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GRUNDLAGEN DER ENZYMOLOGIE:

AKTIVITÄTS- UND SUBSTRATBESTIMMUNGEN

BIOCHEMISCHE GRUNDLAGEN

In lebenden Organismen katalysieren Enzyme chemische Stoffumwandlungen. Ein Enzym

wird durch seine katalytische Aktivität charakterisiert; d. h. durch seine Fähigkeit, die

Umsetzung eines oder mehrerer Substrate in einer spezifischen Reaktion zu definierten

Produkten zu beschleunigen. Enzyme sind im Allgemeinen Proteine. Enzymproteine weisen

eine spezifische Struktur auf, d. h. eine spezifische Primär-, Sekundär- und Tertiärstruktur

sowie, falls das Enzym aus mehreren Untereinheiten zusammengesetzt ist, eine bestimmte

Quartärstruktur. Die Anordnung der Atome in einer definierten Struktur wird durch den pH

der Lösung, Temperatur, Ionenstärke etc. beeinflusst. Deshalb haben diese Faktoren einen

entscheidenden Einfluss auf die katalytische Aktivität eines Enzyms.

Mit Hilfe enzymatisch katalysierter Reaktionen kann zum einen die Menge eines Enzyms,

zum anderen die Konzentration von Substraten bestimmt werden. Beides wird klinisch zur

Diagnose und Charakterisierung von Stoffwechselerkrankungen angewandt.

BESTIMMUNG DER KATALYTISCHEN AKTIVITÄT

Zur Bestimmung der Aktivität eines Enzyms wird die Menge an verbrauchtem Substrat pro

Zeit oder die Menge an entstehendem Produkt pro Zeit gemessen. Die Aktivität eines

Enzyms wird in der Regel bei maximaler Geschwindigkeit, d. h. im Bereich der Substrat-

sättigung, bei optimalen Cosubstrat- und Effektorkonzentrationen, bei optimalem pH und bei

einer willkürlich festgesetzten Temperatur (meist 37°C) bestimmt.

Die Einheit der Aktivität, "Unit" (abgekürzt U), ist definiert als Umsatz von 1 µmol Substrat

pro Minute.

1 U = 1 µmol x min-1

Eine andere weniger gebräuchliche Einheit ist das Katal (kat):

1 kat = 1 mol x sec-1; 1 nkat = 1 nmol x sec-1 (n = nano = 10-9)

Im klinisch-chemischen Labor ist es üblich, die Aktivität pro Volumen zu bestimmen und in

der Einheit U/l anzugeben. Auch die Normalwerte werden meistens in U/l angegeben.

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Die Einheit U/l ist gleich 1 µmol x l-1 x min-1. Bei der Aktivität pro Volumen handelt es sich

also um die Änderung einer Konzentration (µmol/l) pro Zeit (min) oder um die Reaktions-

geschwindigkeit. Entsprechend werden Aktivitäten pro Volumen durch Bestimmungen der

Anfangsgeschwindigkeit der katalysierten Reaktion gemessen. Dabei misst man entweder

die Abnahme der Konzentration eines Substrates (-d[S]/dt) oder die Zunahme der Konzen-

tration eines Produktes (d[P]/dt) unter genau definierten Testbedingungen (pH, Ionenstärke,

Temperatur).

Als spezifische Enzymaktivität bezeichnet man die Aktivität bezogen auf eine definierte

Menge Enzymprotein: U/mg = µmol x min-1 x mg-1 oder kat/kg = µkat/mg

BESTIMMUNG VON SUBSTRATKONZENTRATIONEN

Aufgrund der hohen Spezifität eines Enzyms für das Substrat kann dessen Konzentration

mittels eines Enzyms auch in einem Gemisch bestimmt werden. In diesem Fall arbeitet man

mit hohen Enzymkonzentrationen. Man bestimmt den Anfangszustand des Testsystems und

setzt das Enzym dann in so hoher Konzentration zu, das die gewünschte katalysierte

Reaktion in kurzer Zeit praktisch vollständig abläuft. Aus der Differenz zwischen Anfangs-

und Endzustand wird die umgesetzte Substratmenge bestimmt. Aufgrund des Gleich-

gewichts zwischen Hin- und Rückreaktion wird ein Teil des Substrats nicht restlos in Produkt

umgewandelt. Um eine weitgehend irreversible Umwandlung zu erreichen, muss in der

Regel eines der Reaktionsprodukte aus der Testmischung entfernt werden. Das lässt sich

zum Beispiel durch eine weitere praktisch irreversible Reaktion, die von einem Hilfsenzym

katalysiert wird, oder durch chemische Umsetzung eines Produktes erreichen. Wenn z. B.

bei einer Reaktion H+-Ionen entstehen, können diese durch Neutralisation, d. h. indem ein

hoher pH-Wert eingestellt wird, entfernt werden.

Enzymatische Bestimmungen von Metaboliten sind in der Regel genauer und wesentlich

spezifischer als Bestimmungen mit chemischen Methoden. Eine häufig angewandte chemi-

sche Methode zur Bestimmung von Pyruvat im Serum beruht auf der Bildung des Hydrazons

mit 2,4-Dinitrophenylhydrazin. Aber andere im Serum, physiologisch und pathologisch,

vorkommende Ketosäuren (-Ketoglutarat, Acetoacetat und Oxalacetat) reagieren ebenfalls

und täuschen eine zu hohe Pyruvatkonzentration vor. Spezifisch kann hingegen Pyruvat mit

Hilfe des Enzyms Lactatdehydrogenase (LDH) bestimmt werden. Bevor auf Einzelheiten

dieser Bestimmung eingegangen wird, sollen einige generelle Überlegungen angestellt

werden.

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Jede chemische Reaktion erreicht einen Gleichgewichtszustand. In der Schreibweise

A + B C + D

zeigt der Doppelpfeil an, dass die Reaktion in beiden Richtungen, vorwärts und rückwärts,

verläuft. Wenn die Reaktion mit einer Mischung von A und B beginnt, so wird die Bildung von

C und D, die Hinreaktion, zunächst relativ schnell verlaufen. Mit der Anhäufung von C und D

setzt nun aber auch die Rückreaktion ein, die umso schneller wird, je mehr C und D gebildet

sind. Proportional wird die Hinreaktion langsamer werden, je mehr A und B verbraucht sind.

Im Gleichgewichtszustand laufen Hin- und Rückreaktion mit gleicher Geschwindigkeit ab.

Die Gleichgewichtslage einer Reaktion wird durch das Massenwirkungsgesetz ausgedrückt.

Die Geschwindigkeit einer Reaktion ist das dem Produkt der Konzentrationen der Reaktions-

teilnehmer proportional, d. h. für die oben genannte Reaktion:

vhin = k1 [A] . [B] und vrück = k2 [C] . [D]

wobei k1 und k2 die Geschwindigkeitskonstanten und vhin und vrück die Geschwindigkeiten

der Vorwärts- und Rückwärts-Reaktion bedeuten.

Im Gleichgewichtszustand ist

vhin = vrück und damit

k1 [A] . [B] = k2 [C] . [D]

Daraus folgt:

𝑘1

𝑘2= 𝐾 =

[𝐶] ∙ [𝐷]

[𝐴] ∙ [𝐵]

Das Verhältnis der Geschwindigkeitskonstanten wird als Gleichgewichtskonstante K defi-

niert; sie gibt an, in welchem Konzentrationsverhältnis die Reaktanten im Gleichgewichts-

zustand vorliegen.

Als Anwendungsbeispiel soll Pyruvat mit Hilfe der Lactatdehydrogenase (LDH) bestimmt

werden. LDH katalysiert die folgende Reaktion:

LDH

Lactat + NAD+ Pyruvat + NADH + H+

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Mit Hilfe des Massenwirkungsgesetzes soll berechnet werden, unter welchen Bedingungen

die Reaktion von Pyruvat zu Lactat quantitativ abläuft. Die Gleichgewichtskonstante K' hängt

vom pH-Wert und von der Temperatur ab. Bei pH 7.0 und 25°C beträgt sie:

𝐾′ =[𝑃𝑦𝑟𝑢𝑣𝑎𝑡] ∙ [𝑁𝐴𝐷𝐻]

[𝐿𝑎𝑐𝑡𝑎𝑡][𝑁𝐴𝐷+]= 2,3 ∙ 10−5

K' ist die "scheinbare" Gleichgewichtskonstante, die sich von der pH-unabhängigen

thermodynamischen Gleichgewichtskonstante K unterscheidet. Für die LDH-Reaktion ist

𝐾 =[𝑃𝑦𝑟𝑢𝑣𝑎𝑡] ∙ ⟦𝑁𝐴𝐷𝐻⟧ ∙ [𝐻+]

[𝐿𝑎𝑐𝑡𝑎𝑡] ∙ [𝑁𝐴𝐷+]= 2,3 ∙ 10−12 𝑚𝑜𝑙/𝑙

Um die pH-abhängige Konstante K' für ein gegebenes pH zu berechnen, wird K durch die

gegebene Wasserstoffionenkonzentration dividiert.

bei pH 7: [𝐻+] = 10−7 𝑚𝑜𝑙

𝑙; 𝐾′𝑝𝐻=7,0 =

2,3∙10−12

10−7 = 2,3 ∙ 10−5

bei pH 8: [𝐻+] = 10−8 𝑚𝑜𝑙

𝑙; 𝐾′𝑝𝐻=8,0 =

2,3∙10−12

10−8 = 2,3 ∙ 10−4

bei pH 9: [𝐻+] = 10−9 𝑚𝑜𝑙

𝑙; 𝐾′𝑝𝐻=9,0 =

2,3∙10−12

10−9 = 2,3 ∙ 10−3

und so weiter.

Da die enzymatische Metabolitbestimmung in gepufferter Lösung ausgeführt wird und die

Wasserstoffionenkonzentration praktisch konstant bleibt, genügt K' zur Charakterisierung der

Reaktion.

Im menschlichen Blut beträgt die Pyruvatkonzentration ungefähr 5·10-5 mol/l. Nachdem Blut

enteiweißt und ein aliquoter Teil des Überstandes mit Puffer, NADH und LDH in der

Messküvette gemischt worden ist, beträgt die Pyruvatkonzentration 2·10-5 mol/l. Die

Lactatkonzentration im Blut beträgt ungefähr 1 10-3 mol/l, d. h. die Konzentration im Bestim-

mungsansatz beträgt 4 10-4 mol/l.

71

Das Ergebnis der Pyruvatbestimmung wäre zufrieden stellend, wenn 99% des Pyruvats zu

Lactat reduziert würden; d. h. die Pyruvatkonzentration sollte von 2.10-5 mol/l auf 0,02 10-5

mol/l oder um 1,98 10-5 mol/l abfallen. Zu Beginn des Tests liegen folgende Konzentrationen

vor:

Pyruvat = 2 10-5 mol/l

NADH = 10 10-5 mol/l

Lactat = 40 10-5 mol/l

NAD+ = 0

Für jedes mol Pyruvat, das reduziert wird, wird ein mol NADH oxydiert, und es werden 1 mol

Lactat und 1 mol NAD+ gebildet. Nachdem 99% oder 1,98 10-5 mol/l Pyruvat reduziert

worden sind, sind folgende Konzentrationen im Reaktionsansatz vorhanden:

Pyruvat = 2 10-5 1,98 10-5 = 0,02 10-5 mol/l

NADH = 10 10-5 1,98 10-5 = 8,02 10-5 mol/l

Lactat = 40 10-5 + 1,98 10-5 = 41,98 10-5 mol/l

NAD+ = 10-5 + 1,98 10-5 = 1,98 10-5 mol/l

In die Gleichung für das Massenwirkungsgesetz eingesetzt errechnet sich:

[𝑃𝑦𝑟𝑢𝑣𝑎𝑡] ∙ [𝑁𝐴𝐷𝐻]

[𝐿𝑎𝑐𝑡𝑎𝑡] ∙ [𝑁𝐴𝐷+]=

0,02 ∙ 10−5 ∙ 8,02 ∙ 10−5

41,98 ∙ 10−5 ∙ 1,98 ∙ 10−5= 1,92 ∙ 10−3

Das Resultat zeigt, dass nach einem Umsatz von 99% der Quotient immer noch größer als

K' = 2,3. 10-5 ist, d. h. die Reaktion wird weiterlaufen, bis nahezu 100% des Pyruvats

reduziert worden sind. Diese Berechnung zeigt, dass die Bestimmung von Pyruvat in einem

Gemisch mit der LDH möglich ist.

ALLGEMEINE FRAGESTELLUNGEN

Isoenzyme: Definition, Vorkommen und molekulare Grundlagen der Isoenzymentstehung;

LDH, ihre Rolle im Stoffwechsel und in der Klinik;

Glykolyse, Gluconeogenese, Cori-Zyklus;

Grundbegriffe der enzymatischen Katalyse;

Definition der Enzymaktivität, der Enzymaktivität pro Volumen (Reaktionsgeschwindigkeit)

und der spezifischen Aktivität;

Prinzip der Substratbestimmung und Aktivitätsbestimmung.

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ZIELSETZUNG DER EXPERIMENTE

Eine Reihe von physikalischen und chemischen Methoden steht zur Verfügung, um die

Geschwindigkeit enzymkatalysierter Reaktionen zu bestimmen. Besonders günstig sind aber

die Methoden, bei denen nicht von außen in die Reaktion eingegriffen werden muss, sondern

bei denen z. B. während der Reaktion die Änderung eines optisch messbaren Parameters

erfolgt. Auf diesem Prinzip kann die Aktivität von Oxidoreduktasen bestimmt werden, die

NAD+ oder NADP+ als Cosubstrat umsetzen. Die entstandenen NADH oder NADPH haben

eine zusätzliche Absorptionsbande bei 340 nm; d. h. die Zunahme der Extinktion während

der Reaktion ist ein Maß für den Umsatz der Cosubstrate. Die entsprechenden Konzentra-

tionsänderungen werden dann mit Hilfe des Lambert-Beerschen Gesetzes berechnet (für

weitere Einzelheiten siehe Versuch "Grundlagen der Enzymkinetik").

Substratbestimmung und Aktivitätsbestimmung werden anhand der von LDH

katalysierten Reaktion durchgeführt.

CH3 CH3

LDH

C = 0 + NADH + H+ CH-OH + NAD+

COO- COO-

Pyruvat L(+)Lactat

LDH kommt praktisch in allen Geweben vor. Hohe Aktivitäten lassen sich im Herzmuskel, in

der Leber, im Skelettmuskel, in Erythrozyten und Thrombozyten nachweisen.

GEWEBSVERTEILUNG DER LDH-ISOENZYME

Viele Enzyme sind aus mehreren identischen oder nicht-identischen Untereinheiten aufge-

baut. Vielfach sind diese Enzyme nur aktiv, wenn sie die richtige Quartärstruktur aufweisen.

Austausch der Untereinheiten ergibt eine Familie von Enzymen innerhalb eines einzigen

Organismus, die alle die gleiche Reaktion katalysieren. Diese so genannten Isoenzyme

unterscheiden sich in ihren physikalischen Eigenschaften (Molekulargewicht, isoelektrischer

Punkt, Denaturierungstemperatur) wie auch in ihren katalytischen Eigenschaften (KM, pH-

Optimum, Wechselzahl). Da diese Untereinheiten vielfach Genprodukte von dublizierten

Genen sind, die aus einem einzigen Präkursor entstanden sind, haben sie noch viele

gemeinsame Eigenschaften. In den vorliegenden Übungen sollen die Isoenzyme der LDH

studiert werden. Anschließend wird die Bedeutung der Isoenzyme als diagnostisches Mittel

in der Klinik diskutiert.

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FUNKTIONEN DER LDH-ISOENZYME

Isoenzyme werden von Pro- und Eukaryonten produziert, um den metabolischen Fluss zu

einer gegebenen Zeit den besonderen Bedingungen der Umgebung anzupassen. Die kataly-

tischen Eigenschaften dieser Isoenzyme können leicht geändert werden, indem ein Typ einer

Untereinheit in der Syntheserate verändert wird, was leichter gelingt, als die Synthese eines

gesamten neuen Enzyms. In Säugern prädominieren bestimmte Isoenzyme häufig entweder

in bestimmten Geweben oder in einem Gewebe zu einer bestimmten Entwicklungszeit. Die

LDH ist aus vier Untereinheiten aufgebaut, die entweder dem Typ M (Muskeltyp) oder dem

Typ H (Herztyp) entsprechen. Diese Untereinheiten werden durch nicht-kovalente Bindungen

zusammengehalten. Die Kombination dieser beiden Untereinheiten zu einem Tetramer in

unterschiedlichen Relationen ergibt fünf Isoenzyme: H4, H3M, H2M2, HM3 und M4, die man

auch als LDH 1, 2, 3, 4 und 5 bezeichnet. Die Anteile der fünf LDH-Isoenzyme im Cytosol

sind von Gewebe zu Gewebe unterschiedlich, innerhalb eines Organs jedoch relativ

konstant.

Die Verteilung der LDH-Isoenzmye in den verschiedenen Organen weist eine Korrelation zu

deren O2-Versorgung auf. Das H4-Isoenzym arbeitet relativ langsam und wird durch einen

Überschuss an Pyruvat gehemmt. Das M4-Enzym hat dagegen eine wesentlich höhere

Wechselzahl und wird kaum durch Pyruvat gehemmt (Tabelle I).

Tabelle I:

Eigenschaften der LDH-Isoenzyme

Isoenzym Wechselzahl Km(Pyr) Hemmung durch Pyruvat von

physiologischen Konzentrationen

H4(LDH 1) 45.000 sec-1 1 . 10-4 M ja

M4(LDH 5) 100.000 sec-1 3 . 10-5 M nein

Die Zelle gewinnt viel mehr ATP durch die Verstoffwechselung des Pyruvats im

Citronensäurezyklus als durch Umsetzung zu Lactat. Dazu ist allerdings Sauerstoff nötig, um

das produzierte NADH reoxydieren zu können und damit in der Atmungskettenphospho-

rylierung ATP zu synthetisieren. In einem aeroben Gewebe, wie im Herzen, steht Sauerstoff

immer in genügenden Mengen zur Verfügung, so dass jede Umwandlung von Pyruvat zu

Lactat, d. h. Abzug dieses Metaboliten vom Citronensäurezyklus, einen Energieverlust

darstellen würde. Deshalb dominieren in diesem Gewebe die Isoenzyme H4 und H3M, deren

Aktivität Pyruvat bei physiologischen Konzentrationen hemmt. Dementsprechend wird

Pyruvat nicht zu Lactat umgesetzt, sondern im Citronensäurezyklus verstoffwechselt. In

anaeroben Geweben mit limitiertem Sauerstoffangebot, wie z. B. in kontrahierenden

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Skelettmuskeln, wird ATP unabhängig von der Verfügbarkeit von Sauerstoff während der

Umwandlung von Glucose in Pyruvat produziert. Wenn die ATP-Konzentration sinkt, steigt

der Fluss der Glykolyse um ein vielfaches an, um die notwendige Menge ATP zu

synthetisieren. Unter diesen Bedingungen muss NADH schnell in NAD+ überführt werden,

weil es sonst zum Stopp der Glykolyse kommen würde. NAD+ kann aber durch die LDH-

Reaktion schnell regeneriert werden. Deshalb herrscht in solchen anaeroben Geweben das

Isoenzym M4 mit hoher Wechselzahl vor, dessen Aktivität Pyruvat nicht hemmt. Als Produkt

der Reaktion akkumuliert Lactat, was schließlich im Cori-Zyklus zur Gluconeogenese benutzt

werden kann.

Die metabolische Funktion der LDH ist in der nächsten Abbildung zusammengefasst:

NACHWEIS VON LDH-ISOENZYMEN

Aufgrund der hohen Proteinkonzentrationen des Serums ist der Nachweis der LDH-Iso-

enzyme im Serum nicht einfach. Mit Hilfe einer spezifischen Färbemethode, die die Sub-

stratspezifität der LDH-Isoenzyme ausnutzt, können die einzelnen Isoenzyme dargestellt

werden. Dazu ist eine Trennung der LDH-Isoenzyme aus verschiedenen Gewebeextrakten

durch Elektrophorese auf Zelluloseacetat notwendig. Nach der elektrophoretischen Trennung

werden die Zellulose-Acetatstreifen in einer alkalischen Färbelösung inkubiert, die NAD, das

Lactat und zwei Redox-Farbstoffe enthält. An den Stellen, an denen sich LDH-Isoenzyme

befinden, werden von Lactat und NAD+ Pyruvat, NADH und H+ gebildet. Der Wasserstoff des

NADH wird über Phenacin-Methosulfat (PMS) durch zwei Redoxsysteme auf farbloses

Tetrazoliumchlorid übertragen. Das durch die Reduktion des Tetrazoliumsalzes entstandene

blauviolette Formazan lokalisiert die Stellen mit LDH-Aktivität auf der Folie.

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Durch Hybridisierung von M4 und H4 können alle Isoenzyme erzeugt werden. Diese

Hybridisierung kann durch langsames Einfrieren und Wiederauftauen erreicht werden, da die

Quartärstruktur der LDH im Eisgitter nicht stabil ist. Bei der Renaturierung zum quartären

Enzym bilden sich dann alle fünf Isoenzyme. Nach Trennung und Färbung können die

gebildeten Mengen der fünf Isoenzyme durch Densitometrie ermittelt werden, wenn man

annimmt, dass die Intensität der Färbung der Enzymaktivität proportional ist.

Alternativ kann die Isoenzymmenge an M4 auch durch milde Denaturierung ermittelt werden.

Die H-Untereinheit ist gegen Denaturierung in Harnstoff oder Hitze stabiler als die M-

Untereinheit. M4 kann deshalb durch Inkubation in Harnstoff oder durch Erhitzen auf 60°C

inaktiviert werden, wonach die Menge an H4 im Serum gemessen und anschließend

berechnet werden kann.

KLINISCHE ANWENDUNG

Die Identifizierung von Isoenzymen der LDH beruht auf ihrer schnellen elektrophoretischen

Trennung und bildet damit die Basis für verschiedene klinische Anwendungen, die sowohl

die Gewebeart als auch deren Zerstörungsgrad definieren können. Dazu wird sehr häufig

das Isoenzymmuster der LDH in Serum bestimmt. Normalerweise ist der LDH-Aktivitäts-

spiegel in Serum sehr niedrig.

Im pathologischen Fall werden die Zellmembranen des geschädigten Organs meist permea-

bel für Enzyme und andere Makromoleküle, die dann in den extrazellulären Raum austreten

können. Gelangen sie in ausreichender Konzentration in den Intravasalraum, so können sie

quantitativ im Blutplasma bestimmt werden, was Rückschlüsse auf Ausmaß und Umfang der

Beschädigung zulässt.

Die im Serum messbare LDH-Aktivität stellt eine Summe der aus verschiedenen Organen

stammenden Isoenzyme dar. Deswegen kann aus einer einfachen Aktivitätsmessung nicht

unbedingt auf die Organherkunft des Enzyms geschlossen werden. Da aber im Falle der

LDH das Verhältnis der einzelnen Isoenzyme von Organ zu Organ unterschiedlich ist, spie-

gelt sich die Schädigung eines bestimmten Gewebes auch als typisches Isoenzymmuster im

Serum wider. Eine solche Differenzierung der LDH-Isoenzyme nach Organen ist mit Elek-

trophorese möglich. Auf diese Weise lässt sich z. B. unterscheiden, ob eine Erhöhung der

LDH-Aktivität im Serum auf eine Schädigung des Herzmuskels oder der Leberzelle zurück-

zuführen ist.

76

Elektrophoretische Auftrennung von LDH-Isoenzymen aus menschlichen Seren

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VERSUCHSDURCHFÜHRUNG UND VERSUCHSPROTOKOLL

Hilfsmittel die mitzubringen sind:

- Kittel

- Lineal

- Taschenrechner

ALLGEMEINE HINWEISE:

- die Proben/Reagenzien müssen vor dem Einsatz komplett aufgetaut sein

- die Proben/Reagenzien müssen vor dem Pipettieren durchmischt werden

- Enzyme sind während des Versuchs auf Eis zu lagern

- pro Versuch soll nur eine Person pipettieren (Ausschluss von Pipettierfehlern)

- die Ansätze werden grundsätzlich nacheinander pipettiert und gemessen

- Auswertung Versuch 2: das Steigungsdreieck nicht innerhalb der ersten 15 Sek

einzeichnen

78

BESTIMMUNG VON PYRUVAT IM OPTISCHEN TEST NACH WARBURG MIT LDH ALS BEISPIEL EINER

SUBSTRATKONZENTRATIONSBESTIMMUNG

Drei Küvetten werden wie im Pipettierplan angegeben angesetzt. Die Abnahme der

Extinktion bei 366 nm wird nach Zugabe der LDH bis zu einem konstanten Wert verfolgt.

Vor Beginn der Messung wird das Photometer bei 366 nm gegen eine mit Phosphatpuffer

gefüllte Küvette geeicht. Diese Eichung wird von Zeit zu Zeit überprüft.

Pipettierplan

Ansatz 1 Ansatz 2 Ansatz 3

ml Na-Phosphat-Puffer (0,1 mol/l, pH 7.4) 1,50 1,50 1,50

ml NADH (0,01 mol/l) 0,05 0,05 0,05

ml Na-Pyruvat 0,05 0,10 0,15

ml H2O 0,38 0,33 0,28

Der Küvetteninhalt wird durch dreimaliges Umdrehen der Küvette (bitte vorher mit Parafilm

verschließen) gründlich gemischt und die Anfangsextinktion (E0) gemessen. Nach 30 sec

wird überprüft, ob E0 unverändert bleibt. Die Küvette wird aus dem Photometer

herausgenommen. Das Enzym (jeweils 0,02 ml) wird in die Küvette pipettiert. Der

Küvetteninhalt wird sofort mit Parafilm verschlossen und erneut gemischt. Nach Entfernen

des Parafilms wird die Küvette in das Photometer eingesetzt. In Abständen von 1 min wird

die Extinktion abgelesen, bis keine Änderung mehr registriert wird.

Messplan

abgelesene Extinktion

Zeit Ansatz 1 Ansatz 2 Ansatz 3

Eo

30 sek

Start durch Zugabe von LDH (0,02 ml/Küvette; mischen)

1 min

2 min

3 min

4 min

5 min

6 min

79

AUSWERTUNG UND FEHLERDISKUSSION

Zu Versuch 1 – Lambert-Beer’sche Gesetz

Berechnen Sie aus der Differenz der Anfangsextinktion und der Extinktion nach Ende der

Reaktion mit Hilfe des Lambert-Beer'schen Gesetzes die Konzentration der Pyruvat-Lösung.

80

2A Bestimmung der Aktivität pro Volumen von H4 und M4 bzw. der LDH im

Normalserum und im Serum von Herzinfarktpatienten

Vier Küvetten werden wie im Pipettierplan angegeben nacheinander angesetzt und

nacheinander gemessen. Die Abnahme der Extinktion bei 366 nm wird nach Zugabe der

LDH bis zu einem konstanten Wert verfolgt.

Vor Beginn der Messung wird das Photometer bei 366 nm gegen eine mit Phosphatpuffer

gefüllte Küvette geeicht. Diese Eichung wird von Zeit zu Zeit überprüft.

Pipettierplan - 2A

H4 M4 Normal-

Serum

Infarkt-

Serum

ml Phosphatpuffer (0,1 mol/l, pH 7.4) 1,50 1,50 1,50 1,50

ml NADH (0,01 mol/l) 0,05 0,05 0,05 0,05

ml H2O 1,30 1,30 0,95 1,25

ml H4 (20 µg/ml) 0,05 0 0 0

ml M4 (12,5 µg/ml) 0 0,05 0 0

ml Normalserum 0 0 0,40 0

ml Herzinfarktserum 0 0 0 0,10

Der Küvetteninhalt wird wie im Versuch 1 durchgemischt und die Anfangsextinktion (E0)

abgelesen. Nach 30 sec wird überprüft, ob E0 unverändert bleibt.

Im weiteren Verlauf muss darauf geachtet werden, dass die exakten Zeitabstände zwischen

den Extinktionsablesungen einhalten werden.

Die Reaktion wird durch Zugabe von 0,1 ml Pyruvatlösung (0,01 mol/l) pro Küvette gestartet.

Nach Zugabe von Pyruvat wird gründlich gemischt.

Die Extinktion soll 15 sec nach dem Mischen und danach in den angegebenen Abständen

(genau!) abgelesen werden. Die Daten werden im Messplan 2A notiert.

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Messplan - 2A

abgelesene Extinktion

Zeit in sek H4 M4 Normal-

Serum

Infarkt-

Serum

Eo

30

Start durch Zugabe von Pyruvat (0,1 ml/Küvette)

15

30

60

90

120

150

180

210

240

270

300

82

2B Abschätzung der Menge H4 in normal und Herzinfarkt-Seren durch Harnstoff-

Stabilitätstest

Vier Küvetten werden wie im Pipettierplan angegeben nacheinander angesetzt und

nacheinander gemessen. Die Abnahme der Extinktion bei 366 nm wird nach Zugabe der

LDH bis zu einem konstanten Wert verfolgt.

Vor Beginn der Messung wird das Photometer bei 366 nm gegen eine mit Harnstoffpuffer

gefüllte Küvette geeicht. Diese Eichung wird von Zeit zu Zeit überprüft.

Pipettierplan - 2B

H4 M4 Normal-Serum

Infarkt-Serum

ml Harnstoff (6 mol/l) in Phosphatpuffer

(0,1 mol/l, pH 7.4) 1,50 1,50 1,50 1,50

ml NADH (0,01 mol/l) 0,05 0,05 0,05 0,05

ml H2O 1,30 1,30 0,95 1,25

ml H4 (20 µg/ml) 0,05 0 0 0

ml M4 (12,5 µg/ml) 0 0,05 0 0

ml Normalserum 0 0 0,40 0

ml Herzinfarktserum 0 0 0 0,10

Die Proben werden gut gemischt und bei Raumtemperatur für 1,5 Minuten stehen

gelassen. Anschließend wird die LDH-Aktivität pro Volumen, wie im Teil A beschrieben,

bestimmt.

Im weiteren Verlauf muss darauf geachtet werden, dass die exakten Zeitabstände zwischen

den Extinktionsablesungen einhalten werden.

Die Reaktion wird durch Zugabe von 0,1 ml Pyruvatlösung (0,01 mol/l) pro Küvette gestartet.

Nach Zugabe von Pyruvat wird gründlich gemischt.

Die Extinktion soll 15 sec nach dem Mischen und danach in den angegebenen Abständen

(genau!) abgelesen werden. Die Daten werden im Messplan 2B notiert.

83

Messplan – 2B

abgelesene Extinktion

Zeit in sek H4 M4 Normal-

Serum

Infarkt-

Serum

Eo

30

Start durch Zugabe von Pyruvat (0,1 ml/Küvette)

15

30

60

90

120

150

180

210

240

270

300

84

AUSWERTUNG UND FEHLERDISKUSSION

Allgemeines zu den Grafiken

Es sollen 2 getrennte Grafiken der Extinktionswerte auf Millimeterpapier (im Querformat)

erstellt werden.

1. Grafik: H4, M4 (aus 2A) und H4 + Harnstoff, M4 + Harnstoff (aus 2B)

2. Grafik: Normalserum, Infarktserum (aus 2A) und

Normalserum + Harnstoff, Infarktserum + Harnstoff (aus 2B)

Wichtig: das Steigungsdreieck nicht innerhalb der ersten 15 Sek. einzeichnen.

Zu Versuch 2A/B

Für jede Küvette (A und B) soll der gemessene Extinktionswert in Abhängigkeit von der Zeit

graphisch dargestellt werden. Für jeden Ansatz soll aus dem linearen Teil der Darstellung die

Abnahme der Extinktion pro Zeit (E/min) ermittelt werden und daraus die Aktivitäten der

LDH pro Volumen (µmol . min-1 . ml-1) in den einzelnen Ansätzen berechnet werden.

Berechnung des DE/min

Die Berechnung der Aktivitäten erfolgt bei allen Proben aus dem Zeitraum 30 bis 90 sec, nur

beim Infarktserum wird der Zeitraum 15 bis 30 sex, (x4) gewählt.

85

Berechnung des E/min

Die Berechnung der Aktivitäten erfolgt bei allen Proben aus dem Zeitraum 30 bis 90 sec, nur

beim Infarktserum wird der Zeitraum 15 bis 30 sec (x4) gewählt.

Übersichtstabelle der berechneten Daten – 2A/B

Probe ∆E/min F* Aktivität (U/ml)

H4

M4

Normalserum

Herzinfarktserum

H4 + Harnstoff

M4 + Harnstoff

Normalserum + Harnstoff

Herzinfarktserum + Harnstoff

*F = Verdünnungsfaktor

Aus den berechneten Aktivitätswerten soll der Anteil an denaturierter H4 in der gereinigten

H4-Probe errechnet werden. M4 dürfte vollständig denaturiert worden sein. So kann an-

genommen werden, dass die verbleibende Aktivität im Harnstoff behandelter Seren

ausschließlich auf H4-Aktivität zurückzuführen ist.

Übersichtstabelle der berechneten Daten

LDH-Aktivität pro Volumen Verlust

Probe mit Harnstoff (U/ml) ohne Harnstoff (U/ml) %

H4

M4

Normalserum

Herzinfarktserum

86

Rechenhilfe

𝑉𝑒𝑟𝑙𝑢𝑠𝑡 (𝑖𝑛%) =𝐴𝑘𝑡. 𝑜ℎ𝑛𝑒 𝐻𝑎𝑟𝑛𝑠𝑡𝑜𝑓𝑓 − 𝐴𝑘𝑡. 𝑚𝑖𝑡 𝐻𝑎𝑟𝑛𝑠𝑡𝑜𝑓𝑓

𝐴𝑘𝑡. 𝑜ℎ𝑛𝑒 𝐻𝑎𝑟𝑛𝑠𝑡𝑜𝑓𝑓∙ 100

Der Verlust an H4-Aktivität wird mit dem oben bestimmten Anteil an H4-Denaturierung

korrigiert. Bei der Berechnung der Aktivitätswerte der Seren wird dieser prozentuale

H4-Verlust während der Harnstoffbehandlung berücksichtigt.

Anteile in %

H4 nicht H4

Normalserum

Herzinfarktserum

Rechenhilfe

% 𝐻4/𝑆𝑒𝑟𝑢𝑚 =𝐴𝑘𝑡. 𝐻4 (𝑜ℎ𝑛𝑒 𝐻𝑎𝑟𝑛𝑠𝑡𝑜𝑓𝑓) ∙ 𝐴𝑘𝑡. 𝑆𝑒𝑟𝑢𝑚 𝑚𝑖𝑡 𝐻𝑎𝑟𝑛𝑠𝑡𝑜𝑓𝑓

𝐴𝑘𝑡. 𝑆𝑒𝑟𝑢𝑚 (𝑜ℎ𝑛𝑒 𝐻𝑎𝑟𝑛𝑠𝑡𝑜𝑓𝑓) ∙ 𝐴𝑘𝑡. 𝐻4 (𝑚𝑖𝑡 𝐻𝑎𝑟𝑛𝑠𝑡𝑜𝑓𝑓)∙ 100