Herpesviren II

Bettina KempkesHelmholtz Zentrum München (HMGU)

23.5. 2011

Herpesviren: Strukturmerkmale

4. Hüllmembranmit Gykoproteinkomplexen (12-14 Proteine)

1. lineares GenomDNA Doppelstrang

und Coreproteine

3.Tegument (HSV: 23 virale/49 zelluläre Proteine)

2. Kapsid(HSV: 8 virale Kapsid

und Kapsid-assoziierte Pr.)

Herpesviridae:

Gemeinsamkeiten

Biologische Merkmale1. virale Enzyme : DNA Metabolismus (Thymidinekinase; Thymidylatesynthase;

Ribonukleotidkinase)DNA Synthese (DNA Polymerase, HelikaseProzessierung von Proteinen)

2. Subzelluläre KompartimentierungKern: Virale DNA Replikation und Kapsid AssemblierungZytoplasma/ER: Morphogenese des Virion

3. Virusproduktion führt zum Tod der Zelle

4. Lebenslange Latenz Zirkuläres Genom Reaktivierung im natürlichen Wirt("Das Virus verbleibt (persistiert) im Wirt. Es gibt jedoch Phasen oder infizierte Zellpopulation,in denen das Virus nicht mehr nachgewiesen werden kann.")

8 humanpathogene Herpesviren

Herpes-Simplex Virus (HSV) 1+2 (HHV 1/2)

Varizella-Zoster Virus (VZV) (HHV 3)

Humanes Herpesvirus 6 A/B (HHV 6)

Epstein-Barr Virus (EBV) (HHV 4)

Cytomegalovirus (CMV) (HHV 5)

Humanes Herpesvirus 7 (HHV 7)

Kaposi Sarkom assoziiertes Herpesvirus (HHV 8)

Tierpathogene Herpesviren(Auswahl)

• Bovines Herpesvirus Typ1** (α) infektiöse Rhinotracheitis/genitaleManifestationen mit breiter Symptomatik

• Bovines Herpesvirus Typ2 (α) ulzerative Entzündung der Euter, Übertragung u.a. durch Fliegen

• Bovines Herpesvirus Typ3 (γ) bösartiges Katarrhalfieber• Equine Herpesvirus Typ 1 (α) Aborte• Porcine Herpesvirus *Typ1 (α) Pseudorabiesvirus*/ Aujeszkysche Krankheit

Übertragung auf Hunde/Katzen und Rinder möglich• Feline Herpesvirus (α) Katzenschnupfen• Kanine Herpesvirus (α) Welpensterben• Porcine Zytomegalovirus (β) Schäden des ZNS, hohe Mortalität• Murine Zytomegalovirus (β) Wichtiges CMV Modell• Galline Herpesvirus **(Typ1) (α) infektiöse Laryngotracheitis mit hoher Morbidität und

Mortalitätund hohen wirtschaftlichen Verlusten(Hühner/Enten/Schwäne)

• Galline Herpesvirus (Typ2) (α) Mareksche Krankheit mit hoher Morbidität und Mortalitätund hohen wirtschaftlichen VerlustenInfektion und Transformation von T-LymphozytenVirusintegration

* DIVA Impfstoffe(differentiating between infection and vaccination)** attenuierten Lebendimpfstoff

DNA Replikation im Zellkern(Latenz oder Lytische Replikation)

DE

RE

E

TGN

TGNLATENZ oder LYTISCHE REPLIKATION ?Das virale Genom zirkularisiert.

LATENZ: virus- und gewebespezifische eingeschränkte Genexpression

LYTISCHE REPLIKATION:Kaskade der viralen Genexpression immediate early: Transaktivatoren(delayed) early: Enzyme für virale DNA Synthese

Lytische Replikationlate: Strukturproteine (Kapsid-, Tegument und Hüllproteine)

Prozessierung und Verpackung der linearen viralen Genome in Kapside.

HerpesvirenAntivirale Therapie

• Chemotherapie• (Zytokinbehandlung)• Adoptive Immuntherapie

Latente oder lytische DNA Replikation

TR

oriPTR

oriLyt

TR

oriLyt

oriP

TR

oriP

TR

oriP

TR

oriP

TRTR

TR

oriLyt

Latente Replikation(zell. DNA Polymerase)

Lytische Replikationvirale DNA Polymeraseund virale Kofaktoren

Azyklische Nukleosidanaloga(Azyklische Zucker)

Analogon virale Thymidinkinase** zelluläre KinaseAcycloguanosin Guanosin +Famiciclovir (Pro-Drug)* Guanosin +Ganciclovir Guanosin virale zelluläre KinaseBirivudin Uracil +Cidovir Monophosphat Cytosin +

* verbesserte Bioverfügbarkeit

Molekulare Virologie 3. Auflage Modrow et al. Principles of Virology 3. Auflage Flint et al.

** Entwicklungvon Resistenzen

Reduktion oder Verlust derThymidinkinase

oder

Verlust derSubstratspezifität fürAzyklischeNukleosidanaloga

Chemotherapie

• Nucleosidanaloga

Beispiel:Acycloguanosin

ACG

Gertrude ElionNobelpreis 1988

Forscarnet

Nicht-nucleosidische HemmstoffePyrophosphatanalog: Foscarnet

Phosphoameisensäure

Molekulare Virologie 3. Auflage Modrow et al.

bindet an die Pyrophosphatbindestelle der viralen DNA Polymerase

Resistenzen: Aminosäureaustausche in der viralen DNA Polymerase

NucleosidanalogonTrifluridin

Trifluormethylthymidin: Substrat der viralen DNA PolymeraseStörungen der helicalen DNA Struktur nach Einbau Direkte Blockade der Polymerisation(Kinase ?)

Fomivirsen:Antisense-Oligonucleotid zur spezifischen Blockade derExpression von "immediate early genes" des CMV

phosphorothioate 5'-GCGTTTGCTCTTCTTCTTGCG-3'

ANTIMICROBIAL AGENTS AND CHEMOTHERAPY, Sept. 1996, p. 2004–2011 Vol. 40, No. 9Inhibition of Human Cytomegalovirus Immediate-Early GeneExpression by an Antisense OligonucleotideComplementaryto Immediate-Early RNAKEVIN P. et al.

CMV retinitis: intraocular injection in a concentration of 6.6 mg/mL

HSV-1 Latenz

Epithelzelle:

Replikation

Nervenzelle:Latenz (LAT RNA Expression)Reaktivierung

Latenz: Virale Proteine werden nicht exprimiert. Epigenetische Modifikationen des Genoms verhindern die Expression lytischer Geneund entziehen die infizierten Zellen der Immunkontrolle durch Virus-spezifische B- und T-Zellen.

Virale Mimikry und virale Piraterie

• Mimikry (Funktionelle Konvergenz/Analoge)– CD40/LMP1– B-Zellrezeptor/ LMP2A– Notch-Signaltransduktion/EBNA-2

• Piraterie (Homologe) – "primordial genes or domains" ( evolutionär alt z. Bsp

aus Bakteriophagen)– Wirtsgene oder Domänen aus Wirtsgenen (häufig

fehlen Introns/ retrovirale Übertragung?) (Beispiele: virale IRFs aus KSHV

virales Interleukin 10)

Immune Evasion der Herpesviren"Immunsystem-Umgehungsstrategien"

• Angeborenes Immunsystem- Effektorzellen (Makrophagen, Monozyten, Dendriten, Granulozyten, Natürliche Killerzellen)

- Zellautonome SytemeInterferone (α,β) und Zytokine

• Adaptive Immunsystem- Humorale Immunantwort

B-Zellen- Zellvermittelte Immunantwort

AntigenpräsentationT-Zellen(γ-Interferone)

Angriffsmöglichkeiten:

Lymphozyten

B-Zelle T-Helferzelle - MHC I T-Killerzelle – MHC II

Humorale Immunantwort Zellvermittelte (restringierte) Immunantwort

EBV infiziert und immortalisiert primäre B-Zellen in vitroProliferative Latenz (Latenz III)

EBV

EBNA-1

ABC

EBNA-3

LMP-2A/B

C pLMP-2A p

LMP-2B p

EBNA-LP

LMP-1

EBV Nuclear AntigenLatent Membrane Protein

C BF1 (C-promoter binding) S u(H) (Suppressor of hairless)L ag-1 (C.elegans)

RBP-Jk/RBP-J/Jk/RBP(recombination signal binding protein kappa)

CSL/CBF1

EBNA-2

EBNA-3A/B/C EBNA-2

Die B-Zelle: Aktivierung und Differenzierung

Germinal center reaction

Activation of naive B cellsby antigen

Memory B cellPlasma cell

EBV:Latente Transkriptionsprogramme

"Latency in vivo"

Latent reservoir in vivo: memory B cells Lytic reactivation in plasma cells

Type 0

Type IEBNA-1

Type II:EBNA-1LMP-1, LMP2A/B

Type III:EBNA-1EBNA-2,-3A,-3B,-3C,LPLMP-1,LMP2A/B

Type I:Burkitt's lymphoma

Type III:Post-Transplant-LmphomaAIDS ass. B cell LymphomaInfectious Mononucleosis

Type II:Hodgkin's disease

EBV associateddiseasesof B cell origin

Beta-trefoil (BTD)

RHR-C

RHR-N

ßC4

CSL structure: Kovall et al., 2004

The CSL protein CBF1

CBF1

Corepressor

ubiqitously expressed

highly conserved in evolution

tissue differentiation and development

sequence specific DNA binding factor

recruits co-repressor activity

C/GTGGGAA

C/GTGGGAA

Coactivator

CBF1EBNA-2

C/GTGGGAA C/GTGGGAA

Coactivator

CBF1NotchNotch Corepressor

CBF1

?

Herpesviralprotein

CBF1

?

??

?

C/GTGGGAA

Corepressor

CBF1EBNA-3A/C

The Notchpathway: CSL/CBF1 signalling

in cells infected with γ-herpesviruses

Notch/CBF1 signalling

Herpesviral CBF1 signalling

C/GTGGGAA

CBF1vIRF/RTA/LANA

MAM-L1

EBV:

KSHV:

Das virale Protein LMP2A aus EBV und der B-Zellrezeptor Komplexrekrutieren die Kinasen Lyn und Syk über ITAM Motive

Ligand-vermittelte AktivierungAbberante Konstitutive Aktivierung

Thorley-Lawson 2001

Kanonischer und alternativer NFkB Signalweg werden in Tumoren häufig dereguliert

Jost und Ruland 2007

p65 p50RelB p52

LMP1

NH2AS187AS 24

AS1

AS 193 Plasmamembran

Zytoplasma

Kern

verändert aus Cornelia Hömig (Dissertation)

ATF2 Elk-1

FOS Jun

AP-1 aktivierte Gene

Kanonischer NFkB Signalweg Alternativer NFkB Signalweg

Das virale Protein LMP1 des EBV und der Ligand-aktivierte CD40 Rezeptoraktivieren ähnliche Signalwege und in der Folge kommt es

auch zur Aktivierung der Transkription ähnlicher Zielgene im Kern

verschiedene Adaptorenaus der TRAF Familie

Ligand-vermittelte Aktivierung Abberante Konstitutive Aktivierung

MAP- Kinase Signalweg

CD40

Adoptive Immuntherapie:Zellbasierte Krebstherapie am Beispiel EBV assoziierter Erkrankungen

(Post-Transplantlymphome, Morbus Hodgkin)

Expansion EBV infizierter B-Zellen in vitro

Ko-Kultur mit T-Zellen

Expansion EBV spezifischer T-Zellen

B-Zelle+ EBVex vivo:

Peripheres Blut

Vor der Transplantation: Patient oder Knochenmarksspender (EBV pos.)

Nach der Transplantation:

T-Zelle

***

* *

Das latente KSHV GenomLatente Gene: LANA1, v-Cyclin, v-FLIP, Kaposin, miRNAs (vIRF3)

virale Piraterie lytischer und latenter Gene

Zelluläre Heterogenität des Kaposi Sarkoms (Spindelzellen und zelluläres Infiltrat)

Hämatoxylin und Eosin

Reaktive Entzündung oder neoplastische Veränderung

Lytischer oder abortiv lytischerLebenszyklus

LatenterLebenszyklus

LANA

Parakrine Stimulationder latent infizierten NachbarzelleAngiogeneseEntzündungsmediatoren

Inhibition von p53 abh. ApoptoseZellzyklusregulation

Die SpindelzellevGPCR K1 K15

KSHV Proteine

vCyclin

vCyclinLANA

vIL-6

Cyclin abhängige Kinasen (CDKs) werden von Cyclinen aktiviert und von spezifischen Inhibitoren (CKIs) kontrolliert.

Das Retinoblastoma Protein (Rb) inhibiert die Aktivierung von E2F-regulierten Genen im hypo-phosporyliertem Zustand.Die Rb Phosphorylierung führt zur Auflösung des Rb/E2-F Komplexes.Der Transkriptionsfaktor E2-F aktiviert die Transkription.

E2-F

Rb

Gene desS-Phasen-

eintritt

E2-F

cyclincdk

P P

Rb

AUS AN.

v-cyclin wird in latent mit KSHV infizierten Zellen exprimiert.

Boshoff und Weiss, 2002

p15p16p18p19

CKIs der INK Genfamilie

Coscoy 2007

KSHV Proteine

Interferon Regulatory Factor (IRF)

A) Induktion der Immunantwort B) Interferon Wirkung(Expression antiviraler Proteine)

Plasmamembran

Kern

KSHV Blockade der

Anti-apoptotische Proteinedes KSHV:

vBCL-2 blockiert BAX/BAC vermittelten Cytochrom C AusstromvFLIP aktiviert NF-kB SignaltransduktionvIAP blockiert die Aktivierung der Effektor-Kaspasen

P. Krammer et al., 2007

Immune Evasion CMVAntigenprozessierung und Antigenpräsentation im Komplex mit MHC Klasse I Proteinen

a) US6 blockiert TAP-vermittelten Transport von Peptiden ins ER (Early und Late)b) US3: MHC Klasse I Moleküle werden im ER zurückgehalten (Immediate Early)c) US11: US2: Rücktransport von MHC Klasse I und Degradation im Zytoplasma

(Early)

Transporters Associatedwith Antigen Processing(TAP)

hCMV

Reddehase (2002)

Proteasom

ER

MHC Klasse I Peptid-beladen

T-Killerzelle

Virus-infizierteZielzelle

T-Zellrezeptor CD8

MHC Klasse I

Zelllyse

MCMV: Antigenprozessierung und Antigenpräsentation durch MHC Klasse I Moleküle

a) m04 (E/L) eskortiert nicht funktionelle/modifizierte MHC Klasse I Molekülean die Plasmamembran

b) m06 (E): lysosomale Degradation von MHC Klasse I und Antigen c) m152 (E): Retention von Antigen beladenen MHC Klasse I Molekülen im ER

mCMV

T-Killerzelle

Virus-infizierteZielzelle

T-Zellrezeptor CD8

MHC Klasse I

Zelllyse

NatürlicheKillerzelle

Virus-infizierteZielzelle

KillerInhibitorischerRezeptor (KIR)

MHC Klasse I

Blockade der ZelllyseReddehase (2002)

ER

GOLGI

Proteasom

Herpesvirus Saimiri (HVS)

• γ2-Herpesvirus, apathogen im natürlichen Wirt, Übertragung durchSpeichel, lebenslange Persistenz

• HVS kann aus dem peripheren Blut infizierter Tiere durch Kokulturgewonnen werden

• Akute T-Zelllymphome in anderen Affenspezies (Tamarin, Krallenaffen)

• Langzeitproliferation humaner T Zellen

Saimiri sciureus

Herpesvirus Saimiri (HVS)

Saimiri sciureus

Transformations-assoziierte Membranproteine des HVS regulierenNF-kB, MAPK, STAT, Lck Signalwege

Murine γ-Herpesvirus 68 (MHV68)ein Tiermodell für γ-Herpesviren (EBV und KSHV)

• natürlicher Wirt: Waldmaus und Rötelmaus

• Übertragung: Experimentell durchTröpfcheninfektion (intranasal) in Labormausstämmen

• Infektiöse Mononukleose und Splenomegalie• Lebenslange Latenz in B-Zellen

• Anerkanntes Modell für Etablierung von Latenzaber als Tumormodell umstritten

Zeit nach Infektion

Zeit nach Infektion

Zeit nach Infektion

Viru

s-Ti

ter

CD

8+T-

Zelle

nSp

leno

meg

alie

,A

ntik

örpe

r

Lytisches Virus

Latentes Virus

CD8+

Vβ4+CD8+

Splenomegalie

PolyklonaleAntikörper

VirusspezifischeAntikörper

A

B

C

Zeitverlauf der MHV 68 Infektion und der Virus-spezifischen Immunantwort

Herpesviren Vorlesung

• Principles in Virology Hrsg. Flint, Enquist, Racaniello, Skalka (2009)• Medizinische Virologie Hrsg. Doer, Gerlich (2010)• Molekulare Virologie Hrsg. Modrow, Falke,Truyen,Schätzl 3. Auflage (2010)• Fields Virology Hrsg. Knipe, Howley Band 2 (2007)

• Zahlreiche Folien aus: Virologie Vorlesung LMU (Medizinische Fakultät)

Bettina KempkesHämotologikumHelmholtz Zentrum MünchenMarchioninistr. 2581377 München (Großhadern)

Kempkes@helmholtz-muenchen.de