1

1

Parvovirus, Pasteurellenund Co.

Infektionsüberwachung bei kleinen Labornagern

Werner Nicklas

Homburg, 11. März 2019

2

Das Vorgehen bei der Überwachung

ist abhängig von • wissenschaftlichen Fragestellungen• baulichen Bedingungen• Haltungsbedingungen• Herkunft (Beschaffung) der Tiere• Personal• diagnostischen Möglichkeiten• Finanzen

3

Die Häufigkeit von

Untersuchungen sollte abhängig

gemacht werden

vom Risiko der

Erregereinschleppung

4

Die Zahl zu untersuchender Tiere

(Stichprobe)

ist abhängig von der vermuteten

Anzahl positiver Tiere in der

Population

5

Infektionsüberwachung bei Versuchstieren

Anzahl zu untersuchender Tiere (Stichprobengröße)

– „ILAR Formel“ (1976)

– Cannon and Roe (1986)

6

2

7

Berechnung der Tierzahl

Voraussetzungen• Infektion gleichmäßig verteilt (beide

Geschlechter)

• Populationsgröße > 100 Tiere

• Probenentnahme nach dem Zufallsprinzip

Formel: log 0,05---------- = Anzahl Tierelog N

N = Prozentsatz nicht infiziert0.05= 95% confidence limit

8

Zahl zu untersuchender Tiere

% positiv Sicherheit95% 99% 99,9%

5 59 90 13510 29 44 6620 14 21 3130 9 13 2050 5 7 10

9

Sample size required for detecting disease with 99% confidence

1616200

16150

15100

1580

1460

1340

1120

1015

1010

# anim. to be sampled to detect 25% prevalencePopulation size

10

Probenentnahme für Infektionsüberwachung

ausreichende Tierzahl Entnahme nach dem Zufallsprinzip

Barrieren - Zucht vorhanden möglich

Barrieren - Experiment meist vorhanden nicht möglich

Isolatorhaltung meist nicht vorhanden meist nicht möglich

Mikroisolator (Filter-top) nein

IVC nein

transgene Linie meist nicht vorhanden nicht möglich

immundefiziente Tiere nicht sinnvoll

11

Sentinels

werden für Untersuchungszwecke in einen Tierbestand gebracht und nach ausreichend langer Verweilzeit (Expositionsdauer mind. 8-10 Wochen oder länger) stellvertretend für eine Population untersucht.

12

Sentinels

Einsatzgebiet• experimentelle Haltungen• Immundefiziente Tiere

(keine Antikörperbildung)

• transgene Tiere (Individuum oft unersetzlich, Immundefekte?)

3

13

Sentinels

Auswahlkriterien• Mikrobiologische Qualität (bes. bei

immundefizienten Tieren)

• Immunologische Kompetenz

• Stamm (Inzucht, Auszucht)

• Alter: junge adulte Tiere

Sentinels

Ganz wichtig!!!!!

• Mikrobiologische Qualität– Sentinels dürfen die Erreger nicht

mitbringen, auf die untersucht werden soll

– Bsp: Staph. aureus, Pneumocystis sp., Ps. aeruginosa, etc.

14

Sentinels – “dirty bedding“

Sentinels werden benutzter Einstreu, Staub, Aerosolen ausgesetzt

• Wenige Sentinels repräsentieren eine Kolonie

• Einstreumenge? Nur begrenzte Mengen können übertragen werden, Risiko der „Verdünnung“ einer infektiösen Dosis

• IVC: auch Erhöhung der Wahrscheinlichkeit der Übertragung durch Exposition von Sentinelsgegenüber unfiltrierter Abluft

• Nicht alle Erreger werden leicht übertragen!!! 15

Sentinels – “dirty bedding”Nicht alle Erreger werden leicht übertragen

• Respiratorische Erreger werden kaum übertragen [z. B., Sendai Virus, Filobacterium rodentium (CAR bacillus), Mykoplasmen, Pasteurellaceae], schlechte Übertragung von Milben

• einige Erreger sind sehr stark an ihren Wirt adaptiert (Pasteurellaceae, Filobacterium rodentium, Streptobacillus moniliformis)

• Resistenz gegenüber best. Erregern (MPV, Rotavirus) nimmt mit zunehmendem Alter zu

16

Sentinels – “dirty bedding”Nicht alle Erreger werden leicht übertragen

• Bei bestimmten Stämmen reduzierte Empfänglichkeit gegenüber spezifischen Erregern (e.g., MPV - C57BL/6, MVM - Auszuchtmäuse)

• Immundefiziente Tiere sind hilfreich zum Nachweis bestimmter Erreger (Pneumocystis, C. bovis)

• Serokonversion tritt z. T. sehr spät (>10 Wochen) auf, z. B. bei bakteriellen Erregern (z. B. Pasteurellaceen, Streptobacillus)

17

Käfigwechsel in Umsetzstation (laminar flow), Käfige dicht verschlossen

Kein Austausch von Erregern zwischen Käfigen – bei korrektem handling

Einzelbelüftete Käfige (IVC)

18

4

Health monitoring bei IVC Haltung

• Direkte Untersuchung von Kolonietieren ist möglich, aber große Tierzahlen notwendig

• Üblicherweise indirektes Testen über Sentinels• Gepoolte Einstreu aus mehreren Käfigen von

Kolonietieren

• Nachweis einer Infektion ist abhängig von Übertragung der Erreger auf Sentinels.

• Sentinels müssen einer infektiösen Dosisdes Erregers ausgesetzt sein

19

Sentinels - IVC Haltung• Modifikationen

– Mehrere Tiere der Ausgangskolonie gehen durch einen Sentinelkäfig

– Abluft – Sentinels

• Mögliche Alternativen? – Untersuchung von kranken Tieren!!!!! – Untersuchung von eingehenden Tieren

(Prophylaxe) – Definition „Mikrobiologische Einheit“: Linie /

Stamm, Experiment– PCR zum Testen auf aktive Infektionen– Abluftfilter (PCR) 20

Information zum Infektionsstatus

• Europa: FELASA Empfehlung (2002, 2014)

• USA: keine Vorgaben (z. B. durch AALAS)

• Australien: Einfuhrbestimmungen (Hantaviren)

• Keine weltweit standardisierte Vorgehensweise für Infektionsüberwachung und Ergebnismitteilung

• Erhältliche Informationen sind sehr variabel, Lesen und Verstehen teilweise schwierig und zeitraubend 21 22

23 24

5

Information zum Infektionsstatus

• Untersuchungsergebnis („test report“): erstellt vom Diagnostiklabor, gilt für Tiere einer Einsendung

• Gesundheitszeugnis („health report“): fasst Daten von regelmäßigen und wiederholten Untersuchungen zusammen, Information basiert auf größeren Tierzahlen, zusätzliche Informationen (z. B. klinische Beobachtungen, Haltungsbedingungen, Untersuchungsprogramm, etc.)

25

Gesundheitszeugnis

• Genaue Bezeichnung der Herkunft („microbiological unit“), z. B. Raum-Nr., Barriere

• Haltungsbedingungen (z. B. Barriere, offene Käfige, IVC, Isolator)

• Name(n) des/der Diagnostiklabor(s)• Datum der Neubelegung / Sanierung• Datum der letzten Untersuchung

26

Gesundheitszeugnis

• Anzahl untersuchter Tiere (seit Neubelegung oder für best. Zeitraum, z. B. 12/18 Monate)

• Methoden (klinisch, mikroskopisch, Serologie, Kultur, Histopathologie, PCR)

• Name(n) nachgewiesener Erreger • Name(n) nicht nachgewiesener Erreger• Behandlungen, Impfungen, etc. • Kontaktperson

27 28

29

Gesundheitszeugnis

Zusätzliche für das Verständnis des Gesundheitszeugnisses wichtige Informationen

• Untersuchungsprogramm (direkte Untersuchung von Kolonietieren, Sentinels, etc.)

• Klinische Beobachtungen 30

6

FELASA Empfehlungen

FELASA Recommendations for the health monitoring of rodent and rabbit colonies in breeding and experimental units. Laboratory Animals (2002) 36, 20-42

FELASA Recommendations for the health monitoring of rodent and rabbit colonies in breeding and experimental units. Laboratory Animals (2014) 48, 178-192

31

AALAS/FELASA Working Group on Health Monitoring of rodents for animal transfer

Journal of the American Association for Laboratory Animal Science (2014) 53 (6), 633-640

32

33

Infektionen bei Versuchstieren

Wichtige Aufgaben der Tierhausleitung

• Einschleppung von Mikroorganismen (von außen)

• Übertragung von Mikroorganismen innerhalb einer Kolonie

verhindern

34

Wichtigste Quelle für Einschleppung von Erregern in eine Tierhaltung

Tierlieferungen von außen

35

Carty et al. 2008

36

7

Marx JO, Gaertner DJ and Smith AL.

Results of survey regarding prevalence ofadventitial infections in mice and rats at biomedical research facilities.

J Am Assoc Lab Anim Sci 2017; 56: 527-533.

37

Bezug von Labortieren

• Häufiger Bezug von genetisch veränderten Tieren von sehr vielen Universitäten/Forschungseinrichtungen

• Diese Tiere sind mit einer höheren Wahrscheinlichkeit infiziert als Tiere von kommerziellen Züchtern

►Erhöhte Bedeutung von zuverlässigen Informationen zum Infektionsstatus 38

Verhindern von Erregereinschleppung

Bei Tieren, evtl. auch bei von Tieren stammenden Proben

Voraussetzung sind aussagekräftige Informationen zum Infektionsstatus

39

Voraussetzung für sicheres Einbringen von Tieren

Zuverlässige und umfassende Information zum Infektionsstatus

Ist häufig schwer erhältlich!

40

41

„SPF“

Das Freisein von einzeln aufzulistenden Erregern

muss durch regelmäßige Untersuchung

einer ausreichend großen Zahl von Tieren

(Stichprobengröße)

im richtigen Alter

mit geeigneten Methoden

nachgewiesen sein.

• “SPF”• ‘barrier-reared’ • ‘virus-antibody-free’ (VAF) • ‘SOPF’• ‘clean conventional’• ‘pathogen-free’ or ‘murine pathogen-

free’ (MPF) • ‘optimal hygienic conditions’ (OHC) • ‘health-monitored’ • ’conventional’

42

8

Infektionen heute

• Kaum klinische Erkrankungen

• „pathogene“ Keime weitgehend eliminiert

Aber • Trotzdem Einflüsse von Erregern auf

Versuchsergebnisse

43 44

Viren species mouse rat

Mouse hepatitis virus (MHV) x Kilham rat virus (KRV) x Mice minute virus (MMV) x Mouse parvovirus (MPV) Pneumonia virus of mice (PVM) x x Reovirus type 3 x x Sendai virus x x Mouse encephalomyelitis virus (GD VII) x x Toolan's H-1 virus x Rat Minute Virus (RMV) x Rat corona virus (RCV/SDAV) x Mouse adenovirus (FL, K87) x Ectromelia virus x K virus x Lymphocyt. choriomeningitis virus (LCMV) x Polyoma virus x Laktate dehydrogenase virus (LDV) x Mouse rota virus (EDIM) x Hantaviruses x Murine Norovirus x

45

Parvoviren

• Minute Virus of Mice (MVM)

• Mouse Parvovirus (MPV)

• Mouse Kidney Parvovirus (MKPV)

• Kilham Rat Virus (KRV)

• Toolan‘s H-1 Virus (H-1)

• Rat Parvovirus (RPV)

• Rat Minute Virus (RMV)

46

Parvoviren

• Replikation nur in mitotisch aktiven Zellen (S Phase)

• lytische Infektion von Tumorzellen – Beeinflussung von Tumorentstehung und -wachstum

(onkosuppressiv, Kontamination von Tumorzellen)

• Einfluß auf Embryonalentwicklung – embryonaler Frühtod, zerebellare Hypoplasie,

Missbildungen, Teratologie, Embryologie

• lymphotrop– Beeinflussung des Immunsystems, immunsuppressiv

47

Murine norovirus (MNV)

Cadwell, K., et al. (2010)

Virus-Plus-Susceptibility Gene Interaction Determines Crohn’s Disease Gene Atg16L1 Phenotypes in Intestine

Cell 141, 1135–1145 “…an interaction between a specific virus infection and a mutation in the Crohn’s disease susceptibility gene Atg16L1 induces intestinal pathologies in mice…”

48

Bakterielle Infektionserreger(Auswahl)

• Filobacteriumrodentium (CAR bacillus)

• Citrobacterrodentium

• Clostridium piliforme• Corynebacterium

(C.) bovis• C. kutscheri• Helicobacter spp. • Leptospira spp.

• Mycoplasma spp. • „Pasteurella

pneumotropica“ • P. multocida• Pseudomonas

aeruginosa • Salmonella sp. • Staphylococcus aureus• Streptobacillus

moniliformis• Streptococcus spp.

9

49

Helicobacter hepaticus

Chronische Hepatitis

Empfänglich: A/J, BALB/cAnN, C3H/HeN, SCID/N, SJL/N

Resistent: C57BL/6N B6C3F1

Lebertumoren

Empfänglich: A/J (männlich)

50

Helicobacter hepaticus

Entzündliche Darmerkrankungen (IBD)

• Insbesondere bei immundefizienten Mäusen (nude, scid)

• Auslösung von IBD bei verschiedenen Mäusestämmen beschrieben (Swiss-Webster, scid, A/J, IL10-/-, Rag2-/-

• Verzögerung des Auftretens von IBD bei best. Linien

51

Helicobacter Infektion

52

H. typhlonius

H. bilis

Pasteurellaceen

• Wichtigste Erreger bei Maus und Ratte: Rodentibacter (früher „P. pneumotropica“), aber auch andere Arten (z. B. Muribacter muris) kommen vor

• meist hohe Wirtsspezifität

• weite Verbreitung in Nagerpopulationen, klinisch häufig inapparent

53 54

„Rodentibacter spp.“

• Besiedelt alle Schleimhäute (Atem-, Urogenital-, Verdauungstrakt, Konjunktiven)

• Pathogenität: gering

• Mortalität: keine / gering

• Bei immundefizientenTieren: reduzierte Lebenserwartung durch Abszessbildung etc.

10

55

„Rodentibacter spp.“

Identifizierung und Bestimmung von Isolaten – ungenügend standardisierte Methoden zur

Identifizierung, kommerzielle Identifikations-Kits: nur bedingt brauchbar

Häufig ungenügende Übereinstimmung von Identifizierungsergebnissen zwischen Labors

Zuverlässigkeit Gesundheitszeugnisse?

Staphylococcus aureus

• Übertragung vom Menschen auf Versuchstiere (Nager) möglich

• weite Verbreitung in Labortierpopulationen

• wichtiger Eitererreger (Abszessbildung) auch bei immunkompetenten Tieren

• bei immundefizienten Tieren: Wund- und Hautinfektionen, Abszesse, nicht akzeptabel bei nude, scid, rag 56

ß-hämolysierende Streptokokken (B)

• gelegentlich lokale Abszesse und systemische Infektionen bei immunkompetenten Tieren (z. B. bei Transportstress)

• bei immundefizientenTieren: Infektionen des Genitaltrakts, systemische Infektionen, z. T. mit Todesfällen 57 58

Endoparasiten (Beispiele)

• Helminthen– Syphacia

– Aspiculuris

• Protozoen – Spironucleus muris

– Trichomonaden

59

Ektoparasiten (Beispiele)

• Milben (Maus) – Myobia musculi, Myocoptes musculinus,

Radfordia affinis, R. ensifera, Demodex sp.

• Läuse

• Flöhe

60

Vielen Dank