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Title JUSTUS-LIEBIG

UNIVERSITY GIESSEN

MEDICAL FACULTY

HLA – System, klinische Bedeutung

Gregor Bein Zentrum für Transfusionsmedizin und Hämotherapie

Universitätsklinikum Gießen und Marburg GmbH

Institut für Klinische Immunologie und Transfusionsmedizin Justus-Liebig-Universität Gießen

HLA-System - Klinische Bedeutung

1. Biologische Funktion der HLA-Moleküle 2. Nachweis von HLA-Antikörpern und Antigenen 3. Klinische Bedeutung in der Organtransplantation 4. Klinische Bedeutung in der allogenen

Stammzelltransplantation

(Krankheitsassoziationen)

HLA-System und klinische Bedeutung

1. Biologische Funktion der HLA-Moleküle 2. Nachweis von HLA-Antikörpern und Antigenen 3. Klinische Bedeutung in der Organtransplantation 4. Klinische Bedeutung in der allogenen

Stammzelltransplantation

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Antigen + APC T +

Aktivierung, Proliferation

Anergie, Suppression

Ignoranz

Adaptive Immunantworten

Struktur HLA-Klasse I Molekül

Struktur HLA-Klasse II Molekül

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Peptid-Präsentation durch HLA-Moleküle

HLA – Moleküle präsentieren Peptidantigene

Antigen-Prozessierung und Präsentation MHC-Klasse II: Exogene Peptide

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Antigen-Prozessierung und Präsentation MHC-Klasse I: Endogene Peptide

Erkennung von Peptidantigenen durch den T-Zell-Rezeptor

Peptide binden über Anker-Aminosäuren an HLA-Moleküle

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Peptide binden über Anker-Aminosäuren an HLA-Moleküle

HLA – Moleküle: polymorphe AS-Positionen

Zusammenfassung: Antigenpräsentation

  HLA-Klasse II – Moleküle –  Exogene Peptide: Aufnahme von Antigenen zur

Initiierung einer adaptiven Immunantwort –  Expression auf Antigen-präsentierenden Zellen –  Präsentation an CD4+ T-Zellen (T Helfer Zellen)

  HLA-Klasse I – Moleküle –  Endogene Peptide: Anzeige intrazellulärer Infektion –  Expression auf fast allen kernhaltigen Zellen

(nicht auf Erythrozyten) –  Präsentation an CD8+ T-Zellen (zytotoxische T Zellen)

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Shiina T Tissue Antigens 64:631 (2004)

Polymorphismus und Polygenie tragen zur Diversität der HLA-Moleküle eines Individuums bei

Haplotyp

HLA-Allele: Kodominante Expression

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HLA- A * 24: 02: 01: 02 L

Genort Breite Spezifität

(„Antigen“) Exonvariante

(stumm) Suffix*

Molekularbiologische Typisierung

Allel (Proteinvariante)

Intronvariante (stumm)

*Suffix: N Null allele L Low expression S Secreted, not on cell surface Q Questionable expression

- Doppelpunkt als Trennzeichen -  Führende Nullen -  Bis zu drei Stellen (e.g. A*02:101) - „w“ wir vom HLA-C-Genort entfernt: e.g. C*01:03

HLA-Nomenklatur 2010 (hla.alleles.org)

HLA alleles that encode for identical peptide binding domains (P groups) (exon 2 and 3 for HLA class I and exon 2 for HLA class II A*01:01P A*01:01:01:01/A*01:01:02/A*01:01:03/A*01:01:04/A*01:01:05/

A*01:01:06/A*01:01:07/A*01:01:08/A*01:01:09/A*01:01:10/A*01:01:11/A*01:01:12/A*01:01:13/A*01:01:14/A*01:32/A*01:37/A*01:45

HLA-Nomenklatur: P - Gruppen

HLA alleles that share identical nucleotide sequences for the exons encoding the peptide binding domains (G groups) (exon 2 and 3 for HLA class I and exon 2 for HLA class II

A*01:01:01G 01:01:01:01/01:01:01:02N/01:04N/01:22N/01:32/01:34N/01:37/01:45

HLA-Nomenklatur: G - Gruppen

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Bekannte Allele an den Genorten HLA-A, B, C, DRB1

Antigenic variants e.g. HLA-A2 (2 digit resolution)

Allelic variants* e.g. HLA-A*0201 (Proteins)

HLA-A 28 1176

HLA-B 60 1641

HLA-C 10 808

HLA-DRB1 21 774

* www.ebi.ac.uk/imgt/hla/ Release 3.4.0, 08 April 2011

Aber, - die Zahl der häufigen Allele (f > 1%) in einer gegebenen Population ist deutlich niedriger - Allele sind nicht zufällig miteinander kombiniert: konservierte Haplotypen e.g. HLA-A1, B8, DR3

HLA-System und klinische Bedeutung

1. Biologische Funktion der HLA-Moleküle 2. Nachweis von HLA-Antikörpern und Antigenen 3. Klinische Bedeutung in der Organtransplantation 4. Klinische Bedeutung in der allogenen

Stammzelltransplantation

Serologischer Nachweis von HLA-Antigenen und Antikörpern   Mikro-Zytotoxizitätstest nach Terasaki

(Lymphozytotoxizitäts-Test, LCT-Test) –  Isolierung von Lymphozyten

(Dichtegradientenzentrifugation, Beads) –  Inkubation mit Antiseren (n ≥ 120 für Klasse I) –  Inkubation mit Kaninchen-Komplement –  Anfärbung der lysierten Zellen und Fixierung

  ELISA   Luminex

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HLA-Typisierung: Isolierung von PBMC durch Dichtegradienten-Zentrifugation

HLA-Typisierung: Mikrozytotoxizitätstest (Terasaki)

HLA-Typisierung: Mikrozytotoxizitätstest (Terasaki)

Negatives Testergebnis intakte Zellen

Positives Testergebnis lysierte Zellen

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No association of kidney graft loss with human leukocyte antigen antibodies detected exclusively by sensitive luminex single-antigen testing: a collaborative transplant study report.

Süsal C et al., Transplantation (2011)

HLA-Typisierung Molekulargenetische Typisierung von HLA-Allelen

  Molekulargenetische Verfahren

–  PCR-SSO (Sequence Specific Oligonucleotides)

–  PCR-SSP (Sequence Specific Primers)

–  Sequenzierung (Sequencing Based Typing, SBT)

HLA-Polymorphismus

HLA-X*01 ... ACGTGGTCATAATGCTTCCAGACA ... HLA-X*02 ... ----C------------------- ... HLA-X*03 ... -------A---------------- ... HLA-X*04 ... -----------------TT----- ... HLA-X*05 ... ----C--A---------------- ... HLA-X*06 ... ----C------------TT----- ... HLA-X*07 ... -------A---------TT----- ... HLA-X*08 ... ----C--A---------TT----- ... HLA-X*09 ... ------------------T----- ... - Hypervariable Regionen (HVR) - Public epitopes (fast keine allelspezifischen SNPs) - Genduplikation und –konversion (Gen?) - Polymorphismus in cis oder trans (Chromosom?)

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Molekulargenetische HLA-Typisierung: Polymorphismus in cis oder trans?

HLA-X*01 ... ----A------.------T------ ... HLA-X*02 ... ----C------.------T------ ... HLA-X*03 ... ----A------.------G------ ... HLA-X*04 ... ----C------.------G------ ... Patient C.T. HLA-X*01 ... ----A------.------T------ ... HLA-X*04 ... ----C------.------G------ ... Patient T.C. HLA-X*02 ... ----C------.------T------ ... HLA-X*03 ... ----A------.------G------ ...

SSO, SBT

Molekulargenetische HLA-Typisierung: Polymorphismus in cis oder trans?

  Wie lösen wir das cis/trans – Problem? –  Familienuntersuchung (Segregation der Haplotypen) –  Klonierung von PCR – Produkten –  Klonierung von Chromosomen (Hybridoma-Technologie) –  Trennung der Allele durch allelspezifische Sonden und

immunomagnetische Beads –  Sequence Specific Priming (PCR-SSP)*

* Bein 1992, Olerup 1992

HLA-Typisierung: PCR – SSP, Prinzip I

Extension <--ATCACGTTGGACCGTAAGT-5´ ||||||||||||||||||| ===CAGTGCAACCTGGCATTCA===========TAGTGCAACCTGGCATTCA=== ===GTCACGTTGGACCGTAAGT===========ATCACGTTGGACCGTAAGT=== ||||||||||||||||||| 5´-CAGTGCAACCTGGCATTCA--> Extension

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HLA-Typisierung: PCR – SSP, Prinzip I

Extension <--ATCACGTTGGACCGTAAGT-5´ ||||||||||||||||||| ===CAGTGCAACCTGGCATTCC===========TAGTGCAACCTGGCATTCA=== ===GTCACGTTGGACCGTAAGG===========ATCACGTTGGACCGTAAGT=== ||||||||||||||||||X 5´-CAGTGCAACCTGGCATTCA--> STOP

Molekulargenetische HLA-Typisierung: Polymorphismus in cis oder trans?

Patient C.T. HLA-X*01 ... ----A------.------T------ ... HLA-X*04 ... ----C------.------G------ ... Patient T.C. HLA-X*02 ... ----C------.------T------ ... HLA-X*03 ... ----A------.------G------ ...

Sequence-Specific Priming

PCR 1 +

PCR 4 +

PCR 2 - PCR 3 -

PCR 1 -

PCR 4 +

PCR 2 + PCR 3 +

HLA-Typisierung: PCR – SSP Agarose-Gelelektrophorese von PCR – Produkten

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HLA-Typisierung: PCR – SSP Ethidiumbromid gefärbtes Gel, UV – Licht (254 nm)

HLA-Typisierung: PCR – SSP direkte Sequenzierung

C C G A T A C T C

G A T A C T G A T A

T+

Kontrolle HLA-Gen X

T+ C+ C+

Homozygot T Heterozygot Homozygot C

HLA-System und klinische Bedeutung

1. Biologische Funktion der HLA-Moleküle 2. Nachweis von HLA-Antikörpern und Antigenen

(Gewebetypisierung) 3. Klinische Bedeutung in der Organtransplantation 4. Klinische Bedeutung in der allogenen

Stammzelltransplantation

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Erkennung von Peptidantigenen durch den T-Zell-Rezeptor

Direkte Aktivierung von T-Zellen durch allogene Antigen-präsentierende Zellen

Hyperakute Abstoßung

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Akute Abstoßung

Chronische Abstoßung

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HLA-System und Organtransplantation

Das wichtigste Transplantationsantigen?

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Aufgaben der klinischen Immunologie in der Organtransplantation

  Empfänger: –  ABO-Blutgruppe (2x) –  Erythrozytäre Antikörper (passenger lymphocyte syndrome) –  HLA-Typisierung (HLA-A, B, DRB1) –  HLA-Antikörpersuche- und Identifizierung (alle 3 Monate)

Achtung! Antikörper lebenslang berücksichtigen –  Infektionsstatus –  Cross match vor Transplantation

  Spender: –  ABO-Blutgruppe (2x) –  Erythrozytäre Antikörper (passenger lymphocyte syndrome) –  HLA-Typisierung (HLA-A, B, DRB1) –  Infektionsstatus

HLA-System und klinische Bedeutung

1. Biologische Funktion der HLA-Moleküle 2. Nachweis von HLA-Antikörpern und Antigenen

(Gewebetypisierung) 3. Klinische Bedeutung in der

Thrombozytentransfusion 4. Klinische Bedeutung in der allogenen

Stammzelltransplantation

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Allogene Stammzelltransplantation

Transplantatabstoßung Graft-versus-host-disease (GVHD) Graft-versus-leukemia effect (GVL)

Rezidivrate nach syngener und allogener Transplantation hämatopoetischer Stammzellen

Appelbaum FR, Nature (2001)

  Probleme klinischer Studien –  Fallzahlen gering –  Verschiedene Krankheitsbilder mit unterschiedlichen

immunologischen Komplikationen –  Infolge des hohen Kopplungsungleichgewichts in der

HLA-Region ist die isolierte Untersuchung eines Genortes kaum möglich. Bsp.: DRB1, DQB1

–  Ein „Allel-mismatch“ kann in verschiedenen Populationen völlig unterschiedliche Bedeutung haben

Klinische Bedeutung der HLA-Kompatibilität in der allogenen Stammzelltransplantation

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A*0201-0205 Kaukasier

A*0201-0206 Japaner

www.HistoCheck.de

Allel-mismatch in verschiedenen Populationen

High-resolution donor-recipient HLA matching contributes to the success of unrelated donor marrow transplantation

Lee SJ et al., Blood 110:4576 (2007)

Single allele or antigen mismatches at HLA-A, -B, -C, and -DRB1

Lee SJ et al., Blood 110:4576 (2007)

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Survival of patients with early disease depending on degree of HLA matching (8/8, 7/8, and 6/8) for HLA-A, -B, -C, and -DRB1

Lee SJ et al., Blood 110:4576 (2007)

Mortalität in Abhängigkeit eines einzelnen HLA-mismatch (adjustiert für Alter und ethnische Herkunft, n = 4796)

Petersdorf EW et al., Tissue Antigens 69 suppl 1:25 (2007)

National Marrow Donor Program HLA Matching Guidelines for Unrelated Adult Donor Hematopoietic Cell Transplants

Bray RA et al., Biol Blood Marrow Transplant 14(9 Suppl):45 (2008)

Genort Suchstrategie Matching Auflösung A ja empfohlen hoch

B ja empfohlen hoch

C ja empfohlen hoch

DRA nein nein

DBR1 ja empfohlen hoch

DRB3, DRB4, DRB5 ja nicht bekannt

DQA1 nein nein

DQB1 ja unklar

DPA1 nein nein

DPB1 nein unklar

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Suche nach HLA-identischen Fremdspendern

Zentrales Knochenmarkspender Register Deutschlands, www.zkrd.de

Wenn kein passender Spender gefunden wird?

  HLA-A, -B, -C and -DRB1 sind gleich zu werten

  Ein Allel-mismatch ist besser als ein Antigen-mismatch

  Die Allel-mismatches sollten minimiert werden