HTNCre- BC-Wahlpraktikum

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Versuchsprotokoll Proteintransduktion am Beispiel der HTNCre-Rekombinase von: Sebastian Michalski Versuchsdatum: 12. / 13.03.2015 Wahlpraktikum Biochemie

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protein transduction via HTNCre fusion protein

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  • Versuchsprotokoll

    Proteintransduktion am Beispiel der HTNCre-Rekombinase

    von: Sebastian Michalski Versuchsdatum: 12. / 13.03.2015

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    1 THEORETISCHER HINTERGRUND ..................................................................................................... 3 1.1 CRE/LOXP REKOMBINATIONSSYSTEM .................................................................................................... 3 1.2 BLAU-WEI-SELEKTION / X-GAL ........................................................................................................... 4 1.3 CV1-5B ZELLEN ....................................................................................................................................... 4 1.4 PROTEINTRANSDUKTION MITTELS HTNCRE-FUSIONSPROTEIN .......................................................... 5 2 DURCHFHRUNG .................................................................................................................................... 6 2.1 SPLITTEN DER ZELLKULTUR .................................................................................................................... 6 2.2 HTNCRE-TRANSDUKTION VON CV1-5B ............................................................................................... 6 2.3 X-GAL FRBUNG ....................................................................................................................................... 6 2.4 BESTIMMUNG DER X-GAL POSITIVEN ZELLEN PER MIKROSKOP ........................................................... 6 3 ERGEBNISSE .............................................................................................................................................. 7 4 DISKUSSION .............................................................................................................................................. 9 5 LITERATURVERZEICHNIS .................................................................................................................. 10

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    1 Theoretischer Hintergrund Ziel des Versuches ist, es die Transduktionseffizienz des HTNCre-Fusionsprotein in CV1-5B Zellen in Abhngigkeit der Konzentration von HTNCre zu untersuchen. Die Effizienz wurde ber den relativen Anteil X-Gal positiver Zellen an der totalen Zellanzahl ermittelt. 1.1 Cre/loxP Rekombinationssystem Beim Cre/loxP System handelt es sich um ein Rekombinationssystem aus dem Bakteriophagen P1 , welches eine sequenzspezifische Rekombination, zwischen zwei definierten Stellen, den sogenannten loxP Stellen ermglicht. Dabei wird je nach Orientierung der beiden loxP Stellen zueinander das flankierte Fragment durch das Protein Cre invertiert oder als circulres Fragment ausgeschnitten. Die loxP Stellen sind 34 bp lange Sequenzen , welche sich aus einer 8 bp langen asymmetrischen Core-Sequenz und zwei flankierenden 13 bp langen palindromischen Sequenzen zusammensetzen. Diese Asymmetrie sorgt fr die Mglichkeit der unterschiedlichen Orientierung. Die Rekombination an sich erfolgt durch die Flipase Aktivitt des Cre-Proteins (causes recombination). Bei gleicher Orientierung der loxP Stellen erfolgt Exzision, bei der das interne Fragment ringfrmig ausgeschnitten wird, wohingegen bei invertierter Anordnung eine Inversion des internen Fragments erfolgt. Somit lassen sich ber dieses System Gene ausschalten indem Fragmente entfernt werden, oder neue Genkonstrukte knnen an diesen Stellen eingefgt werden (Nagy, 2000).

    recombinase-mediated recombination depends on thelocation and orientation of the loxP sites. They can belocated cis or trans. In the former situation, their orien-tation can be the same or the opposite (Fig. 1B,C). In thecase of trans localization, the DNA strands involved canbe linear or circular. The outcome of the recombinationbetween loxP sites depends on the actual scenario con-cerning these variables. It could be excision or inversionof an intervening sequence in the case of cis loxP sites(Fig. 1B,C) or insertion of one DNA into another ortranslocation between two molecules (chromosomes) inthe case of trans loxP sites.ES cell and transgenic technologies quickly recog-

    nized (Gu et al., 1993) the potential in the new tool and

    started the development of complex strategies toachieve far more sophisticated genetic alterations thanhad been possible before. Now we have an enormous setof building blocks from which to select the desiredcombinations to achieve particular goals (Nagy, 1996).As far as imaginable genetic alterations are concerned,there is not too much left in the impossible category.Cre recombinase is certainly one of the key tools that

    made many of the newly developed genome alterationtechnologies possible. For in vitro recombination be-tween loxP sites in cis, excision works efficiently with-out any active selection if the Cre is transiently ex-pressed from a strong promoter (Nagy et al., 1998). Therange of excision is surprisingly large. We successfully

    FIG. 1. Cre/loxP system. (A) Close-up of Cre recombinase-mediated recombination between two 34bp loxP sites. Schematics of excision vs. integration (B) and inversion (C).

    100 NAGY

    Abb. 1: a)Struktur der loxP Stellen b)Produkt der Rekombination in Abhngigkeit der Orientierung : gleiche Orientierung fhrt zu Excision c) inverse Orientierung zu Inversion des Fragments. [Nagy,2000]

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    1.2 Blau-Wei-Selektion / X-Gal Bei der Frbung mit X-Gal wird das -Galactosidasegen als Reportergen verwendet. Exprimieren Zellen funktionsfhige -Galactosidase ist diese durch ihre Glycosidase-Aktivitt in der Lage den ursprnglich gelben Farbstoff X-Gal in 5-Brom-4-Chlor-indoxyl und Galactose zu spalten. Ersteres erscheint nach Oxidation mit Luftsauerstoff als der blaue Farbstoff 5,5'-Dibromo-4,4'-Dichloro-Indigo. So kann anhand der Blaufrbung der Zellen bestimmt werden, ob diese funktionsfhige -Galactosidase exprimiert haben.

    Abb. 2: Reaktion von X-Gal vom gelben Farbstoff zum blauen Farbstoff. 1.3 CV1-5B Zellen Bei den verwendeten CV1-5B Zellen handelt es sich um Fibroblasten aus der grnen Meerkatze, bei den ein Cre-Reportertransgen stabil transfiziert wurde (Neumann, 2015). Das integrierte Genkonstrukt enthlt folgende Komponenten: (1) SV40 Promotor (2) Neomycin-Resistenz-Gen flankiert von zwei loxP Stellen in selber Orientierung und dem (3) -Galactosidasegen mit Kernlokalisierungssequenz. Da (2) zwischen dem Promotor und (3) liegt kann -Galactosidase nur exprimiert werden, wenn das Neo-Gen durch Cre entfernt wurde. Die Aktivitt der Cre-Rekombinase wird somit indirekt ber die Expression von -Galactosidase ber die in 1.2 vorgestellte Reaktion nachgewiesen.

    Abb. 3: Reportergenkonstrukt in CV1-5B Zellen [Neumann,2015]

    NH

    HN

    O

    CH2OH

    O

    OH

    OH

    OHCl

    Br

    O

    CH2OH

    OH

    OH

    OH

    OH

    HN

    Cl

    Br

    HO

    NH

    O

    O

    Cl

    Br

    Cl

    Br

    X-Gal

    gelb blau

    -Galactosidase Ox.Materialien und Methoden zum Modulpraktikum Betreuer: Dr. Sebastian Neumann

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    1.5 VERSUCHSORGANISMEN

    1.5.1 CV1-5B-Zellen

    Bei den CV1-5B-Zellen handelt es sich um eine stabil transfizierte Fibroblasten-Zelllinie aus der grnen Meerkatze, bei der ein Cre-Reportertransgen stabil im Genom integriert ist. In die CV1-Zellen wurde ein Vektor transfiziert, der einen offenen Leserahmen (open reading frame, ORF) fr -Galactosidase aus Escherichia coli enthlt. Die -Galactosidase wird allerdings nicht exprimiert, da sich zwischen dem Promotor und dem ORF der -Galactosidase die Sequenz fr ein Neomycin-Resistenz-Gen befindet. Dieses Gen ist durch zwei loxP-Seiten flankiert, so dass es in Gegenwart aktiver Cre-Rekombinase herausge-schnitten wird und -Galactosidase exprimiert werden kann. Durch Frbung mit X-Gal knnen auf Basis der Blaufrbung die Zellen identifiziert werden, in denen die Cre-vermittelte Rekombination erfolgte. Die Angabe 5B steht fr den stabilen Klon 5B (Kellendonk et al., 1996).

    Abb. 1: Aufbau des Reportergenkonstruktes der Cre-Reporterzelllinie CV1-5B

    (Abbildung modifiziert aus Kellendonk et al., 1996)

    Die Zellen wurden freundlicherweise von Dr. Ursula Lichtenberg (Institut fr Genetik, Universitt Kln) zur Verfgung gestellt.

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    1.4 Proteintransduktion mittels HTNCre-Fusionsprotein Ziel der Proteintransduktion ist es, ein gewnschtes Konstrukt ohne virale Vektoren in die Zelle zu befrdern. Das Cre/loxP System stellt ein mchtiges Instrument fr die Mutation von Genen dar, da es einfache sequenzspezifische Rekombination ermglicht. Allerdings existiert bei der Anwendung dieses Verfahrens in Sugerzellen das Problem, dass das fr die Rekombination bentigte Cre-Protein nur sehr schlecht in die Zelle aufgenommen wird und somit die Rekombinationseffizienz zu gering ist. Durch Fusion von Cre mit viralen Importdomnen wird die Aufnahme des Proteins stark gesteigert ohne direkt virale Vektoren verwenden zu mssen. Beim verwendeten Fusionsprotein wurde N-terminal ein his-tag zur Aufreinigung, sowie die TAT-PTD-Domne aus dem HI-Virus angehngt, welche die Aufnahme in die Zelle frdert. Darber hinaus ist vor dem eigentlichen Cre-Anteil eine Kernlokalisierungssequenz eingefgt worden, sodass das Protein im Zellkern landet, in dem die Rekombination letztendlich stattfindet Abb. 4: Aufbau des HTNCre-Fusionsproteins mit TAT-PTD Importdomne und NLS (Kernimportsequenz). Das N-term. His-Tag dient zur Aufreinigung. [Neumann,2015]

    Materialien und Methoden zum Modulpraktikum Betreuer: Dr. Sebastian Neumann

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    2 ANHANG

    Abb. 2: bersicht verschiedener Cre-vermittelter Rekombinationsereignisse

    Abb. 3: Schematische Darstellung des rekombinanten Cre-Fusionsproteins HNTCre Am N-Terminus der Wildtyp-Cre-Rekombinase (Cre) befinden sich ein Histidin-tag (H6), eine TAT-PTD-Domne (TAT) und ein Kernlokalisierungssignal (NLS). (Abbildung modifiziert aus Peitz et al., 2002)

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    2 Durchfhrung 2.1 Splitten der Zellkultur Zum Splitten der Zellkultur wurden die in einer T75 Zellkulturflasche kultivierten Zellen vom berstand befreit und mittels PBS-EDTA-Trypsin (8 mL PBS, 1 ml EDTA 0,2 M, 1 mL Trypsin) Lsung von Flaschengrund getrennt. Nach Zentrifugation wurde der berstand verworfen und das Pellet in 1 mL Medium resuspendiert. Ein Aliquot wurde davon wurde wieder mit Medium in einer T75-Zellkulturflasche versetzt um somit eine neue Kultur anzusetzen. Der Rest des berstandes wurde fr die weiteren Versuche verwendet. Mittels Neubauer-Zhlkammer wurde die Zellanzahl bestimmt um das bentigte Volumen fr 5*104 Zellen pro Well zu bestimmen. 2.2 HTNCre-Transduktion von CV1-5B Fr die erfolgreiche Transduktion wurde das Medium der Zellen abgesaugt, da fr die Transduktion kein FCS vorhanden sein darf. Die HTNCre-Lsung wurde in FCS-freiem und Protease-Inhibitor haltigem Medium aufgenommen und steril filtriert. Die filtrierte Lsung wurde so verdnnt, dass HTNCre Konzentrationen von 1 M, 5 M und 10 M erhalten wurden. 500 l der jeweiligen Konzentration wurde in je zwei Wells mit Zellen zur Doppelbestimmung pipettiert. Die Zellen mussten, danach 24h inkubiert werden, was bereits vorbereitet wurde. 2.3 X-Gal Frbung Zur X-Gal Frbung wurde der berstand entfernt und die Zellen mit PBS-Puffer gewaschen. Nach Fixierung mit 4% Paraformaldehyd wurde jeweils 500 l X-Gal Frbelsung hinzugegeben und ber Nacht bei 37C inkubiert. 2.4 Bestimmung der X-Gal positiven Zellen per Mikroskop Die Zellkerne aller Zellen wurde mit DAPI angefrbt um sie unter UV-Licht am Mikroskop zhlen zu knnen. Die X-Gal positiven Zellen wurden unter normalem Licht ausgezhlt.

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    3 Ergebnisse Zur Bestimmung der Transduktionsrate wurde die Anzahl an X-Gal positiven Zellen, sowie die Gesamtzahl der Zellen fr jede HTNCre-Konzentration jeweils drei mal in unterschiedlichen Bereichen gezhlt und die Mittelwerte der beiden Anzahlen gebildet. Zur besseren Zhlbarkeit wurden die Zellkerne dazu mit DAPI angefrbt. Somit konnte unter UV-Licht die Gesamtzahl der Zellen anhand der Zellkerne ermittelt werden, wohingegen unter normalem Licht die Anzahl X-Gal positiver Zellen gezhlt wurde. Die Transduktionsrate ist dabei der Quotient aus Anzahl X-Gal positiver Zellen und der totale Zellanzahl. % = . . 100 ( 1 ) Die nchste Abbildung zeigt einen Vergleich der X-Gal positiven Zellen und der gesamten Zellanzahl mit steigender HTN-Cre Konzentration.

    Abb. 5: Vergleich der Menge an X-Gal positiven Zellen , also Zellen die Transduktion durchgefhrt haben (oben), mit Gesamtanzahl der Zellen (unten) mit steigender HTNCre Konzentration. Dabei ist deutlich zu sehen, dass mit steigender HTNCre-Konzentration immer mehr X-Gal positive Zellen zu sehen sind, wohingegen die totale Zellanzahl relativ konstant bleibt. X-Gal positive Zellen zeigen im UV-Licht lediglich eine schwchere DAPI-Frbung, was durch einen Quenching-Effekt zu erklren ist. Die Daten der Auszhlung sind in der nchsten Tabelle dargestellt.

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    Tabelle 1: Mittelwerte der Gesamtzellanzahl und X-Gal positiver Zellen mit daraus abgeleiteter Transduktionsrate inklusive Standardabweichung in Abhngigkeit der HTNCre-Konzentration. Konzentration HTNCre [M] Mittelwert Zellen gesamt Mittelwert Zellen X-Gal pos. Transduktionsrate [%] Standardabweichung [%]

    0 355,67 - - - 1 344 36 10,47 0,3 5 370,67 62,67 16,91 0,24

    10 339,33 130 38,31 1,89 Dabei steigt die Transduktionseffizienz von 10,47% bei einer HTNCre-Konzentration von 1 M ber 16,91% bei 5 M, bis auf ein Maximum von 38,31 % bei einer HTNCre-Konzentration von 10 M. In der nchsten Abbildung ist die Transduktionsrate in Abhngigkeit der HTNCre-Konzentration zur besseren Veranschaulichung noch einmal in einem Balkendiagramm mit der Standardabweichung der Transduktionsrate als Fehlerbalken dargestellt. Darber hinaus, wurde eine Regressionsgerade angefittet um das Verhltnis von Konzentration und Transduktionsrate zu beschreiben Die Abbildung zeigt auch hier den deutlichen Anstieg der Transduktionsrate, wobei die angefittete Regression am besten einen exponentiellen Anstieg beschreibt. Das Bestimmtheitsma fr die exponentielle Regressionsgerade betrgt 99,27%. Auf Grund der geringen Datenmenge, sollte dieser Befund allerdings nicht bedenkenlos hingenommen werden, sodass ein linear Zusammenhang auch mglich scheint.

    Abb. 6: Balkendiagramm der Transduktionsrate in Abhngigkeit der HTNCre-Konzentration mit Standardabweichung als Fehlerbalken. Exponentielle Regressionsgerade zur Trendbestimmung eingefgt.

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    4 Diskussion In diesem Versuch konnte gezeigt, werden dass die Proteintransduktion mit dem HTNCre-Fusionsprotein mglich ist und die Transduktionsrate direkt mit der eingesetzten Menge des Fusionsproteins zusammenhngt. Hhere Konzentration von HTNCre fhren zu grerer Transduktionsrate. Ob es sich dabei um einen linearen oder exponentiellen Zusammenhang handelt bentigt eine grere Datenlage zur Evalutation. Da es fr die Proteintransduktion Ziele in der therapeutischen Anwendung gibt, gilt es darber noch zu klren ob in humanen Zellen hnliche Transduktionsraten erreicht werden knnen. Zumindest konnte bereits eine HTNCre vermittelte Transduktion in HeLA-Zellen gezeigt werden und auch Fusionsproteine mit anderen viralen Importsystemen wie VP-22 aus Herpes-Simplex Viren zeigten erfolgreiche Transduktion (Ford, Souberbielle, Darling, & Farzaneh, 2001). Andere Versuche, mit dem selben HTNCre-Konstrukt, konnten in Abhngigkeit der Konzentration sogar 50-95% Transduktionseffizienz in verschiedenen Sugerzellen zeigen. Darber hinaus steigt die Transduktionsrate auch mit der Inkubationszeit (Peitz, Pfannkuche, Rajewsky, & Edenhofer, 2002). Ebenso konnte gezeigt werden, dass kontinuierlich hohe Cre-Expression toxisch fr embryonale Stammzellen der Maus ist, wohingegen Transduktion ber das HTNCre System normales Zellwachstum zeigte. Auch in diesem Versuch zeigte sich eine erhhte Transduktionsrate in Abhngigkeit der HTNCre-Konzentration (Peitz et al., 2007). Zusammenfassend stellt die Proteintransduktion in Zukunft mglicherweise eine Methode dar, nicht nur Proteine wie Cre in die Zelle zu transduzieren, sondern auch Chemotherapeutika oder Konstrukte fr andere therapeutische Zwecke in die Zelle zu schleusen.

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    5 Literaturverzeichnis Ford, K. G., Souberbielle, B. E., Darling, D., & Farzaneh, F. (2001). Protein transduction: an alternative to genetic intervention? Gene Therapy, 8, 14. doi:10.1038/sj.gt.3301383 Nagy, A. (2000). Cre recombinase: The universal reagent for genome tailoring. Genesis,

    26, 99109. doi:10.1002/(SICI)1526-968X(200002)26:23.0.CO;2-B Neumann, S. (2015). Proteintransduktion am Beispiel HTNCre-Rekombinase. Peitz, M., Jger, R., Patsch, C., Jger, A., Egert, A., Schorle, H., & Edenhofer, F. (2007). Enhanced purification of cell-permeant Cre and germline transmission after transduction into mouse embryonic stem cells. Genesis (New York, N.Y.: 2000), 45(8), 50817. doi:10.1002/dvg.20321 Peitz, M., Pfannkuche, K., Rajewsky, K., & Edenhofer, F. (2002). Ability of the hydrophobic FGF and basic TAT peptides to promote cellular uptake of recombinant Cre recombinase: a tool for efficient genetic engineering of mammalian genomes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 99(31), 44894494. doi:10.1073/pnas.032068699