Generierung von gesättigten N-Heterozyklen mit Iminreduktasen...2019/12/14  · Generierung von...

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Generierung von gesättigten N-Heterozyklen mit Iminreduktasen Von der Fakultät 4: Energie-, Verfahrens- und Biotechnik der Universität Stuttgart genehmigte Abhandlung zur Erlangung der Würde eines Doktors der Naturwissenschaften (Dr. rer. nat.) Vorgelegt von Niels Borlinghaus aus Wuppertal Hauptberichter: Prof. Dr. Bernhard Hauer Mitberichter: Prof. Dr. Albert Jeltsch Vorsitzender: Prof. Dr.-Ing. Ralf Takors Tag der mündlichen Prüfung: 12.12.2019 Institut für Biochemie und Technische Biochemie Abteilung Technische Biochemie 2019

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Generierung von gesättigten N-Heterozyklen

mit Iminreduktasen

Von der Fakultät 4: Energie-, Verfahrens- und Biotechnik der Universität Stuttgart genehmigte Abhandlung zur Erlangung der Würde eines

Doktors der Naturwissenschaften (Dr. rer. nat.)

Vorgelegt von

Niels Borlinghaus

aus Wuppertal

Hauptberichter: Prof. Dr. Bernhard Hauer

Mitberichter: Prof. Dr. Albert Jeltsch

Vorsitzender: Prof. Dr.-Ing. Ralf Takors

Tag der mündlichen Prüfung:

12.12.2019

Institut für Biochemie und Technische Biochemie

Abteilung Technische Biochemie

2019

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III

Folgende Fachartikel wurden im Rahmen dieser Arbeit veröffentlicht:

M. Lenz, N. Borlinghaus, L. Weinmann, B. M. Nestl „Recent advances in imine reductase

catalyzed reactions.“ World J. Microbiol. Biotechnol. 2017, 33, 199.

N. Borlinghaus, B. M. Nestl „Switching the Cofactor Specificity of an Imine Reductase.“

ChemCatChem 2018, 10, 183–187.

N. Borlinghaus, S. Gergel, B. M. Nestl „Biocatalytic Access to Piperazines from Diamines

and Dicarbonyls.” ACS Catal. 2018, 8, 3727–3732.

A. Al-Shameri, N. Borlinghaus, L. Weinmann, P. N. Scheller, B. M. Nestl, L. Lauterbach

„Synthesis of N-heterocycles from diamines via H2-driven NADPH recycling in the presence

of O2.“ Green Chem. 2019, 21, 1396–1400.

N. Borlinghaus, L. Weinmann, F. Krimpzer, P. Scheller, A. Al-Shameri, L. Lauterbach,

A.-S. Coquel, C. Lattemann, B. Hauer, B. Nestl „Cascade biotransformation to access 3-

methylpiperidine in whole cells.“ ChemCatChem. 2019, 11, 5738– 5742.

N. Borlinghaus, S. Gergel, Bettina M. Nestl, F. Thol, H. Penders “Preparation of imine

reductases at 15L scale and their application in asymmetric piperazine synthesis”,

accepted book chapter for „Practical methods for Biocatalysis and Biotransformations 3”,

edited by J. Whittall and P. W. Sutton, published by Wiley-VCH.

N. Borlinghaus, B. M. Nestl „Reductive Hydrazinations with Imine Reductases”

Manuscript in preparation.

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I. Eidesstattliche Erklärung

Hiermit erkläre ich, dass ich die vorliegende Arbeit mit dem Titel „Generierung von

gesättigten N-Heterozyklen mit Iminreduktasen“ selbstständig verfasst habe, und dass

ich keine anderen als die angegebenen Quellen und Hilfsmittel benutzt habe. Alle

wörtlich oder sinngemäß aus anderen Werken übernommenen Aussagen sind als solche

gekennzeichnet worden. Des Weiteren bestätige ich, dass die vorgelegte Arbeit nicht in

gleicher oder ähnlicher Form bei einer anderen Institution zur Erlangung eines

akademischen Grades eingereicht wurde

I. Declaration of Authorship:

I hereby declare that the present thesis entitled “Generation of saturated N-Heterocycles

with imine reductases” is the result of my own work, that all sources used or quoted

have been indicated, and that I have not used any illegitimate means. I further declare

that I have not submitted this thesis for a degree in some form or another.

Korntal, 05.07.2019

Niels Borlinghaus

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II. Danksagung

An erster Stelle möchte ich mich bei Herr Prof. Dr. Bernhard Hauer bedanken, der

mich als Doktorand in seinen Arbeitskreis aufgenommen hat und mir die Bearbeitung

dieses spannenden Themas überlassen hat. Weiterhin möchte ich mich für die

Unterstützung und die Ermutigung während meiner Arbeit bedanken. Auch für die

vielen Freiheiten, die ich in meiner Forschung hatte, und das damit verbundene

Vertrauen, möchte ich mich bedanken.

Herrn Prof. Dr. Albert Jeltsch und Herrn Prof. Dr.-Ing. Ralf Takors danke ich herzlich

für die Übernahme des Zweitgutachters, bzw. für die Übernahme des

Prüfungsvorsitzenden.

Ganz besonders bedanken möchte ich mich bei Dr. Bettina Nestl für die hervorragende

Betreuung während meiner gesamten Zeit als Doktorand. Vor allem für die fachliche

Unterstützung und den Austausch über theoretische und praktische Fragestellungen,

sowie für die Überarbeitung von Manuskripten und die Überarbeitung dieser Arbeit

möchte ich mich herzlich bedanken. Danken möchte ich auch für deine ständige und

unermüdliche Motivation in allen Phasen dieses Projektes.

Ein weiterer Dank gilt Dr. Bernd Nebel für die fachliche Unterstützung bei analytischen

Fragestellungen, sowie für die Sicherstellung einer funktionierenden Analytik.

Bedanken möchte ich mich auch bei meinen Kooperationspartnern Dr. Oliver Lenz,

Dr. Lars Lauterbach und Ammar Al-Shameri an der TU Berlin. Hierbei möchte ich

mich vor allem für die enge und produktive Zusammenarbeit bedanken, sowie für den

fachlichen Austausch. Auch für die herzliche Aufnahme bei meinen Aufenthalten in

Berlin möchte ich mich bedanken.

Ein weiterer Dank geht an meine Kollegen aus dem IRED-Team (Maike Lenz, Philipp

Scheller, Leonie Weinmann und Bettina Nestl). Dies war eine sehr lehrreiche und

produktive Zusammenarbeit für mich.

Auch möchte ich mich bei den Kollegen des Rosalind-Franklin-Labors (Sebastian

Gergel, Benjamin Aberle, Ludwig Bengel, Maike Lenz, Julia Halder, Sara Hoffman,

Lars Hinner) für die freundschaftliche Arbeitsatmosphäre und die vielen fachlichen

Diskussionen bedanken.

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Darüber hinaus möchte ich mich bei allen Kolleginnen und Kollegen bedanken, mit

denen ich in den letzten drei Jahren zusammen arbeiten durfte. Bei euch bedanke ich

mich vor allem für die angenehme Atmosphäre und die Hilfsbereitschaft im Laboralltag,

sowie für die Bereitschaft sich jederzeit über fachliche und technische

Problemstellungen auszutauschen.

Bedanken möchte ich mich auch bei den Studenten Sebastian Gergel, Andreas Reichl,

Phillip Jegl und Steffen Bernhard, welche in verschieden Bereichen dieses Projektes

beteiligt waren und von mir betreut wurden.

Auch bedanken möchte ich mich bei der Deutschen Forschungsgesellschaft (DFG) für

die finanzielle Unterstützung dieses Projektes.

Nicht zuletzt möchte ich mich bei meiner großartigen Frau Mareike bedanken, die mich

stets voll und ganz bei meiner Arbeit unterstützte.

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III. Inhaltsverzeichnis

I. Eidesstattliche Erklärung ......................................................................................................................... V

II. Danksagung ................................................................................................................................................ VI

III. Inhaltsverzeichnis ............................................................................................................................... VIII

IV. Abkürzungsverzeichnis ..................................................................................................................... XIII

V. Zusammenfassung ................................................................................................................................. XIV

V. Abstract .................................................................................................................................................... XVII

1. Einleitung ................................................................................................................................................. 1

1.1. Biokatalyse ....................................................................................................................................... 1

1.2. N-Heterozyklen .............................................................................................................................. 2

1.2.1. N-Heterozyklen als Pharmabausteine ............................................................................... 3

1.2.2. Piperazine .................................................................................................................................... 4

1.3. Enzymatische Bildung von chiralen N-Heterozyklen ...................................................... 6

1.4. Iminreduktasen .............................................................................................................................. 7

1.4.1. Reaktionsmechanismus .......................................................................................................... 9

1.4.2. IRED katalysierte Reaktionen............................................................................................ 11

1.4.3. Promiskuitive, iminreduzierende Enzymaktivitäten ............................................... 13

1.4.4. Enzymkaskaden mit Iminreduktasen ............................................................................ 14

2. Motivation ............................................................................................................................................ 16

3. Material und Methoden ................................................................................................................. 17

3.1. Materialien .................................................................................................................................... 17

3.1.1. Chemikalien .............................................................................................................................. 17

3.1.2. Vewendete Enzyme ............................................................................................................... 17

3.1.3. Verwendete Kits ..................................................................................................................... 18

3.1.4. Verwendete Plasmide ........................................................................................................... 18

3.1.5. Verwendete Mutagenese-Primer ..................................................................................... 19

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3.1.6. Verwendete E. coli Stämme ................................................................................................. 21

3.1.7. Verwendete Puffer und Lösungen .................................................................................... 22

3.2. Molekularbiologische Methoden ........................................................................................... 24

3.2.1. Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ................................................................................... 24

3.2.2. Klonierung mittels Gibson assembly ................................................................................ 25

3.2.3. Ortsgerichtete Mutagenese mittels Gibson assembly ................................................ 25

3.2.4. Ortsgerichtete Mutagenese mittels QuikChangeTM .................................................... 26

3.2.5. Agarose-Gelelektrophorese ................................................................................................ 26

3.2.6. Herstellung chemisch kompetenter Zellen ................................................................... 27

3.2.7. Hitzeschocktransformation von E. coli Zellen ............................................................. 27

3.2.8. Plasmidisolierung aus E. coli .............................................................................................. 28

3.2.9. DNA-Sequenzierung ............................................................................................................... 29

3.3. Kultivierung und Protein-Expression ................................................................................. 29

3.3.1. Verwendete Kulturmedien .................................................................................................. 29

3.3.2. Expression von IREDs im Schüttelkolben ..................................................................... 30

3.3.3. Expression von PuOs im Schüttelkolben ....................................................................... 31

3.3.4. Toxizitätsstudie in E. coli JW5510 .................................................................................... 31

3.4. Proteinreinigung und Validierung ........................................................................................ 32

3.4.1. Zellaufschluss ........................................................................................................................... 32

3.4.2. Co2+-basierte Affinitätschromatographie ...................................................................... 32

3.4.3. Proteinkonzentrationsbestimmung ................................................................................ 34

3.4.4. SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) ................................................. 34

3.5. Bestimmung der Enzymaktivität........................................................................................... 35

3.5.1. Photometrischer NAD(P)H-Assay für IREDs ................................................................ 35

3.5.2. Photometrische Analyse kinetischer Parameter für IREDs .................................... 37

3.5.3. Photometrischer NAD(P)H -Assay für Alkoholdehydrogenasen .......................... 38

3.5.4. Photometrischer H2O2-basierter Assay für Oxidasen ............................................... 39

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3.5.5. In vitro Biotransformationen mit IREDs ....................................................................... 40

3.5.6. In vitro Biotransformationen mit kontinuierlicher Substratzugabe .................. 43

3.5.7. In vitro Biotransformationen mit Enzymkaskaden ................................................... 44

3.6. In vivo Biotransformation in E.coli JW5510 ..................................................................... 46

3.7. Probenaufarbeitung (Extraktion und Derivatisierung) ............................................... 46

3.8. Screening-Systeme ..................................................................................................................... 50

3.8.1. Screening-System zur Identifizierung von IRED-Varianten mit geänderter

Kofaktorspezifität .................................................................................................................................... 50

3.8.2. Screening-System zur Identifizierung von IRED-Varianten mit erhöhter

Aktivität für Substrate mit niedriger Anfangsaktivität ............................................................. 52

3.8.3. Screening-System zur Identifizierung von IRED-Varianten mit geänderter

Stereoselektivität ..................................................................................................................................... 54

3.9. Analytische Methoden .............................................................................................................. 55

3.9.1. Gaschromatographie (GC) .................................................................................................. 56

3.9.2. Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) ................................................ 59

3.10. Bioinformatische Methoden ............................................................................................... 60

3.10.1. Erstellung eines Homologiemodells ........................................................................... 60

3.10.2. Docking, Energieminimierung und MD-refinements mit Yasara .................... 60

3.10.3. Multisequenzalignments ................................................................................................. 60

3.10.4. Strukturalignments ........................................................................................................... 61

4. Ergebnisse ............................................................................................................................................ 62

4.1. Asymmetrische Reduktion von zyklischen Iminen ....................................................... 62

4.1.1. Vergleich der kinetischen Parameter von R-IRED_Ms mit R-IRED_Sr für

Modellsubstrate........................................................................................................................................ 62

4.1.2. Testen neuer Iminsubstrate ............................................................................................... 63

4.2. Reduktive Aminierung .............................................................................................................. 64

4.2.1. Reduktive Aminierung mit ausgewählten Beispielsubstraten ............................. 65

4.2.2. Erweiterung des Substratspektrums durch Verwendung von Hydrazinen .... 66

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4.3. Doppelte reduktive Aminierung ............................................................................................ 69

4.3.1. Studien zur Aufklärung des Reaktionsweges ............................................................... 72

4.3.2. Aktivitätsvergleich mit R-IRED_Sr und S-IRED_Pe ..................................................... 74

4.3.3. Untersuchung des Substratspektrums ........................................................................... 75

4.3.4. Quantifizierung, Upscaling und Produktisolierung ................................................... 77

4.3.5. Aktivitätssteigerung durch Verwendung von Additiven ......................................... 79

4.3.6. Toxizitätsstudie ....................................................................................................................... 81

4.3.7. In vivo Biotransformationen ............................................................................................... 83

4.3.8. Verwendung von α-Ketosäureester an Stelle von Dicarbonylen ......................... 85

4.3.9. Verwendung von α-Hydroxycarbonylen an Stelle von Dicarbonylen ................ 86

4.3.10. Doppelte reduktive Hydrazinierung ........................................................................... 89

4.4. Bildung von N-Heterzyklen mithilfe von Enzymkaskaden ......................................... 91

4.4.1. Enzymkaskade mit Putrescinoxidase und IRED ......................................................... 91

4.4.2. Enzymkaskade mit Alkoholdehydrogenasen oder Alkoholoxidasen und

R-IRED_Ms ................................................................................................................................................... 95

4.5. Entwicklung von NADH-abhängigen R-IRED_Ms-Varianten ...................................... 98

4.5.1. Weiterführende Untersuchung von Varianten V8 und V10 ................................ 100

4.5.2. Kristallstruktur von R-IRED_Ms-WT und R-IRED_Ms-V8 ..................................... 103

4.6. Mutationsstudie zur Identifizierung von Stereoselektivitäts-bestimmenden

Aminosäurepositionen ........................................................................................................................ 104

5. Diskussion .......................................................................................................................................... 111

5.1. Charakterisierung von R-IRED_Ms..................................................................................... 111

5.2. Reduktive Hydrazinierung.................................................................................................... 113

5.3. Doppelte reduktive Aminierung ......................................................................................... 115

5.4. Doppelte reduktive Hydrazinierung ................................................................................. 119

5.5. Verwendung von Additiven zur Steigerung der Enzymaktivität ........................... 119

5.6. IRED katalysierte Reaktion von α-Hydroxycarbonylen mit Diaminen ............... 120

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XII

5.7. Änderung der Kofaktorspezifität ........................................................................................ 121

5.8. Änderung der Stereoselektivität......................................................................................... 126

6. Ausblick ............................................................................................................................................... 131

7. Anhang .................................................................................................................................................. 133

7.1. Archivierte Plasmide ............................................................................................................... 133

7.2. Aminosäure- und DNA-Sequenzen .................................................................................... 133

7.2.1. DNA-Sequenz der R-selektiven Iminreduktase aus Myxococcus stipitatus .... 133

7.2.2. Aminosäure-Sequenz der R-selektiven Iminreduktase aus Myxococcus

stipitatus (WT) ........................................................................................................................................ 134

7.2.3. Aminosäure-Sequenz der NADH-abhängigen R-IRED_Ms-Variante V8 .......... 134

7.2.4. Aminosäure-Sequenz der NADH-abhängigen R-IRED_Ms-Variante V10 ........ 134

7.2.5. Aminosäure-Sequenz von R-IRED_Ms-Variante 44A2 (veränderte

Stereoselektivität) ................................................................................................................................. 135

7.2.6. Plasmidkarte von pBAD33_R-IRED_Ms-His6 ............................................................ 135

7.3. Beispielhafte SDS-Gele ............................................................................................................ 136

7.4. Beispielhafte Chromatogramme ......................................................................................... 137

7.5. Mögliche Substratorientierungen für die Bildung von enantiokomlementären

Produkten ................................................................................................................................................. 140

8. Literaturverzeichnis ..................................................................................................................... 141

9. CURRICULUM VITAE ...................................................................................................................... 152

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IV. Abkürzungsverzeichnis

Å Ångström 1 Å = 10−10 m HPLC Hochleistungsflüssigkeitschromatograohie

ABTS 2,2-Azino-di(3-ethylbenzthiazolin-6-sulfonsäure)

HRP horseradish peroxidase

ACN Acetonitril IPTG Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid

ADH Alkoholdehydrogenase IRED Iminreduktase

ADP Adenosindiphosphat kb Kilobasen

AO Alkoholoxidase KBE Koloniebildende Einheiten

APS Ammoniumpersulfat kDa Kilodalton

ATP Adenosintriphosphat Kpi Kaliumphosphat

AU Absorptionseinheiten LB lysogeny broth

β-HAD β-Hydroxysäuredehydrogenase M Molar (mol L-1)

BCA Bicinchoninsäure MeOH Methanol

BSA bovine serum albumin MD molecular dynamics

C Kohlenstoff MOPS 3-(N-Morpholino)propansulfonsäure

CMC Kritische Mizellbildungskonzentration MS Massenspektrometrie(-Detektor)

Co Cobalt MTBE tert-Butyl-Methylether

CV Säulenvolumen N Stickstoff

DAD Diodenarray-Detektor NAD(P)H Nikotinamidadenindinukleotid(phosphat)

DCM Dichlormethan NH3 Amoniak

ddH2O Doppelt deionisiertes Wasser NMR Kernspinresonanz(-Messung)

de Diastereomerenüberschuss O2 Molekularer Sauerstoff

DHFR Dihydrofolatreduktase OD600 Optische Dichte bei λ = 600 nm

DMSO Dimethylsulfoxid P2CR Pyrrolin-2-carboxylatreduktase

DNA Desoxyribonukleinsäure PAGE Polyacrylamidgelelektrophorese

dNTP Desoxyribonukleosidtriphosphat PCR Polymerasenkettenreaktion

dr Diastereomerenverhältnis PDB Proteindatenbank

DRR Dihydroreticulinreduktase PEG Polyethylenglycol

DTT Dithiothreitol PP Pyrophosphat

E. coli Escherichia coli PuO Putrescinoxidase

EDTA Ethylendiamintetraessigsäure rr Regioisomerenverhältnis

ee Enantiomerenüberschuss RT Raumtemperatur

ELAA Ethyl-4-chloroacetoacetat SDS Natriumdodecylsulfat

EtOH Ethanol SDR short chain dehydrogenase/reductase

F420 Koenzym F420 SH Lösliche Hydrogenase

FDH Formiatdehydrogenase TAE TRIS-Acetat-EDTA

FE Flächeneinheiten TB Terrific Broth

FID Flammenionisationsdetektor TIRED Thiazolinyl Iminreduktase

G6P Glukose-6-phosphat TOF turnover frequency

G6PDH Glukose-6-phosphatdehydrogenase TRIS Tris(hydroxymethyl)aminomethan

GC Gaschromatograph(ie) U Unit (1 U ≙ 1µmol min-1)

H2 Molekularer Wasserstoff WT Wildtyp

H2O2 Wasserstoffperoxid

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V. Zusammenfassung

Gesättigte N-Heterozyklen sind sehr gefragte Verbindungen, die als Bausteine für die

Synthese von Pharmazeutika und Agrochemikalien eingesetzt werden. Insbesondere die

Bereitstellung von chiralen Vorstufen gilt in der organischen Chemie als sehr

herausfordernd. Immer häufiger setzt man deshalb Biokatalysatoren ein, welche sich

durch ihre exzellente Stereo-, Regio- und Chemoselektivität auszeichnen. Für die

enzymvermittelte Generierung von chiralen, gesättigten N-Heterozyklen sind nur

wenige Enzyme bekannt, von denen die meisten zu spezifisch sind, um sie abseits ihrer

natürlichen Funktion einzusetzen. Iminreduktasen (IREDs) hingegen erwiesen sich in

letzter Zeit als sehr vielversprechende Biokatalysatoren mit vergleichsweise breitem

Substratspektrum. Die Entwicklung von neuen und bereits bestehenden IRED-basierten

Biotransformationen zur Herstellung chiraler N-Heterozyklen ist deshalb ein

Forschungsgebiet mit großem Potenzial.

Im Rahmen dieser Arbeit konnte das Reaktions- und Produktspektrum von IREDs

erheblich erweitert werden. Die Entwicklung von neuen Methoden und die Erschließung

neuer Substratfamilien ermöglichte die Bildung von N-Heterozyklen, welche zuvor

enzymatisch nicht zugänglich waren. Erstmals wurde eine IRED katalysierte, doppelte

reduktive Aminierung angewendet, bei welcher Diamine und Dicarbonyle zu Piperazin

Heterozyklen oder Piperazin-ähnlichen Produkten umgesetzt wurden. Die verwendeten

Substratgruppen stellen hochreaktive Substanzen dar, welche ohne die Anwesenheit

von IREDs rasch zu diversen Nebenprodukten abreagieren. Durch die Verwendung von

IREDs konnte die Nebenproduktbildung hingegen fast vollständig unterdrückt werden,

da die Substrate kontrolliert und mit hoher Aktivität umgesetzt wurden. Dabei konnten

ausgezeichnete Produktbildungen von bis zu > 99%, sowie Stereoselektivitäten von bis

zu > 99% und Regioselektivitäten von bis zu > 99% erreicht werden. Die Durchführung

von spezifischen Kontrollexperimenten führte außerdem zu ersten Hinweisen bezüglich

der Abfolge der einzelnen Katalyseschritte. Eine besonders hohe Aktivität und ein sehr

breites Substratspektrum gegenüber dieser neuartigen Applikation wurde bei der

R-selektiven IRED aus Myxococcus stipitatus (R-IRED_Ms) festgestellt. So konnten 84

verschiedene Produkte gebildet werden. Neben Piperazinen konnten auch

Homopiperazine (Diazepane), sowie bi- und trizyklische Produkte gebildet werden.

Dabei war es möglich an allen sechs Positionen des Piperazinrings unterschiedliche

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Substituenten einzuführen. In Up-Scaling Experimenten mit 50 mM Substrat konnten bis

zu 8,1 g L-1 Produkt gebildet und eine isolierte Ausbeute von bis zu 87% erreicht

werden.

Durch die Kombination von α-Hydroxycarbonylen mit Diaminen, sowie durch die

Verwendung von Hydrazinen anstelle von Diaminen, konnte das Substrat- und

Produktspektrum zusätzlich erweitert werden. So konnte beispielsweise erstmals

(S)-2-Hydroxymethylpiperazin ausgehend von Dihydroxyaceton und Ethylendiamin

gebildet werden. Des Weiteren gelang die Bildung von Hexahydropyridazinen und

1,2-Diazepanen mit Hilfe von Hydrazinen und Dicarbonylen.

Weitere sehr bedeutsame N-Heterozyklen sind Pyrrolidine und Piperidine. Durch die

Anwendung einer Enzymkaskade mit einer Putrescinoxidase und einer IRED konnten

verschiedene 1‘-, 2‘- und 3‘-substituierte Pyrrolidine und Piperidine ausgehend von

Diaminen gebildet werden. Dabei konnten Produktbildungen von bis zu 99% und

Stereoselektivitäten von bis zu 93% (ee) erreicht werden. Auf diesem Weg gelang auch

die Bildung von N-Methylpyrrolidin, welches ein tertiäres, zyklisches Aminprodukt ist

und durch andere alternative Enzymkaskaden bislang nicht zugänglich war.

Ein weiterer Schritt zur Verbesserung der Anwendbarkeit von IREDs war die

Generierung einer NADH-abhängigen IRED-Variante. Bislang sind nur NADPH-

abhängige IREDs bekannt, jedoch hat die Verwendung von NADH gegenüber NADPH

einige Vorteile. So ist NADH deutlich günstiger und stabiler als NADPH. Außerdem

stehen effizientere und kostengünstigere Kofaktor-Regenerationssysteme zur

Verfügung.

Durch die Mutagenese der Aminosäurereste an den Positionen N32, R33, T34, K37, L67

und T71 in R-IRED_Ms, sowie durch die photometrische Untersuchung von über 1800

Kolonien konnten einige vielversprechende Varianten identifiziert werden. Die besten

Varianten V8, V9 und V10 zeigten eine bis zu 2900-fach gesteigerte NADH/NADPH

Spezifität, sowie bis zu 100% Aktivität mit NADH verglichen mit dem Wildtypenzym und

NADPH.

Die durchgeführten Studien mit R-IRED_Ms zeigen ein einzigartiges Reaktions- und

Substratspektrum. Für einige Pharmabausteine wird jedoch eine enantiokomplementäre

IRED benötigt, um das gefragte Produktenantiomer zu bilden. Eine S-selektive IRED mit

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ähnlichen Eigenschaften zu finden könnte jedoch sehr aufwendig sein. Es wurde deshalb

versucht die Stereoselektivität von R-IRED_Ms durch enzyme engineering zu ändern, in

der Hoffnung, dass die Eigenschaften gegenüber dem Substrat- und Reaktionsspektrum

erhalten bleiben. In einem enantio-sensitiven Screening mit über 3000 Kolonien konnte

eine neue Region identifiziert werden, welche einen starken Einfluss auf die

Stereoselektivität des Enzyms hat. Die Variante 44A2 mit fünf Mutationen in dieser

Region zeigte einen Enantiomerenüberschuss von 91% (S) gegenüber der Bildung von

2-Methylpyrrolidin. Im Vergleich zum Wildtyp (>99% R) wurde die Stereoselektivität

somit fast vollständig umgekehrt. Es zeigte sich, dass die eingeführten Aminosäurereste

in Variante 44A2 eine substratspezifische Stereoselektivitätsänderung bewirken. Es

konnte jedoch noch nicht geklärt werden, welche Interaktionen letztendlich für die

substratabhängige Änderung der Selektivität verantwortlich sind.

Insgesamt konnte durch diese Arbeit die Anwendbarkeit und das Verständnis gegenüber

IREDs verbessert werden. Die Entwicklung von neuen Methoden und Reaktionen, sowie

die Mutagenesestudien zeigen, dass IREDs sehr vielseitige Biokatalysatoren mit

erstaunlichen Fähigkeiten sind. Vor allem für die Bildung von N-Heterozyklen weisen sie

ein großartiges Potenzial auf, das im Bereich der Biokatalyse bislang einzigartig ist und

in Zukunft stark an Bedeutung gewinnen könnte.

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XVII

V. Abstract

Saturated N-heterocycles are highly demanded compounds that are used as building

blocks for the synthesis of pharmaceuticals and agrochemicals. In particular, the

provision of chiral precursors is very challenging in organic chemistry. Therefore,

biocatalysts with excellent stereo-, regio- and chemoselectivity are increasingly used.

Only a few enzymes are known for the enzyme-mediated generation of chiral, saturated

N-heterocycles. Most of them are very specific demonstrating activity towards the

natural substrates. In contrast, imine reductases (IREDs) have recently proven to be

very promising biocatalysts with a broad substrate scope. Therefore, the development of

new and existing IREDs for the production of chiral N-heterocycles is a field of research

with great potential.

In this work, the reaction and product spectrum of IREDs could be considerably

expanded. The development of new methods and the use of new substrate families

enabled the formation of N-heterocycles, which were previously not accessible by

biocatalytic approaches. For the first time, an IRED-catalyzed double reductive

amination was applied, in which diamines and dicarbonyls were directly converted to

piperazine heterocycles or piperazine-like products. The used substrates represent

highly reactive substances which rapidly react, without the presence of IREDs, to various

by-products. By using IREDs, however, the by-product formation could be almost

completely suppressed because the substrates were controlled and reacted with high

activity. Excellent product formations of up to > 99%, stereoselectivities of up to > 99%

as well as regioselectivities of up to > 99% were achieved. The performance of specific

control experiments also led to initial indications regarding the sequence of the

individual catalysis steps. Particularly high activity and a broad substrate spectrum were

observed for the R-selective IRED from Myxococcus stipitatus (R-IRED_Ms). Thus 84

different products could be formed. In addition to piperazines and homopiperazines

(diazepanes), bi- and tricyclic products could also be generated. Thereby, it was possible

to introduce different substituents at all six positions of the piperazine moiety. In up-

scaling experiments with 50 mM substrate, up to 8.1 g L-1 product could be formed, and

an isolated yield of up to 87% could be achieved.

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XVIII

The combination of α-hydroxycarbonyls with diamines, as well as the use of hydrazines

instead of diamines, further expanded the substrate and product spectrum. For example,

(S)-2-hydroxymethyl piperazine could be formed for the first time from

dihydroxyacetone and ethylenediamine. Furthermore, hexahydropyridazines and

1,2-diazepanes were formed from hydrazines and dicarbonyls.

Other very important N-heterocycles are pyrrolidines and piperidines. By applying an

enzyme cascade combining a putrescine oxidase with an IRED, different 1'-, 2'- and 3'-

substituted pyrrolidines and piperidines could be formed from diamines. Product

formations of up to 99% and stereoselectivities of up to 93% (ee) could be achieved. In

this way, the formation of N-methyl pyrrolidine, which is a tertiary cyclic amine product

and has not been accessible through other alternative enzyme cascades, was also

successfully generated.

A further step to improve the applicability of IREDs was the generation of an NADH-

dependent IRED variant. So far only NADPH-dependent IREDs are known, but the use of

NADH has some advantages over NADPH. NADH is much cheaper and more stable than

NADPH. Besides, more efficient and cost-effective cofactor regeneration systems are

available.

By mutagenesis of amino acid residues at positions N32, R33, T34, K37, L67 and T71 in

R-IRED_Ms, and by photometric analysis of over 1800 colonies, promising variants could

be identified. The best variants V8, V9, and V10 showed up to 2900-fold increased

NADH/NADPH specificity and up to 100% activity with NADH compared to wild type

enzyme and NADPH.

The studies performed with R-IRED_Ms show a remarkable reaction and substrate

spectrum. However, for some pharmaceutical building blocks, enantiocomplementary

IREDs are required to form the desired S- as well as R-product enantiomers. In this light,

finding an S-selective IRED with similar properties remains challenging. As an

alternative, the stereoselectivity of R-IRED_Ms was changed with enzyme engineering. In

an enantio-sensitive screening with over 3000 colonies, a new region could be

identified, which has a strong influence on the stereoselectivity. The variant 44A2 with

five mutations in this region showed an enantiomeric excess of 91% (S) for the

formation of 2-methylpyrrolidine. Thus, the stereoselectivity was almost completely

reversed compared to the wild type (> 99% R). By further experiments, it was shown

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XIX

that the amino acid residues introduced in variant 44A2 caused a substrate-specific

change in stereoselectivity. However, it has not yet been clarified, which specific

interactions are responsible for the substrate-dependent change in selectivity.

Overall, this work improved the applicability and understanding of IREDs. The

development of new methods and reactions as well as the mutagenesis studies show

that IREDs are very versatile biocatalysts with incredible capabilities. Especially for the

formation of N-heterocycles, they show great potential, which is unique in the field of

biocatalysis and could gain more and more importance in the future.

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Einleitung

1

1. Einleitung

Der weltweite Bedarf an Feinchemikalien ist enorm. Insbesondere in der

pharmazeutischen Industrie werden ständig neue komplexe chemische Bausteine

benötigt, sodass auch neue Herstellungsverfahren entwickelt werden müssen.[1]

Besonders herausfordernd ist dabei der Umstieg auf nachwachsende Rohstoffe, da die

meisten etablierten chemischen Prozesse auf fossilen Ressourcen basieren.[2,3]

Außerdem müssen für die Herstellung von komplexen Feinchemikalien oft zahlreiche

Prozessschritte mit teils niedriger Effizienz und hohem Energiebedarf angewendet

werden, was die Nachhaltigkeit zusätzlich verschlechtert.[4] Die Nachfrage für

alternative, bioökonomische Prozesse ist deshalb sehr hoch, sodass chemische

Verfahren zunehmend durch biotechnologische Ansätze ersetzt werden.[5–7] Die

Verwendung von Enzymen oder ganzen Zellen als Biokatalysatoren gewinnt deshalb in

den letzten Jahren immer mehr an Bedeutung.[8–15]

1.1. Biokatalyse

Im Fokus der Biokatalyse stehen Enzyme und deren Fähigkeit spezifische Reaktionen

katalysieren zu können.[16,17] Es handelt sich somit um ein naturwissenschaftliches Feld,

das die Fachbereiche Biotechnologie und Chemie verbindet. Der größte Vorteil von

enzymvermittelten Reaktionen gegenüber chemischen Reaktionen ist die meist hohe

natürliche Selektivität von Enzymen. So können chemo-, regio- und stereoselektive

Biotransformationen gewährleistet werden.[18–21] Des Weiteren bietet eine

biokatalytische Applikation die Möglichkeit zu nachhaltigeren und

umweltfreundlicheren Prozessen.[7,22,23] Weitere Vorteile sind die Evolvierbarkeit und

Kombinierbarkeit von Enzymen.[18,24] Dennoch gibt es auch einige Nachteile von

Biokatalysatoren gegenüber chemischen Katalysatoren. Die Verfügbarkeit von Enzymen

ist beschränkt und häufig weisen sie ein vergleichsweise schmales Substratspektrum

auf.[17] Auch die Stabilität und Aktivität von Enzymen unter nicht natürlichen

Gegebenheiten ist oft ein limitierender Faktor.[25] Einige Enzyme sind außerdem

abhängig von teuren Kofaktoren, sodass diese in einem Prozess bereitgestellt werden

müssen.[17] Durch den Einsatz von Ganzzellsystemen oder enzymatischen Kofaktor-

Regenerationssystemen kann die Bereitstellung von Kofaktoren zwar deutlich reduziert

werden,[26–29] jedoch ist dies nicht immer erfolgreich.

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Einleitung

2

Weltweit arbeiten Forschergruppen an der Verbesserung von biokatalytischen

Systemen um die Anwendbarkeit von Enzymen zu verbessern. Durch ein sogenanntes

„enzyme engineering“ können einige der erwähnten Schwachstellen adressiert werden.

Die zur Verfügung stehenden Technologien für die Entwicklung von Enzymen haben

sich in den letzten Jahren maßgeblich verbessert, was zuletzt sogar zur Verleihung des

Chemienobelpreis an Prof. Frances H. Arnold geführt hat.[30] Das Prinzip beim enzyme

engineering ist die zyklische Anwendung von Mutagenese, Genexpression und Selektion,

um die Eigenschaften von Enzymen gezielt zu verändern.[31–34] Zahlreiche Studien

zeigen, dass beispielsweise Stabilität und Aktivität deutlich verbessert werden

können.[35,36] Auch das Substratspektrum und die Selektivität von Enzymen kann über

ein enzyme engineering verändert und erweitert werden.[37–41] Zusätzlich sorgt die

Identifizierung neuer natürlich vorkommender Enzyme für eine stetig steigende

Verfügbarkeit von Biokatalysatoren. Auch die Entwicklung nicht natürlicher

Enzymaktivitäten,[42–44] sowie die Entwicklung von artifiziellen Enzymen (denovo

design)[45] tragen dazu bei, dass immer mehr neue und verbesserte Enzymsysteme für

industrielle Applikationen zur Verfügung stehen.[13]

1.2. N-Heterozyklen

N-Heterozyklen sind zyklische organische Verbindungen, deren Ringsysteme neben

Kohlenstoffen aus mindestens einem Stickstoffatom bestehen. Solche Verbindungen sind

in der Natur weit verbreitet und für Organismen jeglicher Art lebensnotwendig.[46] Das

Vorkommen von N-Heterozyklen in Lebewesen ist breit gefächert. Essentielle

Komponenten sind z.B. die Pyrimidin- und Purinbasen der DNA, die Aminosäuren Prolin,

Histidin und Tryptophan, sowie verschiedene Porphyrine und andere Kofaktoren.

Daneben gibt es eine Vielzahl an komplexen Sekundärmetaboliten, bei denen

N-Heterozyklen als Grundbausteine auftreten.[47] Solche Verbindungen machen einen

Großteil der sogenannten Alkaloide aus und haben typischerweise sehr spezifische

biologische Wirkungen.[48,49] Besonders bekannt sind beispielsweise einige Opioide,

welche durch ihre spezifische Bindung an verschiedenen Rezeptoren des

Nervensystems eine schmerzlindernde Wirkung erzeugen.[50] Über 20.000 Alkaloide

sind bereits beschrieben worden.[51] Die meisten dieser Verbindungen enthalten die im

Folgenden abgebildeten N-Heterozyklen (Abb.1).[49,52]

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Einleitung

3

Abbildung 1: Häufig auftretende N-Heterozyklen in Alkaloiden. Die wichtigsten Alkaloid-Gruppen wurden anhand der strukturellen Verwandtschaft (ohne Berücksichtigung des Biosynthesewegs) zugeordnet. Weitere wichtige Alkaloid-Gruppen sind die Phenylethylamino-Alkaloide, welche in der Regel keinen N-Heterozyklus enthalten, sowie die Terpenoid- und Stereoid-Alkaloide, welche nicht zu einem bestimmten N-Heterozyklus zugeordnet werden können.

1.2.1. N-Heterozyklen als Pharmabausteine

Auch in der Entwicklung von pharmazeutischen Wirkstoffen macht man sich die

biologische Wirksamkeit von N-Heterozyklen zu Nutze. So enthalten drei Viertel der 120

umsatzstärksten niedermolekularen Pharmazeutika aus 2018 einen N-Heterozyklus.[53]

Ein wichtiger Ausgangspunkt für nachfolgende Syntheseschritte in der Herstellung von

pharmazeutischen Wirkstoffen ist deshalb die Bildung eines N-Heterozyklus. Hierfür

existieren teilweise gut etablierte chemische Verfahren. Häufig werden vor allem fünf-

und sechsgliedrige Heterozyklen mit unterschiedlichen Sättigungsgraden benötigt

(Abb.2).[54] Die chemische Herstellung aromatischer N-Heterozyklen kann z.B. über eine

Paal-Knorr- Synthese[55] oder eine Michael-Addition[56] erfolgen. Für nicht aromatische

N-Heterozyklen existieren andere chemische Verfahren, die häufig miteinander

kombiniert werden müssen. Der mehrstufige Prozess beinhaltet dabei zum Beispiel

Metall katalysierte Zyklisierungen, C-H-Aminierungen, Hydroaminierungen, Ring-

Transformationen, oder Imin- bzw. Enamin- Reduktionen.[57–59]

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Einleitung

4

Abbildung 2: Die fünf häufigsten N-Heterozyklen bezogen auf 640 N-heterozyklische Pharmazeutika (modifiziert nach E. Vitaku et al.).[54] Neben Pyridinen (blau, aromatisch) zählen vier nicht aromatische N-Heterozyklen (Piperidine, Piperazine, Cepheme, Pyrrolidine, rot) zu den fünf häufigsten Vertretern. Der angegebene prozentuale Anteil bezieht sich auf die 640 analysierten N-heterozyklischen Pharmazeutika (zugelassen in den USA).

Eine zusätzliche Herausforderung sind C-substituierte gesättigte Heterozyklen, da bei

diesen Verbindungen Stereozentren existieren. Somit müssen stereoselektive Verfahren

eingesetzt werden um ein pharmazeutisches Endprodukt mit möglichst hoher

Enantiomerenreinheit zu erhalten.[60] Dies ist jedoch in einem rein chemischen Prozess

meist aufwendig und nur mit Hilfe von aufwendigen Verfahren oder teuren

Katalysatoren realisierbar.[57,58,61,62] Die Identifizierung und Entwicklung von Enzymen

zur biokatalytischen Herstellung von chiralen N-Heterozyklen ist daher eine

vielversprechende Alternative.

1.2.2. Piperazine

Piperazine sind privilegierte Bausteine der Pharmaindustrie, welche in über 6% aller

oral verabreichten Medikamente enthalten sind.[63,64] Damit gilt Piperazin als der dritt

häufigste Heterozyklus in allen Pharmazeutika.[54,65] Umso erstaunlicher ist es, dass

Piperazine in der Natur quasi nicht vorkommen. Nur eine Hand voll Piperazin-haltiger

Naturstoffe konnten bislang gefunden werden.[66–71] Die Biosynthese dieser Stoffe lässt

sich nach derzeitigem Wissensstand auf die Dimerisierung von Aminoaldehyden bzw.

Aminosäuren zurückführen.[66,68,70] Hierfür spricht vor allem eine symmetrische

Anordnung der Substituenten an Position 2 und 5 des Piperazinrings, sowie die

Aufklärung des Biosynthesewegs von Herquilin A in Penicillium herquei.[66] Im Gegensatz

zur natürlichen Bildung von Piperazin gibt es zahlreiche chemische Verfahren zur

Bildung von Piperazinen, welche sich aufgrund der hohen Nachfrage etabliert haben.

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Einleitung

5

Neben der Reduktion von Pyrazinen oder Diketopiperazinen werden auch Metall-

vermittelte oder Metall-katalysierte Zyklisierungsreaktionen angewendet.[64,72–79]

Bekannte Beispiele für Piperazin-haltige Pharmazeutika sind das Bruskrebs-

Medikament Palbociclib, die Leukämie-Medikamente Dasatinib und Imatinib, die

Schizophrenie-Medikamente Aripiprazol und Brexpiprazol, das Herzmedikament

Ranolazin oder das Potenzmittel Sildenafil.[53] Besonders häufig weisen Piperazin-

haltige Verbindungen psychoaktive Wirkungen auf, sodass einige Piperazinvorstufen

auch für die Herstellung von verschiedenen Drogen missbraucht werden.[80]

Meistens werden Piperazine ohne C-Substituenten als Vorstufe benötigt. Doch auch

chiral substituierte Piperazine werden immer häufiger in der Entwicklung von

Pharmazeutika eingesetzt.[81–86] Bekannte Beispiele sind die HIV-Medikamente Indinavir

und Vicriciroc, das Antidepressivum Mirtazapin, das Beruhigungsmittel Vestipiant oder

das Antibiotikum Sparfloxacin (Abb.3).[87–91] Hier werden chirale C-substituierte

Piperazine als Pharmabausteine benötigt, deren chemische Bereitstellung sehr

herausfordernd ist.[73,92]

Abbildung 3: Beispiele für bekannte Pharmazeutika, bei welchen chirale C-substituierte Piperazine (rot markiert) als Vorstufe benötigt werden.

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Einleitung

6

1.3. Enzymatische Bildung von chiralen N-Heterozyklen

Aufgrund der signifikanten Präsenz von N-Heterozyklen in Lebewesen, gibt es

zahlreiche Enzyme die bei deren Biosynthese beteiligt sind. Dabei sind für eine

biotechnologische Applikation vor allem solche Enzyme interessant, die die Bildung von

chiralen N-Heterozyklen ermöglichen. In den meisten bekannten Biosynthesewegen

werden hierfür Reduktasen eingesetzt, welche die stereoselektive Reduktion eines

prochiralen zyklischen Imins katalysieren. Ein sehr bekanntes Beispiel hierfür findet

man im Primärstoffwechsel in der Biosynthese von L-Prolin.[93–95] Wie alle

proteinogenen Aminosäuren wird auch L-Prolin mit einer exzellenten

Enantiomerenreinheit gebildet. In manchen Biosynthesewegen wird das Stereozentrum

schon durch die Vorstufe L-Ornithin oder L-Glutaminsäure vorgegeben. Besonders

interessant ist jedoch die Biosynthese mittels Pyrrolidin-2-carboxylatreduktase (P2CR).

Dieses Enzym ist in der Lage eine prochirale zyklische Imin-Zwischenstufe

stereoselektiv zu reduzieren, sodass ausschließlich L-Prolin entsteht (Abb.4, A).[96] Die

P2CR gehört zu der Familie der Ketimin-Reduktasen, welche auch für die Reduktion von

weiteren zyklischen Iminen genutzt werden können. Jedoch sind sie auf Substrate mit

einem 2‘-Carboxylsubstituent angewiesen.[97,98]

Daneben sind ein paar Enzyme des Sekundärstoffwechsels bekannt, welche ebenfalls die

Reduktion von zyklischen Iminen katalysieren. Ein Beispiel ist die

Dihydrofolatreduktase (DHFR), welche die selektive Reduktion von 7,8-Dihydrofolat zu

(S)-5,6,7,8-Tetrahydrofolat katalysiert (Abb.4, B).[99] Die Thiazolinyl Iminreduktase

(TIRED) katalysiert die Reduktion eines Thiazolinrings in der Biosynthese der

Siderophore Pyochelin und Yersiniabactin (Abb.4, C).[100,101] Auch in der Biosynthese

von Morphin wird ein zyklisches Imin reduziert. Hier katalysiert die

Dihydroreticulinreduktase (DRR) die Reduktion eines Dihydroquinolinrings

(Abb.4, D).[102,103] Ein weiteres Enzym, das an dieser Stelle zu erwähnen ist, ist die F420-

abhängige Reduktase (TomJ) im Biosyntheseweg von Tomaymycin, welche eine

Pyrrolin-ähnliche Struktur reduziert (Abb.4, E).[104] Jedoch wird bei diesem Schritt kein

Stereozentrum erzeugt.

Im Gegensatz zu diesen sehr spezifischen Enzymen (A-E) weisen Iminreduktasen

(IREDs) ein deutlich breiteres Substratspektrum auf, sodass eine Vielzahl zyklischer

Iminsubstrate selektiv reduziert werden können (Abb.4, F).[105] Die natürliche Funktion

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Einleitung

7

dieser Enzymfamilie ist bislang nicht bekannt. Aufgrund des breiten Substratspektrums

ist die Beteiligung in einem einzigen spezifischen Biosyntheseweg eher

unwahrscheinlich.

Abbildung 4: Die Abbildung zeigt verschiedene bekannte Enzyme, welche die stereoselektive Reduktion von zyklischen Iminen katalysieren können und damit zur Bildung von chiralen N-Heterozyklen beitragen.

1.4. Iminreduktasen

Lange Zeit gab es kaum biokatalytische Möglichkeiten um chirale gesättigte

N-Heterozyklen herzustellen, da entsprechende Enzyme noch nicht beschrieben

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Einleitung

8

wurden. Erst 2010 wurde die Enzymfamilie der Iminreduktasen (IREDs) entdeckt,

sodass neue enzymatische Ansätze möglich waren.[106] 2011 wurden die ersten IREDs

aus Streptomyces-Stämmen erfolgreich isoliert und charakterisiert.[107] Seit 2013 kennt

man außerdem die ersten Röntgenstrukturen von IREDs (Abb. 5).[108] IREDs sind

homodimere Proteine mit je einem N-terminalen NADPH-Bindemotiv

(Rossmannfaltung). Eine Besonderheit ist, dass die beiden Monomere sehr stark

ineinander verschränkt sind. Nach der N-terminalen Domäne durchdringt eine lange

α-Helix die C-terminale Domäne des jeweils anderen Monomers. Anschließend folgt der

C-terminale Teil, welcher wiederum von der langen α-Helix des anderen Monomers

durchdrungen wird. Es handelt sich also nicht um zwei Monomere, die über eine

Oberflächeninteraktion miteinander verbunden sind. Stattdessen sind die Monomere so

sehr ineinander verflochten, dass eine Dissoziation unter Beibehaltung der

Proteinfaltung kaum möglich scheint.

Abbildung 5: Darstellung der Röntgenstruktur der R-selektiven IRED aus Streptomyces kanamyceticus, welche 2013 gelöst wurde (pdb-ID = 3zhb).[108] Gezeigt ist sowohl die Sekundärstrukturdarstellung (A) als auch die Oberflächendarstellung (B). Die beiden (Homo-)Monomere sind in Grau und Beige dargestellt. Die beiden gebundenen NADP+-Moleküle sind ebenfalls gezeigt. Die Darstellung erfolgte mit Pymol.

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Einleitung

9

Das aktive Zentrum wird jeweils aus der N-terminalen Domäne des einen Monomers

und der C-terminalen Domäne des anderen Monomers gebildet. Erste Hinweise weisen

darauf hin, dass es einen „offenen“ und „geschlossenen“ Zustand des aktiven Zentrums

gibt, bei welchen sich die beiden Domänen in einem unterschiedlichen Abstand

zueinander befinden.[109] Dies hängt auch davon ab, ob NADPH gebunden ist oder nicht.

Die Kristallstrukturen von unterschiedlichen Enzymkonformationen bestätigen, dass

das aktive Zentrum einer starken Dynamik unterliegt.[109]

Die Funktionen der konservierten Aminosäurereste im aktiven Zentrum sind bislang

weitestgehend ungeklärt. Die Position 171 (Nummerierung bezogen auf die R-selektive

IRED aus Myxococcus stipitatus, R-IRED_Ms) wurde bereits mehrfach als katalytisch

aktive Aminosäure beschrieben. Sie befindet sich auf der gleichen Domäne wie die

NADPH Bindetasche. Hier ist in den meisten R-selektiven IREDs eine Asparaginsäure

(D-Typ) und in den meisten S-selektiven IREDs ein Tyrosin (Y-Typ) konserviert.[110]

Aufgrund der Ausrichtung und der Konservierung dieser Position, vermutet man eine

Beteiligung an der Protonierung des Substrates.[108,111] Allerdings könnte die

Protonierung auch über ein aktiviertes Wassermolekül ablaufen.[105,111] Bei

Negativkontrollen mit einer Mutation an dieser Stelle wurden unterschiedliche

Beobachtungen gemacht. Häufig zeigte sich eine drastisch reduzierte Aktivität.[112]

Teilweise wurden jedoch auch erhebliche Restaktivitäten detektiert.[113] Es könnte sein,

dass die katalytische Beteiligung von Position 171 nur auf einen Teil der IREDs zutrifft.

Hierfür spricht auch die Tatsache, dass manche IREDs an dieser Stelle Aminosäuren

aufweisen, welche keine Protonierung übernehmen können (z.B. Phenylalanin, Alanin

oder Asparagin).[114]

1.4.1. Reaktionsmechanismus

Verschiedene Studien weisen darauf hin, dass der Katalysemechanismus von

Iminreduktasen (Abb. 6) ähnlich wie bei den Ketoreduktasen, bzw. wie bei der

Reduktionsreaktion von Alkoholdehydrogenasen abläuft.[109,115–117]

Der entscheidende Schritt im Reaktionsmechanismus von IREDs ist der nukleophile

Angriff des Hydrids von NADPH auf den positiv teilgeladenen und damit elektrophilen

Kohlenstoff der Iminbindung. Bei diesem Schritt wird außerdem die Stereoselektivität

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Einleitung

10

determiniert. Abhängig davon, ob der Angriff des Hydrids von der Re- oder Si-Seite

erfolgt, entsteht das S- oder R-Enantiomer.[118] Mit diesem Schritt verbunden ist eine

Elektronenumlagerung im Nikotinamid-Teil, sodass NADP+ entsteht. Das

π-Elektronenpaar der Imin-Doppelbindung klappt zum Stickstoff. Dieser wird

protoniert, sodass aus dem Iminsubstrat schließlich ein Aminprodukt gebildet wird.

Falls die Protonierung durch einen Aminosäurerest erfolgt, muss dieser anschließend

wieder regeneriert werden. Bevor ein weiterer Katalysezyklus durchlaufen werden

kann, muss der verbrauchte Kofaktor (NADP+) diffusiv durch NADPH ersetzt werden.

Außerdem muss das Produkt aus dem aktiven Zentrum entlassen werden, um die

Aufnahme eines neuen Substrates zu ermöglichen.

Abbildung 6: Vorgeschlagener Katalysezyklus für Iminreduktasen am Beispiel der Reduktion von 2-Methylpyrrolin zu (R)- oder (S)-2-Methylprrolidin. 1) Hydridtransfer und Protonierung; 2) Gegebenenfalls Regenerierung der katalytischen Aminosäure durch Protonierung.

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Einleitung

11

1.4.2. IRED katalysierte Reaktionen

Die Reduktion von Iminen ist der namensgebende Reaktionstyp welcher durch IREDs

katalysiert wird (Abb. 7). Die Herausforderung bei Iminen ist, dass sie Hydrolyse-labil

sind und in eine Carbonyl- und Aminkomponente zerfallen können.[119] Im wässrigen

Milieu stellt sich ein pH-abhängiges Gleichgewicht zwischen dem Imin und dem

Hydrolyseprodukt ein, wobei die Hydrolyse bei hohen pH-Werten vermindert

stattfindet.[120] Azyklische Imine sind im Vergleich zu zyklischen Iminen meist deutlich

instabiler. Durch Substituenten mit einem +I- oder +M-Effekt kann die Imingruppe

stabilisiert werden.[119,121]

Die IRED katalysierte Reduktion des Imins zum Amin hat ebenfalls einen Einfluss auf

das Hydrolysegleichgewicht. Das Imin wird dem Gleichgewicht entzogen, sodass sich

dieses zu Gunsten der IRED verschiebt.

Abbildung 7: IRED katalysierte Reduktion von zyklischen bzw. azyklischen Iminen, sowie das Hydrolysegleichgewicht des Iminsubstrats. Als Beispiele wurden die Substrate 2-Methylpyrrolin (zyklisches Imin) und N-Benzylidenmethylamin (azyklisches Imin) dargestellt.

Um die Stabilität des Iminsubstrats zu gewährleisten wurden zunächst nur zyklische

Imine oder durch Phenylgruppen stabilisierte azyklische Imine eingesetzt.[107,113,122–124]

So wurden mit IREDs anfangs hauptsächlich Pyrrolidine, Piperidine,

Tetrahydroisoquinoline, Indoline oder Hexahydro-β-carboline gebildet.[112,125–127] Dabei

wurden neben zyklischen Iminen auch zyklische Iminium-Ionen eingesetzt. Später

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Einleitung

12

stellte man fest, dass auch instabile Imine von IREDs umgesetzt werden können. Hierfür

setzt man jedoch nicht das Imin sondern das Carbonyl- und Aminsubstrat ein.[98,128]

Beide Substrate stehen in einem Gleichgewicht mit dem Imin, welches durch die IRED

reduziert werden kann (Abb. 8). Diese Art der Anwendung wird als reduktive

Aminierung bezeichnet und bietet extrem viele Möglichkeiten im Vergleich zur

normalen Imin Reduktion.[98,109,128–131] Im Gegensatz zu Iminsubstraten stehen

vielzählige stabile und kostengünstige Substrate zur Verfügung, welche miteinander

kombiniert werden können.[132,133]

Abbildung 8: Reaktionsschema der IRED katalysierten Iminreduktion (blau) ausgehend vom Iminsubstrat, sowie die reduktive Aminierung (orange) ausgehend vom Carbonyl- und Aminsubstrat.

Eine interessante Thematik bezüglich der reduktiven Aminierung ist auch die

Fragestellung, ob IREDs einen Einfluss auf die Kondensationsreaktion haben. Erste

Hinweise deuten darauf hin, dass zumindest manche IREDs die Fähigkeit besitzen, die

Kondensation katalytisch zu beschleunigen. Anhand von Kristallstrukturen von Enzym-

Substrat-Komplexen wurde eine Tyrosinrest-vermittelte Aktivierung der

Carbonylgruppe bei einer IRED aus Aspergillus terreus postuliert.[109] Es wird deshalb

angenommen, dass auch die Kondensationsreaktion enzymatisch beschleunigt wird,

sodass beide Reaktionsschritte der reduktiven Aminierung unter dem Einfluss der

Iminreduktase stehen. In diesem Zusammenhang wird deshalb auch die Bezeichnung

„reduktive Aminase“ anstelle von Iminreduktase verwendet.[109,132]

Auch die Rückreaktion, also die Oxidation eines Amins zu einem Imin, kann durch IREDs

katalysiert werden, wobei hierfür höhere pH-Werte (<10,0) benötigt werden.[134] In

diesem Fall ist es außerdem förderlich ein Amin auszuwählen, dessen Imin-Analogon

sehr instabil ist, und somit sofort hydrolysiert. So wird das Gleichgewicht zu Gunsten

der Oxidation verschoben.[134]

Neben den Imin reduzierenden Aktivitäten konnte auch eine promiskuitive Aktivität von

IREDs gegenüber der Reduktion einer aktivierten Carbonylverbindung beobachtet

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Einleitung

13

werden. Jedoch konnte dies bislang nur für ein Substrat (2,2,2-Trifluoroacetophenon)

gezeigt werden, welches stereoselektiv zum entsprechenden Akloholprodukt umgesetzt

wurde.[135]

1.4.3. Promiskuitive, iminreduzierende Enzymaktivitäten

Abseits der IREDs wurden mittlerweile in weiteren Enzymfamilien Imin-reduzierende

Aktivitäten detektiert. Hierbei handelt es sich jedoch nicht um die natürliche Funktion,

sondern um eine promiskuitive Aktivität, welche in der Regel auch nicht sehr stark

ausgeprägt ist. Eine nah verwandte Enzymfamilie der IREDs sind die

β-Hydroxysäuredehydrogenasen.[114] Sie katalysieren normalerweise die Oxidation von

Hydroxygruppen oder die Reduktion von Carbonylgruppen. Jedoch weisen sie zusätzlich

eine, wenn auch schwache, promiskuitive Aktivität für die Reduktion von zyklischen

Iminen auf. Dies konnte am Beispiel von 2-Methylpyrrolin gezeigt werden.[115] Durch

einen gezielten Austausch einer Aminosäure im aktiven Zentrum von β-HADs konnte

diese Anfangsaktivität außerdem um das 12-fache gesteigert werden.[115]

Des Weiteren zeigt die Glutamatdehydrogenase eine reduzierende Aktivität gegenüber

Pyrrolin-2-carboxylat und Piperidin-2-carboxylat. Dabei wird ähnlich wie bei der P2CR

die stereoselektive Bildung von L-Prolin bzw. L-Pipecolinsäure beobachtet.[136] Eine

weitere promiskuitive Aktivität wurde bei der Glukosedehydrogenase gegenüber

Dihydroisoquinolin-Derivaten festgestellt.[137] Die Glukosedehydrogenase gehört zu der

großen Enzymfamilie der kurzkettigen Dehydrogenasen/Reduktasen (SDRs) mit über

168 000 bekannten Proteinen.[138] Es ist also wahrscheinlich, dass noch weitere Enzyme

dieser Familie existieren, die eine ähnliche promiskuitive Aktivität aufweisen.

Neben promiskuitiven Aktivitäten konnten auch schon artifizielle Enzymaktivitäten für

die Reduktion von zyklischen Iminen erzeugt werden. Dies gelang mit Hilfe von

artifiziellen Metalloenzymen.[139–141] Hierbei konnten jedoch nur moderate

Stereoselektivitäten erreicht werden.[141]

Auch für die reduktive Aminierung wurden bereits weitere Enzymfamilien gefunden,

welche diese Reaktion promiskuitiv katalysieren können. Hierzu gehört die

Opinsäuredehydrogenase, sowie die Ketiminreduktasen und die Amin

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Einleitung

14

Dehydrogenasen.[142–146] Die Möglichkeiten sind im Vergleich zu IREDs jedoch deutlich

beschränkter, vor allem in der Wahl des Aminsubstrates.

1.4.4. Enzymkaskaden mit Iminreduktasen

Eine wichtige Voraussetzung für eine wirtschaftliche Anwendung von

Biotransformationen ist die Zugänglichkeit der Ausgangsverbindungen. In diesem

Zusammenhang sind Multienzymsysteme sehr förderlich.[147] So können komplexe

Strukturen schrittweise ausgehend von einfachen Verbindungen aufgebaut werden. Die

Aneinanderreihung von mehreren biokatalytischen Schritten wird dabei als

Enzymkaskade bezeichnet. Auch für die Generierung von gesättigten N-Heterozyklen

wurden bereits einige Enzymkaskaden mit IREDs entwickelt (Abb. 9).[148–151] Die

Anwendung von zusätzlichen Enzymen ermöglicht die Verwendung von sehr einfachen

linearen Ausgangsverbindungen.

Abbildung 9: Verschiedene Enzymkaskaden zur Bildung von gesättigten N-Heterozyklen ausgehend von einfachen linearen Verbindungen. Als Ausgangsverbindung können Diamine (A,B), Dicarbonyle (C) oder Ketosäuren (D) verwendet werden.

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Einleitung

15

Ausgehend von Diaminen (A, B), Dicarbonylen (C) oder Ketosäuren (D) können

Aminoaldehyde in ein oder zwei Schritten enzymatisch gebildet werden. Die

Aminoaldehyde reagieren spontan unter Abspaltung von Wasser zu zyklischen Iminen,

welche schließlich durch eine IRED reduziert werden können, sodass gesättigte

N-Heterozyklen entstehen. Die abgebildeten Enzymkaskaden A, C und D konnten

außerdem auch im Ganzzell-System (E. coli) durchgeführt werden.

Die angewendete Route über eine Aminoaldehyd Zwischenstufe erinnert stark an die

natürlichen Biosynthesewege von gesättigten N-Heterozyklen. Auch hier verläuft die

Synthese in der Regel über ein Aminoaldehyd.[93,94,152–156]

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Motivation

16

2. Motivation

Die Untersuchung und Entwicklung von Iminreduktasen (IREDs) führte in den letzten

neun Jahren zu beeindruckenden Ergebnissen. Vor allem durch die reduktive

Aminierung konnte die Anwendbarkeit von IREDs erheblich gesteigert werden, sodass

nun die Bildung von vielzähligen chiralen primären, sekundären und tertiären Aminen

möglich ist. Der Zugang zu N-Heterozyklen ist jedoch immer noch sehr beschränkt. Zwar

können einige zyklische Imine stereoselektiv reduziert werden, jedoch sind für viele

wichtige N-Heterozyklen entsprechende Iminvorstufen nicht verfügbar. Piperazin ist

beispielsweise der zweithäufigste gesättigte N-Heterozyklus in Pharmazeutika. Dennoch

gibt es (abseits dieser Arbeit) bislang keine biokatalytischen Methoden um Piperazine

mit unterschiedlichem Substituierungsmuster aufzubauen.

Ziel dieser Arbeit war es, den enzymatischen Zugang zu neuen N-Heterozyklen zu

schaffen. Hierfür sollten insbesondere IREDs sowie IRED-basierte Enzymkaskaden

eingesetzt werden.

Für die Anwendung von Enzymkaskaden sollten unter anderem unterschiedliche

Kofaktorregenerationssysteme in Betracht gezogen werden. Hierbei ist jedoch die

strikte NADPH Abhängigkeit von IREDs eine große Einschränkung. Um dies zu umgehen

sollte eine NADH abhängige IRED mittels ortsgerichteter Mutagenese entwickelt

werden, sodass neue Möglichkeiten eröffnet werden.

Neben Enzymkaskaden sollten auch neue Substrate und Reaktionen mit IREDs getestet

werden. Ein besonderes Augenmerk sollte dabei dem Aufbau von Piperazingerüsten

gelten, da dies sehr gefragte Pharmabausteine sind. Des Weiteren sollten analog zu

Aminen auch Hydrazine als neuartige IRED-Substrate getestet werden. Auch sollte

geprüft werden, ob sich diese für die IRED katalysierte Bildung von N-Heterozyklen

eignen.

Zuletzt sollten außerdem Aminosäurepositionen in der aktiven Tasche identifiziert

werden, welche zur Stereoselektivität von IREDs beitragen. Die identifizierten

Positionen sollten schließlich für ein beispielhaftes enzyme engineering herangezogen

werden, um die Stereoselektivität einer ausgewählten Iminreduktase vollständig

umzukehren. So sollte auch das Verständnis über die Funktion verschiedener

selektivitätsbestimmender Aminosäuren im aktiven Zentrum verbessert werden.

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Material und Methoden

17

3. Material und Methoden

3.1. Materialien

3.1.1. Chemikalien

Alle in dieser Arbeit verwendeten Chemikalien wurden, sofern nicht anders angegeben,

von den Firmen Sigma Aldrich und Fluka (Steinheim, DE), abcr GmbH (Karlsruhe, DE),

VWR (Darmstadt, DE), Thermo Fisher (Braunschweig, DE), Alfa Aesar (Karlsruhe, DE),

Fluorochem (Hadfield, UK) und Prozomix (Haltwhistle, UK) bezogen.

3.1.2. Vewendete Enzyme

Neben den selbst hergestellten Enzymen kamen auch einige kommerziell erhältliche

Enzyme zum Einsatz (Tab. 1).

Tabelle 1: Verwendete Enzyme und deren Verwendung.

Enzym Herkunft Verwendung

PfuUltraII Fusion HS DNA-Polymerase

Agilent (Santa Clara, US) PCR, QuikChange-PCR

Phusion High-Fidelity DNA-Polymerase

NEB (Frankfurt, DE) Gibson assembly

T5-Exonuclease NEB (Frankfurt, DE) Gibson assembly

Taq DNA-Ligase NEB (Frankfurt, DE) Gibson assembly

Dpn1 NEB (Frankfurt, DE) Verdau von DNA-Templat

DNAseI (Rind) Sigma Aldrich (Steinheim, DE)

Enzymatischer Zellaufschluss

Lysozym aus Hühnereiweiß AppliChem GmbH (Darmstadt, DE)

Enzymatischer Zellaufschluss

Peroxidase (Meerrettich) AppliChem GmbH (Darmstadt, DE)

Aktivitäts-Assay für Oxidasen

Glukose-6-P-Dehydrogenase aus Leuconostoc mesenteroides

Alfa Aesar (Karlsruhe, DE) Regeneration von NADPH und NADH

Formiat-Dehydrogenase aus Candida boidinii

Sigma Aldrich (Steinheim, DE)

Regeneration von NADH

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Material und Methoden

18

3.1.3. Verwendete Kits

Für verschiedene molekular- und mikrobiologische Techniken wurden

Anwendungsspezifische Kits verwendet, welche im Folgenden aufgeführt sind (Tab. 2).

Tabelle 2: Verwendete Kits und deren Verwendung.

Kit Herkunft Verwendung

ZyppyTM Plasmid Miniprep Kit

Zymo Research (Irvine, US)

Isolierung von Plasmid-DNA aus E. coli

DNA Clean and ConcentratorTM

Zymo Research (Irvine, US)

DNA-Reinigung

ZymocleanTM Gel DNA Recovery Kit

Zymo Research (Irvine, US)

Extraktion von DNA aus einem Agarosegel

PierceTM BCATM Protein Assay Kit

Thermo Fisher (Braunschweig, DE)

Bestimmung der Gesamt-Proteinkonzentration

3.1.4. Verwendete Plasmide

Für die heterologe Expression und Herstellung von Iminreduktasen (IREDs) und

Putrescinoxidasen (PuOs) wurden drei verschiedene Expressionssysteme verwendet,

sodass auch drei verschiedene Plasmide eingesetzt wurden (Tab 3).

Tabelle 3: Verwendete Plasmide.

Plasmid Empfänger-stamm

Resistenz-marker Operon

Verwendeter Induktor

An-wendung

pET28a(+) E. coli DH5α / E. coli BL21(DE3)

Kanamycin-Resistenz

Lactose-Operon

IPTG IREDs

pBAD18[157] E. coli JW5510 Ampicillin-Resistenz

Arabinose-Operon

L(+)-Arabinose

PuOs

pBAD33[157] E. coli JW5510 Chlor-amphenicol-Resistenz

Arabinose-Operon

L(+)-Arabinose

IREDs

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Material und Methoden

19

3.1.5. Verwendete Mutagenese-Primer

Für das Einfügen von zielgerichteten Mutationen wurden verschiedene Techniken

angewendet, wobei spezifische Oligonukleotide (Primer) eingesetzt wurden (Tab 4,5).

Alle Primer wurden von Metabion International AG (Planegg, DE) bezogen.

Tabelle 4: Verwendete Primer zur Generierung von R-IRED_Ms Enzymvarianten mit geänderter Kofaktorspezifität.

Ziel- Mutation

Verwen-detes Templat

Muta-genese Strategiea

Ange-wendete Technikb

Sequenz (5‘->3‘) V = vorwärts, R = rückwärts

R33X, T34X, K37X

WT 3 B V: GTGGAACHVCRMKAAAGCCDAKAGCGAACCGCTGGCAAAACTG R: GTTCGCTMTHGGCTTTMKYGBDGTTCCACACCGTGGTCGTGTAG

N32X V1 2 A V: CACGACCACGGTGTGGNNKTACGAGAAAGCC R: GGCTTTCTCGTAMNNCCACACCGTGGTCGTG

K37X V1 2 A V: GAACTACGAGAAAGCCNNKAGCGAACCGCTGGC R: GCCAGCGGTTCGCTMNNGGCTTTCTCGTAGTTC

L67X V5 2 A V: CGTGGTTAATGTGNNKGATTATGACACCTCTGATC R: GATCAGAGGTGTCATAATCMNNCACATTAACCACG

T71X V5 2 A V: GTGCTGGATTATGACNNKTCTGATCAGCTGCTGC R: GCAGCAGCTGATCAGAMNNGTCATAATCCAGCAC

L75X V8 2 A V: GACACCTCTGATCAGNNKCTGCGCCAAGACGAAG R: CTTCGTCTTGGCGCAGMNNCTGATCAGAGGTGTC

N32E V3 1 A V: CACGACCACGGTGTGGGAATACGAGAAAGCC R: GGCTTTCTCGTATTCCCACACCGTGGTCGTG

R33Y WT 1 A V: CCACGGTGTGGAACTACACCAAAGCCAAAAGCG R: CGCTTTTGGCTTTGGTGTAGTTCCACACCGTGG

R37A V8 1 A V: GAATACGAGAAAGCCGCGAGCGAACCGCTGGC R: GCCAGCGGTTCGCTCGCGGCTTTCTCGTATTC

L67I V7 1 A V: CGTGGTTAATGTGATTGATTATGACGTGTCTGATC R: GATCAGACACGTCATAATCAATCACATTAACCACG

T71V WT 1 A V: GTGCTGGATTATGACGTGTCTGATCAGCTGCTGC R: GCAGCAGCTGATCAGACACGTCATAATCCAGCAC

T71V V6 1 A V: CGTGGTTAATGTGATTGATTATGACGTGTCTGATC R: GATCAGACACGTCATAATCAATCACATTAACCACG

a Folgende Mutagenesestrategien kamen zum Einsatz: 1) Punktmutation(en); 2) Sättigungsmutagenese an einer Position; 3) Kombinatorische Teilsättigungsmutagenese

an drei Positionen gleichzeitig. b Folgende Techniken zum Einführen von Mutationen wurden angewendet:

A) QuikChange™-PCR; B) Gibson assembly.

Tabelle 5: Verwendete Primer zur Generierung von R-IRED_Ms Enzymvarianten mit geänderter Stereoselektivität. Die Mutationsstelle im Primer ist grau markiert.

Ziel- Mutation

Verwen-detes Templat

Muta-genese Strategiea

Ange-wendete Technikb

Sequenz (5‘->3‘) V = vorwärts, R = rückwärts

A122V, T123P, P124A

V8 1 A V: CGGTGCGATCATG GTT CCG GCG GATTTTATTGGCCAG R: CTGGCCAATAAAATC CGC CGG AAC CATGATCGCACCG

D171Y V8 1 A V: CATGCCTCAGCACTG TAT AGCGCCCTGCTGTTTCAG R: CTGAAACAGCAGGGCGCT ATA CAGTGCTGAGGCATG

M178F V8 1 A V: CCTGCTGTTTCAG TTC TGGGGCACCCTGTTC R: GAACAGGGTGCCCCA GAA CTGAAACAGCAGG

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Material und Methoden

20

Q234D, T235V, L236D

V8 1 A V: CTGACCGCAGACGCT GAT GTG GAT GCAAGTCTGGAAGG R: CCTTCCAGACTTGC ATC CAC ATC AGCGTCTGCGGTCAG

H242G V8 1 A V: CAAGTCTGGAAGCT GGT AACGTGGCGTTC R: GAACGCCACGTT ACC AGCTTCCAGACTTG

S95X, D171X

V8 3 B V: CAGCTGACC KHT GGTTCTCCGGCACTGGC R: CAGGGCGCT ADM CAGTGCTGAGGCATGACC V: CTCAGCACTG KHT AGCGCCCTGCTGTTTCAG R: CGGAGAACC ADM GGTCAGCTGAACCAGCAG

I120X, M121X

V8 3 A V: CTGGACGGTGCG KHT KHT GCCACCCCGGATTTTATTG R: CAATAAAATCCGGGGTGGC ADM ADM CGCACCGTCCAG

A122X, T123X

V8 3 A V: GACGGTGCGATCATG KHT KHT CCGGATTTTATTGGC R: GCCAATAAAATCCGG ADM ADM CATGATCGCACCGTC

L175X, M178X

V8 3 A V: GACAGCGCCCTG KHC TTTCAG KHT TGGGGCACCCTG R: CAGGGTGCCCCA ADM CTGAAA GDM CAGGGCGCTGTC

A241X, H242X

V8 3 A V: CTGGCAAGTCTGGAA KHT KHT AACGTGGCGTTCC R: GGAACGCCACGTT ADM ADM TTCCAGACTTGCCAG

V212X V8 2 A V: CTGACCGAACCG NNK ACCCAGGGTGCCGTTG R: CGGCACCCTGGGT MNN CGGTTCGGTCAGTTTG

A237X V8 2 A V: GACGCTCAGACGCTG NNK AGTCTGGAAGCTCATAAC R: GAGCTTCCAGACT MNN CAGCGTCTGAGCGTCTG

M13X V8 2 A V: GTTATTGGCGCTGGCCGT NNK GGCTCCGCACTG R: CAGTGCGGAGCC MNN ACGGCCAGCGCCAATAAC

P124X V8 2 A V: CGATCATGGCCACC NNK GATTTTATTGGCCAGGC R: GCCTGGCCAATAAAATC MNN GGTGGCCATGATCG

A245X V8 2 A V: GGAAGCTCATAACGTG NNK TTCCAACACCTGCTG R: CAGCAGGTGTTGGAA MNN CACGTTATGAGCTTCC

L170X, D171Y, S172Q

V8 1+2 A V: CATGCCTCAGCACTG NNK TAC CAG GCCCTGCTGTTTCAG R: CTGAAACAGCAGGGC CTG GTA MNN CAGTGCTGAGGCATG

A245X 15B7 2 A V: GGAAGTTTATAACGTG NNK TTCCAACACCTGCTG R: CAGCAGGTGTTGGAA MNN CACGTTCAAATATTCC

A241X, H242X

110D2 3 A V: CTGGCAAGTCTGGAA KHT KHT AACGTGTTGTTCC GGAACAACACGTT ADM ADM TTCCAGACTTGCCAG

A241X 15B7 2 C

V: GCTCAGACGCTGGCAAGTCTGGAA NDT TATAACGTGGCGTTCCAACACCTGC V: GCTCAGACGCTGGCAAGTCTGGAA VHG TATAACGTGGCGTTCCAACACCTGC V: GCTCAGACGCTGGCAAGTCTGGAA TGG TATAACGTGGCGTTCCAACACCTGC R: CAGACTTGCCAGCGTCTGAGCGTCTGCGGTCAGGCGATTTTGCTG

H242X 15B7 2 C

V: GCTCAGACGCTGGCAAGTCTGGAAGTT NDT AACGTGGCGTTCCAACACCTGCTG V: GCTCAGACGCTGGCAAGTCTGGAAGTT VHG AACGTGGCGTTCCAACACCTGCTG V: GCTCAGACGCTGGCAAGTCTGGAAGTT TGG AACGTGGCGTTCCAACACCTGCTG R: CAGACTTGCCAGCGTCTGAGCGTCTGCGGTCAGGCGATTTTGCTG

A241M, H242X

V8 1+2 C

V: GCTCAGACGCTGGCAAGTCTGGAA ATG NDT AACGTGGCGTTCCAACACCTGCTG V: GCTCAGACGCTGGCAAGTCTGGAA ATG VHG AACGTGGCGTTCCAACACCTGCTG V: GCTCAGACGCTGGCAAGTCTGGAA ATG TGG AACGTGGCGTTCCAACACCTGCTG R: CAGACTTGCCAGCGTCTGAGCGTCTGCGGTCAGGCGATTTTGCTG

E240X, N243X

15B7 3 B V: GCTCAGACGCTGGCAAGTCTG KHT GTTTAT KHT GTGGCGTTCCAACACCTGCTGGCC R: CAGACTTGCCAGCGTCTGAGCGTCTGCGGTCAGGCGATTTTGCTG

V244X, F246X

110C2 3 A V: GTCTGGAAGCTCATAAC KHT TGT KHT CAACACCTGCTGGCC R: GGCCAGCAGGTGTTG ADM ACA ADM GTTATGAGCTTCCAGAC

V244X, 15B7 1+3 A V: GTCTGGAAGTTTATAAC KHT TGT KHT CAACACCTGCTGGCC R: GGCCAGCAGGTGTTG ADM ACA ADM GTTATAAACTTCCAGAC

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Material und Methoden

21

A245C, F246X

V244X, F246X

110D2 3 A V: GTCTGGAAGCTCATAAC KHT TTG KHT CAACACCTGCTGGCC R: GGCCAGCAGGTGTTG ADM CAA ADM GTTATGAGCTTCCAGAC

V244X, A245L, F246X

24E4 1+3 A V: GTCTGGAAATTTATAAC KHT TTG KHT CAACACCTGCTGGCC R: GGCCAGCAGGTGTTG ADM CAA ADM GTTATAAATTTCCAGAC

A245L D171Y 1 A V: GGAAGCTCATAACGTG TTG TTCCAACACCTGCTGG R: CCAGCAGGTGTTGGAA CAA CACGTTATGAGCTTCC

A245X 24E4 2 A V: GTCTGGAAATTTATAACGTG NNK TTCCAACACCTGCTGG R: CCAGCAGGTGTTGGAA MNN CACGTTATAAATTTCCAGAC

G96D, S79X

V8 1+2 A V: GTTCAGCTGACCAGC GAT NNK CCGGCACTGGCTC R: GAGCCAGTGCCGG MNN ATC GCTGGTCAGCTGAAC

T94X, G96D, S79X

V8 1+3 A V: CTGGTTCAGCTG KHT AGCGAT KHT CCGGCACTGGCTG R: CAGCCAGTGCCGG ADM ATCGCT ADM CAGCTGAACCAG

F246X 110D2 2 A V: GAAGCTCATAACGTG TTG NNK CAACACCTGCTGGCC R: GGCCAGCAGGTGTTG MNN CAA CACGTTATGAGCTTC

A241X 23B3 2 A V: GCTGGCAAGTCTGGAA NNK TATAACGTGTTGTTCC R: GGAACAACACGTTATA MNN TTCCAGACTTGCCAGC

H242X 23B3 2 A V: GGCAAGTCTGGAAGTT NNK AACGTGTTGTTCCAAC R: GTTGGAACAACACGTT MNN AACTTCCAGACTTGCC

N243X 23B3 2 A V: CAAGTCTGGAAGTTTAT NNK GTGTTGTTCCAACACC R: GGTGTTGGAACAACAC MNN ATAAACTTCCAGACTTG

N243X V244X

23B3 3 A V: CAAGTCTGGAAGTTTAT KHT KHT TTGTTCCAACACCTGC R: GCAGGTGTTGGAACAA ADM ADM ATAAACTTCCAGACTTG

a Folgende Mutagenesestrategien kamen zum Einsatz: 1) Punktmutation(en); 2) Sättigungsmutagenese an einer Position; 3) Kombinatorische Teilsättigungsmutagenese an zwei Positionen gleichzeitig. b Folgende Techniken zum Einführen von Mutationen wurden angewendet:

A) QuikChange™-PCR; B) Gibson assembly; C) Gibson assembly kombiniert mit „22c-trick”.[158]

3.1.6. Verwendete E. coli Stämme

Das Gen für R-IRED_Ms wurde im Rahmen eines früheren Projektes von GenSkript

(Piscataway, US) synthetisiert und in einem pET28a(+)-Vektor geliefert. Deshalb wurde

zunächst mit einem passenden Expressionsstamm (E. coli BL21(DE3)) gearbeitet,

welcher das Gen für die nötige T7-Polymerase trägt. Für die Klonierungsarbeiten mit

pET28a(+) wurde außerdem der Klonierungsstamm E. coli DH5α verwendet. Im

weiteren Verlauf wurde das Gen in einen pBAD33-Vektor überführt. In diesem Plasmid

standen auch weitere IREDs zur Verfügung, welche bereits in Vorarbeiten kloniert

wurden. Für pBAD-Plasmide wurde der Stamm E. coli JW5510 aus der Keio-

Collection[159] herangezogen, bei welchem die Gene der Abbauenzyme von

L(+)-Arabinose ausgeschaltet sind. Auch für die Arbeiten mit PuOs, welche in einem

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Material und Methoden

22

pBAD18-Vektor integriert waren, wurde E. coli JW5510 verwendet. Neben der

Expression von IREDs und PuOs wurden auch sämtliche Klonierungsarbeiten in diesem

Stamm durchgeführt. Tabelle 6 zeigt den Genotyp der verwendeten Stämme.

Tabelle 6: Genotypen der verwendeten E. coli Stämme.

Stamm Genotyp

E. coli DH5α F- fhuA2 lac(del)U169 phoA glnV44 Φ80' lacZ(del)M15 gyrA96 recA1 relA1 endA1 thi-1 hsdR17

E. coli BL21(DE3) F- ompT gal dcm lon hsdSB(rB- mB-) λ(DE3 [lacI lacUV5-T7 gene 1 ind1 sam7 nin5])

E. coli JW5510 F- Δ(araD-araB)567 ΔlacZ4787(::rrnB-3)λ-ΔygjG763::kann rph-1 Δ(rhaD-rhaB)568 hsdR514

3.1.7. Verwendete Puffer und Lösungen

3.1.7.1. Puffer zur Herstellung kompetenter E. coli-Zellen (RbCl-Methode)

Tabelle 7: Puffer zur Herstellung kompetenter E. coli-Zellen.

TFBI-Puffer TFBII-Puffer

Kaliumacetat 0,59 g MOPS 0,21 g

RbCl 2,42 g RbCl 0,12 g

CaCl2 0,29 g CaCl2 1,1 g

MgCl2·4H2O 2,0 g Glycerin 37,8 g

Glycerin 37,8 g ddH2O 200 mL

ddH2O 200 mL pH 6,5 mit NaOH

pH 5,8 mit Essigsäure

3.1.7.2. Puffer und Lösungen für die Agarose-Gelelektrophorese

Tabelle 8: Puffer und Lösungen für die Agarose-Gelelektrophorese.

DNA-Ladepuffer 50x TAE-Puffer 0,7%ige Agaroselösung

Saccharose 4 g TRIS 0,21 g Agarose 3,5 g

Orange G 20 mg Essigsäure 57,1 mL 1x TAE-Puffer Ad 500 mL

ddH2O 10 mL EDTA 18,6 g

ddH2O ad 1 L

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Material und Methoden

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3.1.7.3. Puffer und Lösungen für die Proteinreinigung

Tabelle 9: Puffer und Lösungen für die Proteinreinigung.

Bindepuffer Waschpuffer (5 mM Imidazol)

Elutionspuffer (500 mM Imidazol)

KCl 22,4 g KCl 22,4 g KCl 22,4 g

Kpi-Puffer (50 mM)

ad 1 L

Imidazol 342 mg

Imidazol 34,2 g

Kpi-Puffer

(50 mM) ad 1 L

Kpi-Puffer (50 mM)

ad 1 L

3.1.7.4. Puffer und Lösungen für die SDS-PAGE

Tabelle 10: Puffer und Lösungen für die SDS-PAGE

6x SDS-Ladepuffer Coomassie Färbelösung

Coomassie Entfärbelösung

DTT 926 mg Ethanol 300 mL Ethanol 300 mL

Glycerin 3,78 g Essigsäure 100 mL Essigsäure 100 mL

SDS 1 g Coomassie 1 g ddH2O 600 mL

Bromphenol-blau 12 mg ddH2O 600 mL

TRIS-HCl Puffer pH 8,0 (350 mM)

10 mL

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Material und Methoden

24

3.2. Molekularbiologische Methoden

3.2.1. Polymerase-Kettenreaktion (PCR)

Zur Amplifikation linearer DNA-Fragmente wurden PCR-Methoden angewendet. Hierbei

wird die DNA zunächst thermisch in die Einzelstränge aufgetrennt. Durch Absenken der

Temperatur erfolgt anschließend die Anlagerung von Oligonukleotiden (Primer) an die

Einzelstränge. Im nächsten Schritt wird die Temperatur wieder erhöht, sodass das

Temperaturoptimum der DNA-Polymerase erreicht wird. Diese bindet an das 3‘-Ende

des Primers und beginnt den fehlenden Strang in 5‘->3‘ Richtung zu vervollständigen.

Durch periodische Wiederholung dieser drei Schritte mit einem passenden

Temperaturprogram kann das DNA-Fragment exponentiell vervielfältigt werden. Im

Folgenden sind die Komponenten eines PCR-Ansatzes (Tab 11), sowie das allgemeine

Temperaturprogram gezeigt, (Tab 12).

Tabelle 11: Zusammensetzung eines PCR-Ansatzes (Endvolumen 50 µl).

Komponente Volumen / µl

10x PfuUltraII-Puffer 5

DMSO 1

dNTPs (10 mM) 1,25

DNA-Templat (50-100 ng µl-1) 0,5-1

Vorwärts-Primer (10 µM) 1

Vorwärts-Primer (10 µM) 1

PfuUltraII Fusion HS Polymerase 0,75

ddH2O 39-39,5

Tabelle 12: Temperaturprogram für eine PCR.

Schritt Temperatur Dauer Zyklen

Hot-start PfuUltraII Denaturierung Primer-Anlagerung Elongation Auffüllreaktion

95°C 95°C 55°C 72°C 72°C

2 min 30 s 45 s 20s / kb 4 min

1 30 1

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Material und Methoden

25

3.2.2. Klonierung mittels Gibson assembly

Die Durchführung des Gibson assembly erfolgte nach Gibson et al.[160] Zunächst wurden

geeignete Primer designt, welche für die PCR eingesetzt wurden. Die gewonnenen

linearen DNA-Fragmente wurden anschließend mit einem präparativen Agarosegel

getrennt, ausgeschnitten und mit dem ZymocleanTM Gel DNA Recovery Kit gereinigt.

Schließlich wurden 5 µl der DNA-Fragmente mit 15 µl eines 1,33-fach konzentrierten

Gibson-Mastermix vermischt. Die enthaltenen Komponenten sind in Tabelle 13

aufgeführt. Abhängig von Anzahl und Größe der Fragmente wurde ein bestimmtes

Mischungsverhältnis gewählt. Meistens wurden ein großes und ein kleines Fragment

vermischt. Hierbei wurde ein Verhältnis von 1 (großes Fragment) zu 3 (kleines

Fragment) bezogen auf die Stoffmengenkonzentration gewählt.

Tabelle 13: Auflistung aller im Gibson-Mix enthaltenen Komponenten, sowie die resultierenden Endkonzentrationen.

Komponente Endkonzentration

TRIS-HCl Puffer (pH 7,5) 100 mM

PEG-800 5% (w/v)

MgCl2a 10 mM

DTT 10 mM

dNTPs je 0,05 mM

NAD+ 1 mM

T5 Exonuklease 4 U mL-1

Phusion® High-Fidelity Polymerase 25 U mL-1

Taq DNA Ligase 4000 U mL-1

a hydratisiertes Salz wurden verwendet

3.2.3. Ortsgerichtete Mutagenese mittels Gibson assembly

Neben der Klonierung von DNA-Fragmenten können auch Mutationen über Gibson

assembly in ein Gen eingeführt werden. Ähnlich wie bei der QuikChange™-Methode

(Kap. 3.2.4) wird auch hier die Mutation über Primer eingefügt. Der Hauptvorteil hierbei

besteht jedoch darin, dass mehrere Mutationen an sehr unterschiedlichen Stellen

gleichzeitig eingefügt werden können. Weitere Vorteile gegenüber der QuikChange™

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Material und Methoden

26

Methode sind die exponentielle Amplifikat-Bildung und eine höhere Effizienz bei der

anschließenden Transformation von E. coli Zellen.

3.2.4. Ortsgerichtete Mutagenese mittels QuikChangeTM

Bei dem von Stratagene (La Jolla, US) entwickelten QuikChangeTM-Protokoll können eine

oder mehrere nebeneinanderliegende Mutationen mit Hilfe von mutagenen Primern in

ein Gen eingefügt werden. Im Vergleich zur ortsgerichteten Mutagenese mittels Gibson

assembly ist die QuikChange™-Methode etwas schneller, außerdem sind die benötigten

Primer kleiner und damit günstiger. Die QuikChange™-Primer sind etwa 30-35

Nukleotide lang und sind (abgesehen von der Mutationsstelle in der Mitte des Primers)

komplementär zur Templat-DNA. Bei jedem PCR-Zyklus wird das ganze Plasmid

amplifiziert. Die amplifizierten DNA-Stränge tragen die gewünschte Mutation, jedoch

können sie nicht für weitere Zyklen als Templat dienen, da der nun komplementäre

Primer in die falsche Richtung zeigt. Aus diesem Grund ist die Amplifikatbildung nicht

exponentiell sondern nur linear ansteigend, sodass nach 30 Zyklen das Verhältnis von

Amplifikat zu Templat maximal 30:1 beträgt. Aus diesem Grund ist der anschließende

Verdau der Templat-DNA mit Dpn1 sehr wichtig. Um einen maximal wirksamen Verdau

zu erreichen, wurden 2 µl Dpn1 zu 50 µl PCR-Produkt gegeben und für 1-2 h bei 37°C

inkubiert.

3.2.5. Agarose-Gelelektrophorese

45 mL Agaroselösung (0,7% w/v, 70°C) wurden mit 2,5 µl Midori Green (Nippon

Genetics Europe GmbH, Düren, DE) vermischt und zum Aushärten in eine

Agarosegelkammer gegossen. Nach Überschichtung mit TAE-Puffer und Beladung der

Geltaschen erfolgte die Elektrophorese (100 Volt, 45-60 min). Als Marker wurde der

1kbp plus DNA Marker (Fermentas, St. Leon-Rot, DE) verwendet. Die aufgetrennten

DNA-Fragmente wurden anschließend unter UV-Licht (λ = 365 nm) analysiert und

gegebenenfalls aus dem Gel ausgeschnitten.

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Material und Methoden

27

3.2.6. Herstellung chemisch kompetenter Zellen

Die Herstellung chemisch kompetenter E. coli Zellen erfolgte nach der RCl-Methode.

Hierfür wurden 100 mL vorgewärmtes LB-Medium mit 500 µl Zellsuspension

(Vorkultur) angeimpft und in einem 250 ml Erlenmeyerkolben bei 37°C und 180 rpm

inkubiert. Nach etwa 2,5-3,5 h wurden die Zellen bei einer OD600 von 0,5-0,7 geerntet

(10 min, 3220 g, 4°C). Das Zellpellet wurde anschließend mit 40 mL gekühltem TFBI-

Puffer resuspendiert und 15 min auf Eis gelagert. Anschließend wurden die Zellen

erneut zentrifugiert (10 min, 3220 g, 4°C). Das Pellet wurde nun mit 5 mL TFBII-Puffer

resuspendiert und erneut für 15 min auf Eis gelagert. Anschließend wurden die Zellen

auf vorgekühlte Plastik-Tubes verteilt (je 25 µl) und zügig bei -80°C tiefgefroren.

3.2.7. Hitzeschocktransformation von E. coli Zellen

Bei der Hitzeschocktransformation werden chemisch kompetente E. coli Zellen mit

Plasmid versetzt und durch einen Wärmeimpuls zur Aufnahme der DNA angeregt.

Hierbei kann die Effizienz durch verschiedene Parameter deutlich verbessert werden,

was jedoch nicht immer nötig ist. Bei der Transformation mit linearer DNA ist die

Ausbeute an transformierten Kolonie bildenden Einheiten (KBE) deutlich geringer als

bei der Transformation mit isolierten zyklischen Plasmiden (Re-Transformation). Des

Weiteren ist die Ausbeute bei der Transformation mit PCR- oder Gibson assembly-

Produkt stark davon abhängig wie gut die vorangegangenen Schritte funktioniert haben.

Sodass zur Sicherheit die Transformationseffizienz maximiert werden sollte. Im

Folgenden sind die Protokolle für die Re-Transformation (geringe Effizienz) und die

Transformation mit PCR- oder Gibson assembly-Produkt (hohe Effizienz) gezeigt

(Tab. 14).

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Material und Methoden

28

Tabelle 14: Verwendete Parameter bei der Hitzeschocktransformation von E. coli Zellen.

Parameter bei der Hitzeschock-transformation

Re-Transformation

Transformation mit PCR- / Gibson assembly-Produkt

Menge an chemisch kompetenten Zellen

≥ 5 µl 25 µl

Menge an eingesetztem Plasmid

10-50 ng 100-200 ng

Inkubationszeit auf Eis vor dem Hitzeschock

2-5 min 15-30 min

Länge des Hitzeschocks bei 42°C

45-60 s 60 s

Inkubationszeit auf Eis nach dem Hitzeschock

2 min 2 min

Zugabe von kaltem LB-Medium

250 µl 250 µl

Inkubation im Thermo-shaker (37°C, 600 rpm)

45-60 min 60 min

Verwendetes Volumen zum Ausplattieren

50 µl 275 µl (verteilt auf 2-3 Platten)

Inkubation der Platten bei 37°C

14-18 h 14-18 h

3.2.8. Plasmidisolierung aus E. coli

Für die Isolierung von Plasmid-DNA aus E. coli wurde das ZyppyTM Plasmid Miniprep Kit

von Zymo Research (Irvine, US) verwendet. Die einzelnen Schritte erfolgten nach der im

Kit enthaltenen Anleitung. Vor jeder Plasmidisolierung wurden 5 mL LB-Medium mit

Antibiotikum versetzt, mit einer Einzelkolonie angeimpft und über Nacht bei 37°C

inkubiert. Für die Isolierung wurden je 4 mL Zellsuspension eingesetzt. Die Elution der

DNA am Ende der Prozedur erfolgte mit 40-45 µl vorgewärmtem, doppelt deionisierten

Wasser (≈ 50°C).

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Material und Methoden

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3.2.9. DNA-Sequenzierung

Die Sequenzierung von DNA-Abschnitten wurde von Eurofins-GATC (Ebersberg, DE)

durchgeführt. Hierfür wurden 20 µl DNA-Lösung (40-60 ng µl-1) verschickt und ein

passender vorrätiger Sequenzierungsprimer ausgewählt (Tab. 15).

Tabelle 15: Verwendete Sequenzierungsprimer aus dem Sortiment von Eurofins-GATC.

Primer Anwendung Richtung Sequenz (5‘->3‘)

T7 pET28a(+) vorwärts TAATACGACTCACTATAGGG

T7-term pET28a(+) rückwärts CTAGTTATTGCTCAGCGGT

pBAD-FP pBAD33/pBAD18 vorwärts ATGCCATAGCATTTTTATCC

pTrcHis-RP pBAD33 rückwärts CTTCTGCGTTCTGATTTAATCTG

3.3. Kultivierung und Protein-Expression

3.3.1. Verwendete Kulturmedien

Alle Kulturmedien (Tab. 16) wurden nach der Präparation autoklaviert und

anschließend mit dem passenden Antibiotikum versetzt (Tab. 17).

Tabelle 16: Zusammensetzung der verwendeten Komplexmedien.

LB-Medium LB-Agar TB-Medium

Trypton 10 g Trypton 10 g Trypton 12 g

Hefeextrakt 5 g Hefeextrakt 5 g Hefeextrakt 24 g

NaCl 10 g NaCl 10 g Glycerin 5 g

dH2O ad 1 L Agar-Agar 16 g 10x TB-Salta 0,1 L

dH2O ad 1 L dH2O 0,9 L

a 0,72M K2HPO4 0,17M KH2PO4 (Zugabe nach Autoklavieren)

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Material und Methoden

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Tabelle 17: Zusammensetzung von M9-Minimalmedium

M9-Medium 10x M9-Salze Spurenelement- lösung (SE)

10x M9-Salze

1x Na2HPO4 337 mM EDTA 13,4 mM

Glukose 0,4% KH2PO4 220 mM FeCl3 3,1 mM

MgSO4 1 mM NaCl 85,5 mM ZnCl2 0,62 mM

CaCl2a 0,3 mM NH4Cl 93,5 mM CuCl2 76 µM

Biotin 1 µg mL-1 CoCl2 42 µM

Thiamin 1 µg mL-1 H3BO3 162 µM

100x SE 1x MnCl2a 8,1 µM

a hydratisierte Salze wurden verwendet

Tabelle 18: Verwendete Antibiotika.

Antibiotikum Endkonzentration Anwendung

Chloramphenicol 34 µg mL-1 IREDs in pBAD33

Ampicillin 100 µg mL-1 PuOs in pBAD18

Kanamycin 50 µg mL-1 IREDs in pET28a(+)

3.3.2. Expression von IREDs im Schüttelkolben

Zur Expression von IREDs wurden 400 mL steriles TB-Medium mit Chloramphenicol

versetzt (Endkonzentration: 34 µg mL-1) und mit 2 mL Zellsuspension (Vorkultur)

angeimpft. Die Zellen wurden in 2 L-Erlenmeyerkolben (ohne Schikane) bei 37°C und

180 rpm inkubiert (Inkubationsschüttler Multitron/Pro, Infors AG, Bottmingen, CH).

Nach etwa 3-4 h wurde eine OD600 von 0,9-1,1 erreicht. Dann wurden die Zellen mit

L(+)-Arabinose induziert (Endkonzentration: 0,02%) und für weitere 20 h bei 25°C und

180 rpm inkubiert (Inkubationsschüttler Multitron/Pro, Infors AG, Bottmingen, CH). Die

Zellernte erfolgte durch Zentrifugation bei 4°C und 8980 g für 20 min (Zentrifuge:

Avanti J-26S XP; Rotor: JLA8.1, Beckman, Krefeld, DE).

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Material und Methoden

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3.3.3. Expression von PuOs im Schüttelkolben

Zur Expression von PuOs wurden 400 mL steriles TB-Medium mit Ampicillin versetzt

(Endkonzentration: 100 µg mL-1) und mit 2 mL Zellsuspension (Vorkultur) angeimpft.

Die Zellen wurden nun in 2 L-Erlenmeyerkolben (ohne Schikane) bei 37°C und 180 rpm

inkubiert (Inkubationsschüttler Multitron/Pro, Infors AG, Bottmingen, CH). Nach etwa

3 h wurde eine OD600 von 0,7-0,9 erreicht. Dann wurden die Zellen mit L(+)-Arabinose

induziert (Endkonzentration: 0,02%) und für weitere 20 h bei 25°C und 180 rpm

inkubiert (Inkubationsschüttler Multitron/Pro, Infors AG, Bottmingen, CH). Die Zellernte

erfolgte durch Zentrifugation bei 4°C und 8980 g für 20 min (Zentrifuge: Avanti J-26S

XP; Rotor: JLA8.1, Beckman, Krefeld, DE).

3.3.4. Toxizitätsstudie in E. coli JW5510

Zur Ermittlung der Toxizität verschiedener Substanzen gegenüber wachsenden E. coli

Zellen wurde der Einfluss der Substrate auf die relative Wachstumsrate der Zellen in LB-

bzw. TB-Medium bei 30°C bzw. 37°C analysiert. Hierfür wurden jeweils 250 mL

Erlenmeyerkolben mit 100 mL Medium befüllt und mit E. coli JW5510 Zellen beimpft.

Bei Erreichen einer OD600 von 0,05 wurde das schwach bewachsene Medium verwendet

um Deep-Well-Platten (Ritter riplate SW, 2 mL, Ritter GmbH, Schwabmünchen, DE) mit

je 1 mL pro well zu befüllen. Die Medien wurden anschließend mit unterschiedlichen

Substanzen in unterschiedlichen Konzentrationen (0,05-50 mM) versetzt und bei 30°C

bzw. 37°C und 320 rpm (Inkubationsschüttler Multitron/Pro, Infors AG, Bottmingen,

CH) inkubiert. In regelmäßigen Abständen wurde die OD600 ermittelt um die

Wachstumsrate (µ = 𝑓(𝑡) = ln(

𝑂𝐷𝑡𝑂𝐷𝑡0

)

𝑡−𝑡𝑜) zu berechnen. Als Vergleichspunkt dienten

Kontrollen ohne zugegebene Substanz.

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Material und Methoden

32

3.4. Proteinreinigung und Validierung

3.4.1. Zellaufschluss

Für den Zellaufschluss wurde das Zellpellet von 800 mL Zellsuspension mit 30 mL

Bindepuffer mit einem vorgekühltem Dounce-Homogenisator resuspendiert. Die

homogene Zellsuspension wurde nun mit einem Hochdruckhomogenisator (Emulsi Flex

C-5, Avestin, CA) in 3 Zyklen mit 750-1000 bar Gegendruck bei 4°C aufgeschlossen. Das

so gewonnene Zelllysat wurde anschließend durch Zentrifugation von Schwebstoffen

und Zelltrümmern befreit (45 min, 4°C, 11440 g, Zentrifuge: Avanti J-26S XP; Rotor:

JA14.50, Beckman, Krefeld, DE). Der Überstand mit dem gelösten Zielprotein wurde mit

einem Spritzenfilter filtriert (Polyethersulfon-Membran mit 0,45 µm Porendurchmesser,

VWR, Darmstadt, DE) und auf Eis gelagert.

3.4.2. Co2+-basierte Affinitätschromatographie

Alle IREDs und PuOs wurden mit einem N-terminalen His6-Tag exprimiert, welcher für

die Co2+-basierte Affinitätschromatographie notwendig ist. Hierfür wurden die Gene am

N-Terminus um 60 bp (IREDs) bzw. 33 bp (PuOs) verlängert. Dabei codiert die

angefügte Sequenz unter anderem für sechs aufeinanderfolgende Histidine, umrandet

von einem Glycin-Serin-Motiv, welches zur Flexibilität des Tags beiträgt (Tab. 19).

Tabelle 19: Verwendete His6-Tags für die Co2+-basierte Affinitätschromatographie. Das Histidin-Motiv ist rot markiert, das benachbarte Glycin-Serin-Motiv ist grau markiert.

His6-Tag (Aminosäuresequenz) Position Anwendung

MGSSHHHHHHSSGLVPRGSH N-terminal IREDs

MGSHHHHHHGS N-terminal PuOs

Die gelösten His-Tag-Proteine sind im Lysat enthalten, welches zuvor durch den

Zellaufschluss gewonnen wurde. Die Isolierung der Zielproteine aus dem Lysat erfolgte

nun mit Hilfe von His GraviTrapTM TALON® Säulen (GE Healthcare, Little Chalfont, UK).

Die Säulen haben ein Säulenvolumen (CV) von 1 mL und ein Durchmesser von 16 mm.

Der Durchfluss der verwendeten Lösungen basiert allein auf Gravitation, sodass keine

Geräte benötigt werden. Das Protokoll zur Reinigung von IREDs und PuOs mit

angefügtem His6-Tag ist im Folgenden aufgeführt (Tab. 20). Das His6-Motiv ist in der

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Material und Methoden

33

Lage zweiwertige Metallionen (z.B. Co2+ oder Ni2+) mit hoher Affinität zu binden, sodass

ein entsprechendes Säulenmaterial die His-Tag-Proteine bindet. Das Zielprotein bleibt

am Säulenmaterial gebunden, während andere Proteine in der Regel spätestens beim

Waschschritt von der Säule gewaschen werden. Die Elution des Zielproteins erfolgt

durch eine 500 mM Imidazol-Lösung. Imidazol ist bei hohen Konzentrationen in der

Lage die Koordination der Histidinreste mit Co2+ aufzuheben, indem es al kompetitiver

Elektronendonor selbst eine Wechselwirkung mit Co2+ eingeht, und das Protein

verdrängt.[161]

Tabelle 20: Arbeitsschritte für die Co2+-Affinitätschromatographie zur Aufreinigung von IREDs und PuOs

Arbeitsschritt Verwendete Lösung

Verwendetes Volumen

Aufgefangene Fraktion

Spülen ddH2O 10 mL ---

Spülen, Äquilibrieren Bindepuffer 10 mL ---

Beladen der Säule Lysat 25-35 mL ---

Waschen Bindepuffer 5 mL ---

Waschen Waschpuffer (5 mM Imidazol)

5 mL ---

Eluieren Elutionspuffer (500 mM Imidazol)

1 mL Fraktion 1

Eluieren Elutionspuffer (500 mM Imidazol)

2 mL Fraktion 2

Eluieren Elutionspuffer (500 mM Imidazol)

2 mL Fraktion 3

Spülen Elutionspuffer (500 mM Imidazol)

10 mL ---

Spülen ddH2O 20 mL ---

Spülen 20% Ethanol 5 mL ---

Nach der Elution befindet sich das Zielprotein in einer 500 mM Imidazol-Lösung, sodass

eine Umpufferung notwendig ist. Hierfür wurde Fraktion 2 in einen Dialyseschlauch

(Spectra/Por® 1, 6 – 8 kDa MWCO, Spectrum Laboratories, Los Angeles, US) überführt

und zweimal 2 h in 5 L kaltem Kpi-Puffer(50 mM, 4°C) unter Rühren dialysiert.

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Material und Methoden

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3.4.3. Proteinkonzentrationsbestimmung

Die Ermittlung der Gesamtproteinkonzentration erfolgte mit dem PierceTM BCATM

Protein Assay Kit (Thermo Fisher, Braunschweig, DE). Die Durchführung der

Konzentrationsbestimmung, sowie die Kalibrierung des Kits erfolgte nach den im Kit

enthaltenen Protokollen. Für die Kalibriergerade wurde der BSA-Standard (2 mg mL-1)

verwendet, welcher im Kit enthalten ist. Um eine Absorption im linearen Bereich der

Kalibriergerade zu erreichen wurden gereinigte Proteine in einer 50-fachen, bzw. Lysate

in einer 100-fachen Verdünnung eingesetzt. Nach der Inkubation der Enzymlösung mit

der Reaktionslösung kommt es zur Bildung eines Farbkomplexes aus Cu+ und

Bicinchoninsäure.[162] Die Messung der Absorption bei λ = 562 nm erfolgte mit dem

SPECTRAmax 340C Photometer (Molecular Devices, Sunnyvale, US). Alle Messungen

wurden in Triplikaten durchgeführt.

3.4.4. SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE)

Die Auftrennung von Proteinen nach Größe erfolgte durch SDS-Polyacrylamid-

Gelelektrophorese (SDS-PAGE).[163] Hierfür wurden 12%ige Fertig-SDS-Gele verwendet

(ExpressPlusTM PAGE GEL, GenScript, Piscataway, US). Als Laufpuffer wurde ein 1x TRIS-

MOPS-Puffer (GenScript, Piscataway, US) verwendet. Zunächst wurde eine

Proteinkonzentration von 2,4 µg µl-1 (gereinigtes Enzym) bzw. 4,8 µg µl-1 (Lysat)

eingestellt. 20 µl der Proteinlösung wurde mit 4 µl SDS-Ladepuffer versetzt und für

10 min bei 95 °C denaturiert. Anschließend wurden 10 µl der Lösung in die SDS-PAGE

Gel-Tasche überführt. Als Protein-Marker wurde der PageRuler Prestained Protein

Ladder (Fermentas, St. Leon-Rot, DE) verwendet. Die Elektrophorese erfolgte für 40-

50 min bei konstanten 140 Volt. Anschließend wurde das Gel entnommen und in

Coomassie-Färbelösung inkubiert (20 min, RT). Die Entfärbung erfolgte über Nacht in

Coomassie-Entfärbelösung (15-20 h, RT).

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Material und Methoden

35

3.5. Bestimmung der Enzymaktivität

3.5.1. Photometrischer NAD(P)H-Assay für IREDs

Die Aktivität von IREDs kann über die Abnahme des Kofaktors NAD(P)H erfolgen.

Hierbei macht man sich zu Nutze, dass NAD(P)H bei λ = 340 nm ein

Absorptionsmaximum aufweist, die oxidierten Form NAD(P)+ absorbiert in diesem

Wellenlängenbereich hingegen nicht. Die NAD(P)H-Abnahme kann also photometrisch

bei λ = 340 nm erfolgen.

Für die Ermittlung der Enzymaktivität von IREDs wurde zunächst eine Kalibriergerade

mit verschiedenen NAD(P)H-Konzentrationen erstellt. Sie ermöglichte die Umrechnung

der Absorptions-Abnahme (AU min-1) in NAD(P)H-Verbrauch (µM min-1). Die

Reaktionen wurden in 96-well Mikrotiterplatten (Greiner Bio-One GmbH,

Kremsmünster, AT) durchgeführt. Dabei wurde je ein Volumen von 200 µl eingestellt.

Die Messung erfolgte bei 25°C. Die Reaktion wurde kurz vor Beginn der Messung

entweder mit der Zugabe von NAD(P)H (Iminreduktion) ober mit der Zugabe von

Carbonylsubstrat (Reduktive Aminierung, Doppelt Reduktive Aminierung), oder mit der

Zugabe von IRED (Reduktive Hydrazinierung, Doppelt Reduktive Hydrazinierung)

gestartet. Die Messung der Absorption bei λ = 340 nm erfolgte mit dem SPECTRAmax

340C Photometer (Molecular Devices, Sunnyvale, US). Der Zeitraum der Messung war

abhängig vom Substrat und von der Art der Reaktion und betrug zwischen 10 und

60 min. Dabei wurde das Zeitintervall (Δt) der Messpunkte immer so gewählt, dass 61

Zeitpunkte enthalten sind (z.B.: t = 15 min, Δt = 15 s; oder t = 20 min, Δt = 20 s). Im

Folgenden sind beispielhafte Ansätze zur photometrischen Bestimmung der IRED

Aktivität für verschiedene Reaktionen gezeigt (Tab. 21-25).

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Material und Methoden

36

Tabelle 21: Ansätze zur photometrischen Aktivitätsbestimmung von IREDs für die Reduktion von Iminsubstraten.

NADPH-Assay NADH-Assay

Komponente End-konzentration

Komponente

End-konzentration

Kpi-Puffer, pH 7,0 50 mM Kpi-Puffer, pH 7,0 50 mM

Iminsubstrat 5 mM Iminsubstrat 5 mM

R-IRED_Ms-WT 0,2-30 µM R-IRED_Ms-V8 0,2-30 µM

NADPH 0,4 mM NADH 0,35 mM

Tabelle 22: Ansätze zur photometrischen Aktivitätsbestimmung von IREDs für die reduktive Aminierung.

NADPH-Assay NADH-Assay

Komponente End-konzentration

Komponente

End-konzentration

Kpi-Puffer, pH 7,0 50 mM Kpi-Puffer, pH 7,0 50 mM

Aminsubstrat 10 mM Aminsubstrat 10 mM

Carbonylsubstrat 5 mM Carbonylsubstrat 5 mM

R-IRED_Ms-WT 5-30 µM R-IRED_Ms-V8 5-30 µM

NADPH 0,4 mM NADH 0,35 mM

Tabelle 23: Ansätze zur photometrischen Aktivitätsbestimmung von IREDs für die reduktive Hydrazinierung.

NADPH-Assay

Komponente End-konzentration

Kpi-Puffer pH 6,0 200 mM

Hydrazinsubstrat 50 mM

Carbonylsubstrat 25 mM

R-IRED_Ms-WT 5-30 µM

NADPH 0,4 mM

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Material und Methoden

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Tabelle 24: Ansätze zur photometrischen Aktivitätsbestimmung von IREDs für die doppelte reduktive Aminierung.

NADPH-Assay NADH-Assay

Komponente End-konzentration

Komponente

End-konzentration

Kpi-Puffer, pH 7,0 50 mM Kpi-Puffer, pH 7,0 50 mM

Diamin 5 mM Diamin 5 mM

Dicarbonyl 5 mM Dicarbonyl 5 mM

R-IRED_Ms-WT 1-60 µM R-IRED_Ms-V8 1-60 µM

NADPH 0,4 mM NADH 0,35 mM

Tabelle 25: Ansatz zur photometrischen Aktivitätsbestimmung von R-IRED_Ms für die reduktive Hydrazinierung.

NADPH-Assay

Komponente End-konzentration

Kpi-Puffer, pH 6,0 200 mM

Hydrazinsubstrat 50 mM

Carbonylsubstrat 25 mM

R-IRED_Ms-WT 1-60 µM

NADPH 0,4 mM

3.5.2. Photometrische Analyse kinetischer Parameter für IREDs

Für die Ermittlung der kinetischen Parameter bezüglich der IRED katalysierten

Reduktion verschiedener Iminsubstrate wurden dieselben Bedingungen gewählt wie

bereits in (Kap. 3.5.1) beschrieben. Dabei wurde die Substratkonzentration in sinnvollen

Schritten variiert (0,05 mM - 50 mM), sodass eine Interpretation der Datenpunkte

möglich war. Zur Ermittlung der kinetischen Parameter wurde eine Michaelis-Menten-

Kinetik angenommen (𝑣 = 𝑓(𝑆) =𝑣𝑚𝑎𝑥∙[𝑆]

𝐾𝑚+[𝑆]). Km ist hierbei die Michaelis-Menten-

Konstante und beschreibt die Substratkonzentration, bei der die Umsatzgeschwindigkeit

des Enzyms halbmaximal ist. Für Substrate, bei denen die Aktivität bei steigender

Substratkonzentration zunächst anstieg und schließlich wieder abnahm wurde der

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Material und Methoden

38

Term mit einer Inhibierungskonstante (Ki) erweitert und eine

Substratüberschussinhibierung berücksichtigt (𝑣 = 𝑓(𝑆) =𝑣𝑚𝑎𝑥

𝐾𝑚[𝑆]

+[𝑆]

𝐾𝑖

).

Die jeweiligen Parameter wurden so gewählt, dass die Summe der quadratischen

Abweichungen der Messpunkte zur berechneten kinetischen Funktion (𝑓(𝑆)) minimal

war. Alle Substratkonzentrationen wurden in Triplikaten gemessen.

3.5.3. Photometrischer NAD(P)H -Assay für Alkoholdehydrogenasen

Zur Ermittlung der Aktivität von Alkoholdehydrogenasen (ADHs) bezüglich der

Oxidation von Hydroxy-Gruppen zu Carbonyl-Gruppen wurde ein ähnlicher Assay wie

bei den IREDs angewendet. Diesmal wurde jedoch die Bildung und nicht die Abnahme

von NAD(P)H detektiert, da während der Oxidationsreaktion von Dehydrogenasen

NAD(P)+ zu NAD(P)H umgewandelt wird. Es wurde je ein Volumen von 200 µl in

Mikrotiterplatten (Greiner Bio-One GmbH, Kremsmünster, AT) eingestellt. Die Messung

erfolgte bei 25°C. Die Reaktion wurde kurz vor Beginn der Messung durch die Zugabe

von NAD(P)+ gestartet. Die Messung der Absorption bei λ = 340 nm erfolgte mit dem

SPECTRAmax 340C Photometer (Molecular Devices, Sunnyvale, US). Im Folgenden ist

ein beispielhafter Ansatz zur photometrischen Bestimmung der Oxidationsaktivität von

ADHs gezeigt (Tab. 26).

Tabelle 26: Eingesetzte Komponenten und Endkonzentrationen für die photometrische Bestimmung der Oxidationsaktivität von ADHs.

Komponente Endkonzentration

Puffera 50 mM

Alkoholsubstrat 5-25 mM

ADH 0,5 mg mL-1

NAD(P)+ 2,5 mM

a Die Art des Puffers, sowie der pH Wert wurde (falls bekannt) an das Enzym angepasst.

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Material und Methoden

39

3.5.4. Photometrischer H2O2-basierter Assay für Oxidasen

Bei der von Oxidasen katalysierten Oxidation dient molekularer Sauerstoff (O2) als

Elektronakzeptor. Dabei wird meist O2 zu Wasserstoffperoxid (H2O2) reduziert. Die

H2O2-Bildung ist somit proportional zur Enzymaktivität. Sie lässt sich mit einer

Peroxidase und dem Farbstoff ABTS photometrisch quantifizieren. Die Peroxidase

verwendet das entstandene H2O2 als Elektronakzeptor um ABTS zu ABTS+ zu oxidieren

(Abb. 10), welches bei λ = 405 nm photometrisch detektiert werden kann.

Abbildung 10: Peroxidase katalysierte Oxidation von ABTS.

Die photometrische Bestimmung der Aktivität von Oxidasen erfolgte in

Mikrotiterplatten (Greiner Bio-One GmbH, Kremsmünster, AT) mit einem Füllvolumen

von 200 µl. Die Detektion der ABTS+-Bildung erfolgte mit dem SPECTRAmax 340C

Photometer (Molecular Devices, Sunnyvale, US) bei λ = 405 nm für 15 min bei 30°C. Im

Folgenden ist ein beispielhafter Ansatz zur photometrischen Bestimmung der Aktivität

von Oxidasen gezeigt (Tab. 27).

Tabelle 27: Eingesetzte Komponenten und Endkonzentrationen für die photometrische Bestimmung der Aktivität von Oxidasen.

Komponente Endkonzentration

TRIS-HCl Puffer pH=8,0 50 mM

Amin- oder Alkoholsubstrat

10-50 mM

Oxidase 0,01-5 µM

HRPa 8 U mL-1

ABTS 2 mM

NAD(P)+ 2,5 mM

a horse radish peroxidase (HRP), Peroxidase aus Armoracia rusticana.

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Material und Methoden

40

3.5.5. In vitro Biotransformationen mit IREDs

Um die Produktbildung der IREDs für verschiedene Substrate zu ermitteln wurden

Biotransformationen in 2,5 mL Glasgefäßen (Rotilabo Sample Vials, Carl Roth, Karlsruhe,

DE) durchgeführt. Dabei wurde ein Füllvolumen von 200 µl bzw. 350 µl

(Probenentnahme zu drei Zeitpunkten) eingestellt. Die Inkubation der Proben erfolgte

vorwiegend in einem Inkubationsschüttler (25 °C, 180 rpm, Multitron/Pro, Infors AG,

Bottmingen, CH) und manchmal in einem Thermoschüttler (25 °C, 550 rpm,

Thermomixer-comfort, Eppendorf AG, Hamburg, DE). Im Folgenden sind beispielhafte

Biotransformationsansätze gezeigt (Tab. 28-32).

Tabelle 28: Beispielhafte Ansätze zur Biotransformation von Iminsubstraten mit Hilfe von IREDs

Reduktion von Iminen Reduktion von Iminen in

Anwesenheit von Poloxameren

Komponente End-konzentration

Komponente

End-konzentration

Kpi-Puffer pH 7,0 50 mM Kpi-Puffer pH 7,0 50 mM

Iminsubstrat 5 mM Poloxamer 1-10 %

IRED 0,5-5 µM Iminsubstrat 5 mM

NAD(P)H 2-2,5 mM IRED 0,5-5 µM

MgCl2 2,5 mM NAD(P)H 2-2,5 mM

G6P 20 mM MgCl2 2,5 mM

G6PDH 5 U mL-1 G6P 20 mM

G6PDH 5 U mL-1

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Material und Methoden

41

Tabelle 29: Beispielhafte Biotransformationsansätze zur reduktiven Aminierung bzw. Hydrazinierung von Carbonylen mit Hilfe von IREDs

Reduktive Aminierung Reduktive Hydrazinierung

Komponente End-konzentration

Komponente

End-konzentration

Kpi-Puffer pH 7,0 50 mM Kpi-Puffer pH 6,0 100 mM

Aminsubstrat 25 mM Hydrazinsubstrat 50 mM

Carbonylsubstrat 5 mM Carbonylsubstrat 25 mM

IRED 2-30 µM IRED 5-30 µM

NAD(P)H 2,5 mM NAD(P)H 2,5 mM

MgCl2 2,5 mM MgCl2 2,5 mM

G6P 20 mM G6P 30 mM

G6PDH 5 U mL-1 G6PDH 5 U mL-1

Tabelle 30: Beispielhafte IRED katalysierte Biotransformationsansätze zur doppelten reduktiven Aminierung von Dicarbonylen mit Diaminen.

Doppelte reduktive Aminierung Doppelte reduktive Aminierung mit

erhöhten Substratkonzentrationen

Komponente End-konzentration

Komponente

End-konzentration

Kpi-Puffer pH 7,0 50 mM Kpi-Puffer pH 7,0 100 mM

Diaminsubstrat 5 mM Diaminsubstrat 50 mM

Dicarbonylsubstrat 6,25 mM Dicarbonylsubstrat 62,5 mM

IRED 5-60 µM IRED 30 µM

NAD(P)H 2-2,5 mM NAD(P)H 2,5 mM

MgCl2 2,5 mM MgCl2 2,5 mM

G6P 30 mM G6P 110 mM

G6PDH 5 U mL-1 G6PDH 10 U mL-1

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Material und Methoden

42

Tabelle 31: IRED katalysierter Biotransformationsansatz zur doppelten reduktiven Aminierung von Dicarbonylen mit Diaminen mit FDH-Regenerationssystem (links). IRED katalysierter Biotransformationsansatz zur reduktiven Aminierung von Hydroxycarbonylen mit Diaminen (rechts).

Doppelte reduktive Aminierung in Anwesenheit von Additiven

Doppelte reduktive Aminierung mit FDH-Regenerationssystem

Komponente End-konzentration

Komponente

End-konzentration

Kpi-Puffer pH 7,0 50 mM Kpi-Puffer pH 7,0 50 mM

Additiv 1-10 % Diaminsubstrat 10 mM

Diaminsubstrat 10 mM Dicarbonylsubstrat 12,5 mM

Dicarbonylsubstrat 12,5 mM IRED (V8) 30 µM

IRED 15 µM NADH 2 mM

NAD(P)H 2 mM Natriumformiat 30 mM

MgCl2 2,5 mM FDH 8 U mL-1

G6P 30 mM

G6PDH 5 U mL-1

Tabelle 32: Biotransformationsansatz für die IRED katalysierte doppelte reduktive Hydrazinierung (links) und für die reduktive Aminierung von α-Hydroxycarbonylen mit Diaminen (rechts).

Doppelte reduktive Hydrazinierung

Reduktive Aminierung von α-Hydroxycarbonylen mit Diaminen

Komponente End-konzentration

Komponente

End-konzentration

Kpi-Puffer pH 6,0 100 mM Kpi-Puffer pH 8,0 100 mM

Hydrazinsubstrat 5 mM Diaminsubstrat 5 mM

Carbonylsubstrat 5 mM α-Hydroxycarbonyl 50 mM

IRED 30 µM IRED 30 µM

NAD(P)H 2,5 mM NAD(P)H 2,5 mM

MgCl2 2,5 mM MgCl2 2,5 mM

G6P 30 mM G6P 30 mM

G6PDH 5 U mL-1 G6PDH 5 U mL-1

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Material und Methoden

43

3.5.6. In vitro Biotransformationen mit kontinuierlicher Substratzugabe

Die in vitro Biotransformationen (doppelte reduktive Aminierung) mit kontinuierlicher

Substratzugabe erfolgten in 2,5 mL Glasgefäßen bei Raumtemperatur. Die

Durchmischung wurde mit einem Magnetrührstab (5x2 mm) und einem Magnetrührer

gewährleistet. Die Zugabe des Dicarbonylsubstrates erfolgte kontinuierlich, um die

spontane Nebenreaktion mit Diaminen zu verringern. Gleichzeitig wird so die Enzym-

Inaktivierung durch Dicarbonyle[164] reduziert. Für die kontinuierliche Zugabe wurde

eine Spritzenpumpe (LA-30, Landgraf Laborsysteme HLL GmbH, Langenhagen, DE)

verwendet. Hierbei wurde typischerweise ein Endvolumen von 350 µl eingestellt. Die

Zugabe des Dicarbonyls erfolgte mit einer Flussrate von 8,75 µ h-1 für 5 h. Nach weiteren

60 min wurde die Reaktion mit NaOH gestoppt. Im Folgenden sind beispielhafte

Reaktionsansätze für niedrige und hohe Substratkonzentrationen gezeigt (Tab. 33,34).

Tabelle 33: Beispielhafte IRED katalysierte Biotransformationsansätze zur doppelten reduktiven Aminierung mit kontinuierlicher Substratzugabe für niedrige und hohe Substratkonzentrationen.

Doppelte Reduktive Aminierung mit 5 mM Substrat

Doppelte Reduktive Aminierung mit 50 mM Substrat

Komponente End-konzentration

Komponente

End-konzentration

Kpi-Puffer pH 7,0 50 mM Kpi-Puffer pH 7,0 500 mM

Diaminsubstrat 5 mM Diaminsubstrat 50 mM

Dicarbonylsubstrat 6,25a mM Dicarbonylsubstrat 62,5a mM

IRED 30 µM IRED 30 µM

NAD(P)H 2,5 mM NAD(P)H 2,5 mM

MgCl2 2,5 mM MgCl2 2,5 mM

G6P 40 mM G6P 160 mM

G6PDH 5 U mL-1 G6PDH 5 U mL-1 a theoretisch verwendete Endkonzentration nach fünfstündiger Zugabe

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Material und Methoden

44

Tabelle 34: Beispielhafter IRED katalysierter Biotransformationsansatz zur doppelten reduktiven Aminierung mit kontinuierlicher Substratzugabe unter Anwendung der Formiatdehydrogenase (FDH) bei einer Gesamt-Substratkonzentration von 40 mM im 10 mL Maßstab.

Doppelte Reduktive Aminierung mit 40 mM Substrat und FDH-Regenerationssystem im 10 mL-Maßstab

Komponente End-konzentration

Kpi-Puffer pH 7,0 200 mM

Pluronic-P123 5%

Diaminsubstrat 40 mM

Dicarbonylsubstrat 42a mM

IRED 30 µM

NADH 2,5 mM

Natriumformiat 100 mM

FDH 12 U mL-1

a theoretisch verwendete Endkonzentration nach fünfstündiger Zugabe

3.5.7. In vitro Biotransformationen mit Enzymkaskaden

Für die Bildung von N-Heterozyklen ausgehend von einfachen linearen Substraten

wurden verschiedene Enzymkaskaden getestet. Dabei wurden die

Reaktionsbedingungen an die verwendeten Enzyme angepasst. Die Inkubation erfolgte

in 2,5 mL Glasgefäßen (25 °C, 180 rpm, Rotilabo Sample Vials, Carl Roth, Karlsruhe, DE)

mit einem Füllvolumen von 200-400 µl. Bei der Verwendung von Oxidasen wurden die

Glasgefäße horizontal geschüttelt um den Sauerstoffeintrag zu verbessern. Im Folgenden

sind beispielhafte Biotransformationsansätze für verschiedene Kaskaden gezeigt

(Tab. 35,36).

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Material und Methoden

45

Tabelle 35: Beispielhafte Biotransformationsansätze zur Bildung von N-Heterozyklen ausgehend von Diaminen bzw. Diolen mit Hilfe von Oxidasen und IREDs in einer Enzymkaskade.

Enzymkaskade mit PuOs und IREDs

Enzymkaskade mit Alkoholoxidasen und IREDs

Komponente End-konzentration

Komponente

End-konzentration

TRIS-HCl Puffer pH 8,0 50 mM Kpi-Puffer pH 7,5 50 mM

Diaminsubstrat 5-10 mM Diolsubstrat 250 mM

PuO 0.1-5 mg mL-1 Ethylendiamin 5 mM

IRED 1 mg mL-1 Alkohol-Oxidase 0,05 mg mL-1

NADPH 2,5 mM IRED 30 µM

MgCl2 2,5 mM NAD(P)H 2,5 mM

G6P 20 mM Catalase 20 U mL-1

G6PDH 1 U mL-1 MgCl2 2,5 mM

G6P 30 mM

G6PDH 5 U mL-1

Tabelle 36: Beispielhafte Biotransformationsansätze zur Bildung von N-Heterozyklen ausgehend von Diolen und Ethylendiamin mit Hilfe von Dehydrogenasen und IREDs in einer Enzymkaskade.

Diol-Biotransformation mit Dehydrogenasen und IREDs

Komponente End-konzentration

Kpi-Puffer pH 8,0 100 mM

MgCl2 2,5 mM

Diolsubstrat 50 mM

ECAAa 50 mM

NAD+ 2,5 mM

ADH 2 U mL-1

Ethylendiaminb 5 mM

NADPHb 2,5 mM

IREDb 60 µM

G6Pb 30 mM

G6PDHb 5 U mL-1

a Ethyl-4-chlororacetoacetat b Zugabe nach 4 h

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Material und Methoden

46

3.6. In vivo Biotransformation in E.coli JW5510

Neben den Biotransformationen mit gereinigten Enzymen (in vitro) wurden auch

Biotransformationen im Ganz-Zell-System (in vivo) durchgeführt. Dafür wurde zunächst

R-IRED_Ms in E.coli JW5510 in TB-Medium exprimiert. Die Zellen wurden anschließend

geerntet und in verschiedenen Medien resuspendiert (M9-Medium, TB-Medium,

100 mM Kpi-Puffer pH 7,0). Die Ganzzell-Biotransformation erfolgte bei

Raumtemperatur in 2,5 mL Glasgefäßen mit einem Füllvolumen von 1000 µL. Die

Zugabe des Dicarbonyls erfolgte kontinuierlich mit Spritzenpumpe (LA-30, Landgraf

Laborsysteme HLL GmbH, Langenhagen, DE) und einer Flussrate von 25 µ h-1 für 5 h.

Nach weiteren 60 min wurde die Reaktion mit NaOH gestoppt. Die Komponenten des

Ganzzellansatzes sind in Tabelle 37 gezeigt.

Tabelle 37: Komponenten und Endkonzentrationen eines Ganzzellansatzes für die doppelte reduktive Aminierung.

Komponente Endkonzentration

Zellsuspension in verschiedenen Medien

OD600: 40

Glukose 0-100 mM

L(+)-Arabinose 0,02%

Diamin 5 mM

Dicarbonyl 6,25 mM

a theoretisch verwendete Endkonzentration nach fünfstündiger Zugabe.

3.7. Probenaufarbeitung (Extraktion und Derivatisierung)

Für die Analyse der gebildeten Produkte mittels GC oder HPLC (normal phase) war es

notwendig die Produkte in eine organische Phase zu bringen. Hierfür wurden

verschiedene Extraktions-Methoden eingesetzt. In den meisten Fällen war außerdem

eine Derivatisierung nötig, da die Produkte nicht hydrophob genug waren um in die

organische Phase zu gehen. Im Folgenden sind mehrere Extraktions- und

Derivatisierungs-Methoden gezeigt, mit denen die allermeisten Proben aus dieser Arbeit

erfolgreich aufgearbeitet werden konnten (Tab. 38-44).

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Material und Methoden

47

Tabelle 38: Protokoll zur Aufarbeitung von polaren Pyrrolidinen und Piperidinen.

Schritt Beschreibung

1 Entnahme von 100 µl Probe und Überführung in ein 1,5 mL Plastiktube.

2 Zugabe von 10 µl des internen Standards (50 mM Stock-Konzentration)

3 Abstoppen der Reaktion und Erhöhung des pH-Wertes auf ≈ 14 durch Zugabe von 20 µl NaOH (5 M)

4 Zugabe von 250 µl Derivatisierungs-Mix (MTBE, 50 µl mL-1 Essigsäure-Anhydrid)

5 Derivatisierung und Extraktion durch 30 s vortexen

6 Zentrifugation (2 min, 20200 g, RT) zur Trennung der Phasen

7 Entnahme von 200 µl organischer Phase (oben) und Überführung in ein GC-Glasgefäß mit Glaseinsatz.

Tabelle 39: Protokoll zur Aufarbeitung von polaren Piperazinen.

Schritt Beschreibung

1 Entnahme von 100 µl Probe und Überführung in ein 1,5 mL Plastiktube.

2 Zugabe von 10 µl des internen Standards (50 mM Stock-Konzentration)

3 Abstoppen der Reaktion und Erhöhung des pH-Wertes auf ≈ 14 durch Zugabe von 20 µl NaOH (5 M)

4 Zugabe von 250 µl Derivatisierungs-Mix (DCM, 50 µl mL-1 Essigsäure-Anhydrid)

5 Derivatisierung und Extraktion durch 30 s vortexen

6 Zentrifugation (2 min, 20200 g, RT) zur Trennung der Phasen

7 Entnahme von 200 µl organischer Phase (unten) und Überführung in ein GC-Glasgefäß mit Glaseinsatz.

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Material und Methoden

48

Tabelle 40: Protokoll zur Aufarbeitung von unpolaren zyklischen Aminprodukten.

Schritt Beschreibung

1 Entnahme von 100 µl Probe und Überführung in ein 2 mL Plastiktube.

2 Zugabe von 10 µl des internen Standards (50 mM Stock-Konzentration)

3 Abstoppen der Reaktion und Erhöhung des pH-Wertes auf ≈ 14 durch Zugabe von 20 µl NaOH (5 M)

4 Zugabe von 750 µl MTBE

5 Extraktion durch 30 s vortexen

6 Zentrifugation (1 min, 20200 g, RT) zur Trennung der Phasen

7 Entnahme von 600 µl organischer Phase (oben) und Überführung in ein GC-Glasgefäß ohne Glaseinsatz.

Tabelle 41: Protokoll zur Aufarbeitung von N-Methyl-Pyrrolidin.

Schritt Beschreibung

1 Entnahme von 1 mL Probe und Überführung in ein 2 mL Plastiktube.

2 Abstoppen der Reaktion und Erhöhung des pH-Wertes durch Zugabe von 50 µl NaOH (5 M)

3 Zugabe von 250 µl DCM

4 Extraktion durch 2 min vortexen

5 Zentrifugation (2 min, 20200 g, RT) zur Trennung der Phasen

6 Entnahme von 200 µl organischer Phase (unten) und Überführung in ein GC-Glasgefäß mit Glaseinsatz.

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Material und Methoden

49

Tabelle 42: Probenaufarbeitung für die chirale GC-Analyse von Pyrrolidinen, Piperidinen und 1-Methyl-3-phenylpiperazin.

Schritt Beschreibung

1 Entnahme von 100 µl Probe und Überführung in ein 2 mL Plastiktube.

2 Abstoppen der Reaktion und Erhöhung des pH-Wertes auf ≈ 14 durch Zugabe von 20 µl NaOH (5 M)

3 Zugabe von 250 µl Derivatisierungs-Mix (MTBE, 50 µl mL-1 Essigsäure-Anhydrid)

4 Derivatisierung und Extraktion durch 30 s vortexen

5 Quenchen des überschüssigen Essigsäure-Anhydrids durch Zugabe von 100 µl 4%iger Methylamin-Lösung

6 Zugabe von 250 µl MTBE

7 30 s vortexen

8 Zentrifugation (1 min, 20200 g, RT) zur Trennung der Phasen

9 Entnahme von 200 µl organischer Phase (oben) und Überführung in ein GC-Glasgefäß mit Glaseinsatz.

Tabelle 43: Probenaufarbeitung für die chirale HPLC-Analyse von 2-Methylpiperazin und 2-Phenylpiperazin.

Schritt Beschreibung

1 Entnahme von 100 µl Probe und Überführung in ein 2 mL Plastiktube.

2 Abstoppen der Reaktion und Erhöhung des pH-Wertes auf ≈ 14 durch Zugabe von 20 µl NaOH (5 M)

3 Zugabe von 200 µl Derivatisierungs-Mix (DCM, 5 mM 1-Fluor-2,4-dinitrobenzol)

4 30 s vortexen

5 Inkubation für 60 min bei 30°C

6 Quenchen des überschüssigen 1-Fluor-2,4-Dinitrobenzols durch Zugabe von 5 µl Diethylamin.

7 Zugabe von 200 µl DCM

8 30 s vortexen

9 Zentrifugation (1 min, 20200 g, RT) zur Trennung der Phasen

10 Entnahme von 200 µl organischer Phase (unten) und Überführung in ein GC-Glasgefäß mit Glaseinsatz.

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Material und Methoden

50

Tabelle 44: Protokoll für die HPLC-Analyse (Umkehrphase) von Ethambutol.

Schritt Beschreibung

1 Entnahme von 350 µl Probe und Überführung in ein 2 mL Plastiktube

2 Abstoppen der Reaktion und Erhöhung des pH-Wertes durch Zugabe von 10 µl NaOH (5 M)

3 Zugabe von 700 µl DCM

4 30 s vortexen

5 Zentrifugieren (1 min, 20200 g, RT) zur Trennung der Phasen

6 Überführung von 500 µl der organischen Phase in ein neues Plastiktube

7 Eindampfen der organischen Phase mit einem Evaporator (GeneVac EZ-2, SP Scientific, Ipswich, UK) bei 40°C für etwa 30 min

8 Zugabe von 200 µl Laufmittelgemisch (50% H2O, 50% ACN)

9 30 s vortexen

10 Überführung in ein GC-Glasgefäß mit Glaseinsatz.

3.8. Screening-Systeme

3.8.1. Screening-System zur Identifizierung von IRED-Varianten mit geänderter Kofaktorspezifität

Für die Identifizierung von R-IRED_Ms Enzym-Varianten mit geänderter

Kofaktorspezifität wurde ein photometrisches Screening-System im 96-well Format

entwickelt. Zunächst wurden 96er Deep-Well-Platten (Ritter riplate SW, 2 mL, Ritter

GmbH, Schwabmünchen, DE) mit LB-Medium (750 µL pro well, 34 µg mL-1

Chloramphenicol) befüllt und mit Einzelkolonien der Mutantenbibliothek beimpft. Diese

Vorkulturplatte wurde bei 25°C und 800 rpm für etwa 22 h inkubiert (TiMix Control mit

TH30-Thermostat, Edmund Bühler GmbH, Hechingen, DE). Mit der Vorkulturplatte

wurde anschließend eine Expressionsplatte (ebenfalls 96er Deep-Well-Platte)

angeimpft. Hierfür wurden 50 µl der Vorkultur auf je 950 µl LB-Medium (34 µg mL-1

Chloramphenicol, 0,021% Arabinose) gegeben. Die Expression der R-IRED_Ms Varianten

erfolgte ebenfalls bei 25°C und 800 rpm für 22 h (TiMix Control mit TH30-Thermostat,

Edmund Bühler GmbH, Hechingen, DE). Anschließend wurden die Zellen durch

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Material und Methoden

51

Zentrifugation (4°C, 15 min, 3220 g, Zentrifuge: 5810 R, Rotor: A-4-62, Eppendorf AG,

Hamburg, DE) geerntet und die Zellpellets über Nacht bei -80°C tiefgefroren. Für den

enzymatischen Zellaufschluss wurden die Pellets mit 200 µl Lysepuffer (50 mM Kpi-

Puffer, pH 7,0, 750 µg mL-1 Lysozym, 10 µg mL-1 DNAseI) re-suspendiert und für 60 min

bei 37°C und 180 rpm (Inkubationsschüttler Multitron/Pro, Infors AG, Bottmingen, CH)

inkubiert. Anschließend wurde die Suspension in Rund-Boden-Mikrotiterplatten

überführt und zur Abtrennung der unlöslichen Bestandteile für 60 min zentrifugiert

(4°C, 3220 g, Zentrifuge: 5810 R, Rotor: A-4-62, Eppendorf AG, Hamburg, DE). Während

der Zentrifugation wurden pro Platte jeweils zwei Reaktionsplatten (Tab. 45)

vorbereitet (eine für den NADPH-Assay und eine für den NADH-Assay). Nach der

Zentrifugation wurde das lösliche E. coli Lysat (Überstand) erhalten, in welchem die

exprimierten R-IRED_Ms Varianten gelöst sind. 150 µl des Überstandes wurden sehr

vorsichtig abgenommen, in eine frische Rund-Boden-Mikrotiterplatte überführt und bei

4°C gelagert. Nun wurden die Reaktionsplatten nacheinander durch Zugabe von Lysat

gestartet (60 µl Lysat auf 240 µl Reaktionsmix) und die Abnahme des Kofaktors

NAD(P)H photometrisch bei λ = 340 nm verfolgt (25°C, t = 30 min, Δt = 30 s,

SPECTRAmax 340C Photometer Molecular Devices, Sunnyvale, US).

Tabelle 45: Komponenten und Endkonzentrationen der Screening-Reaktionsplatte für die Messung der NADH und NADPH-Abnahme zur Identifizierung von IRED-Varianten mit geänderter Kofaktorspezifität.

Komponente Endkonzentration

Kpi-Puffer pH 7,0 50 mM

Methylpyrrolin 5 mM

NAD(P)H 0,35 mM

Lysata Verhältnis 1:4

a Zugabe von Lysat zum Starten der Reaktion kurz vor der Messung.

Aus den Messungen konnte nun für jede Variante sowohl die Aktivität mit NADH, als

auch die Aktivität mit NADPH berechnet werden. Die Kofaktorspezifität ergab sich aus

dem Quotient der NADH-Abnahme und der NADPH-Abnahme. Für die Auswahl von

positiv veränderten Varianten wurde sowohl die Spezifität als auch die absolute

Aktivität mit NADH als Kofaktor berücksichtigt. Zur Bestätigung der positiv veränderten

Enzymvarianten wurde ein Re-Screening durchgeführt. Hierfür wurden die Plasmide

der ausgewählten Mutanten isoliert und für eine Re-Transformation von E. coli JW5510

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Material und Methoden

52

verwendet. Es wurden von jeder Mutante je sechs Kolonien verwendet und das

Screening mit dieser biologischen Sechsfachbestimmung wiederholt und mit dem

Wildtyp bzw. Parent-Enzym verglichen. Diejenigen Varianten, die unter

Berücksichtigung der Varianz eine signifikante Verbesserung zeigten, wurden nun

sequenziert. Des Weiteren wurden solche Varianten im Schüttelkolben exprimiert und

für eine genauere Analysen gereinigt.

3.8.2. Screening-System zur Identifizierung von IRED-Varianten mit erhöhter Aktivität für Substrate mit niedriger Anfangsaktivität

Ein Screening auf Basis von Substraten mit niedriger Grundaktivität ist sehr

herausfordernd, da sich die schwache IRED Enzymaktivität von der

Hintergrundaktivität des E. coli Lysats abheben muss. Die Varianz muss also so niedrig

wie möglich gehalten werden und gleichzeitig muss eine hohe IRED-Konzentration

gewährleistet werden. Das photometrische Screening-System im 96-well Format wurde

deshalb für diese Anwendung verändert. Zunächst wurden 96er Deep-Well-Platten

(Ritter riplate SW, 2 mL, Ritter GmbH, Schwabmünchen, DE) mit TB-Medium (550 µL

pro well, 34 µg mL-1 Chloramphenicol) befüllt und mit Einzelkolonien der Mutanten-

Bibliothek beimpft. Diese Vorkulturplatte wurde bei 37°C und 320 rpm für etwa 20 h

inkubiert (Inkubationsschüttler HT Minitron, Infors AG, Bottmingen, CH). Mit der

Vorkulturplatte wurde anschließend eine Expressionsplatte (ebenfalls 96er Deep-Well-

Platte) angeimpft. Hierfür wurden 50 µl der Vorkultur auf je 950 µl TB-Medium

(34 µg mL-1 Chloramphenicol, 0,021% w/v Arabinose) gegeben. Die Expression der

R-IRED_Ms Varianten erfolgte bei 25°C und 800 rpm für 24 h (TiMix Control mit TH30-

Thermostat, Edmund Bühler GmbH, Hechingen, DE). Anschließend wurden die Zellen

durch Zentrifugation (4°C, 15 min, 3220 g, Zentrifuge: 5810 R, Rotor: A-4-62, Eppendorf

AG, Hamburg, DE) geerntet. Die Zellpellets wurden anschließend in 500 µl Kpi-Puffer

(50 mM, pH 7,0) re-suspendiert und erneut abzentrifugiert (4°C, 15 min, 3220 g,

Zentrifuge: 5810 R, Rotor: A-4-62, Eppendorf AG, Hamburg, DE). Die gewaschenen

Zellpellets wurden über Nacht bei -80°C tiefgefroren. Für den enzymatischen

Zellaufschluss wurden die Pellets mit 500 µl Lysepuffer (50 mM Kpi-Puffer, pH 7,0,

400 µg mL-1 Lysozym, 5 µg mL-1 DNAseI) re-suspendiert und für 120 min bei 25°C und

180 rpm (Inkubationsschüttler Multitron/Pro, Infors AG, Bottmingen, CH) inkubiert. Zur

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Material und Methoden

53

Abtrennung der unlöslichen Bestandteile wurden zwei Zentrifugationsschritte

durchgeführt. Zunächst wurden die Deep-Well-Platten für 30 min zentrifugiert (4°C,

3220 g, Zentrifuge: 5810 R, Rotor: A-4-62, Eppendorf AG, Hamburg, DE). Anschließend

wurden je 300 µl Überstand in eine Rund-Boden-Mikrotiterplatte überführt und für

weitere 30 min zentrifugiert (4°C, 3220 g, Zentrifuge: 5810 R, Rotor: A-4-62, Eppendorf

AG, Hamburg, DE). Während der Zentrifugation wurden je zwei

Reaktionsplatten (Tab. 46) vorbereitet (eine für die Zielreaktion und eine für die

Detektion der Hintergrundreaktion). Nach der Zentrifugation wurden 200 µl des

Überstandes in eine frische Rund-Boden-Mikrotiterplatte überführt und bei 4°C

gelagert. Nun wurden die Reaktionsplatten nacheinander mit Lysat versetzt (80 µl Lysat

auf 120 µl Reaktionsmix). Nach Zugabe des Substrates wurde die Abnahme des

Kofaktors NAD(P)H photometrisch bei λ = 340 nm verfolgt (25°C, t = 20 min, Δt = 20 s,

SPECTRAmax 340C Photometer Molecular Devices, Sunnyvale, US).

Aus den Messungen konnte nun für jede Variante sowohl die Gesamtaktivität für die

NAD(P)H-Abnahme, als auch die Hintergrundaktivität für die NAD(P)H-Abnahme

berechnet werden. Die Differenz dieser Steigungen kann auf die IRED-Aktivität

zurückgeführt werden.

Bei der Auswahl des Substrates ist zu beachten, dass insbesondere Carbonylsubstrate

wie z.B. Glyoxal oder Methylglyoxal sehr hohe Hintergrundaktivitäten im E. coli Lysat

aufweisen, was die Extraktion geringer IRED-Aktivitäten trotz optimiertem Screening-

System quasi unmöglich macht.

Tabelle 46: Komponenten und Endkonzentrationen der Screening-Reaktionsplatten für die Messung der NAD(P)H-Abnahme zur Identifizierung von IRED-Varianten mit höherer Aktivität, am Beispiel einer doppelten reduktiven Aminierung.

Reaktionsplatte Kontrollplatte

Komponente Endkonzentration Komponente Endkonzentration

Kpi-Puffer pH 7,0 50 mM Kpi-Puffer pH 7,0 50 mM

Diamin 5 mM Dicarbonyla 5 mM

Dicarbonyla 5 mM NAD(P)H 0,35 mM

NAD(P)H 0,35 mM Lysata Verhältnis 2:3

Lysata Verhältnis 2:3

a Zugabe kurz vor der Messung.

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Material und Methoden

54

3.8.3. Screening-System zur Identifizierung von IRED-Varianten mit geänderter Stereoselektivität

Das Screening-System zur Identifizierung von IRED-Varianten mit geänderter

Stereoselektivität im 96-well Format erfolgte mit Hilfe von Gaschromatographie (GC)

und einer chiralen Säule. Als Modellsubstrat zur Bestimmung der Stereoselektivität

wurde 2-Methylpyrrolin ausgewählt. Als Parent diente die R-IRED_Ms-Variante V8,

welche NADH-abhängig ist.[165] Zunächst wurden 96er Deep-Well-Platten (Ritter riplate

SW, 2 mL, Ritter GmbH, Schwabmünchen, DE) mit TB-Medium (600 µL pro well,

34 µg mL-1 Chloramphenicol) befüllt und mit Einzelkolonien der Mutanten-Bibliothek

beimpft. Diese Vorkulturplatte wurde bei 37°C und 320 rpm für etwa 8 h inkubiert

(Inkubationsschüttler HT Minitron, Infors AG, Bottmingen, CH). Mit der Vorkulturplatte

wurde anschließend eine Expressionsplatte (ebenfalls 96er Deep-Well-Platte)

angeimpft. Hierfür wurden 100 µl der Vorkultur auf je 900 µl TB-Medium (34 µg mL-1

Chloramphenicol, 0,022% w/v Arabinose) gegeben. Die Expression der R-IRED_Ms

Varianten erfolgte bei 25°C und 800 rpm für 22 h (TiMix Control mit TH30-Thermostat,

Edmund Bühler GmbH, Hechingen, DE). Anschließend wurden die Zellen durch

Zentrifugation (4°C, 15 min, 3220 g, Zentrifuge: 5810 R, Rotor: A-4-62, Eppendorf AG,

Hamburg, DE) geerntet und die Zellpellets über Nacht bei -80°C tiefgefroren. Für den

enzymatischen Zellaufschluss wurden die Pellets mit 400 µl Lysepuffer (50 mM Kpi-

Puffer, pH 7,0, 400 µg mL-1 Lysozym, 5 µg mL-1 DNAseI) resuspendiert und für 60 min

bei 37°C und 180 rpm (Inkubationsschüttler Multitron/Pro, Infors AG, Bottmingen, CH)

inkubiert. Zur Abtrennung der unlöslichen Bestandteile wurde die Deep-Well-Platte für

30 min zentrifugiert (4°C, 3220 g, Zentrifuge: 5810 R, Rotor: A-4-62, Eppendorf AG,

Hamburg, DE). Während der Zentrifugation wurde je eine Reaktionsplatte

vorbereitet (Tab. 47). Nach der Zentrifugation wurden 150 µl des Überstandes in die

Reaktionsplatte gegeben, welche zuvor mit 50 µl Reaktionsmix versetzt wurde. Die

Biotransformation von 2-Methylpyrrolin erfolgte für 4 h bei 25°C und 180 rpm

(Inkubationsschüttler Multitron/Pro, Infors AG, Bottmingen, CH).

Nach 4 h wurde die Biotransformation durch Zugabe von 20 µl NaOH (5M) gestoppt.

Anschließend folgte die Derivatisierung und Extraktion durch Zugabe von 250 µl

Derivatisierungsmix (MTBE, 4 µl mL-1 Essigsäureanhydrid). Da die zur Verfügung

stehenden Abdichtungsvorrichtungen für Deep-Well-Platten nicht dicht genug waren

um beim Schütteln von MTBE dem Dampfdruck Stand zu halten, wurde auf Schütteln

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Material und Methoden

55

verzichtet. Stattdessen wurden die Phasen durch auf- und abpipettieren (10 Mal mit

400 µl) durchmischt. Anschließend erfolgte die Zugabe von 50 µl 4%iger, wässriger

Methylamin-Lösung um das überschüssige Essigsäureanhydrid zu quenchen.

Anschließend wurde die organische Phase durch Zugabe von 750 µl MTBE vergrößert.

Erneut wurden die Phasen mit der Pipette durchmischt (8 Mal mit 1000 µl).

Anschließend wurden die Phasen durch Zentrifugation getrennt (4°C, 4 min, 3220 g,

Zentrifuge: 5810 R, Rotor: A-4-62, Eppendorf AG, Hamburg, DE). 200 µl der organischen

Phase (oben) wurden in GC-Glasgefäße mit Glaseinsatz überführt und gasdicht

verschlossen. Die Trennung und Analyse der gebildeten Produktenantiomere erfolgte

mit chiraler GC.

Tabelle 47: Komponenten und Konzentrationen der Screening-Reaktionsplatten für die Identifizierung von IRED-Varianten mit geänderter Stereoselektivität.

Komponente Konzentration im Reaktionsmix Endkonzentration

Kpi-Puffer pH 7,0 50 mM 50 mM

Methylpyrrolin 40 mM 10 mM

NADH 8 mM 2 mM

MgCl2 10 mM 2,5 mM

G6PDH 2,4 U mL-1 0,6 U mL-1

Lysat --- Verhältnis 3:1

3.9. Analytische Methoden

Für die qualitative und quantitative Analyse gebildeter Produkte wurden

unterschiedliche analytische Methoden eingesetzt. Die Auftrennung der aufgearbeiteten

Proben erfolgte chromatographisch mittels Gaschromatographie (GC) oder

Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC). Für die qualitative Analyse der

Produktpeaks wurden Masse-Detektoren (GC-MS / LC-MS) verwendet. Für die

quantitative Analyse der Produktpeaks wurde ein Flammenionisations-Detektor (GC-

FID) oder ein Diodenarray-Detektor (HPLC-DAD) verwendet.

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Material und Methoden

56

3.9.1. Gaschromatographie (GC)

Die meisten Produkte wurden mittels Gaschromatographie analysiert. Voraussetzung

hierfür war, dass der Analyt spätestens nach einer Derivatisierung in eine organische

Phase extrahiert werden kann. Außerdem musste der Siedepunkt je nach verwendeter

Säule unterhalb von 320°C bzw. unterhalb von 220°C (chirale GC) liegen. Im Folgenden

sind die verwendeten Gaschromatographen und Detektoren (Tab. 48), sowie die

verwendeten GC-Säulen (Tab. 49) und die verwendeten Methoden (Tab. 50) gezeigt. In

(Tab. 50) sind die analysierten Produkte mit Zuordnung einer Methode aufgelistet.

Tabelle 48: Verwendete Gaschromatographen.

Nummer Gaschromatograph Detektor Sampler

1 Shimadzu GC-2010 (Kyōto, JP)

FID (integriert) Shimadzu AoC-20

2 Agilent GC 7890A (Waldbronn, DE)

MSa+FID (Agilent 5975C Series MSD)

Autosampler 7693

3 Agilent GC 7820A (Waldbronn, DE)

MSa (5977B MSD) PAL RSI 120

a Quadrupol-Technologie mit Elektronenspray-Ionisation (70 eV), Scan-Modus (40-400 m z-1).

Tabelle 49: Verwendete GC-Säulen.

Nummer Säule Länge/Durchmesser/ Flüssigkeitsfilm Material

1 HP-1ms UI, Agilent

30 m / 250 µm / 0.25 µm

100% Dimethylpolysiloxan

2 DB-5, Agilent 30 m / 250 µm / 0.25 µm

5% Phenyl-, 95% Dimethylpolysiloxan

3 ZB-5, Phenomenex

30 m / 250 µm / 0.25 µm

5% Phenyl-, 95% Dimethylpolysiloxan

4 Beta-DEX 225, Supelco

30 m / 250 µm / 0.25 µm

25% 2,3-di-O-acetyl-6-O-TBDMS-ß-cyclodextrin in SPB-20 poly(20% Phenyl 80% Dimethylpolysiloxan)

5 CP-Chirasil-DEX CB, Agilent

30 m / 250 µm / 0.25 µm

Cyclodextrin gebunden an Dimethylpolysiloxan

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Material und Methoden

57

Tabelle 50: Verwendete GC-Methoden und Temperaturprogramme.

Nr. Temperaturprogramm Säule GC Split Temperatur Heizrate Temperatur Haltezeit Injektor Detektor

1 -

8°C min-1 50°C min-1

100°C 130°C 200°C

1 min - -

1, 3 1 5 250 330

2 - 40°C 5 min 3 1 5 250 330

3

- 40°C min-1 2,5°C min-1

20°C min-1

50°C min-1

100°C 150°C 170°C 200°C 260°C

1 min - - -

2 min

1,3 1 5 250 330

4

- 40°C min-1 2,5°C min-1

50°C min-1

100°C 155°C 165°C 300°C

- - -

2 min

1 1 5 250 330

5 -

20°C min-1 50°C min-1

50°C 90°C

200°C

1 min - -

1 1 5 250 330

6

- 50°C min-1 10°C min-1

50°C min-1

120°C 200°C 230°C 300°C

- - -

2 min

3 1 10 250 330

7

- 40°C min-1 4°C min-1

50°C min-1

100°C 260°C 290°C 320°C

1 min - -

2 min

1,3 1 5 250 330

8 - 150°C 8 min 1 1 15 250 330

9

- 20°C min-1 10°C min-1

50°C min-1

100°C 150°C 200°C 320°C

1 min - -

2 min

1 1 5 250 330

10 -

25°C min-1 100°C 320°C

1 min 2,5 min 2 2,3 5 250 330

11 -

20°C min-1 50°C min-1

50°C 150°C 320°C

2 min -

2,5 min 2 2,3 5 250 330

12 - 153 7,5 min 4 1 10 225 225 13 - 142 15 min 4 1 10 225 225

14

- 50°C min-1 1,5°C min-1

50°C min-1

100°C 130°C 150°C 220°C

2 min - -

1 min

4 1 15 250 255

15 -

50°C min-1 5°C min-1

120°C 180°C 200°C

2 min -

2 min 5 1 40 225 225

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Material und Methoden

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Tabelle 51: Zuordnung der analysierten Produkte zu den beschriebenen Methoden.

Quantitative Analyse

Produkte Derivatisierunga Methode

Pyrrolidin, 2-Methylpyrrolidin, Piperidin, 2-Methylpiperidin, 3- Methylpiperidin

Ja 1

N-Methylpyrrolidin Nein 2

Piperazin, N-Methylpiperazin, N-Ethylpiperazin, N-Isopropylpiperazin, 2,5-Dimethylpiperazin, Octahydro-2H-pyrido[1,2-a]pyrazin

Ja 3

2-Methylpiperazin Ja 4

1,4-Dimethylpiperazin Nein 5

2-Hydroxymethylpiperazin Ja 6

2-Phenylpiperazin, N-Methyl-3-phenylpiperazin Ja 7

2-Phenylpiperazin, N-Methyl-3-phenylpiperazin Nein 8

Homopiperazin Ja 9

Qualitative Analyse und Produktidentifizierung

Produkte Derivatisierunga Methode

Alle Piperazinprodukte außer solche, die an beiden Stickstoffen eine Substitution aufweisen

Ja 10

Alle zyklischen Hydrazine Ja 10

N-Benzyl-3-phenylpiperazin, N-Benzyl-Decahydroquinoxalin, Tetradecahydrophenazin, 2-(6-methoxy-2-naphthyl)piperazin, 6b,7,8,9,10,10a-hexahydroacenaphtho[1,2-b]pyrazin

Nein 10

Piperazine mit Substitutionen an beiden Stickstoffen Nein 11

Chirale Analyse

Produkte Derivatisierunga Methode

R/S-2-Methylpyrrolidin (Screening) Ja 12

R/S-2-Methylpyrrolidin Ja 13

R/S-2-Methylpiperidin, R/S-3-Methylpiperidin Ja 14

R/S-N-Methyl-3-phenylpiperazin Ja 15 a Derivatisierung erfolgte mit Essigsäureanhydrid

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Material und Methoden

59

3.9.2. Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC)

Für ein paar wenige Produkte war eine Analyse mittels GC nicht möglich oder nicht

zufriedenstellend. Insbesondere die Auftrennung der Enantiomere von

2-Methylpiperazin, 2-Phenylpiperazin und 2-Hydroxymethylpiperazin war mittels

chiraler GC nicht erfolgreich. Bei diesen Produkten wurde die Bestimmung des

Enantiomerenüberschuss (ee) deshalb mit einer HPLC (Normalphase) durchgeführt.

Hierfür wurde ein HPLC-System von Agilent verwendet (Agilent 1200 series,

Waldbronn, DE; Ausstattung: Degaser G1322A, quaternäres Pumpensystem G1311A,

Säulenthermostat G1316A, Autosampler G1329A, Dionenarray-Detektor (DAD)

G1315D). Für die Trennung der Enantiomere wurde eine Chiraalpak IC Säule (Länge:

250 mm, Durchmesser: 4,6 mm, Porengröße: 5 µm, Daicel, Osaka, JPN) eingesetzt. Die

Säule wurde auf 20°C temperiert, als Laufmittel wurde eine Mischung aus Cyclohexan,

Ethanol und Diethylamin (75%, 24,8%, 0,2% v/v) isokratisch verwendet. Die Trennung

erfolgte innerhalb von 25 min mit einer Flussrate von 0,7 mL min-1.[166]

Die Analyse von Ethambutol erfolgte mittels LC-MS (Umkehrphase). Hierfür wurde

ebenfalls ein LC-System von Agilent verwendet (Agilent 1260 series, Waldbronn, DE;

Ausstattung: Degaser G4225A, quaternäres Pumpensystem G1312B, Säulenthermostat

G1316A, Autosampler G1367E, Massen-Detektor (MS) 6130 Quadrupol MS). Es wurde

eine Kinetex HILIC Säule (Länge: 50 mm, Durchmesser: 2,1 mm, Porengröße: 1,7 µm,

Phenomenex, Aschaffenburg, DE) verwendet. Die Säule wurde auf 40°C temperiert, als

Laufmittel wurde eine Mischung aus H2O und Acetonitril (ACN) eingesetzt. Die

Trennung erfolgte innerhalb von 30 min unter Anwendung eines

Konzentrationsgradienten (Tab. 52) und mit einer konstanten Flussrate von 0,5 mL min-

1. Der MS-Detektor wurde mit einer positiven Ionisierung (3500 V) im Scan-Modus (50-

400 m z-1) betrieben.

Tabelle 52: Konzentrationsgradient des LC-MS-Programms zur Analyse von Ethambutol.

Gradient [% min-1] ACN [%] Haltezeit

- 98 3 min

4,4 10 2 min

- 98 5 min

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Material und Methoden

60

3.10. Bioinformatische Methoden

3.10.1. Erstellung eines Homologiemodells

Die Erstellung von Homolgiemodellen erfolgte mithilfe des Swiss-Model Servers[167,168].

In einem Online-Tool (https://swissmodel.expasy.org/) wurde die Aminosäuresequenz

im FASTA-Format eingefügt. Die Ermittlung eines geeigneten Templats für die

Modellierung war ebenfalls in diesem Tool enthalten und basierte auf einer möglichst

hohen Aminosäuresequenzidentität. Die Generierung des 3D-Homologiemodells

basierte auf der Kristallstruktur des Templats.

3.10.2. Docking, Energieminimierung und MD-refinements mit Yasara

Die Dockingstudien mit NADH und den R-IRED_Ms-Varianten wurden mit Yasara[169]

durchgeführt. Hierfür wurde für die Enzymvarianten jeweils ein Homologiemodell

erstellt (Kap. 3.10.1). NADPH wurde mit einem Strukturalignment mit PyMol in das

Homologiemodell eingefügt und anschließend wurde die Phosphat-Gruppe durch eine

Hydroxygruppe ersetzt. Anschließend wurden getrennte pdb-Dateien für das Enzym

und NADH erstellt. Die Enzym pdb-Datei wurde mit Yasara in einer mit Wasser gefüllten

Simulationsbox energieminimiert (YAMBER3 Kraftfeld). Anschließend wurde ein

Docking mit NADH und der energieminimierten Enzymvariante durchgeführt. Das beste

Docking-Ergebnis wurde anschließend erneut energieminimiert und unter Anwendung

eines sogenannten MD-refinement simuliert (0,5 ns, YAMBER3 Kraftfeld).

3.10.3. Multisequenzalignments

Zur Identifizierung konservierter Aminosäurepositionen wurden Multisequenz-

alignments mit Clustal Omega[170] (https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/)

erstellt. Hochkonservierte Positionen, sowie funktionell konservierte Positionen wurden

automatisch gekennzeichnet.

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Material und Methoden

61

3.10.4. Strukturalignments

Für einen strukturellen Vergleich verschiedener IREDs wurden Strukturalignments mit

der freien Software PyMol (The PyMOL Molecular Graphics System, Version 1.2r1,

Schrödinger, LLC) durchgeführt. Hierbei werden die Strukturen so übereinandergelegt,

dass die Summe aller räumlichen Abstände zwischen den Strukturen minimal ist.

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Ergebnisse

62

4. Ergebnisse

4.1. Asymmetrische Reduktion von zyklischen Iminen

Eine zentrale Aktivität von IREDs ist die asymmetrische Reduktion von zyklischen

Iminen zur Generierung von chiralen zyklischen Aminen. Jedoch wurde bislang nur ein

schmales Substratspektrum für diese Art von Reaktion publiziert. Um neue IREDs mit

neuen Aktivitäten zu identifizieren wurden in Vorarbeiten mit GSK (Glaxo Smith Kline

GmbH, Brentford, UK) 35 verschiedene IREDs mit 347 Iminsubstraten getestet (Daten

sind nicht veröffentlicht). Dabei konnte für 122 Substrate eine Aktivität nachgewiesen

werden. Das Substratspektrum dieser Enzymfamilie geht also weit über das hinaus, was

bislang beschrieben wurde. Jedoch waren die Substratspektren von Enzym zu Enzym

sehr unterschiedlich, wobei eine IRED, die R-selektive IRED aus Myxococcus stipitatus

(R-IRED_Ms), ein besonders breites Substratspektrum zeigte.

Da die Entwicklung neuer IRED katalysierter Reaktionen und die Verwendung neuer

Substrate im Fokus dieser Arbeit stand, wurde diese vielversprechende IRED für die

weiteren Arbeiten ausgewählt.

4.1.1. Vergleich der kinetischen Parameter von R-IRED_Ms mit R-IRED_Sr für

Modellsubstrate

Um ein erstes Bild der katalytischen Eigenschaften von R-IRED_Ms zu gewinnen, wurden

die kinetischen Parameter für einige Modellsubstrate untersucht (Tab. 53). Die Analyse

zeigt, dass substituierte Pipereidine (2-4) deutlich effizienter reduziert werden als

Methylpyrroline (1) und Dihydroisoquinoline (5-6). Auffallend ist der relativ hohe

Km-Wert (1,0 mM) bezüglich 1 und die starke Substratüberschuss-inhibierung

(KI = 0,21 mM) bei der Verwendung von Dihydroisoquinolin (5).

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Ergebnisse

63

Tabelle 53: Kinetische Parameter von R-IRED_Ms für ausgewählte Iminsubstrate.

Substrat Produkt Km kcat KI kcat Km-1

mM s-1 mM mM-1 s-1

1,0 2,3 20 2,2

0,10 1,5 --- 15

0,34 2,7 4 7,9

0,84 4,8 --- 5,7

0,29 0,9 0,21 3,1

0,11 0,04 13 0,36

4.1.2. Testen neuer Iminsubstrate

Das breite Subtratspektrum von R-IRED_Ms gegenüber Iminen (GSK-Screening), sowie

die Bestätigung einer guten katalytischen Effizienz gegenüber Modell-Iminsubstraten

gab Anlass für die Untersuchung weiterer, anspruchsvoller Iminsubstrate, für welche

bislang keine IRED Aktivitäten beschrieben wurden. Verschiedene 5-, 6- und 7-gliedrige

zyklische Imine wurden getestet. Dabei wurden solche Verbindungen ausgewählt, bei

denen ein zweiter Stickstoff (13-23) oder ein anderes zweites Heteroatom (24-26)

enthalten war (Abb. 11).

Abbildung 11: Getestete 5- und 6- und 7-gliedrige zyklische Iminsubstrate mit je zwei enthaltenen Heteroatomen pro Heterozyklus. Verbindungen 17 und 19 wurden im Rahmen der Masterarbeit von Sebastian Gergel synthetisiert.[171]

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Ergebnisse

64

Von diesen 14 getesteten Verbindungen wurden vier Verbindungen erfolgreich

umgesetzt (19, 20, 25 und 26). Aus der beobachteten NADPH-Abnahme wurde die

Wechselzahl oder kurz TOF (engl. für turnover frequency) berechnet, welche ein Maß für

die Enzymaktivität ist (Tab. 54). Zum Vergleich wurde die Aktivität unter gleichen

Bedingungen für das Modellsubstrat 2-Methylpyrrolin (1) gemessen.

Tabelle 54: Gemessene Aktivitäten (TOF) für die Reduktion von neuen Iminsubstraten mit R-IRED_Ms. Zum Vergleich wurde die Aktivität unter gleichen Bedingungen für das Modellsubstrat 2-Methylpyrrolin (1) gemessen.

Imin- substrat

Erwartetes Produkt

Aktivität (TOF)

120 ± 4 min-1

22,8 ± 0,2 min-1

0,035 ± 0,001 min-1

5,9 ± 0,2 min-1

118 ± 8 min-1

Die angegebene Standardabweichung bezieht sich auf eine Dreifachbestimmung.

4.2. Reduktive Aminierung

Eine weitere interessante Fähigkeit von IREDs ist die reduktive Aminierung. Hierbei

wird ein Carbonylsubstrat mit einem Aminsubstrat kombiniert. Die spontane Bildung

eines Imin-Intermediates und die anschließende IRED katalysierte Reduktion

ermöglicht die Verknüpfung beider Substrate zu einem Aminprodukt. Diese Art der

Reaktion eröffnet den Zugang zu einer Vielzahl von chiralen Aminen. Jedoch können mit

dieser Methode keine N-Heterozyklen gebildet werden, da beide Substrate linear

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Ergebnisse

65

miteinander verknüpft werden. Deshalb stand die (einfache) reduktive Aminierung

nicht im Hauptfokus dieser Arbeit.

4.2.1. Reduktive Aminierung mit ausgewählten Beispielsubstraten

Um die Anwendbarkeit der R-IRED_Ms im Bereich der reduktiven Aminierung grob

einschätzen zu können wurde die Aktivität für ein paar ausgewählte reduktive

Aminierungen bestimmt. Zuvor wurde das pH-Optimum für die reduktive Aminierung

untersucht. Interessanter Weise lag das pH-Optimum wie auch bei der Reduktion von

zyklischen Iminen bei pH 7,0. Die meisten IREDs benötigen höhere pH-Werte um eine

optimale Katalyse der reduktiven Aminierung zu erreichen.[128,130] Fünf verschiedene

Substratkombinationen wurden mit R-IRED_Ms getestet (Tab. 55).

Tabelle 55: Gemessene Enzymaktivitäten mit R-IRED_Ms für die reduktive Aminierung mit ausgewählten Substratkombinationen.

Nr. Carbonyl-substrata

Amin-substrata

Erwartetes Produkt

Aktivität (TOF)

A

50,2 ± 0,5 min-1

B

22,9 ± 0,1 min-1

C

0,020 ± 0,003 min-1

D

0,44 ± 0,03 min-1

E

---

a Carbonyl- und Aminsubstrate wurden im Verhältnis1:5 eingesetzt. --- keine Aktivität beobachtet Die angegebene Standardabweichung bezieht sich auf eine Dreifachbestimmung.

Die höchsten Aktivitäten wurden bei Substratkombinationen A und B gemessen. Dies

zeigt, dass sowohl Ketone als auch Aldehyde mit R-IRED_Ms gut reduktiv aminiert

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Ergebnisse

66

werden können. Die Aktivität gegenüber Ketonen mit aromatischem Rest (33, 34) war

insgesamt deutlich schwächer. Vor allem Acetophenon (33) wurde kaum umgesetzt. Die

Bildung des Antihistamins Cyclizin (42) gelang nicht.

4.2.2. Erweiterung des Substratspektrums durch Verwendung von Hydrazinen

Nachdem bereits die Reduktion eines zyklischen Hydrazons (Kap. 4.1.2), (20)

erfolgreich gezeigt werden konnte, stellte sich die Frage ob sich Hydrazine für die

reduktive Aminierung eignen. Hierbei würde sich aus dem Carbonylsubstrat und dem

Hydrazinsubstrat ein Hydrazon-Intermediat bilden, welches anschließend durch

R-IRED_Ms zu einem verknüpften Hydrazin reduziert werden könnte. Diese Art der

reduktiven Aminierung mit Hydrazinen wird im Folgenden „reduktive Hydrazinierung“

genannt, da kein Amin sondern ein Hydrazin aus der Reaktion hervor geht.

Auch mit dieser Reaktion können keine N-Heterozyklen gebildet werden. Jedoch handelt

es sich um eine neue enzymatische Aktivität. Deshalb wurde die reduktive

Hydrazinierung etwas ausführlicher untersucht. Wieder war eine Optimierung der

Reaktionsparameter notwendig. Die höchste Aktivität wurde bei pH 6,0 im Kpi-Puffer

beobachtet. Zunächst wurden 29 Carbonylsubstrate mit Methylhydrazin kombiniert und

die Aktivität photometrisch bestimmt (Tab. 56-59).

Tabelle 56: Gemessene Aktivitäten für die reduktive Hydrazinierung von linearen und verzweigten aliphatischen Aldehyden mit Methylhydrazin (43).

Aldehyd (linear)

Aktivität (TOF)

Aldehyd (verzweigt)

Aktivität (TOF)

--- 0,74 ± 0,02 min-1

6,9 ± 0,4 min-1 0,72 ± 0,04 min-1

9,0 ± 0,3 min-1 1,19 ± 0,06 min-1

6,3 ± 0,6 min-1

0,54 ± 0,05 min-1

0,64 ± 0,10 min-1 Methylhydrazin

--- keine Aktivität beobachtet. Die angegebene Standardabweichung bezieht sich auf eine Dreifachbestimmung.

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Ergebnisse

67

Tabelle 57: Gemessene Aktivitäten für die reduktive Hydrazinierung von linearen und verzweigten aliphatischen Ketonen mit Methylhydrazin (36).

Keton (linear)

Aktivität (TOF)

Keton (verzweigt)

Aktivität (TOF)

0,31 ± 0,03 min-1

0,12 ± 0,01 min-1

1,3 ± 0,2 min-1 0,08 ± 0,02 min-1

0,24 ± 0,02 min-1 0,08 ± 0,01 min-1

0,55 ± 0,03 min-1

Die angegebene Standardabweichung bezieht sich auf eine Dreifachbestimmung.

Tabelle 58: Gemessene Aktivitäten für die reduktive Hydrazinierung von zyklischen und Hydroxy-funktionalisierten Ketonen mit Methylhydrazin (36).

Keton (zyklisch)

Aktivität (TOF)

Keton (mit Hydroxygruppe)

Aktivität (TOF)

0,31 ± 0,04 min-1

0,27 ± 0,02 min-1

0,57 ± 0,08 min-1 0,18 ± 0,01 min-1

36 ± 2 min-1 ---

0,16 ± 0,05 min-1

--- keine Aktivität beobachtet. Die angegebene Standardabweichung bezieht sich auf eine Dreifachbestimmung.

Tabelle 59: Gemessene Aktivitäten für die reduktive Hydrazinierung von aromatischen Aldehyden und Ketonen mit Methylhydrazin (36).

Arylaldehyd Aktivität (TOF)

Arylketon Aktivität (TOF)

---

---

--- 0,83 ± 0,17 min-1

--- 0,51 ± 0,15 min-1

--- keine Aktivität beobachtet. Die angegebene Standardabweichung bezieht sich auf eine Dreifachbestimmung.

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Ergebnisse

68

Die gemessenen Aktivitäten zeigen, dass verzweigte Carbonylsubstrate schlechter

umgesetzt werden als lineare. Des Weiteren werden lineare aliphatische Aldehyde

besser reduktiv hydraziniert als lineare aliphatische Ketone. Die optimale Kettenlänge

für lineare aliphatische Aldehyde liegt bei 3-5 Kohlenstoffen mit einer maximalen

Aktivität von 9 min-1 (TOF) mit n-Butanal (32). Bei den linearen aliphatischen Ketonen

zeigte ebenfalls das C4-Substrat (53) das beste Ergebnis (TOF = 1,3 min-1). Verzweigte

(56-58) und Hydroxy-funktionalisierte Ketone (62-64) hingegen zeigten nur schwache

Aktivitäten unterhalb von 0,3 min-1 (TOF). Bei zyklischen Ketonen konnte der Sechsring

(31) deutlich besser umgesetzt werden als der 4- oder 5-Ring (59, 60). Mit 31 wurde

außerdem im Rahmen dieses Substratscreenings die höchste Aktivität gemessen

(TOF = 36 min-1). Die Verwendung eines ähnlichen Substrates mit einer konjugierten

Doppelbindung (61) zeigte trotz der sterischen Ähnlichkeit kaum Aktivität. Im Vergleich

zu aliphatischen Substraten wurden aromatische Aldehyde und Ketone nur schlecht

umgesetzt. Mit Benzaldehyd (65) und Acetophenon (33) wurde keine Aktivität

beobachtet. Mit den Ketonen 34 und 68 wurde eine geringe Aktivität von 0,83 bzw.

0,51 min-1 (TOF) detektiert.

Neben Methylhydrazin (43) wurde ein weiteres Hydrazin getestet. Da Hydrazine sehr

giftig und hoch reaktiv sind wurde ein zyklisches Hydrazin (Hexahydropyridazin, 69)

ausgewählt, das weniger reaktiv und weniger giftig ist. Auch mit 69 wurden einige

Carbonyle getestet, jedoch zeigte die Negativkontrolle ohne Carbonylsubstrat eine

starke NADPH-Abnahme. Es fand also eine Reaktion zwischen NADPH und 69 statt, die

das Signal überdeckte. Eine photometrische Analyse war deshalb nicht möglich.

Stattdessen wurden zwei verschiedene Biotransformationen durchgeführt um eine

entsprechende Hydrazinierung mit 69 mittels GC-MS zu bestätigen (Tab. 60).

Für alle getesteten Substratkombinationen konnte eine reduktive Hydrazinierung

mittels GC-MS erfolgreich bestätigt werden. Theoretisch ist eine IRED katalysierte

Weiterreaktion des Produktes mit dem Carbonylsubstrat denkbar, jedoch wurde dies

nur bei einer Substratkombination (32 mit 69) beobachtet. Hier fand zu einem geringen

Teil (≈ 1%) eine zweite reduktive Hydrazinierung mit 32 und dem bereits gebildeten

Produkt 75a statt, sodass 75b gebildet wurde.

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Ergebnisse

69

Tabelle 60: Analysierte Biotransformationen für die reduktive Hydrazinierung von Carbonylen mit Hydrazinen. Die abgebildeten Produkte konnten erfolgreich mit einem Massendetektor identifiziert werden. Die Peakfläche der Produktpeaks ist in Flächeneinheiten (FE) angegeben.

Carbonyl-substrata

Hydrazin-substrata

Erwartetes Produkt

Peakfläche (GC-MS)b (x1.000.000 FE)

20,4

23,1

49,7

155,8

5,4

100,5 1,1

a Carbonyl- und Aminsubstrate wurden im Verhältnis 1:2 eingesetzt. b Produktpeaks wurden anhand der Molmasse des acetylierten Produkts, sowie dessen Fragmentierungsmuster identifiziert.

4.3. Doppelte reduktive Aminierung

Die Bildung eines N-Heterozyklus unter Anwendung einer intermolekularen einfachen

reduktiven Aminierung ist nicht möglich, da hierfür mindestens zwei Bindungen

geknüpft werden müssen. Es wurde deshalb untersucht, ob eine doppelte reduktive

Aminierung möglich ist, bei der zwei C-N-Bindungen geknüpft werden. In Abbildung 12

sind zwei verschiedene Möglichkeiten für eine solche Reaktion gezeigt. Zum einen

könnte eine Aminocarbonyl-Verbindung verwendet werden (A), die mit sich selbst

zweimal verknüpft wird. Jedoch sind solche Substrate in der Regel instabil und es gibt

nur wenige kommerziell erhältliche Substrate mit einem Aminocarbonyl-Motiv. Des

Weiteren ist mit dieser Reaktion nur die Bildung von symmetrisch substituierten

N-Heterozyklen möglich, was die Anwendbarkeit erheblich einschränkt. Alternativ

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Ergebnisse

70

könnten Dicarbonyle mit Diaminen kombiniert werden (B). Beide Substratgruppen sind

stabil und kommerziell verfügbar. Durch die Kombination von verschieden

substituierten Substraten ist die Bildung von asymmetrisch substituierten Piperazinen

oder Homopiperazinen möglich.

Abbildung 12: Möglichkeiten für die doppelte reduktive Aminierung. A) Verwendung von Aminocarbonylen zur Bildung von symmetrisch substituierten N-Heterozyklen am Beispiel von einfach-substituierten Substraten. B) Verwendung von Dicarbonylen und Diaminen zur Bildung von asymmetrisch substituierten N-Heterozyklen am Beispiel von einfach-substituierten Dicarbonylen mit nicht-substituierten Diaminen.

Wegen der klaren Vorteile von Möglichkeit B gegenüber Möglichkeit A wurden

hauptsächlich Reaktionen des Typs B untersucht. Eine Aktivität von R-IRED_Ms

gegenüber Reaktionstyp A wurde lediglich an drei Beispielsubstraten (76-78)

getestet (Tab. 61), jedoch konnte bei diesen Substraten kaum eine Aktivität und keine

Produktbildung beobachtet werden.

Tabelle 61: Getestete Aminocarbonylsubstrate für die R-IRED_Ms katalysierte doppelte reduktive Aminierung zur Bildung symmetrisch substituierter Piperazin Heterozyklen.

Aminocarbonyl-substrat

Erwartetes Produkt

Aktivität (TOFNADPH )

Produkt-bildung

0,004 ± 0,0001 min-1 ---

--- ---

--- ---

--- keine Aktivität bzw. Produktbildung beobachtet. Die angegebene Standardabweichung bezieht sich auf eine Dreifachbestimmung.

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Ergebnisse

71

Im nächsten Schritt sollte die doppelte reduktive Aminierung mit Dicarbonylen und

Diaminen getestet werden. Hierfür wurde zunächst Glyoxal (82) mit Ethylendiamin (83)

kombiniert um die Bildung von Piperazin (84) zu ermöglichen. Dabei wurde eine starke

R-IRED_Ms Aktivität in Form einer NADPH-Abnahme beobachtet (Abb. 13) und durch

entsprechende Kontrollen bestätigt. Das Signal bei λ = 340 nm wurde bei längeren

Messungen durch die Bildung eines absorptiven Nebenprodukts überlagert. Durch die

Wahl einer geeigneten Enzym- und Substratkonzentration wurde ein Absorptionssignal

erhalten, welches zunächst durch die IRED-Aktivität (NADPH-Abnahme) dominiert wird,

und schließlich, nach Verbrauch von NADPH den Anstieg des gebildeten

Nebenproduktes zeigt.

Abbildung 13: Photometrischer Nachweis der R-IRED_Ms Aktivität (P1) für die doppelte reduktive Aminierung mit Glyoxal (82) und Ethylendiamin (83), sowie verschiedene Kontrollmessungen (K1-K4). K1 = Kontrolle ohne Enzym; K2 = Kontrolle ohne Glyoxal; K3 = Kontrolle ohne Ethylendiamin; K4 = Kontrolle ohne NADPH.

Mit diesem Test konnte zwar die Aktivität mit 82 und 83 eindeutig nachgewiesen

werden, jedoch musste noch überprüft werden, ob eine einfache oder eine doppelte

reduktive Aminierung katalysiert wird. Es wurde deshalb eine Biotransformation

durchgeführt um die Bildung von 84 mittels GC-MS zu bestätigen. Die Messung zeigte,

0

0,5

1

1,5

2

2,5

0 5 10 15 20 25 30

Ab

sorp

tio

n b

ei

34

0 n

m [

AU

]

Reaktionszeit [min]

K1

K2

K3

K4

P1

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Ergebnisse

72

dass die eingesetzten Substrate erfolgreich zu 84 umgesetzt wurden. Die beobachtete

NADPH-Abnahme basiert demnach auf einer doppelten reduktiven Aminierung,

wenngleich nicht gesagt werden kann, ob die beobachtete Steigung die Aktivität beider

Reduktionsschritte repräsentiert oder nur die Aktivität des ersten Reduktionsschrittes.

Dies hängt davon ab, welcher Reduktionsschritt der ratenbegrenzte Schritt ist.

Theoretisch ist eine nachfolgende reduktive Aminierung zwischen dem

Piperazinprodukt und dem Carbonylsubstrat denkbar, welche zu ungewollten

Nebenprodukten führen würde. Dies wurde jedoch nicht beobachtet. Eine

entsprechende Aktivität konnte außerdem in einer Kontrollreaktion mit Glyoxal (82)

und Piperazin (84) ausgeschlossen werden, bei der keine NADPH-Abnahme beobachtet

wurde.

4.3.1. Studien zur Aufklärung des Reaktionsweges

Für die doppelte reduktive Aminierung sind zwei verschiedene Reaktionswege (A, B)

denkbar (Abb. 14). In Reaktionsweg A wird das erste Imin-Intermediat (I-1) zuerst

mittels IRED reduziert, sodass ein nicht-zyklisches Amin-Intermediat (I-2a) entsteht.

Anschließend folgt eine zweite Kondensationsreaktion zu I-3-1. Dieses Intermediat

steht durch Imin-Enamin-Tautomerie im Gleichgewicht mit I-3-2 und I-3-3. Ausgehend

von I-3-1 oder I-3-3 folgt die finale IRED katalysierte Reduktion zur Bildung des

Piperazinproduktes. In Reaktionsweg B finden zuerst beide Kondensationsreaktionen

statt, sodass ein zyklisches Diimin-Intermediat (I-2b) gebildet wird. Anschließend folgt

die IRED katalysierte Reduktion zu I-3-1. Der letzte Reduktionsschritt zur Bildung des

Piperazinproduktes läuft identisch ab zu Reaktionsweg A ab.

Einen Nachweis zu finden, ob R-IRED_Ms Reaktionsweg A oder B bevorzugt ist nicht

trivial, da alle Reaktionen im Gleichgewicht miteinander stehen. Die Intermediate I-2a

und I-2b können deshalb auch im jeweils anderen Reaktionsweg auftreten, ohne dass

sie zur Reaktion beitragen. Der Nachweis von Intermediaten liefert deshalb keinen

Beweis für einen bestimmten Reaktionsweg. Um dennoch einen Hinweis für den

präferierten Reaktionsweg zu bekommen wurde im Rahmen der Masterarbeit von

Sebastian Gergel[171] ein Diimin-Intermediat (I-2b) synthetisiert, dessen Gleichgewicht

stark auf der Seite des Diimins liegt. Hierfür wurde 5,6-Dimethyl-2,3-dihydropyrazin

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Ergebnisse

73

(17) ausgewählt. Durch den +I-Effekt der beiden Methylgruppen liegt das

Hydrolysegleichgewicht stärker auf Seiten des Diimins. Ein weiterer Vorteil dieser

Verbindung ist, dass die beiden Methyl-Substituenten die Bildung von Nebenprodukten

während der Synthese stark reduzieren.

Abbildung 14: Mögliche Reaktionswege für die doppelte reduktive Aminierung, am Beispiel der Bildung von substituierten Piperazinen.[172] In Reaktionsweg A laufen zwei aufeinanderfolgende reduktive Aminierungen ab, wobei die erste intermolekular ist und die zweite intramolekular. In Reaktionsweg B finden zuerst beide Kondensationsreaktionen statt zur Bildung eines zyklischen Diimins. Anschließend folgen zwei Reduktionsschritte zur Bildung des Piperazinproduktes.

Durch die Messung der Aktivitäten mit I-2b (17) im Vergleich zu den

Ausgangssubstraten (85 mit 83) kann die Präferenz des Enzymes zumindest für diese

Substratkombination beurteilt werden (Tab. 62). Interessanterweise konnte keine

Aktivität für die Reduktion des Diimin-Intermediates (17) festgestellt werden (B).

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Ergebnisse

74

Ausgehend von dem entsprechenden Dicarbonyl bzw. Diamin wurde hingegen eine

starke NADPH-Abnahme und schließlich auch die Bildung von 86 beobachtet.

Tabelle 62: Vergleich der Aktivität von R-IRED_Ms für die Bildung von 86 im Vergleich zum Diimin-Intermediat, welches in Reaktionsweg B auftreten würde.[171]

Nr. Substrat(e)

Erwartetes Produkt

Aktivität (TOFNADPH )

A

24,1 min-1

B ---

--- keine Aktivität beobachtet.

4.3.2. Aktivitätsvergleich mit R-IRED_Sr und S-IRED_Pe

Nachdem die Aktivität für die doppelte reduktive Aminierung mit R-IRED_Ms für

mehrere Substratkombinationen nachgewiesen werden konnte, stellte sich die Frage ob

auch andere IREDs diese Fähigkeit besitzen. Es wurden deshalb Biotransformationen

mit R-IRED_Ms und mit der R-selektiven IRED aus Streptosporangium roseum DSM43021

(R-IRED_Sr), sowie mit der S-selektiven IRED aus Paenibacillus elgii (S-IRED_Pe)

durchgeführt (Tab. 63).[172] Für den Vergleich wurden drei Substratkombinationen

(A, B, C) ausgewählt. Kombination A zur Bildung von Piperazin (84) kann als

Modellreaktion für diese Art der Biotransformation gesehen werden. Die weiteren

Substratkombinationen B und C führen zur Bildung von chiralen Piperazinen (90a,

91a), welche unter anderem als Pharmabausteine für die Produktion von Vicriciroc

(HIV-Wirkstoff) bzw. Mirtazapin (Antidepressivum) eingesetzt werden können. Für

diese Verbindungen wurde auch erstmals die Stereoselektivität der IREDs gegenüber

der doppelten reduktiven Aminierung untersucht.

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Ergebnisse

75

Tabelle 63: Vergleich drei verschiedener IREDs bezüglich der doppelten reduktiven Aminierung mit drei beispielhaften Substratkombinationen. Gezeigt sind die Produktbildungen mit 5 mM Substrat nach 6 h, sowie die Enantiomerenüberschüsse der gebildeten chiralen Piperazinprodukte.[172]

Nr. Dicarbonyl-substrata

Diamin-substrata

Erwartetes Produkt

Produktbildung und Enantiomerenüberschuss (%)

R-IRED_Ms R-IRED_Sr S-IRED_Pe

A

84 ± 5 14 ± 1 ---

B

95 ± 7 >99 (R)

>99 94 (R)

33 ± 7 88 (S)

C

>99 >99 (R)

7 ± 1 56 (R)

4 ± 1 17 (S)

--- keine Produktbildung beobachtet Die angegebene Standardabweichung bezieht sich auf eine Dreifachbestimmung.

Der Vergleich von drei verschiedenen IREDs zeigt, dass die doppelte reduktive

Aminierung auch von anderen IREDs katalysiert werden kann. Es handelt sich also um

eine generelle Fähigkeit dieser Enzymfamilie. Es wurden Produktbildungen von bis zu

>99% und Stereoselektivitäten von bis zu >99% erreicht. Durch den Einsatz von

S-IRED_Pe war auch die Bildung des S-Enantiomers möglich, jedoch waren die Aktivität

und die Selektivität deutlich geringer. R-IRED_Ms zeigte insgesamt die höchste Aktivität

und Stereoselektivität und wurde für weitere Studien ausgewählt.

4.3.3. Untersuchung des Substratspektrums

Um das Substratspektrum für die doppelte reduktive Aminierung mit R-IRED_Ms zu

untersuchen wurden 117 Substratkombinationen getestet. Es wurden sowohl NADPH-

Assays als auch Biotransformationen durchgeführt. In Tabelle 64 sind 84

Substratkombinationen gezeigt, bei denen eine R-IRED_Ms katalysierte Produktbildung

nachgewiesen werden konnte. Eine grobe Einschätzung der Aktivität anhand der

NADPH-Abnahme und anhand der detektierten Produktpeak-Fläche ist durch ein

Farbschema gekennzeichnet. Des Weiteren sind in Tabelle 65 solche

Substratkombinationen gezeigt, bei denen keine Produktbildung nachgewiesen werden

konnte.

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Ergebnisse

76

Tabelle 64: Getestete Substratkombinationen für die doppelte reduktive Aminierung mit erfolgreicher Produktbildung.[172] Anhand der NADPH-Abnahme (photometrisch) und der Produktbildung (GC-MS) wurden die Substratkombinationen bezüglich der beobachteten Aktivität in drei Gruppen unterteilt (rot = niedrige Aktivität, türkis = moderate Aktivität, blau = hohe Aktivität). Die Synthese und Aktivitätsbestimmung einiger substituierter Phenylglyoxale erfolgte im Rahmen der Bachelorarbeit von Andreas Reichl.[173]

a) Beide möglichen Regioisomere wurden detektiert. b) Eins von zwei möglichen Regioisomeren wurde detektiert.

Zahlreiche Piperazin- und Homopiperazinprodukte konnten erfolgreich gebildet

werden. Dabei wurden Substrate mit unterschiedlichen sterischen Ansprüchen

hohe Aktivität

moderate Aktivität

niedrige Aktivität

a) a)

a) b) b) b)

a) b) b) b)

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Ergebnisse

77

akzeptiert. Neben C- und N-substituierten Piperazinen konnten auch einige bi-

und trizyklische Produkte gebildet werden.

Tabelle 65: Substratkombinationen, bei denen keine Produktbildung mit R-IRED_Ms beobachtet wurde. Das erwartete Produkt, welches jedoch nicht gebildet wurde, ist in Rot dargestellt.

Diaminsubstrate, bei welchen sich eine aromatische Gruppe direkt am Amin-Stickstoff

befindet (200-202) wurden von R-IRED_Ms nicht akzeptiert. Carboxy-funktionalisierte

Diamine (205-208) wurden ebenfalls nicht akzeptiert. Auch die Bildung von einigen 7-,

8- und 9-gliedrigen Ringprodukten (225-226, 237-239) war nicht erfolgreich. Harnstoff

(209) und Guanidin (210) eigneten sich nicht für die doppelte reduktive Aminierung.

Nur wenige der getesteten Dicarbonyle (194-199) wurden von R-IRED_Ms nicht

akzeptiert.

4.3.4. Quantifizierung, Upscaling und Produktisolierung

Von den 84 erfolgreichen Produktbildungen konnten 13 quantifiziert werden, da

entsprechende Produktstandards zur Verfügung standen. Für drei Beispiele wurde

außerdem ein Upscaling (10-fache Substratkonzentration, 50 mM) mit anschließender

Produktisolierung durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 66 aufgeführt.[172]

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Ergebnisse

78

Tabelle 66: Produktbildungen, Ausbeuten und Selektivitäten in der R-IRED_Ms katalysierten Bildung von ausgewählten Piperazinen und Homopiperazinen.[172]

Produktbildung Isolierte

Ausbeute ee dr rr

Produktbildung (5 mM)a (5 mM)a (50 mM)b

% % (g L-1) % (mg) % %

84 ± 5 10 ± 1 (0,4)

6 (0,5)

--- --- ---

89 ± 5

> 95 68 ± 7 (3,4)

65 (6,0)

> 99 (R)

--- --- 85 ± 3

39 ± 1 n.b. n.b. n.b. --- --- > 99

71 ± 2 n.b. n.b. n.b. 97:3 trans

--- > 99

40 ± 2d n.b. n.b. > 99 (R)

n.b. 2:1 > 95

> 99 n.b. n.b. 90 ± 1 --- --- 1,5 ± 0,1c

> 99d 92 ± 9 (8,1)

87 (9,5)

> 99 (R)

--- > 99:1

a 5 mM Diaminsubstrat und 6,25 mM Dicarbonylsubstrat (kontinuierliche Zugabe), 1 mg mL-1 R-IRED_Ms; die Bestimmung der Produktbildung erfolgte nach 6 h. b 50 mM Diaminsubstrat und 62,5 mM Dicarbonylsubstrat (kontinuierliche Zugabe), 1 mg mL-1 R-IRED_Ms; die Bestimmung der Produktbildung erfolgte nach 6 h. c wegen geringer Aktivität wurde die doppelte Menge R-IRED_Ms eingesetzt (2 mg mL-1). d Werte beziehen sich auf das abgebildete Regioisomer. ee Enantiomerenüberschuss, dr Diastereomerenverhältnis, rr Regioisomerenverhältnis, n.b. nicht bestimmt. Die angegebene Standardabweichung bezieht sich auf eine Dreifachbestimmung.

Insgesamt konnten sehr hohe Produktbildungen erreicht werden. Biotransformationen

bei denen das Diamin 1,2-Diaminopropan (112) verwendet wurde, zeigten eine

verminderte Produktbildung (90b, 129). Bei Homopiperazin (128) konnte trotz

doppelter IRED-Konzentration nur eine Produktbildung von 1,5 % erreicht werden. Die

Verwendung von einfach N-substituierten Diaminen zeigte im Vergleich mit 68 eine um

bis zu 15% gesteigerte Aktivität (124, 192). Im Up-scaling wurde das beste Ergebnis mit

91a erzielt. Hierbei wurden 8,1 g L-1 Produkt gebildet und 87 % des Produktes konnten

isoliert werden. Es zeigte sich, dass R-IRED_Ms bei 91a neben der hohen

Stereoselektivität auch eine hohe Regioselektivität von > 99:1 aufweist. Ähnliche

Beobachtungen konnten auch bei anderen Produkten gemacht werden, bei welchen

C-substituierte Dicarbonyle mit N-substituierten Diaminen kombiniert wurden. Im

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Ergebnisse

79

Gegensatz dazu ging die Regioselektivität weitestgehend verloren, wenn C-substituierte

Dicarbonyle mit C-substituierten Diaminen kombiniert wurden, wie z.B. bei 129

(rr = 2:1).

4.3.5. Aktivitätssteigerung durch Verwendung von Additiven

Im Rahmen der Bachelorarbeit von Steffen Bernhard konnte gezeigt werden, dass durch

die Verwendung von Additiven wie TPGS-750-M oder einigen Poloxameren die Aktivität

von R_IRED_Ms gesteigert werden kann.[174] In der Arbeit wurde ausschließlich die

Reduktion von zyklischen Iminen untersucht. Nun sollte überprüft werden, ob sich

dieser Effekt auch für die doppelte reduktive Aminierung übertragen lässt. Als

Modellsystem wurde die Bildung von 91a ausgewählt. Es wurde der Einfluss von vier

verschiedenen Additiven (Poloxamer F-127, Poloxamer F-68, Poloxamer P-123 und

TPGS-750-M) untersucht (Abb. 15).

Abbildung 15: Strukturformeln der verwendeten Additive. Die verwendeten Poloxamere sind Blockpolymere und gehören zu den Pluronics®. Sie bestehen aus veretherten Ethylenglycol- bzw. 1,2-Propandiol-Einheiten. Die verwendeten Pluronic Poloxamere variieren lediglich in der mittleren Größe der einzelnen Polymerblöcke (x, y).[175] TPGS-750-M hingegen ist ein VitaminE-Derivat mit einem Succinyl-Linker und einem Polyethylenglycol-Rest (n ≈ 15). Die endständige Hydroxygruppe ist methyliert.

Eine wichtige Kenngröße für solche Verbindungen ist die kritische Mizellenbildungs-

Konzentration (CMC). Sie gibt an, ab welcher Konzentration einer wässrigen Lösung eine

Mizellbildung beobachtet wird. Die literaturbekannten CMCs der verwendeten Additive

sind in Tabelle 67 aufgeführt.

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Ergebnisse

80

Tabelle 67: Auflistung der verwendeten Additive mit literaturbekannter kritischer Mizellenbildungs-Konzentration (CMC).[175,176]

Additiv CMCa

Pluronic F-127 2,8 µM

Pluronic F-68 480 µM

Pluronic P-123 4,4 µM

TPGS-750-M 400 µM

a CMC bei pH 7,4 und 37°C

Die Effekte der Additive wurde in drei verschiedenen Puffersystemen (Kpi-, TRIS-HCl

und TEOA-Puffer je 50 mM, pH 7,0) untersucht. Dabei wurden je vier verschiedene

Konzentrationen (2%, 5%, 7,5% und 10% w/v) des Additivs eingesetzt. Es wurden

10 mM Diaminsubstrat und 12,5 mM Dicarbonylsubstrat verwendet und eine

R_IRED_Ms-Konzentration von 10 µM eingestellt. Um sowohl positive als auch negative

Effekte analysieren zu können wurde die Reaktion nach 20 min gestoppt. Zu diesem

Zeitpunkt lag die Produktbildung ohne Additiv je nach Puffersystem zwischen 17% und

38%. Die beobachteten Effekte sind in Abbildung 16 dargestellt.

In allen drei Puffersystemen konnten positive Effekte der Additive gegenüber der

Aktivität von R-IRED_Ms beobachtet werden. Die besten Ergebnisse wurden mit den

Poloxameren F-127 und P-123 erzielt. Hierbei konnte im Kpi-Puffer eine bis zu 1,5-fache

Aktivitätssteigerung und in den anderen Puffern sogar eine bis zu 2,4-fache Steigerung

beobachtet werden. Poloxamer F-68 zeigte hingegen kaum positive Effekte. Die

Verwendung von 2 % (w/v) TPGS zeigte ebenfalls einen positiven Effekt in allen Puffern.

Die Verwendung von noch höheren Konzentrationen war mit TPGS-750-M aufgrund der

hohen Viskosität nicht möglich.

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Ergebnisse

81

Abbildung 16: Produktbildungen nach 20 min als Maß für die Aktivität von R-IRED_Ms bezüglich der Umsetzung von N-Methylethylendiamin (89) und Phenylglyoxal (88) zu (R)-N-Methyl-3-phenylpiperazin (91a, 100% ≙ 10 mM). Vergleich von Biotransformationen mit und ohne Zugabe von Additiven in drei verschiedenen Puffersystemen (Pufferstärke jeweils 50 mM, pH 7,0). Die angegebenen Fehlerbalken entsprechen der Standardabweichung einer Dreifachbestimmung.

4.3.6. Toxizitätsstudie

Um zu testen, ob auch Ganzzellsysteme für die doppelte reduktive Aminierung in Frage

kommen, wurde zunächst überprüft, in welchem Maße Dicarbonyle, Diamine und

Piperazine toxisch für E. coli sind. Für die Toxizitätsstudie wurden solche Substrate

ausgewählt, welche zur Bildung der Produkte 84, 90a und 91a eingesetzt werden, sowie

0

10

20

30

40

50

Pro

du

ktb

ild

un

g [

%]

HEPES

0

10

20

30

40

50

Pro

du

ktb

ild

un

g [

%]

TEOA

0

10

20

30

40

50

60

70

Pro

du

ktb

ild

un

g[%

]

Kpi

F-127 F-68 P123 TPGS

F-127 F-68 P123 TPGS

F-127 F-68 P123 TPGS

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Ergebnisse

82

die Produkte selbst. Die Studien wurden sowohl in LB- als auch in TB-Medium

durchgeführt (Tab. 68). Als Maß für die Toxizität wurde die relative Wachstumsrate

(µrel) berechnet. 100% entsprechen der gemessenen Wachstumsrate von E. coli ohne

Zugabe von Substanzen.

Tabelle 68: Relative Wachstumsraten von E. coli in Anwesenheit verschiedener Substanzen. Die Messungen erfolgten in LB- bzw. TB-Medium. Vier verschiedene Konzentrationen der jeweiligen Substanzen wurden getestet. Vermindertes Wachstum ist hellblau (schwache Toxizität) bzw. orange (starke Toxizität) gekennzeichnet.

Substanz

Relative Wachstumsraten µrel [%]a

0,1 mM 1 mM 10 mM 50 mM LB TB LB TB LB TB LB TB

96 ± 2 > 99 97 ± 1 > 99 66 ± 2 70 ± 1 3 ± 2 8 ± 7

96 ± 1 98 ± 1 65 ± 1 76 ± 2 2 ± 1 10 ± 15 --- 2 ± 1

97 ± 1 > 99 79 ± 2 83 ± 1 3 ± 1 6 ± 6 n.b. n.b.

> 99 > 99 97 ± 1 98 ± 2 97 ± 1 97 ± 1 --- ---

> 99 > 99 98 ± 1 > 99 98 ± 1 98 ± 1 --- 19 ± 15

98 ± 1 > 99 > 99 > 99 97 ± 2 > 99 --- 67 ± 3

> 99 > 99 > 99 > 99 97 ± 1 > 99 17 ± 9 72 ± 1

97 ± 1 > 99 97 ± 1 98 ± 1 96 ± 3 98 ± 1 14 ± 2 22 ± 2

a 100% entsprechen der gemessenen Wachstumsrate von E. coli ohne Zugabe von Substanzen. LB: 100% ≙ 1,56 h-1; TB: 100% ≙ 2,27 h-1. --- kein Wachstum beobachtet, n.b. nicht bestimmt. Die angegebene Standardabweichung bezieht sich auf eine Dreifachbestimmung.

Die Toxizitätsstudie zeigt, dass die getesteten Diamine und Piperazine in

Konzentrationen ≤ 10 mM keinen Einfluss auf das Wachstum haben. Die höchsten

Toxizitäten zeigten die Dicarbonyle 87 und 88. Hier wurde schon bei einer

Konzentration von 1 mM ein vermindertes Wachstum festgestellt. Bei 10 mM und

50 mM fand bei diesen Substraten kaum noch Wachstum statt. Es ist bereits bekannt,

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Ergebnisse

83

dass Glyoxale eine hohe Toxizität gegenüber Zellen und insbesondere gegenüber

Proteinen aufweisen.[164] Von den getesteten Dicarbonylen wurde Glyoxal (82) am

besten verkraftet. Hier lag die relative Wachstumsrate mit 10 mM 82 immerhin noch bei

etwa 70%. Bei einer Konzentration von 50 mM wurde bei allen Substanzen kaum noch

Wachstum beobachtet. Eine Ausnahme sind die Piperazine 84 und 90a, bei ihnen betrug

die relative Wachstumsrate trotz der hohen Konzentration im TB-Medium noch etwa

70%. Hier war der Unterschied zum LB-Medium besonders deutlich, in welchem kein

Wachstum (50 mM 84) bzw. nur 17% Wachstum (50 mM 90a) beobachtet wurde. Der

Unterschied könnte auf die höhere Pufferkapazität von TB-Medium zurückzuführen

sein.

4.3.7. In vivo Biotransformationen

Um zu zeigen, dass die doppelte reduktive Aminierung zur Bildung von

Piperazinprodukten auch in vivo möglich ist, wurde eine Ganzzell-Biotransformation mit

einer Substratkonzentration von 5 mM (Diamin) bzw. 6,25 mM (Dicarbonyl)

durchgeführt. Als Modellreaktion wurde die Bildung von 90a ausgehend von den

Substraten 87 und 83 ausgewählt. Die toxische Wirkung von 87 wurde durch eine

kontinuierliche Zugabe vermindert. Für die Zellsuspension wurden verschiedene

Medien und Lösungen getestet (Tab. 69). Dabei wurde jeweils eine OD600 von 25

(≈ 42,5 g L-1 Zellfeuchtgewicht[177]) eingestellt. Es zeigte sich, dass frische Zellen eine

höhere Aktivität aufweisen als solche, die bereits einmal eingefroren und wieder

aufgetaut wurden. Die Leervektor-Negativkontrollen zeigten wie erwartet keine

Produktbildung.

Im Vergleich zu den in vitro Experimenten (Kap. 4.3.4) zeigten die in vivo

Biotransformationen eine deutlich niedrigere Produktbildung. Die höchste

Produktbildung wurde in 100 mM Kpi-Puffer mit 25 mM Glukose beobachtet. Im

Folgenden wurde getestet, ob die Zugabe von Glukose oder die Verlängerung der

Reaktionszeit zu einer höheren Produktbildung im Ganzzellansatz führt (Abb. 17).

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Ergebnisse

84

Tabelle 69: Gemessene Produktbildungen im Ganzzellsystem in verschiedenen Medien bzw. Lösungen. Insgesamt wurden 5 mM Diamin (83) und 6,25 mM Dicarbonyl (87) eingesetzt. Die Zugabe des Dicarbonyls erfolgte kontinuierlich über 5 h. Reaktionen wurden nach 6 h gestoppt und mittels GC-FID analysiert.

Medium / Lösung Produktbildung

LB-Medium 18,1%

TB-Medium 4,8%

M9-Medium 19,1 ± 2,0%

M9-Medium (+ 25 mM Glukose) 15,1%

100 mM Kpi-Puffer 6,5%

100 mM Kpi-Puffer (+ 25 mM Glukose) 24,4 ± 2,1% Die angegebene Standardabweichung bezieht sich auf eine Dreifachbestimmung.

Abbildung 17: Produktbildung zu verschiedenen Zeitpunkten in der Ganzzellbiotransformation zur Bildung von R-2-Methylpiperazin (90a). Es wurde eine Zellkonzentration von OD600 = 25 eingestellt. Die Reaktion wurde in 100 mM Kpi-Puffer (pH 7,0) mit 25 mM Glukose durchgeführt. Nach einer fünfstündigen kontinuierlichen Substratzugabe wurden die Proben erneut mit 25 mM Glukose versetzt und für weitere 25 h inkubiert.

Die Analyse der Ganzzellbiotransformation zu verschiedenen Zeitpunkten zeigt, dass die

Produktbildung in den ersten acht Stunden stetig ansteigt und dann abflacht. Die Zugabe

von weiterer Glukose nach 5 h erwies sich als förderlich.

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Ergebnisse

85

4.3.8. Verwendung von α-Ketosäureester an Stelle von Dicarbonylen

Es stellte sich die Frage, ob auch α-Ketosäureester mit Diaminen kombiniert werden

können. In einer solchen Reaktion wäre nur eine IRED katalysierte reduktive

Aminierung nötig. Die zweite C-N Bindungsknüpfung könnte durch die sogenannte

Aminolyse[178] erfolgen, bei der eines der Amine den Carboxyl-Kohlenstoff nukleophil

angreift und der veresterte Alkohol abgespalten wird (Abb. 18).

Abbildung 18: Postulierte Bildung von Ketopiperazinen aus α-Ketosäureestern und Diaminen. Die Reaktion besteht aus einer IRED katalysierten reduktiven Aminierung und einer Aminolyse. Die abgebildeten Schritte können auch in umgekehrter Reihenfolge erfolgen.

Drei verschiedene α-Ketosäureester (244-246) wurden mit Ethylendiamin (83)

kombiniert um die beschriebene Rektion mittels NADPH-Assay zu untersuchen

(Tab. 70). Anschließend wurden zusätzlich Biotransformationen durchgeführt um die

Bildung von Ketopiperazinen nachzuweisen.

Obwohl bei zwei der getesteten α-Ketosäureester eine signifikante NADPH-Abnahme

beobachtet wurde, konnte die Produktbildung mittels GC-MS nicht nachgewiesen

werden. Vermutlich ist eine spontane Aminolyse unter den angewendeten

Reaktionsbedingungen nicht erfolgt. Die Negativkontrollen ohne Enzym zeigten wie

erwartet keine NADPH Abnahme. Als Alternative kann der Schritt der Aminolyse

chemisch durchgeführt werden. In einem zweiten Schritt kann dann die Iminvorstufe

des Ketopiperazins durch R-IRED-Ms reduziert werden. Dies wurde bereits für die

Bildung von 249 erfolgreich durchgeführt.[171]

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Ergebnisse

86

Tabelle 70: Verwendete α-Ketosäureester für die Umsetzung mit 83 zur Bildung von Ketopiperazinen.[171]

α-Ketosäure-ester Diamin

Erwartetes Produkt TOFNADPH

Produkt bildung

0,9 ± 0,08 min-1 ---

4,1 ± 0,5 min-1 ---

--- ---

--- keine Aktivität beobachtet / keine Produktbildung nachgewiesen Die angegebene Standardabweichung bezieht sich auf eine Dreifachbestimmung.

4.3.9. Verwendung von α-Hydroxycarbonylen an Stelle von Dicarbonylen

Die Tatsache, dass Ethylendiamin (83) ein sehr gutes Substrat für die doppelte

reduktive Aminierung mit R-IRED_Ms ist, führte zu der Idee Ethambutol (250) zu bilden,

welches ein gefragtes Antibiotikum ist. Hierfür wären zwei reduktive Aminierungen mit

1-Hydroxy-2-Butanon (63) an den beiden Aminogruppen notwendig (Abb. 19). Im

Gegensatz zur doppelten reduktiven Aminierung mit Dicarbonylen würde bei einer

solchen Reaktion kein N-Heterozyklus entstehen. Nach der Optimierung der

Reaktionsparameter konnte eine deutliche NADPH-Abnahme beobachtet werden. Die

Zugabe von 63 in einem starken Überschuss (10:1) zeigte sich von Vorteil. Trotz der

beobachteten NADPH-Abnahme konnte die Bildung von 250 mittels LC-MS

ausgeschlossen werden. Interessanterweise bildete sich stattdessen 2-Etyhlpiperazin

(251).

Dies war der erste Hinweis darauf, dass auch α-Hydroxycarbonyle mit Diaminen

kombiniert werden können, um entsprechende Piperazinprodukte zu generieren. Diese

Erkenntnis schien zunächst nicht sonderlich gewinnbringend, da ein enormer

Überschuss des α-Hydroxycarbonyls notwendig ist und die beobachtete Aktivität gering

war. Die Verwendung von Dicarbonylen ist somit deutlich effizienter. Dennoch ergab

sich eine bedeutsame Anwendung für diese neu entdeckte Aktivität. Die Bildung von

2-Hydroxymethylpiperazin (255) als mögliche Vorstufe für Piperazin-2-carboxylat war

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Ergebnisse

87

bislang nicht möglich, da das entsprechende Dicarbonyl sehr instabil ist und deshalb

nicht käuflich erwerblich ist. Es wurde sogar eine Synthese mittels Selenoxidation

unternommen[179], jedoch war das erwünschte Dicarbonyl noch mit Selendioxid

verunreinigt, sodass die verwendeten Enzyme sofort denaturierten.

Abbildung 19: Die Biotransformation von 1-Hydroxy-2-butanon (63) mit Ethylendiamin führte nicht wie anfangs erwartet zur Bildung von Ethymbutol (250), sondern zur Bildung von 2-Ethylpiperazin (251).

Durch die neue Erkenntnis konnte nun das entsprechende α-Hydroxycarbonyl

(Dihydroxyaceton, 254) anstelle des Dicarbonyls eingesetzt werden, um die Bildung von

255 zu erreichen. Neben 254 wurden noch weitere α-Hydroxycarbonyle getestet, um

eine generelle Anwendung dieser Reaktion zu bestätigen. Nachdem für die meisten der

getesteten Substratkombinationen eine signifikante NADPH-Abnahme festgestellt

wurde, wurden Biotransformationen durchgeführt um die Produktbildung zu bestätigen

(Tab. 71). Eine Quantifizierung wurde nur für die Bildung von 255 durchgeführt, da die

anderen Produkte durch Verwendung des entsprechenden Dicarbonyls besser

zugänglich sind.

Alle getesteten α-Hydroxycarbonyle wurden erfolgreich zum Piperazinprodukt

umgesetzt. Lediglich die Bildung von 2-Hydroxymethylhomopiperazins (256) unter

Verwendung von 1,3-Propandiamin (118) gelang nicht. Das wichtigste Ergebnis dieser

Studie war die erstmalige Bildung von 255. Eine quantitative Analyse zu verschiedenen

Zeitpunkten dieser Biotransformation ist in Tabelle 72 gezeigt.

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Ergebnisse

88

Tabelle 71: Getestete α-Hydroxycarbonyle für die reduktive Aminierung mit Diaminen zur Bildung von Piperazinen. Die Bestätigung der Produktbildung erfolgte mittels GC-MS.

α-Hydroxy-carbonyla Diamina

Erwartetes Produkt

Produktbildung bestätigt (GC-MS)

Ja

Ja

Ja

Ja

Jab

Nein

a α-Hydroxycarbonyl und Diamin wurden im Verhältnis 10:1 eingesetzt. b Quantifizierung siehe (Tab. 72).

Tabelle 72: Die R-IRED_Ms katalysierte Bildung von Hydroxymethylpiperazin (255) erfolgte mittels reduktiver Aminierung von Dihydroxyaceton (254, 50 mM) mit Ethylendiamin (83, 5 mM). Die voranschreitende Produktbildung wurde zu verschiedenen Zeitpunkten ermittelt.

Reaktions-zeit Produktbildung Enantiomerenüberschuss

2 h 62 ± 3% n.b.

5 h 82 ± 2% n.b.

20 h 98 ± 2% > 95% (S) n.b. nicht bestimmt. Die angegebene Standardabweichung bezieht sich auf eine Dreifachbestimmung.

Für 255 konnte eine Produktbildung von 98 ± 2% mit einem Enantiomerenüberschuss

von > 95 % nach 20 h erreicht werden.

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Ergebnisse

89

4.3.10. Doppelte reduktive Hydrazinierung

Die Verwendung von Hydrazinen für die reduktive Aminierung wurde bereits

erfolgreich getestet (Kap. 4.2.2). Nun wurde untersucht, ob Dicarbonyle mit Hydrazinen

doppelt reduktiv aminiert werden können. Dabei handelt es sich um eine ähnliche

Reaktion wie bei der doppelten reduktiven Aminierung, nur dass beide Stickstoffe aus

derselben funktionellen Gruppe (Hydrazingruppe) bereitgestellt werden (Abb. 20). Als

Produkt resultiert ein zyklisches Hydrazin, weshalb diese Reaktion im Folgenden

doppelte reduktive Hydrazinierung genannt wird.

Abbildung 20: Generelles Reaktionsschema der doppelten reduktiven Hydrazinierung von Dicarbonylen mit Hydrazinen.

Für diese Art der Reaktion wurden verschiedene Substratkombinationen getestet. Dabei

wurde neben Methylhydrazin (43) auch Hydrazin (261) und Hexahydropyridazin (69)

als Nukleophil eingesetzt. Die R-IRED_Ms katalysierte Bildung von zyklischen

Hydrazinprodukten wurde mittels GC-MS überprüft (Tab. 73).

Insgesamt konnten sechs zyklische Hydrazinprodukte erfolgreich gebildet werden (266,

268-271, 273). Dabei erwies sich als hilfreich, wenn das Dicarbonyl- und

Hydrazinsubstrat vor Zugabe des Enzyms zunächst für 5 min inkubiert wurden. Durch

die Kondensation der Substrate kann die toxische Wirkung gegenüber den Enzymen

verringert werden. Eine Quantifizierung der Produktbildung war nicht möglich, da keine

Produktstandards zur Verfügung standen. Stattdessen sind in Tabelle 73 die

gemessenen Peakflächen angegeben, welche zumindest eine grobe Einschätzung der

Enzymaktivität erlauben. Insgesamt konnte jedoch gezeigt werden, dass eine R-IRED_Ms

katalysierte doppelte reduktive Hydrazinierung von Dicarbonylen zur Bildung von

zyklischen Hydrazinen möglich ist.

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Ergebnisse

90

Tabelle 73: Getestete Substratkombinationen für die doppelte reduktive Aminierung von Dicarbonylen mit Hydrazinen. Die Bildung von zyklischen Hydrazinprodukten wurde mittels GC-MS überprüft.

Diarbonyl Hydrazin Erwartetes Produkt

Produktbildung bestätigt (GC-MS)a

Peakfläche (x1.000.000 FE)

Nein ---

Nein ---

Nein ---

Nein ---

Ja 29,2

Nein ---

Ja 69,9

Ja 107,8

Ja 1,3

Ja 3,3

Nein ---

Ja 341,0

a Produktpeaks wurden anhand der Molmasse des acetylierten Produkts, sowie dessen Fragmentierungsmuster identifiziert.

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Ergebnisse

91

4.4. Bildung von N-Heterzyklen mithilfe von Enzymkaskaden

Verschiedene Enzymkaskaden wurden getestet um zum einen die Bildung von

N-Heterozyklen ausgehend von sehr einfachen Verbindungen zu ermöglichen. Zum

anderen sollte der Zugang zu neuen N-Heterozyklen geschaffen werden, für die bislang

keine passenden Substrate zur Verfügung standen.

4.4.1. Enzymkaskade mit Putrescinoxidase und IRED

Die Bildung von N-Heterozyklen ausgehend von Diaminen unter Anwendung einer

Putrescinoxidase aus Rhodococcus erythropolis (PuO_Re) kombiniert mit einer IRED

wurde im Rahmen der Doktorarbeit von Leonie Weinmann bereits untersucht.[151] Sie

konnte mit dieser Art Enzymkaskade sowohl in vitro als auch in vivo erfolgreich

Pyrrolidin- und Piperidinderivate bilden. Nach der Oxidation des Diamins durch PuO_Re

bildet sich ein Aminocarbonyl-Intermediat, welches spontan unter Abspaltung von

Wasser zum zyklischen Imin reagiert. Dieses kann schließlich mir einer IRED zum

zyklischen Aminprodukt reduziert werden (Abb. 21). Um die Vergleichbarkeit mit den

Vorarbeiten zu gewährleisten wurde nicht die R-IRED_Ms sondern die R-IRED_Sr für

diese Kaskade eingesetzt.

Abbildung 21: Schematische Darstellung der Enzymkaskade zur Bildung von substituierten Pyrrolidinen und Piperidinen, ausgehend von Diaminen unter Verwendung von PuO_Re und R-IRED_Sr.

In Zusammenarbeit mit Ammar Al-Shameri (Arbeitskreis Dr. Oliver Lenz und Dr. Lars

Lauterbach, Institut für Chemie, TU Berlin) wurde diese Enzymkaskade weiter

untersucht und mit einem H2-basiertem Kofaktorregenerationssystem[180,181]

kombiniert.[182] Zunächst wurde das Substratspektrum von PuO_Re untersucht. Neben

dem Wildtypenzym wurden auch fünf verschiedene Enzymvarianten getestet, welche

aus der Mutantenbibliothek einer vorangegangenen Mutationsstudie

entstammen.[151,183] Die Mutationen der Varianten liegen vor allem im

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Ergebnisse

92

Substrateingangskanal, welcher stellenweise nur sehr schmal ist, und somit für

verzweigte Substrate kaum durchlässig ist. Die Oxidationsaktivität gegenüber elf

Diaminen wurde photometrisch analysiert (Tab. 74).

Das natürliche Substrat (204) wurde wie erwartet vom Wildtypenzym am besten

umgesetzt. Für längerkettige und Methyl-substituierte Diamine (274-278) zeigte sich

jedoch, dass je nach Substrat die Enzymvarianten V1 oder V2 eine höhere Aktivität als

der Wildtyp aufweisen.

Tabelle 74: Aktivitäten von PuO_Re-Varianten für die Oxidation verschiedener Diamine. Die am besten geeignetsten Enzymvarianten (abhängig vom verwendeten Substrat) sind grau hinterlegt.

Aktivität (TOF / min-1) mit verschiedenen PuO_Re-Enzymvariantena

Diamin WT V1 V2 V3 V4 V5

--- --- --- --- --- ---

--- --- --- --- --- ---

1128 ± 47 940 ± 42 509 ± 8 793 ± 14 233 ± 4 3.8 ± 0.3

98 ± 9 105 ± 2 121 ± 11 68 ± 5 30 ± 2 1.9 ± 0.2

20 ± 1 30 ± 1 30 ± 1 12 ± 0.5 1.3 ± 0.1 0.7 ± 0.04

5.6 ± 0.1 10 ± 1 3.5 ± 0.1 2.2 ± 0.1 3.3 ± 0.1 0.1 ± 0.01

47 ± 8 43 ± 1 82 ± 3 33 ± 2 8.1 ± 0.3 1.3 ± 0.1

372 ± 18 456 ± 20 255 ± 5 281 ± 2 104 ± 4 1.0 ± 0.3

--- --- --- --- --- ---

1.6 ± 0.1 0.7 ± 0.14 0.9 ± 0.03 0.6 ± 0.01 0.2 ± 0.01 0.2 ± 0.01

242 ± 10 686 ± 34 203 ± 10 114 ± 4 109 ± 6 1.0 ± 0.1

a WT: Wildtyp; Variante V1: E203G; Variante V2: L200I, E203S, I206L; Variante V3: D202S, F205I; Variante V4: E203P, I206L; Variante V5: L200I, E203S, I206L, E325Y. --- keine Aktivität beobachtet Die angegebene Standardabweichung bezieht sich auf eine Dreifachbestimmung.

In der Arbeit von Leonie Weinmann wurde bereits gezeigt, dass bei der Verwendung der

Substrate 276 und 277 ein moderater Enantiomerenüberschuss (ee) des

Piperidinproduktes beobachtet werden kann, welcher allerdings mit steigender

Reaktionszeit und Produktbildung sinkt.[151] Dieses Phänomen wurde nochmals genauer

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Ergebnisse

93

untersucht. Hierfür wurde die Produktbildung und der ee nach 30 min Reaktionszeit bei

unterschiedlichen Enzymkonzentrationen ermittelt (Tab. 75).

Tabelle 75: Produktbildung und Enantiomerenüberschüsse für die Bildung von 8 und 282 mithilfe von PuO und IRED in unterschiedlichen Enzymverhältnissen. Reaktionen wurden nach 30 min gestoppt.

Enzymkonzentration (mg mL-1)

Produktbildung (%), (ee %)

PuO_Re-V1 R-IRED_Sr

0,1 1 2 ± 0.1 (57 S) 22 ± 3 (93 R)

0,2 1 n.b. 33 ± 1 (87 R)

0,5 1 12 ± 3 (55 S) n.b.

1 1 16 ± 4 (57 S) 72 ± 1 (43 R)

5 1 47 ± 3 (47 S) 90 ± 1 (3 R)

5 1 86 ± 3 (40 S)a 99 ± 1 (rac.)a

a Messwerte nach 2 h. n.b. nicht bestimmt, rac. racemisch. Die angegebene Standardabweichung bezieht sich auf eine Dreifachbestimmung.

Durch die Änderung des PuO/IRED Verhältnis konnte die Produktbildung nach 30 min

schrittweise erhöht bzw. erniedrigt werden. Je höher das PuO : IRED Verhältnis, desto

höher die Produktbildung. Die Messungen bestätigen, dass der ee mit zunehmender

Produktbildung abnimmt. Dieser Effekt ist besonders stark bei der Bildung von

3-Methylpiperidin (282). Hier wird bei einer Produktbildung von 22% ein ee von

93% (R) gemessen. Nach vollständiger Umsetzung hingegen liegt das Produkt als

Racemat vor.

Um die Anwendbarkeit dieser Enzymkaskade zu verdeutlichen wurde die

Biotransformation von fünf verschiedenen Diaminen untersucht (Tab. 76).[182] Die

Kofaktorregeneration erfolgte u. a. H2-basiert mit einer NADP+-abhängigen

Hydrogenase-Variante aus Ralstonia euthropha H16 (SHE341A/S342R). Die Versuche mit

SHE341A/S342R wurden von Ammar Al-Shameri (TU Berlin, Arbeitskreis Dr. Oliver Lenz

und Dr. Lars Lauterbach) durchgeführt.

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Ergebnisse

94

Tabelle 76: Erreichte Produktbildungen und Enantiomerenüberschüsse für die Biotransformation zur Bildung von N-Heterozyklen ausgehend von Diaminen, unter Anwendung der Enzymkaskade bestehend aus PuO_Re-V1 und R-IRED_Sr. [182] Für die Kofaktorregeneration wurde sowohl die SHE341A/S342R (Bedingung1) als auch die Glukose-6-phosphatdehydrogenase (Bedingung 2, 3) verwendet.

Produktbildung und

Enantiomerenüberschuss (ee %) Diamin Produkt Bedingung 1a Bedingung 2b Bedingung 3c

71 ± 7% n.b. n.b.

30 ± 4% 34 ± 2% n.b.

97 ± 2% n.b. n.b.

24 ± 12%

(40 S) 86 ± 3%

(40 S) 16 ± 4%

(57 S)

56 ± 6% (25 R)

99 ± 1% (rac.)

22 ± 3% (93 R)

a Verwendung von 10 mM Substrat, NADPH-Regenerierung mit SHE341A/S342R, Proben wurden mit H2 und O2 (50:50) begast, 4 h, 22°C. b Verwendung von 5 mM Substrat, 5 mg mL-1 PuO_Re V1, 1 mg mL-1 R-IRED_Sr, NADPH-Regenerierung mit Glukose-6-phosphatdehydrogenase, 2 h, 25°C. c Verwendung von 5 mM Substrat, 0,1 mg mL-1 PuO_Re-V1 (für 282) bzw.1 mg mL-1 PuO_Re-V1 (für 8),1 mg mL-1 R-IRED_Sr, NADPH-Regenerierung mit Glukose-6-phosphatdehydrogenase (G6PDH), 0,5 h, 25°C. n.b. nicht bestimmt. Die angegebene Standardabweichung bezieht sich auf eine Dreifachbestimmung.

Mit der beschriebenen Enzymkaskade konnten zwei Pyrrolidine (283, 284) und drei

Piperidine (285, 8, 282) erfolgreich gebildet werden. Je nach Reaktionsbedingung

konnten hohe Produktbildungen (bis zu 99%) oder hohe Enantiomerenüberschüsse (bis

zu 93%) erreicht werden.

Zusätzlich konnte die Kaskade zu Bildung von 282 im Ganzzellsystem gezeigt

werden.[151] In Zusammenarbeit mit Leonie Weinmann und Sanofi-Aventis Deutschland

und unter Verwendung eines 20 L Bioreaktors konnten bis zu 80 g L-1 Produkt gebildet

werden. [184]

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Ergebnisse

95

4.4.2. Enzymkaskade mit Alkoholdehydrogenasen oder Alkoholoxidasen und R-IRED_Ms

Die Bildung von chiralen Piperazinen mit funktionalisiertem Substituent ist

herausfordernd, da die meisten Dicarbonylvorstufen instabil und nicht erhältlich sind. In

Kapitel (Kap. 4.3.9) konnte dieses Problem umgangen werden, indem ein

α-Hydroxycarbonyl anstelle des Dicarbonyls verwendet wurde. So gelang bereits die

Bildung von 2-Hydroxymethylpiperazin (255). Doch auch die Verfügbarkeit von

α-Hydroxycarbonylen mit zusätzlicher funktioneller Gruppe ist sehr beschränkt.

Verwendet man hingegen Diole, können zahlreiche funktionalisierte Substrate

eingesetzt werden (Tab. 77). Im Folgenden wurde deshalb versucht Diole enzymatisch

zum α-Hydroxycarbonyl zu oxidieren. Eine Anschließende Umsetzung mit

Ethylendiamin (83), katalysiert durch R-IRED_Ms, könnte schließlich zur Bildung

entsprechender Piperazinprodukte führen (Abb. 22). Jedoch ist dabei zu beachten, dass

für den zweiten Schritt ein Überschuss des α-Hydroxycarbonyls nötig ist, und somit die

Kaskade nur dann möglich ist, wenn der erste Schritt mit einer sehr hohen Aktivität

katalysiert wird.

Tabelle 77: Beispiele für verfügbare Diole und zugehörige Piperazinprodukte, die durch eine entsprechende Enzymkaskade gebildet werden würden.

Diol Produkt Diol Produkt

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Ergebnisse

96

Abbildung 22: Schematische Darstellung der Enzymkaskade zur Bildung von chiralen Piperazinen mit funktionalisierten Substituenten, ausgehend von Diolen unter Verwendung von Alkoholdehydrogenasen (A) oder Alkoholoxidasen (B) und R-IRED_Ms.

Aufgrund des hohen Potenzials dieser Kaskade wurden einige Alkoholdehydrogenasen

(ADHs) und Alkoholoxidasen (AOs) hinsichtlich der Oxidationsaktivität gegenüber

Diolen getestet. Für das Screening wurden die Diole 286-290 ausgewählt. Die

Ergebnisse des Screenings sind in Tabelle 78 aufgeführt.

Insgesamt wurden vier Enzyme mit Oxidationsaktivität gegenüber Diolen gefunden. Die

Glycerindehydrogenase aus Cellulomonas sp. zeigte Aktivität gegenüber 286-288 und

290. Jedoch gelangen diese Oxidationen nur bei pH-Werten >9 (Optimum bei pH 10,5).

R-IRED_Ms hingegen zeigt für diese Reaktion ein pH-Optimum von 7-8. Es wurden daher

Enzymkaskaden mit R-IRED_Ms bei pH 8, 9 und 9,5 durchgeführt. Jedoch konnte keine

Bildung von Piperazinprodukten festgestellt werden. Eine weitere vielversprechende

Oxidationsaktivität zeigte die ADH80 von C-LEcta (Leipzig, DE). Hier wurde zwar nur

eine Aktivität gegenüber 286 gemessen, im Gegensatz zur Glycerindehydrogenase war

jedoch die Oxidation bei pH 8,0 möglich. So konnte die Enzymkaskade mit R-IRED_Ms

bei pH 8,0 durchgeführt werden. Verschiedene Substrat- und Kofaktor-Konzentrationen,

sowie die Verwendung von zwei getrennten Kofaktorregenerationssystemen wurde

untersucht. Dennoch konnte keine Produktbildung festgestellt werden. Ähnlich verhielt

es sich bei der Anwendung von Alkoholoxidasen. Obwohl Oxidationsaktivitäten

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Ergebnisse

97

gegenüber der Diole beobachtet wurden (Galaktoseoxidase aus Dactylium dendroides,

sowie mit der AO aus Pichia pastoris), waren die entsprechenden Enzymkaskaden nicht

erfolgreich.

Tabelle 78: Aktivitätsscreening einiger Alkoholdehydrogenasen und Alkoholoxidasen gegenüber fünf ausgewählten Diolen (286-290). Enzym-Substrat-Kombinationen, bei denen eine Aktivität beobachtet wurde, sind blau gekennzeichnet.

Alkoholdehydrogenasen (ADHs)

ADH aus Saccharomyces cerevisiae

ADH aus Thermoanaerobacter brockii

ADH aus Parvibaculum lavamentivorans

Lactat-DH aus dem Muskelgewebe von Hasen

Glutamat-DH aus der Rinderleber

Gukose-6-phosphat-DH aus Leuconostoc mesenteroides

Gukose-6-phosphat-DH aus Saccharomyces cerevisiae

Glycerin-DH aus Cellulomonas sp.

ADH80 von C-LEcta (Ursprung unbekannt)

ADH107 von C-LEcta (Ursprung unbekannt)

ADH171 von C-LEcta (Ursprung unbekannt)

ADH175 von C-LEcta (Ursprung unbekannt)

Alkoholoxidasen (AOs)

Glukoseoxidase aus Aspergillus niger

Galaktoseoxidase aus Dactylium dendroides

Galaktoseoxidase Variante M3-5[185]

AO aus Pichia pastoris

Cholinoxidase aus Arthrobacter chlorophenolicus WT

Cholinoxidase aus Arthrobacter chlorophenolicus L7[186]

Cholinoxidase aus Arthrobacter chlorophenolicus N1[186]

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Ergebnisse

98

4.5. Entwicklung von NADH-abhängigen R-IRED_Ms-Varianten

Alle bislang bekannten IREDs sind strikt NADPH abhängig. Die Verwendung von NADH

anstelle von NADPH ist jedoch deutlich attraktiver. Ziel war es deshalb die

Kofaktorspezifität von R-IRED_Ms zu ändern.

Um die Anfangsaktivität von R-IRED_Ms mit NADH einschätzen zu können wurden die

kinetischen Parameter bezüglich 2-Methylpyrrolin (1) in Anwesenheit von NADPH und

NADH verglichen (Tab. 79). Für einen Vergleich wurden dieselben Messungen

außerdem mit R-IRED_Sr durchgeführt.

Tabelle 79: Vergleich der kinetischen Parameter bezüglich 2-Methylpyrrolin (1) in Anwesenheit von NADPH und NADH. Die Messungen wurden mit R-IRED_Ms und zum Vergleich auch mit R-IRED_Sr durchgeführt.

NADPH NADH

IRED Km kcat KI kcat Km-1 Km kcat KI kcat Km-1

mM min-1 mM mM-1 min-1 mM min-1 mM mM-1 min-1

R-IRED_Ms 1,0 ± 0,1 138 ± 3 20 ± 2 134 ± 16 10,6 ± 1,2 1,8 ± 0,2 21 ± 5 0,17 ± 0,01

R-IRED_Sr 1,4 ± 0,1 69 ± 3 45 ± 6 49 ± 3 2,6 ± 0,7 0,47 ± 0,06 38 ± 12 0,18 ± 0,02

Die angegebene Standardabweichung bezieht sich auf eine Dreifachbestimmung.

Wie erwartet werden bei der Verwendung von NADH mit beiden Enzymen deutlich

schlechtere Werte erreicht. Die katalytische Effizienz ist etwa 460-fach (R-IRED_Ms)

bzw. 270-fach (R-IRED_Sr) verschlechtert. Dennoch erreicht R-IRED_Ms mit NADH einen

etwa vierfach höheren kcat-Wert als R-IRED_Sr und zeigt somit die höhere

Anfangsaktivität in Anwesenheit von NADH.

Die Mutationsstrategie zur Änderung der Kofaktorbindetasche (Rossmannfaltung)

erfolgte in Anlehnung an die Vorschläge des Online-Tools CSR-SALAD[187]

(http://www.che.caltech.edu/groups/fha/CSRSALAD/index.html). Da zu diesem

Zeitpunkt noch keine Kristallstuktur für R-IRED_Ms zur Verfügung stand, wurde die

Kristallstruktur der R-selektiven IRED aus Strepromyces kanamyceticus (R-IRED_Sk) als

Input-Datei verwendet. Die vorgeschlagenen Mutantenbibliotheken an Positionen 32-34,

37, 67, 71 und 75 wurden erstellt und gescreent (Tab. 80). An Position 37 wurde

zusätzlich eine Sättigungsmutagenese durchgeführt (Tab. 80, Runde 2). Als

Modelsubstrat wurde 2-Methylpyrrolin (1) ausgewählt.

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Ergebnisse

99

Tabelle 80: Durchgeführte Mutageneserunden zur Identifizierung von R-IRED_Ms-Varianten mit geänderter Kofaktorspezifität.[165] In Runde 1 wurde eine Teilsättigungsmutagenese gleichzeitig an drei Stellen durchgeführt (orange). Anschließend folgten Sättigungsmutagenesen (Runde 2-7, rot), und die manuelle Kombinierung von vielversprechenden Mutationen (nicht gezeigt).

Mutageneserunde Aminosäureposition

32 33 34 37 67 71 75

Wildtyp-Sequenz N R T K L T L

Runde 1 N X1 X2 X3 L T L

Runde 2 N Y E X L T L

Runde 3A X Y E A L T L

Runde 3B X Y E R L T L

Runde 4 E Y E R X T L

Runde 5 E Y E R L X L

Runde 6 E Y E R L T X

Etablierte Mutationen aus vorherigen Runden

X1 Teilsättigungsmutagenese mit X = C,H,N,P,R,S,T,Y

X2 Teilsättigungsmutagenese mit X = A,D,E,K,N,T

X3 Teilsättigungsmutagenese mit X = D,E,K,N,Y

X Sättigungsmutagenese mit X = alle 20 Aminosäuren

Verschiedene Aminosäureaustausche führten zu verbesserten Aktivitäten mit NADH,

bzw. zu einer verbesserten Spezifität (𝐴𝑘𝑡𝑖𝑣𝑖𝑡ä𝑡 𝑚𝑖𝑡 𝑁𝐴𝐷𝐻

𝐴𝑘𝑡𝑖𝑣𝑖𝑡ä𝑡 𝑚𝑖𝑡 𝑁𝐴𝐷𝑃𝐻). Die einzige Position, an der

keine Mutation mit verbesserter Aktivität oder Spezifität gefunden wurde, war

Position 75. Einige vielversprechende Mutationen wurden im Anschluss manuell

kombiniert, sodass bis zu sechs Mutationen pro Enzymvariante eingeführt wurden. In

Tabelle 81 sind die Aktivitäten und Spezifitäten für 15 R-IRED_Ms-Varianten gezeigt.[188]

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Ergebnisse

100

Tabelle 81: Aktivitäten und Kofaktorspezifitäten für verschiedene R-IRED_Ms-Varianten. Die höchste erreichte Aktivität gegenüber NADH, sowie die höchste erreichte Spezifität wurden grau markiert.

Variante Mutationen TOFNADH TOFNADPH Spezifität

min-1 min-1 TOFNADH TOFNADPH-1

Wildtyp - 2,0 ± 0,1 91 ± 2 0,022 ± 0,001

1 R33Y 4,1 ± 0,1 61 ± 1 0,067 ± 0,001

2 T71V 11,7 ± 0,4 16 ± 1 0,74 ± 0,03

3 (V1) R33Y, T34E 9,4 ± 1 6,6 ± 1 1,4 ± 0,3

4 (V2) R33Y, T34E, K37A 10,4 ± 0,2 0,70 ± 0,03 14,7 ± 0,6

5 (V3) R33Y, T34E, K37R 12,7 ± 0,4 9,0 ± 0,3 1,4 ± 0,06

6 R33Y, T34E, K37A, T71V 32 ± 1 2,4 ± 0,1 13,4 ± 0,6

7 R33Y, T34E, K37R, T71V 37 ± 1 26 ± 1 1,4 ± 0,1

8 (V4) N32E, R33Y, T34E, K37A 2,2 ± 0,1 0,05 ± 0,01 45 ± 3

9 (V5) N32E, R33Y, T34E, K37R 10,0 ± 0,5 0,8 ± 0,06 11,9 ± 1,0

10 N32E, R33Y, T34E, T71V 29 ± 1 2,8 ± 0,05 10,3 ± 0,5

11 (V6) N32E, R33Y, T34E, K37R, L67I 14,3 ± 0,2 0,95 ± 0,05 15,1 ± 0,8

12 (V7) N32E, R33Y, T34E, K37R, T71V 45 ± 3 2,5 ± 0,08 17,9 ± 1,2

13 (V8) N32E, R33Y, T34E, K37R, L67I, T71V 94 ± 10 4,8 ± 0,2 19,6 ± 2,2

14 (V9) R33Y, T34E, K37A, L67I, T71V 84 ± 2 6,6 ± 0,3 12,8 ± 0,6

15 (V10) N32E, R33Y, T34A, K37R, L67I, T71V 38 ± 5 0,60 ± 0,02 64 ± 8

Die angegebene Standardabweichung bezieht sich auf eine Dreifachbestimmung.

Einige Varianten mit verbesserter Aktivität gegenüber NADH bzw. verbesserter

Kofaktorspezifität konnten identifiziert werden. Die Aktivität mit NADH konnte

vollständig wiederhergestellt werden (V8). Die höchste Spezifität wurde mit Variante

V10 erreicht. Hier wurde NADH 64-mal besser akzeptiert als NADPH. Damit wurde die

Spezifität gegenüber dem Wildtyp um das 2900-fache erhöht.

4.5.1. Weiterführende Untersuchung von Varianten V8 und V10

Die gezeigten Aktivitäten der Enzymvarianten (Kap. 4.5) wurden bei einer

Substratkonzentration von 5 mM ermittelt. Nun sollte untersucht werden, inwiefern sich

die kinetischen Parameter der Varianten V8 und V10 im Vergleich zum Wildtyp

unterscheiden. Hierfür wurden die kinetischen Parameter mit 2-Methylpyrrolin (1) in

Anwesenheit von NADH bzw. NADPH untersucht (Tab. 82).[165]

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Ergebnisse

101

Tabelle 82: Kinetische Parameter bezüglich 2-Methylpyrrolin (1) von R-IRED_Ms-Wildtyp (WT) und den Varianten V8 und V10 in Anwesenheit von NADPH bzw. NADH.[188]

In Anwesenheit von NADPH

Km (mM) kcat (s-1) KI (mM) kcat Km-1 (mM-1 s-1)

WT 1,0 ± 0,1 2,3 ± 0,1 20 ± 2 134 ± 16

V8 12 ± 2 0,14 ± 0,01 11 ± 2 0,7 ± 0,1

V10 6,8 ± 0,9 0,02 ± 0,002 16 ± 4 0,2 ± 0,03

In Anwesenheit von NADH

Km (mM) kcat (s-1) KI (mM) kcat Km-1 (mM-1 s-1)

WT 23 ± 1 0,09 ± 0,003 12 ± 1 0,2 ± 0,01

V8 9,8 ± 0,3 3,9 ± 0,04 21± 0,2 24 ± 01

V10 11 ± 2 1,5 ± 0,2 29 ± 6 7,9 ± 1,6

Die angegebene Standardabweichung bezieht sich auf eine Dreifachbestimmung.

Die Bestimmung der kinetischen Parameter bestätigt, dass die Kofaktorspezifität von V8

und V10 erfolgreich umgedreht wurde. V8 erreicht sogar höhere Wechselzahlen (kcat)

mit NADH als der Wildtyp mit NADPH. Jedoch zeigen beide Varianten einen erhöhten

KM-Wert, sodass die katalytische Effizienz (kcat KM-1) insgesamt deutlich niedriger ist als

beim Wildtyp.

Im nächsten Schritt wurden Biotransformationen mit 8 mM 1 durchgeführt, um die

Produktbildung und die Stereoselektivität der Varianten V8 und V10 mit dem Wildtyp

zu vergleichen (Tab. 83).[188] Die Enzymkonzentration (2 µM) und die Reaktionszeit

(45 min) wurden so gewählt, dass der Will-Typ beim Abstoppen der Reaktion gerade

den Vollumsatz erreicht. Somit ist eine optimale Vergleichbarkeit gegeben. Auf ein

Kofaktorregenerationssystem wurde an dieser Stelle verzichtet. Stattdessen wurde ein

Überschuss an NAD(P)H (10 mM) eingesetzt.

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Ergebnisse

102

Tabelle 83: Produktbildungen und Enantiomerenüberschüsse bezüglich der Bildung von 2-Methylpyrrolidin (7) mit R-IRED_Ms-Wildtyp (WT) und den Varianten V8 und V10 in Anwesenheit von NADPH bzw. NADH.[188]

In Anwesenheit von NADPH

Produktbildung (%) ee (%)

WT > 98 > 99 R

V8 46 ± 2 > 99 R

V10 11± 1 > 99 R

In Anwesenheit von NADH

Produktbildung (%) ee (%)

WT 14 ± 1,7 > 99 R

V8 > 98 > 99 R

V10 94 ± 3 > 99 R

Diese Ergebnisse zeigen, dass sich beide Varianten (V8, V10) hervorragend für eine

Biotransformation von 1 eignen. Beide erreichten mit NADH ähnliche Produktbildungen

wie der Wildtyp mit NADPH. Die Stereoselektivität wurde nicht beeinflusst.

Um festzustellen ob die generierten Varianten V8-V10 auch für andere Reaktionen

eingesetzt werden können, wurde beispielhaft die Bildung von 84 und 255 untersucht

(Tab. 84).

Tabelle 84: Produktbildung und Enantiomerenüberschüsse für die Varianten V8-V10 bezüglich der Bildung von 84 und 255.

Produktbildung (%), (ee %)

Substrate Produkte Reaktionszeit WT (NADPH)

V8 (NADH)

V9 (NADH)

V10 (NADH)

4 h 84 ± 5 82 ± 3 81 ± 1 65 ± 1

5 h

82 ± 2

77 ± 2

n.b.

67 ± 5

20 h > 98 (>95 S)

> 98 (>95 S)

n.b. 93 ± 1 (>95 S)

n.b. nicht bestimmt. Die angegebene Standardabweichung bezieht sich auf eine Dreifachbestimmung.

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Ergebnisse

103

Die beiden Beispiele zeigen, dass die generierten Varianten auch für andere

Reaktionstypen, wie die doppelte reduktive Aminierung oder die Reaktion von

α-Hydroxycarbonylen mit Diaminen, geeignet sind. Es wurden ähnliche

Produktbildungen erreicht wie beim Wildtyp. Die Stereoselektivität bei der Bildung von

255 wurde durch die eingefügten Mutationen nicht beeinträchtigt.

4.5.2. Kristallstruktur von R-IRED_Ms-WT und R-IRED_Ms-V8

Durch eine Kooperation mit der Forschungsgruppe von Prof. Gideon J. Grogan

(Universität York) konnte die Kristallstruktur von R-IRED_Ms-WT und R-IRED_Ms-V8

gelöst werden (Abb. 23).

Abbildung 23: Gelöste Kristallstruktur von R-IRED_Ms-WT (links) und R-IRED_Ms-V8 mit gebundenem Kofaktor (NAD(P)+, hellblau). Die gezeigten Strukturen sind bislang noch nicht in der Proteindatenbank hinterlegt. Die beiden IRED-Monomere sind jeweils in zwei verschiedenen Grautönen angedeutet. Die Visualisierung erfolgte mit Pymol. Gezeigt ist die Oberflächen-Darstellung des Enzyms.

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Ergebnisse

104

4.6. Mutationsstudie zur Identifizierung von Stereoselektivitäts-bestimmenden Aminosäurepositionen

Durch eine Mutationsstudie im aktiven Zentrum von R-IRED_Ms sollten

Stereoselektivitäts-bestimmende Aminosäurepositionen identifiziert werden. Die

gefundenen Positionen sollten anschließend für die Entwicklung einer S-selektiven

Enzymvariante genutzt werden. Als Templat für diesen „selectivity-switch“ wurde die

NADH-abhängige Variante V8 eingesetzt. Eine erfolgreiche Änderung der

Stereoselektivität hätte also den Nebeneffekt, dass erstmals auch eine NADH-abhängige,

S-selektive IRED zur Verfügung steht.

Verschiedene, teils Literatur-bekannte Positionen wurden für eine erste Mutationsrunde

adressiert. Die Positionen wurden anhand eines Multisequenz-Alignments ausgewählt,

für welches die Sequenzen verschiedener R- und S-selektiver IREDs herangezogen

wurden (Abb. 24).

Abbildung 24: Multisequenz-Alignment mit 31 IREDs, davon 12 S-selektive (blau) und 19 R-selektive IREDs (grün). Die Sequenz von R-IRED_Ms ist dickgedruckt. Zur Orientierung sind einige Aminosäurepositionen angegeben (bezogen auf R-IRED_Ms). Eine Besonderheit ist die „D-Typ“ S-selektive IRED aus Streptomyces rimosus. Im Gegensatz zu den meisten S-selektiven IREDs weist sie kein Tyrosin (Y), sondern eine Asparginsäure (D) an der katalytischen Position auf (gelb markiert).

96 123 171 178 234 242Aminosäureposition (R-IRED_Ms):

S-s

ele

kti

ve

IR

ED

sR

-se

lek

tiv

e I

RE

Ds

212

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Ergebnisse

105

Die Positionen 123, 171 und 178 (bezogen auf R-IRED_Ms) sind bereits mehrfach in

Bezug auf R- und S-Selektivität beschrieben worden.[110,114] Jedoch können auch mit

diesen Positionen keine absoluten Regeln abgeleitet werden. Die S-selektive IRED aus

Streptomyces rimosus entspricht beispielsweise dem „D-Typ“, jedoch ist sie nicht wie

erwartet R-selektiv sondern S-selektiv.[110]

Im Rahmen dieser Arbeit wurden auf Sequenzebene weitere signifikante Positionen im

aktiven Zentrum gefunden. So weisen die meisten S-IREDs an Position 96 (bezogen auf

R-IRED_Ms) eine Asparaginsäure auf, während R-IREDs vorwiegend Glycin an dieser

Position aufweisen. Position 123 wurde bislang immer einzeln betrachtet, schaut man

sich jedoch auch die benachbarten Positionen an fällt auf, dass bei S-IREDs häufig das

Motiv „VPA“ und bei R-IREDs häufig das Motiv „AVP“ zu finden ist. Es sind also dieselben

Aminosäuren vorhanden, jedoch ist die Reihenfolge verändert. An Position 212 befindet

sich bei R-IREDs häufig ein Tryptophan, in S-IREDs hingegen befinden sich überwiegend

kleine Aminosäuren an dieser Position. Auch interessant ist, dass an Position 234 bei

S-IREDs eine Asparaginsäure konserviert ist. An derselben Position konnte bei R-IREDs

jedoch keine Konservierung festgestellt werden. Eine weitere signifikante Position ist

242. Hier ist bei S-IREDs vorwiegend ein Methionin oder Glycin zu finden. Bei R-IREDs

hingegen befindet sich dort meistens ein Histidin oder ein Glutamin.

Zunächst wurden an den genannten Positionen einige gezielte Mutationen eingeführt

und getestet. An den Positionen S96 und D171 wurden außerdem eine Sättigungs- bzw.

kombinierte Teilsättigungsmutagenese durchgeführt (Tab. 85). Als Modellreaktion

wurde die Reduktion von 2-Methylpyrrolin (1) zu (R)- oder (S)-2-Methylpyrrolidin (7)

ausgewählt.

Die generierten Enzymvarianten, sowie die erstellten Mutantenbibliotheken wurden

mittels Platten-Screening (Kap. 3.8.3) analysiert. Jedoch konnte keine Variante mit

geänderter Stereoselektivität gefunden werden. Die Varianten R1A1-R1A5 wurden

außerdem für eine genauere Analyse gereinigt. Jedoch waren sie extrem instabil und

präzipitierten nach kurzer Zeit. Die einzige stabile Variante war R1A3 (M178F), jedoch

zeigte sie keinerlei Veränderung der Stereoselektivität.

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Ergebnisse

106

Tabelle 85: Eingeführte Mutationen im Rahmen der ersten Mutageneserunde zur Identifizierung Selektivitäts-bestimmender Aminosäurepositionen.

Nr. Aminosäureposition

94 96 97 122 123 124 170 171 172 178 234 235 236 242

Wildtyp T G S A T P L D S M Q T L H

R1A1 T G S V P A L D S M Q T L H

R1A2 T G S A T P L Y S M Q T L H

R1A3 T G S A T P L D S F Q T L H

R1A4 T G S A T P L D S M D V D H

R1A5 T G S A T P L D S M Q T L G

R21 T G S A T P X Y Q M Q T L H

R37 T D X A T P L D S M Q T L H

R38 X1 D X1 A T P L D S M Q T L H

Gezielte Mutation

X1 Teilsättigungsmutagenese mit X = A, D, F, S, V, Y

X Sättigungsmutagenese mit X = alle 20 Aminosäuren

Da diese rationale Vorgehensweise keinen Erfolg zeigte wurden keine gezielten

Einzelmutationen mehr vorgenommen. Stattdessen wurden im nächsten Schritt weitere

Bibliotheken im aktiven Zentrum generiert und gescreent. Dabei wurden alle

Aminosäurepositionen berücksichtigt, welche sich in der Nähe vom C4-Atom von NADH

(Position des Hydrid-Transfers) befinden. Aminosäurepositionen, die sich in räumlicher

Nähe zueinander befanden, wurden zu Paaren zusammengefasst und in einer

kombinierten Teilsättigungsmutagenese gleichzeitig ausgetauscht. Somit wurden auch

kombinatorische Effekte teilweise berücksichtigt. An allen weiteren Positionen wurde

eine Sättigungsmutagenese durchgeführt (Tab. 86).

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Ergebnisse

107

Tabelle 86: Eingeführte Mutationen im Rahmen der zweiten Mutageneserunde zur Identifizierung Selektivitäts-bestimmender Aminosäurepositionen.

Nr. Aminosäureposition

13 95 120 121 122 123 124 171 175 178 212 237 241 242 245

Wildtyp M S I M A T P D L M V A A H A

R18 X S I M A T P D L M V A A H A

R11 M X1 I M A T P X1 L M V A A H A

R12 M S X1 X1 A T P D L M V A A H A

R13 M S I M X1 X1 P D L M V A A H A

R19 M S I M A T X D L M V A A H A

R14 M S I M A T P D X1 X1 V A A H A

R16 M S I M A T P D L M X A A H A

R17 M S I M A T P D L M V X A H A

R15 M S I M A T P D L M V A X1 X1 A

R110 M S I M A T P D L M V A A H X

X1 Teilsättigungsmutagenese mit X = A, D, F, S, V, Y

X Sättigungsmutagenese mit X = alle 20 Aminosäuren

Alle zehn Mutantenbibliotheken der zweiten Mutageneserunde wurden mittels Platten-

Screening analysiert. Dabei konnten in den Bibliotheken R11-R14 sowie in den

Bibliotheken R16-R19 keine Varianten mit veränderter Stereoselektivität beobachtet

werden. In der Bibliothek R15 konnte eine Variante (15B7, A141V/H242Y) identifiziert

werden, die im Vergleich zum Wildtyp etwas mehr S-Enantiomer gebildet hat, sodass

der Enantiomerenüberschuss (ee) von > 99% R auf 95% R sank. Eine weitere Variante

wurde in R110 gefunden (110C2, A245C) mit einem ee von 97% R. Am

vielversprechendsten war jedoch Variante 110D2 (A245L), welche zwar kaum aktiv

war, jedoch ein fast racemisches Produktgemisch generierte (ee ≈ 14% R).

Aufgrund dieser Ergebnisse wurden die Positionen 241, 242 und 245, sowie die

umliegenden Aminosäuren in einer weiteren Mutageneserunde verändert (Tab. 87).

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Ergebnisse

108

Tabelle 87: Eingeführte Mutationen im Rahmen der dritten Mutageneserunde zur Identifizierung Selektivitäts-bestimmender Aminosäurepositionen.

Nr. Aminosäureposition

240 241 242 243 244 245 246

Wildtyp E A H N V A F

R22 E V Y N V X F

R36 E I Y N V X F

R23 E X1 X1 N V L F

R24 E X Y N V A F

R25 E V X N V A F

R26 E M X N V A F

R27 X1 V Y X1 V A F

R28 E A H N X1 C X1

R29 E V Y N X1 C X1

R31 E A H N X1 L X1

R32 E I Y N X1 L X1

R39 E A H N V L X

R41 E X Y N V L F

R42 E V X N V L F

R43 E V Y X V L F

R44 E V Y X1 X1 L F

Etablierte Mutationen aus vorherigen Runden

X1 Teilsättigungsmutagenese mit X = A, D, F, S, V, Y

X Sättigungsmutagenese mit X = alle 20 Aminosäuren

Alle 16 Mutanten-Bibliotheken der dritten Mutageneserunde wurden mittels Platten-

Screening analysiert. Es zeigte sich, dass diese Region einen starken Einfluss auf die

Stereoselektivität hat. Durch das Einführen zusätzlicher Mutationen in dieser Region

konnte die Bildung des S-Enantiomers weiter gesteigert werden. Einige Enzymvarianten

mit veränderter Stereoselektivität konnten gefunden werden. In Tabelle 88 sind alle

gefundenen Varianten sortiert nach Stereoselektivität aufgeführt.

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Ergebnisse

109

Tabelle 88: Identifizierte R-IRED_Ms-Varianten mit geänderter Stereoselektivität bezüglich der Bildung von 2-Methylpyrrolidin (7).

Variante Mutationen Enantiomeren-überschuss (%)

Wildtyp - > 99 (R)

V8 N32E / R33Y / T34E / K37R / L67I / T71V > 99 (R)

110C2 V8 + A245C 97 (R)

15B7 V8 + A241V / H242Y 95 (R)

27H9 V8 + E240D / A241V / H242Y / N243F 94 (R)

27F7 V8 + E240D / A241V / H242Y / N243Y 92 (R)

24E4 V8 + A241I /H242Y 92 (R)

27C8 V8 + E240S / A241V / H242Y / N243Y 91 (R)

25C11 V8 + A241V / H242F /A245T 80 (R)

36BB10 V8 + A241I/H242Y/A245T 78 (R)

36F10 V8 + A241I/H242Y/A245G 68 (R)

110D2 V8 + A245L 14 (R)

41C3 V8 + A241L/H242Y/A245L 31 (S)

23B3 V8 + A241V/H242Y/A245L 72 (S)

44D6 V8 + A241V/H242Y/N243A/V244S/A245L 72 (S)

44E2 V8 + A241V/H242Y/N243D/V244S/A245L 72 (S)

43G9 V8 + A241V/H242Y/N243Y/A245L 78 (S)

44B4 V8 + A241V/H242Y/N243D/V244F/A245L 80 (S)

44A2 V8 + A241V/H242Y/N243D/V244Y/A245L 91 (S)

Durch die Einführung von fünf Mutationen an den Positionen 241-245 konnte ein

Enantiomerenüberschuss von 91% (Variante 44A2) erreicht werden. Das bedeutet, dass

etwa 95,5% S-Enantiomer und nur 4,5% R-Enantiomer gebildet wurden. Die

Stereoselektivität konnte also fast vollständig gedreht werden. Allerdings wurde bei

allen S-selektiven Varianten eine stark reduzierte Aktivität festgestellt. Um einen

genaueren Vergleich der Aktivitäten zu ermöglichen wurde die Variante 44A2 gereinigt.

Es zeigte sich jedoch, dass diese Enzymvariante nicht sehr stabil ist und bereits kurz

nach der Reinigung allmählich denaturierte. Eine zweite Aufreinigung mit 5% (w/v)

Glycerin als Stabilisator verlief ähnlich und führte nicht zu einer Verbesserung der

Enzymstabilität. Direkt nach der Reinigung wurden Biotransformationen gestartet,

wobei zu diesem Zeitpunkt ein Teil des Enzyms bereits denaturiert war. Die Ergebnisse

der Biotransformation sind in Tabelle 89 zusammengefasst. Neben der Reduktion von

2-Methylpyrrolin (1) wurde außerdem die Bildung von N-Methyl-3-phenylpiperazin

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Ergebnisse

110

untersucht. Zum Vergleich wurden außerdem Biotransformationen mit dem Wildtyp

und mit der S-selektiven IRED aus Paenibacillus elgii (S-IRED_Pe) durchgeführt.

Tabelle 89: Produktbildungen und Enantiomerenüberschüsse aus der in vitro Untersuchung mit der R-IRED_Ms Variante 44A2. Zum Vergleich wurden Biotransformationen mit S-IRED_Pe durchgeführt.

Produktbildung %, (ee %)

Substrat/e Produkte R-IRED_Ms-WT 44A2 S-IRED_Pe

> 99

(>99 R) >99

(91 S) >99

(95 S)

> 99

(>99 R) 15 ± 2 (99 R)

4 ± 1 (17 S)

Die angegebene Standardabweichung bezieht sich auf eine Dreifachbestimmung.

Überaschenderweise war die Stereoselektivität von 44A2 gegenüber der Bildung von

91a nahezu unverändert verglichen mit dem Wildtyp. Die induzierte S-Selektivität ließ

sich also nicht auf eine andere Reaktion übertragen.

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Diskussion

111

5. Diskussion

Im Fokus dieser Arbeit stand die Generierung von N-Heterozyklen mit Hilfe von

Iminreduktase (IRED) basierten biokatalytischen Systemen. Durch die Anwendung einer

R-selektiven IRED aus Myxococcus stipitatus und die Entwicklung neuartiger IRED

katalysierter Reaktionen konnten schließlich zahlreiche Zielverbindungen erfolgreich

generiert werden. Weiterhin gelang durch einen enzyme engineering Ansatz erstmalig

die Entwicklung einer strikt NADH abhängigen IRED, sodass neue

Kofaktorregenerationssysteme zur Verfügung stehen. Eine umfangreiche

Mutationsstudie im aktiven Zentrum ermöglichte darüber hinaus die Identifizierung von

selektivitätsbestimmenden Positionen, sodass ein „enantioselectivity-switch“ mit einer

Iminreduktase durchgeführt werden konnte.

5.1. Charakterisierung von R-IRED_Ms

Das IRED-Screening der Firma GSK (Glaxo Smith Kline GmbH) war ein wichtiger Hinweis

dafür, dass IREDs abseits von den bislang beschriebenen Reaktionen eine Vielzahl

weiterer zyklischer Imine reduzieren können. Die R-selektive IRED aus Myxococcus

stipitatus (R-IRED_Ms) zeigte dabei das breiteste Substratspektrum und wurde deshalb

für weitere Studien ausgewählt.

Die ermittelten kinetischen Parameter von R-IRED_Ms (Kap. 4.1.1) bezüglich einiger

Modellsubstrate zeigen, dass dieses Enzym eine höhere Affinität zu Piperidinen (2-4)

und Dihydroisoquinolinen (5,6) aufweist verglichen mit 2-Methylpyrrolin (1). Mit

Dihydroisoquinolinen werden jedoch nur schwache Aktivitäten erreicht.

Vergleicht man die Werte von R-IRED_Ms mit literaturbekannten Werten von anderen

IREDs[124] (Tab. 90) fällt auf, dass phenylsubstituierte Pipereidine (3,4) mit einer

verhältnismäßig hohen Effizienz umgesetzt werden. Interessant dabei ist, dass

2-Phenylpipereidin (3) eine relativ starke Substratüberschussinhibierung erzeugt

(KI ≈ 4 mM). Mit 4-Fluoro-2-phenylpiperidin (4) hingegen, wird keine Inhibierung

beobachtet. Ähnliches wird auch bei der R-selektiven IRED aus Streptosporangium

roseum DSM43021 (R-IRED_Sr) und bei der S-selektiven IRED aus Paenibacillus elgii

(S-IRED_Pe) beobachtet. Da die aktive Tasche von IREDs in der Regel sehr hydrophob ist,

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Diskussion

112

könnte es sein, dass sich hydrophobe Gruppen im aktiven Zentrum anlagern und dieses

blockieren, ohne dass dabei eine Katalyse erfolgt. Dies ist eine von mehreren möglichen

Gründen für eine Substratüberschussinhibierung.[189] Die beobachtete Inhibierung,

welche bei Substraten mit Phenylring (3, 5, 6) besonders hoch ist, könnte durch eine

solche Blockade der aktiven Tasche erklärt werden. Bei 4 hingegen werden die

hydrophoben Wechselwirkungen durch den Fluor-Substituenten verringert, was ein

Grund dafür sein könnte, weshalb eine Substratüberschussinhibierung nicht beobachtet

wird.

Tabelle 90: Vergleich der ermittelten kinetischen Parameter von R-IRED_Ms mit literaturbekannten Werten von anderen IREDs.[124] R-IRED_Sr: R-selektive IRED aus Streptosporangium roseum DSM43021, R-IRED_St: R-selektive IRED aus Streptomyces turgidiscabies, S-IRED_Pe: S-selektive IRED aus Paenibacillus elgii.

Substrat IRED Km

(mM) kcat

(s-1) KI

(mM) kcat Km-1

(mM-1 s-1) R-IRED_Ms

R-IRED_Sr R-IRED_St S-IRED_Pe

1,0 1,1 1,8 1,3

2,3 1,0 0,5

0,03

20 28 21 33

2,2 0,9 0,3

0,02

R-IRED_Ms R-IRED_Sr R-IRED_St S-IRED_Pe

0,1 0,2 0,2 1,4

1,5 11 8

0,1

--- 11 31

140

15

55 36 0,8

R-IRED_Ms R-IRED_Sr R-IRED_St S-IRED_Pe

0,34 0,5 0,3 1,4

2,7 0,4 0,1

0,002

4 16 7 8

7,9 1,0 0,5

0,002

R-IRED_Ms R-IRED_Sr R-IRED_St S-IRED_Pe

0,84 0,4 0,3 2,8

4,8 0,4 0,2 0,1

--- --- 11 ---

5,7 0,1 0,6

0,004

R-IRED_Ms R-IRED_Sr R-IRED_St S-IRED_Pe

0,29 0,05 0,06 0,13

0,9 0,4 0,3 0,1

0,2 6 4

91

3,1 8,4 5,8 0,9

R-IRED_Ms R-IRED_Sr R-IRED_St S-IRED_Pe

0,11 0,08 0,03 0,14

0,04 0,22 0,1

0,01

13 24 15 ---

0,36 2,8 3,8

0,08

Neben der Bestimmung der kinetischen Parameter beinhaltete die weitere

Charakterisierung von R-IRED_Ms das Testen neuer Iminsubstrate (Kap. 4.1.2). Dabei

zeigte sich unter anderem, dass 3-Phenyl-5,6-dihydropyrazin-2(1H)-one (19) mit hoher

Aktivität zum Ketopiperazinprodukt reduziert wird (Kap. 4.1.2, Tab. 54). Mittels

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Diskussion

113

Aminolyse[178] von Glyoxylatestern mit Ethylendiamin könnten neben 19 noch weitere

analoge Substrate hergestellt werden (einstufige Synthese). Durch die anschließende

Reduktion mit R-IRED_Ms könnte somit die Bildung unterschiedlicher chiraler

Ketopiperazine ermöglicht werden. Ein Beispiel für die Anwendung eines chiralen

Ketopiperazins ist die Herstellung des Anti-Diabetes Wirkstoffs Evogliptin.[190]

Weiterhin gelang die Reduktion eines Dihydrothiazols (25, Kap. 4.1.2, Tab. 54). Ähnliche

Substrate konnten in einer anderen Studie bereits erfolgreich von IREDs reduziert

werden.[191] Eine außergewöhnlich hohe Aktivität wurde außerdem gegenüber dem

Iminsubstrat 26 beobachtet (Kap. 4.1.2, Tab. 54). Hierbei handelt es sich um einen

siebengliedrigen Ring mit den Heteroatomen Stickstoff und Sauerstoff. Es wurde bereits

beschrieben, dass IREDs Heterozyklen mit Stickstoff und Sauerstoff reduzieren können,

jedoch wurden bei diesen Studien 2H-1,4-Benzoxazine eingesetzt, welche sich stark von

26 unterschieden.[192]

Gegenüber Imidazolinen (13-14) und Tetrahydropyrimidinen (15-16) konnte keine

Aktivität nachgewiesen werden. Durch den zweiten Stickstoff, der sich bei diesen

Substraten direkt neben der Imingruppe befindet, gibt es eine Mesomerie-

Stabilisierung.[193] Dies könnte der Grund für das Ausbleiben einer IRED katalysierten

Reduktion sein.

Im nächsten Schritt konnte gezeigt werden, dass auch reduktive Aminierungen mit

R-IRED_Ms möglich sind. Von den wenigen getesteten Substraten zeigte sich

Cyclohexanon (31) als das am besten geeignetste Carbonylsubstrat. Ein Vergleich mit

anderen Studien zeigt, dass auch bei anderen IREDs häufig die höchsten Aktivitäten mit

Cyclohexanon gemessen werden. [130–132]

5.2. Reduktive Hydrazinierung

Eine bislang noch nicht beschriebene Reaktion ist die IRED katalysierte Umsetzung von

Carbonylsubstraten mit Hydrazinen anstelle von Aminen. In diesem Fall wird kein Imin-

Intermediat, sondern ein Hydrazon-Intermediat gebildet, welches anschließend mit

einer IRED zum Hydrazin reduziert werden kann (Abb. 25). Diese Art der Reaktion wird

deshalb in dieser Arbeit auch als reduktive Hydrazinierung bezeichnet. Je nachdem wie

viele Substituenten sich am Hydrazinsubstrat befinden, können weitere Reaktionen mit

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Diskussion

114

dem Produkt und dem Carbonylsubstrat stattfinden, sodass verschiedene weitere

Hydrazinierungsprodukte möglich sind (Abb. 25).

Abbildung 25: Allgemeines Reaktionsschema der IRED katalysierten reduktiven Hydrazinierung von Carbonylen mit Hydrazinen, am Beispiel von einfach substituierten Hydrazinen. Durch zusätzliche reduktive Hydrazinierungsschritte können theoretisch weitere Hydrazinierungsprodukte entstehen.

Die Ergebnisse des Substratscreenings (Kap. 4.2.2, Tab. 56-59), sowie die identifizierten

Hydrazinprodukte (Kap. 4.2.2, Tab. 60) zeigen, dass die reduktive Hydrazinierung

analog zur reduktiven Aminierung angewendet werden kann. Die Weiterreaktion der

Produkte mit dem Carbonylsubstrat wurde nur in einem Fall beobachtet. Diese

Möglichkeit der Nebenproduktbildung spielt also kaum eine Rolle und ist kein

wesentlicher Nachteil gegenüber der reduktiven Aminierung. Ein Grund für das

Ausbleiben der Weiterreaktion ist möglicherweise der sterische Anspruch des

Nukleophils. Ähnliche Beobachtungen gibt es auch bei der Verwendung von sterisch

anspruchsvollen Aminen für die reduktive Aminierung.[128,132]

Ein Vergleich der Ergebnisse der reduktiven Hydrazinierung (Kap. 4.2.2) mit den

Ergebnissen der reduktiven Aminierung (Kap. 4.2.1) zeigt, dass die Substratpräferenz

von R-IRED_Ms für beide Reaktionstypen ähnlich ist. Bei vier Carbonylsubstraten

(31-34) ist ein direkter Vergleich möglich. Hier zeigt sich, dass Methylamin insgesamt

besser akzeptiert wird als Methylhydrazin. Diese Beobachtung trifft jedoch nicht auf

Phenylaceton (34) zu. Hier war die Aktivität mit Methylhydrazin doppelt so hoch wie

mit Methylamin.

Im Vergleich zu chiralen Aminen, welche bei der reduktiven Aminierung gebildet

werden, gibt es kaum bekannte Pharmazeutika mit Hydrazin Strukturmotiven. Jedoch

treten Hydrazine häufig als Zwischenstufen in verschiedenen Syntheserouten auf, wie

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Diskussion

115

beispielsweise bei der Fischerschen Indolsynthese.[194] Eines von wenigen Beispielen für

ein Pharmazeutikum mit Hydrazingruppe ist das Zytostatikum Procarbazin.[195]

Eine mögliche Anwendung für die reduktive Hydrazinierung wäre auch die Bildung von

chiralen, primären oder sekundären Aminen mithilfe eines zweiten chemischen

Schrittes. Nach der IRED katalysierten Bildung des chiralen Hydrazins könnte das

Hydrazin mit Wasserstoff reduktiv gespalten werden, sodass ein primäres oder

sekundäres chirales Amin zurückbleibt (Abb. 26). Für die Spaltung können

beispielsweise Nickel- oder Palladium-Katalysatoren eingesetzt werden.[196–199]

Interessant ist diese Strategie vor allem dann, wenn bei der reduktiven Hydrazinierung

höhere Aktivitäten oder Selektivitäten erreicht werden als bei der reduktiven

Aminierung.

Abbildung 26: Bildung von primären oder sekundären Aminen durch eine doppelte reduktive Hydrazinierung mit anschließender reduktiver Spaltung des Hydrazins.

5.3. Doppelte reduktive Aminierung

Die doppelte reduktive Aminierung ist eine neue Anwendungsmöglichkeit für IREDs,

welche im Rahmen dieser Arbeit erstmals beschrieben wurde.[172] Sie ermöglicht die

direkte Bildung von substituierten Piperazinen und Homopiperazinen ausgehend von

Dicarbonylen und Diaminen.

Eine Herausforderung bei dieser Reaktion ist, dass Dicarbonyle und Diamine in

wässriger Lösung spontan miteinander reagieren, und diverse Nebenprodukte bilden

können. [200] Je nach Substratkombination sind diese Reaktionen unterschiedlich schnell

und zeigen sich meist durch eine Verfärbung der Lösung. Durch die Verwendung von

R-IRED_Ms werden die Substrate jedoch meist rasch umgesetzt, sodass die

Nebenreaktionen weitestgehend unterdrückt werden. Oft bleibt deshalb die Lösung der

Biotransformation klar, während sich die Negativkontrolle ohne Enzym verfärbt. Die

stark verminderte Nebenproduktbildung durch den Einsatz von R-IRED_Ms konnte

außerdem mittels GC-MS bestätigt werden.

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Diskussion

116

Im Gegensatz zur (einfachen) reduktiven Aminierung sind bei dieser Reaktion zwei

IRED katalysierte Reduktionen nötig, sodass sich zwei mögliche Reaktionswege ergeben

(Kap. 4.3.1, Abb. 14). Die Tatsache, dass das Diimin-Intermediat 17 (Intermediat aus

Reaktionsweg B) nicht von R-IRED_Ms reduziert werden konnte (Kap. 4.3.1, Tab. 62), ist

ein Beweis dafür, dass zumindest für die Substratkombination 2,3-Butandion (85) mit

Ethylendiamin (83) Reaktionsweg A bevorzugt wird. Somit wird das erste (lineare)

Imin, welches nach der ersten Kondensationsreaktion entsteht, direkt reduziert, noch

bevor die zweite Kondensation stattfindet. Erst dann bildet sich das zweite (zyklische)

Imin, welches anschließend reduziert wird. Da es sich bei der zweiten Kondensation um

eine intramolekulare Reaktion handelt, kann davon ausgegangen werden, dass die

zweite Kondensation schneller abläuft als die erste (intermolekulare) Kondensation.

Falls beide Kondensationen außerhalb des Enzyms stattfinden sollten, ist eine

Reduktion des ersten Kondensationsproduktes kaum möglich, da das Intermediat

vermutlich rasch zum Diimin weiterreagiert, bevor es das aktive Zentrum von

R-IRED_Ms erreicht. Die Ergebnisse können deshalb auch als Indiz dafür gesehen

werden, dass die Kondensationsreaktion im aktiven Zentrum des Enzyms stattfindet.

Ein weiterer Hinweis dafür, dass R-IRED_Ms an der Kondensationsreaktion beteiligt ist,

ist das ermittelte pH-Optimum, welches sowohl für die einfache als auch für die doppelte

reduktive Aminierung bei pH 7,0 liegt.[132] Die enzymunabhängige Kondensation im

wässrigen Milieu wird hingegen bei höheren pH-Werten begünstigt. Dies ist auch der

Grund, weshalb bei anderen IREDs für die reduktive Aminierung häufig ein pH-Optimum

von pH > 9,0 beobachtet wird. [128,130] Ein Vorschlag für den Mechanismus der IRED

vermittelten Kondensationsreaktion wurde bereits am Beispiel einer IRED aus

Aspergillus terreus beschrieben.[109]

Durch die Untersuchung von 117 Substratkombinationen für die doppelte reduktive

Aminierung mit R-IRED_Ms konnten eine Reihe an Erkenntnissen gewonnen werden.

Zunächst fällt auf, dass der Großteil der getesteten Dicarbonyle akzeptiert wurde. Dabei

wurden sowohl sehr kleine als auch sehr große Dicarbonyle umgesetzt. Es stellt sich die

Frage wie es dem Enzym gelingt, solch große Substrate ins aktive Zentrum zu schleusen,

bzw. die noch größeren Produkte dann wieder aus dem aktiven Zentrum zu entlassen.

Hierbei kommt dem Enzym zu Nutze, dass sich das aktive Zentrum an der Grenzfläche

zwischen zwei Monomeren befindet. Eine Öffnung des aktiven Zentrums ist deshalb

deutlich einfacher als bei anderen Enzymen, bei denen sich das aktive Zentrum im

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Diskussion

117

Inneren eines Monomers befindet. Erste Hinweise für eine „offene“ und „geschlossene“

Konformation bei IREDs wurden bereits beschrieben.[109]

Auch auf Seiten der Diaminsubstrate wurden verschieden große Substituenten

akzeptiert. Jedoch zeigte sich, dass Diamine, bei denen sich eine aromatische Gruppe in

direkter Nachbarschaft zum Stickstoff befindet, nicht umgesetzt werden. Es ist bekannt,

dass aromatische Amine eine niedrigere Nukleophilie aufweisen.[201] Ein weiterer Grund

könnte sein, dass das Imin- oder Diimin-Intermediat durch das konjugierte π-System

stabilisiert wird und deshalb nicht reduziert wird. Gegen diese Erklärung sprechen

jedoch die hohen Aktivitäten, die mit Phenylglyoxal (88) erreicht werden. Auch hier

entstehen Imin-Intermediate mit konjugiertem 𝜋-System, welche sehr effizient von

R-IRED_Ms reduziert werden.

Auch Carboxy-funktionalisierte Diamine wurden nicht akzeptiert. Ein Grund dafür

könnte die hydrophobe aktive Tasche sein, welche vermutlich kaum Interaktionen mit

derartig polaren Verbindungen zulässt.

Durch Verwendung von 1,3-Propandiamin (118) konnten auch siebengliedrige

Heterozyklen, sogenannte Homopiperazine (Diazepane), gebildet werden. Jedoch war

die Aktivität deutlich geringer. Die Bildung von acht- oder neungliedrigen Heterozyklen

gelang nicht. In 7-10 gliedrigen Ringsystemen existieren höhere Ringspannungen

(Prelog-Spannung), sodass der Ringschluss energetisch benachteiligt ist.[202,203] Dies

könnte ein möglicher Grund für die niedrige Aktivität sein.

Bei der Bildung von einfach C-substituierten Piperazinen konnten

Enantiomerenüberschüsse (ee) von bis zu > 99% erreicht werden (90a, 137a,

91a, Kap. 4.3.4, Tab. 66). Dies ist vor allem deshalb eindrücklich, da zwischen den

beiden Reduktionsschritten das Intermediat über Imin-Enamin-Tautomerie

racemisieren kann (Kap. 4.3.1, Abb. 14). Um dennoch diese exzellente Stereoselektivität

erklären zu können, gibt es zwei Möglichkeiten. Entweder die Reduktion des

Intermediates läuft sehr schnell ab, sodass die Racemisierung stark unterdrückt wird.

Oder das Gleichgewicht zwischen den beiden möglichen Imin-Intermediaten liegt stark

auf der Seite des prochiralen Imins, also auf der Seite, bei der sich auch der

C-Substituent befindet. Hierfür spricht die Tatsache, dass Alkylgruppen oder

Arylgruppen die Imingruppe aufgrund des +I bzw. +M-Effekts stabilisieren.

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Diskussion

118

Bei zweifach C-substituierten Piperazinen können theoretisch zwei chirale Zentren

stereoselektiv gebildet werden. Dies ist jedoch nur möglich, wenn die bereits erwähnte

Imin-Enamin-Tautomerie vollständig unterdrückt wird. Es hängt also davon ab, wie

schnell der letzte Reduktionsschritt abläuft. Bei hohen Aktivitäten kann die

Racemisierung unterdrückt werden, sodass beide chirale Zentren stereoselektiv gebildet

werden. Ein Beispiel hierfür ist die Bildung von 2,3-Dimethylpiperazin (86) mit einem

Diastereomerenverhältnis von 97:3 (trans).

Bei der Umsetzung von asymmetrischen Dicarbonylen mit asymmetrischen Diaminen

können zwei mögliche Regioisomere entstehen. Dies ist davon abhängig welche

Carbonylgruppe mit welcher Amingruppe reagiert. Wenn C-substituierte Dicarbonyle

mit N-substituierten Diaminen kombiniert wurden, war die Regioselektivität sehr hoch,

und nur eins von zwei möglichen Regioisomeren wurde detektiert. Ein Beispiel hierfür

ist die Bildung von 91a. Hier reagierte das primäre Amin ausschließlich mit dem Keton

und das sekundäre Amin ausschließlich mit dem Aldehyd. Eine solche Regioselektivität

wurde hingegen nicht beobachtet, wenn C-substituierte Dicarbonyle mit

C-substituierten Diaminen kombiniert wurden. In diesen Fällen wurden beide

Regioisomere detektiert. Ein Grund für den Verlust der Regioselektivität könnte darin

bestehen, dass die beiden primären Aminogruppen des Diaminsubstrats zu ähnlich sind

und deshalb IRED keine klare Präferenz bezüglich der Orientierung des Diamins

aufweist. Ein Beispiel für eine solche Substratkombination ist die Bildung von 129. Hier

wurde ein Regioisomerenverhältnis von etwa 2:1 beobachtet.

Durch verschiedene in vivo Experimente konnte gezeigt werden, dass die doppelte

reduktive Aminierung auch im Ganzzellsystem gelingt. Jedoch war es nicht möglich eine

Produktbildung von über 25% zu erreichen. In späteren Experimenten mit E. coli-Lysat

zeigte sich, dass verschiedene Glyoxale (82, 87, 88) durch E. coli-eigene Enzyme

reduziert werden. Dabei handelt es sich vermutlich um Alkoholdehydrogenasen (ADHs),

welche eine oder beide Carbonyl-Gruppen unter NAD(P)H-Verbrauch reduzieren. Somit

konkurriert R-IRED_Ms mit den in E. coli enthaltenen ADHs um das angebotene

Dicarbonyl. Dies kann als Grund für die verminderte Produktbildung gesehen werden.

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Diskussion

119

5.4. Doppelte reduktive Hydrazinierung

Auch die Bildung von Hexahydropyridazinen und 1,2-Diazepanen mit zwei

nebeneinander liegenden Stickstoffen ausgehend von Hydrazinen und Dicarbonylen

konnte erfolgreich gezeigt werden (Kap. 4.3.10). Die Bildung von fünfgliedrigen Ringen

war jedoch nicht möglich. Als Grund hierfür kann die spontane Reaktion der Substrate

zu Pyrazol gesehen werden,[204] welches in großen Mengen sowohl in der Probe, als auch

in der Negativkontrolle ohne Enzym als Nebenprodukt detektiert wurde. Die Bildung

von sechs- und siebengliedrigen Ringprodukten war hingegen erfolgreich. Häufig wurde

neben dem zyklischen Hydrazinprodukt auch das zyklische Hydrazonintermediat

detektiert. Hier war die Peakfläche sogar meist deutlich größer verglichen mit dem

Hydrazinprodukt. Dies ist ein Hinweis dafür, dass die erste IRED katalysierte Reduktion

schneller abläuft als die zweite Reduktion. Durch Verlängerung der Reaktionszeit oder

durch Erhöhung der Enzymkonzentration könnte die Produktbildung weiter gesteigert

werden. Im Vergleich zu zyklischen Aminen finden zyklische Hydrazine bislang kaum

Anwendung in der Industrie. Ein Beispiel für ein Pharmazeutikum mit einem chiralen,

zyklischen Hydrazin ist der blutdrucksenkende Wirkstoff Cilazapril.[205]

5.5. Verwendung von Additiven zur Steigerung der Enzymaktivität

Durch die Verwendung der Poloxamere Pluronic F-127 oder Pluronic P-123, konnte die

Aktivität für die R-IRED_Ms katalysierte doppelte reduktive Aminierung bis zu 2,4-fach

gesteigert werden. Die eingesetzten Konzentrationen (2-10% w/v) waren deutlich

oberhalb der kritischen Mizellbildungskonzentration (CMC). Zusätzliche Studien mit

weiteren Substraten und weiteren Additiven wurden im Rahmen der Bachelorarbeit von

Steffen Bernhard durchgeführt.[174] Ein Vergleich der Ergebnisse zeigt, dass der Effekt

nicht nur pufferabhängig sondern auch substratabhängig ist. Ein stabilisierender Effekt

kann deshalb ausgeschlossen werden, da dies eine substratunabhängige

Aktivitätssteigerung zur Auswirkung hätte. Ein literaturbekanntes Beispiel für den

Einsatz von Additiven zur Steigerung der Enzymaktivität sind Studien mit Esterasen.

Hierbei wirkt das Additiv als Löslichkeits- bzw. Phasenvermittler.[206] In einer weiteren

Studie wurden Mizellen bildende Additive verwendet um die Aktivität einer

Alkoholdehydrogenase gegenüber lipophilen Substraten zu verbessern.[207] Auch hier

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Diskussion

120

fungierte das eingesetzte Additiv unter anderem als Löslichkeitsvermittler.

In dieser Arbeit wurden die Aktivitätssteigerungen jedoch mit sehr gut löslichen

Substraten beobachtet, sodass in diesem Fall die Erklärung einer

Löslichkeitsverbesserung nicht ausreicht. In einem Test mit 3,4-Dihydroisoquinolin (5),

welches vergleichsweise schlecht löslich ist, war der positive Effekt sogar deutlich

geringer als bei gut löslichen Substraten.[174] Die substratabhängige Aktivitätssteigerung

ist ein Hinweis darauf, dass das Additiv in irgendeiner Form einen Einfluss auf den

Enzymsubstratkomplex hat. Um jedoch die Frage nach der Ursache für die

Aktivitätssteigerung zu klären, sind weitere Untersuchungen notwendig.

5.6. IRED katalysierte Reaktion von α-Hydroxycarbonylen mit Diaminen

Die Bildung von Piperazinprodukten ausgehend von α-Hydroxycarbonylen ist eine

spezielle Art der reduktiven Aminierung, welche im Rahmen dieser Arbeit entdeckt

wurde. Der gezeigte Reaktionsweg ist eine mögliche Erklärung für diese Art der

Reaktion (Abb. 27).

Abbildung 27: Mögliche Reaktionswege zur Bildung von Piperazinprodukten ausgehend von α-Hydroxycarbonylen am Beispiel von einfach C-substituierten α-Hydroxycarbonylen mit Ethylendiamin (83).

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Diskussion

121

Im Gegensatz zur doppelten reduktiven Aminierung ist in diesem Fall nur ein

Reduktionsschritt nötig. Stattdessen ist eine Umlagerung des ersten Imin-Intermediates

nötig. Die Keto-Endiol-Tautomerie bei α-Hydroxycarbonylen führt dazu, dass zwei

mögliche Carbonyltautomere vorliegen, welche im Gleichgewicht miteinander stehen.

Bei einfach C-substituierten α-Hydroxycarbonylen ist das eine Carbonyltautomer ein

Keton und das andere Carbonyltautomer ein Aldehyd (A). Somit kann die

Kondensationsreaktion mit Ethylendiamin (83) theoretisch entweder mit dem Keton

(oben) oder mit dem Aldehyd (unten) erfolgen. Das gebildete Imin-Intermediat lagert

sich anschließend durch Imin-Enamin-Tautomerie und Keto-Enol-Tautomerie um (B).

Das nun vorliegende Aminocarbonyl-Intermediat zyklisiert unter Wasserabspaltung

zum zyklischen Imin (C).

Der entscheidende Unterschied der beiden Reaktionswege ist nun, dass ausgehend vom

Aldehyd (unten) ein prochirales Imin-Intermediat gebildet wird. Durch die

anschließende IRED katalysierte Reduktion kann das Piperazinprodukt stereoselektiv

gebildet werden (D). Beim oberen Reaktionsweg, ausgehend vom Keton, ist dies

hingegen nicht möglich. Bei einem Kontrollexperiment mit 3-Hydroxy-3-methyl-2-

butanon, bei dem eine Umlagerung aufgrund des tertiären Alkohols nicht möglich ist,

wurde wie erwartet kein Piperazinprodukt beobachtet.

Die Tatsache, dass 2-Hydroxymethylpiperazin (255) ausgehend von Dihydroxyaceton

(254) mit einem Enantiomerenüberschuss von > 95% gebildet wurde, ist ein starker

Hinweis darauf, dass das Aldehydtautomer und nicht das Ketotautomer für die

reduktive Aminierung genutzt wird. Der Carbonyl-Kohlenstoff von Aldehyden ist stärker

positiv teilgeladen als bei Ketonen. Deshalb ist der nukleophile Angriff des Diamins bei

Aldehyden im Vergleich zu Ketonen begünstigt. Dies könnte ein möglicher Grund für die

Bevorzugung des Aldehydtautomers sein.

5.7. Änderung der Kofaktorspezifität

Alle bislang beschriebenen Vertreter der IRED-Enzymfamilie sind strikt NADPH-

abhängig.[105,111] Für die biotechnologische Anwendung ist jedoch NADH der geeignetere

Kofaktor. Zum einen ist NADH stabiler[208] und billiger, zum anderen stehen für NADH

deutlich effizientere Kofaktorregenerationssysteme zur Verfügung.[209–213]

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Diskussion

122

Um die Kofaktorspezifität von R-IRED_Ms zu ändern wurden verschiedene

Mutantenbibliotheken erstellt und gescreent.[188] Ziel dabei war es nicht nur eine NADH-

abhängige Variante zu erstellen, sondern Ziel war es auch, dass diese Variante eine

gleichermaßen hohe Aktivität aufweist wie das Wildtypenzym. Die angewendete

Mutationsstrategie basierte auf dem Vorschlag des Online-Tools CSR-SALAD[187]. Obwohl

die Kristallstruktur einer verwandten IRED als Input-Datei für dieses Tool verwendet

wurde, war die Vorhersage sehr zuverlässig. Die Mutagenese zeigte an sechs von sieben

vorgeschlagenen Positionen die erwünschten Effekte. Abweichend vom Vorschlag des

Online-Tools wurden an Position K37 alle 20 Aminosäuren getestet. Nur so konnten die

Mutationen K37A und K37R gefunden werden, welche sich als sehr förderlich erwiesen.

Die adressierten Aminosäurepositionen können in zwei Gruppen eingeteilt werden. N32,

R33, T34 und K37 bilden eine Bindetasche für die 2‘-Phosphatgruppe von NADPH.

Durch Mutationen an dieser Stelle kann die Interaktion mit der Phosphatgruppe

verringert, und gleichzeitig die Interaktion mit der 2‘-Hydroxygruppe von NADH

verbessert werden. Mutationen in diesem Bereich wirken deshalb sehr stark auf die

Kofaktorspezifität. Die Positionen L67 und T71 hingegen interagieren mit dem

Adenosin-Teil von NAD(P)H. Dieser Teil ist bei beiden Kofaktoren gleich aufgebaut,

jedoch haben diese Aminosäuren einen Einfluss auf die Positionierung des Kofaktors.

Mutationen in diesem Bereich wirken deshalb eher auf die Aktivität als auf die

Spezifität.[187]

Durch die Kombination von verschiedenen Mutationen an allen sechs Positionen konnte

die Spezifität vollständig umgedreht werden. Dabei zeigte die Mutation K37A den

höchsten Effekt auf die Spezifität und die Mutation T71V den höchsten Effekt auf die

Aktivität mit NADH. Die beste Variante (V8) zeigte eine gleich hohe Aktivität mit NADH

verglichen mit dem Wildtyp und NADPH. Um die Effekte der Mutationen in dieser

Variante besser zu verstehen, wurde in Kooperation mit der Forschungsgruppe von

Prof. Gideon J. Grogan (Universität York) die Kristallstruktur von R-IRED_Ms-WT und

R-IRED_Ms-V8 gelöst, sodass ein direkter struktureller Vergleich möglich ist (Abb. 28).

In der Kristallstruktur von R-IRED_Ms-WT ist die natürliche Konformation und

Positionierung von NADPH zu sehen. Vergleicht man dies mit der Kristallstruktur von

R-IRED_Ms-V8, so sind kaum Unterschiede in der Ausrichtung des Kofaktors zu

erkennen. Durch die Einführung der sechs gezeigten Mutationen ist es demnach

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Diskussion

123

gelungen, NADH trotz der fehlenden 2‘-Phosphatgruppe in der natürlichen

Konformation und Positionierung zu binden. Vor allem der Nikotinamid-Teil des

Kofaktors (in dieser Darstellung der untere Teil) ist quasi identisch angeordnet. Dies ist

insofern wichtig, da hier der Hydridtransfer auf das Substrat stattfindet. So lässt sich

auch erklären, weshalb die Variante V8 eine vollständig wiederhergestellte Aktivität

aufweist.

Abbildung 28: 3D-Darstellung der Kofaktorbindestelle von R-IRED_Ms Wildtyp (links) und R-IRED_Ms-V8 (rechts) basierend auf der Kristallstruktur. Der co-kristallisierte Kofaktor NADP+ (links) bzw. NAD+ (rechts) ist in Hellblau dargestellt. Die in dieser Studie adressierten Aminosäurereste sind in Cyan dargestellt. Gezeigt ist nur eines von zwei R-IRED_Ms-Monomeren. Das zweite Monomer würde in dieser Darstellung den unteren Teil der Kofaktorbindestelle verdecken und wurde für eine bessere Ansicht ausgeblendet. Die Visualisierung wurde mit PyMol durchgeführt.

Anhand der Kristallstruktur kann auch die Rolle der eingeführten Aminosäurereste

erahnt werden. So ist es sehr wahrscheinlich, dass die eingefügten Glutaminsäurereste

an Position 32 und 34, sowie der Argininrest an Position 37 eine Interaktion mit der

Ribose von NADH eingehen. Insbesondere Wasserstoffbrücken zwischen den besagten

Resten und der 2‘- bzw. 3‘-Hydroxygruppe sind denkbar. Neben der gesteigerten

Affinität zu NADH wird die Bindung zu NADPH verschlechtert. Die Mutationen N32E und

T34E verkleinern die 2‘-Phosphat-Bindetasche, sodass es zu sterischen Hinderungen bei

der Bindung von NADPH kommt. Des Weiteren sorgen die beiden negativ geladenen

WT V8

N32

K37

T34R33

T71

L67

N32E

K37R

T34E

R33Y

T71V

L67I

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Diskussion

124

Glutaminsäurereste für eine elektrostatische Abstoßung der ebenfalls negativ geladenen

Phosphatgruppe.

Bei genauerem Betrachten der gebundenen Kofaktoren können geringfügige

Unterschiede im Adenosin-Teil des Kofaktors festgestellt werden. Dies könnte im

Zusammenhang mit den Aminosäureresten an Position 33 und 71 stehen. Durch die

Mutation T71V wird eine mögliche Wasserstoffbrücke aufgelöst, was der Auslöser für

die leichte Drehung des Adenin-Teils sein könnte. Offensichtlich ist dies sehr wichtig für

die optimale Ausrichtung und Bindung von NADH, da die Mutation T71V einen stark

positiven Effekt auf die Aktivität mit NADH zeigte. Eventuell werden dadurch auch die

anderen Interaktionen verbessert, was die positiven kooperativen Effekte der Mutation

T71V mit den weiteren Mutationen erklären würde.

Eine weitere wichtige Position ist R33. Es ist beschrieben, dass der Argininrest der

Haupt-Interaktionsparnter der 2‘-Phosphatgruppe von NADPH ist.[187] Eine Mutation an

dieser Stelle schwächt somit die Affinität zu NADPH ab. Der Austausch von Arginin

gegen Tyrosin an dieser Position führte zu den besten Ergebnissen. Möglicherweise gibt

es eine förderliche π-π-Wechselwirkung zwischen dem Tyrosinrest und dem Adenin-

Teil.

Neben V8 war auch V10 eine sehr interessante Variante. Sie zeigt zwar eine geringere

Aktivität mit NADH, dafür jedoch eine 2900-fach erhöhte NADH/NADPH Spezifität. Dies

liegt daran, dass fast ausschließlich NADH akzeptiert wird. Für V10 wurde keine

Kristallstruktur gelöst, jedoch unterscheiden sich die Varianten V8 und V10 nur in

Position 37. Die Frage ist nun, warum der Alaninrest bei V10 an dieser Stelle dazu führt,

dass NADPH viel schlechter akzeptiert wird. Die natürliche Aminosäure an dieser

Position ist ein Lysin, welches eine positive Ladung trägt und damit die negativ geladene

2‘-Phosphatgruppe stabilisiert. Bei V8 ist an dieser Stelle ein Arginin welches ebenfalls

eine positive Ladung trägt. Der stabilisierende Effekt bleibt also erhalten, sodass trotz

der anderen Mutationen NADPH immer noch zu einem gewissen Grad interagieren kann.

Durch die Mutation zu Alanin geht diese Stabilisierung vollständig verloren, was der

Grund dafür sein könnte, dass NADPH bei Variante V10 kaum noch akzeptiert wird.

Die Tatsache, dass die Varianten V8 und V10 auch für andere Substrate und andere

Reaktionstypen erfolgreich eingesetzt werden konnten (Kap. 4.5.1 Tab. 84) zeigt, dass

das aktive Zentrum der Varianten ähnlich funktionsfähig ist wie das des Wildtyps.

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Diskussion

125

Dennoch haben sich die katalytischen Eigenschaften von V8 und V10 verändert, was

anhand der gemessenen kinetischen Parameter deutlich wird (Kap. 4.5.1 Tab. 82). Beide

Varianten zeigen eine verschlechterte Affinität zu 2-Methylpyrrolin (1) im Vergleich

zum Wildtyp. Diese Beobachtung war entgegen der Erwartungen, da die Positionierung

des Kofaktors fast identisch ist und keine Mutationen im aktiven Zentrum vorgenommen

wurden. Anhand der Kristallstrukturen wurde nun das aktive Zentrum vom Wildtyp und

V8 verglichen. Die Überlagerung der Strukturen zeigte, dass sowohl die

Sekundärstruktur, als auch die Ausrichtung der Aminosäurereste bei beiden Strukturen

im aktiven Zentrum gleich ist. Die einzige Auffälligkeit war der Methioninrest an

Position 121. Hier zeigt der Methylrest in zwei unterschiedliche Richtungen (Abb. 29).

Auch wenn der Unterschied nur geringfügig ist, kann daraus geschlossen werden, dass

es durchaus weitreichende Effekte der eingefügten Mutationen, bzw. des veränderten

Kofaktors gibt, welche sich bis ins aktive Zentrum erstrecken. Die besagte Methylgruppe

befindet sich in unmittelbarer Nähe (6,4 Å) zum C4-Atom des Kofaktors, an welchem der

Hydridtransfer stattfindet. Des Weiteren ist sie in direkter Nachbarschaft (2,8 Å) zum

katalytisch beteiligten Asparaginsäurerest. Eine Beeinflussung der katalytischen

Eigenschaften ist deshalb denkbar.

Abbildung 29: Dreidimensionale Anordnung der Aminosäuren M121 und D171 im aktiven Zentrum von R-IRED_Ms-WT (beige) und R-IRED_Ms-V8 (blau). Die Strukturen wurden mithilfe eines Struktur-Alignments (PyMol) übereinander gelagert.

D171

M121

NAD(P)+

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Diskussion

126

5.8. Änderung der Stereoselektivität

Eine der wichtigsten Eigenschaften von IREDs ist die hohe Stereoselektivität, die es

ermöglicht chirale Amine mit exzellenter Enantiomerenreinheit zu generieren.[105,214]

Die durchgeführten Studien mit R-IRED_Ms zeigen die effiziente Bildung von

verschiedensten chiralen N-Heterozyklen. Das außergewöhnlich breite

Substratspektrum von R-IRED_Ms und dessen hohe Aktivität gegenüber der doppelten

reduktiven Aminierung ist bislang einzigartig. Jedoch ist durch dieses Enzym nur ein

Enantiomer zugänglich. Für einige Pharmabausteine wird jedoch das jeweils andere

Enantiomer benötigt. Zwar sind bereits einige S-selektive IREDs beschrieben worden,

jedoch könnte es sehr aufwendig sein, eine enantiokomplementäre IRED mit

vergleichbaren Eigenschaften zu finden. Eine alternative Möglichkeit ist deshalb die

Änderung der Stereoselektivität durch enzyme engineering, in der Hoffnung, dass die

besagten Eigenschaften erhalten bleiben.

Um Anhaltspunkte für eine Mutagenesestrategie zu finden stellt sich die Frage,

inwiefern sich die aktiven Zentren von R- und S-selektiven IREDs unterscheiden, und

welche Aminosäurepositionen für die Stereoselektivität verantwortlich sind. Auf

Sequenzebene konnten bereits einige signifikante Unterschiede zwischen R- und

S-selektiven IREDs festgestellt werden.[110,112,114] Die bekannteste Position ist D171

(R-IRED_Ms-Nummerierung), welche auch als katalytisch aktive Aminosäure

beschrieben wird.[108] Während ein Großteil der R-selektiven IREDs an dieser Position

eine Asparaginsäure aufweisen, besitzen die meisten S-selektiven IREDs ein Tyrosin.[114]

Die genaue Funktion des konservierten Asparaginsäure- bzw. Tyrosinrests ist bislang

unklar. Ob, und in welcher Form diese Position an der Protonierung des Substrats

beteiligt ist, scheint von IRED zu IRED unterschiedlich zu sein. Dies zeigen

unterschiedliche Ergebnisse von Mutationsstudien an dieser Position,[112,113] sowie die

Tatsache, dass auch IREDs mit Aminosäuren wie Alanin oder Phenylalanin an dieser

Position existieren.[114]

Einerseits ist eine direkte Beteiligung von Position 171 im Katalysemechanismus

denkbar. Hierbei würde die Protonierung des Stickstoffs direkt durch die Carboxy- bzw.

Hydroxygruppe der Aminosäure erfolgen. Andererseits könnte es auch eine indirekte

Beteiligung geben, bei der beispielsweise ein Wassermolekül koordiniert und aktiviert

wird, welches dann die Protonierung übernimmt. Daneben ist auch die Beteiligung

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Diskussion

127

mehrerer Aminosäuren unter Ausbildung eines Protonennetzwerks denkbar. Ein

solches System wurde bereits für die nahe verwandten β-Hydroxysäuredehydrogenasen

beschrieben.[215]

Um die Funktion von D171 in R-IRED_Ms zu untersuchen wurden Varianten mit

Mutationen an dieser Position erstellt. Die meisten Varianten der Sättigungsmutagenese

(D171X) zeigten kaum Aktivität, was ein Hinweis für die Wichtigkeit dieser Position im

Katalysezyklus ist. Um zu überprüfen, ob D171 als Protonendonor fungiert, wurde die

Asparaginsäure gegen Asparagin ausgetauscht (D171N). Bei dieser Mutation wird die

Carboxylgruppe durch eine Carboxamidgruppe ausgetauscht, sodass der

Aminosäurerest die protonierende Fähigkeit verliert. Die Positionierung der

funktionellen Gruppe, sowie die Fähigkeit zur Wasserstoffbrückenbildung bleibt jedoch

erhalten. Da die Variante V8-D171N eine kaum verringerte Aktivität zeigte, kann eine

D171 vermittelte direkte Protonierung ausgeschlossen werden. Stattdessen ist es

naheliegend, dass es sich um eine indirekte Beteiligung handelt, welche auch durch die

Aminosäure Asparagin übernommen werden kann. Da S-selektive IREDs meistens ein

Tyrosin an dieser Position aufweisen, wurde auch die Mutation D171Y gezielt eingeführt

und getestet. Jedoch zeigte diese Variante einen fast vollständigen Aktivitätsverlust.

Auch konnten keine Veränderungen in der Stereoselektivität festgestellt werden.

Neben Position D171 gibt es noch weitere literaturbekannte Positionen, welche sich bei

R- und S-selektiven IREDs signifikant unterscheiden. Dazu zählen die Positionen P124

und M178 (R-IRED_Ms-Nummerierung).[110] Doch durch die Mutagenese an diesen und

weiteren signifikanten Positionen konnten ebenfalls keine Varianten mit geänderter

Stereoselektivität gefunden werden.

Das bislang einzige literaturbekannte Beispiel für eine Änderung der Stereoselektivität

bei IREDs ist eine Studie an der R-selektiven IRED aus Aspergillus oryzae

(R-IRED_Ao).[132] Hierbei wurden Einzelmutationen an Position W210 (R-IRED_Ao-

Nummerierung) eingefügt. Dabei konnte gezeigt werden, dass insbesondere die

Mutation W210A bei den getesteten reduktiven Aminierungen zu einer signifikanten

Änderung der Stereoselektivität führt.[132] Eine Sättigungsmutagenese an der analogen

Position in R-IRED_Ms (V212) zeigte jedoch keinerlei Varianten mit geänderter

Stereoselektivität. Vermutlich ist an dieser Stelle eine drastische Vergrößerung der

Substratbindetasche notwendig um eine Änderung der Stereoselektivität zu erreichen.

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128

Da R-IRED_Ms jedoch bereits eine relativ kleine Aminosäure (Valin) an dieser Position

besitzt, ist eine derartige Veränderung nicht möglich.

In weiteren Mutagenesestudien im aktiven Zentrum zeigte sich schließlich, dass

Mutationen in einer bestimmten Region (A241-A245) zur Änderung der

Stereoselektivität beitragen. Durch die Kombination von fünf Mutationen in diesem

Bereich (Variante 44A2) konnte die Stereoselektivität von > 99% R (ee) zu 91% S (ee)

geändert werden. Diese Variante trägt die Mutationen A241V, H242Y, N243D, V244Y

und A245L. Besonders interessant ist hierbei die Mutation H242Y, da Tyrosin ein

potenzieller Protonendonor ist. Außerdem befindet sich diese Position in einem sehr

ähnlichen Abstand (≈7,4 Å) zum C4-Atom von NADH verglichen mit D171 (Abb. 30). Es

ist also denkbar, dass Y242 die Protonierung des Substrats von der anderen Seite

ermöglicht und somit eine geänderte Substratorientierung unterstützt (Anhang,

Kap. 7.5, Abb. 40). Die Erstellung und Untersuchung der Variante 44A2-Y242F spricht

jedoch gegen diese Hypothese. Durch den Austausch von Tyrosin zu Phenylalanin kann

weder eine direkte, noch eine indirekte Protonierung durch diese Position stattfinden.

Dennoch wurde eine ähnliche Aktivität wie bei 44A2 und ein Überschuss des

S-Enantiomers beobachtet (ee = 48% S). Eine katalytische Beteiligung von Y242 kann

somit ausgeschlossen werden.

Abbildung 30: Darstellung der aktiven Tasche von R-IRED_Ms-V8 mit gebundenem NAD+ (hellblau) und einiger wichtiger Aminosäuren (cyan).

D171

A245

H242

A241

V212

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Diskussion

129

Möglich wäre stattdessen eine substratspezifische Interaktion der Positionen 241-245

mit 2-Methylpyrrolin (1). Dies würde auch erklären, weshalb die Stereoselektivität

gegenüber der Reduktion von 1 nahezu vollständig umgekehrt wurde und gleichzeitig

die Stereoselektivität gegenüber der Bildung von N-Methyl-3-phenylpiperazin (91a)

unverändert blieb.

Abbildung 31: Schematische Darstellung der aktiven Tasche von R-IRED_Ms-WT (A, C) und R-IRED_Ms-44A2 (B, D) mit zwei verschiedenen Substraten (blau, orange). Die beiden IRED-Monomere sind durch verschiedene Grautöne gekennzeichnet. Gezeigt ist ein Vorschlag zur Wirkungsweise der eingeführten Mutationen bei der Variante 44A2 zur Erklärung der substratspezifischen Stereoselektivitätsveränderung. Beim Wildtypenzym werden die Substrate in der pro-R-Konfiguration gebunden (A, C), was zur Bildung des R-Enantiomers führt. Bei der Variante 44A2 ermöglichen die eingeführten Aminosäurereste an Position 241-245 eine substratspezifische Interaktion, sodass abhängig vom Substrat entweder eine alternative Substratorientierung (pro-S) gewährleistet wird (B), oder weiterhin die „pro-R“-Konfiguration favorisiert wird (D).

Folgende Hypothese kann somit aufgestellt werden um eine substratspezifische

Stereoselektivitätsveränderung zu erklären: Die Aminosäureaustausche an den

Positionen 241-245 in der Variante 44A2 ermöglichen eine spezifische Interaktion mit

2-Methylpyrrolin (1), sodass eine geänderte Substratorientierung („pro-S“) ermöglicht

WT

WT

44A2

44A2

A) B)

C) D)

pro-R

pro-R pro-R

pro-S

Pos. 241-245

Pos. 241-245

Pos. 241-245

Pos. 241-245

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Diskussion

130

wird, die zur Bildung des S-Enantiomers führt. Bei der Bildung von N-Methyl-3-

phenylpiperazin (91a) hingegen wird diese pro-S-Konfiguration nicht unterstützt,

sodass die Substratorientierung trotz der Mutationen gleich bleibt („pro-R“) und das

R-Enantiomer gebildet wird (Abb. 31).

Insgesamt konnte durch diese Mutagenesestudie eine neue Region identifiziert werden,

welche abhängig vom eingesetzten Substrat einen Einfluss auf die Stereoselektivität des

Enzyms hat. Die durchgeführten Kontrollen lassen die Vermutung zu, dass es sich um

eine spezifische Interaktion des Substrates mit den Positionen 241-245 handelt. Für eine

Bestätigung dieser Hypothese sind jedoch weitere Untersuchungen notwendig.

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Ausblick

131

6. Ausblick

Die nachhaltige Bereitstellung von chiralen, gesättigten N-Heterozyklen zur Produktion

von Pharmazeutika und anderen Feinchemikalien ist sehr gefragt. Neben den bekannten

chemischen Methoden gewinnen biotechnologische Alternativen immer mehr an

Bedeutung. Im Rahmen dieser Arbeit konnten unter Anwendung von Iminreduktasen

(IREDs) neue biokatalytische Methoden entwickelt werden, die die Bildung von

unterschiedlichen chiralen, gesättigten N-Heterozyklen ermöglichen.

Durch die Anwendung einer doppelten reduktiven Aminierung gelang erstmals die

direkte Generierung von Piperazinen und Homopiperazinen ausgehend von

Dicarbonylen und Diaminen. Neben den 117 getesteten Substratkombinationen gibt es

noch zahlreiche weitere Substratkombinationen die getestet werden können, um

weitere Produkte zu bilden. Zusätzlich zu der Erschließung von neuen Produkten wäre

auch die Generierung von enatiokomplementären Produkten sehr interessant. In einigen

Beispielen ist das S-Enantiomer besonders gefragt, welches von R-IRED_Ms nicht

gebildet wird. Es wäre deshalb von Interesse eine S-selektive IRED zu finden oder zu

entwickeln, die eine hohe Aktivität gegenüber der doppelten reduktiven Aminierung

aufweist.

Ein weiteres Piperazin-Derivat mit hohem Potenzial ist Piperazin-2-carboxylat. Hierfür

kann 2,3-Diaminopropansäure herangezogen werden, welche wiederum aus

Asparaginsäure synthetisiert werden kann.[216,217] Die entsprechende Reaktion war mit

der R-selektiven IRED aus Myxococcus stipitatus (R-IRED_Ms) nicht erfolgreich, sodass

weitere IREDs hinsichtlich dieser Reaktion getestet werden müssten. Eine Alternative

wäre die enzymatische oder chemische Oxidation von (S)-Hydroxymethylpiperazin,

welches mithilfe von R-IRED_Ms gebildet werden kann.

Die doppelte reduktive Aminierung gelang auch im Ganzzellsystem, jedoch konnten im

Rahmen dieser Arbeit nur geringe Produktbildungen beobachtet werden. Dies könnte

durch weitere Studien verbessert werden. Dabei wäre zum Beispiel interessant

verschiedene Knock-out E. coli-Stämme zu testen, bei denen Alkoholdehydrogenasen

ausgeschaltet sind, sodass die ungewollte Reduktion des Dicarbonylsubstrats

vermindert stattfindet.[218] Auch könnte berücksichtigt werden, dass die Aufnahme des

Diamins in die Zelle möglicherweise pH-abhängig ist, und dass eine Verstoffwechselung

des Diamins über eine Glutaminsynthetase möglich ist.[219] Ein weiterer Vorschlag wäre

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Ausblick

132

die in vivo Bildung des Dicarbonylsubstrats ausgehend vom Primärstoffwechsel. Hier ist

vor allem die Methylglyoxalsynthase ein sehr interessantes Enzym.[220]

Bei der Änderung der Kofaktorspezifität von R-IRED_Ms konnte eine Variante (V8)

gefunden werden, welche mit NADH dieselbe Aktivität aufweist, wie der Wildtyp mit

NADPH. Durch die Aufklärung der Kristallstruktur von V8 konnten einige Erkenntnisse

gewonnen werden welche sich möglicherweise auf andere IREDs übertragen lassen. Die

Durchführung eines sogenannten „cofactor-switch“ bei anderen IREDs könnte somit

erleichtert werden.

Die ausführliche Mutagenesestudie im aktiven Zentrum von R-IRED_Ms zur Änderung

der Stereoselektivität führte ebenfalls zu wichtigen Erkenntnissen. So konnte eine neue

Selektivitäts-bestimmende Region identifiziert werden. Eine Mutagenese an dieser Stelle

kann, wie in dieser Arbeit gezeigt, zu einer substratspezifischen Umkehrung der

Stereoselektivität führen. Dies könnte auch bei anderen IREDs angewendet werden. Die

erreichte Selektivität von Variante 44A2 lag bei 91% S (Enantiomerenüberschuss).

Durch die Weiterentwicklung des Enzyms könnte womöglich die verlorengegangene

Aktivität und Stabilität wieder hergestellt werden. Des Weiteren sind weiterführende

Untersuchungen notwendig um ein besseres Verständnis bezüglich der beobachteten

Effekte zu gewinnen.

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Anhang

133

7. Anhang

7.1. Archivierte Plasmide

ITB-Nummer Plasmid

Beschreibung des enthaltenen Gens Quelle

pITB5583 pET28a(+)_R-IRED_Ms Iminreduktase aus Myxococcus stipitatus GSK, Dr. Murray Brown

pITB5584 pBAD33_R-IRED_Ms Iminreduktase aus Myxococcus stipitatus Diese Arbeit

pITB5585 pBAD33_R-IRED_Ms-V8 Iminreduktase aus Myxococcus stipitatus Mutationen: N32E, R33Y, T34E, K37R, L67I, T71V

Diese Arbeit

pITB5586 pET28a(+)_R-IRED_Ms-V8 Iminreduktase aus Myxococcus stipitatus Mutationen: N32E, R33Y, T34E, K37R, L67I, T71V

Diese Arbeit

pITB5587 pBAD33_R-IRED_Ms-V9 Iminreduktase aus Myxococcus stipitatus Mutationen: R33Y, T34E, K37A, L67I, T71V

Diese Arbeit

pITB5588 pBAD33_R-IRED_Ms-V10 Iminreduktase aus Myxococcus stipitatus Mutationen: N32E, R33Y, T34E, K37A, L67I, T71V

Diese Arbeit

pITB5589 pBAD33_R-IRED_Ms-44A2 Iminreduktase aus Myxococcus stipitatus Mutationen: N32E, R33Y, T34E, K37R, L67I, T71V, A241V, H242Y, N243D, V244Y, A245L

Diese Arbeit

7.2. Aminosäure- und DNA-Sequenzen

7.2.1. DNA-Sequenz der R-selektiven Iminreduktase aus Myxococcus stipitatus

ATGGGCAGCAGCCATCATCATCATCATCACAGCAGCGGCCTGGTGCCGCGCGGCAGCCAT ATGAAACCGACCCTGACCGTTATTGGCGCTGGCCGTATGGGCTCCGCACTGATTAAAGCA TTCCTGCAATCTGGCTACACGACCACGGTGTGGAACCGTACCAAAGCCAAAAGCGAACCG CTGGCAAAACTGGGCGCACATCTGGCTGATACGGTGCGTGACGCCGTTAAACGCAGCGAT ATTATCGTGGTTAATGTGCTGGATTATGACACCTCTGATCAGCTGCTGCGCCAAGACGAA GTGACGCGTGAACTGCGCGGCAAACTGCTGGTTCAGCTGACCAGCGGTTCTCCGGCACTG GCTCGTGAACAGGAAACGTGGGCGCGCCAACATGGCATTGATTATCTGGACGGTGCGATC ATGGCCACCCCGGATTTTATTGGCCAGGCAGAATGCGCTCTGCTGTACAGTGGTTCCGCG GCCCTGTTCGAAAAACACCGTGCTGTCCTGAATGTGCTGGGCGGTGCCACCAGCCATGTC GGCGAAGATGTTGGTCATGCCTCAGCACTGGACAGCGCCCTGCTGTTTCAGATGTGGGGC ACCCTGTTCGGTACGCTGCAAGCACTGGCTATTTCTCGCGCAGAAGGCATCCCGCTGGAA AAAACCACGGCGTTTATCAAACTGACCGAACCGGTCACCCAGGGTGCCGTTGCAGATGTC CTGACCCGTGTTCAGCAAAATCGCCTGACCGCAGACGCTCAGACGCTGGCAAGTCTGGAA GCTCATAACGTGGCGTTCCAACACCTGCTGGCCCTGTGTGAAGAACGTAATATCCATCGC GGTGTTGCGGATGCCATGTACTCCGTTATTCGTGAAGCGGTCAAAGCCGGCCACGGTAAA GATGACTTTGCAATTCTGACCCGCTTCCTGAAATAA

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Anhang

134

7.2.2. Aminosäure-Sequenz der R-selektiven Iminreduktase aus Myxococcus stipitatus (WT)

HHHHHH = His6-Tag; M = ursprüngliches Start-Methionin

MGSSHHHHHHSSGLVPRGSHMKPTLTVIGAGRMGSALIKAFLQSGYTTTVWNRTKAKSEPLAKLGAHL

ADTVRDAVKRSDIIVVNVLDYDTSDQLLRQDEVTRELRGKLLVQLTSGSPALAREQETWARQHGIDYLD

GAIMATPDFIGQAECALLYSGSAALFEKHRAVLNVLGGATSHVGEDVGHASALDSALLFQMWGTLFGTL

QALAISRAEGIPLEKTTAFIKLTEPVTQGAVADVLTRVQQNRLTADAQTLASLEAHNVAFQHLLALCEER

NIHRGVADAMYSVIREAVKAGHGKDDFAILTRFLK

7.2.3. Aminosäure-Sequenz der NADH-abhängigen R-IRED_Ms-Variante V8

HHHHHH = His6-Tag; M = ursprüngliches Start-Methionin; X = Punktmutation

MGSSHHHHHHSSGLVPRGSHMKPTLTVIGAGRMGSALIKAFLQSGYTTTVWEYEKARSEPLA

KLGAHLADTVRDAVKRSDIIVVNVIDYDVSDQLLRQDEVTRELRGKLLVQLTSGSPALAREQET

WARQHGIDYLDGAIMATPDFIGQAECALLYSGSAALFEKHRAVLNVLGGATSHVGEDVGHASA

LDSALLFQMWGTLFGTLQALAISRAEGIPLEKTTAFIKLTEPVTQGAVADVLTRVQQNRLTAD

AQTLASLEAHNVAFQHLLALCEERNIHRGVADAMYSVIREAVKAGHGKDDFAILTRFLK

7.2.4. Aminosäure-Sequenz der NADH-abhängigen R-IRED_Ms-Variante V10

HHHHHH = His6-Tag; M = ursprüngliches Start-Methionin; X = Punktmutation

MGSSHHHHHHSSGLVPRGSHMKPTLTVIGAGRMGSALIKAFLQSGYTTTVWEYEKAASEPLA

KLGAHLADTVRDAVKRSDIIVVNVIDYDVSDQLLRQDEVTRELRGKLLVQLTSGSPALAREQET

WARQHGIDYLDGAIMATPDFIGQAECALLYSGSAALFEKHRAVLNVLGGATSHVGEDVGHASA

LDSALLFQMWGTLFGTLQALAISRAEGIPLEKTTAFIKLTEPVTQGAVADVLTRVQQNRLTAD

AQTLASLEAHNVAFQHLLALCEERNIHRGVADAMYSVIREAVKAGHGKDDFAILTRFLK

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Anhang

135

7.2.5. Aminosäure-Sequenz von R-IRED_Ms-Variante 44A2 (veränderte Stereoselektivität)

HHHHHH = His6-Tag; M = ursprüngliches Start-Methionin; X = Punktmutation

MGSSHHHHHHSSGLVPRGSHMKPTLTVIGAGRMGSALIKAFLQSGYTTTVWNRTKAKSEPLA

KLGAHLADTVRDAVKRSDIIVVNVLDYDTSDQLLRQDEVTRELRGKLLVQLTSGSPALAREQE

TWARQHGIDYLDGAIMATPDFIGQAECALLYSGSAALFEKHRAVLNVLGGATSHVGEDVGHAS

ALDSALLFQMWGTLFGTLQALAISRAEGIPLEKTTAFIKLTEPVTQGAVADVLTRVQQNRLTA

DAQTLASLVYDYLFQHLLALCEERNIHRGVADAMYSVIREAVKAGHGKDDFAILTRFLK

7.2.6. Plasmidkarte von pBAD33_R-IRED_Ms-His6

Abbildung 32: Plasmidkarte von pBAD33_R-IRED_Ms-His6.

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Anhang

136

7.3. Beispielhafte SDS-Gele

Abbildung 33: Beispielhaftes SDS-Gel für die Trennung verschiedener E. coli Lysate mit überexprimierter R-IRED_Ms (WT) und verschiedenen R-IRED_Ms-Varianten (V1-V10).

Abbildung 34: Beispielhaftes SDS-Gel für die Trennung verschiedener gereinigter IREDs. Gezeigt ist sowohl die R-IRED_Ms (WT) sowie verschiedene R-IRED_Ms-Varianten (V1-V10).

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Anhang

137

7.4. Beispielhafte Chromatogramme

Abbildung 35: Beispielchromatogramm für die Bestimmung der Produktkonzentration für die Bildung von 2-Methylpyrrolidin (7) mit 3-Methylpiperidin als internen Standard.

Abbildung 36: Beispielchromatogramm für die chirale GC-Messung zur Bestimmung der Stereoselektivität gegenüber der Bildung von 2-Methylpyrrolidin (7).

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Anhang

138

Abbildung 37: Chromatogram der chiralen GC-Messung zur Auftrennung von R- und S-Methylpyrrolidin (7). Neben den Produktstandards (rosa, schwarz) sind die gebildeten Produktenantiomere aus der Biotransformation mit R-IRED_Ms-V8 (braun) bzw. mit R-IRED_Ms-44A2 (blau) gezeigt.

Abbildung 38: Beispiel-GC-MS-Chromatogramm (oben) zur Identifizierung von doppelt acetyliertem Piperazin (84 x 2Ac) aus der Biotransformation mit R-IRED_Ms ausgehend von den Substraten Glyoxal (82) und Ethylendiamin (83). Sowie das zugehörige Massenfragmentierungsmuster (unten).

(R)-Methylpyrrolidin

(R/S)-Methylpyrrolidin

Biotransformation mit R-IRED_Ms-V8

Biotransformation mit R-IRED_Ms-44A2

Retentionszeit (min)

8,25 8,5 8,75 9,0 9,25

170

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Anhang

139

Abbildung 39: Beispiel-GC-MS-Chromatogramm (oben) des dopelt acetylierten Produktstandards für Piperazin (84 x 2Ac). Sowie das zugehörige Massenfragmentierungsmuster (unten).

170

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Anhang

140

7.5. Mögliche Substratorientierungen für die Bildung von enantiokomlementären Produkten

Abbildung 40: Darstellung verschiedener Ausrichtungen des Substrates, die zur Bildung unterschiedlicher Produkt-Enantiomere führt. Drei verschiedene Möglichkeiten sind am Beispiel eines 2‘-substituierten Pyrrolins gezeigt. Die Art der Substrat-Drehung ist durch Rotationspfeile angedeutet, der gezeigte Mechanismus ist jeweils derselbe. Der Hydrid-Transfer ist in Rot gezeigt und erfolgt bei A) und C) von oben, und bei B) von unten (gestrichelt).

Die in (Abb. 40-A) angedeutete Substratorientierung soll beispielhaft für eine

pro-R-Orientierung sein. Dabei wird gewährleistet, dass die Protonierung von der Seite

der katalytischen Aminosäure erfolgt. Wenn die Substratorientierung zu einer

pro-S-Orientierung geändert werden soll, ergeben sich zwei Möglichkeiten

(Abb. 40-B,C). Bei der in B) gezeigten Substratorientierung wird weiterhin die

Protonierung von der Seite der katalytischen Aminosäure ermöglicht, da sich die

Position des Stickstoffs nicht ändert. Bei der in C) gezeigten Substratorientierung ist

hingegen eine Protonierung von der gegenüberliegenden Seite notwendig.

Zwischenzeitlich wurde vermutet, dass der eingeführte Tyrosinrest an Position 242

diese Aufgabe übernehmen kann. Diese Hypothese wurde jedoch widerlegt.

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Literaturverzeichnis

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9. CURRICULUM VITAE

PERSÖNLICHE DATEN

Name Niels Borlinghaus

Geburtsdaten 18.03.1992, Wuppertal

Nationalität deutsch

AKADEMISCHER WERDEGANG

06/2016 - 08/2019 Promotion, Institut für Biochemie und technische Biochemie, Abteilung technische Biochemie, bei Prof. Dr. Bernhard Hauer Doktorarbeit: „Generierung von gesättigten N-Heterozyklen mit Iminreduktasen.“

10/2014 – 04/2016 Master of Science

Technische Biologie, Universität Stuttgart Masterarbeit: „Entwicklung von promiskuitiven Enzymaktivitäten hinsichtlich C-C-knüpfenden Reaktionen.“

10/2011 – 10/2014 Bachelor of Science

Technische Biologie, Universität Stuttgart Bachelorarbeit: „Optimierung eines P450-Fusionskonstruktes durch Änderung der Interaktionsfläche zwischen Häm- und Reduktase-Domäne“

09/2008 – 06/2011 Abitur

Mathilde-Planck-Gymnasium, Ludwigsburg