Grundlagen der Molekularen Biophysik WS 2011/12

(Bachelor)

Dozent: Prof. Dr. Ulrike Alexiev

(R.1.2.34, Tel. 56100/Sekretariat Frau Endrias Tel. 53337)

Tutoren: Dr. Kristina Kirchberg

Alexander Boreham

6-stündig (2x2-stündige Vorlesung, 1x2-stündige Übung)

Vorlesung: Di, Do 8.30-10 Uhr Beginn: 18.10.11 (FBR Raum)

Übung: Mo 8:30-10 Uhr, 10-12 Uhr

Beginn: 24.10.11 SR E2, FBR Raum

Folgende Folien sind nur zur Verwendung in der Vorlesung und nicht für

Veröffentlichung und Weiterverbreitung

7. /8. VORLESUNG

Kofaktoren bringen Farbe ins Leben

Was sind Kofaktoren?

Meistens kleine Moleküle, die entweder kovalent (i), nicht-kovalent (ii)

oder über Komplexbildung (iii) im Protein gebunden sind.

Warum sind sie notwendig?

Funktion und Struktur

Was sind Kofaktoren?

Meistens kleine Moleküle, die entweder kovalent (i), nicht-kovalent (ii)

oder über Komplexbildung (iii) im Protein gebunden sind.

Warum sind sie notwendig?

Funktion und Struktur

Kovalent

Bakteriorhodopsin

Rhodopsin

C-term

C316

F313

Y306

P303 N302

N55

D83 S299

S298

K296

E113

E181

Ret

W126

H211

E122

Y136

T251

E247

E134

R135

H8

1

2

3

4 5

6

7

hn

Retinal ist als Kofaktor kovalent über eine protonierte Schiffsche base an ein

Lysin Rest des Opsins gebunden

Eine Möglichkeit:

Bindung von Aldehyden oder Ketonen an Proteine kann durch

Ausbildung einer Schiff'schen Base zwischen der Carbonyl-Gruppe

Carbonyl-Gruppe und der Amino-Gruppe einer Lysin-Seitenkette

erfolgen

Kovalente Bindung von Kofaktoren an Proteine

Carbonyl-Gruppe

z.B. Retinal

(Vitamin A-Aldehyd)

Amino-Gruppe

von Lysin-Seitenkette

z.B. Lys216

in Bacteriorhodopsin

Schiff'schen Base

Was sind Kofaktoren?

Meistens kleine Moleküle, die entweder kovalent (i), nicht-kovalent (ii)

oder über Komplexbildung (iii) im Protein gebunden sind.

Warum sind sie notwendig?

Funktion und Struktur

Kovalent

z.B.

Bakteriorhodopsin

Rhodopsin

Nicht-Kovalent

z.B.

Chlorophyll

Photosynthese

Chlorophylle sind nicht-kovalent in großen Proteinkomplexen gebunden

Struktur des Antennenkomplex LH2 eines

Purpurbakteriums. Die BChl sind gelb

(B800) und orange (B850) gezeichnet.

Zur besseren Übersichtlichkeit wurden

die Phytylschwänze nicht gezeichnet und

die Proteinumgebung transparent

dargestellt. Die Magnesiumatome im

Zentrum der BChl sind als Kugeln

dargestellt.

Was sind Kofaktoren?

Meistens kleine Moleküle, die entweder kovalent (i), nicht-kovalent (ii)

oder über Komplexbildung (iii) im Protein gebunden sind.

Warum sind sie notwendig?

Funktion und Struktur

Kovalent

z.B.

Bakteriorhodopsin

Rhodopsin

Nicht-Kovalent

z.B.

Chlorophyll

Komplexbildung

z.B.

Fe-S-Cluster

Fe-S-Cluster

Rieske protein is a iron-sulfur protein (ISP) component of cytochrome bc1

complex and the cytochrome b6f complex which was first discovered and isolated

by John S. Rieske and co-workers in 1964. It is a unique [2Fe-2S] cluster in that

one of the two Fe atoms is coordinated by two histidine residues rather than two

cysteine residues.

1bcc

Kofaktoren im Überblick

I. Pigment, Chromophore

II. Redoxfaktoren,

Elektronentransport

III. Katalysatorfunktion,

Substrataktivierung

IV. Reine Strukturfunktion

Metallfreie Pigmente

(Carotinoide, Retinale, Phycocyanin etc)

Metall-organische Pigmente

(Hämgruppe, Chlorophylle, etc)

Organische Redox-Moleküle

(NAD, Chinon, Flavin, Ascorbinsäure, etc)

Redox-aktive Metall-Komplexe

(Fe-S Cluster, blaue Cu-Zentren, etc)

Redox-inaktive Metall-Komplexe

(Ca-Zentren, Zn-Zentren etc)

Alkohol-Dehydrogenase (ADH)

Alkohol-Dehydrogenase (ADH)

Bacteriorhodopsin (bR)

Cytochrom C oxidase (COX)

p-p* Übergänge

meistens stark

absorbierend

d-d Übergänge

schwach

absorbierend

Lig-Me-charge

transfer mittel bis

stark

absorbierend

I. Pigment, Chromophore

Spektroskopie

aus verschiedenen historischen oder sachlichen Gründen

gibt es unterschiedliche Einheiten zur Messung der

Frequenzen oder Wellenlängen:

Wichtigste Umrechnungsfaktoren:

1cm-1 = 29.9 GHz = 1.2398 x10-4 eV

1 kcal/kmol = 0.349cm-1

Korrekte Zusammenhänge

][

][1

1

1

-

-

sh

Energiecv

cmhc

Energie

c

v

n

Optische Molekülspektren

Gesamtanregungsenergie eines Moleküls

Rotationsspektren:

Übergänge zwischen den Rotationsniveaus eines gegebenen Schwingungsniveaus in

einem bestimmten Elektronenzustand (Mikrowellen, Ferninfrarot

Ramanspektroskopie)

Rotationsschwingungsspektren:

Übergänge von den Rotationsniveaus eines gegebenen Schwingungsniveaus zu den

Rotationsniveaus eines anderen Schwingungsniveaus im gleichen Elektronenzustand

(elektronischer Anregungszustand bleibt erhalten), (Infrarot Infrarot- und

Ramanspektroskopie)

Elektronenspektren:

Übergänge zwischen den Rotationsniveaus der verschiedenen Schwingungsniveaus

eines Elektronenzustandes und den Rotations-und Schwingungsniveaus eines anderen

Elektronenzustandes. Enhält alle Schwingungsbanden des betreffenden

Elektronenübergangs, jede mit ihrer Rotationsstruktur. (Nahinfrarot, Sichtbar, Ultraviolett

Elektronische Bandenspektroskopie)

rotvibel EEEE

Moleküle, Chemische Bindung und Molekülorbitale

Die chemische Bindung kommt durch die äusseren Elektronen (Valenzelektronen),

die schwächer an den Kern gebunden sind, zustande.

Kohlenstoff

Moleküle, Chemische Bindung und Molekülorbitale

Die chemische Bindung kommt durch die äusseren Elektronen (Valenzelektronen),

die schwächer an den Kern gebunden sind, zustande.

Kohlenstoff besitzt sechs Elektronen.

Aufenthaltsort der Elektronen kann nur durch eine Wahrscheinlichkeitsfunktion

(Wellenfunktion als Lösung der Schrödingergleichung) bestimmt werden. Die

Wellenfunktion kann durch sog. Wahrscheinlichkeitswolken oder -schalen

visualisiert werden.

K-Schale (s)

M-Schale (s,p)

zwei Elektronen besetzen die innere 1s-Schale.

zwei Elektronen besetzen das 2s-Niveau der zweiten Schale

zwei Elektronen besetzen das 2px- und 2py- Niveau (auf zwei der drei Zustände

2px, 2py, 2pz) 2s2p (Aufspaltungsenergie 4eV)

Hybridisierung Beispiel Kohlenstoff

Bildung von 4 energetisch gleichwertigen sp3-Orbitalen

Der mit der Hybridisierung verbundene Energieaufwand (4eV) wird durch

die chemische Bindung wiedergewonnen.

Entartung der 2s und 2p Zustände -> Störungstheorie der Entartung:

Linearkombinationen der alten mit einander entarteten Wellenfunktionen

(LCAO-Methode)

-> Ladungsschwerpunkt hat sich gegenüber s-Funktion verschoben

Überlappen sich die sp3-Orbitale von Atomen, können sie feste kovalente

Bindungen bilden, die dann die tetraedrische Struktur widerspiegeln. z.B. Methan

CH4 (4 H an den Spitzen des Tetraeders, tetragonale Hybridisierung )

Hybridisierung bei Ethylen und Benzol

trigonale Hybridisierung:

Wellenfunktionen vom s, px, py Typ bilden drei Vorzugsrichtungen in einer

Ebene durch geeignete Linearkombinationen : sp2 –Hybridisierung

vierte Wellenfunktion pz spielt Rolle bei Bindung

C-C Bindung Beiträge von s, px - Zustand

zusätzlicher Elektronen Beitrag vom freien pz-Zustand -- zusätzlicher

Bindungseffekt = Doppelbindung

Ethylen

Benzol

alle 6 pz-Zustände sind gleichwertig -> Elektron kann also im Prinzip in jedem

dieser Zustände sitzen delokalisierte p-Elektronenwolke

trigonale Hybridisierung, aehnlich wie Ethylen sp2 –Hybridisierung,

hier Ringstruktur s -Bindungen

Bahnwellenfunktionen von Elektronen in Molekülen nennt man s,p, d,... analog zu

s, p, d,.. Orbitalen in Atomen.

Elektronische Spektren grösserer Moleküle

-Anregung ganz verschiedener Elektronen im Molekül moeglich

-Drei Grenzfälle von Anregung:

1) Lichtabsorption durch am Zusammenhalt des Moleküls nicht beteiligte

Elektronen lokalisierte Gruppe im Molekül: Chromophor

2) Lichtabsorption durch bindende Elektronen, bei denen die Anregung zu

einer Dissoziation de Moleküls führen kann

3) Lichtabsorption durch nicht-bindende , aber über grössere Teile des

Moleküls verteilte Elektronen

Chromophor :

C=C Doppelbindung: Anregung durch einen pp*-Übergang bei ca. 180 nm (ca. 7eV)

C=O Carbonylgruppe: Anregung durch einen np*-Übergang bei ca. 290 nm

Anregung eines Elektrons des Sauerstoffs in ein vorher leeres p-Orbital

d.h. Übergang von einem vorher nichtbindenen Zustand in ein p-Orbital

n- nicht-bindend, p*- angeregtes p-Orbital

Absorptionsspektren von Aromaten

Aromate= Moleküle mit delokalisierten p-Bindungen

Absorption durch Elektronen in nicht-lokaliserten Orbitalen, die aber nicht für

den Zusammenhalt des Moleküls massgeblich sind

Phe (F) Tyr (Y) Trp (W)

Absorption von Licht:

Wichtig: Energiedifferenz zwischen zwei Zuständen eines Moleküls und

Wahrscheinlichkeit des Übergangs (alle möglichen Zwischenstufen

zwischen stark erlaubten und stark verbotenen Zuständen)

Lambert-Beersches Gesetz

Für die Lichtabsorption von Molekülen mit Konzentration c in einer

homogenen Probe der Dicke d gilt

cdeII - 0

I0- einfallendes Licht, I- von der Probe durchgelassenes Licht,

e- molarer Absorptions (Extinktions)koeffizient (M-1cm-1), molarer

Wirkungsquerschnitt für die Lichtabsorption

303,2/e cdI

Ie

0log

ecd – “Optische Dichte”, Absorbanz

Abgabe der von einem Molekül absorbierten Energie

Aromatenspektren

Je grösser das konjugierte p-Elektronensystem desto langwelliger die Absorption

2pz-Elektronen gehen sogenannte p-Bindungen ein, bei denen die Elektronen mit

einem Knoten der Aufenthaltswahrscheinlichkeit ueber das ganze Molekül verteilt

sind.

p-Bindungen sind weniger stark als s-Bindungen und werden bei geringerer

Quantenenergie als bei s-Bindungen angeregt

- pp*-Übergange sind die energetisch tieftsen Anregungen von Aromaten,

- zeigen ausgeprägte Schwingungsstruktur (Anregung zwischen

gebundenen Zuständen des Moleküls, Bindung bleibt erhalten)

- erhalten ein für das Molekül charakteristisches Schwingungsspektrum

Verschiebung nach kleineren Quantenenergien mit zunehmender Länge des

konjugierten (=delokalisiert) Systems

Konjugation findet auch in linearen Polyenen statt

Erklärung: aufgrund des längs der Kette frei beweglichen Elektrons

b-Carotin

Retinal

Erklärung: aufgrund des längs der Kette frei beweglichen Elektrons

Anschauliche erste Näherung mit Modell von Elektronen im Kasten bzw.

Potentialtopf

2

0

22

8 am

hnEn

Energieeigenwerte eines Elektrons (Masse m0) im eindimensionalen

Potentialtopf der Länge a

Mit n=1,2,3,…

b-Carotin: 11 Doppelbindungen mit 22 konjugierten Elektronen

in jedes Niveau n passen nur 2 Elektronen mit gegengesetztem Spin

n=1 bis n=11 im Grundzustand besetzt

Längstwellige Absorption bei 450nm bedeutet Übergang von n=11 nach n=12

(tiefster nicht besetzter Zustand)

-> Energiedifferenz 2

0

222

11128)1112()(

am

hEEE --

Erklärung: aufgrund des längs der Kette frei beweglichen Elektrons

Anschauliche erste Näherung mit Modell von Elektronen im Kasten bzw.

Potentialtopf

2

0

22

8 am

hnEn

Energieeigenwerte eines Elektrons (Masse m0) im eindimensionalen

Potentialtopf der Länge a

Mit n=1,2,3,…

b-Carotin: 11 Doppelbindungen mit 22 konjugierten Elektronen

in jedes Niveau n passen nur 2 Elektronen mit gegengesetztem Spin

n=1 bis n=11 im Grundzustand besetzt

Längstwellige Absorption bei 450nm bedeutet Übergang von n=11 nach n=12

(tiefster nicht besetzter Zustand)

-> Energiedifferenz 2

0

222

8)1112()450(

am

hnmE -

A7.17a

Retinal

Absorption in Lösung bei ca. 380 nm

Gebunden im Protein bei ca. 500 nm

kann zu 600nm verschoben werden in D85A

Protonierte Schiffsche Base und Gegenionen (elektrostatisches Feld in der

Chromophorbindungstasche)

Asp96

Asp85

COO-

Redox-aktive und nichtaktive Metall-Komplexe

Übergangsmetalle spielen eine Rolle:

Elemente von Scandium bis Nickel haben eine

nichtaufgefüllte innere 3d Schale:

Farbe und Paramagnetismus

Chemische Wertigkeit wird durch äussere

Valenzelektronen bestimmt, aber sie sind den

inneren 3d-Elektronen energetisch sehr eng

benachbart -> die 3d-Elektronen wechseln

zwischen den Schalen

Gilt ebenfalls für die 4d Übergangselemente

(z.B. Ruthenium)

d-Block Übergangselemente

.

Group 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

Period 4 Sc 21 Ti 22 V 23 Cr 24 Mn 25 Fe 26 Co 27 Ni 28 Cu 29 Zn 30

Period 5 Y 39 Zr 40 Nb 41 Mo 42 Tc 43 Ru 44 Rh 45 Pd 46 Ag 47 Cd 48

Period 6 La 57 Hf 72 Ta 73 W 74 Re 75 Os 76 Ir 77 Pt 78 Au 79 Hg 80

Period 7 Ac 89 Rf 104 Db 105 Sg 106 Bh 107 Hs 108 Mt 109 Ds 110 Rg 111 Cn 112

Biologische Funktion anorganischer Elemente

•O2-Transport

•Elektronentransport (Energiehaushalt)

•Reaktionen mit kleinen Molekülen: O2,N2,H2, CO2, CH4, H2O2

•Aufbau und Abbau org. Verbindungen (Gruppenübertragungen,

radikalische Reaktionen)

•Strukturfunktion individueller Metallionen in Makromolekülen

•Biomineralisation

•Ladungstrager zur Informationsuebertragung

•Magnetotaxis, Gravitations-Sensing

•Chlorophyll in der Photosynthese

Weiter von Interesse weil:

•Toxizität anorg Elemente

•Therapeutika (Krebs)

•Biomemiticshe Substanzen

Metall Funktion, beteiligte Enzyme

Natrium Ladungsträger, osmotisches Gleichgewicht

Kalium Ladungsträger, osmotisches Gleichgewicht

Magnesium Struktur, Hydrolase, Isomerase

Calcium Struktur, Signalweiterleitung, Ladungsträger

Vanadium Stickstoff-Fixierung, Oxidase

Chrom ?

Molybdän Stickstoff-Fixierung, Oxidase, Oxo-Transfer

Wolfram Dehydrogenase

Mangan Photosynthese, Oxidase, Struktur

Eisen Oxidase, Sauerstofftransport und Speicherung

Elektronenübertragung, Stickstoff-Fixierung

Cobalt Oxidase, Alkylgruppenübertragung

Nickel Hydrogenase, Sauerstofftransport,Elektronenübertragung

Kupfer Oxidase, Sauerstofftransport, Elektronenübertragung

Zink Struktur, Hydrolase

FIGURE 2. UV-visible absorption spectroscopy

of wild type and ABCE1

mutants. A, spectra of WT ABCE1 isolated from S.

solfataricus (S. solf., black

line) or from E. coli (red line) as well as the mutants

C54S (green line) and C24S

(orange line) were recorded in the buffer C. WT

ABCE1 isolated from S. solfataricus

was incubated with the reductant sodium dithionite

(B) or the oxidant

potassium ferricyanide (C) at the indicated

concentrations for 2 min. All spectra

were recorded at a protein concentrations of 50 mM.

FeS clusters

d-d Übergänge:

Aufsplittung der d-Orbitale, Elektron geht von einem zum anderen d-

Orbital

In Übergangsmetall-Komplexen gibt es ein Splitting der Energielevel

der d Orbitale, hängt ab von jeweiligen Metall, seinem

Oxidationszustand und der Natur der Umgebung

Liganden-Metall-Charge Transfer:

Elektron geht von Liganden Orbital zu Metallorbital

Häufig wenn Metall in hochoxidierten Zustand

Ligandenfeldtheorie

Jahn-Teller-Theorem, Hundsche Regel