500 hypercholesterinämischen Patienten in den USA identifiziert.

Daten bezüglich der Prävalenz in Europa liegen bisher noch nicht vor (Boren et al.

2001). Ein Vergleich der bisher gefundenen Prävalenzen der ApoB- Mutationen mit den

in dieser Arbeit gefundenen Daten für (ApoB- H3543YMarburg) zeigt, dass die neue

identifizierte Mutation mit einer Prävalenz von 1: 213 eine sehr häufige Mutation in

Deutschland ist, wenn man sie mit den Daten für R3500Q im untersuchten Kollektiv

vergleicht (1 heterozygote Patientin unter 853 Probanden). Dies bestätigte sich auch in

einem zweiten unabhängigen aus, Südwest- Deutschland stammenden

koronarangiografierten Kollektiv der Ludwighafen Risk and Cardiovascular Health-

Study (LURIC-Studie) (Winkelmann et al. 2001), das ebenfalls mit DGEE- Screening

auf ApoB- Genmutationen untersucht wurde. Es fand sich eine annähernd gleiche

Häufigkeit der ApoB- H3543YMarburg- Mutation (12 heterozygote Patienten unter 3300

untersuchten Probanden, unpublizierte Daten aus der Abteilung von Prof. W. März,

Institut für Klinische Chemie der Universität Graz) wie im Marburger Kollektiv. Die

durchgeführte ApoB- Haplotypanalyse zur Seggregation von ApoB- H3543Y ermittelte

einen eigenständigen Konsensus- Haplotyp: Xba I +, Msp I +, Xsp I +, EcoR I + , 3´HVR

4. Diskussion 177

35, der sich von den bisher beschriebenen Haplotypen der anderen publizierten ApoB-

Mutationen unterschied (Wenham et al. 1997; Fisher et al. 1999). Bei der identifizierten

Patientin mit der ApoB- R3500Q- Mutation fand sich der für diese Mutation in

kaukasischen Populationen am häufigsten gefundene Konsensus- Haplotyp 194: Xba I -,

Msp I +, Xsp I +, EcoR I + und 3´HVR 49 (Ludwig und McCarthy 1990; Castillo et al.

2002). Da nahezu alle bisherigen ApoB- Mutationsträger europäischen Ursprungs sind,

wird vermutet, dass die meisten R3500Q- Mutationsträger von einem gemeinsamen

Vorfahren keltischen Ursprungs abstammen, der vor ca. 6750 Jahren in Europa lebte

(Miserez und Muller 2000), was auch den häufig gefundenen Konsensus- Haplotyp 194

erklärt. Wir konnten ApoB- H3543YMarburg bisher nur in heterozygoter Form bei

Personen mit deutsch- ethnischem Hintergrund identifizieren. Es könnte sein, dass

ApoB- H3543YMarburg populationsgenetisch ein „founder effect“ ist, der einer anderen

Volksgruppe entstammt. Interessanterweise besaßen alle bisher gefundenen

Mutationsträger Vorfahren im Osten Europas (Schlesien, Ostpreußen, Pommern). Die

hohe Prävalenz der Mutation in den von uns untersuchten Kollektiven könnte somit

durch Migration (Völkerwanderung) von Osten nach Westen nach Marburg gekommen

sein. Um diese Hypothese zu bestätigen, sind weitere populationsgenetische Studien in

unterschiedlichen Regionen Deutschlands und Osteuropas zur Inzidenz von ApoB-

H3543YMarburg notwendig. Die Frage, warum ApoB- H3543YMarburg in Deutschland

nicht schon früher identifiziert wurde, lässt sich durch die unterschiedlichen

molekularbiologischen Nachweisverfahren zur Detektion der Mutationen in

Lipidkliniken/Ambulanzen erklären. In den meisten Fällen erfolgt bei Verdacht auf

Dyslipidämien ein spezifischer PCR- RFLP- Nachweis der Mutationen R3500Q und

R3531C auf DNA- Ebene (Hansen et al. 1991; Rust et al. 1993). Ein hochsensitives

DGGE- basiertes Screening, welches den Nachweis bekannter und neuer ApoB-

Genmutationen ermöglicht, wird in Deutschland nur von wenigen Arbeitsgruppen

durchgeführt (Fisher et al. 1999; Nauck et al. 2001).

Im zweiten Teil dieser Arbeit wurden extrem seltene und schon in frühester Kindheit

schwerstmanifestierte Formen der familiären Hypercholesterinämie (FH), die durch

Defekte im LDL- Rezeptor entstehen, untersucht. Bei der familiären

Hypercholesterinämie (FH) findet man klinisch eine massive Erhöhung der

Plasmakonzentration an LDL- Cholesterin- um das 2-6fache des Normalwertes. Die

4. Diskussion 178

Erkrankung wird autosomal dominant vererbt und ist mit einer Heterozygotenfrequenz

von ca. 1:250 (in Populationen mit founder effect) -1:500 (bei einer

Homozygotenfrequenz von ca. 1:1000000) eine der häufigsten monogenetisch vererbten

Stoffwechselerkrankungen (Goldstein und Brown 1989; Austin et al. 2004). Als Folge

der massiven LDL- Akkumulation kommt es zur chemischen Modifikation der LDL

(Acetylierung und Oxidation) und Einwanderung in den subendothelialen Raum, wo

weitere oxidative Prozesse zu einer unregulierten Aufnahme dieser LDL durch

Monozyten/Makrophagen über die Scavenger- Rezeptoren Typ- A-I/II (Krieger und

Herz 1994; Stary 1995) führen, was letztendlich dann zur Ausbildung von

komplizierten Plaques in den Arterien des systemischen Kreislaufs insbesondere der

Aorta und ihren Ästen, sowie der Koronararterien, Karotiden und Aortenklappen führt.

Die Lebenserwartung unbehandelter homozygoter Patienten (compound heterozygot)

liegt unter 20 Jahren. Für „true homozygous“- FH liegt die Lebenserwartung je nach

Defekt, unter 10 Jahren. In der hier vorliegenden Arbeit konnte erstmals eine neue

homozygote FH- Mutation (FH- W556RMarburg) bei einem eineiigen männlichen

türkischen Zwillingspaar identifiziert werden, das einer consanguinen Ehe beider Eltern

entstammte. Betrachtet man die Häufigkeit einer Geburt von eineiigen Zwillingen, die

bei ca. 1:300 liegt und die Inzidenz für eine homozygote FH, welche 1:1000000 beträgt,

so dürften rechnerisch etwa 20 homozygote eineiige FH- Zwillingspaare auf der Erde

leben, von denen wahrscheinlich viele schon wegen mangelnder ärztlicher Versorgung

und frühzeitiger medizinischer Intervention an den Folgen kardiovaskulärer oder

zerbrovaskulärer Ereignisse verstorben sind. In der Literatur fand sich bis heute keine

beschriebene homozygote familiäre Hypercholesterinämie bei eineigen Zwillingen,

sodass davon ausgegangen werden kann, dass FH- W556RMarburg zur Zeit weltweit der

einzige Fall dieser Art ist. Die Untersuchung einer zweiten FH- Familie (ebenfalls ein

consanguines Eheverhältnis der Eltern) aus dem Libanon führte zum erneuten Nachweis

von FH- W556RMarburg in homozygoter Form bei einem 4- jährigen Mädchen.

Interssanterweise zeigten sich bei diesem Mädchen, verglichen mit den Jungen aus der

türkischen Familie, deutlich niedrigere initiale Werte (ohne therapeutische Intervention)

für das atherogene LDL- Cholesterin (- 30%) und höhere Werte für das vasoprotektive

HDL- Cholesterin (+ 75%). Diese Tendenz zeigte sich auch bei den heterozygoten

Müttern aus beiden Familien. Die Tatsache, dass trotz Vorliegen einer identischen

4. Diskussion 179

LDLR- Mutation bei Frauen ein moderateres Lipidprofil vorliegt als bei Männern, lässt

auf zusätzliche Mechanismen schließen, die bei Frauen zur Ausprägung eines weniger

atherogenen Lipidphänotyps führen (z.B. durch eine effizientere Aktivierung von LDLR

und Scavanger- Rezeptor- Pathways, und/oder einen aktiveren zellulären

Cholesterintransport durch Mitglieder der ATP- bindenden Cholesterintransporter

ABCA und ABCG). Ein möglicher Grund für diese Unterschiede könnte in einer

zusätzlichen Aktivierung der Genexpression über hormonelle Stimuli bei Frauen liegen.

Seit längerer Zeit ist bekannt, dass Sexualhormone einen Einfluss auf die

kardiovaskuläre Morbidität und Mortalität bei Frauen und Männern haben (Mendelsohn

und Karas 2005). Während Androgene (männliche Geschlechtshormone) einen

Risikofaktor für kardiovaskuläre Erkrankungen darstellen, wird den Östrogenen

(weibliche Geschlechtshormone) eine KHK- Schutzfunktion zugesprochen. Der durch

Östrogene hervorgerufene vasoprotektive Schutzeffekt wird bei Frauen durch höhere

HDL- und niedrigere LDL- Spiegel hervorgerufen, geht jedoch postmenopausal

verloren und führt danach sogar zu einer höheren kardiovaskulären Morbidität und

Mortalität bei Frauen. Bisher sind die genauen Mechanismen über die Östrogene ihre

Schutzfunktion ausüben, nicht exakt aufgeklärt. Eine zentrale Rolle in diesem Prozess

scheint jedoch der Östrogenrezeptor (ER-

Zellkulturmodellen konnte eine Mitwirkung von ER- -

regulierten Genen des Lipidstoffwechsels aufgezeigt werden (Lopez et al. 2002). Diese

Studien ermittelten, dass ER- Transkription von LDLR, SCARB1 und ABCA1

zellspezifisch regulieren kann, sowohl über direkte Mechanismen (Bindung an HREs

und cis- acting SP1 repeats in den Promotoren dieser Gene), als auch indirekt durch

Interaktion mit an den Promotor gebundenen Transkriptionsfaktoren der basalen

Transkriptionsmaschinerie, jedoch ist bisher nicht genau bekannt, welche Faktoren die

ER- - vermittelte Aktivierung des SREBP/SCAP/INSIG- Pathways steuern. Die ER- -

vermittelte geschlechtspezifische Schutzfunktion vor Atherosklerose konnte auch in

tierexperimentellen Studien nachgewiesen werden. So konnte z.B. in LDLR- -- Mäusen

ein Schutz vor der Ausbildung von atherosklerotischen Läsionen und der CD36-

Rezeptor- vermittelten Akkummulation von Cholesterinestern in Makrophagen von

weiblichen Tieren gegenüber männlichen Tieren nachgewiesen werden, der dann

verloren ging, wenn es zu einer Inaktivierung von ER- - -- Tieren

4. Diskussion 180

kam (Allred et al. 2006). Diese Daten konnten somit zeigen, dass es

geschlechtspezifische hormonell induzierte regulatorische Mechanismen für die

Aktivierung des SREBP/SCAP/INSIG- Pathways gibt, die zu einer unterschiedlichen

Cholesterinverstoffwechselung in beiden Geschlechtern führen und damit verbunden

das Atheroskleroserisiko nachhaltig beeinflussen. Eine weitere Erklärung für die

unterschiedlichen HDL- und LDL- Spiegel bei Männern und Frauen mit der LDLR

W556R-Mutation, könnten zusätzliche SNPs und Haplotypen (Single Nucleotide

Polymorphisms) in Genen oder genregulatorischen Elementen (Enhancern/Silencern)

des Lipidstoffwechsels liefern, welche regulatorische, postranskriptionelle und

postranslationelle Mechanismen beeinflussen, die dann zu einem besseren/schlechteren

HDL- und LDL- Katabolismus führen (Betard et al. 1996). Prinzipiell liegt in der

Erforschung von geschlechtsspezifischen Mechanismen auf den Lipidstoffwechsel bei

Patienten mit identischer FH- Mutation ein hohes Potenzial für zukünftige

Therapieansätze. Hierzu sind jedoch weiterführende Experimente mit SNP- und

Genexpressionsarrays notwendig, um die zugrunde liegenden Faktoren/Mechanismen

zu identifizieren, damit diese Erkenntnisse dann für eine optimale Therapie von FH-

Patienten und auch anderen Patienten mit Lipidstoffwechselstörungen verwendet

werden können.

Die LDLR- Haplotypanalyse beider Familien konnte ein direktes Verwandschafts-

verhältnis aufgrund unterschiedlicher Haplotypen des LDLR- Wildtyp- Allels klar

ausschließen und zeigen, dass die Mutation FH- W556RMarburg in beiden Familien mit

dem Konsensus- Haplotyp: SfaN I +, Stu I +, Hinc II +, Ava II - und Nco I- vererbt wird,

was darauf hindeutet, dass es sich bei der neu identifizierten FH- W556R- Marburg -

Mutation wahrscheinlich um einen, im Mittleren Osten häufig vorkommenden „founder

effect“ handelt, der in den bisher durchgeführten populationsgenetischen Studien zu FH

in dieser Region, unentdeckt blieb. Aus den Daten der Dallas FH- Kollektion von

Goldstein und Brown an der Southwestern- University/Texas geht hervor, dass es im

Libanon bisher 4 homozygote FH- Mutationen gibt, die einem „founder effect“

enstammen (Lehrman et al. 1987). Diese konnten bei libanesischen Christen und

Angehörigen der Drusen, einer islamischen Sekte, die seit mehr als 1000 Jahren isoliert

im Libanon lebt, identifiziert werden (Landsberger et al. 1992). Bisher gibt es nur

geschätzte Daten zur Prävalenz von FH- Mutationen im gesamten Libanon, es wird

4. Diskussion 181

jedoch von einer Häufigkeit von 1:100000 für homozygote und 1:171 für heterozygote

FH ausgegangen (Goldstein und Brown 1989). Eine Studie von Sözen et al., die

während der Verfassung dieser Dissertation publiziert wurde, beschäftigte sich mit der

Prävalenz von FH und möglichen founder- Effekten in der Türkei (Sozen et al. 2005).

Diese Studie konnte zeigen, dass die W556R- Mutation mit einer Häufigkeit von 21,4%

die häufigste homozygote FH- Mutation in der Türkei ist. Diese Daten bestätigen unsere

erhobenen Befunde, die nahe legen, dass FH- W556RMarburg eine „founder mutation“ im

Mittleren Osten ist. In einer von Jensen et al. durchgeführten Studie zur Prävalenz von

FH in der dänischen Population (Jensen et al. 1997) wurde mittels SSCP- Analyse, bei

einer Untersuchung von 65 nicht miteinander verwandten dänischen FH- Familien, ein

neues FH- Allel identifiziert, welches die gleiche Aminosäure (Tryptophan 556) im

LDLR betraf, wie bei FH- W556RMarburg. Hierbei wurde Tryptophan 556 jedoch nicht

durch Arginin, sondern Serin substituiert (FH- W556S). Dieses neue FH- Allel wurde

bei 12% der dänischen FH- Familien (alle heterozygote Träger) identifiziert. Eine

LDLR- Haplotypanalyse ermittelte einen Konsensus-Haplotyp der auf einen „founder

effect“ der Mutation schließen ließ. Ein Abgleich mit dem für FH- W556RMarburg

ermittelten LDLR- Haplotyp zeigte einen anderen Haplotyp bei den dänischen FH-

Patienten, was darauf schließen lässt, dass es sich um zwei unabhängig voneinander

entstandene founder- Mutationen (unter der Annahme, dass keine

Rekombinationsereignisse am LDLR- Lokus stattgefunden haben) handelt.

4.1.1 ApoB- H3543YMarburg- und FH- W556RMarburg - funktionell relevante Defekte,

die über unterschiedlichen Mechanismen wirken

Die Untersuchungen zur funktionellen Relevanz der bisher identifizierten ApoB-

Defekte (R3500Q, R3500W R3531C und R3480W) durch Bindungs- und

Aufnahmexperimente in Zellkultur mit markierten LDL- Partikeln von heterozygoten

Mutationsträgern- ermittelten Bindungs- und Aufnahmekapazitäten, die bei ca. 30-70%

der Norm (Wildtyp- LDL) lagen (Gallagher und Myant 1995; Gaffney et al. 1995;

Pullinger et al. 1999), was zeigte, dass alle Aminosäuresubstitutionen in diesem Bereich

von nur 51 Aminosäuren, die zelluläre LDL- Bindung/Aufnahme deutlich reduzierten.

Erste Experimente zur funktionellen Relevanz dieser Region bei der Bindung von

ApoB- 100 an den LDLR wurden durch Untersuchungen und Bindungsstudien mit in

transgenen Mäusen generierten, trunkierten ApoB- Molekülen von Boren et al. am

4. Diskussion 182

Gladstone Institute of Cardiovascular Disease in San Francisco/USA gewonnen. In

ihren Experimenten identifizierten Boren et al. die Bindungsdomäne („B- site“) von

ApoB- 100 an den LDL- Rezeptor. Diese ist im Bereich der Aminosäuren 3359-3369

lokalisiert und nahezu identisch mit der ApoE- Bindungsstelle zum LDLR, was in

Domänen- Austausch und Bindungsexperimenten mit trunkierten ApoB- Molekülen

gezeigt werden konnte. In weiteren Experimenten fanden sie heraus, dass die ersten

89% des ApoB- 100 Moleküls den LDL- Partikel gürtelförmig umrunden, während die

verbliebenen 11% am carboxylterminalen Ende bogenförmig den Gürtel überqueren

(Boren et al. 1998), siehe Abbildung 44. Sie postulierten darauf ein Modell, bei dem das

carboxyterminale Ende des ApoB- 100 als negativer Modulator der LDL-

Rezeptorbindung fungiert und die Bindung der größeren VLDL- Partikel an den LDL-

Rezeptor verhindert. Erst durch die Lipolyse der VLDL und Umwandlung zu kleineren

IDL und LDL- Partikeln ändert das ApoB- 100- Molekül seine Konformation (Wang et

al. 2000) und erlaubt so eine Bindung über die „B- site“ an den LDL- Rezeptor. In

Aminosäureaustausch- Experimenten mit „site directed mutagenesis“ konnte in

weiterführenden Experimenten gezeigt werden, dass die Überquerung des

carboxyterminalen Gürtels an Position 3500 des ApoB- 100 durch die spezifische

Interaktion von Arginin 3500 (R3500) mit Tryptophan 4369 (W4369) hervorgerufen

wird und essentiell für die Bindung an den LDLR ist. Beim Krankheitsbild des FDB

(R3500Q- Mutation) ist diese Interaktion gestört, sodass die eigentliche

Rezeptorbindungsstelle „B- site“ partiell vom carboxyterminalen Gürtel maskiert wird,

was zu einer reduzierten LDL- Rezeptorbindung führt (Boren et al. 2001). ApoB-

H3543YMarburg ist nun eine weitere, neu identifizierte Mutation, die im Bereich des

carboxyterminalen Modulatorelements liegt. Vergleicht man alle ApoB- Defekte in

dieser Region miteinander, so zeigt sich, dass alle mit dem Verlust der positiv

geladenen Aminosäure Arginin (R) einhergehen, die bei allen Defekten durch eine

ungeladene Aminosäure substitutiert wird (Glutaminin, Cystein, Tryptophan). Auch bei

ApoB- H3543YMarburg kommt es durch die Substitution von Histidin (H) durch das

ungeladene Tyrosin (Y) zum Verlust einer positiven Ladung. Dieser Ladungsverlust ist

jedoch geringer, da Histidin schwächer basisch ist als Arginin. Die in dieser Arbeit

durchgeführten Experimente zur Aufnahme und Bindung von ApoB- H3543YMarburg

DiI- LDL (Teupser et al. 1996) in HeLa- Zellen im direkten Vergleich mit ApoB-

4. Diskussion 183

R3500Q- LDL haben gezeigt, dass ApoB- H3543YMarburg - LDL genau wie die anderen

LDL- Partikel mit defekten ApoB- 100 deutlich schlechter über den LDL- Rezeptor

internalisiert und gebunden wurden (-31 bzw. 35% der Norm), was sich auch in den

Untersuchungen mit der konfokalen Mikroskopie zeigte. Der Vergleich mit den parallel

ermittelten Daten für ApoB- R3500Q- LDL zeigte jedoch, dass die in den Experimenten

ermittelten zellulären Aufnahme- und Bindungskapazitäten von ApoB- H3543YMarburg -

LDL höher waren als die von R3500Q- LDL und den in der Literatur publizierten Daten

für die ApoB- Mutationen R3531C und R3500W (Innerarity et al. 1987; Fisher et al.

1999; Pullinger et al. 1999). In der 2001 erschienenen Arbeit zum molekularen

Mechanismus der reduzierten LDL- Bindung beim Krankheitsbild des FDB (R3500Q-

Mutation) postulierte Boren, dass Tryptophan 4369 nicht nur spezifisch mit Arginin

3500, sondern auch mit den Argininresten 3531 und 3480 interagiert und, dass die

Substitution dieser basischen Aminosäuren die Bindung an den LDLR ebenfalls

reduziert (Boren et al. 2001). Es wäre denkbar, dass alle basischen Aminosäurereste

(Arginin, Lysin, Histidin) in dieser Region die spezifische Interaktion zwischen

Tryptophan 4369 und Arginin 3500 des carboxyterminalen Modulatorelements

stabilisieren und Substitutionen dieser Aminosäuren die Bindung an den LDLR

reduzieren. Die funktionellen Daten mit der neu identifizierten ApoB- H3543YMarburg -

Mutation in dieser Arbeit weisen sehr stark auf einen solchen Mechanismus hin. Zur

detaillierten Abklärung dieser Hypothese sind jedoch „site directed mutagenesis“-

Experimente zur Substitution der Aminosäurereste R3531, R3480, H3543 notwendig. In

der Abbildung 44 ist das von Boren entwickelte Modell der Bindung von ApoB- 100 an

den LDLR dargestellt.

4. Diskussion 184

Abbildung 44: Mechanismus der gestörten Bindung von ApoB- H3543YMarburg und der

anderen bisher identifizierten ApoB- Defekte an den LDL- Rezeptor, nach dem von Boren et al.

postulierten Modell der ApoB- 100- Bindung an den LDL- Rezeptor. Das Bild zeigt, wie der

carboxyterminale Bereich von ApoB- 100 durch spezifische Interaktion der Aminosäuren

Tryptophan 4369 und Arginin 3500 sowie weiterer Reste in unmittelbarer Nähe von Arginin

3500 (R3531 und H3543), die Bindung über die Rezeptorbindungseite („B-site“) an den LDLR

ermöglicht. Bei den ApoB- Defekten R3500Q (FDB), R3531C und der neuen ApoB- H3543Y-

Mutante ist diese Interaktion gestört und es kommt zu einer reduzierten LDLR- Bindung.

Während es sich bei ApoB- H3543YMarburg um einen Liganden- Defekt handelte, der zu

einer reduzierten zellulären Aufnahme und Bindung von LDL führte, betraf die FH-

W556RMarburg- Mutation das zweite zentrale Protein des Cholesterinstoffwechsels, den

LDL- Rezeptor. Die Experimente zur Charakterisierung der funktionellen Auswirkung

von FH- W556RMarburg mit Fibroblasten- Kulturen von einer der betroffenen FH-

Familien ergaben, dass die Mutation in Position 556 des LDLR im fünften von sechs

hochkonservierten YWTD- Repeats des ß- Propeller- Motifs („six bladed propeller

structure“) (Jeon et al. 2001) zu einem kompletten Verlust von funktionellen zellulären

LDL- Rezeptoren führten. Bei FH- W556RMarburg handelte es sich um eine von weltweit

bisher 4 beschriebenen FH- Mutationen im fünften YWVD- Repeat des LDLR (siehe

auch: http://www.ucl.ac.uk/fh/). Zwei dieser Mutationen- FH- Moskau und FH- Odense

bewirken Stopp- Codons, die Rezeptoren der Klasse 1 (siehe Punkt 1.2.5 dieser Arbeit)

B-site(AS 3359 -3369)

His3543

Arg3500

Trp4369

COOH

NH2

ApoB-100

R3500

W4369

ApoB- 100

H3543

COOH

NH2

R3531H3543Y

R3500Q

W4369

COOH

NH2

ApoB- 100

B-site(AS 3359-3369)

R3500W

R3531C B-site

(AS 3359-3369)

LDL- Partikel mit normalem ApoB- 100 LDL- Partikel mit mutiertem ApoB- 100

http://www.ucl.ac.uk/fh/).

4. Diskussion 185

produzieren (Goldstein und Brown 1989; Hobbs et al. 1990). Wie bereits erwähnt,

identifizierten Jensen et al. in einer dänischen FH- Studie eine Mutation im fünften

YWVD- Repeat des LDL- Rezeptors, die ebenfalls die Aminosäure Tryptophan 556

betraf. Bei diesem FH- Allel wurde Tryptophan 556 durch Serin substituiert (W556S),

jedoch konnte diese Mutation wie alle bisher weltweit beschriebenen Mutationen in

diesem Repeat, nur in heterozygoter Form nachgewiesen werden (Jensen et al. 1997),

sodass FH- W556RMarburg die erste tatsächliche homozygote Mutation („true

homozygous“) im fünften YWVD- Repeat des LDL- Rezeptors ist, die bei eineiigen

Zwillingen identifiziert wurde. Die dänische Gruppe charakterisierte die W556S-

Mutante hinsichtlich ihrer funktionellen Auswirkungen. In transient transfizierten COS-

7- Zellen überexpremierten sie unter Kontrolle des CMV- Promotors die LDLR-

W556S- Mutante und konnten in „pulse chase“ Experimenten zeigen, dass die Zellen

nur noch die 120 KDa LDL- Rezeptor- Präkursormoleküle produzierten und keine

funktionellen 160 KDa LDL- Rezeptoren an der Zelloberfläche mehr nachweisbar

waren, was auf einen kompletten Transportdefekt vom Endoplasmatischen Retikulum

(ER) zum Golgi Apparat (Klasse 2A LDLR- Transportdefekt) zurückzuführen war. Im

Rahmen dieser Arbeit konnten wir diese Daten in Zellen, die tatsächlich nur defekte

W556R- LDL-Rezeptoren aufweisen, bestätigen. Die mit DiI- LDL durchgeführten

Bindungs- und Aufnahmestudien in Fibroblasten der homozygot betroffenen Kinder,

zeigten keinerlei nennenswerte Aufnahmen. Es fand sich lediglich eine unspezifische

Aufnahme, die bei ca. 5% der Kontrollen lag. In der konfokalen Mikroskopie mit

homozygoten LDLR-W556R- Fibroblasten, bei denen die LDLR- Produktion durch

Kultivierung in LPDS- Medium maximal stimuliert wurde, konnte mittels

Immunofluoreszenz- Analyse kein LDLR an der Zelloberfläche mehr nachgewiesen

werden, was einen Klasse 2A LDLR- Transportdefekt implizierte und durch eine

Westernblotanalyse endgültig bestätigt wurde. Die zeigte, dass in homozygoten

Fibroblasten nur die 120 KDa LDL- Rezeptor- Präkursorform nachweisbar war. Etwa

50% der FH- verursachenden LDLR- Mutationen produzieren Rezeptoren, die das

Endoplasmatische Retikulum (ER) nur partiell oder überhaupt nicht verlassen können

(„retained LDL receptors“). Die genauen Mechanismen, die dazu führen, dass Klasse

2A LDLR im ER zurückgehalten werden, sind bisher nicht genau geklärt. Zwei

Proteine, für die eine Rolle bei Klasse 2 LDLR- Defekten aufgezeigt werden konnte,

4. Diskussion 186

sind die molekularen Chaperone GRP 78 (Jorgensen et al. 2000) und RAP (receptor

associated protein). Diese beiden Proteine kontrollieren im ER, ob die LDL- Rezeptoren

korrekt gefaltet sind (quality control) (Jorgensen et al. 2003) und verhindern im Falle

von RAP auch eine frühzeitige Komplexierung des LDLR mit den Liganden ApoE und

B im ER (Li et al. 2002). Sind die LDL- Rezeptoren nicht korrekt gefaltet, so werden

sie wahrscheinlich chaperon- vermittelt über Proteasomen abgebaut. Ein sehr gut

charakterisiertes Beispiel hierfür ist die -Mutante bei cystischer Fibrose (Jensen

et al. 1995), bei der gezeigt werden konnte, dass aufgrund inkorrekter Faltung des

Proteins (Bross et al. 1999) eine Retention im ER mit rapidem proteasomalem Abbau

stattfindet (Ward et al. 1995). In einer Arbeit mit stabil transfizierten Zellen, in denen

Klasse 2- LDL- Rezeptoren überexpremiert wurden, konnten Li et al. zeigen, dass eine

Inhibition des proteasomalen Degradationssystems zu einem verzögerten Abbau von

Klasse 2A LDL- Rezeptoren im ER führte und parallel dazu die Anzahl von mutierten

LDL- Rezeptoren an der Zelloberfläche anstieg, während die Degradation von Wildtyp-

LDL- Rezeptoren nicht beeinflusst wurde. Eine direkte Ubiquitinierung der mutierten

LDL- Rezeptoren, die Voraussetzung für eine Aktivierung des zellulären proteasomalen

Abbauweges ist (Nobelpreis für Chemie 2004 an die Mediziner: Aaron Ciechanover,

Avram Hershko (Israel) und Irvin Rose (USA)), konnte die Gruppe aber nicht

nachweisen (Li et al. 2004). Stattdessen postulierten sie, dass nicht die mutierten LDL-

Rezeptoren selbst, sondern ein mit den Rezeptoren assoziertes, bisher nicht genau

bekanntes, molekulares Chaperon ubiquitiniert wird und anschließend der

LDLR/Chaperon- Komplex proteasomal abgebaut wird. Wir vermuten, dass bei FH-

W556RMarburg, dieselben Prozesse ablaufen. In unseren Westernblot- Untersuchungen

mit heterozygoten W556R- Fibroblasten, konnten wir trotz maximaler Aktivierung der

LDLR- Expression keine 120 KDa Rezeptoren nachweisen, was auf einen rapiden

proteasomalen Abbau inkorrekt gefalteter Rezeptoren hinweist. Zur Aufklärung der

genauen intrazellulären Mechanismen sind jedoch weiterführende zellbiologische

Experimente erforderlich. Für diese Zwecke sind FH- W556RMarburg- Fibroblasten ein

ideales Tool, da es sich um ein nicht transfiziertes Zellsystem handelt, in dem die

zellulären Wirkungsmechanismen unter verschiedenen Bedingungen (z.B. Kultivierung

+/- LPDS, Cholesterin, Statinen etc.) real studiert werden können. Die Abbildung 45

4. Diskussion 187

zeigt die möglichen zellulären Mechanismen, die zur Retention von FH- W556R- LDL-

Rezeptoren im Endoplasmatischen Retikulum (ER) und zu deren Degradation führen.

Abbildung 45: Möglicher Mechanismus, der dazu führt, dass mutierte Klasse 2A LDL-

Rezeptoren wie LDLR- W556RMarburg- im ER zurückgehalten und intrazellulär abgebaut werden.

Nach erfolgter Qualitätskontrolle im ER durch molekulare Chaperone (wie z.B. GRP 78 und

RAP) gelangen, korrekt gefaltete LDLR über Vesikel zum Golgi- Apparat, wo durch weitere

Prozessierung die reifen 160 KDa LDL- Rezeptoren entstehen („on pathway“). Sind die LDLR

nicht korrekt gefaltet wie bei FH- W556RMarburg, so kommt es wahrscheinlich zunächst zur

Retention der LDLR im ER („off patway) und späteren Ausschleusung der Rezeptoren in das

Cytoplasma, wo durch Ubiquitinierung eine Degradation der Rezeptoren über Proteasomen

erfolgt. Ob dabei die Rezeptoren selbst oder mit den Rezeptoren assoziierte molekulare

Chaperone ubiquitiniert werden, ist bisher nicht genau geklärt.

4.1.2 Die relative Expression zentraler Gene der Cholesterinbiosynthese in

homozygoten FH- W556RMarburg - Fibroblasten ist deutlich erhöht

Die in der vorliegenden Arbeit durchgeführten Real- Time RT/PCR- Untersuchungen

mit FH- W556RMarburg- Fibroblasten zeigten, dass die relativen Expressionen von fünf

der acht untersuchten zentralen Gene der Cholesterinbiosynthese in homozygoten FH-

Korrekte Faltung(LDLR- W556)

Endoplasmatisches Retikulum

Golgi- Apparat

Molekulare Chaperone(z.B. GRP 78, RAP)

Inkorrekte Faltung(LDLR- W556R)

Retention/Cytopl. Abbau

„off pathway“

Prozessierung(reife LDL- Rezeptoren 160 KDa)

„on pathway“

(LDL- Rezeptoren 120 KDa)

LDLR (120KDa)

Proteasom

UbiquitinierungDegradation

Cytoplasma

4. Diskussion 188

W556RMarburg- Fibroblasten deutlich erhöht waren. Bei einem verwendeten cut- off-

Wert von +/- 1,5fach, zeigten sich in homozygoten FH- W556RMarburg- Fibroblasten

signifikant erhöhte Expressionsanstiege für LDL- Rezeptor, SREBP-2, SREBP-1a,

INSIG 1, sowie HMG- CoA- Reduktase, was aufgrund des intrazellulären

Cholesterindefizits wegen fehlender funktioneller LDL- Rezeptoren auch zu erwarten

ist, sodass der zelluläre Cholesterinbedarf durch eine gesteigerte zelluläre Synthese und

kolaterale Aufnahmewege für Cholesterin erfolgen muss. Wie bereits in der Einleitung

dieser Arbeit genauer erläutert, greift das intrazellulär synthetisierte Cholesterin in den

Zellmetabolismus ein (Anderson 2003) und reguliert über mehrere Stellglieder die

transkriptionelle Kontrolle der Gene, die in der Cholesterinbiosynthese eine zentrale

Rolle spielen (Brown und Goldstein 1997; Goldstein et al. 2002). Ist eine ausreichende

Menge an Cholesterin vorhanden, so wird über die Bindung des regulatorischen

Proteins INSIG 1 (Yabe et al. 2002; Yang et al. 2002) an SCAP eine weitere

Prozessierung der SREBP- Vorläufer- Proteine in aktive Transkriptionsfaktoren

blockiert (Brown et al. 2002; Adams et al. 2003) und dadurch die LDL- Rezeptor und

intrazelluläre Cholesterinsynthese gedrosselt (Loewen und Levine 2002; Rawson 2003).

Aus den durchgeführten Studien zur Expression von SCAP, SREBP-1a/2 und INSIG 1

in FH- Fibroblasten ging hervor, dass SREBP-2 die zentrale Rolle bei der Regulation

von Genen der Cholesterinbiosynthese spielt. Für SCAP sahen wir keine Unterschiede

in der Expression dieses Gens in FH- Fibroblasten, sodass es scheint, dass die

Transkription des SCAP- Gens konstitutiv ist und die Aktivität von SCAP

posttranskriptionell oder postranslationell reguliert wird. Dieses muss jedoch noch in

weiter führenden Experimenten mit FH- Fibroblasten anderer Patienten überprüft

werden, da diesbezüglich keine Hinweise in der Literatur gefunden wurden. Ein

interessanter Aspekt war die erhöhte Expression von INSIG 1 in FH- Fibroblasten, die

wahrscheinlich als Gegenregulation für eine Überladung der Zellen mit Cholesterin

erfolgte. Sever et al. konnten zeigen, dass INSIG 1 nicht nur spezifisch mit SCAP,

sondern auch mit der HMG- CoA- Reduktase interagiert und diese Interaktion zu einer

Ubiquitinin- abhängigen proteasomalen Degradation dieses geschwindigkeits-

bestimmenden Enzyms der Cholesterinbiosynthese führt (Sever et al. 2003; Song et al.

2005). Als Folge kommt es zu einer gedrosselten intrazellulären de novo Synthese von

Cholesterin. Die Daten dieser Arbeit deuten darauf hin, dass dieser

4. Diskussion 189

Regulationsmechanismus bei FH- W556RMarburg- Fibroblasten zum Tragen kommt, um

eine überschießende durch SREBP-2 induzierte Überladung mit Cholesterin zu

verhindern. Eine neuere Arbeit von Gong et al. hat gezeigt, dass SREBP-2 in einem

konvergenten Feedback- Mechanismus auch die Expression von INSIG 1 positiv

reguliert und dafür sorgt, dass die intrazellulären Level an INSIG 1 nach ausreichender

zellulärer Versorgung mit Cholesterin wieder hergestellt werden, um eine weitere

Prozessierung der SREBP- Vorläufer- Proteine durch INSIG 1- Bindung an den

SCAP/SREBP- Komplex am ER zu verhindern (Gong et al. 2006).

Generell muss gesagt werden, dass es sich bei den in dieser Arbeit durchgeführten

Experimenten mit der Real- Time RT/PCR in FH- Fibroblasten lediglich um eine

Erfassung der relativen Expressionen dieser Gene in untransfizierten Primärzellen

handelte. Um die detaillierten Mechanismen der Regulation, Aufnahme, und Synthese

von Cholesterin aufzuklären, sind weitere proteinbiochemische und zellbiologische

Untersuchungen (zur Aufklärung von Interaktionen/Degradationen der einzelnen

Proteine) erforderlich.

4.1.3 Die mRNA- und Proteinspiegel von SCARB1 in homozygoten und

heterozygoten FH- W556RMarburg- Fibroblasten sind erhöht, aber die Expression

von ABCA1 unterscheidet sich deutlich

Ein weiterer interessanter Befund der Real- Time RT/PCR- Experimente in dieser

Arbeit war die ermittelte, deutlich erhöhte Expression und Translation von SCARB1,

sowohl in heterozygoten, als auch in homozygoten FH- W556RMarburg- Fibroblasten.

Dieses deutet stark darauf hin, dass SCARB1 einen kollateralen Bypass- Pathway

darstellt, über den FH- W556R- Fibroblasten Cholesterinester unabhängig vom LDLR-

Pathway aufnehmen können. In einer Studie zur Regulation der SCARB1- Expression

in der humanen Nierenkarzinom- Zellinie 293, konnten Treguier et al. eine individuelle

SREBP- Bindungsstelle im Promotor von SCARB1 identifizieren. Sie konnten zeigen,

dass eine Überexpression von SREBP-2 in stabil transfizierten Zellen mit einem

proportionalen Anstieg der Expression und Translation von SCARB1 einherging

(Treguier et al. 2004). Aus ihren Beobachtungen folgerten sie, dass SREBP-2 der

zentrale transkriptionelle Regulator zur Aktivierung des LDLR- Pathways für die

Cholesterinaufnahme ist. Zusätzlich zum LDLR- Pathway reguliert auch SCARB1 die

intrazelluären Cholesterinspiegel in diesen Zellen durch einen nicht- endozytotischen

4. Diskussion 190

Pathway. In diesem Prozess ist SREBP-2 ein stärkerer Aktivator als SREBP-1a. Ein

Befund, der sich mit den Daten dieser Arbeit deckt, auch hier zeigte sich, dass die

Expression von SREBP-2 in FH- W556R- Fibroblasten 4 mal höher war als die von

SREBP-1a. Ein weiterer Hinweis, der darauf hindeutet, dass SCARB1 einen Bypass-

Pathway zur Aufnahme von Cholesterin darstellt, kommt aus Experimenten mit NPC1

(Niemann Pick C1 protein) knock out- Mäusen. Xie et al. konnten zeigen, dass eine

Blockade des NPC1- abhängigen Clathrin- Coated- Pit- Pathways durch knock out von

NPC1 (wie bei der Cholesterinesterspeicherkrankheit Woolmann- Disease), zu einer

gesteigerten intrazellulären Cholesterinsynthese und Aufnahme von nicht lysosomalen

Cholesterin via SCARB1 in diesen Tieren führte (Xie et al. 2006). Diese Situation ist

vergleichbar mit der bei homozygoter familiärer Hypercholesterinämie, bei der es durch

den kompletten Verlust des LDLR- Pathways zu einer kompletten Blockade der

rezeptorvermittelten Aufnahme von Cholesterinestern aus LDL kommt. In FH- Zellen

stellt die Aufnahme von nicht- lysosomalen Cholesterinestern aus HDL und LDL über

SCARB1 einen kollateralen Weg dar, der es ermöglicht, Cholesterinester unabhängig

vom NPC1- abhängigen Clathrin- Coated- Pit- Patway direkt in die metabolisch aktiven

Pools der Zelle einzuschleusen. In unseren Untersuchungen fanden wir erhöhte

SCARB1 mRNA und Proteinspiegel in heterozygoten und homozygoten FH W556R-

Fibroblasten. Im Gegensatz zu SCARB1 war die Genexpression des

Cholesterintransporters ABCA1 in homozygoten FH- W556RMarburg- Fibroblasten

signifikant erniedrigt (- 4,34fach), wohingegen sie in heterozygoten Zellen erhöht war

(+1,4fach). Eine mögliche Erklärung hierfür liegt in den unterschiedlichen

intrazellulären Cholesterinspiegeln, welche in homozygoten Zellen trotz der SREBP-2-

induzierten Aktivierung von SCARB1 und HMGCR nicht hoch genug sind, um

genügend LXR- Liganden für eine Aktivierung der ABCA1- Transkription zu

generieren (Schmitz et al. 2001). In heterozygoten Fibroblasten hingegen kann

Cholesterin sowohl durch de novo Synthese, die Aufnahme über die noch vorhandenen

Kopie des intakten LDL- Rezeptors und via SCARB1 bereitgestellt werden, wodurch

die intrazellulären Cholesterinspiegel in diesen Zellen hoch genug sind, um genügend

LXR- Liganden für eine Aktivierung der ABCA1 Gen- Transkription zu generieren. In

der Vergangenheit haben sich zwei Studien mit kontroversen Ergebnissen mit der

SREBP-2- vermittelten transkriptionellen Kontrolle von ABCA1 befasst. Zeng et al.

4. Diskussion 191

konnten zeigen, dass eine Cholesterin- Depletion in SREBP-2 überexpremierenden,

transfizierten humanen Endothelzellen zu einer Aktivierung der LDLR und

Reprimierung der ABCA1- Expression führte. Nach ihren Befunden wird die

erniedrigte ABCA1- Expression durch die Bindung von SREBP-2 an das E-Box-

Element im ABCA1- Promotor herbeigeführt (Zeng et al. 2004). Im Gegensatz dazu

fanden Wong et al. in transfizierten Chinese Hamster Ovarien- Zellen (CHO- Zellen)

eine SREBP-2- abhängige erhöhte Transkription von ABCA1. Wong et al. postulieren,

dass SREBP-2 ein indirekter Modulator der ABCA1- Transkription ist, der über die

Aktivierung des Mevalonat- Pathways LXR- Liganden generiert, welche die Expression

von ABCA1 positiv regulieren (Wong et al. 2006). Die Daten unserer Experimente mit

untransfizierten Primärzellen stehen im Einklang mit beiden Hypothesen und

postulieren, dass eine Aktivierung der ABCA1- Transkription abhängig vom

intrazellulären Level an unverestertem Cholesterin bzw. LXR- Liganden ist und

SREBP-2 möglicherweise der Schlüsselregulator in diesem Prozess ist. In

heterozygoten FH- W556R- Zellen werden durch die SREBP-2- induzierte Aktivierung,

der LDLR, SCARB1 und HMGCR- Pathways genügend LXR- Liganden gebildet, und

die Expression von ABCA1 wird durch Dissoziation/Degradation von SREBP-2 am E-

Box- Element im ABCA1- Promotor aktiviert (Abbildung 46). In homozygoten FH-

W556R- Zellen sind durch den kompletten Ausfall des LDLR- Pathways die

intrazelluläre de novo Synthese von Cholesterin und die Aufnahme von nicht

lysosomalen Cholesterin via SCARB1 die Hauptwege der Cholesterinzufuhr. Hier

reichen die intrazellulären Spiegel an unverestertem Cholesterin jedoch nicht aus, um

genügend LXR- Liganden für eine Aktivierung der ABCA1- Expression zu generieren,

wodurch es durch Bindung von SREBP-2 an das E-Box- Element im ABCA1-

Promotor zu einer Inhibition der ABCA1- Transkription kommt (Abbildung 47). In den

Abbildungen 46 und 47 ist ein Modellsystem für die unterschiedliche SREBP-2-

vermittelte Transaktivierung des ABCA1- Promotors in heterozygoten und

homozygoten FH- W556R- Zellen dargestellt.

4. Diskussion 192

Abbildung 46: Möglicher Mechanismus der Aktivierung von ABCA1 in heterzygoten FH-

W556R- Fibroblasten. Durch Aktivierung der LDLR, SCARB1- und HMGCR- Pathways wird

eine ausreichende Menge von LXR- Liganden generiert und der ABCA1 Promotor aktiviert.

ABCA1- Promotor

LXR- Liganden (hohe Spiegel)

SREBP-2

E-Box

RXRLXR

GC-Box GC-Box

SP-1

DR-4 TATA

RNA-Pol. II

Dissoziation/Degradation

SP-1

++

FH- W556R- Fibroblasten (heterozygot)

LDLR

CC,CE

SaureCEase

CC

CC

Endosom/Lysosom

SCARB1NPC1

NeutraleCEase

C,CE C

ACAT

CNeutraleCEase

C

Acetyl- CoASynthese

C

LXR- Liganden

++

++

++

++

++

++

LDL- C

LXR- Liganden

LXR- Liganden

ABCA1 ++

LDL- C

HDL- C

4. Diskussion 193

Abbildung 47: Möglicher Mechanismus der Reprimierung von ABCA1 in homozygoten FH-

W556R- Fibroblasten. Trotz einer Aktivierung der SCARB1- und HMGCR- Pathways, stehen

wegen des kompletten Ausfalls des LDLR- Pathways nicht genügend LXR- Liganden zur

Verfügung, um den ABCA1- Promotor zu aktivieren.

ABCA1- Promotor

LXR- Liganden (niedrige Spiegel)

SREBP-2

E-Box

RXRLXR

GC-Box GC-Box

SP-1

DR-4 TATA

RNA-Pol. II

Bindung/Inhibition

SP-1

--

FH- W556R- Fibroblasten (homozygot)

LDL- C

LDLR

CC,CE

SaureCEase

CC

CC

Endosom/Lysosom

SCARB1NPC1

NeutraleCEase

C,CE C

ACAT

CNeutraleCEase

C

Acetyl- CoASynthese

C

LXR- Liganden

++

++

++

--

+

--

LDL- C

LXR- Liganden

LXR- Liganden

ABCA1 --

HDL- C

4. Diskussion 194

4.1.4 In vivo Kinetik- Untersuchungen mit ApoB- H3543YMarburg- und FH- W556R

Marburg- Patienten zeigen einen verzögerten LDL ApoB- 100 Turnover

Um die Auswirkungen von ApoB- H3543YMarburg und FH- W556RMarburg auf den

Lipidstoffwechsel in vivo zu erfassen, wurden mit jeweils einem heterozygoten

Mutationsträger Turnover- Untersuchungen zur Verstoffwechselung des VLDL- und

LDL ApoB- 100 durchgeführt. Es fand sich, wie erwartet und in Übereinstimmung mit

den in der Literatur publizierten Daten von in vivo- Kinetikuntersuchungen der ApoB-

Mutationen R3500Q und R3500W, eine deutliche Reduktion der ApoB- 100 LDL FCR

beim ApoB- H3543YMarburg - Patienten um -28%, was zu einem dreifachen Anstieg der

Verweilzeit im Plasma (RT) führte. Die PR war, wie in anderen FDB- Studien (Gaffney

et al. 2002), reduziert, der Pool im Vergleich zu diesen Studien aber nur mäßig erhöht

(Pietzsch et al. 1996). Genau wie in der von Schaefer et al. publizierten in vivo

Turnover- Studie (Schaefer et al. 1997) mit einem homozygoten R3500Q- Patienten

fand sich eine Reduktion der FCR bei gesteigertem VLDL- Pool um das fünf- bzw.

zweifache, was die defekte ApoB- Bindung an den LDL- Rezeptor verdeutlichte und in

einer verlängerten Plasmaverweildauer des VLDL ApoB- 100 resultierte, da das VLDL

ApoB- 100 im Vergleich zu den Kontrollen nicht adäquat über den LDL- Rezeptor aus

der Zirkulation entfernt werden konnte. Im Rahmen dieser Arbeit wurden keine

Untersuchungen zum IDL ApoB- 100- Stoffwechsel durchgeführt. In einer anderen

Studie konnte jedoch eine signifikante Reduktion der VLDL- IDL- zu LDL -

Konversion in FDB nachgewiesen werden (Pietzsch et al. 1996). Bei der neuen ApoB-

H3543Y- Mutante scheint es ebenfalls zu einer reduzierten verminderten

Nettokonversion von IDL zu LDL zu kommen, sodass wie bei FDB, aufgrund des

defekten Liganden ApoB die zelluläre Cholesterinaufnahme sinkt. Als Folge kommt es

zu einer gesteigerten zellulären LDL- Rezeptor- und Cholesterinbiosynthese. Durch die

größere Anzahl intakter LDL- Rezeptoren können nun vermehrt die LDL- Vorstufen

(insbesondere IDL- Partikel) über den Liganden ApoE in die Zelle aufgenommen

werden, was eine Erklärung für den reduzierten Nettotransfer von IDL nach LDL bei

FDB und ApoB- H3543Y ist (Gaffney et al. 2002). Aufgrund der noch vollkommen

intakten ApoE- Bindung kommt es zu einer relativen Kompensation des defekten

ApoB- 100 durch ApoE über einen sogenannten „ApoE rescue shuttle“. Dieser

Mechanismus würde auch die bei FDB beobachtete moderatere Erhöhung des

4. Diskussion 195

Cholesterinspiegels im Vergleich zu FH erklären. Da aus den IDL jedoch auch immer

LDL- Partikel entstehen, haben die ApoB- H3543Y- LDL wegen ihrer reduzierten

Bindung an den LDLR eine verlängerte Plasmaverweildauer, was ihnen auf Dauer ein

hohes atherogenes Potential verleiht. In den Bindungs- und Aufnahmeexperimenten

zeigte sich eine um -31 bzw. 34% reduzierte zelluläre Bindung/Aufnahme von ApoB-

H3543Y- LDL, was mit den ermittelten in vivo Kinetikdaten für die FCR (-28%) bzw.

RT (etwa dreifach velängert) des LDL- ApoB- 100 von ApoB- H3543YMarburg-

Patienten korreliert. Die in vivo turnover Daten des heterozygoten FH- W556RMarburg -

Patienten zeigten ein umgekehrtes Bild. Anders als bei ApoB- H3543Y ist hier die

Konversion von IDL zu LDL erhöht, was zu einer erhöhten Produktionsrate (PR) und

verzögerten FCR von LDL- ApoB- 100 bei FH- W556RMarburg führt. Hier kommt es

wegen des defekten LDL- Rezeptors nicht zu einer relativen Kompensation durch Apo

E, da sowohl ApoB- 100 und ApoE als Liganden nicht mehr an den defekten LDL-

Rezeptor binden können. In Studien mit FH- Patienten konnte eine Reduktion der

VLDL- ApoB- 100 und ApoE- FCR´s bereits aufgezeigt werden. Bei FH- W556RMarburg

werden die zirkulierenden LDL- Partikel als Folge des fehlenden „ApoE rescue

shuttles“ daher vermehrt über Scavangerrezeptoren (z.B. Makrophagen Scavenger

Rezeptoren Typ I und II) in die Zelle aufgenommen, was das höhere

Atheroskleroserisiko von FH- Patienten gegenüber Patienten mit ApoB- Defekten

erklärt.

4.1.5 Therapie von Patienten mit ApoB- H3543YMarburg und FH- W556RMarburg

Die klinische Relevanz der neu entdeckten Defekte ApoB- H3543YMarburg und FH-

W556RMarburg zeigt sich auch in einer noch nicht publizierten Studie unserer

Arbeitsgruppe zum in vivo Stoffwechsel der Mutationsträger unter Therapie mit den

beiden HMG- CoA- Reduktasehemmern Pravastatin (Pravasin) und Atorvastatin

(Sortis). Es kam unter beiden Medikamenten zu einer signifikanten Reduktion der

Werte für Gesamtcholesterin (GC), LDL- Cholesterin (LDL- C) und ApoB bei den

Patienten. Für den in dieser Arbeit untersuchten ApoB- H3543YMarburg- Patient ergaben

sich unter Pravasin Reduktionen von: GC -43%, LDL- C -65%, ApoB -43%. Für FH-

W556RMarburg ergaben sich unter Pravasin Werte von: GC -16%, LDL- C -20%, ApoB -

14%. Unter der Therapie mit Atorvastatin ergaben sich für ApoB- H3543YMarburg die

folgenden Senkungen: GC -50%, LDL- C -70 %, ApoB -54%, sowie HDL- C +33%.

4. Diskussion 196

Bei FH- W556RMarburg waren die Werte wie folgt: GC -40%, LDL- C -46 %, ApoB -

42%, sowie HDL- C +13%. Unter Therapie mit Atorvastatin kam es auch zu einer

leichten Erhöhung des vasoprotektiven HDL- Cholesterins, die sich unter Therapie mit

Pravastatin nicht zeigte. Die beobachteten Veränderungen der Lipidwerte stimmen mit

denen anderer Arbeitsgruppen überein (Hansen et al. 1994) und zeigen, dass die

Therapie von ApoB- H3543YMarburg- Patienten effizienter ist als die von FH-

W556RMarburg- Patienten. Die Reduktion von GC, LDL- C und Apo B- 100 durch die

HMG- CoA- Reduktasehemmer ist durch eine gedrosselte endogene

Cholesterinproduktion und eine Hochregulation des LDL- Rezeptors bedingt, wodurch

das zelluläre „steady state“ in Richtung einer vermehrten Aufnahme über den LDLR-

Pathway verschoben wird (Goldstein und Brown 1989). Bei ApoB- H3543YMarburg und

FDB (R3500Q) kommt es durch eine vermehrte Expression funktionstüchtiger LDL-

Rezeptoren zur vermehrten Aufnahme von Cholesterin über ApoE- tragende LDL-

Vorstufen (VLDL und IDL) und somit zu einer deutlicheren Senkung der

Cholesterinwerte im Plasma als bei FH- W556RMarburg. Die Cholesterinsenkung bei FH-

W556RMarburg kommt vornehmlich durch die erhöhte LDL- clearance über die

hochregulierten intakten LDL- Rezeptoren zustande. Da es sich bei FH- W556RMarburg

um einen Klasse 2 A Transportdefekt handelt, sind nur intakte LDL- Rezeptoren an der

Zelloberfläche vorhanden, die anders als bei heterozygoten FH mit bindungsdefekten

LDL- Rezeptoren nicht mit der Funktion des intakten Rezeptors interferieren

(transdominant negative Effekte). Dieses könnte auch eine Erklärung für die oft

beobachtete Genotyp/Phänotyp- Variabilität bei FH sein (Soutar 1998; Austin et al.

2004). Wir sahen in den Kinetikstudien mit Pravasin und Atorvastatin, wie erwartet,

eine deutliche Steigerung der LDL ApoB- 100- FCR und eine Reduktion des LDL

ApoB- 100- Pools bei den Patienten. Zu gleichen Ergebnissen in

Turnoveruntersuchungen bei Patienten mit moderater (Vega et al. 1990) und gemischter

Hyperlipoproteinämie (Parhofer et al. 1993) unter Pravastatintherapie kamen auch

andere Arbeitsgruppen. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Therapie mit

HMG- CoA- Reduktasehemmern sowohl bei ApoB- H3543YMarburg, als auch bei

heterozygoten FH- W556RMarburg- Patienten sehr gut funktioniert und zur Zeit die

einzige Intervention zur effizienten Senkung des Atheroskleroserisikos bei den

betroffenen Patienten darstellt. Anders sieht die Situation bei den homozygot

4. Diskussion 197

betroffenen Kindern von FH- W556RMarburg aus. Hier gibt es zur Zeit keine suffiziente

medikamentöse Therapie, die eine relevante LDL- Senkung herbeiführen könnte.

Atorvastatin zeigte initial keine relevante Senkung und wurde wegen einer möglichen

Hemmung der intrazellulären Cholesterinbiosynthese abgesetzt. Unter Therapie mit

Ezetemibe konnte das LDL- Cholesterin um 15% gesenkt werden. Ezetemibe hemmt

die intestinale Cholesterinresorption durch eine reversible Inhibition des in den

Dünndarmzellen lokalisierten Cholesterintransporters NPC1L1 (Nieman Pick C 1 like

protein). Der einzige Weg für eine klinisch relevante, adequate Cholesterinsenkung bei

den Kindern ist die extrakorporale Plasmaapherese (LDL- Apherese), über die das LDL

aus der Zirkulation entfernt wird. Diese Therapie wurde von Prof. Dr. J.R. Schaefer

gemeinsam mit Prof. Dr. G. Klaus (Klinik für Kinder- und Jugendmedizin, Direktor

Prof. Dr. R. F. Maier) am Universitätsklinikum Gießen und Marburg GmbH, erstmals

bei Kindern dieses Alters durch den Umbau eines Apheresesystems, welches

normalerweise nur für Erwachsene verwendbar ist, im September 2000 (im Alter von 4

Jahren) bei den Marburger FH- Zwillingen gestartet und läuft seitdem 1 x wöchentlich.

Unter dieser Therapie konnte das LDL- Cholesterin der Kinder von anfänglich >1100

mg/dl, nach der ersten durchgeführten LDL- Apherese stabil auf ca. 600 mg/dl (- 46%

vor LDL- Apherese) gesenkt werden. Im Verlauf der Therapie wurde dieser Wert dann

nochmals um 60% gesenkt und liegt zur Zeit im Mittel bei ca. 240 mg/dl (nach LDL-

Apherese), sodass im Verlauf der letzten Jahre durch dieses Interventionsverfahren eine

LDL- Senkung von 78% des ursprünglichen Wertes erreicht wurde. Aus ärztlicher Sicht

ist dieser Wert natürlich immer noch zu hoch, doch die Marburger Erfahrungen haben

gezeigt, dass dieses Therapieverfahren auch bei FH- Kindern dieses Alters ohne

Komplikationen durchgeführt werden kann, und einen KHK- Progress, der unbehandelt

zu einem frühzeitigen Tod führt, aufhält. Die über dieses Therapieverfahren gewonnene

Zeit lässt darauf hoffen, dass in der medizinischen Forschung neue therapeutische

Ansätze zur Behandlung von homozygoter FH entwickelt werden, die speziell bei

betroffenen Kindern dann zur Anwendung kommen können.

5. Zusammenfassung 198

5. Zusammenfassung

Die Atherosklerose und ihre Folgeerkrankungen, insbesondere die koronare

Herzkrankung (KHK) ist in den westlichen Industrienationen für die Mehrheit der

Todesfälle verantwortlich. In großen epidemiologischen Studien konnte die Bedeutung

von Fettstoffwechselstörungen, insbesondere die der Hypercholesterinämie als

kardiovaskulärer Risikofaktor aufgezeigt werden. Die familiäre Hypercholesterinämie

(FH) ist eine monogenetisch autosomal dominant vererbte Lipidstoffwechselstörung,

die in homozygoter Ausprägung zu schwerstmanifesten Formen einer Atherosklerose

führt. Bei betroffenen Patienten kommt es ohne medizinische Intervention bereits in der

ersten Lebensdekade zu einem frühzeitigen Tod durch Myokardinfarkt oder

Schlaganfall. Die Ursachen von FH sind Mutationen in den Genen des LDL-Rezeptors

und dessen Ligand ApoB-100, die zu einem Plasmaanstieg von atherogenen LDL-

Partikeln führen. In der vorliegenden Arbeit wurden in einer DGGE- basierten

Mutationsstudie mit Patienten aus dem Kollektiv der Marburger Präventions-Allianz

zwei neue Defekte des LDL-Rezeptors (W556R) und von ApoB-100 (H3543Y)

identifiziert und detailliert funktionell charakterisiert. Diese Untersuchungen konnten

zeigen, dass ApoB-H3543YMarburg mit 1: 223 eine sehr hohe Prävalenz in der deutschen

Population aufweist und häufiger vorkommt als alle bisher publizierten ApoB-

Mutationen. Strukturell kommt es bei ApoB-H3543YMarburg genau wie bei den anderen

ApoB-Defekten mit reduzierter LDL-Rezeptorbindung zur Substitution einer positiv

geladenen Aminosäure (H) durch eine neutrale Aminosäure (Y) im carboxyterminalen

Modulatorelement der LDLR-Bindungsstelle von ApoB-100. Bindungs- und

Aufnahmekinetikstudien mit fluoreszenzmarkiertem DiI- ApoB-H3543YMarburg- LDL in

HeLa-Zellen zeigten eine reduzierte Bindung an und Aufnahme über den LDLR (-31%

bzw. 35% der Norm). In vivo Kinetikuntersuchungen zum Turnover von ApoB-

H3543YMarburg- LDL ermittelten wir, wie für die FDB-R3500Q-Mutation bereits

vorbeschrieben, einen verlangsamten ApoB-H3543YMarburg- LDL Katabolismus. Diese

Daten konnten klar zeigen, dass es sich bei ApoB-H3543YMarburg um einen neuen

Defekt mit funktioneller Relevanz handelt. Neben ApoB-H3543YMarburg konnte im

Rahmen dieser Arbeit weltweit erstmals die LDL-Rezeptor-Mutation (W556R) in

homozygoter Form bei einer Familie mit 3-jährigen eineiigen männlichen Zwillingen

identifiziert werden. Diese Mutation konnte dann ein zweites Mal in homozygoter Form

5. Zusammenfassung 199

bei einem 4-jährigen Mädchen aus einer nicht verwandten FH-Familie aus dem Libanon

nachgewiesen werden. Phänotypisch zeigte sich eine geschlechtsspezifische heterogene

Ausprägung der W556R-Mutation (weibliche Mutationsträger hatten deutlich niedrigere

LDL- und höhere HDL-Spiegel). Die LDLR-W556R-Mutation betrifft das fünfte

hochkonservierte YWVD- Repeat des six bladed ß-Propeller- Motif im LDLR und führt

zu einer kompletten zellulären LDLR-Defizienz. Aufnahme und Bindungsstudien mit

DiI-LDL in Fibroblasten von homozygoten Patienten zeigten keine nachweisbare DiI-

LDL- Bindung/Aufnahme mehr (< 5%). Bei heterozygoten Patienten lagen LDL-

Bindung und Aufnahme bei 45% bzw. 49% der Norm. Experimente mit konfokaler

Mikroskopie und Western- Blotting identifizierten einen Transportdefekt Klasse 2a mit

kompletter LDLR-Retention im Endoplasmatischen Retikulum als molekulare Ursache

der W556R-Mutation. Real-Time PCR-Untersuchungen zur Auswirkung von W556R

auf die Regulation der intrazellulären Cholesterinbiosynthese ermittelten eine stark

erhöhte Expression zentraler Gene des Cholesterinstoffwechsels, die hauptsächlich über

den SREBP-2 (Sterol regulatory element-binding protein 2) Transkriptionsfaktor

vermittelt wurde. Zusätzlich fanden sich erhöhte mRNA-und Proteinspiegel von

SCARB1 (Scavenger-receptor-type- B-I) in Fibroblasten von homozygoten und

heterozygoten W556R- Patienten, was auf einen nicht endozytotischen kollateralen

Pathway zur direkten Aufnahme von Cholesterin aus HDL und nativen LDL bei FH-

W556R via SCARB1 hinweist. Im Gegensatz dazu zeigte sich eine stark reduzierte

Genexpression des zellulären Cholesterintransporters ABCA1 in homozygoten, aber

nicht in heterozygoten Fibroblasten, die abhängig von der Menge an intrazellulären

ABCA1-LXR-Liganden zu sein scheint. Wie bei ApoB-H3543YMarburg fand sich in der

in vivo Kinetik-Untersuchung eines FH-W556R-Patienten eine deutlich erhöhte LDL-

Plasmaverweildauer.Zusammenfassend lässt sich feststellen, dass ApoB-H3543YMarburg-

und LDLR-W556R häufig vorkommende, funktionell relevante Mutationen sind und es

geschlechtsspezifische Faktoren gibt, die trotz des Vorliegens einer identischen LDLR-

Mutation zu einer unterschiedlich starken Expression des Phänotyps führen. Die

Erforschung der zugrundeliegenden Mechanismen bietet ein hohes Potenzial für

zukünftige Therapieansätze der homozygoten familiären Hypercholesterinämie, für die

es bis zum heutigen Zeitpunkt trotz der enormen Fortschritte in der molekularen

Medizin leider immer noch keine adäquate medikamentöse Therapie gibt.

6. Literaturverzeichnis 200

6. Literaturverzeichnis

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7. Anhang 232

7. Anhang

7.1 Abkürzungsverzeichnis

ABCA ATP- bindender Kassettentransporter

ACVB Aorto-koronarer Venenbypass

Apo Apolipoprotein

APS Ammoniumpersulfat

ARH Autosomal Rezessive Hypercholesterinämie

ATP Adenosintriphosphat

cDNA copy DNA

CETP Cholesterylester- Transferprotein

CI Chemische Ionisierung

CR Katabolismusrate

D Deuterium

DGGE Denaturierende Gradientengel Elektrophorese

E Anreicherung

EI Elektron Impakt

EtBr Ethidiumbromid

FCR Fraktionelle Katabolismusrate

FDB Familiär defektes Apolipoprotein B

FH Familiäre Hypercholesterinämie

FITC Fluoresceinisothiocyanat

FSR Fraktionelle Syntheserate

GC Gaschromatograph

H Histidin

HDL High Density Lipoprotein

HFBA Heptafluorobutyricacid

HLP Hyperlipoproteinämie

HMGC R 3-Hydroxy-3-Methylglutaryl-CoenzymA-Reduktase

HMGCS 3-Hydroxy-3-Methylglutaryl-CoenzymA- Synthase

HTGL Hepatische Triglyzeridlipase

IDL Intermediate Density Lipoprotein

7. Anhang 233

IE Isotopen Anreicherung

IEF Isoelektrische Fokusierung

INSIG Insulin induced gene

IR Isotopen Verhältnis (Isotope Ratio)

KHK koronare Herzkrankheit

Kontr. Kontrolle

LCAT Lecithin Cholesterin Acyltransferase

LDLR Low density lipoprotein receptor

Lp Lipoprotein

LPL Lipoproteinlipase

LSM Laser Scanning Mikroskopie

LXR Liver-X-receptor

MS Massenspektrometer

MTP Mikrosomales- Transferprotein

Mut. Mutante

MW Mittelwert

NPC1L1 Nieman Pick disease like- protein 1

NPxY Asparagin-Prolin-x-Tyrosin

PAGE Polyacrylamid Gelelektrophorese

pAVK Periphere arterielle Verschlusskrankheit

PLTP Phospholipid- Transferprotein

PR Produktionsrate

Q Tracee Pool

q Tracer Pool

R Arginin

RFLP Restriktions- Fragment- Längen- Polymorphismus

RT Residenzzeit

RT/PCR Reverse transcription/Polymerase chain reaction

RXR Retionoid-X-Rezeptor

SAAM Simulation, Analysis And Modelling

SCAP SREBP cleavage activating protein

SCARB1 Scavenger-receptor-type B 1

7. Anhang 234

SD Standard Deviation (Standardabweichung)

SDS Sodium dodecyl sulfat

SNP Single nucleotide polymorphism

SR Scavenger receptor

SRE Sterol regulatory element

SREBP Sterol regulatory element binding protein

SSCP Single strand conformation polymorphism

Std. Standard

t Zeit

TEMED N,N,N,N – Tetramethylethylenediamine

Tm Melting temperature (Schmelztemperatur)

TRITC Tetramethylrhodaminisothiocyanat

UZ Ultrazentrifuge

VLDL Very Low Density Lipoprotein

VLDLR Very low density lipoprotein receptor

W Tryptophan

Wt Wildtyp

YWTD Tyrosin-Tryptophan-Threonin-Asparaginsäure

7. Anhang 235

7. 2 Lebenslauf

Personalien

Name: Muhidien Soufi

Geburtsdatum: 19.08.1964

Geburtsort: Marburg

Familienstand: Verheiratet mit Rosemarie Bode

Kinder: Marlon-Muhidien Bode

Schulausbildung

1971-75: Astrid Lindgren Grundschule Marburg

1975-81: Gesamtschule Richtsberg Marburg

1981-1984: Gymnasium Philippinum Marburg

Abschluß: Allgemeine Hochschulreife

Hochschulstudium

1985-1991: Studium der Humanbiologie an der Philipps-Universität Marburg

1987: Diplom-Vorprüfung

1991: Diplom-Hauptprüfung

Berufliche Tätigkeit

1992-1994: Wiss. Hilfskraft am Institut für Molekularbiologie und Tumorforschung in

Marburg.

1996-1998: Anstellung als wissenschaftlicher Mitarbeiter im Labor von Prof. Dr. A.

Steinmetz und Prof. Dr. J. R. Schaefer im Rahmen einer ABM- Maßnahme des

Arbeitsamts Marburg.

1999: Übernahme als wiss. Mitarbeiter durch Prof. Dr. J. R. Schaefer in die

Arbeitsgruppe Präventive Kardiologie, Klinik für Innere Medizin, Universitätsklinikum

Gießen und Marburg, GmbH. Tätigkeit: Aufbau des molekularbiologischen Labors.

Seitdem Laborleiter der Arbeitsgruppe Präventive Kardiologie (Dr. Pohl

Stiftungsprofessur „Präventive Kardiologie“ an Prof. Dr. J.R. Schaefer)

7. Anhang 236

7.3 Verzeichnis der akademischen Lehrer

Meine akademischen Lehrer in Marburg waren die Damen und Herren Professoren:

Amon, Aumüller, Aziz, Basler, Beato, Braasch, Braun, Drenckhahn, Engel,

Eschenbach, Fruhstorfer, Fuhrmann, Ganz, Geus, Golenhofen, Gotzen, Gressner, Griss,

Grzeschik, Habermehl, Happle, Havemann, Huffmann, Joseph, Jentzsch, Kaffarnik,

Kern, Kirchner, Kleinsasser, Klenk, Klose, Koecke, Koolmann, Kretschmer, Krieg,

Kroll, Lange, Lennartz, Lührman, Maisch, Mannherz, Müller, Mennel, Moosdorf,

Netter, Pfab, Pohlen, Priebe, Prinz, Remschmidt, Riedmiller, Rogausch, Röhm,

Rothmund, Schachtschabel, Schäfer, Schmitz-Moormann, Schneider, Schüffel, Seitz,

Schulz, Siegrist, Slenczka, Thomas, Uniscker, Vogt, von Wichert, Westphal, Zelder,

Zimmermann,.

7. Anhang 237

7. 4 Danksagung

An dieser Stelle gilt mein besonderer Dank…

…Herrn Prof. Dr. Juergen R. Schaefer für die Bereitstellung des Themas, die stetige

Motivation, sowie hervorragende wissenschaftliche Betreuung und fortwährende

Förderung meiner Arbeit und wissenschaftlichen Laufbahn.

… allen Ärzten und lieben Freunden aus dem Labor für Präventive Kardiologie: Alex,

Bilgen und Mostafa, für die entgegengebrachte Freundschaft und Mitwirkung bei allen

Studien, ohne euch wäre vieles nicht realisierbar gewesen.

… den guten Seelen des Labors: Sabine und Ulrike, für eure fortwährende

Unterstützung und die schöne Zeit die ich mit euch verbringen durfte.

…Prof. Dr. Armin Steinmetz der gemeinsam mit Prof. Dr. Juergen R. Schaefer mein

Interesse am Gebiet der Fettstoffwechsel- und Arterioskleroseforschung geweckt und

aufrechterhalten hat.

… Prof. Dr. Hans Kaffarnik und Prof. Dr. Kurt Oette, die Pioniere der

Lipidstoffwechselforschung, für all die fachlichen Diskussionen und wunderbaren

geselligen Abende bei allen nationalen und internationalen Meetings.

… allen Studienteilnehmern für ihre Mitwirkung, ohne Sie wäre diese Arbeit nicht

möglich gewesen.

… meiner Familie. Ihr habt mir diesen Weg ermöglicht und mich immer unterstützt.

Mein unermesslicher Dank gilt Rosemarie und Marlon. Ihr habt mir die Kraft und die

Zuversicht gegeben, die ich in dieser Zeit benötigt habe und mir in allen

Lebenssituationen den Rücken gestärkt. Eure Liebe ist mein Antrieb für alles bisherige

und zukünftige.

7. Anhang 238

7.5 Publikationen

Soufi M, Sattler AM, Maerz W, Starke A, Herzum M, Maisch B, Schaefer JR. A new

but frequent mutation of apoB-100-apoB His3543Tyr. Atherosclerosis. 2004;174:11-16.







Spiecker M, Darius H, Hankeln T, Soufi M, Sattler AM, Schaefer JR, Node K, Borgel J,

Mugge A, Lindpaintner K, Huesing A, Maisch B, Zeldin DC, Liao JK. Risk of coronary

artery disease associated with polymorphism of the cytochrome P450 epoxygenase

CYP2J2. Circulation. 2004;110:2132-36.

Schaefer JR, Sattler AM, Hackler B, Kurt B, Hackler R, Maisch B, Soufi M.

Hyperlipidemia in patients with apolipoprotein E 2/2 phenotype: apolipoprotein A5

S19W mutation as a cofactor. Clin Chem. 2004;50:2214.

Hufnagel B, Dworak M, Soufi M, Mester Z, Zhu Y, Schaefer JR, Klumpp S, Krieglstein

J. Unsaturated fatty acids isolated from human lipoproteins activate protein phosphatase

type 2Cbeta and induce apoptosis in endothelial cells. Atherosclerosis. 2005;180:245-54.

Sattler AM, Soufi M, Maisch B, Schaefer JR. Lipids and lipoproteins in women. Herz.

2005;30:368-74.

Soufi M, Sattler AM, Herzum M, Maisch B, Schaefer JR. Molecular basis of Obesity

and the risk for Cardiovascular Disease. Herz. 2006;3:200-206.

7. Anhang 239

Bronner G, Sattler AM, Hinney A, Soufi M, Geller F, Schafer H, Maisch B, Hebebrand

J, Schaefer JR. The 103I variant of the melanocortin 4 receptor is associated with low

serum triglyceride levels. J Clin Endocrinol Metab. 2006;91:535-8.

Soufi M, Sattler AM, Maisch B, Schaefer JR. Molecular mechanisms involved in

atherosclerosis. Herz. 2002;27:637-48.

Freie Vorträge und Postervorträge mit publiziertem Abstract

Soufi M, Ruppert V, Sattler AM, Klaus G, Teupser D, Thiery J, Maisch B, und

Schaefer JR. Untersuchungen zur Expression von Genen der Cholesterinbiosynthese bei

Trägern der LDL-Rezeptormutation (W556R). Perfusion. 20; (2). 21. Jahrestagung der

Deutschen Gesellschaft für Arterioskleroseforschung, Blaubeuren, 2007.

Soufi M, Sattler AM, Kurt B, Maisch B, Schaefer JR. VLDLR mutations in subjects

from the “Marburger Präventions-Allianz“ CAD database and thei association with

Obesity. LaboratoriumsMedizin. 30; (5). 2. Deutscher Atherosklerosekongress,

Münster, 2006.

Soufi M, Sattler AM, Broenner G, Hinney A, Kurt B, Maisch B, Hebebrand J, Schaefer

JR. Genetische Faktoren der Adipositas und koronaren Herzerkrankung (KHK). Akt

Ernähr Med. 31; (5). 22. Jahrestagung der Deutschen Adipositas-Gesellschaft, Köln,

2006.

Soufi M, Sattler AM, Kurt B, Ruppert V, Maisch B, Schaefer JR. Der VLDL-Rezeptor:

Bindeglied zwischen Energiestoffwechsel des Herzens und Adipositas (NGFN-2

Obesity and Related Disorders). Medizinische Klinik. 101; (4).112. Jahrestagung der

DGIM, Wiesbaden, 2006.

Soufi M, Ruppert V, Sattler AM, Starke A, Maisch B, und Schaefer JR.

Characterization of a novel and frequent apo B-100 mutation in Germany (apoB-100

H3543Y). Perfusion. 17; (9). 1. Deutscher Atherosklerosekongress, Leipzig, 2004.

7. Anhang 240

Soufi M, Sattler AM, Rafat M, Maisch B, Dugi K, Biedenkopf A und Schaefer JR.

Detektion eines frequenten Polymorphismus (S19W) im Apolipoprotein A-V bei

Patienten mit Hypertriglyzeridämie. Medizinische Klinik. 98; (Abstract-Band I). 109.

Jahrestagung der DGIM, Wiesbaden, 2003.

Soufi M, Imhof M, Sattler AM, Rafat M, Maisch B, und Schaefer JR.

Mutationsscreening der endothelialen NO-Synthase (eNOS). Medizinische Klinik. 97;

(Abstract- Band II). 108. Jahrestagung der DGIM, Wiesbaden, 2002.

Soufi M, Sattler AM, Maisch B, und Schaefer JR. Neuartiger LDL-Rezeptordefekt bei

einem Kind mit familiärer Hypercholesterinämie (FH), Carotis-interna-Stenose und

Apoplex. Perfusion. 14; (2). 15. Jahrestagung der Deutschen Gesellschaft für

Arterioskleroseforschung, Blaubeuren, 2001.

Soufi M, Hackler R, Sattler AM, Maisch B, und Schaefer JR. Nachweis einer neuen

Variante des Apolipoprotein E (Leu141Met) bei einem Patienten mit therapierefraktärer

Hyperlipidämie. Medizinische Klinik. 96; (Abstract- Band II). 107. Jahrestagung der

DGIM, Wiesbaden, 2001.

Soufi M, Zschoke J, Quak E, Hofmann G, Maisch B, und Schaefer JR. First description

of homozygous familial hypercholesterolemia (FH) in twins. Atherosclerosis. 147;

(Suppl. 2). 10th International Dresden Symposium on Lipoproteins and Atherosclerosis

Dresden, 1999.

7. Anhang 241

Buchbeiträge

Heinle H, Schulte H, Hahmann H, von Eckardstein: Arteriosklerose: Neue Konzepte,

Risikofaktoren und Targets: Köhler-Verlag-Tübingen (2006). M. Soufi: Hyperlipidämie

bei Patienten mit ApoE 2/2 und ApoA5 S19W

Heinle H, Schulte H, Hahmann H: Besondere Aspekte der cerebrovaskulären und

peripheren Arteriosklerose: Köhler-Verlag-Tübingen (2004). M. Soufi: Untersuchungen

des ApoA5-Gens bei Patienten mit Hypertriglyzeridämie.

Richter V, Reuter W, Rassoul F, Thiery J: Lipoproteinmetabolismus und

Atherosklerose-Prävention. Verlag wissenschaftliche Scripten-Zwickau; (2002).

M. Soufi: Screening auf Mutationen des LDL-Rezeptorgens bei Kindern mit familiärer

Hypercholesterinämie (FH).

Richter V, Reuter W, Rassoul F: Aktuelle Aspekte der Lipoprotein und

Atheroskleroseforschung: Verlag wissenschaftliche Scripten-Zwickau; (2000).

M. Soufi: Vereinfachtes DGGE-Screeningverfahren zur Detektion von neuen und

bekannten Mutationen des LDL-Rezeptors bei familiärer Hypercholesterinämie.

Vortragspreise

Soufi M, Hackler R, Sattler AM, Maisch B, und Schaefer JR. Nachweis einer neuen

Variante des Apolipoprotein E (Leu141Met) bei einem Patienten mit therapierefraktärer

Hyperlipidämie. (2001). 107. Jahrestagung der Deutschen Gesellschaft für Innere

Medizin (DGIM) in Wiesbaden, 1. Posterpreis in der Sektion Endokrinologie.

Soufi M, Imhof M, Sattler AM, Rafat M, Maisch B, und Schaefer JR.

Mutationsscreening der endothelialen NO-Synthase (eNOS). (2002) 108. Jahrestagung

der Deutschen Gesellschaft für Innere Medizin (DGIM) in Wiesbaden, 1. Posterpreis in

der Sektion Angiologie.

7. Anhang 242

7.6 Ehrenwörtliche Erklärung

Ich erkläre ehrenwörtlich, dass ich die dem Fachbereich Medizin Marburg zur

Promotionsprüfung eingereichte Arbeit mit dem Titel „ Funktionelle Charakterisierung

neu identifizierter Defekte des LDL-Rezeptors und von Apolipoprotein B-100“ in der

Klinik für Kardiologie (Direktor: Prof. Dr. B. Maisch) in der Arbeitsgruppe Präventive

Kardiologie unter Leitung von Prof. Dr. J. R. Schaefer ohne sonstige Hilfe selbst

durchgeführt und bei der Abfassung der Arbeit keine anderen als die in der Dissertation

aufgeführten Hilfsmittel benutzt habe. Ich habe bisher an keinem in- oder ausländischen

Medizinischen Fachbereich ein Gesuch um Zulassung zur Promotion eingereicht, noch

die vorliegende oder eine andere Arbeit als Dissertation vorgelegt.

Marburg, Januar 2008

Funktionelle Charakterisierung neu identifizierter Defekte...

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