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Tierartenspezifische Analytik in

Futtermitteln – Rechtlicher Hintergrund

und aktueller Stand

Dr. Jutta Zagon

Abteilung 5 Lebensmittelsicherheit

NRL für tierisches Protein in Futtermitteln

Karlsruher Futtermitteltag – 25.06.2013 Seite 2

Standorte

Das BfR verfügt über

Standorte in:

Berlin-Jungfernheide

Berlin-Marienfelde

Alt-Marienfelde / Versuchsgut

Karlsruher Futtermitteltag, 25.06.2013

NRL für tierisches Protein in Futtermitteln

- Mikroskopische Analyse / LVU Institut für

Futtermitteluntersuchung

Oldenburg, Dr. Michael Egert

- PCR

- Immunologische Verfahren

- Massenspektroskopie / GC / LC

- Methodenentwicklung & Validierung

Externe

Kooperation

Standort Jungfernheide, Berlin

Abteilung 5, Prof. Dr. Dr. A. Lampen

Lebensmittelsicherheit


Bovine spongiforme Enzephalopathie (BSE) Chronologie einer Pandemie

Erster Fall UK

> 180.000 infizierte Rinder in 25 Ländern *

* Inklusive USA, Canada

1986 2007 2000-2002

Erste Fälle DE

Keine neuen Fälle DE

Seit 2010

http://www.oie.int/animal-health-in-the-world/bse-specific-data/

Stand: 28. März 2013

2001 “TSE-Verordnung” VO (EG) Nr. 999/2001

27. Juni 1994 Verf.verbot an Wiederkäuer 94/381/EG

1992

> 35.000 Fälle UK

2012

3 Fälle UK


Verfütterungsverbot - gesetzlicher Hintergrund

VO (EG) No. 999/2001

„TSE-Verordnung“

Verfütterungsverbot für

tierisches Protein an

Wiederkäuer / verarbeitetes

tierisches Protein (VTP) an

andere Nutztiere als

Wiederkäuer außer Pelztiere

VO (EG) No. 1069/2009

„Hygiene-VO für

tierische Nebenprodukte“

„Kannibalismus-Bann“


Ausnahmen für Einzel- und Mischfuttermittel

Wiederkäuer Nicht-

Wiederkäuer

außer

Fische

Aquakultur

Eier, Eiprodukte, Milch,

Milcherzeugnisse, KolostrumZ Z Z

Hydrolysierte Proteine von Nicht-

Wiederkäuern oder aus Häuten und

Fellen von Wiederkäuern

Z Z Z

Nicht-Wiederkäuer-Kollagen u.

GelatineZ Z Z

Pflanzl. Produkte mit geringen

Kontaminationen an

Knochensplittern

Z Z Z

Fischmehl (a. i. Milchaustauscher) NZ / Z Z Z

Di- und Tricalciumphosphat

tierischen UrsprungsNZ Z Z

Blutprodukte von Nicht-

WiederkäuernNZ Z Z

Verarbeitetes Protein (VTP) von

Nicht-Wiederkäuern NZ NZ Z

Nutztiere außer PelztiereVorgeschriebene

Produktionsweise/

getrennte

Produktionsstrecken

ab. 1. Juni 2013

VO (EG) Nr. 56/2013


Tierarten/gruppen-spezifische Analytik erforderlich!

VO (EG) Nr. 56/2013

VTP von Nichtwiederkäuern in

der Aquakultur wieder erlaubt

Ruminantennachweis erforderlich ab

1. Juni 2013

Zukünftige Lockerungen?

VTP von Geflügel an Schweine (v.v.)?

Nur möglich wenn validierte

Nachweismethoden vorliegen!

„Lifting the

Feedban“

Zweite EU-

TSE-Roadmap

Ausschließlich VTP der Kategorie 3

Rückverfolgbarkeit muss gesichert sein über

tierart-spezifische Methoden (PCR)

Keine Intraspezies-Verfütterung („Kannibalismus“)

Strikt getrennte Produktionsstrecken


Gesetzlich vorgeschriebene Analytik

Mikroskopie

und

PCR

VO (EG) Nr. 51/2013

vom 16. Januar 2013

(Änderung des Anhang VI der

VO (EG) Nr. 152/2009)


• Nur noch qualitative Methode, LOD ≤ 0,1 % (VTP) w/w

Mikroskopiemethode gemäß VO 152/2009

- letztmalig verändert durch VO 51/2013 -

• Färbung (z.B. Horn, Haare, Knochen) optional

• Positives Ergebnis bei ≥ 5 tierischen Partikeln

• Methode detailliert in VO beschrieben

• Zusätzliche SOPs auf Webseite EURL-AP veröffentlicht


Exponentielle Amplifikation:

21 = 2 Kopien 22 = 4 Kopien 23 = 8 Kopien 24 = 16 Kopien 235 = 34 Mrd. Kopien

Zielsequenz

35-50

Zyklen Zyklus 2 Zyklus 4 Zyklus 3 Zyklus 1

Real-Time PCR – Eine Zielsequenz wird amplifiziert


1. Denaturierung (95 °C)

2. Primer- und Sondenanlagerung (60 °C)

3. Verlängerung mit Verdrängung der Sonde (Elongation)

4. Exonukleaseaktivität schneidet Sonde (60 °C)

Fluoreszenz

TaqManTM-Technologie


Offizielle PCR-Methode zum Ruminantennachweis

• SOP verknüpft mit VO (EG) Nr. 51/2013

- Legal Sources and SOPs“ - http://eurl.craw.eu/ -

• Redundante Zielsequenz (SINE-Fragment) ~ 200.000 cp / Zelle

LOD ≤ 0,1 % (VTP) w/w

• Plasmidstandards zur „Cut-off“-Bestimmung sind auf Anfrage vom

EURL-AP beziehbar!

• Gefahr von Kreuzkontaminationen! Bestimmung eines „Cut-off“-Wertes

notwendig!

• Extraktionsmethode vorgeschrieben (Wizzard)

http://eurl.craw.eu/


• Teilnehmer: 26 NRLs davon verwertbare Ergebnisse aus 21 Laboren

• 76.2 % der Labore: alle Analysen korrekt; kein Problem mit DNAs

• 23.8 % der Labore (5/21) lieferten falsch-positives Ergebnis mit 1 %

Schwein-VTP-Probe (Matrixprobe)

Ruminanten-PCR im „Implementation

Test“ - 2012 (EURL-AP)

• 4 Matrixproben: 3 x 0.1 % w/w entweder Schaf oder Rind-VTP

1 x 1 % w/w Schwein-VTP in Pflanzenmatrix

• 6 DNA-Extrakte: 4 x 0.1-0.2 % w/w entweder Schaf oder Rind-VTP

1 x 1 % oder 5 % w/w Schwein-VTP in Pflanzen-DNA

1 x Blank – 100% Pflanzenextrakt


• Final Report – Mai 2013

Erste Laborvergleichsuntersuchung (LVU)

2013 – Ruminanten-PCR

• Teilnehmer: 27 NRLs – Deadline 5. April 2013

• 4 Matrixproben – 2 x 0.1 % w/w TVP-Rind (137 oC) in „Aquafeed“

2 x „Aquafeed“ frei von Ruminanten-TVP

1 Zusatzprobe 0.1 % w/w TVP-Schaf oder

0.1 % w/w TVP-Schwein in Pflanzenmatrix

• 92.5 % (25/27) der Labore: alle 4 Matrixproben korrekt

• 81.5 % (22/27) der Labore: alle 5 Proben (4 + 1 Zusatzprobe) korrekt

• 0.7 % falsch negative Befunde

• Problemprobe 0.1 w/w TVP-Schwein: 3/11 Laboren falsch pos. Ergebnis


• Performance ist gut

Schlussfolgerungen EURL-AP – LVU PCR 2013

• Methode ist in den NRLs etabliert

• Falsch-positive Ergebnisse sind möglicherweise auf

Kontaminationen in den Laboren zurückzuführen

• Falsche Ergebnisse durch:

- Abweichungen vom Protokoll (speziell bei Cut-off-Bestimmung)

- mangelnde Homogenisierung der Proben

- unpassender Thermocycler (Glaskapillaren)

- Cut-off-Bestimmung war nicht auswertbar


Vorgehensweise bei der

Untersuchung von

Futtermitteln für die Aquakultur


EURL-AP-SOPs verknüpft mit VO (EG) Nr. 51/2013


EURL-SOP „Operational Schemes for the combination of

light microscopy and PCR“

No further analysis

Feed or feed material

for aquaculture and

fur animals

Is the feed or feed

material intended to

fur animals

Is the feed or feed

material known to

contain terrestrial

PAP

PCR Light microscopy

Further analysis

required (under

validation by EURL-AP)

Detection of particles from

terrestrial origin?

No prohibited

consituents of

terrestrial origin

detected

Presence of DNA?

-

-

-

-

+

+

+ +

Prohibited constituents

of terrestrial animals

detected


Kombination Mikroskopie – PCR?

Fluorescence in situ hybridization (FISH)

- Knochensplitter sedimentieren

- Probe erhitzen – DNA denaturieren

- Einzelsträngige DNA +

- Fluoreszenzmarkierte Sonde

- Visueller artspezifischer Nachweis


Alternativen zur PCR

• Immunologische Verfahren?

- Selektivitäts- und Sensitivitätsprobleme

- „Proprietary Methods“ – nicht mehr gewünscht

als Standardmethoden

• Massenspektroskopische Verfahren?

- Noch keine Ringversuchsdaten

- Apparativ aufwendig

- Mit hitzestabilen Markern aber zukünftiges Potential


Rindermehl (145 oC) Geflügelmehl

Fischmehl Schweinemehl

Identifizierung hitzestabiler Proteine

2-D-Gelelektrophorese

Rindfleisch 100 oC


Neue hitzestabile Markerproteine –

das Knochenprotein Osteocalcin (OC)

1 10 20 30 40 49

17 21 24

Posttranslationale

Carboxylierung

Artspezifischer

Bereich

Gla Gla Gla

• Stabiles Knochenprotein, in fossilen Knochen (Neandertaler) nachweisbar

Artspezifischer

Bereich

• MALDI-TOF/HR-Q-TOF/MS : Schwein und Rind: spezifischer Nachweis in

Fleisch-/Knochenmehlen möglich (Balizs et al., 2011)

• Immunologischer Nachweis von Rind in FKM (145 oC) möglich (Kreuz et al., 2012)


Peptidliganden statt Antikörper – Selektion durch Phage-Display

Phage Display über Panning-Runden

M13 Phagenpartikel

Phage display mit kommerziellen Bibliotheken Phage libraries: Ph.D.-7, Ph.D.-12 (New England Biolabs) Bsp. für Zielmoleküle: Osteocalcin, Fibrinopeptide B, MBM* Rindspezifisch

* Meat and bone meal


Identifizierung von VTP-Markerproteinen, z.B.

☞ Bovines Osteocalcin ☞ Bovines Fibrinopeptide B ☞ Bovines Troponin

Vorarbeit

Vorteil: Keine Antikörper notwendig

Phage Display

Ziel

Selektion und Identifizierung von hoch-affinen Peptidbindern

Entwicklung einfacher Assays, ähnlich ELISA


Aptamere - neue Wege in der Analytik

Einzelsträngige DNA- oder RNA-Oligonukleotide

Dreidimensionale Struktur → hochaffine und spezifische Bindung von

Targetmolekülen

Zahlreiche Targetmoleküle:

– Ionen

– Nukleotide, Oligonukleotide, Nukleinsäuren

– organische Farbstoffe

– Cofaktoren

– Glykoproteine

– Kohlenhydrat

– Aminosäuren, Peptide, Proteine

– Antibiotika

– Viren

– ganze Zellen

Struktur eines Aptamers

gegen humanes Thrombin

(nach Bock, 1992)


Aptamer-basierter Thrombinnachweis in sprühgetrocknetem Plasma

Thrombin

– Serinprotease des Gerinnungssystems im Blutplasma

– spaltet Fibrinogen zu Fibrin

– inaktive Vorstufe: Prothrombin

Aptamer gegen humanes Thrombin von Bock et al. (1992)

– DNA-Sequenz 5´-GGTTGGTGTGGTTGG-3´

– Kombiniert mit einem Rinder-Thrombin/Prothrombin-AK

– Aufbau eines Sandwich-ELONA

Sandwich-ELONA:

• 15-mer DNA-Aptamer (Bock, 1992),

biotinyliert/auf Strep-Platte gebunden

• bovines Thrombin/Plasma

• sheep anti-Thrombin (HRP)


Aptamere sind für ihr Target sehr spezifisch und weisen es mit hoher

Empfindlichkeit nach

– Thrombin: 10 ng/ml

– Prothrombin: 20 ng/ml (Einsatz von Faktor Xa erforderlich)

Sprühgetrocknetes bovines Plasma

– erfolgreiche rindspezifische Detektion im Sandwich-ELONA möglich

– Prinzipielle Eignung gezeigt

Blutmehl

– vom eingesetzten Thrombin-Aptamer nicht „erkannt“ (Prozessierungsgrad!)

Ausblick und Ziele

– Gezielte Herstellung von Aptameren gegen prozessierte Proteine

– Aufbau von kommerziell unabhängigen Nachweissystemen

– Einsatz z.B. in der Biosensor-Technik

Ausblick


Fazit

• PCR-basierte Methoden werden auch zukünftig vorrangig entwickelt und eingesetzt

- Geflügel-spezifische und Schwein-spezifische Systeme in der

Validierung (EURL-AP)

• Kombination Mikroskopie/PCR (FisH)? - unter Validierung (EURL-AP)

• Spektroskopische Methoden auf dem Vormarsch aber noch

nicht ausgereift – zukünftige Rolle noch nicht absehbar

• Einsatz immunologischer Methoden oder Ersatzmethoden zu

Antikörpern wird von deren Sensitivität , Spezifität , Herstellbarkeit

abhängen. Validierte kommerzielle Kits erreichten die Sensitivität

von 0.1 % w/w nicht.


Vielen Dank für Ihre Aufmerksamkeit

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