Gelelektrophorese am Isas

SDS-Page 2D

SDS-PAGE

• Natrium – Dodecyl – Sulfat – Polyacrylamid Gelelektrophorese

• Kontinuierliche PAGE• Diskontinuierliche PAGE• Durch SDS Proteine entfaltet, 1 Nettoladung

proportional zur Molekülgröße

2D -PAGE

• Separation der Proteine nach 2 physikalischen Parametern

• Auch orthogonale Seperation• 1. Dim.: Separation durch isoelektrischen

Punkt• 2. Dim.: Separation nach elektrophoretischen

Trennverfahren

NachweißgrenzeM

olek

ülm

asse

Trennungskapazität

Cells

Proteine

Peptide

Aminosäuren

Arbeitsschema für 2D-PAGE

IPG-strip

1. Dimension

‚Probenbehälter‘

pH 3.0 pH 10.0

Proteine wandern im elektrischen Feld zu ihren isoelektrischen Punkt

+ -

1. Dimension

IPG-Strips:• Im Handel erhältliche

Gel-Streifen mit unmobilen und eingestellten pH-gradient (pH 3-10 )

• Vorbereitung da Streifen im Schiff transportiert wurden sind diese dehydratisiert (längere Lagerung)

• Rehydratisierung ist nötig• Für 24 cm Streifen sind 450 µL

nötig • Mischung aus – 8M Harnstoff– 2M Thioharnstoff– 2% CHAPS– 0.002% Bromphenol blau– 2% IPG-Puffer

Isoelektrische Fokusierung

• Assembly of IEF-System– Streifen in Vorrichtung (Streifenhalter)– Elektroden an das Gel anschließen– Proben aufs Gel/Streifen geben – Streifen mit Öl abdecken – Ungefähre Laufzeit 20h !!!!

Vorbereitung für 2 Dimension

• Re-puffering von IPG-Streifen• Reduktion and Alkylierung Schritt• Streifen auf 2 Gel packen und laden• Gel mit Agarose Lösung auffüllen, so dass

Streifen gut aufliegt

2. Dimension

• Ungefähre Laufzeit 4h

Färbung

• Colloidal Coomassie (G-250)– 34% Methanol– 2% Phosphorsäure– 17% Ammoniumsulfat– 0,066% Coomassie

• Silber Färbung