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1 HPLC • SMB • Osmometry Einsatz der Gelpermeationschromatographie (GPC) zur Untersuchung von Chitosanen – Möglichkeiten und Grenzen –

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HPLC • SMB • Osmometry

Einsatz der Gelpermeationschromatographie

(GPC)

zur Untersuchung von Chitosanen

– Möglichkeiten und Grenzen –

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HPLC • SMB • Osmometry

• Das Prinzip der konventionellen GPC

• GPC-Praxis und Chitosane

• Grenzen der konventionellen GPC und der GPC generell

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Das Prinzip der GPC – Trennung nach Molekülgröße

Chromatographische Methode zur Trennung von Molekülen nach Größe.

"Größe" meint hier hydrodynamisches Volumen: Die dreidimensionale Gestalt des Moleküls im verwendeten Lösungsmittel.

Wird die Bestimmung von Molmassenverteilungen und verschiedenen Molmassenmittelwerten auf Basis einer Kalibrierung mit Standardpolymeren vorgenommen, so spricht man von konventioneller GPC.

Andere Formen der GPC: GPC-Lichtstreukopplung, Einsatz der sogenannten "Universellen Kalibrierung".

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Das Prinzip der GPC – Apparativer Aufbau

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Das Prinzip der GPC – Säulen 1

Die Säulen:

• Gefüllt mit sphärischen Partikeln im unteren µm-Bereich. Häufig 5 - 10 µm.

• Die Partikel besitzen Poren.

• Zahlreiche unterschiedliche Phasen und Spezialphasen verfügbar, z. B. von

Waters, Shodex, PL, PSS. Diverse Applikationsdatenbanken.

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Das Prinzip der GPC – Säulen 2

Porenweite und Trennbereich eines typischen handelsüblichen Säulen-Sets

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Das Zylinderporenmodell

Das Prinzip der GPC – Der Trennmechanismus 1

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Das Prinzip der GPC – Der Trennmechanismus 2

Das zugängliche Porenvolumen:

Molekül > Pore Poren nicht zugänglich erster Peak (z. B. Aggregate)Elution mit dem ZwischenkornvolumenAusschlußvolumen

Molekül < Pore zugängliches Porenvolumenabhängig von der Molekülgröße Trennung nach Molekülgröße

Molekül « Pore ganzes Porenvolumen zugänglich letzter Peak (z. B. Salze)Elutionsvolumen =(Zwischenkornvolumen + Porenvolumen)Volumen totaler Permeation

Anders als bei anderen chromatographischen Methoden steht für ein gegebenes System also nur ein bestimmtes Elutions-"Fenster" für die Trennung zur Verfügung.

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Das Prinzip der GPC – Kalibrierung und unbekannte Proben 1

Die Kalibrierung

• wird mit Polymer-Standards bekannter Molmasse

durchgeführt (M oder Mpeak)

• stellt eine Beziehung zwischen Molmasse und

Elutionsvolumen her

• bildet die Basis zur Bestimmung der

Molmassenverteilung unbekannter Proben.

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Das Prinzip der GPC –Kalibrierung und unbekannte

Proben 2

Für jeden Streifen des Elugrammes der unbekannten Probe sind durch Messung bzw. Kalibrierbeziehung Konzentration und Molmasse bekannt.Damit können Verteilungen und Mittelwerte berechnet werden.

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Das Prinzip der GPC – Kalibrierung und unbekannte Proben 3

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GPC-Praxis und Chitosane – Messungen 1

Chitosan F: Molmassenverlauf mit Konzentrationspeaks

41.0x10

51.0x10

61.0x10

71.0x10

10 15 20 25 30

Mol

ar M

ass

(g/m

ol)

Time (min)

Molar Mass vs. Time F4_A__01F4_B__01F4_C__01

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GPC-Praxis und Chitosane – Messungen 2

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.0x10 4 1.0x10 5 1.0x10 6 1.0x10 7

Cum

ulat

ive

Wei

ght F

ract

ion

W

Molar Mass (g/mol)

Cumulative Molar Mass F4_A__01F4_B__01F4_C__01

Chitosan F: Kumulative Verteilung

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GPC-Praxis und Chitosane – Messungen 3

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

1.0x10 3 1.0x10 4 1.0x10 5 1.0x10 6

Diff

eren

tial W

eigh

t Fra

ctio

n

Molar Mass (g/mol)

Differential Molar Mass F4_A__01Norm = Log3rd order

Chitosan F: Differentielle Verteilung

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GPC-Praxis und Chitosane – Messungen 4

Probe Mn(g/mol) Mw (g/mol)

E, 1. Messung 109.000 210.000

E, 2. Messung 109.000 209.000

E, 3. Messung 110.000 209.000

F, 1. Messung 80.900 122.000

F, 2. Messung 78.700 121.000

F, 3. Messung 76.300 120.000

Die Chitosane E und F (aus den Vorversuchen für das UFT)

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GPC-Praxis und Chitosane – Methodenvariation 1

Einflußgröße typisch bedeutend beispielsweise für ...

Konzentration 1 mg/ml Überladung, Viskosität (Viscosity Fingering)Loop 100 µlFlußrate 1 ml/min Scherung, AuflösungTemperatur Viskosität, DiffusionpH LadungszustandPuffer Robustheit der Methodeandere Salze Unterdrückung von AdsorptionSäulen (Material, Anzahl,Porenweite, Korngröße,Abmessungen)

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GPC-Praxis und Chitosane – Methodenvariation 2

-1.0

0.0

1.0

2.0

3.0

4.0 6.0 8.0 10.0 12.0 14.0

LS, A

UX

(vol

ts)

Volume (mL)

Chromatograms HES200_A

Schultern im Signal einer HES-Probe. – Feststellen, ob diese mit einer anderen Säulenkombination erhalten bleiben.

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GPC-Praxis und Chitosane – Methodenvariation 3

Parameter Methode A Methode B Methode C Methode DKonzentration [mg/ml] 3 0,5Schleifenvolumen [µl] 20 280 100Flußrate [ml/min] 1 1 0,7 1[°C] 25 25pH sauer 2 sauer sauer

Pufferart TFA NaH2PO4 EssigsäureEssigsäure/

Natriumacetat

Pufferkonzentration 0,2 % in Wasser 0,01 M in Wasser 1 % in Wasser 0,5 M / 0,5 Mandere Salze - Art NaNO3 NaNO3 / NaClandere Salze - Konzentration 0,5 M 0,3 M / 20 g/l

Säulen - Material PSS NovemaPL Aquagel-OH

MixedPSS HEMA Bio

linear

PL Aquagel-OH oder TSKgel

GMPWxlSäulen - Anzahl 1 2 2Säulen - Porenweite [Å] 3.000 mixedSäulen - Korngröße [µm] 10 8 10Säulen - Abmessungen [mm] 8 x 300 7,5 x 300 8 x 300Standards Pullulane

Chitosan-Methoden: Sauer, mit oder ohne Salze

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Grenzen – Relativmethode 1: Beispiel HES und Dextran

31.0x10

41.0x10

51.0x10

61.0x10

4.0 6.0 8.0 10.0 12.0

Mol

ar M

ass

(g/m

ol)

Volume (mL)

Molar Mass vs. Volume HES70_ADEX80K_A

Unterschiedliches Elutionsverhalten von HES und Dextran

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Grenzen – Adsorption und Verschleppung 2

61.0x10

71.0x10

8.0 10.0 12.0 14.0

Mol

ar M

ass

(g/m

ol)

Volume (mL)

Molar Mass vs. Volume HYALURON

Verschleppung / Adsorption: Molmasse gegen Volumenmit Konzentrationssignal - Probe: Natrium-Hyaluronat

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Grenzen – Adsorption und Verschleppung 3

Chitosane - Feldflußfraktionierung (FFF)

41.0x10

51.0x10

61.0x10

71.0x10

81.0x10

91.0x10

101.0x10

10 20 30 40 50

Mol

ar M

ass

(g/m

ol)

Volume (mL)

Molar Mass vs. Volume CHITO_ACHITO_B

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GPC-Praxis und Chitosane – Probenvorbereitung 1

Das Probenhandling von der Einwaage bis zur Messung

• kann die Resultate erheblich beeinflussen

• kann die Reproduzierbarkeit erheblich beeinflussen

• kann die Probe stark verändern oder verfälschen.

Dies ist trivial, offensichtlich, jedermann bekannt, simpel ...

und doch ist das Probenhandling eine der häufigsten

Ursachen für Probleme und Widersprüche !

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GPC-Praxis und Chitosane – Probenvorbereitung 2

• Nicht rühren, nur sanft schwenken

• evtl. vorquellen lassen (ohne Salze)

• Lösung inspizieren (Lupe)

- - Gelteilchen, Fussel, Trübung ?

• evtl. nachsalzen

• Lösung inspizieren

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GPC-Praxis und Chitosane – Probenvorbereitung 3

Filtration: kann die Probe stark verändern, ist schlecht reproduzierbar.

FilterflächePorenweite

Menge des FiltratesMaterial (Adsorption)

Filtrationsgeschwindigkeitsekundärer Filtrationseffekt

Filtrationswiderstand beachten (Gele, Aggregate)

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GPC-Praxis und Chitosane – Probenvorbereitung 4

• Zentrifugation (mitunter der Filtration vorzuziehen)

• Zeitablauf der Probenvorbereitung festlegen und einhalten

• Art der Lagerung der Proben festlegen und einhalten

Chitosane: Vorquellen in Wasser oder Säure, Salze erst später

hinzufügen.

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GPC-Praxis und Chitosane – Reproduzierbarkeit 1

• regelmäßig Blanks messen• regelmäßig Standardgemisch messen• internen Standard verwenden• Drücke notieren

Probe: Zeiten, Flächen (Recovery), Peakformen, Resultate nichtreproduzierbar.

Fall 1: Standardgemisch ebenfalls unreproduzierbarPrüfen: Flußrate, Temperatur, Injektor, Standardgemisch, Säulen,Dichtigkeit, Detektor, Lösungsmittel.

Fall 2: Standardgemisch reproduzierbarPrüfen: Probenvorbereitung, Robustheit der Methode (Eluent-Säulen-Kombination), Eluent, Säulen.

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Das Prinzip der GPC – Reproduzierbarkeit 2

-0.4

0.0

0.4

0.8

1.2

10.0 12.0 14.0 16.0 18.0 20.0

LS, A

UX

(vol

ts)

Volume (mL)

Chromatograms D_1D_2D_3D_4

D1 und D2: "Chitosan F" in Essigsäure 1%ig und 0,15 M NaNO3D3 und D4: "Chitosan F" in Essigsäure 1%ig, 0,30 M NaNO3 und 20 g/l NaCl

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GPC-Praxis und Chitosane – Recovery

Bei Probenvorbereitung und Chromatographie Substanz verloren

oder "generiert"?

• Detektoren off-line kalibrieren

• Probenschleifen "nachwiegen"

• Bei Autosamplern:

Probenflaschen nachwiegen, Injektion beobachten

• Flußrate "nachwiegen"

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Grenzen – Relativmethode 2: Molmasse und hydrodynamisches Volumen

Die GPC trennt nach hydrodynamischem Volumen ("Molekülgröße in Lösung") – nicht generell nach Molmasse.

Ein kompaktes Molekül und ein gestrecktes Molekül gleicher Molmasse eluieren also bei unterschiedlichen Volumina.

Die Kalibrierung ist daher strenggenommen nur gültig,• wenn die unbekannte Probe unter den exakt gleichen Bedingungen

gemessen wird• wenn Kalibriersubstanzen und Probensubstanzen das gleiche

Polymere sind.

Leider stehen aber für viele Substanzen keine Polymerstandards zur Verfügung.

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Grenzen – Relativmethode 3: Auswege

• Oft ist die scheinbare Molmassenverteilung aussagekräftig genug(also die relativ zum Eichstandard berechnete).

• Unterschiede zwischen Proben werden trotz der Einschränkung erkannt.

• Kalibriersubstanzen "möglichst ähnlich wählen“.• Universelle Kalibrierung per Umrechnung.• Universelle Kalibrierung per Messung (Viskosimeter).• Absolutdetektoren einsetzen.

Chitosane: Häufig wird die Kalibrierung mit Pullulanen durchgeführt.

Chitosane: Unterschiedliche Deacetylierungsgrade könnten zu unterschiedlichem Elutionsverhalten führen. – Nachprüfen.

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Grenzen – Adsorption und Verschleppung 1

• Unerwünschte Wechselwirkungen zwischen Probe und stationärer Phase.

• Tailing, verspätete Elution.• Oft mit Konzentrationsdetektoren nicht erkennbar. Nachprüfen

mit Lichtstreudetektion.• Häufig gerade bei Polyelektrolyten.

Nur zu vermeiden, wenn eine geeignete Kombination von mobiler und stationärer Phase existiert und auch gefunden wird.

• Verschleppung bei Proben mit ultrahochmolekularen Anteilen, welche sich durch die Säule "quetschen“.

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