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Aus der Medizinischen Klinik und Poliklinik I der Universität Würzburg Direktor: Prof. Dr. med. G. Ertl Hämodynamische Auswirkungen synthetischer, pflanzlicher und endogener Cannabinoide im Modell der isolierten Kaninchenlunge Inaugural-Dissertation zur Erlangung der Doktorwürde der Medizinischen Fakultät der Bayerischen Julius-Maximilians-Universität Würzburg vorgelegt von Jürgen Wolf aus Obersulm Würzburg, Oktober 2005

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Aus der Medizinischen Klinik und Poliklinik I

der Universität Würzburg

Direktor: Prof. Dr. med. G. Ertl

Hämodynamische Auswirkungen synthetischer, pflanzlicher und endogener Cannabinoide im Modell

der isolierten Kaninchenlunge

Inaugural-Dissertation

zur Erlangung der Doktorwürde der Medizinischen Fakultät der

Bayerischen Julius-Maximilians-Universität Würzburg

vorgelegt von

Jürgen Wolf

aus Obersulm

Würzburg, Oktober 2005

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Referent: Priv.-Doz. Dr. J. Wagner

Koreferent: Prof. Dr. O. Elert

Dekan: Prof. Dr. G. Ertl

Tag der mündlichen Prüfung: 29. November 2005

Der Promovend ist Arzt

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Inhaltsverzeichnis

1 Einleitung .......................................................................................................................... 1 1.1 Die Entdeckung eines Endocannabinoidsystems............................................................... 1 1.2 Kardiovaskuläre Wirkungen von Cannabinoiden............................................................ 4 1.3 Pulmonale Wirkungen von Cannabinoiden ...................................................................... 8 1.4 Zielsetzung der Arbeit ......................................................................................................... 9

2 Material und Methoden................................................................................................... 11 2.1 Modell der isolierten, perfundierten und ventilierten Kaninchenlunge ....................... 11

2.1.1 Versuchsaufbau ............................................................................................................................. 11 2.1.2 Versuchsvorbereitung.................................................................................................................... 14 2.1.3 Präparation .................................................................................................................................... 14 2.1.4 Kalibrier- und Aufwärmphase....................................................................................................... 17 2.1.5 Steady-State-Phase........................................................................................................................ 17

2.2 Messgrößen und Messtechnik........................................................................................... 17 2.2.1 Messung der pulmonalarteriellen und pulmonalvenösen Perfusionsdrücke (PAP,LAP) .............. 18 2.2.2 Bestimmung des pulmonalkapillären Druckes (PCP) ................................................................... 18 2.2.3 Bestimmung der Gefäßwiderstände (Ra, Rv) ................................................................................. 18 2.2.4 Bestimmung des kapillären Filtrationskoeffizienten (Kf,c)............................................................ 19 2.2.5 Bestimmung der Compliance ........................................................................................................ 22 2.2.6 Bestimmung der Retention (∆W).................................................................................................. 22

2.3 Versuchsdurchführung...................................................................................................... 22 2.3.1 Versuchsablauf und Stimulation ................................................................................................... 22

2.4 Biochemische Analytik ...................................................................................................... 23 2.4.1 Bestimmung der Konzentrationen von Anandamid und 2-AG mittels Flüssigkeits-

chromatographie / Massenspektrometrie (LC/MS) ....................................................................... 23 2.5 Substanzen .......................................................................................................................... 24 2.6 Statistische Auswertung .................................................................................................... 25

3 Ergebnisse........................................................................................................................ 26 3.1 Pulmonalarterieller Druck................................................................................................ 26 3.2 Pulmonalkapillärer Druck und Verteilung der pulmonalen Gefäßwiderstände ......... 31 3.3 Gefäßpermeabilität und Compliance ............................................................................... 35 3.4 Endocannabinoidgehalt der Lunge .................................................................................. 35

4 Diskussion........................................................................................................................ 36

5 Zusammenfassung........................................................................................................... 42

6 Literatur ........................................................................................................................... 43

7 Publikationen und Vorträge zur vorliegenden Promotion ............................................ 54

Danksagung............................................................................................................................. 55

Lebenslauf ............................................................................................................................... 57

I

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1. Einleitung

1 Einleitung Die Marihuana-Pflanze, Cannabis sativa, ist der Menschheit seit Jahrtausenden als

Arzneipflanze bekannt. Bereits in der Arabischen Medizin des Mittelalters sind viele

ihrer heute bekannten therapeutischen Indikationen sowie ihr Missbrauch als Droge

beschrieben [1,2].

1.1 Die Entdeckung eines Endocannabinoidsystems

Die Entdeckung der Strukturformel des ∆ 9-Tetrahydrocannabinol (∆ 9-THC), dem

psychoaktiven Hauptwirkstoff der Marihuana-Pflanze, im Jahre 1964 [3] ermöglichte

erstmals eine differenzierte Erforschung der Wirkung von Cannabis.

Abbildung 1: Chemische Struktur von ∆ 9-THC, Abbildung aus [4]

Zwei Jahre nachdem experimentelle Hinweise die Existenz eines Cannabinoid-

rezeptors vermuten ließen [5], gelang es im Jahr 1990 den CB1-Rezeptor zu

identifizieren. 1993 folgte die Entdeckung des CB2-Rezepors [6].

Während der CB2-Rezeptor fast ausschließlich von immunkompetenten Zellen

gebildet wird [6], findet sich der CB1-Rezeptor vor allem im Gehirn [7] und in

zahlreichen peripheren Geweben [8].

1992 wurde man bei der Suche nach einem körpereigenen Liganden des

Cannabinoidrezeptors fündig. Aus Schweinehirnen gelang damals die Isolierung des

Arachidonsäurederivats Arachidonylethanolamid (Anandamid) [9]. Dabei handelt es

sich, wie aufgrund der Fettlöslichkeit pflanzlicher Cannabinoide bereits vermutet

wurde, um ein Lipid.

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1. Einleitung

Abbildung 2: Chemische Struktur von Arachidonylethanolamid (Anandamid), Abbildung aus [4]

Wenig später wurde ein zweites Endocannabinoid, das 2-Arachidonylglycerol (2-AG)

entdeckt [10]. Anandamid und 2-AG sind die beiden bekanntesten und biologisch

relevantesten Endocannabinoide.

Abbildung 3: Chemische Struktur von 2-Arachidonylglycerol (2-AG), Abbildung aus [4]

Die Einführung von Cannabinoidrezeptor-Knockout-Mäusen [11,12], die Synthese

von spezifischen Cannabinoidrezeptoragonisten und –antagonisten [13] sowie

Inhibitoren des Endocannabinoidabbaus [14], hat in den letzten Jahren geholfen,

Wissen über die physiologische und pathophysiologische Bedeutung der Endo-

cannabinoide zu gewinnen.

Man weiß heute, dass endogene Cannabinoide – neben ihrer kardiovaskulären

Funktion, auf die noch im Detail eingegangen werden soll – Funktionen in unserem

Nervensystem haben, wo sie zum Beispiel Schmerz und Spastik beeinflussen

können [4]. Außerdem interagieren sie mit unserem Immunsystem, haben Einfluss

auf grundlegende Zellfunktionen wie zum Beispiel Zellproliferation [15] und

Embryonalentwicklung [16] und beeinflussen die Appetitregulation [17]. Daher

überrascht es auch nicht, dass in verschiedensten Fachbereichen die therapeutische

Nutzung von Cannabinoiden in Erwägung gezogen wird. Seit 1998 kann in

Deutschland Dronabinol, das natürlich vorkommende (-)-trans-Isomer des ∆ 9-THC,

auf Betäubungsmittelrezept verschrieben werden. In Amerika ist Dronabinol unter

dem Markennamen Marinol® erhältlich und auf zwei Indikationen beschränkt:

Gewichtsverlust bei Aids-Patienten in Folge von Appetitlosigkeit sowie Übelkeit und

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1. Einleitung

Erbrechen infolge einer Chemotherapie bei Krebserkrankung. Das deutsche Gesetz

sieht eine derartige Beschränkung nicht vor.

Mit Rimonabant®, dem CB1-Rezeptorantagonisten SR141716A, befindet sich ein

weiteres Medikament in der klinischen Phase III Studie und soll noch im Verlauf des

Jahres 2005 auf den Markt kommen [18]. Indikationen für Rimonabant® sind die

Gewichtsreduktion bei Patienten mit metabolischem Syndrom [17] und die

Unterstützung der Abstinenz bei Rauchern [19].

Neben seiner aktivierenden Wirkung auf CB1- und CB2- Cannabinoidrezeptoren [20]

stimuliert Anandamid noch spezifische Anandamidrezeptoren [21,22] und VR1-

Vanilloidrezeptoren [23]. Außerdem gelang es in den letzten Jahren mit Noladinäther,

Virodhamine (O-Arachidonoylethanolamine) und N-archidonoyldopamine (NADA)

weitere endogene Cannabinoide zu identifizieren [24].

Anandamid entsteht aus einer membrangebundenen Vorläuferstufe, dem N-

Arachidonyl-Phosphatidyl-Ethanolamid, das der Phospholipase D als Substrat dient

und unter Abspaltung von phosphoriger Säure zu Anandamid abgebaut wird [25]. 2-

AG ist ein Arachidonsäureester und entsteht in einem ähnlichen Mechanismus wie

Anandamid aus anderen Fettsäurevorstufen [26].

N-Arachidonyl-Phosphatidyl-Ethanolamid

Arachidonylethanolamid (Anandamid)

Phosphorsäure

Abbildung 4: Synthese von Anandamid aus einer membrangebundenen Vorläuferstufe, modifiziert nach [25]

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1. Einleitung

Anandamid wird durch das Enzym Anandamid-Amidohydrolase, auch Fettsäuren-

Amidohydrolase (FAAH) genannt, zu Arachidonsäure und Ethanolamid hydrolysiert

[25,27]. 2-AG kann durch dieselbe Fettsäuren-Amidohydrolase (FAAH) wie

Anandamid zu Arachidonsäure und Glycerol hydrolysiert werden [28]. Wahrscheinlich

ist das Hauptenzym für den Abbau von 2-AG jedoch eine Monoacylglycerol-Lipase

(MGL), wie durch die Blockade des Enzyms mit einen spezifischen Inhibitor gezeigt

werden konnte [29,30]. Für Anandamid ist zusätzlich noch ein in Neuronen [31] und

Makrophagen [32,33] lokalisierter Transportmechanismus beschrieben, der

Anandamid durch selektive Aufnahme in die Zelle inaktivieren kann.

In den letzten Jahren wurde eine weitere Möglichkeit des Abbaus von Anandamid

und 2-AG entdeckt. Beide Endocannabinoide können der Cyclooxygenase-2 als

Substrat dienen [34,35]. Es entstehen dabei für Anandamid Prostacyclin- und

Prostaglandinethanolamide (Prostamide) und für 2-AG Prostacyclin- und

Prostaglandinglycerylester. Diese neuen Lipide sind eng verwandt mit den

bekannten, aus freier Arachidonsäure entstehenden Prostaglandinen und

Prostacyclinen. Im Falle von Anandamid sind die Hauptprodukte aus diesem

Abbauweg das unstabile PGH2–Ethanolamid, das nichtenzymatisch zu hauptsächlich

PGE2-Ethanolamid und in geringerem Ausmaß zu PGD2 -Ethanolamid isomerisiert

[36].

1.2 Kardiovaskuläre Wirkungen von Cannabinoiden

Cannabinoide zeigen vielfältige kardiovaskuläre Wirkungen. Eine sehr häufig

gesehene Reaktion auf Cannabinoide ist die Erweiterung von Gefäßen. Dies konnte

für viele Organsysteme mit verschiedensten experimentellen Ansätzen gezeigt

werden. Beim genaueren Betrachten verbirgt sich dahinter ein recht komplexes

System, mit unterschiedlichsten Wirkmechanismen, auf das im folgenden Abschnitt

kurz eingegangen werden soll.

Bereits in den 70er Jahren wurde die Wirkung der Kulturdroge ∆9-THC auf Blutdruck

und Herzfrequenz untersucht. Beim Menschen zeigt sich als akuter Effekt eine

Tachykardie ohne signifikante Veränderung des Blutdrucks [37]. Der Langzeitkonsum

beim Menschen hingegen, sowie die akute und chronische Verabreichung bei

Versuchstieren führt zu einem lang anhaltenden Blutdruckabfall und zu Bradykardie

[38].

Verabreicht man narkotisierten Ratten oder Mäusen Anandamid intravenös als Bolus,

so kann man eine reproduzierbare, triphasische Reaktion beobachten. Zunächst

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1. Einleitung

kommt es zu einer wenige Sekunden dauernden, durch den Vagusnerven

vermittelten Bradykardie, die sekundär einen Blutdruckabfall bewirkt. Darauf folgt ein

kurzdauernder Blutdruckanstieg, der aber weder sympathisch, noch durch CB1-

Rezeptor-Aktivierung vermittelt wird und dessen Ursache letztlich noch nicht geklärt

ist. Anschließend folgt eine 5-10 min andauernde Phase von Hypotonie und milder

Bradykardie, die durch den CB1-Rezeptor vermittelt wird und durch den CB1-

Rezeptorantagonist SR 141716A geblockt werden kann [39]. Die Hypotonie nach

intravenöser Gabe von Anandamid wird sowohl durch Blockade von α-Rezeptoren,

als auch durch Rückenmarksdurchtrennung (in Höhe HWK 2) und der damit

verbundenen Ausschaltung des Sympathikus verhindert [39]. Sie findet sich

hingegen kaum in nichtnarkotisierten, ungestörten Ratten, bei denen

bekanntermaßen der Sympathikotonus niedrig ist [40]. Anandamid scheint also einen

sympathikolytischen Effekt zu haben. Im Einklang dazu zeigen einzelne ältere

Arbeiten, dass ∆9-THC durch eine zentral vermittelte Hemmung des Sympathikus

den Blutdruck senken kann [41]. Inzwischen mehren sich die experimentellen

Hinweise, dass dieser sympathikusreduzierende Effekt von Anandamid nicht

zentralen Ursprungs, sondern peripher lokalisiert ist: durch die Aktivierung von

Cannabinoidrezeptoren auf präsynaptischen, postganglionären Nervenendigungen

wird die Ausschüttung von Noradrenalin gehemmt [8,42].

Eine Blutdruckerniedrigung kann durch Verminderung des Gefäßwiderstands oder

des Herzminutenvolumens, oder aus einer Kombination beider Mechanismen erreicht

werden. Eliminiert man den sympathischen Tonus durch einen Ganglien-Blocker und

hebt anschließend den Blutdruck durch Vasopressin über reine Vasokonstriktion,

bleibt die stark blutdrucksenkende Wirkung des potenten synthetischen

Cannabinoids HU-210 erhalten, obwohl die Bradykardie nun fehlt [43]. Man vermutet

daher, dass Cannabinoide durch Hemmung des kardialen Sympathikotonus die

Herzfrequenz senken können, sie ihre blutdrucksenkende Wirkung jedoch durch

direkte Gefäßerweiterung entfalten. Bestätigt wurde dies durch Versuche, in denen

chemisch der Sympathikus von Ratten zerstört wurde [44]. Auch zeigte sich, dass

das Ausmaß der Blutdrucksenkung – bereits nanomolare Gaben von HU-210 senken

den mittleren arteriellen Blutdruck in narkotisierten Ratten über Stunden hinweg um

mehr als 80 mm Hg – weit über die durch α-Rezeptorblockade oder Rückenmarks-

durchtrennung erreichbaren Werte hinausgeht [45]. Erstaunlicherweise überstehen

die Tiere diese massive Hypotonie unbeschadet, was an mögliche protektive

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1. Einleitung

Eigenschaften von Endocannabinoiden bei akutem Kreislaufversagen, das mit stark

erniedrigtem Blutdruck einhergeht, denken lässt.

Viele Untersuchungen zeigen, dass die Hypotonie nach Cannabinoidgabe durch

CB1-Rezeptoren vermittelt wird. Sie kann durch vorherige Gabe des CB1-

Antagonisten SR141716A verhindert werden [39,45]. Außerdem kann in CB1-

Rezeptor-Knockout-Mäusen durch Cannabinoidgabe keine Hypotonie ausgelöst

werden [46].

Der selektive CB1-Rezeptorantagonist SR141716A alleine verändert den Blutdruck

jedoch nicht. Dies legt nahe, dass unter physiologischen Ruhebedingungen

Cannabinoide wenig zum Gefäßtonus beitragen [47].

Völlig anders stellt sich die Situation im experimentellen Blutungsschock der Ratte

dar. Hier konnte gezeigt werden, dass der CB1-Rezeptorantagonist SR141716A

dosisabhängig und deutlich den Blutdruck erhöht. Im Blutungsschock kommt es

durch die Minderperfusion der Organe zur Endocannbinoidaktivierung. Makrophagen

synthetisieren vermehrt Anandamid, welches im Schock über periphere CB1-

Rezeptoren hypotensiv wirkt [47].

Ähnliches gilt für den Endotoxinschock, der durch Lipopolysaccharide,

– Zellbestandteile gramnegativer Bakterien – ausgelöst wird und ein folgenschweres

klinisches Problem mit hohen Mortalitätsraten um 50 % bei Patienten mit schwerer

Sepsis darstellt. Im experimentellen, durch Lipopolysaccharid-Infusion ausgelösten,

septischen Schock der Ratte synthetisieren Thrombozyten vermehrt das

Endocannabinoid 2-Arachidonylglycerol (2-AG) und Makrophagen Anandamid. Beide

Endocannabinoide tragen zur Hypotonie im septischen Schock bei [48]. Inzwischen

konnten auch bei Patienten im Endotoxinschock erhöhte Serumspiegel von

Anandamid und 2-AG nachgewiesen werden [49].

Sowohl im hämorrhagischen als auch im durch experimentelle Ligatur der linken

Herzkranzarterie bei Ratten induzierten kardiogenen Schock verkürzt die

Antagonisierung der Endocannabinoideffekte das Überleben, obwohl der Blutdruck

angehoben wird. Im kardiogenen Schock entwickelte sich rasch eine endotheliale

Dysfunktion, die durch SR141716A noch verstärkt wird [50]. Vermutlich üben

Endocannabinoide in der Schocksituation durch Gefäßerweiterung der Hirn- und

Herzkranzarterien eine wichtige biologische Schutzfunktion aus [43].

Neben der direkten Aktivierung von CB1-Rezeptoren, wie es zum Beispiel für glatte

Gefäßmuskelzellen von Hirnarterien der Ratte gezeigt ist [51], gibt es eine Reihe

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1. Einleitung

weiterer Regulationsmechanismen. Die durch Anandamid an Ringpräparationen der

Herzkranzarterie des Schafes verursachte Gefäßerweiterung konnte sowohl durch

den Cyclooxygenaseinhibitor Indomethacin, als auch durch den Fettsäure-Amido-

hydrolaseinhibitor Phenylmethyl-Sulfonyl-Fluorid (PMSF) deutlich abgeschwächt

werden. Die Blockade des CB1-Rezeptors durch SR 141716A zeigte keinen Effekt. In

diesem Fall scheint der Effekt also durch ein Produkt der Cyclooxygenase, einem

vasoaktiven Prostanoid verursacht zu sein [52].

Wie dieses Beispiel ferner zeigt, ist die Beurteilung kardiovaskulärer Effekte von

Endocannabinoiden durch eine Varianz, abhängig von der verwendeten Tierspezies,

erschwert. Im Gegensatz zu den beschriebenen Befunden an Ringpräparationen von

Herzkranzarterien des Schafes beschreiben verschiedene Arbeitsgruppen für

Herzkranzarterien der Ratte eine rezeptorabhängige und durch SR 141716A

hemmbare Vasodilatation [43,53].

Zwar verursachen Cannabinoide in fast allen vaskulären Stromgebieten

Vasodilatation, jedoch ist auch vereinzelt Vasokonstriktion zu beobachten. In

anästhesierten Ratten konnte unter Verwendung radioaktiv markierter Mikrosphären

in Hirn-, Herz- und Nierengefäßen eine Verringerung des vaskulären Widerstandes

gezeigt werden, während sich der vaskuläre Widerstand der Milz erhöhte [43].

Ein indirekter Mechanismus, Gefäße zu erweitern ist die Aktivierung von Vanilloid-

rezeptoren. Vanilloide wie Olvanil oder Capsaicin ähneln Anandamid strukturell. In

Gefäßen unterschiedlicher Tierarten konnte gezeigt werden, dass Anandamid

endothelunabhängig durch VR1-Rezeptor-Aktivierung Vasodilatation vermittelt.

Cannabinoide mit einer von Anandamid abweichenden Struktur, wie das

synthetische HU-210 oder das endogene 2-AG, zeigen diesen Effekt nicht.

Anandamid bindet an VR1-Rezeptoren perivaskulärer, sensibler Nerven und setzt

dadurch das Calcitoningen-verwandte Peptide (CGRP) frei, welches für die

Relaxation verantwortlich ist [23]. Wie inzwischen an TRPV1-Rezeptor-Knockout-

mäusen – die keine VR1-Rezeptoren besitzen – gezeigt werden konnte, spielt der

VR1-Rezeptor bei der Blutdruckantwort nach Anandamidgabe im Vergleich zum CB1-

Rezeptor jedoch eine untergeordnete Rolle [54].

Stickstoffmonoxid (NO) hat bei der physiologischen Regulation der Gefäßweite eine

große Bedeutung. In der Nierenarterie der Ratte verursacht Anandamid durch

endotheliale Freisetzung von NO Vasodilatation. Sowohl durch den CB1-Rezeptor-

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1. Einleitung

antagonisten SR141716A als auch durch den NO-Synthase-Inhibitor L-NAME wurde

der Effekt gehemmt [55].

Neben den klassischen Cannabinoidrezeptoren scheint es weitere Rezeptoren zu

geben, an denen Endocannabinoide ihre Wirkungen entfalten. So konnte zumindest

funktionell durch Arbeiten mit CB1/CB2-Doppelknockout-Mäusen ein endothel-

ständiger „Anandamidrezeptor“ in der Mesenterialarterie der Ratte identifiziert

werden, der dort nach Anandamidgabe Vasodilatation vermittelt. Dieser

Anandamidrezeptor wird durch Anandamid, R-Methanandamid und „Abnormal

Cannabidiol“, einem synthetischen Cannabidiol-Analogon ohne psychoaktive

Wirkung aktiviert und durch SR 141617A und dem Cannabidiol-Analogon O-1918

gehemmt [22]. Bestätigt wird dieser Anandamidrezeptor auch durch Untersuchungen

an der Kaninchenaorta, wo ebenfalls eine endothelabhängige, SR 141716A sensitive

Vasodilatation gezeigt werden konnte [56]. Allerdings ist dieser Rezeptor noch nicht

geklont.

Auch andere Arbeitsgruppen vermuten weitere Cannabinoidrezeptoren [53,57].

Allerdings ist noch unklar, ob diese zusätzlichen Rezeptoren tatsächlich

eigenständige Cannabinoidrezeptoren sind. Möglicherweise besitzen Cannabinoide,

analog der Wirkung von Anandamid am Vanilloidrezeptor, auch nur Struktur-

ähnlichkeiten mit den eigentlichen Agonisten dieser Rezeptoren und haben daher die

Fähigkeit an sie zu binden.

1.3 Pulmonale Wirkungen von Cannabinoiden

Im Vergleich zu den kardiovaskulären Effekten der Endocannabinoide ist über ihre

pulmonalen Effekte weit weniger bekannt. Hierbei konzentrierte sich die Forschung

auf die Atemwege und weniger auf die Lungengefäße.

Von ∆ 9-THC weiß man, dass es beim Menschen bronchialerweiternd wirkt [58,59].

Merkwürdigerweise zeigen manche Asthmatiker aber Bronchospasmen nach ∆ 9-

THC Gabe [60,61]. Anandamid scheint bei der intrinsischen Kontrolle der

Atemwegsregulation eine Rolle zu spielen. Dabei führt es, wie an Ratten und

Meerschweinchen gezeigt werden konnte, zu gegensinnigen Effekten. Einerseits

verhindert Anandamid das Auftreten von Husten und Bronchienverengung nach

Provokation durch den Reizstoff Capsaicin, andererseits verursacht es

Bronchienverengung wenn der verengende Einfluss des Vagusnerven ausgeschaltet

ist [62]. Möglicherweise hängt die Reaktionsweise – Bronchodilatation oder

-konstriktion – vom Kontraktionszustand der Bronchialmuskulatur ab. Sowohl

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1. Einleitung

Bronchienverengung als auch Bronchienerweiterung waren CB1-Rezeptor vermittelt,

während die Blockade des VR1-Vanilloidrezeptors keinen Effekt hatte. In dieser

Studie konnte auch gezeigt werden, dass Anandamid in Ratten und

Meerschweinchenlungen durch einen Ca2+-ionenabhängigen Mechanismus

synthetisiert wird [62]. Auch 2-AG kommt in Rattenlungen vor, wobei die

physiologische Bedeutung von 2-AG in der Lunge bisher nicht bekannt ist [63].

Im Widerspruch dazu zeigen Ergebnisse einer anderen Arbeitsgruppe keinen

antiobstruktiven Effekt von Anandamid in Meerschweinchenlungen, in denen zuvor

durch Calcimycinexposition ein Bronchospasmus verursacht wurde. Jedoch vermag

Anandamid die Verletzung des Atemwegsepithels zu begrenzen und die

Einwanderung von Leukozyten zu reduzieren [64].

Ob und wie Endocannabinoide auf die pulmonalen Gefäße wirken ist bisher nicht

beschrieben. In zwei Studien aus den 70er Jahren wurde die Wirkung von ∆ 9-THC

auf die Lungenstrombahn untersucht. Bei narkotisierten Hunden konnte nach

intravenöser Gabe von ∆ 9-THC ein signifikanter Anstieg des Lungenwiderstandes

festgestellt werden, der durch beidseitige Vagotomie praktisch gänzlich verhindert

wurde und auf einen vagalen Reflexmechanismus zurückgeführt wurde [65]. Eine

zweite Arbeit zeigt nach Injektion von ∆ 9-THC einen dosisabhängigen Anstieg des

Perfusionsdrucks in der isolierten Meerschweinchenlunge. Dieser Effekt wurde durch

vorherige Gabe von Aspirin verhindert und von den Autoren durch die Freisetzung

„prostaglandinartiger Substanzen“ erklärt [66]. Lange vor Entdeckung der

Cannabinoidrezeptoren, sind diese beiden Studien durch fehlende pharma-

kologische Möglichkeiten, cannabinoidezeptorvermittelte Mechanismen aufzu-

decken, erschwert.

1.4 Zielsetzung der Arbeit

Die pulmonale Hypertonie ist eine Erkrankung mit deutlich eingeschränkter

Lebenserwartung und begrenzter Therapiemöglichkeit. Neben Calciumkanal-

antagonisten kommen Thromboxanantagonisten, Prostacyclinanaloga, Endothelin-

rezeptorantagonisten oder der Phosphodiesteraseinhibitor Sildenafil (Viagra®) zum

Einsatz [67]. Leider versagen die zur Verfügung stehenden Therapiemöglichkeiten

bei einem erheblichen Anteil der Patienten und der Einfluss auf die Sterblichkeit ist

nach wie vor unklar [68].

Nachdem Cannabinoide im systemischen Kreislauf hauptsächlich vasodilatierend

wirken [43], haben wir versucht, ihren Einfluss auf die Lungenstrombahn zu

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1. Einleitung

charakterisieren. Wir wollten sehen, ob Cannabinoide auch in der Lunge

vasodilatierend wirken und damit als neue Substanzklasse zur Behandlung des

Lungenhochdrucks denkbar wären. Diese Arbeit setzte sich deshalb mit dem

biologischen Effekt verschiedener endogener, pflanzlicher und synthetischer

Cannabinoide auf den pulmonalarteriellen Druck in einem isolierten Lungenmodell

auseinander. Außerdem sollte geprüft werden, ob biologisch relevante Endo-

cannabinoidspiegel im Lungengewebe vorhanden sind und damit ein

endocannabinoid-vermitteltes Regulationssystem des pulmonalarteriellen Druckes

bestehen könnte.

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2. Material und Methoden

2 Material und Methoden 2.1 Modell der isolierten, perfundierten und ventilierten Kaninchenlunge

Das verwendete Organmodell wurde bereits 1912 von Knowlton und Starling

beschrieben [69] und kommt in modifizierter Form seit 1996 an der Medizinischen

Universitätsklinik Würzburg in der Arbeitsgruppe von Dr. H. Wahn zur Anwendung.

2.1.1 Versuchsaufbau

Die Lungen wurden beim verwendeten Versuchsaufbau in einem geschlossenen

Kreislaufsystem kontinuierlich mit Hilfe einer Peristaltikpumpe (Gambro PP10-1a)

volumenkonstant perfundiert. Dazu wurde ein PVC-freies Schlauchsystem (Tygon®,

Norton, Akron USA) verwendet. Im Perfusionskreislauf konnte man das verwendete

Perfusionsmedium aus zwei parallel geschalteten doppelwandigen Vorratsbehältern

aus Glas (400 ml; Glasgerätebau Ochs, 37120 Bovenden) entweder in den Kreislauf

einspeisen oder über einen Ablauf verwerfen. Den beiden Vorratsbehältern

vorgeschaltet war eine Verteilerbank (B. Braun, 34209 Melsungen) über die der

venöse Abfluss und die Befüllung mit frischer Perfusionslösung gesteuert werden

konnte. Weitere an die Verteilerbank angeschlossene Dreiwegehähne (B. Braun,

34209 Melsungen) ermöglichten die Entnahme von Perfusatproben. Zwischen der

Peristaltikpumpe und dem isolierten Organ befand sich, zum Schutz der Lunge vor

Embolien, ein Transfusionsfilter (40 µm SQ 40SE; Pall Biomedizin GmbH, 63303

Dreieich) und eine Blasenfalle. Das Perfusat wurde der Lunge über einen in der A.

pulmonalis platzierten Katheter zugeleitet. Der venöse Abfluss wurde über einen im

linken Ventrikel platzierten zweiten Katheter ermöglicht und über ein

kaskadenförmiges Leitersystem in die Vorratsbehälter zurückgeleitet. Dieses

Leitersystem ermöglichte, während des Experiments durch Verschluss der unteren

Kaskadensprosse den pulmonalvenösen Druck bezogen auf den Lungenhilus um 10

cm H20 zu erhöhen (Hydrostatic Challenge).

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2. Material und Methoden

Blasenfalle

Mehrkanalschreiber Wägezelle

Beatmungs-pumpe

Pulmonalarterie

Trachea

Verstärker

Wärmekammer

Filter

Perfusatbehälter

Umschaltventil

RollerpumpeInjektionsport

Kaskadensystem fürvenöse Druckbelastung

linker Ventrikel

Innenkathedermit Druck-aufnehmer

Abbildung 5: Schematische Darstellung der isolierten Kaninchenlunge

Während des eigentlichen Versuchs hing die Lunge frei schwebend in einer 37°C

warmen, feuchten Kammer aus Glas (doppelwandig; Glasgerätebau Ochs) an einem

Kraftaufnehmer mit Wägezelle (Messkonverter MC3; Hottinger Baldwin, Darmstadt),

die mit einem Messverstärker (Eigenbau) verbunden war. Das doppelwandige

Glassystem der feuchten Kammer und der Vorratsbehälter war mit einem

Wärmetauscher (HKB 2219 Multitemp II; Bromma) verbunden und über eine

zirkulierende Flüssigkeit temperiert. Dadurch konnte die Temperatur der

Perfusionsflüssigkeit nach Wunsch eingestellt werden. Die pulmonalarteriellen (PAP)

und pulmonalvenösen, linksatrialen Drücke (LAP) wurden mittels dünnlumiger

Innenkatheter in A. pulmonalis und auf Höhe des linken Vorhofs kontinuierlich erfasst

und über Druckaufnehmer (Combitrans Monitoring-Set venös; B. Braun) an den

Messverstärker weitergeleitet. Die kontinuierliche Registrierung der Parameter

erfolgte über einen Mehrkanalschreiber (Servogor 960; BBC Goerz). Alle zum Druck-

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2. Material und Methoden

ausgleich im System benötigten Entlüftungseinrichtungen an Vorratsbehältern und

Kaskadensystem waren zum Schutz vor einer möglichen bakteriellen Kontamination

durch hydrophobe, bakteriendichte Filtereinheiten mit einer Porengröße von 0,2 µm

gesichert (ReZist 30/0,2; Schleicher + Schuell, 37582 Dasel).

Abbildung 6: Abbildung der Versuchsanlage

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2. Material und Methoden

2.1.2 Versuchsvorbereitung

Alle an der Versuchsdurchführung beteiligten Systeme wurden in einer Spülmaschine

gereinigt. Die kunsstoffhaltigen Anteile wurden anschließend mit 60°C heißem

Formaldehyddampf sterilisiert, die Vorratsbehälter aus Glas mit Wasserdampf

dampfsterilisiert. Das Schlauchsystem wurde aufgebaut und der prä- und

postpulmonale Anteil kurzgeschlossen.

Nach Befüllung des Systems mit steriler, 0,9%iger Kochsalzlösung (NaCl 0.9

Infusionslösung; Fresenius AG, 61346 Bad Homburg) und anschließender

Entlüftung, erfolgte der mehrmalige Austausch der zirkulierenden Flüssigkeit über die

abwechselnd aufgefüllten, parallel geschalteten Vorratsgefäße (Gesamtvolumen der

pyrogenfreien Spülflüssigkeit ca. 1 l). Dadurch wurde die Gefahr einer bakteriellen

Kontamination reduziert. Anschließend wurde die Kochsalzlösung durch Krebs-

Henseleit-Puffer (KHB; Serag Wiesner, 95119 Naila) (Zusammensetzung: NaCl

132,8 mmol/l, KCl 5,2 mmol/l, KH2PO4 1,1 mmol/l, NaHCO3 24,1 mmol/l, CaCl 2,4

mmol/l, MgPO4 1,3 mmol/l und Glucose 240 mg/dl) ersetzt und es folgte ein weiterer

Spülgang (Spülvolumen: 1l). Während dieses Spülgangs wurde das gesamte System

von eventuell noch vorhandenen Luftblasen befreit. Die Innenkatheter für die

pulmonalarterielle und pulmonalvenöse Druckmessung wurden entlüftet und

arterieller sowie venöser Schenkel des Perfusionssystems nach Abschalten der

Zirkulation mit Kocher-Klemmen (alle Instrumente Aesculap, Tuttlingen) vor einem

unerwünschtem Auslaufen während der Präparation gesichert.

2.1.3 Präparation

Als Versuchstiere wurden männliche Kaninchen der Rasse Chinchilla Bastard

(Charles River Deutschland GmbH, 88353 Kißlegg) mit einem Gewicht zwischen 2,2

und 3,5 kg verwendet. Eine behördliche Genehmigung zur Organentnahme lag vor.

Ein Ohr des Kaninchens wurde mit einem Schleimhautanästhetikum (Xylocain®

Pumpspray; Astra GmbH, 22876 Wedel) eingesprüht. Nach kurzer Einwirkungszeit

wurde die Ohrvene mit einer Butterfly-Kanüle (Venofix® S ID 0,5 mm; B. Braun,

34209 Melsungen) punktiert und dieser venöse Zugang anschließend mit

Pflasterstreifen fixiert. Zur Narkoseeinleitung. wurde dem Kaninchen 1 ml des

verwendeten Narkosegemisches, bestehend aus 25 mg (S)-Ketaminhydrochlorid

(Ketanest® S 5 mg/ml, 5 ml Injektionslösung; Parke-Davis GmbH, Berlin) und 80 mg

Xylazinhydrochlorid (Rompun® 2 %, 25 ml Injektionslösung; Bayer AG, Leverkusen),

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2. Material und Methoden

als Einschlafdosis injiziert. Danach erfolgte eine gewichtsadaptierte Antikoagulation

des Tieres mittels eines Heparin-Kochsalzgemisches (Liquemin® N 25000, 5 ml

Injektionslösung mit 5000 I.E./ml; Hoffmann-La Roche AG, 79630 Grenzach-Whylen;

1000 I.E./kg Körpergewicht).

Das Kaninchen wurde nun auf dem Rücken gelagert. Das Präparationsfeld über der

Trachea wurde rasiert. Der Bereich zwischen oberer Thoraxapertur und Larynx

wurde mit 5 ml Lidocain 2 % (Xylocain® 2 % 5 ml Injektionslösung; Astra) infiltriert

Dann das restliche Präparationsgebiet über Thorax und Abdomen vom Fell befreit

und mit einem Hautantiseptikum (Braunol®; B. Braun) bepinselt. Im nächsten Schritt

wurde die Trachea des Kaninchens freipräpariert und eröffnet. Anschließend wurde

ein Beatmungstubus in die Trachea eingebracht und das Tier mittels eines

Kleintierrespirators (Rodent Ventilator 7025; Ugo Basile, Comero/Italien) künstlich mit

Raumluft und einem Atemzugvolumen von 10 ml/kg KG beatmet. Unter

kontinuierlicher Kontrolle des Herzschlags wurden weitere 4 ml des

Narkosegemisches langsam (ca. 0,1 ml/15-30 s) injiziert. Die Reaktion auf

Schmerzreize wurde überprüft und gegebenenfalls die Narkose vorsichtig weiter

vertieft. Im Regelfall war die bis dahin verabreichte Menge von insgesamt 5ml

Narkosegemisch, die etwa 60% der vorbereiteten Gesamtmenge entsprach,

allerdings ausreichend.

Anschließend wurde die Haut über dem Processus xiphoideus eingeschnitten und

Thorax und Abdomen freipräpariert. Unterhalb des Processus xiphoideus wurde das

Abdomen eröffnet und der Processus xiphoideus mit einer Kocherklemme gefasst.

Dieser Einschnitt im Oberbauchbereich wurde quer erweitert, um den abdominellen

Zugang zum Thorax zu ermöglichen. Der Ansatz des Zwerchfells am Sternum wurde

mit einer spitzen gebogenen Pinzette unterfahren und mit einer Darmklemme

gefasst. Das Zwerchfell wurde oberhalb der Darmklemme am Sternum durchtrennt

und der Thorax durch leichten Zug an der Darmklemme eröffnet. Dadurch entstand

ein Pneumothorax und die Lunge löste sich von der Thoraxwand. Das Zwerchfell

wurde auf beiden Seiten entlang des Rippenbogens abpräpariert. Unter Schonung

von Aorta und Vena cava wurden die übrigen durch das Zwerchfell tretenden

Strukturen durchtrennt.

Als nächstes wurde der Brustkorb, von unten kommend mit einer Knochenschere

durch eine mediane Längssternotomie eröffnet. Das Präparationsfeld wurde nun von

einem Assistenten mit 2 Klemmen aufgehalten. Der Thymus wurde stumpf entfernt,

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2. Material und Methoden

das Perikard eröffnet und ebenfalls vorsichtig entfernt. Aorta und A. pulmonalis

wurden am Gefäßursprung mit jeweils einem Faden angeschlungen. Der rechte

Ventrikel wurde dann knapp unterhalb der Pulmonalklappe eröffnet und der

vorbereitete pulmonalarterielle Katheter unter minimalem Perfusatfluss in die Arterie

eingeführt und mittels des vorbereiteten Fadens eingebunden. Anschließend wurde

die Herzspitze unter Eröffnung beider Ventrikel abgetrennt, die Aorta ligiert und der

Beatmungsluft CO2 zur pH-Regulation bei jetzt fehlendem Körperkreislauf und damit

fehlender CO2-Produktion beigemischt. Die nun isolierte Lunge wurde vorsichtig aus

dem Brustkorb entnommen.

Vorsichtig wurden zwei Drittel der Wand des rechten Ventrikels, sowie die Segel der

Mitralklappe entfernt. Das linke Herzohr wurde mit einer Fadenligatur abgebunden,

um Störungen der Gewichtsregistrierung durch unterschiedliche Füllungszustände zu

vermeiden. Zuletzt wurde mit Hilfe einer Tabaksbeutelnaht der Adapter für den

venösen Abfluss in den linken Ventrikel eingenäht (Mersilene™; Ethicon®). Die

Lunge wurde in der feuchten Kammer freischwingend an der Wägezelle

(Messkonverter MC3; Hottinger Baldwin, Darmstadt) aufgehängt (siehe Abbildung 7).

Abbildung 7: Versuchspräparat

Der Adapter wurde an das venöse System angeschlossen und somit der Kreislauf

geschlossen. Eventuell in den venösen Anteil des Systems eingedrungene Luft

wurde entfernt um eine Störung des venösen Abflusses zu vermeiden. Die

Perfusionsgeschwindigkeit betrug zu diesem Zeitpunkt 25 ml/min bei einer

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2. Material und Methoden

Perfusattemperatur von 4°C und das Organ wurde mit einem Atemzugvolumen von

30ml und einer Frequenz von 30 min-1 beatmet.

2.1.4 Kalibrier- und Aufwärmphase

Die Druckaufnehmer wurden über Dreiwegehähne an die Innenkatheter

angeschlossen, entlüftet und kalibriert, wobei der Luftdruck in Hilushöhe als

Nullpunkt definiert wurde. Das Perfusat wurde auf 37°C aufgewärmt und die

Perfusionsgeschwindigkeit nach einem festgelegten Modus (15°C: 50 ml/min, 25°C:

75 ml/min, 35°C: 100 ml/min) langsam erhöht. Der pulmonalvenöse Druck (LAP)

wurde am Ende der Aufwärmphase mittels der höhenverstellbaren Kaskaden-

vorrichtung auf 2 mm Hg eingestellt.

Der pH-Wert des Perfusats wurde in regelmäßigen Abständen (4°C, 15°C, 25°C,

37°C, sowie nach Perfusatwechsel) an einem BGA-Messgerät (ABL 30; Radiometer

Copenhagen) gemessen. Dabei wurde er mittels variabler CO2-Zumischung zur

Beatmungsluft zwischen 7,35 und 7,45 möglichst konstant gehalten. Nach erreichen

einer Perfusattemperatur und Lufttemperatur von 37°C in der feuchten Kammer,

wurde das Perfusat nochmals gewechselt und der pH-Wert erneut kontrolliert. Durch

die beschriebene Versuchsanordnung und -durchführung kann – wie bereits von

anderen Arbeitsgruppen gezeigt – ein nahezu endotoxinfreies rezirkulierendes

Perfusat erreicht werden [70].

2.1.5 Steady-State-Phase

Dem eigentlichen Versuch vorgeschaltet war eine 45 Minuten dauernde Steady-

State-Phase, in der die Lunge unter konstanten äußeren Bedingungen perfundiert

und beatmet wurde. Folgende Bedingungen mussten erfüllt werden, damit die Lunge

für den anschließenden Versuch zugelassen werden konnte: Es durfte kein Verlust

von Perfusatflüssigkeit an den Einbindungsstellen der Katheter auftreten. Ferner

sollte die Lunge homogen weiß entblutet sein und keine äußeren Anzeichen einer

Atelektase oder Ödembildung aufweisen, sowie nicht spontan an Gewicht- oder

Perfusionsdruck zunehmen.

2.2 Messgrößen und Messtechnik

Die Druckregistrierung und -darstellung erfolgte in der Maßeinheit mm Hg, die zwar

nach der internationalen SI-Vereinbarung nicht mehr gebräuchlich, in der Medizin

jedoch noch immer weit verbreitet ist. Zur Berechnung der Widerstände wurden die

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2. Material und Methoden

Drücke nach dem Umrechnungsfaktor: 133,322 Pa = 1 mm Hg in Pascal

umgerechnet.

2.2.1 Messung der pulmonalarteriellen und pulmonalvenösen Perfusions-drücke (PAP,LAP)

Die Messung der Perfusionsdrücke vor und nach der Lungenstrombahn erfolgte mit

kliniküblichen Einmaldruckwandlern (Combitrans Monitoring-Set venös; B. Braun)

über flüssigkeitsgefüllte Innenkatheter auf Höhe der A. pulmonalis

(pulmonalarterieller Druck, PAP) beziehungsweise des linken Vorhofs

(pulmonalvenöser Druck, LAP). Das gemessenen Signal wurde mit einem

Messverstärker (Eigenbau) verstärkt und mit Hilfe eines Mehrkanalschreibers

(Servogor 960; BBC Goerz; Papiervorschub 2 mm/min, Empfindlichkeit 1 mm/ mm

Hg) kontinuierlich registriert. Um Schreiberungenauigkeiten vorzubeugen, wurde

während des Versuchs in regelmäßigen Abständen der Nullpunkt an Schreiber und

Druckaufnehmer abgeglichen.

2.2.2 Bestimmung des pulmonalkapillären Druckes (PCP)

Der pulmonalkapilläre Druck PCP wurde mit Hilfe der “Double−Occlusion−Methode“

bestimmt. Dazu wurde gleichzeitig der pulmonalarterielle Zufluss und der

pulmonalvenöse Abfluss der Lunge mit Hilfe einer Klemme unterbrochen und das

Perfusat über eine Kurzschlussverbindung an der Lunge vorbei geleitet. Die nun

gemessenen pulmonalarteriellen und pulmonalvenösen Drücke (Papiervorschub 60

mm/min) gleichen sich innerhalb weniger Sekunden an und entsprechen dem Druck

im Kapillarbett, der mit dieser Methode hinreichend genau bestimmt werden kann

[71].

2.2.3 Bestimmung der Gefäßwiderstände (Ra, Rv)

Der pulmonalarterielle (Ra) und der pulmonalvenöse (Rv) Widerstand wurden nach

dem Ohm´schen Gesetzes berechnet:

QpR ∆

=

R: Widerstand

∆p: Druckdifferenz

Q: Stromstärke

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2. Material und Methoden

Somit gilt für Ra:

QppR pcpa

a−

=

Ra: pulmonalarterieller Widerstand

pa: pulmonalarterieller Druck

ppcp: pulmonalkapillärer Druck

Q: Perfusionsgeschwindigkeit (konstant 100 ml/min)

Analog gilt für Rv:

QppRv vpcp −

=

Rv: pulmonalvenöser Widerstand

pv: pulmonalvenöser Druck

Die Widerstände werden in folgender Einheit angegeben:

[Pa·s / ml]

(Zur Berechnung der Widerstände erfolgte die Umrechnung der Drücke von mm Hg

nach Pascal)

2.2.4 Bestimmung des kapillären Filtrationskoeffizienten (Kf,c)

Physiologische Grundlagen: Der Kf,c ist eine rechnerisch ermittelte, konstante Größe,

die ein Maß für die Permeabilität der Kapillarwand für isotone Lösungen darstellt.

Nach der Theorie von Starling besteht unter Normalbedingungen ein

Fließgleichgewicht zwischen Filtrations- und Reabsorptionsvorgängen zwischen

Intravasalraum und Interstitium. Dieser Vorgang wird hauptsächlich durch die

hydrostatischen (∆p) und kolloidosmotischen (∆π) Drücke in den jeweiligen

Kompartimenten bestimmt. Der effektive Filtrationsdruck (peff) wird durch folgende

Gleichung beschrieben:

19

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2. Material und Methoden

peff = ∆p − ∆π = (pc − pis) – ( πpl − πis) (1)

pc: hydrostatischer Kapillardruck

pis: hydrostatischer Druck im Interstitium

πpl: kolloidosmotischer Druck im Plasma/Perfusat

πis: kolloidosmotische Druck im Interstitium

Bei Störungen des Gleichgewichtes treten Volumenverschiebungen zwischen

intravaskulärem und interstitiellem Raum auf. Unter diesen Voraussetzungen gilt für

das pro Zeiteinheit über die vaskuläre Grenzfläche tretende Volumen Iv nach der

Starling-Gleichung [72] folgender Zusammenhang:

Iv = Kf,c · peff = Kf,c[(pc − pis) − σ( πpl − πis)] (2)

σ: Reflexionskoeffizient

Für nicht-isogravimetrische Zustände, d.h. bei einem Ungleichgewicht zwischen

Filtration und Reabsorption, gilt σ = 0. In diesem Fall ist Iv direkt proportional zur

effektiv wirksamen Druckdifferenz ∆p zwischen Perfusat und Interstitium. Für den Kf,c

gilt somit:

∆pIvK cf, = (3)

Iv ist außerdem proportional der Gewichtszunahme der Lunge ∆W pro Zeiteinheit ∆t

und somit eine bekannte Messgröße:

ρ∆t∆WIv∗

= (4)

ρ: Perfusatdichte [ρ = 1 g / cm3]

20

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2. Material und Methoden

Somit gilt:

ρ∆p∆t∆WK cf,

∗∗= (4) in (3)

Für die experimentelle Bestimmung des Kf,c war es daher erforderlich, das in der

Steady-State-Phase zwischen Filtration und Reabsorption eingetretene

Fließgleichgewicht (∆p = 0) zu stören. Dies erfolgte durch eine Erhöhung des

linksatrialen (und damit auch des intrakapillären) Druckes um ∆p = 10 cm H2O für

einen Zeitraum von 8 min (Hydrostatic Challenge) [73]. In Folge dieser

Druckerhöhung kam es zum Einstrom von Perfusat aus dem Intravasalraum ins

Interstitium, der mit Hilfe der Registrierung als Gewichtszunahme registriert wurde.

(Papiervorschub 15 mm/min zwei Minuten vor und während des Hydrostatic

Challenge; Empfindlichkeit der Gewichtsregistrierung 10 mm/g). Dieser Perfusat-

einstrom war zu Beginn des Hydrostatic Challenge am größten und nahm im Verlauf

ab, bis sich ein neues Gleichgewicht auf höherem Niveau eingestellt hatte. Der Kf,c

lässt sich in Abhängigkeit von der Zeit mit folgender Exponentialfunktion

beschreiben:

Kf,c(t) = Kf,c · e-kt

(daraus folgt: Kf,c(0) = Kf,c)

e: Euler´sche Zahl, e = 2,718...

k: Proportionalitätsfaktor

Der initial überproportionale Gewichtsanstieg, verursacht durch druckpassive

Flüssigkeitsfüllung des pulmonalen Gefäßbettes wird als Compliance bezeichnet und

hat zur Folge, dass die Bestimmung von Iv(0) als Steigung der Gewichts−Zeit−Kurve

zum Zeitpunkt t = 0 min des Hydrostatic Challenge nicht möglich ist. Deshalb war es

notwendig, Iv(t) zu den Zeitpunkten t = 3,4,5,6,7,8 min zu ermitteln und nach

Logarithmieren der so ermittelten Werte für Kf,c(t) den Kf,c als Steigung einer

Regressionsgeraden durch diese Werte zu berechnen [74]. Der so ermittelte Wert

wurde delogarithmiert und auf das Lungenfeuchtgewicht (wet weight lung, WWL)

bezogen. Dieses wurde nach folgender Formel aus dem Körpergewicht (body weight,

BW) des verwendeten Versuchtieres berechnet [75]:

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2. Material und Methoden

WWL = BW · 0,0024 [g]

Der Kf,c hat somit folgende Dimension:

[Kf,c = cm3 / s · cmH2O · g]

2.2.5 Bestimmung der Compliance

Die Compliance (C) ist ein Maß für die druckpassive Dehnung der pulmonalen

Gefäße und somit auch für den vermehrten intravasalen Flüssigkeitsgehalt der Lunge

nach experimenteller Erhöhung des LAP.

Der Zahlenwert wurde abgeschätzt durch Anlegen einer Tangente an die

Gewichts−Zeit−Kurve des Hydrostatic Challenge bei t=2 min und Extrapolation der

gesamten Gewichtszunahme der Lunge von diesem Zeitpunkt zurück zum Beginn

des Hydrostatic Challenge (t=0 min). Der so gefundene Wert wurde auf den Betrag

der pulmonalvenösen Druckerhöhung bezogen [73]. Als Dimension von C ergibt sich

somit:

[C = g / cmH2O]

2.2.6 Bestimmung der Retention (∆W)

Unter der Retention ∆W versteht man die Differenz der Lungengewichte vor und

nach Ablauf des Hydrostatic Challenge in [g]. Sie ist ein Maß für die irreversible

Zunahme der interstitiellen Flüssigkeit im Verlauf einer Druckkaskade. Nach

Aufheben der Erhöhung des LVP näherte sich das Lungengewicht ebenfalls einer

Exponentialfunktion folgend ihrem nun um ∆W erhöhten Ausgangswert.

Experimentell wurde ∆W deshalb nicht zu einem vorher festgelegten Zeitpunkt

bestimmt, sondern erst wenn sich ein neues Gleichgewicht mit kleinstmöglichem

Wert eingestellt hatte.

2.3 Versuchsdurchführung

2.3.1 Versuchsablauf und Stimulation

Dem eigentlichen Versuch war eine 45 minütige Steady-State-Phase vorgeschaltet,

die zum Zeitpunkt t = - 45 min begann. Während dieser Steady-State-Phase wurde

zum Zeitpunkt t = - 30 min der pulmonalkapillären Druck, mittels “Double−Occlusion−

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2. Material und Methoden

Methode“ bestimmt. Zum Zeitpunkt t = - 15 wurde zur Bestimmung der Compliance

(C) und des kapillären Filtrationskoeffizienten (Kf,c) ein Hydrostatic Challenge

durchgeführt.

Im Anschluss begann die eigentliche, 45 min dauernde, Versuchsphase. Zum

Zeitpunkt t = 0 wurden die Cannabinoidrezeptoragonisten Anandamid (0,5 µmol/l, 1

µmol/l, 5 µmol/l), 2-AG (0,2 µmol/l, 0,4 µmol/l), R-Methanandamid (5 µmol/l), Noladin-

äther (4 µmol/l), HU-210 (5 µmol/l), ∆9-THC (5 µmol/l) direkt in das Perfusats-

vorratsgefäß gegeben, von wo aus sie innerhalb kurzer Zeit in die pulmonale

Zirkulation gelangten. Bei den Kontrollversuchen wurde zum Zeitpunkt t = 0 reiner

Äthanol (1,5 ml) verabreicht, um einen Effekt des Lösungsmittels auszuschließen.

Der CB1-Cannabinoidrezeptorantagonist AM-251 (5 µmol/l) und der VR1-Vanilloid-

rezeptorantagonist Capsazepin (10 µmol/l) wurden 5 min vor Beginn der Gabe von

Anandamid ins Perfusat gegeben. Dieser 5 min dauernde zusätzliche Abschnitt im

Anschluss an die Steady-State-Phase, sollte sicherstellen, dass sich die

Antagonisten ausreichend im Perfusat verteilt hatten und eine sichere Hemmung der

pulmonalen Cannabinoid- beziehungsweise Vanilloidrezeptoren erreicht wurde.

Anandamid, 2-AG, R-Methanandamid, Noladinäther, Capsazepin und ∆9-THC

wurden in reinem Äthanol gelöst, für HU-210 und AM-251 wurde DMSO

(Dimethylsulfoxid) als Lösungsmittel verwendet. Zum Zeitpunkt t = 15 min wurde der

pulmonalkapilläre Druck bestimmt und bei t = 30 min wurde ein Hydrostatic

Challenge zur Bestimmung des pulmonalkapillären Filtrationskoeffizienten (Kf,c) und

der Compliance (C) durchgeführt. Nach t = 45 min wurde der Versuch beendet.

2.4 Biochemische Analytik

2.4.1 Bestimmung der Konzentrationen von Anandamid und 2-AG mittels Flüssigkeitschromatographie / Massenspektrometrie (LC/MS)

Zur Bestimmung des Anandamid- und 2-AG-Gehalts wurde natives Lungengewebe

von fünf Kaninchen in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bis zur weiteren

Aufarbeitung bei -80 °C gelagert.

Zunächst wurde das Gewebe gewogen und dann nach Zugabe von Trispuffer

homogenisiert. 7 nmol 2H4-Anandamid wurde als interner Standard hinzugegeben.

Die Lipidfraktion wurde durch Hinzufügen eines 4°C kalten Chloroform-

Methanolgemisches (2:1) extrahiert und durch Zentrifugation und anschließendem

Abpipettieren der unteren, organischen Phase von den Zellen und dem Trispuffer

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2. Material und Methoden

getrennt. Dieser Vorgang wurde unter Hinzufügen eines Chloroform-Methanol-

Gemisches zweimal wiederholt, um eine möglichst vollständige Extraktion der

Lipidfraktion zu erreichen. Die organische Phase wurde nun unter Stickstoffbegasung

vollständig evaporiert und anschließend zur Entfernung der Proteine in einer

eiskalten Chloroform-Aceton-Mischung wieder in Lösung gebracht. Hierdurch kam es

zur Präzipitation der Proteine, die nun nach Zentrifugation abpippetiert werden

konnten. Nach nochmaligem Evaporieren der verbleibenden Lösung wurde die Probe

erneut in Methanol gelöst und bis zur Analyse bei -80 °C gelagert. Die

vorbeschriebenen Arbeitsschritte wurden in Würzburg durchgeführt.

Die Detektion der Endocannabinoide erfolgte durch Flüssigkeitschromatographie/

Massenspektrometrie (LC /MS) [76] unter Verwendung eines Agilent LC-MSD der

1100-Reihe, ausgestattet mit einem thermostatreguliertem Autosampler und

Säulenkompartiment im Labor von Prof. Kunos, NIAAA, NIH, Bethesda, Maryland,

USA. Der für molekulare Masse empfindliche Detektor (Modell LS) ermöglichte die

chemische Ionisierung positiv geladener Ionen unter atmosphärischem Druck

(atmospheric pressure chemical ionization (APCI)) und das Messen ausgewählter

Ionen (selected-ion-monitoring (SIM)), in unserem Fall Anandamid (Arachidonyl-

ethanolamid (AEA)) mit einer molekularen Masse von 348 g/mol, 2H4-Anandamid

(2H4-AEA) mit 352 g/mol und 2-AG mit 379 g/mol. Eine Eichkurve wurde mittels

synthetischem AEA und 2-AG erstellt. Die Konzentrationen von Anandamid und 2-

AG in den Proben wurden durch eine invers-lineare Regressionsgerade der

Standardkurve bestimmt und sind in pmol/g beziehungsweise nmol/g Lungenfeucht-

gewebe angegeben.

2.5 Substanzen

Die folgende Tabelle enthält ein Verzeichnis der verwendeten Chemikalien und

Pharmaka. Die Bezugsquelle der für die Tierpräparation verwendeten Substanzen

und Pharmaka, sowie die Hersteller der für den Aufbau der Versuchsanlage

verwendeten Materialien sind bereits in den Abschnitten 2.1.2 und 2.1.3 genannt.

Substanz Hersteller/Lieferant

Aceton (2-Propanon) Carl Roth GmbH & Co KG, 76185

Karlsruhe

Anandamid (Arachidonylethanolamid) Sigma-Aldrich GmbH, 82024 Taufkirchen

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2. Material und Methoden

2H4-AEA Geschenk von Prof. Kunos, NIAAA, Bethesda, Maryland, USA.

AM-251 Biotrend Chemikalien GmbH, 50933 Köln

2-AG (Arachidonylglycerol) Alexis Biochemicals, 4415 Lausen,

Schweiz

Capsazepin Alexis Biochemicals, 4415 Lausen,

Schweiz

Chloroform (Trichlormethan, CHCl3) Merck KGaA, 64271 Darmstadt

Dimethylsulfoxid (DMSO) Sigma-Aldrich GmbH, 82024 Taufkirchen

Äthanol, absolut rein Mallinckrodt Baker Chemikalien, 64347

Griesheim

HU-210 Biotrend Chemikalien GmbH, 50933 Köln

Krebs-Henseleit-Puffer Serag Wiesner, 95119 Naila

Methanol Sigma-Aldrich GmbH, 82024 Taufkirchen

(R)-(+)-Methanandamid Biotrend Chemikalien GmbH, 50933 Köln

Noladinäther Biotrend Chemikalien GmbH, 50933 Köln

NaCl 0.9 % Infusionslösung Fresenius AG, 61346

Bad Homburg

∆9-Tetrahydrocannabinol (∆9-THC) Sigma-Aldrich GmbH, 82024 Taufkirchen

Tabelle 1: Substanzenverzeichnis

2.6 Statistische Auswertung

Sämtliche Daten werden als Mittelwerte ± Standardfehler der Mittelwerte (SEM)

dargestellt. Unterschiede zwischen den verschiedenen Behandlungsgruppen wurden

durch One-Way-Anova ermittelt und mit dem Bonferroni Post-Hoc Test korrigiert.

Unterschiede mit einer Fehlerwahrscheinlichkeit (p-Wert) < 0,05 wurden als

signifikant bewertet.

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3. Ergebnisse

3 Ergebnisse 3.1 Pulmonalarterieller Druck

Der durchschnittliche Ausgangsdruck aller Versuche am Ende der Steady-State-

Phase lag bei 5,0 ± 0,2 mm Hg (N = 85).

Das endogene Cannabinoid Anandamid erhöht dosisabhängig den pulmonal-

arteriellen Druck. Abbildung 8 zeigt die Differenz (∆PAPmax) zwischen dem maximal

erreichten Druck nach Gabe von Anandamid und dem jeweiligen Ausgangsdruck vor

Beginn der Substanzgabe. Nach Gabe von 0,5 µmol/l Anandamid wird ein ∆PAPmax

von 6,1 ± 1,1 mm Hg (N = 6) erreicht. 1 µmol/l Anandamid verursacht einen

maximalen Druckanstieg von 15,6 ± 3,8 mm Hg (N = 5). Die Gabe von 5 µmol/l

Anandamid führt zu einem maximalen Druckanstieg von 19,9 ± 3,4 mm Hg (N = 6).

Auch das endogene Cannabinoid 2-Arachidonylglycerol (2-AG) erhöht dosisabhängig

den pulmonalarteriellen Druck (Abbildung 8). Jedoch zeigt bereits eine um den

Faktor 10 niedrigere Dosis von 0,2 µmol/l 2-AG mit einem ∆PAPmax von 19,6 ± 8,8

mm Hg (N = 3) einen vergleichbaren Effekt wie 5 µmol/l Anandamid. Nach Gabe von

0,4 µmol/l 2-AG wird ein maximaler Druckanstieg um 39,5 ± 10,8 mm Hg (N = 4)

erreicht.

Abbildung 8: Maximaler Druckanstieg nach Gabe verschiedener Dosen von Anandamid (weiße, hellgraue und graue Säulen) und 2-Arachidonylglycerol (2-AG) (dunkelgraue und schwarze Säule). Die vertikalen Balken stellen die Standardabweichung des Mittelwertes dar. Alle Effekte unterscheiden sich signifikant von der Nulllinie (p < 0.05 für 0,5 µmol/l Anandamid und 0,2 µmol/l 2-AG; p < 0.01 für 1 µmol/l und 5 µmol/l Anandamid sowie 0,4 µmol/l 2-AG).

26

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3. Ergebnisse

Etwa 2 Minuten nach Gabe von 5 µmol/l Anandamid beziehungsweise 0,4 µmol/l 2-

AG, beginnt der Anstieg des pulmonalarteriellen Druckes, der im Falle von 5 µmol/l

Anandamid etwas träger als bei 0,4 µmol/l 2-AG verläuft. Nach 8,8 ± 0,7 Minuten

erreicht der pulmonalarterielle Druck sein Maximum und bildet sich dann langsam

wieder zurück um am Versuchsende zum Zeitpunkt t = 45 min bei 8,6 ± 2,0 mm Hg

und damit nicht mehr signifikant über den Druckwerten in den Kontrollversuchen zu

liegen (Abbildung 9).

Im Gegensatz dazu erreicht 2-AG sein Druckmaximum bereits nach 3,8 ± 0,4

Minuten. Der Druck fällt nach dem im Vergleich zu Anandamid bedeutend

schnelleren Anstieg auch wesentlich schneller wieder ab und liegt bereits nach 15

Minuten mit 7,8 ± 2,0 mm Hg nicht mehr signifikant über dem Druck in den

Kontrollversuchen (Abbildung 9).

**‡

**

+ ** **

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

-50 -40 -30 -20 -10 0 10 20 30 40 50

t in min

p in

mm

Hg

KontrollversucheAnandamid 5 µmol/l2-AG 0,4 µmol/l

Abbildung 9: Druck-Zeitverlauf von 5 µmol/l Anandamid (gestrichelte Linie mit hellen Rechtecken), 0,4 µmol/l 2-AG (gepunktete Linie mit dunklen Dreiecken) und Kontrollversuchen (durchgezogenen Linie mit hellen Rauten). Die vertikalen Balken stellen die Standardabweichung des Mittelwertes dar. (** p < 0,01 für 5 µmol/l Anandamid vs. Kontrollversuche; + p < 0,05 für 0,4 µmol/l 2-AG vs. Kontrollversuche; ‡ p < 0,01 für 0,4 µmol/l 2-AG vs. Kontrollversuche)

27

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3. Ergebnisse

Die Vorbehandlung mit dem Cannabinoidrezeptorantagonisten AM-251 (5 µmol/l) 5

Minuten vor der Gabe von Anandamid (5 µmol/l) – in dieser Konzentration wirkt

AM-251 antagonistisch am CB1- und CB2-Rezeptor – zeigt keinen signifikanten Effekt

auf den Druckanstieg nach Anandamidgabe (12,9 ± 1,5 mm Hg; N = 6 vs.19,9 ± 3,4

mm Hg für 5 µmol/l Anandamid alleine) (Abbildung 10).

Gibt man AM-251 in CB1-Rezeptor-selektiver Dosierung von 0,1 µmol/l wird der

Druckanstieg nach Gabe von 5 µmol/l Anandamid sogar noch verstärkt (48,7 ± 11,8

mm Hg; N = 5 vs. 19,9 ± 3,4 mm Hg für 5 µmol/l Anandamid alleine). Der VR1-Vanilloidrezeporantagonist Capsazepin (10 µmol/l), 5 min vor Anandamid-

gabe (5 µmol/l) verabreicht, zeigt keinen Einfluss auf den Druckanstieg nach

Anandamid.

Abbildung 10: Auswirkung des Cannabinoidrezeptorantagonisten AM-251 (schraffierte Säulen; 1.schraffierte Säule 5 µmol/l AM-251, 2. schraffierte Säule 0,1 µmol/l AM-251) und des Vanilloid-rezeptorantagonisten Capsazepin (schwarze Säule) auf den Druckanstieg nach Gabe von 5 µmol/l Anandamid (graue Säule) (p > 0,05 für 5 µmol/l AM-251 und 10 µmol/l Capsazepin vs. 5 µmol/l Anandamid alleine; p < 0,05 für 0,1 µmol/l AM-251 vs. 5 µmol/l Anandamid alleine)

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3. Ergebnisse

Im Gegensatz zu den Endocannabinoiden Anandamid und 2-AG führen vergleich-

bare Dosen des synthetischen Cannabinoids HU-210 (0,5 ± 0,1 mm Hg; N = 3) und

des pflanzlichen Cannabinoids ∆ 9-Tetrahydrocannabinol (∆ 9-THC) (1,5 ± 0,4 mm

Hg; N = 5) zu keinem signifikanten Druckanstieg (Abbildung 11).

Abbildung 11: Druckverhältnisse nach Gabe von HU-210 (schraffierte Säule) und ∆ 9-Tetrahydro-cannabinol (∆ 9-THC) (weiße Säule) im Vergleich zu 5 µmol/l Anandamid (graue Säule). (p > 0,05 für HU-210 und ∆ 9-THC vs. Kontrolle; p < 0,01 für 5 µmol/l Anandamid vs. Kontrolle).

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3. Ergebnisse

(R)-(+)-Methanandamid und Noladinäther sind stoffwechselstabile Analoga von

Anandamid und 2-AG. Im Gegensatz zu Anandamid und 2-AG kommt es zu keinem

Druckanstieg nach Gabe von 5 µmol/l Methanandamid (0,3 ± 0,2 mm Hg; N = 4) oder

4 µmol/l Noladinäther (0,3 ± 0,1 mm Hg; N = 4) (Abbildung 12).

Abbildung 12: Druckverhältnisse nach Gabe von 5µmol/l Methanandamid (2.Säule) und 4 µmol/l Noladinäther (4. Säule) im Vergleich zu 5 µmol/l Anandamid (Graue Säule) und 0,4 µmol/l 2-AG (schwarze Säule) (p > 0,05 für Methanandamid und Noladinäther vs. Kontrolle; p < 0,01 für 5µmol/l Anandamid und. 0,4 µmol/l 2-AG vs. Kontrolle).

30

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3. Ergebnisse

3.2 Pulmonalkapillärer Druck und Verteilung der pulmonalen Gefäßwider-

stände

Abbildung 13 zeigt die pulmonalkapillären Druckverhältnisse 15 Minuten (t = - 30

min) nach Beginn der Steady-State-Phase (und damit 30 Minuten vor

Substanzgabe), 15 Minuten (t = 15min) nach Substanzgabe und am Versuchsende (t

= 45 min), die mittels der „Double-Occlusion-Methode“ bestimmt wurden (siehe

2.2.2).

Nach Anandamid- beziehungsweise 2-AG-Gabe kommt es zu einem geringen aber

dennoch signifikanten Anstieg des pulmonalkapillären Druckes 4,4 ± 0,3 mm Hg (für

5 µmol/l Anandamid) bzw. 4,1 ± 0,1 mm Hg (für 0,4 µmol/l 2-AG) vs. 2,8 ± 0,3 mm Hg

bei den Kontrollversuchen).

Am Versuchsende, 45 Minuten nach Substanzgabe, gibt es keine pulmonalkapillären

Druckunterschiede zwischen 5 µmol/l Anandamid sowie 0,4 µmol/l 2-AG und den

Kontrollversuchen.

0

1

2

3

4

5

6

t = -30 min t = 15 min t = 45 min

Pc (m

m H

g)

KontrolleAnandamid 5 µmol/l2-AG 0,4 µmol/l

Abbildung 13: Pulmonalkapilläre Drücke (Pc) zu den Zeitpunkten t = – 30 min (während der Steady-State-Phase vor Substanzgabe), t = 15 min (15 Minuten nach Substanzgabe) und t = 45 min (45 Minuten nach Substanzgabe) bei den Versuchen mit 5 µmol/l Anandamid (graue Säule), 0,4 µmol/l 2-AG (schwarze Säule) und den Kontrollversuchen (weiße Säule). Die vertikalen Balken stellen die Standardabweichung des Mittelwertes dar (Zeitpunkt t = 15 min: p < 0,01 für 5 µmol/l Anandamid und 0,4 µmol/l 2-AG vs. Kontrolle).

Abbildung 14 zeigt das Verhalten der pulmonalarteriellen Widerstände (Ra). Hierbei

ergibt sich für die Versuche mit 5 µmol/l Anandamid nach 15 Minuten eine deutliche

31

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3. Ergebnisse

Zunahme des pulmonalarteriellen Widerstandes auf 1332 ± 255 Pa*s/ml (vs. 220 ±

60 Pa*s/ml bei den Kontrollversuchen), die in etwa einer Versechsfachung des

Ausgangswertes entspricht. Bei den Versuchen mit 0,4 µmol/l 2-AG ist der pulmonal-

arterielle Widerstand zum Zeitpunkt t = 15 min mit 290 ± 173 Pa*s/ml (vs. 220 ± 60

Pa*s/ml bei den Kontrollversuchen) nicht signifikant erhöht.

Der scheinbare Widerspruch – 2-AG führt bereits in geringerer Dosierung zu einer

stärker ausgeprägten Erhöhung des pulmonalkapillären Druckes als Anandamid

(siehe Abbildung 8), aber zu keinem signifikanten Anstieg des pulmonalarteriellen

Widerstandes – erklärt sich durch die unterschiedliche Dynamik im Druck-Zeitverlauf

der beiden Substanzen. Zum Zeitpunkt t = 15 min, dem Zeitpunkt der Messung des

pulmonalkapillären Widerstandes, ist im Falle von 0,4 µmol/l 2-AG der

Ausgangsdruck vor Substanzgabe bereits wieder erreicht, bei 5 µmol/l Anandamid

aber noch eine deutliche Druckerhöhung feststellbar (vergleiche Abbildung 9). Im

Falle von 2-AG ist damit keine Erhöhung des pulmonalkapillären Druckes mehr

messbar.

Am Versuchsende, zum Zeitpunkt t = 45, sind keine Unterschiede zwischen den

pulmonalarteriellen Widerständen messbar.

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

1800

t = -30 min t = 15 min t = 45 min

RA

(Pa*

s/m

l)

KontrolleAnandamid 5 µmol/l2-AG 0,4 µmol/l

Abbildung 14: Pulmonalarterielle Widerstände (Ra) zu den Zeitpunkten t = - 30 min, t = 15 min und t = 45 min bei den Versuchen mit 5 µmol/l Anandamid (graue Säule), 0,4 µmol/l 2-AG (schwarze Säule) und den Kontrollversuchen (weiße Säule) (Zeitpunkt t = 15 min: p < 0,01 für 5 µmol/l Anandamid vs. Kontrolle).

32

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3. Ergebnisse

Die pulmonalvenösen Widerstände sind in Abbildung 15 dargestellt. Auch hier kommt

es zu einem signifikanten, wenn auch im Vergleich zu den pulmonalarteriellen

Widerständen weit geringer ausgeprägten Anstieg (vergleiche Abbildung 14). Für 5

µmol/l Anandamid ergibt sich ein Anstieg auf 185 ± 40 Pa*s/ml, für 0,4 µmol/l 2-AG

auf 155 ± 39 Pa*s/ml (vs. 61 ± 10 Pa*s/ml bei den Kontrollversuchen). Dies

entspricht im Falle von Anandamid in etwa einer Verdreifachung des

Ausgangswertes.

0

50

100

150

200

250

300

t = -30 min t = 15 min t = 45 min

RV

(Pa*

s/m

l)

KontrolleAnandamid 5 µmol/l2-AG 0,4 µmol/l

Abbildung 15: Pulmonalvenöse Widerstände (RV) zu den Zeitpunkten t = - 30 min, t = 15 min und t = 45 min bei den Versuchen mit 5 µmol/l Anandamid (graue Säulen), 0,4 µmol/l 2-AG (schwarze Säulen) und den Kontrollversuchen (weiße Säulen)(Zeitpunkt t = 15 min: p < 0,01 für 5 µmol/l Anandamid sowie 0,4 µmol/l 2-AG vs. Kontrolle).

Die Druckerhöhung durch Anandamid und 2-AG ist vor allem der massiven Erhöhung

des pulmonalarteriellen Widerstandes (Ra) zuzuschreiben. Die Erhöhung des

pulmonalkapillären Druckes (Pc) sowie des pulmonalvenösen Widerstandes (Rv) sind

zu klein um den massiven Druckanstieg nach Anandamid- beziehungsweise 2-AG-

Gabe zu erklären. Die Druckerhöhungen durch Anandamid und 2-AG sind also vor

allem durch eine Widerstandserhöhung im präkapillären Gefäßbett der Lungen-

strombahn verursacht.

Die Erhöhung der pulmonalvenösen Widerstände und pulmonalkapillären Drücke

muss nicht unbedingt die Folge einer direkten Wirkung von Anandamid und 2-AG auf

den betreffenden Gefäßabschnitt sein. Bedingt durch die massive Druck- und

33

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3. Ergebnisse

Widerstandserhöhung im arteriellen Abschnitt des Gefäßbetts kommt auch eine eher

unspezifische Mitreaktion des venösen beziehungsweise pulmonalkapillären

Gefäßbetts als Erklärung in Betracht.

Für die Versuche mit HU-210, ∆9-THC, R-Methanandamid und Noladinäther wurden

ebenfalls Daten zu den pulmonalkapillären Druckverhältnissen und zur

Widerstandsverteilung erhoben. Infolge der ausbleibenden Druckerhöhung nach

Verabreichung der Substanzen ergaben sich aber erwartungsgemäß keine

signifikanten Unterschiede im Vergleich zur Kontrollgruppe (Daten nicht im Detail

dargestellt).

Bei den Versuchen mit dem CB1-Rezeptorantagonisten AM-251 und dem VR1-

Vanilloidrezeptorantagonisten Capsazepin ergaben sich Werte, die vergleichbar mit

denen bei alleiniger Gabe von 5 µmol/l Anandamid sind (Daten nicht im Detail

dargestellt).

34

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3. Ergebnisse

3.3 Gefäßpermeabilität und Compliance

Die Tabelle 2 zeigt die Ergebnisse zum kapillären Filtrationskoeffizienten (Kf,c), zur

Compliance (C) und zur Retention bei den Versuchen mit 5 µmol/l Anandamid, 0,4

µmol/l 2-AG und den Kontrollversuchen.

Durch die Verabreichung von Anandamid und 2-AG kommt es zu keiner signifikanten

Änderung des kapillären Filtrationskoeffizienten, der Compliance und der Retention.

Steady state VersuchGruppe t = -15 t = 30

Kontrolle Kf,c [·10-4cm3 · s-1 · cmH2O-1 · g-1] 1,23 ± 0,09 1,26 ± 0,15

C [g/cm H2O] 0,40 ± 0,02 0,41 ± 0,02

∆W [g] 2,33 ± 0,18 3,02 ± 1,07

Anandamid 5 µMol Kf,c [·10-4cm3 · s-1 · cmH2O-1 · g-1] 1,25 ± 0,21 1,56 ± 0,25

C [g/cm H2O] 0,45 ± 0,02 0,40 ± 0,02

∆W [g] 1,93 ± 0,47 2,65 ± 0,48

2-AG 0,4 µMol Kf,c [·10-4cm3 · s-1 · cmH2O-1 · g-1] 1,38 ± 0,39 2,07 ± 1,33

C [g/cm H2O] 0,37 ± 0,03 0,39 ± 0,02

∆W [g] 1,64 ± 0,42 6,33 ± 5,2

Hydrostatic challenge

Tabelle 2: Kf,c, C und ∆W für die Versuche mit 5 µmol/l Anandamid, 0,4 µmol/l 2-AG und den Kontrollversuchen (p > 0,05 für Kf,c, C und ∆W zu den Versuchen mit 5 µmol/l Anandamid, sowie 0,4 µmol 2-AG vs. Kontrollversuche).

3.4 Endocannabinoidgehalt der Lunge

Anandamid und 2-AG sind im nativen Lungengewebe mittels

Flüssigkeitschromatographie/ Massenspektrometrie (LC /MS) nachweisbar. Dazu

wurde das Gewebe von 5 nativen Kaninchenlungen untersucht. Sowohl Anandamid

wie auch 2-AG waren in jeder dieser Lungen messbar. Die Konzentration von

Anandamid betrug 99 ± 55 pmol/g Lungenfeuchtgewicht, die von 2-AG 19.6 ± 8.4

nmol/g Lungenfeuchtgewicht. 2-AG kommt damit in 200-fach höherer Konzentration

im nativen Lungengewebe vor als Anandamid.

35

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4. Diskussion

4 Diskussion Nachdem Cannabinoide in verschiedenen vaskulären Stromgebieten Gefäße

dilatieren [43], wollten wir wissen, ob sie dazu auch in der pulmonalen Strombahn in

der Lage sind und damit als potentiell neue Stoffklasse zur Behandlung des

pulmonalen Hochdrucks denkbar wären.

Überraschenderweise erhöhen die endogenen Cannabinoide Anandamid und 2-AG

jedoch im Modell der isolierten Kaninchenlunge dosisabhängig den

pulmonalarteriellen Druck.

Wenn auch unerwartet, so ist es trotzdem kein ungewöhnlicher Befund, dass eine

Substanz im systemischen Blutkreislauf Gefäße erweitert, während sie

Pulmonalgefäße verengt. Bradykinin ist ein Beispiel dafür [77,78]. Vasopressin

hingegen erhöht – zumindest in supraphysiologischen Konzentrationen – den

mittleren arteriellen Blutdruck, während es bereits in niedrigen Plasma-

konzentrationen in der Pulmonalarterie vasodilatierend wirkt [79]. Sauerstoffmangel

ist ebenfalls ein Stimulus, der im systemischen Blutkreislauf Gefäße verengt, im

Lungenkreislauf hingegen gefäßerweiternd wirkt [80].

Vieles deutet darauf hin, dass Abbauprodukte von Anandamid für den Druckanstieg

verantwortlich sind. HU-210 ist das potenteste synthetische Cannabinoid bezüglich

seiner hypotensiven und bradykardisierenden Wirkung [45]. Es ist ein starker Agonist

an CB1-Rezeptoren, aber auch am CB2-Rezeptor [20]. Seine chemische Struktur

ähnelt dem ∆9-THC und unterscheidet sich grundlegend von der Arachidonsäure-

struktur der endogenen Cannabinoide Anandamid und 2-AG (vergleiche Abbildung 1

bis Abbildung 3 in Abschnitt 1.1). Im Gegensatz zu Anandamid und 2-AG zeigt HU-

210 keinerlei Effekt auf die pulmonalarteriellen Drücke in der isolierten Kaninchen-

lunge, was gegen eine Vermittlung des Druckanstiegs durch klassische

Cannabinoidrezeptoren zu werten ist.

Im Einklang dazu erhöht das pflanzliche Cannabinoid ∆9-THC – auch ∆9-THC hat

nicht die Fettsäurenstruktur von Anandamid und 2-AG – den pulmonalarteriellen

Druck ebenfalls nicht. In einer Studie aus den 70er Jahren mit narkotisierten Hunden

kam es zwar zum Anstieg des pulmonalen Gefäßwiderstandes nach ∆9-THC, jedoch

wurde dieser Effekt, den die Autoren durch einen vagalen Reflex erklären, durch

bilaterale Vagotomie verhindert [65]. In unserem isolierten Lungenmodell ist ein

Einfluss des Nervus Vagus von vorneherein ausgeschlossen, ein gleichartiger Reflex

36

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4. Diskussion

könnte daher aus methodischen Gründen gar nicht auftreten. Im Widerspruch dazu

und zu unseren eigenen Ergebnissen zur Wirkung von ∆9-THC stehen die

Ergebnisse einer anderen Arbeitsgruppe, ebenfalls aus den 70er Jahren. Sie konnte

zeigen, dass ∆9-THC den pulmonalen Perfusionsdruck in der isolierten

Meerschweinchenlunge erhöht. Der Effekt konnte durch die vorherige Gabe von

Aspirin verhindert werden und wurde durch die Entstehung von „prostaglandinartigen

Substanzen“ erklärt [66]. Eine mögliche Erklärung für die Erhöhung des pulmonalen

Perfusionsdrucks durch ∆9-THC könnte die, im Vergleich zu unseren Versuchen,

höhere Dosierung sein. Eine Druckerhöhung zeigte sich bei der recht hohen

Dosierungen von 15 – 30 µmol/l ∆9-THC. In der isolierten Kaninchenlunge testeten

wir ∆9-THC nur in einer Konzentration von 5µmol/l und sahen keinen Effekt.

Möglicherweise unterscheiden sich verschiedene Tierspezies in der Reaktionsweise

ihrer pulmonalen Gefäße auf Cannabinoide aber auch.

Ein weiteres Argument gegen die Aktivierung von CB1-Rezeptoren als Ursache des

Druckanstieges liefert das Ergebnis unserer Experimente mit AM-251. AM-251 ist

strukturell mit dem CB1-Cannabinoidrezeptorantagonisten SR 141716A verwandt und

selbst ein noch potenterer CB1-Rezeptorantagonist. In der von uns verwendeten,

relativ hohen Dosierung von 5 µmol/l wirkt es aber auch antagonistisch am CB2-

Rezeptor [81,82]. In dieser Dosierung zeigt es keinen Effekt auf den Druckanstieg

nach Anandamidgabe. Erstaunlicherweise verursacht die Verabreichung von AM-251

in der CB1-Rezeptor-selektiven Dosierung von 0,1 µmol/l eine weitere Verstärkung

des Druckanstiegs nach Anandamidgabe. Die Frage nach der Ursache dieses

Effekts kann zum gegenwärtigen Zeitpunkt nicht beantwortet werden. Weitere

Versuche mit CB1-Rezeptorantagonisten, wie zum Beispiel SR 141716A, wären ein

erster Schritt zur Aufklärung dieser Beobachtung. Daher bleibt die Möglichkeit offen,

dass der Nettoeffekt von Anandamid pulmonale Vasokonstriktion ist, gleichzeitig aber

eine Aktivierung von CB1-Rezeptoren, in gewissem Maße, zur pulmonalen

Vasodilatation führt. Die Demaskierung eines solchen Effekts durch CB1-

Rezeptorantagonisten könnte einen, im Vergleich zur alleinigen Gabe von

Anandamid verstärkten Druckanstieg zur Folge haben. Leider gibt es kein wirklich

etabliertes Modell zur Erzeugung eines chronischen Lungenhochdrucks beim

Kaninchen, bei dem man diese Hypothese testen könnte.

Anandamid kann seine Wirkungen nicht nur durch Bindung an CB1-und CB2-

Rezeptoren entfalten. Es hat auch die Fähigkeit an VR1-Vanilloidrezeptoren zu

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4. Diskussion

binden und dadurch Einfluss auf den Gefäßtonus zu nehmen [23]. Die Aktivierung

von VR1-Vanilloidrezeptoren als Ursache der Druckerhöhung konnten wir jedoch

ausschließen. Capsazepin, ein spezifischer Antagonist am VR1-Vanilloidrezeptor [83]

zeigt keine Beeinflussung des Druckanstiegs nach Anandamidgabe.

Eine elegante Methode, um Effekte durch Abbauprodukte aufzudecken, ist die

Verwendung des stoffwechselstabiler Analoga, wie z.B. des Anandamidanalogons

(R)-(+)-Methanandamid. R-Methanandamid ist durch Methylierung gegen

enzymatischen Abbau geschützt [84]. Im Modell der isolierten Kaninchenlunge führt

die Gabe von R-Methanandamid zu keinerlei Druckänderung im Vergleich zum

Ausgangsdruck. Wir werten dies als starken Hinweis dafür, dass Abbauprodukte von

Anandamid für den Druckanstieg verantwortlich sind.

Noladinäther ist selbst ein endogenes Cannabinoid und ein stoffwechselstabiles

Analogon zu 2-AG. Ähnlich wie R-Methanandamid zeigt Noladinäther keinen Effekt

auf den pulmonalarteriellen Druck in unserem Modell. Auch im Falle von 2-AG

scheinen also Abbauprodukte für den Druckanstieg verantwortlich zu sein.

Eine Mitbeteiligung des in der Mesenterialarterie der Ratte beschriebenen

endothelständigen „Anandamidrezeptors“ [21,22] am pulmonalarteriellen

Druckanstieg erscheint äußerst unwahrscheinlich. Wir haben zwar keine Versuche

mit Anandamid nach vorheriger Blockade dieses Rezeptors mit dem Antagonisten O-

1918 gemacht, jedoch zeigt die Gabe von R-Methanandamid – das wie Anandamid

agonistisch an diesem Rezeptor wirkt [21] – keine Beeinflussung des pulmonal-

arteriellen Druckes.

Neben der Unbeeinflussbarkeit der Anandamidwirkung durch den

Cannabinoidrezeptorantagonisten AM-251, dem fehlenden Druckanstieg von

strukturell abweichenden Cannabinoiden wie HU-210 oder ∆9-THC, ist es vor allem

das Unvermögen der stoffwechselstabilen Analoga R-Methanandamid und

Noladinäther den pulmonalarteriellen Druck zu erhöhen, das uns an Abbauprodukte

von Anandamid und 2-AG als Ursache der pulmonalarteriellen Druckerhöhung

denken lässt.

Doch welche Abbauprodukte kommen dafür in Betracht? Anandamid und 2-AG

werden durch die Fettsäuren-Amidohydrolase (FAAH) zu Arachidonsäure und

Ethanolamid beziehungsweise zu Arachidonsäure und Glycerol abgebaut [85]. Bei 2-

AG ist das hauptsächlich für den Abbau verantwortliche Enzym neben der FAAH

wahrscheinlich eine Monoacylglycerol-Lipase [30]. Auch in diesem Fall entstehen

38

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4. Diskussion

Arachidonsäurederivate. Die entstehende Arachidonsäure könnte entweder der

Cyclooxygenase als Substrat dienen und zu Prostaglandinen, Thromboxanen oder

Prostacyclinen oder durch Lipoxygenasen zu Leukotrienen oder Monohydroxy-

tetraensäuren (HETEs) abgebaut werden. Während Prostacyclin und seine Analoga

pulmonale Vasodilatatoren sind und in der Therapie des pulmonalen Hochdrucks

zum Einsatz kommen [86] führt Thromboxan zur Vasokonstriktion der

Pulmonalarterie [87]. Ein wichtiges Produkt der Cyclooxygenase ist Prostaglandin-E2.

Es vermittelt seine Wirkungen über vier verschiedene Rezeptorsubtypen (EP1-EP4).

EP1-Rezeptoraktivierung vermittelt Schmerz und Blutdruckanstieg im systemischen

Kreislauf [88]. In isolierten Ringen menschlicher Pulmonalarterien führt EP3-

Aktivierung zur Kontraktion [89]. PGF2α wirkt in menschlichen Pulmonalgefäßen

spasmogen [90] aber auch Monohydroxytetraensäuren wie 5-HETE und 15-HETE

sind als pulmonale Vasokonstriktoren in Betracht zu ziehen [91]. Die medizinische

Doktorarbeit von Florian Kram mit dem Thema „Das endogene Cannabinoid

Anandamid erhöht cyclooxygenase-2 abhängig den pulmonalarteriellen Druck in der

isolierten Kaninchenlunge“ widmet sich ausführlich der Frage, durch welche

Abbauprodukte von Anandamid der pulmonalarterielle Druckanstieg zustande kommt

[92].

Eine weitere Möglichkeit des Endocannabinoidabbaus ist die direkte Umwandlung

von Anandamid und 2-AG durch die Cyclooxygenase-2 (COX-2) [34,35]. Dabei

entstehen neue Klassen von Prostaglandinen, nämlich die

Prostaglandinethanolamide aus Anandamid und die Prostaglandinglycerylester aus

2-AG. Diese ähneln strukturell den aus freier Arachidonsäure entstehenden

Prostaglandinen. Aus Anandamid entsteht hauptsächlich PGE2-Ethanolamid und in

geringerem Ausmaß PGD2-Ethanolamid [36]. Die biologische Bedeutung dieser

Substanzen ist bisher weitgehend unklar. PGE2-Ethanolamid kontrahiert im Versuch

durch Interaktion mit dem EP1-Prostanoidrezeptor die Trachea von

Meerschweinchen [93]. Eine andere Arbeitsgruppe berichtet, dass PGE2-

Ethanolamid die Iris der Katze kontrahiert und vermutet die Aktivierung neuartiger,

bisher unbekannter Rezeptoren als Ursache [94].

Nachdem Anandamid und 2-AG den pulmonalarteriellen Druck in unserem Modell

erhöhen, wollten wir wissen, ob die beiden Endocannabinoide auch im nativen

Lungengewebe vorkommen und damit möglicherweise eine Rolle bei der Regulation

des pulmonalarteriellen Gefäßtonus spielen könnten. Es ist uns gelungen,

39

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4. Diskussion

Anandamid und 2-AG durch Flüssigkeitschromatographie / Massenspektrometrie im

nativen Lungengewebe nachzuweisen. Die Konzentration von 2-AG (19,6 ± 8,4

nmol/g) war dabei um den Faktor 200 höher als die von Anandamid (99 ± 55 pmol/g).

Die Literatur beschreibt den Nachweis beträchtlicher Mengen von 2-AG in der Lunge

der Ratte, wobei die festgestellten Spiegel im Vergleich zu denen im Rattengehirn

erheblich niedriger waren [63]. Dies verwundert wegen der Funktion der

Endocannabinoide als Neurotransmitter nicht, ursprünglich wurde Anandamid ja auch

im Schweinehirn entdeckt [9]. In einer anderen Studie ist der Nachweis von

Anandamid im Lungengewebe der Ratte sowie in einer Reihe anderer Gewebe der

Ratte nicht gelungen [95]. Am besten sind die Endocannabinoidspiegel im

Nagergehirn untersucht. Dort wirken sie als Neuromodulatoren. Im Vorderhirn der

Maus beträgt der spezifische 2-AG-Gehalt ungefähr 9 nmol/g Gewebe [76,96] und

der Anandamidgehalt 3,2 pmol/g Gewebe [76] beziehungsweise 53 pmol/g Gewebe

[96] – je nach Studie, die man zu Grunde legt. Der Endocannabinoidgehalt der

Kaninchenlunge (99 ± 55 pmol/g für Anandamid und 19,6 ± 8,4 nmol/g für 2-AG) ist

im Vergleich dazu zumindest doppelt so hoch und legt eine biologische Relevanz

nahe. Wie im Mäusegehirn ist auch in der Lunge die Konzentration an 2-AG

wesentlich höher als die von Anandamid.

In weiteren Experimenten mit einem Antagonisten der Fettsäuren-Amidohydrolase

(FAAH) konnte unsere Arbeitsgruppe inzwischen zeigen, dass die für die

Druckerhöhung verantwortlichen Stoffe durch Abbau von Anandamid durch die

Fettsäuren-Amidohydrolase entstehen [92,97]. Wie sich durch Blockade der Cyclo-

oxygenase-2 mit einem Antagonisten zeigte, wird die mutmaßlich entstehende

Arachidonsäure durch die Cyclooxygenase-2 weiter verarbeitet. Für den

Druckanstieg sind offensichtlich die dabei entstehenden Prostanoide verantwortlich.

Während eine Blockade des Thromboxanrezeptors ohne Wirkung blieb, schwächte

die Blockade des EP1-Prostanoidrezeptors durch einen Antagonisten den

Druckanstieg ab, sodass wohl ein Teil des Druckanstiegs durch eine Aktivierung des

EP1-Rezeptors durch Prostaglandin E2 zustande kommen könnte. Diese Befunde

konnten durch den Nachweis der m-RNA sowohl der Fettsäuren-Amidohydrolase,

wie auch der Cyclooxygenase-2 im Kaninchenlungengewebe untermauert werden

[92,97].

Ursprünglich wollten wir mit unseren Untersuchungen eine neue Klasse von

pulmonalarteriellen Vasodilatatoren finden, jedoch zeigen Endocannabinoide –

40

Page 44: Hämodynamische Auswirkungen synthetischer, pflanzlicher ... · weitere endogene Cannabinoide zu identifizieren [24]. Anandamid entsteht aus einer membrangebundenen Vorläuferstufe,

4. Diskussion

entgegen unserer Erwartung – pulmonalarterielle Vasokonstriktion. Pulmonale

Hypertonie könnte daher als Nebenwirkung auftreten, sollten Endocannabinoide

therapeutisch eingesetzt werden, wie es zum Beispiel zur Therapie der

Bewegungsstörungen bei Chorea Huntington denkbar wäre [98]. Eine Therapie mit

∆9-THC hingegen wäre diesbezüglich ungefährlich.

Unsere Ergebnisse könnten zum besseren Verständnis der Pathophysiologie des

pulmonalen Hochdrucks unter bestimmten pathophysiologischen Bedingungen

beitragen. So kommt es beispielsweise im Rahmen des akuten Lungenversagens

(acute respiratory distress syndrom = ARDS) bei der Sepsis zum akuten pulmonalen

Hochdruck. Bakterielle Lipopolysaccharide (LPS) spielen eine große Rolle in der

Sepsis nach Infektion mit gram-negativen Bakterien und im akuten septischen

Lungenversagen [99]. Neben einer LPS induzierten Hochregulation des

Prostaglandin G/H Synthase-2 (COX-2)-Gens in der Kaninchenlunge mit nach-

folgender Umwandlung von freier Arachidonsäure in Thromboxan-B2 als Ursache

pulmonaler Vasokonstriktion [100], könnten auch erhöhte Endocannabinoidspiegel

zur Entstehung des pulmonalen Hochdrucks beitragen. LPS aktivieren im septischen

Schock in Makrophagen und Blutplättchen der Ratte die Produktion von

Endocannabinoiden [48]. Auch im Blut von Patienten im Endotoxinschock konnten

erhöhte Spiegel von Anandamid und 2-AG gemessen werden [49].

Endocannabinoide könnten also durch den von uns aufgezeigten Weg – Abbau

durch die Fettsäuren-Amidohydrolase und die Cyclooxygenase-2 mit Entstehung von

Prostaglandinderivaten – zur Entstehung des pulmonalen Hochdrucks im septischen

Lungenversagen mit beitragen.

41

Page 45: Hämodynamische Auswirkungen synthetischer, pflanzlicher ... · weitere endogene Cannabinoide zu identifizieren [24]. Anandamid entsteht aus einer membrangebundenen Vorläuferstufe,

5. Zusammenfassung

42

5 Zusammenfassung Die endogenen Cannabinoide Anandamid und 2-Arachidonylglycerol (2-AG) erhöhen

dosisabhängig den pulmonalarteriellen Druck in der isolierten, perfundierten und

ventilierten Kaninchenlunge. Cannabinoide, mit einer von der Arachidonsäurestruktur

von Anandamid und 2-AG abweichenden chemischen Struktur, wie das synthetische

HU-210 oder das pflanzliche ∆9-THC erhöhen den pulmonalarteriellen Druck nicht.

Im Gegensatz zu Anandamid und 2-AG führen die stoffwechselstabilen, gegen

enzymatischen Abbau geschützten Analoga von Anandamid und 2-AG, R-

Methanandamid und Noladinäther zu keinem Anstieg des pulmonalarteriellen

Druckes. Blockade des CB1-Rezeptors durch den spezifischen Antagonisten AM-251

verhindert die pulmonalarteriellen Druckerhöhung nach Anandamidgabe nicht. Wir

folgern daraus, dass Abbauprodukte von Anandamid und 2-AG für die

Druckerhöhung verantwortlich sind. Erstmalig konnten wir quantitativ Anandamid und

2-AG in der Kaninchenlunge nachweisen, was eine physiologische Relevanz der

beiden Endocannabinoide bei der Tonus-Regulation des Lungenkreislaufes nahelegt.

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7. Publikationen und Vorträge zur vorliegenden Promotion

54

7 Publikationen und Vorträge zur vorliegenden Promotion Veröffentlichungen

Wahn H., Wolf J., Kram F., Frantz S., Wagner JA.,

The Endocannabinoid Arachidonyl Ethanolamide (Anandamide) Increases

Pulmonary Arterial Pressure via Cyclooxygenase-2 Products in Isolated Rabbit

Lungs.

Am J Physiol Heart Circ Physiol, 2005: p. 00718.2005.

Vorträge

1) Wolf J, Kram F, Wahn H, Wagner JA

Endogenous cannabinoids increase pulmonary arterial pressure via cyclooxygenase-

2 products in isolated rabbit lungs.

IACM Kongress 12.-13.9.2003, Köln

2) Kram F, Wolf J

Endogene Cannabinoide erhöhen den pulmonal-arteriellen Druck in isolierten

Kaninchenlungen

5. Würzburger Promomed Kongress 16.-17. Januar 2004, Würzburg

3) Wagner JA, Wolf J, Kram F, Frantz S, Wahn H

Endogene Cannabinoide erhöhen den pulmonalarteriellen Druck in isolierten

Kaninchenlungen durch Cyclooxygenase-2-Produkte.

70. Jahrestagung der Deutschen Gesellschaft für Kardiologie 15.4.-17.4.2004,

Mannheim

4) Wagner JA, Wolf J, Kram F, Frantz S, Wahn H

Endogenous Cannabinoids Increase Pulmonary Arterial Pressure via

Cyclooxygenase-2 Products in Isolated Rabbit Lungs

European Society of Cardiology Congress 3.-7.9.2005, Stockholm, Sweden

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Danksagung

Mein Dank gilt allen, die mir beim Erstellen dieser Dissertationsschrift mit Rat und Tat

zur Seite gestanden haben.

Besonders hervorheben möchte ich Herrn Priv.-Doz. Dr. Jens Wagner. Bei ihm

bedanke ich mich für die Stellung des Themas und die stetige Unterstützung bei

allen Fragen, die im Rahmen der Experimente und dem Verfassen der

Dissertationsschrift auftraten. Seine ansteckende Begeisterung für die Wissenschaft

und die Innere Medizin haben mich nachhaltig geprägt. Bedanken möchte ich mich

auch für die große Gastfreundschaft, die ich bei zahlreichen Besuchen im Hause

Wagner erfahren durfte.

Ebenso gilt mein Dank Herrn Dr. Hans Wahn, inzwischen Oberarzt der

pneumologischen Abteilung der Fachkliniken Wangen. Neben der Stellung des

Themas möchte ich mich für die tatkräftige Hilfe, vor allem in der schwierigen Phase

der Einarbeitung, bedanken. Seine große Gastfreundschaft durfte ich auf diversen

Sommerfesten und bei meinen Besuchen in Wangen im Allgäu erfahren.

Herrn Prof. Dr. G. Ertl danke ich für das Überlassen der Laborräumlichkeiten zur

Durchführung der Experimente.

Bei Herrn Prof. O. Elert für das Korrekturlesen dieser Arbeit in seiner Funktion als

Koreferent.

Bei Herrn Florian Kram für die immer gute und freundschaftlich Zusammenarbeit bei

der Durchführung der Versuche. Seine aufbauende Art und moralische

Unterstützung an manchem langen Versuchstag wird mir immer positiv in Erinnerung

bleiben.

Herrn Henning Kaufmann und Herrn Florian Finter für die geduldige Einarbeitung in

die Versuchstechnik.

Bei Herrn Dr. S. Frantz für die Durchführung der RT-PCR zur Expression der FAAH

und COX-2.

Bei Herrn Prof. G. Kunos für die Durchführung der Flüssigkeitschromatographie/

Massenspektrometrie in seinem Labor in Bethesda, Maryland.

Frau Helga Wagner, Frau Charlotte Dienesch, Frau Lisa Bauer und Herrn Marco

Abeßer für die Tatkräftige Unterstützung in Fragen der Labororganisation,

wissenschaftlichen Methodik und die vielen aufmunternden Worte.

Page 59: Hämodynamische Auswirkungen synthetischer, pflanzlicher ... · weitere endogene Cannabinoide zu identifizieren [24]. Anandamid entsteht aus einer membrangebundenen Vorläuferstufe,

Meinem Bruder Felix für Durchsicht und Korrektur der Arbeit und meinen Eltern für

ihre stete Förderung, die dies alles erst ermöglicht hat.

Page 60: Hämodynamische Auswirkungen synthetischer, pflanzlicher ... · weitere endogene Cannabinoide zu identifizieren [24]. Anandamid entsteht aus einer membrangebundenen Vorläuferstufe,

Lebenslauf Persönliche Daten Name Jürgen Wolf

Geburtsdatum: 17.05.1978

Geburtsort: Heilbronn

Schulausbildung 1984 - 1988 Michael-Beheim-Grundschule Willsbach

1988 - 1997 Justinus-Kerner-Gymnasium Weinsberg

Zivildienst 1997 - 1998 Tätigkeit im Pflegebereich an der Klinik Löwenstein,

Zentrum für Pneumologie, Thorax- und Gefäßchirurgie

Hochschulausbildung

10/1998 – 5/2005 Studium der Humanmedizin an der Julius-Maximilians-

Universität Würzburg

9/2000 Ärztliche Vorprüfung

9/2001 Erster Abschnitt der Ärztlichen Prüfung

4/2004 Zweiter Abschnitt der Ärztlichen Prüfung

5/2005 Dritter Abschnitt der Ärztlichen Prüfung

Praktisches Jahr

4/2004 – 8/2004 Chirurgie am Krankenhaus Brixen, Brixen, Italien

8/2004 – 11/2004 Praktisches Jahr in Innere Medizin, Medizinische Klinik der

Universität Würzburg

11/2004 – 3/2005 Praktisches Jahr in Neurologie, Neurologische Klinik und

Poliklinik der Universität Würzburg

Beruf seit 06/2005 Assistenzarzt an der Medizinischen Klinik und Poliklinik I der

bayerischen Julius-Maximilians-Universität Würzburg

Würzburg, November 2005