Chemie in der Praxis

Oliver Kayser

Grundwissen Pharmazeutische Biotechnologie

Chemie in der Praxis

Herausgegeben von

Prof. Dr. Erwin MOller-Erlwein, Technische Fachhochschule Berlin Prof. Dr. Wolfram Trowitzsch-Kienast, Technische Fachhochschule Berlin

Prof. Dr. Hartmut Widdecke, Fachhochschule Braunschweig/WolfenbOttel

Die Reihe Chemie in der Praxis richtet sich an Studierende in praxisorientierten Studiengan­gen besonders an Fachhochschulen, aber auch im universitaren Bereich. Ihnen sollen Be­gleittexte angeboten werden fOr solche Studienrichtungen, in denen die Kenntnis von und der Umgang mit chemischen Produkten, Denk- und Verfahrensweisen einen wichtigen Be­standteil bildet.

DarOber hinaus wendet sich die Reihe aber auch an Ingenieure und andere Fachkrafte, denen in ihrem Berufsfeld immer wieder "chemische" Frage- und Aufgabenstellungen unter­schiedlichster Art begegnen. Ihnen bietet die Reihe Gelegenheit, fundamentales Chemie­Wissen sowohl aufzufrischen als auch neue und erweiterte Anwendungsmoglichkeiten kennen zu lernen.

Zielsetzung der Herausgeber bei der Zusammenstellung der einzelnen Titel ist, eine solide und angemessene Vermittlung von Basiswissen mit einem HochstmaB an Aktualitat in der Praxis zu verknOpfen. Hierzu wird bewusst auf eine umfangreiche Darstellung der theoreti­schen Grundlagen verzichtet, um statt dessen die fOr die Praxis relevanten Aspekte in einer verstandlichen Weise darzulegen.

Oliver Kayser

Grundwissen Pha rmazeutische Biotechnologie

1m Teubner

B. G. Teubner Stuttgart· Leipzig' Wiesbaden

Die Deutsche Bibliothek - CIP-Einheitsaufnahme Ein Titeldatensatz fOr diese Publikation ist bei der Deutschen Bibliothek erhaltlich.

Dr. rer. nat. Oliver Kayser Geboren 1967 in Recklinghausen. Studium der Pharmazie an der Westfalischen Wilhelms-Universitat in MOnster von 1986 bis 1991. Nach Aufenthalt an der University of Florida in 1991 die Promotion an der Freien Universitat Berlin im Bereich Pharmazeutische Biologie. Erlangung der Promotion in 1997 und Wechsel zur Industrie (AnalytiCon Drug Discovery) in 1996 und 1997. Ab 1997 Aufnahme einer Habilitationsarbeit am Fachbereich Biologie, Chemie und Pharmazie an der Freien Universitat Berlin im Bereich Pharmazeutische Technologie, Biopharmazie und Biotechnologie. Der Forschungsschwerpunkt liegt in der Formulierung schwerloslicher Biotech-Wirkstoffe und der Entwicklung von Drug-Targeting­Systemen zur Therapie parasitarer Infektionen.

1 . Auflage Marz 2002

Aile Rechte vorbehalten © B. G. Teubner GmbH, Stuttgart/Leipzig/Wiesbaden, 2002

Der Verlag Teubner ist ein Unternehmen der Fachverlagsgruppe BertelsmannSpringer. www.teubner.de

Das Werk einschlieBlich aller seinerTeile ist urheberrechtlich geschOtzt. Jede Verwertung auBerhalb der engen Grenzen des Urheberrechtsgesetzes ist ohne Zustimmung des Ver­lags unzulassig und strafbar. Das gilt insbesondere fOr Vervielfaltigungen, Obersetzun­gen, Mikroverfilmungen und die Einspeicherung und Verarbeitung in elektronischen Systemen.

Die Wiedergabe von Gebrauchsnamen, Handelsnamen, Warenbezeichnungen usw. in diesem Werk berechtigt auch ohne besondere Kennzeichnung nicht zu der Annahme, dass solche Namen im Sinne der Warenzeichen- und Markenschutz-Gesetzgebung als frei zu betrachten waren und daher von jedermann benutzt werden dOrften.

Umschlaggestaltung: Ulrike Weigel, www.CorporateDesignGroup.de

ISBN-13: 978-3-519-03553-4 001: 10.1007/978-3-322-80124-1

e-ISBN-13: 978-3-322-80124-1

Vorwort

Die Biotechnologie gilt als eine der Schl11sseltechnologien des 21. Jahrhunderts. Bio- und

gentechnische Verfahren konnen traditionelle Herstellungsprozesse in der pharmazeutischen

Industrie ersetzen und erganzen. Die Biotechnologie in der pharmazeutischen Industrie wird

zuldinftig ein Motor fiir die Er(orschung und Entwicklung neuer Arzneimittel und

Therapieformen sein. Dies gilt beispielsweise fiir den gezielten Einsatz gentechnisch

veriinderter Organismen bei der Herstellung und Verarbeitung von Arzneimitteln und

Diagnostika, als auch bei der Verwendung von Genen als Trager der Erbinformation bei der

Ztichtung transgener Tiere und bei der aufkommenden Gentherapie. 1m Bereich der

Arzneimittelentwicklung haben die biotechnologischen Wissenschaften einen breiten Raum

eingenommen. Nach vorsichtigen Schatzungen wird sich der Anteil der biotechnologisch

gewonnenen Arzneistoffe in den nachsten Jahren rasant steigem, und mit der Entwicklung der

somatischen Gentherapie steht eine neue biologische Revolution ins Haus, wenn sie sich

gegen ethische und moralische Bedenken etablieren kann und ein gesellschaftsfllhiger

Konsens gefunden wird.

Urn die Entwicklungen im Bereich der pharmazeutischen Biotechnologie zu verstehen, ist ein

solides Grundwissen der eingesetzten Techniken und Methoden unverzichtbar. Diese sind

zwar aus den Bereichen der molekularen Biologie wohl bekannt, die spezifische Anwendung

bei pharmazeutischen Fragestellungen ist dagegen weniger beachtet. Das vorliegende

Lehrbuch soil angehenden Pharmazeuten, Chemikern, Biologen, Biotechnologen, Pharma­

und Chemietechnikem wie Naturwissenschaftlem in der Biomedizin einen Einstieg bieten,

sich schnell und kompakt in dieses Fachgebiet der Biotechnologie einzulesen. Bewusst wurde

auf die vertiefende Darstellung des biologischen und chemischen Grundlagenwissens

verzichtet, da das Buch sich an die Studierenden und Experten mit einem biochemischen,

genetischen und chemischen Vorwissen richtet. 1m Literaturteil findet der Leser Hinweise auf

weiterfiihrende Literatur, die grundlegendes Wissen wesentlich detaillierter diskutieren. In

diesem Buch wurde vielmehr Raum gegeben, Techniken und Methoden im Hinblick auf die

spezifischen Fragestellungen und Probleme zu diskutieren.

Berlin, im Februar 2002

Dr. Oliver Kayser

Inhaltsverzeichnis

Vorwort ................................................................................................. v

Inhaltsverzeicbnis.... ...... ................... ........................................................ VII

Abldirzungsverzeicbnis.............. ...................................................... ........... XI

Allgemeiner Teil

1. Einffihrung in die Pharmazeutische Biotechnologie........................................... 1

1.1 Pharmazeutische Biotechnologie - Definition und Bedeutung. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 1.2 Geschichte der Pharmazeutischen Biotechnologie.......... ..................... ....... 5 1.3 Wirtschaftliche Bedeutung der Pharmazeutischen Biotechnologie................ ... 7

2.

2.1 2.2.

2.2.1 2.2.2 2.3 2.3.1 2.3.2 2.3.3 2.3.4 2.4 2.5 2.5.1 2.5.2

3.

3.1 3.2 3.3

4.

4.1 4.2 4.2.1 4.2.2 4.2.3 4.2.4 4.3 4.3.1 4.3.2

Grundlagen der Pharmazeutischen Biotechnologie................................. 11

Die Zelle - Definitionen, Grundfunktionen und Grundstrukturen. . . . . . . . . . . . . . . . . .... II Struktur und Funktion der pro- und eukaryotischen Zelle in der industriell 15 genutzten Biosynthese ..................................................................... .. Mikroorganismen als Produktionsorganismen .. ...... ........ ....... .................... 15 Saugerzellen als Produktionsorganismen ................................................ 19 Die genetische Information und Genexpression. . .. . . . .. . . .. . .. . .. . . . . . . . .. .. . . .. . .. . ... 23 DNA und RNA als Trager der Erbinformation................. .. ....................... 23 DNA-Replikation............................................................................ 26 Transkription. . .. . . . . . . . .. . .. . .. . .. . . . . .. . .. . .. . .. . .. . . . . .. . .. . .. . .. . . . . .. . .. . . . . .. . .. . .. . .. . . 27 Translation. . .. . .. . .. . .. . .. . .. . .. . . . . .. .. . . .. . .. . .. . .. . .. . .. . .. . .. . .. . .. . . . . .. . .. . .. . .. . .. . . . . . 28 Grundlagen der rekombinanten DNA-Technologie.. ... ............ ............ ... .. ... 30 Biosynthesewege biogener niedermolekularer Wirkstoffe...................... ....... 33 Niedermolekulare Naturstoffe aus pflanzlichen und tierischen Quellen.......... ... 33 Niedermolekulare Naturstoffe aus mikrobiologischen Quellen....... .... ............. 36

Arbeitstechniken und technische Anforderungen an die Herstellung pharmazeutisch biotechnologischer Produkte....................................... 41

Allgemeine Anforderungen........... .................. .................................... 41 Gesetzliche Anforderungen . .................................................... ........... 41 Tecbnische und raumliche Anforderungen................... ...................... ...... 42

Biotechnische und gentechnische Arbeitstechniken............ ..................... 47

Haltung und Konservierung zellularer Organismen ..................................... 47 Grundsatzliche Probleme bei Arbeiten in der Zellkultur............................ ... 48 Kultivierung von Mikroorganismen.................... ...... ... .......................... 48 Kultivierung von Saugerzellen. . ........ . .. . . . . .. . . . . .. . .. . . . . .. . .. . .. . . . . . . . . . . .. . .. . .. . .... 49 Kultivierung pflanzlicher Zellen. . .. . .. . .. . . . . .. . . . . .. . .. . .. . . . . . . . . . . .. . .. . .. . .. . .. . .. . ... 51 Vergleiche der Zellsysteme....................................................... .......... 52 Spezielle DNA-, RNA- und Protein-Techniken.......................................... 53 DNA-Sequenzierung................... . .............. ... . ... ......... ... ... ..... . ... .. ... . . 53 DNA-Hybridisierung.. .. ...... ......... ... ............ ... . .. . ... ..... . ........ . ..... . ... .... 55

VITI

4.3.3 4.3.4 4.3.5 4.3.6 4.3.7 4.3.8 4.3.9 4.3.10 4.4 4.5

4.5.1 4.5.2

5.

5.1 5.2 5.2.1 5.2.2 5.2.3 5.2.4 5.3 5.3.1 5.3.2 5.3.3 5.3.4 5.3.5 5.3.6

6.

Inhaltsverzeichnis

Polymeraseketten-Reaktion (PCR)........................................................ 56 DNA-Synthese ............................................................................... 58 Blotting-Verfahren ........................... '" ... '" ... .. . ... . ... ... .. ... ... ... . .. .. . . ..... 59 Mikro-Array-Chips................................ .......................................... 61 Proteinsequenzierung ........... '" ................................... '" ......... ... ..... ... 63 Gelelektrophorese .................. '" ........................ '" ....... ......... ... ..... .... 66 Immunchemische ELISA .. , ... ... ............ .. . ........ .. .. ... . .. .. . . .. ...... .. . .. . . . . . .... 67 Durchflusszytometrie ........................... '" ...... ............... .... ................. 67 Kombinatorische Chemie ... ,.. ... .. . ... ... ...... .... .. . . . . .. . ... .. .. .. . . .... . . . . . .. . ... . ... 69 Automatisierte Trenn- und Analyseverfahren in der niedermolekularen Wirkstofiforschung .......................................... '" ............ '" ... ..... ....... 73 HPLC-Techniken zur Separation natiirlicher Naturstoffgemische................. ... 74 High Throughput Screening Systeme ..................................................... 76

Bioprozesstechnik ......... '" ................ " ... '" ... .. .......... .. .... . . . . . . ... ... ..... 79

Bioreaktortechnik und Grundlagen der Produktion von Biotech-Produkten....... 79 Upstream-V erfahren. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 79 Zellbiinke ............................................................... '" .. .... . . . .. . ... ... 82 Bioreaktoren ...... " ............. '" '" .......... '" ......................................... , 83 Bioprozesskontrolle......................................................................... 87 Kontaminationen ........... , ..... , .. " ........... '" '" '" .. . .... . . .. .. . .... .. . . .. .. ... . . . ... 88 Downstream-Verfahren.. . ... ... ... . .. ... ...... ... .. . ... . . . . .. ... ... . .. .... .. ... . . . . .. . . . .. . 92 Zentrifugation ............................... , ... . .. . ... ... ... ... ... .. . ... ...... .. . .. . .. . ...... 93 Filtration ..................... " .. . ... . .. . .. ...... .. . . . . . . . . .. . ... ..... . ... ... . .. . . . .. . ... . ..... 96 Chromatographische Verfahren.. . .. .. . . .. .. . . . . .. . . .. . .. .. . . . . . .. . . . . .. . .. . . . . .. . . .. . . .... 97 Zellaufschluss............ ............................................................... ..... 98 Gentechnische Proteinmarkierung zur Optimierung der Aufreinigung... ........ .... 98 Renaturierung von Proteinen ...................... , .. " ... . . . ..... . . . . ... . . . . . . . .. ... ... . .. 99

Bioanalytik und biopharmazeutische Grundlagen in der Produktentwicklung ...........•..................................... ,. ... ..... .... .... .... 101

6.1 Proteinstruktur. .................................... ......................... ............. .... 101 6.2 Proteinstabilitat und Abbanmechanismen ................................ " . .. .. ... .. . . . . 103 6.2.1 Chemische Stabilitat ....... ,. '" . " .................................... " ... , .. .. .. . .. .. . . . . 104 6.2.2 Physikalische Stabilitat .... , . '" '" ... .. . ...... ... ... ... .. . . .. . ... .. . ... ..... . .. .. .. ... .. . . . 105 6.3 Protein- und Nukleinsaurecharakterisierung im Rahmen der Arzneimitte1prufung 106 6.4 Biopharmazeutische und technologische Aspekte von Biotech-Produkten......... III 6.4.1 Pharmakokinetik proteinogener Wirkstoffe...... ........................................ 111 6.4.2 Biopharmazeutische Grundlagen fUr die technologische Formulierung

proteinogener Therapeutika. .. . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . .. . . . . . . .. . . .. .. . . . . .. . . . . . . . . . . . 115 6.4.3 Neue technologische Entwicklungen.............................. ............ ........ .... 120

7. Impfstoffe.................................................................................... 125

7.1 Modeme Impfstoffstrategien... ...... ... ...... ............................................. 126 7.1.1 Subunit-Impfstoffe....... ............ ....................... ....... ..... ..................... 127 7.1.2 Peptidimpfstoffe......... .................... ............................... ............. .... 129 7.1.3 DNA-Vakzine............ ................................................... ............. .... 130 7.2 Adjuvantien................................................................................... 132 7.3 Produktion von Impfstoffen............. .............................. ..... ................ 134 7.3.1 Ausgangsmaterialien...... ................................... ............................... 134 7.3.2 Herstellung..... ..... ............................. ... .................... .................. .... 134

8.

8.1 8.1.1 8.1.2 8.2 8.2.1 8.2.2 8.2.3 8.3 8.3.1 8.3.2 8.3.3 8.4 8.5 8.6 8.7 8.8 8.8.1 8.8.2

9.

9.1 9.2 9.2.1 9.2.2 9.3 9.3.1 9.3.2 9.4 9.5 9.5.1

10.

10.1 10.1.1 10.2 10.2.1 10.2.2 10.3 10.4

Inhaltsverzeichnis

Somatische Gentherapie ................................................................. .

Gnmdlagen und Bedeutung der Gentherapie ............................................ . Somatische Gentherapie und Keimbahngentherapie ................................... . Gentherapeutische Strategien .............................................................. . Einschleusen von DNA in ZeBen ................................. ' ....................... . Ex vivo Therapie .................................................................................................... . In vivo Therapie ............................................................................. . Antisense Therapie ........... , ............................................................. . Vektoren in der Gentherapie .............................................................. . Chemische Transfersysteme .............................................................. . Physikalische Transfersysteme ........................................................... . Biologische Transfersysteme .............................................................. . Neue Strategien gegen Krebs ................................................... ' .......... . Sicherheit in der Gentherapie ............................... ' .............................. . Zulassungsrechtlicher Status gentherapeutischer Verfahren .......................... . Produktion von Gentherapeutika .......................................................... . Das Human-Genomprojekt ............................................................... . Methodischer Ablauf der Genomsequenzienmg ........................................ . Erfolge der Genomsequenzienmg ........................................................ .

Transgenese, Genpharming und Xenotransplantation ............................. .

Transgene Tiere und Pflanzen ...... ' ........................................... ' ......... . HersteBung transgener Tiere .............................................................. . Mikroinjektion .............................................................................. . Gentechnisch veranderte StamrnzeBen ..................... ' ............................ . Beispiele fur trans gene Tiere in der Pharmazie ........................................ . Schafe als transgene Tiere ................................................................. . Knock-Out Mause ................................................. " ............. ' ......... . Gen-Pharming ............................................................................... . Xenotransplantation ........................................................................ . Rechtliche Aspekte der Xenotransplantation ............................................ .

PflanzenzeIlkulturen und trans gene Pflanzen ...................................... .

Zell-, Gewebekulturen und ihre Techniken ............................................ . Protoplastenfusionstechnik ................................................................. . Gentechnische Transfermethoden ............. ' .......................................... . Transformation mit Hilfe des Ti-Plasmids ............................................... . Weitere Gentransfermethoden ............................................................. . Bioprozesstechnik pflanzlicher ZeBen ................................................... . Pflanzen als Bioreaktoren fur essbare Vakzine ....................................... .

IX

139

139 139 140 142 142 142 143 144 145 146 147 149 150 151 151 152 153 154

157

157 158 158 159 160 161 162 163 165 166

167

168 168 169 169 170 171 172

11. Pharma- und Bioinformatik......... ............ ... ......... ......... ...... ... .... .... ... 175

11.1 Gnmdlagen und Bedeutung.......................................... ......... ...... ........ 175 11.2 Pharmainformatik und Genomics...... ..................... ......... ...... ........ ........ 180

12. Patentierung und Zulassung .................................... ......... ............... 183

12.1 12.2 12.3 12.3.1

Patentierung .................................................................................. . Patente in der Pharmazeutischen Biotechnologie ...................................... . Zu1assung von Arzneimitteln ................................................... " ......... . Formaler Ablauf des zentralen Verfahrens .............................................. .

183 185 187 188

x Inhaltsverzeichnis

12.3.2 Inhalt und Anforderungen an das Zulassungsdossier ................................... , 188 12.3.3 Entwicklung einer Produktspezifitat...................................................... 193 12.3.4 Weitere Zulassungsverfabren in der ED und Deutschland.. .... ... ..... .. .. .. . . .. . .... 194

SpezieUer Teil

13. Hochmolekulare, biotechnologisch gewonnene Wirkstoffe 195

13.1 Anforderungen des Europruschen Arzneibuchs an gentechnisch hergestellte Produkte ......................................... '" .................................. '" ...... 195

13.1.1 Priifung auf SteriliUit........................................................................ 197 13.1.2 Priifung aufViren......... ..... ....... ... ....... ............ ....... .... ....... ..... ... ....... 198 13.1.3 Pyrogene......................... ... ..... ... ........................... ... ......... ........ .... 199 13.1.4 Priifung auf Abwesenheit von Erregem der iibertragbaren spongiformen

Enzephalopathie............... .......... ..... ..... ............ ............ .... ...... ... ...... 200 13.2 Rekombinante proteinogene Arzneimittel und Grundziige der klinischen Priifung 203 13.2.1 Priiklinische Entwicklung................................................................... 203 13.2.2 Klinische Priifung ............................................................................ 204 13.3 Gentechnisch hergestellte Insulin-Praparate............................................. 206 13.4 Gentecbnisch hergestellte Erythropoetin-Praparate..................................... 214 13.5 Gentechnisch hergestellte Interferon-Praparate. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ... 216 13.6 Gentechnisch hergestellte Praparate mit Follikel-stimulierenden-Hormon

(FSH) ........................................................................................................................ 221 13.7 Gentechnisch hergestellte Somatropin-Praparate ........................................ 223 13.8 Lepirudin... ..... .... ... ... ... ... ...... ...... ...... ............. ........ ... .... ....... ... ...... 225 13.9 Monoklonale Antikorper... ... ... ...... ... ... ... ... ..... .... ... ..... .... ... ....... ... ....... 226

14. Weiterrdhrende Literatur und InternetIinks..................................................... 235

15. Stichwortverzeichnis.............................................................................................. 249

AbkOrzungsverzeichnis

AMG

BfArM

EMEA

FDA

GC

F&E

GFR

GMP

HIV

HPLC

HTS

i.m.

IFN

IL

LAF

LCIMS

MS

s.c.

SOP

1NF

WHO

WWW

Arzneimittelgesetz

Bundesinstitut fiir Arzneimittel und Medizinprodukte

European Medicines Evaluation Agency

Food and Drug Administration

Gaschromatographie

Forschung und Entwicklung

Glomuliire Filtrationsrate

Good Manufacturing Practice

Human Immunodeficiency Virus

High Pressure Liquid Chromatography (= Hochdruckflussigchromatographie)

High Throughput Screening (= Hochleistungsdurchsatz-Untersuchungen)

intramuskuliir

Interferon

Interleukin

Laminar-Airflow-Werkbank

Gekoppelte Flussigchromatographie/ Massenspektroskopie

Massenspektroskopie

subkutan

Standard Operating Procedures

Tumornekrosefaktor

World Health Organisation (= Weltgesundheitsorganisation)

World Wide Web