Naunyn-Sehmiedebergs Arch. Pharmak. u. exp. Path. 259, 221--238 (1968)

Hydroxylase-Aktivit/it und H/imoprotein-Gehalt von Mikrosomen aus Kaninchenleber*

GERKARD LANGE

Pharmakologisches Insti tut der Universit~t Miinchen

Eingegangen am 2. August 1967

Hydroxylase Activity and Hemoprotein Content o/Mierosomes /rom Rabbit Liver

Summary. Using isolated mierosomes from rabbit liver the activity of the N- and p-hydroxylation of aniline and N-ethylaniline and the dealkylation of N-ethyl- aniline were compared with the optically measured concentrations of cytoehrome b 5 as well as of the compounds which were detected after reduction and addition of ethylisocyanide or CO (eytochrome P-450).

During a 19 days t reatment of rabbits with phenobarbital the cytochrome P-450, the cytochrome b 5 and the ethylisoeyanide (EIO)-compound 455 increased to a different degree.

The following parameters were increased nearly to the same extent as the eyto- chrome P-450: the EIC-eompounds 430 and 434, tile optically measured binding of aniline and the dealkylation of N-ethylaniline.

The p-hydroxylation and the optically measured binding of N-ethylaniline increased to the same extent as the EIC-compound 455.

The N-hydroxylation of N-ethylaniline was not stimulated. The N-hydroxyla- tion of aniline increased to a much greater extent than the cytochrome P-450 and the EIC-compound 455.

The p-hydroxylation of aniline increased about like the cytoehrome b 5. Never- theless the reaction rate was smaller with NADt t than with a NADPH-generating system.

These results suggest that the cytoehrome P-450 or one of the EIC-compounds are involved in the dealkylation and the p-hydroxylation of N-ethylaniline as well as in the p-hydroxylation of aniline but not in the N-hydroxylations of the two substrates.

Key Words: Enzyme stimulation - - Microsomal hydroxylases - - Microsomal hemoproteins -- Drug metabolism -- Aromatic amines.

Zusammen/assung. An isolierten Mikrosomen aus Kaninchenlebern wurde die AktivitEt der N- und p-Hydroxylierung yon Anilin and N-Athylanilin and der Dealkylierung yon N-_&thylanilin mit den optisch bestimmten Konzentrationen von Cytochrom b 5 sowie den nach Reduktion nnd Zugabe yon Athylisoeyanid bzw. CO (Cytochrom P450) erkennbaren Verbindungen verglichen.

W~hrend 19tEgiger Behandlung yon Kaninchen mit Phenobarbital nahmen der Gehalt der Mikrosomen an Cytochrom P450, Cytochrom b 5 und an der Athyliso- cyanid (AIC)-Verbindung 455 verschieden stark zu.

* Ein Teil der Ergebnisse wurde auf der 8. Frfihjahrstagung der Deutsehen Pharmakologisehen Gesellschaft in Mainz (1967) vorgetragen.

16 Naunyn-Schmicdebergs Arch. Pharmak. exp. Path., Bd. 259

222 G. LA~G~:

Ann~hernd im gleiehen Ausmal~ wie das Cytochrom P450 wurden die J~IC- Verbindungen 430 und 434, die optisch gemessene Bindung yon Anflin und die Dealkylierung yon N-Jthylanflin vermehrt.

Die p-Hydroxylierung und die optiseh gemessene Bindung yon N-Athylanilin nahmen ebenso stark zu wie die ~IC-Verbindung 455.

Die Iq-Hydroxylierung yon N-J~thylanilin wurde nieht vermehrt. Die N-Hydro- xylierung yon Anilin nahm wesentlieh starker zu als das Cytoehrom P450 und die AIC-Verbindung 455.

Die p-Hydroxylierung yon Anflin nahm ebenso stark zu wie das Cytoehrom bs. Diese Reaktion verlief abet mit NADH wesentlich langsamer als mit einem IqADPH. bildenden System.

Von den gemessenen Hydroxylierungen kSnnen demnach die Dealkylierung und die p-Hydroxylierung yon N-J~thylanilin und die p-Hydroxylierung yon Anilin yore Cytoehrom P~50 oder einer der AIC-Verbindungen abh~ngen, die N-Hydroxy]ierun- gender beiden Substrate dagegen nieht.

SchliJsselw6rter: Enzyminduktion -- Mikrosomale Hydroxylasen -- Mikroso- male H~imoproteine -- Arzneimittel-Stoffweehsel -- Arom~tisehe Amine.

Die Behandlung yon Kaninehen mit Phenobarbital steigert die iqADPH-abh~ngigen Itydroxylierungen yon Anilin und BT-J~thylanilin durch isolierte Lebermikrosomen ungleich: Die N-Hydroxylierung yon N-~thylanil in wird gar nicht und die p-Hydroxylierung yon Anilin nur wenig vermehrt ; die N-Hydroxylierung yon Ani]in und die p-Hydroxy- lierung yon ~q-~thylanflin nehmen um das Mehrfache zu (LA~G]~). Die verschiedene Indukt ion legt die Annahme nahe, dab diese Hydroxylie- rungen durch verschiedene Enzyme katalysiert werden.

Einige Untersuchungen der letzten Jahre weisen darauf kin, dab in den Mikrosomen zwei verschiedene terminale Oxydasen vorhanden sind: STAvDr~Gv,~ u. ZU~gZ¥C~ fanden zwei versehiedene Bindungskonstan- ten fiir Sauerstoff bei der mikrosomalen ~qADPH-Oxydation. I M ~ u. SATo (1966a) beschrieben zwei Maxima im DJfferenzspektrum yon Mikro- somen naeh Reduktion und Zugabe yon Athylisocyanid. Die relative I-IShe dieser beiden Maxima war abh~ngig yon der Wasserstoffionen- konzentration. Die Autoren schlossen aus ihren Untersuchungen, dab das mikrosomale Cytochrom P45o im reduzierten Zustand in zwei ineinander umwandelbaren Formen existiert, die zueinander in einem pH-abh~ngi- gen Gleichgewieht stehen, und dal3 diese beiden Formen eine versehiedene Rolle bei den Hydroxylierungs-Mechanismen spielen.

Wir haben untersueht, ob die versehiedenen Zunahmen der yon uns untersuchten Hydroxylierungen dem Gehalt der Mikrosomen an Cyto- ehrom P45o oder einer seiner beiden Formen (~thyHsoeyanid-Verbindun- gen) zugeordnet werden kSnnen. Da die Untersehiede zwisehen den Akti- vit~ten der Hydroxylierungen besonders deutlich waren, wenn die Tiere 8 Tage oder l~nger behandelt wurden, haben wir den Ablauf der Indukt ion w~hrend 19t~giger Behandlung yon Kaninchen mit Phenobarbital ver- folgt.

Hydroxylase-Aktivitgt yon Mikrosomen 223

Methoden 1. Behandlung der Tiere und Isolierung der Lebermikrosomen

M~nnliehe und weibliehe Kaninchen einer Mischrasse (mittleres Gewieht ca. 1300 g, Ern/4hrung: A1tromin K-Standardfutter ~ und Wasser) wurden bis zu 19 Ta- gen mit Phenobarbital behandelt. Die Tiere erhielten t~glich am Morgen eine Injek- tion yon 40 nag Phenobarbital-Natrium in 4 ml isotoner NaC1-L5sung/kg s.c.

Die Injektionsl6sung wurde mit HC1 auf ein pH yon etwa 7,4 gebracht. Ausgefal- lenes PhenobarbitM wurde durch Erw~rmen kurz vor der Injektion wieder gelSst. Die Kontrolltiere bekamen t~glieh 4 ml isotone NaCI-LSsung/kg s.c.

24 Std naeh der letzten Injektion wurden Mikrosomen aus der Leber isolier~ (~ethode siehe L~¢E) . Die Mikrosomenpr~par~te enthielten -- gemessen an der Enzymaktivi t /£t- ein Drittel der durch dreifaches l~ehomogenieren des 9000 X g- Niedersehlags insgesamt extrahierbaren MSkrosomen. Dieser Anteil war bei den unbehande]ten und den mit Phenobarbital behandelten Tieren gleich.

2. Messung der Aktivit~it der mikrosomalen Enzyme Die Aktivit~t der isolierten Mikrosomen wurde stets 24 Std naeh dem T6ten der

Tiere untersucht. Die Zusammensetzung der Versuchsans~tze und die Versuchs- bedingungen waren dieselben wie in der vorangehenden Arbeit (LA~cGn), jedoch betrug die Inkuba~ion der Ans~tze 20 rain.

~o]gende Reaktionen wurden gemessen:

a) die Dealkylierung yon N-_&thylanilin dutch Bestimmung des gebildeten Anflins naeh B~ODIE u. AX~L~GD, b) die p-ttydroxylierung yon N-_&thylanilin dutch Bestimmung des gebildeten N-_~thyl-p-Aminophenols nach B~oDIn u. Ax~znOD, c) die N-I-Iydroxy]iertmg yon N-Athylanflin dureh Bestimmung des gebfldeten Pheny]hydroxylamins nach It]~R u. KIESV,, d) die p-Hydroxylierung yon Anilin durch Bestimmung des gebildeten p-Aminophenols nach BRODIn u. AX~L~OD, e) die N-I-Iydroxylierung yon Anilin durch Bestimmung des gebfldeten Phenyl- hydroxylamins nach Itnn~ u. I~ESE.

Der Proteingehalt der Mikrosomenpri~parate wurde in Suspensionen gemessen, die Mikrosomea aus 0,44 g Leber/ml 0,1 m Na-Phosphatpuffer pH 7,4 enthielten (Bestimmung nach Go~c~T., B~DAW~L u. DAWD). Der Gehalt der Fri~parate an Gesamtfett wurde in Suspensionen gemessen, die Mikrosomen aus 2,2 g Leber/ml 0,1 m Na-Phosphatpuffer enthielten (Bestimmung naeh FOLCtr, LEES u. SCA~LE¥).

3. Optische Di//erenzmessungen Der Gehalt an mikrosomalen Hgmoproteinen und die Bindung yon Anilin und

N-Athylanilin an isoliel~e Mikrosomen wurden durch optische Differenzmessung bestimmt. Die Messungen wurden mit Suspensionen yon Mikrosomen aus 0,22 g Leber/ml 0,1 m Na-Phosphatpuffer (entsprechend einem Proteh~gehal~ yon 3,5 bis 7 mg/ml) durchgefiihrt. Die Aufnahme yon Differenzspektren erfolgte mit einem registrierenden Beckman-Spektralphotometer Modell DK 1, die Messungen bei bestimmten Wellenl~ngen mit eLuem Beckman-SpektrMphotometer Modell DU 2.

Die in den Abbfldun.gen angegebenen Anderungen im Gehalt an mikrosomalen tigmoproteinen und die Anderungen der Bindung von Anilin und N-J~thylanilin an isolierte Mikrosomen warden errechnet aus Extinktionsdifferenzen, die auf Mikro- somen aus 0,22 g Leber/ml Cuvetteninhalt bezogen sind. Diese Werte hasten inner- halb der Gruppen yon Mikrosomenprgparaten gleichartig behandelter Tiere eine

1 Altromin GmbH, Lage (Lippe).

16"

224 G. LA~oE:

geringere Streuung als Werte, die auf Milligramm Protein/ml Cuvetteninhalt bezo- gen wurden. Um den Vergleich mit den Werten anderer Autoren zu erleiehtern, sind in den Legenden der Abbfldungen auch die auf Milligramm Protein/ml bezogenen Werte yon Mikrosomen unbehandelter Tiere angegeben.

Cytochrom Pa5o. Die Mikrosomensuspensionen wurden mit einigen K6rnchen Dithionit reduziert und 60 see lang mit Koh]enmonoxid durehperlt. Die Extinktion (Ext.) dieser Mikrosomensuspensionen wurde im Vergleich zu Suspensionen yon Dithionit-behandelten Mikrosomen ohne CO gemessen. Die Differenz zwischen der Ext. im Maximum bei 450 m~ und der kleinsten Ext. bei 500 m~ diente a]s MaB fiir den Gehalt an Cytoehrom Pas0. Der Gehalt wurde nicht in Mol angegeben, da ein molarer Extinktionskoeffizient nicht geniigend genau bekannt ist.

.~thylisocyanid-Verbindungen. J~thylisocyanid wurde synthetisiert aus AgCN und •thy]jodid (ffa0Kso~ u. McKuslcx). Die Mikrosomensuspensionen wurden mit 1 mg Dithionit/ml 0,1 m Na-Phosphatpuffer reduziert. Die MeBcuvette enthielt die mit Dithionit behandelten Mikrosomen und 3 • 10 -8 m ~thylisocyanid (zugesetzt in ~thanolischer L6sung; i/30 des Endvolumens); die Vergleiehseuvette enthielt mit Dithionit behandelte Mikrosomen und die entsprechende Menge J~thanol. Beide Suspensionen hatten stets ein pH yon 7,2. Die Messungen warden immer beim gleiehen pH-Wert durchgeffihrt, well die relative H6he der beiden Maxima des Differenzspektrums bei 430 und 455 m~ yon der Wasserstoffionenkonzentration abh~ngig ist (I~AI u. SiTo, 1966a). Bestimmt wurden die Differenzen zwisehen der Ext. im Maximum bei 430 m~ und der Ext. bei 500 m~ und zwisehen der Ext. im Maximum bei 455 m~z und der Ext. bei 500 m~. Die dureh die beiden Maxima bei 430 und 455 m~ charakterisierten Verbindungen werden in dieser Arbeit als Athyl- isoeyanid (AlC)-Verbindungen 430 und 455 bezeichnet.

Athylisocyanid bildet auch eine Verbindung mit Mikrosomen, denen kein Di- thionit zugegeben wurde ( I ~ u. SiTo, 1966a; NlSm~iYAs]~ u. Mitarb.). Die Konzentration dieser Verbindung wurde bestimmt nach Zugabe yon 3 .10 -3m J~.thylisocyanid durch Messung der Differenz zwischen der Ext. im Maximum bei 434 m~ und der Ext. bei 500 mt~. Diese Verbindung wird in dieser Arbeit als _~IC- Verbindung 434 bezeichnet.

Gytochrom b 5. Die MeBcuvette enthielt Mikrosomen, denen einige K6rnchen Dithionit zugegeben waren, die Vergleichscuvette Mikrosomen gleieher Konzentra- tion ohne Dithionit. Die Differenz zwischen der Ext. im Maximum bei 425 m~ und der Ext. bei 500 m~ diente als MaB ffir den Gehalt der isolierten Mikrosomen an Cytoehrom b~.

Bindung yon Anilin und N-Athylanilin. Mikrosomen, die nicht mit Dithionit behandelt waren, wurde 3,7 • 10 -8 m Anilinhydroehlorid bzw. N-Athylani]inhydro- chlorid zugesetzt (wEBrige L6sung, i/30 des Endvoinmens). Die Yergleichseuvette enthielt Mikrosomen ohne Dithionit mit der entsprechenden Menge Wasser. Als MaB fiir die Bindung yon Anilin diente die Differenz zwischen der Ext. im Maximum bei 431 m~ und der Ext. bei 500 m~. Als MaB fiir die Bindung yon N-Athylanilin diente die Differenz zwischen der Ext. im Minimum bei 422 m~ und der Ext. bei 500 mtz.

Die Mikrosomensuspensionen und die Substratl6sungen wurden bis unmittelbar vor den Messungen in Eiswasser aufbewahrt. Die mit Anflin gemessene ~nderung (Ext. im Maximum bei 431 mtL) wurde sofor~ nach dem Mischen der Mikrosomen- suspensionen mit der SubstratlSsung abgelesen. Diese Anderung nahm mit der Zeit ab. Iqur die sofort abgelesene Messung hatte eine lineare Abh~ngigkeit yon der Protein- und der Anilin-Konzentration. Die mit l~-~thylanilin gemessene ~nderung (Ext. im Minimum bei 422 mt~ ) wurde 30--45 sec naeh dem Mischen der Mikro-

Hydroxylase-Aktivit~t yon Mikrosomen 225

somensusl~ensionen mit der SubstraflSsung gemessen. Diese ~_nderung nahm bis zu 45 see naeh dem Mischen zuniichs~ zu, dann wieder ab. Die 30--45 sec nach dem Misehen abgelesenen l~essungen batten eine lineare Abh~ingigkeit yon der Protein- mad der N-~-thylanilin-Konzentratiom

Ergebnisse 1. x{nderungen des Cytochromgehalts isolierter Lebermilcrosomen

von Kaninchen wShrend 19 tdigiger Behandlung mit Phenobarbital

Die _~nderungen des Cytoct~'omgehMts sind in Abb. 1 wiedergegeben. Der Gehalt an Cy~ochrom b5 wurde w~hrend der 19t/igigen Behandlung vier- bis ffinfmal vermehrt. Der Gehalt an Cytochrom Pas0 und der Gehalt an den ~thylisocaynid(~IC)-Verbindungen 430 und 434 nahmen a~cf das Acht- bis Neunfache zu. Im Gegensatz zur ~IC-Verbindung 430 stieg der Gehal~ an der ~xIC-Verbindung 455 auf das 13fache.

2. AbhSngigkeit der Extinlction in den Maxima der ~thylisocyanid- Verbindungen 430 und 455 yon der l~sser~to//ionenkonzentration

Die beiden ffir ein I-I/~moprotein ungew6hnlichen Maxima der 32IC- Verbindungen yon Dithioni~-behandelten Mikrosomen bei 430 und 455 m~ wurden zuerst yon IMAI u. SATO (i966a) besehrieben. Diese Autoren nehmen an, dag es sieh mn die optisehen Maxima von zwei Formen d e s Cytochrom P4s0 handelt, die zueinander in einem pH-abh/~ngigen GMch- geMeht stehen.

Abb.2 gibt eine AbMngigkeit der Ext . in den Maxima der XIC- Verbindungen 430 und 455 v o n d e r Wasserstoffionenkonzentration wie- der. Je niedriger die Wasserstoffionenkonzentration, desto kleiner wurde die Ext. im Maximum bei 430 m~ und um so gr613er die Ext. im Maximum bei 455 m~. Bei p t I 7,8 wax die Ext. in beiden Maxima gleich grog. Oberhalb yon pH 7,8 wurde die Ext . im Maximmn bei 455 mix grSl3er als bei 430 m~. Der Schnittpunkt der beiden Kurven lag sowohl bei Mikro- somen unbehandelter Tiere als auch bei Mikrosomen yon Tieren, welehe 8 bzw. 14 Tage mit Phenobarbital behandelt worden waren, bei pH 7,8. Die AbMngigkeit der Ext. in den Maxima der XIC-Verbindungen 430 und 455 yon der Wasserstoffionenkonzentration wurde also dureh die Vorbehandlung der Tiere mit Phenobarbital nieht verandert.

3. fltnderung der Bindung von Anilin und N-~thylanilin an i8olierte Lebermilcrosomen wShrend 19 tO~jiger Behandlung yon Kaninchen

mit Phenobarbital

Die Jmderungen der optiseh gemessenen Bindung yon Anilin und N-~thylanilin sind in Abb.3 wiedergegeben. Die durch diese beiden Substrate bedingten spektrMen ~nderungen wurden w/~hrend der Be- handlung mit Phenobarbital gr6Ber. Die mit Anilin gemessene ~-nderung

226

- - 1 5

G. LANGE :

--14

a) AIC-Verbindung /.55

--12 /'/'/ /"

/ --11 /

i

--10 ,/

, / / T ~ b) Cytochrom P450 - - 9 ~ ~ l ] c) ~jC .Verbindung 434

- - 7

i IVI 2 /

_ 1 1 I I I I 0 I 5 8 14 19 Tage

Phenobar bital.-Behandlung

Abb. 1. ~nderungen des Cytochromgehalts isolierter Lebermibrosomen yon Kan~nchen wShrend 19t~igiger Behandlung mit Phenobarbital Abszisse: Anzahl der Tage, an denen die Tiere mit 40 mg Phenobarbital-~atrium/kg s.c. behandelt wurden. Ordinate: Viel- fache der Werte yon Mikrosomen unbeh~ndelter Tiere. Kurven: a) _~thylisocyanid- Verbindung 455 (Mikrosomen nach Zug~be yon Dithionit, A Ext. 455--500 m~); b) Cytochrom Pas0 (AExt. 450--500m~); c) ~thylisocyanid-Verbindung 434 (Mikrosomen ohne Dithionit, ~Ex t . 434--500m~z); d) ~thylisocyanidverbin- dung 430 (~ikrosomen n~ch Zugabe yon Dithionit, A Ext. 430--500 m~) ; e) Cyto- chrom b~ (4 Ext. 425--500 m~z). Werte yon Mikrosomen unbehandelter Tiere (A Ext./ Mikrosomen aus 0,22 g Lebcr/ml bzw. d Ext./rag Protein/ml) : Kurve a ~ 0,096 -t- 0,008 bzw. 0,027 ± 0,004; Kurve b ~ 0,294 ~ 0,023 bzw. 0,084 -t- 0,014; Kurve c

0,143 ± 0,013 bzw. 0,041 ~- 0,008; Kurve d ~ 0,268 ~ 0,014 bzw. 0,077 4- 0,008; Kuz~e e ~ 0,237 -~ 0,010 bzw. 0,068 ~ 0,006

Ext.

&5 t

0.4

0.3

0.2 ~-

Hydroxylase-Aktivit~t yon Mikrosomen

Mikrosomen unbehandelter Tiere

1.0

~: / x - % , X ~ ~ , 455- 500 rn, u

x/ ,.,,,

x 430-500mp

i l l i l ~ , l l l l l l > 70 8.0 pH

Ext.

1.5]

Mikrosomen behcmdetter Tiere

227

\

L X~,~4~X~ ~ Ext. • X 455-500 mp

X / 430-500 m~J

~L_I [ I i ( l , l , , I ~ + 7.0 8.0 pH

Abb. 2. AbMingigkeit der Extlnktion i~ den Maxima der .~fhyllsocyanld-Verbindungen 430 und 455 yon der Wassersto//ionenkonzentration. Isolierte Lebermikrosomen yon unbehandelten Tieren und yon Tieren, welche 8 Tage mit 40 mg Phenobarbital- Natrium/kg s.c. behandelt wurden. PufferlSstmgen: 0,25 m t)hosphatpuffer (pl:[ 6,3 bis 8,0); 0,25 m Tris-Acetat-Puffer (pit 8,0--8,8). Konzentrationen: Mikrosomen

aus 0,22 g Leber/ml, Zugabe yon 1 mg Dithionit/ml; Athylisocyanid 3 • 1 0 - a m

nahm ebenso stark zu wie der Gehalt an Cytochrom P~50 bzw. wie die AIC-Verbindung 430, die mit N-Athylanilin gemessene ~_aderung im Gegensatz dazu wie die AIC-Verbindung 455 (vgl. Abb. 1).

4. AbhS~ngiglceit des durch An i l in und N-,~thylanilin bedingten optischen E//elcts von cler Wassersto//ionenlconzentration

Diese Abh~ngigkeit wurde gemessen, weil sich die optisch gemessene Bindung yon N-Athylanilin im gleichen MaSe wie die Ext. im Maximum der ~IC-Verbindung 455 i~nderte und die Ext. in diesem Maximum yon der Wasserstoffionenkonzentration abh~ngig war. Die Abh~ngigkeit des optischen Effekts yon Anihn und N-Athylanilin yon der Wasserstoff- ionenkonzentration ist in Abb. 4 wiedergegeben. Die mi~ Anilin gemessene spektrale ~nderung wurde zwischen p H 6,5 und 9,0 durch die Wasser- stoffionenkonzentration kaum beeinfluSt. Die mit N-Athylanilin gemes- sene spektrale ~nderung hat te bei p g 7,9 ein Maximum. Bei dieser Wasserstoffionenkonzentration war die Ext. in den Maxima der AIC-Ver- bindungen 430 und 455 nahezu gleich gro8 (vgl. Abb.2).

228 G. LANGE :

m 1 5

--14

--13

a) Bindung von N-Athytanitin

- -12

- -11

- -10

- - 9

- - 8

Bindung Yon b) AniUn

m?

--6

_ 1 I I I I I I 0 1 3 5 8 14 19 Toge

Phenobarbito[-Behandlung

Abb.3. ~nderung der Bindung vow Anilin und N-~thylanilln an isolierte Leber- mikrosomen wghrend 19tggiger Behandlung yon Kaninchen mit Phenobarbital. Ab- szisse: Anzahl der Tage, an denen die Tiere mit 40 mg Phenobarbi ta l - •a t r ium/kg s.c. behandel t wurden. Ordinate: Vielfache der Werte yon Mikrosomen unbehandel- ter Tiere. Kurven : a) Mikrosomen ohne Dithionit , mi t und ohne 3 , 7 . 1 0 -3 m N-~thylani l in , AExt . 422--500 mEz = M ~ ffir die Bindung yon N-Athylanil in; b) Mikrosomen ohne Dithionit, mi t und ohne 3,7 • 10 - a m Anilin, A Ext. 431- -500m~ ---- MaB fiir die Bindung yon Anflin. Werte yon Mikrosomen unbehandel ter Tiere (zJExt./Mikrosomen aus 0,22 g Leber/ml bzw. ~Ex t . /mg Protein/ml): Kurve a - - 0,027 ± 0,005 bzw. - - 0,008 ± 0,002; Kurve b : 0,039 ~ 0,002 bzw. 0,011 ±

O,OOl

Hydroxylase-Aktivit~t yon Mikrosomen 229

,1 Ext. 431- 500 m~ ANILIN

0.075

1-0'050 .

0.025 e/0---'----° "~"0 " "

! F I I 6.5 7.0 715 81,0 8.5 910

pH >

• t Ext,422,500 m/u N-,~THYLANILIN

-0.075

- °°5°eJ

-0.025

pH I 710 I I I 9"

6.5 7.5 8.0 8 5

Abb.4. AbMingigkeit des dutch Anilin und N-Athylanilin bedingten optischen E//ekts yon der Wassersto//ionenkonzentration. Isolierte Lebermikrosomen yon Tieren, welche 8 Tage mit 40 mg Phenobarbit~l-Natrium/kg s.c. behandelt wurden. PufferlSsungen: 0,2m Tris-I-IC1-Puffer (pit 6,5--8,0); 0,2m Tris-M~leat-Puffer (p]:[ 8,0--8,6). Konzentrationen: Mikrosomen aus 0,22 g Leber/ml; Anilin 3,7.10 -a m; N-Athyl-

anilin 3,7 • 10 -8 m. Schichtdicke: 2 mm

5. ,.~nderung der Dealkylierung, der p- und der IV-Hydroxylierung yon N- ~ thylanilin dutch isolierte Lebermi#rosomen wgihrend 19 t@iger Behand-

tung yon Kaninchen mit Phenobarbital

Diese J~lderungen sind in Abb. 5 dargestellt. Die N-IIydroxylierung yon N-)~thylanilin wurde w~hrend der 19t£gigen Behandlung nicht ver- mehrt. Die Dealkylierung yon IN-tithylanilin nahm etwas weniger stark zu als der Gehalt an Cytochrom Pts0 bzw. der Gehalt an den AIC-Vcr- bindungen 430 und 455, aber etwas mehr als der Gehalt an Cytochrom b 5. Die J~nderung der p-Hydroxylierung yon N-)~thy]anilin verlief fiberein- s t immend mit den Anderungen der )[IC-Verbindung 455 bzw. den Ande- rungen der optisch gemessenen Bindung yon N-~thylanilin. Das p i t - Opt imum der p-Hydroxylierung lag wie das der optisch gemessenen Bindung bei ca. pH 8,0 (Abb. 6). Durch die Behandlung der Tiere mit Phenobarbital wurde die Abh~ngig- keit der Reaktionsgeschwindigkeit yon dcrWasserstoffionenkonzentration etwas starker ausgepr~gt und die Lage des optimalen pH-Werts etwas weiter in den alk~lischen Bereich verschoben (Abb. 6). Die genaue Lage des optimalen pH-Werts konnte nicht best immt werden, da Mikrosomen oberhalb yon p H 8,6 irreversibel ver~ndert werden.

230

- - |4

--13

-12

--11

-10

- 9

- 8

- 7

N-ATHYLANI LIN

/ , /

/ /

G. LANGE :

/

/ /

/ /

Sindung p-Hydroxylferung

Cytochrom P450

Decl[kylierung

Cytochrom b 5

I I _ _ I i ,I I

0 1 3 5 8 14 19 Toge Phenobarbita[-Behandlung

Abb. 5. f~nderung der Dealbylierung, der p- und der N-Hydroxylierung yon l~-tlthyl- anilin durch isolierte Lebermibrosomen w~ihrend 19 tggiger Behandlung von Kaninchen mit Phenobarbital. Abszisse: Anzahl der Tage, an denen die Tiere mi~ 40 mg Pheno- barbital-Na~rium/kg s.c. behandelt wurden. Ordinate: Vielfache der Werte yon Mikrosomen unbehandelter Tiere. Werte yon N[ikrosomen unbehandelter Tiere: p-Hydroxylierung = 22,3 ~: 1,65.10 -a ~Iol N-Athyl-p-Aminophenol/g Leber/ 20 rain; Dealkylierung = 14,0 ± 1,28.10 -s Mol Anilin/g Leber/20 rain; N-Hydroxy- ]ierung = 5 , 0 :~ 0,38 • 10 -s NIol Phenylhydroxylamin/g Leber/20 rain. Die Kurven fiir die Anderungen im Gehalt der isolierten Mikrosomen an Cytochrom P~50 und b5 und die Zunahme der optisch gemessenen Bindung yon N-~thylanilin wurden aus

Abb.1 bzw. 3 fibernommen

6. f~nderung der p- und N-Hydroxyl ierung yon An i l in durch isolierte Lebermilcrosomen wghrend 19t~igiger Behandlung yon Kaninchen mit

Phenobarbital

Diese J~ndcrungen sind in Abb .7 wiedergegeben. Die Iq-Hydroxy- l ierung yon Ani l in n a h m wesentlich s tarker zu ~is der Gehalt der isolier-

ttydroxylase-Aktivitat yon Mikrosomen 231

2.5 Mikrosomen behandeIler Tiere

- - 2 . 0 / o / ~ e

e -I.5 /

=1.0 e / e

-0.5

- 2 . 0

pH I I 1 I ] . . . . . . . )

6.6 7.0 7.6 8.0 8.6

Mikrosomen unbehendeller Tiere

-1.5 •

-lo . / / . = - ~ t " / ~ .

-0.5

pH I I I I I --)

e.6 7.0 7r6 8.0 8.6

Abb. 6. Abhgingigkeit der p-Hydroxytierung von N-~thylanilin yon der Wassersto//- ionenkonzentration. Isolierte Lebermikrosomen yon unbehandelten Tieren und yon Tieren, welche 19 Tage mit 40 nag Phenobarbital-Natrium/kg s.c. behandelt wurden. Die Ordinate gib~ die relaHven Geschwindigkeiten der Bildung yon N-J~thyl-p- Aminophenol/Mikrosomen aus 0,11 g Leber/20 rain (Mitte]werte aus Versuchen mit 3 Mikrosomenpraparaten) an; die Geschwindigkeit bei pH 7,0 wurde gleich 1 gesetzt.

PufferlSsungen: 0,2 m Tris-Maleat-Puffer

ten Mikrosomen an Cytochromen, ni~mlich bis aufs 40fache. Die p-Hy- droxylierung v on Anilin nahm weniger stark zu als der Gehalt an Cyto- chrom P450. Die ~nderung der p-Hydroxylierung entsprach der ~_nderung im Gehalt an Cytochrom b 5 (vgl. Abb. 1).

7. Einflufl von N A D T I au/ die p-ttydroxylierung yon Ani l in

Da sich die p-Hydroxylierung fast im gleichen Ausma]~ wie der Gehalt der isolierten Mikrosomen an Cytochrom b 5 ~nderte und weft NADH der Elektronendonator ffir die l~eduktion des Cytochrom b 5 ist, wurde der Einflul~ yon NADH auf diese ~Iydroxylierungsreaktion gemes- sen (Tabel]e). Bei Anwesenheit yon NADH wurde mehr p-Aminophenol gebfldet als ohne Coenzym, jedoch wesentlich weniger als bei Anwesen- heir eines NADPH-bfldenden Systems. Die mit einem NADPH-bildenden System erreichte l%eaktionsgeschwindigkeit wurde durch NADI{ etwas vermehrt. Die NADI~-abh~ngige p-Hydroxylierung yon Anflin war --

232

40

3O 25 20 15

-14

-13

-12

-11

-10

G. LA~GE:

N-Hydroxylierung

I ~ T #,IC-Verbindung/.55

/ / ' / "

/ /

/"

t 1"

S j

Cyt ochrom P450 Bindung

Cytochrom b 5

p-Hydroxylier ung

I I I I I ] I 0 1 3 5 8 14 19 Tage

PhenoborbitaI-Behandiung Abb. 7. ~nderung tier p- und N-Hydroxylierung yon Anili~ dur~h isolierte Lebermikro- 8omen w~hrend 19t@iger Beha~lung yon Kanin~he~ mit Phenobarbital. Abszisse: Anzahl der Tage, an denen die Tiere mit 40 mg 1)henobarbi~al-Natrium/kg s.c. behandelt wurden. Ordinate: Vielfache der Werte yon Mikrosomen unbehandelter Tiere. Werte yon Mikrosomen unbehandelter Tiere: N-tIydroxylierung = 1,1 0 ,15.10 -s Mol 1)henylhydroxylamin/g Leber/20 rain; p-Itydroxylierung = 5,9 j= 0,30 • 10 -s Mol p-Aminophenol/g Leber/20 rain. Die Kurven ffir die _&nderungen im Gehalt der isolierten Mikrosomen an Cytochrom P450, Cytochrom b 5 und an der Athylisocyanid-Verbindung 455 sowie die Zunahme der optisch gemessenen Bin-

dung yon Anilin wurden aus Abb. 1 bzw. 3 fibernommea

Hydroxylase-Aktivit~t yon Mikrosomen 233

Tabetle. Einflufl yon NADH au/ die p-Hydroxylierung yon Anilin. Gemessen wurde die Bildung yon p-Aminophenol/Mi#rosomen aus 0,33 g Leber/20 rain a) bei Anwesen- heit eine8 N ADPH-bildenden Systems (siehe Methoden), b) bei A nwesenheit yon 10 -~ m N A D H und e) bei Anwesenheit eines NADPH.bildenden Systems und 10 -~ m NADH. Von allen Werten wurde die Bildung yon p-Aminophenol ohne Coenzym (nieht enzy- matisehe Hydroxylierung) abgezogen. Die Werte, wetche mit dem 2v'ADPH-bildenden Systeme gewonnen wurden, sind gleich 100°/o gesetzt; die anderen Werte wurden in

Prozent dieses Wefts (Alittelwert ~ mittterer Fehler des ~littelwerts) angegeben

NADPH- I0 -a m NADPH-bflden- bildendes NADH des System 4- System 10 -8 m NADH

Mikrosomen unbehandelter Tiere 100 Mikrosomen yon Tieren, welche 19 Tage mit Phenobarbital behandelt wurden 100

- 4

33 ~ 7,8 142 :j= 16,6

14 =[: 1,6 119 =I= 7,1

.~ . . . . . . . . . t . . . . . . . . { Protein

. . . . . _ ~ ~ { ~ re,. Lebergewich,

f I I .......... ] J 0 I 3 5 8 14 19 Tage

Phen oba rbil,a|-Behand(u ng

Abb. 8. ~4Tnderungen des relativen Lebergewiehts und des Gehalts der Mikrosomenpr~ipa. rate an Protein und Gesamt/ett w6hrend 19tiigiger Behandtung yon Kaninchen mit Phenobarbital. Abszisse: Anzahl der Tage, an denen die Tiere mit 40 mg Pheno- barbi~al-Natrium/kg s.c. behandelt wurden. Ordinate: Vielfache der Werte yon unbehandelten Tieren. Werte der unbehandelten Tiere: Relatives Lebergewicht = 3,7 ~ 0 , 4 ° des KSrpergewiehts; Gehalt der Mikrosomenpr~parate an Protein = 35,1 :t: 6,0 mg/Mikrosomen aus 2,2 g Leber/ml 0,1 m Na-Phosphatpuffer pH 7,4; Gehalt der Mikrosomenpr~parate an Gesam~fett = 7,0 ± 0,9 mg/Mikrosomen aus

2,2 g Leber/mI 0,1 m Na-Phospha~pm%er pH 7,4

gemessen an der NADPH-abh/~ngigen p - t Iydroxyl ie rung - - bei Mikro- somen behandel te r Tiere geringer als bei Mikrosomen unbehande l te r Tiere.

8. ~nderungen des relativen Lebergewichts und dez Gehalts der Mikrosomen. priiparate an Protein und Gesamt/ett wiihrend t9tiigiger Behandlung von

Kaninchen mi t Phenobarbital (Abb. 8)

Das relat ive Leborgewicht u n d der Gehal t der Mikrosomenpr/~par~te an Gesamtfe t t u n d P ro t e in / i nde r t en sich woniger s tark Ms die gemessenen

234 G. L ~ :

Hydroxylierungsreaktionen bzw. der Cytochromgehalt der isolierten Mikrosomen. Das bedeutet, dab alle angegebenen Zunahmen der Hydro- xylierungsaktivit/~t bzw, des Cytochromgehalts nicht nur eine ~imderung der Gesamtaktivitgt bzw. des Gesamtgehalts, sondern auch eine Zunahme der spezifischen Aktivitgt bzw. des spezifisehen Gehalts darstellen.

Diskussion

Wahrend 19tagiger Behandlung yon Kaninchen mit Phenobarbital nahm der Geha]t der isolierten Lebermit~rosomen an Cytochrom P450 starker zu als deren Gehalt an Cytoehrom b s. Der Gehalt an der ~IC- Verbindung 430 gnderte sich ebenso stark wie der Gehalt an Cytochrom P~50- Im Gegensatz dazu nahm die J~IC-Verbindung 455 1,Smal starker zu. Das ist iiberraschend, weft bei Mikrosomen unbehandelter Kaninchen sowohl die Ext . im Maximum der ~IC-Verbindung 430 als auch die Ext. im Maximum der ~IC-Verbindung 455 dem Gehalt an Cytoehrom P450 direkt proportional ist (NISHI~AYASHI U. Mitarb.). Da bei den mit Pheno- barbital behandelten Tieren keine direkte Proportionalitgt zwischen der Ext. im Maximum der ~IC-Verbindung 455 und dem Gehalt an Cytochrom P4s0 mehr vorhanden war, muB man annehmen, dab wghrend der Be- handlung entweder ein anderes Hgmoprotein gebildet wurde oder da~ sieh die Eigensehaften eines Hgmoproteins gnderten.

SLAD~K U. MA~]~an~G erhoben einen ghnlichen Befund an Ratten. Sie untersuehten die I~-Demethylierung yon 3-Methyl-4-Monomethyl- aminoazobenzol dutch isolierte Lebermikrosomen unbehandelter und mit Methyleholanthren behandelter Tiere. Sie fanden, dal3 die Demethylie- rung dureh die Behandlung mit Methyleholanthren nieht im gleichen Verhgltnis zunahm wit die Ext. im Absorptionsmaximum 455 m~ naeh Reduktion und Zugabe yon :4thylisocyanid. DiG Ext. im Maximum der AIC-Verbindung 430 dieser Ratten-Lebermikrosomen nahm dureh die Behandiung mit Methylcholanthren iiberhaupt nicht zu. Diese J~_uderung wird yon den Autoren als Bfldung eines neuen Hgmoproteins bzw. die Zustandsgnderung eines mikrosomalen Hgmoproteins gedeute~.

Die in dieser Arbeit an Kaninchen-Lebermikrosomen erhobenen Befunde sprechen mehr fiir eine Zustandsgnderung als ffir die Bfldung eines neuen Hgmoproteins. Die Abhgngigkeit der relativen HShe der ~thylisocyanid-Maxima bei 430 und 455 m~ yon der Wasserstoffionen- konzentration wurde -- im Gegensatz zu den Befunden yon SLAD~,K U. MA~NE~r~G an Rat ten -- bei Kaninehen-Lebermikrosomen dureh Be- handiung der Tiere mit Phenobarbital nicht vergndert.

Die Ext. in den Maxima der iiIC-Verbindungen 430 und 455 war bei pH 7,8 gleich groB. Dieser Befund steht im Gegensatz zu den Ergebnissen yon IM~ u. 8ATO (1966a), die gleiche Ext. bei p t I 7,4 fanden. D~ in dieser

Hydroxylase-Aktivit~t yon Mikrosomen 235

Arbeit die gleiehen Puffer in der gleiehen Konzentration verwendet

wurden wie yon IMAI u. SATO kann diese Differenz nur durch versehiedene

Eigensehaften der verwendeten Kaninehen und verschiedene Pr/~paration der Lebermikrosomen erklart werden.

•thylisoeyanid bildet mit Mikrosomen nieht nur eine Verbindung naeh Zugabe yon Dithionit, sondern aueh ohne Dithionit, wobei sieh ebenfalls die spektralen Eigensehaften andern (NIs~IIBAYASltI u. Mitarb.). Die Ext. im Maximum dieser ~IC-Verbindung 434 nahm ebenso stark zu wie der Gehalt an Cytochrom P450- Dieses Ergebnis steht in Einklang zu dem Befund yon NISI~IBAYAS~I, O~Vl~A u. SATo, da~ ~thylisoeyanid unter aeroben Bedingungen an die oxydierte Form des Cytochrom P4s0 gebtm- den wird.

Die beiden Substrate Anilin und N-J~thyl~nflin reagieren ebenfalls mit Mikrosomen, denen kein Dithionit zugegeben wurde, unter ~nderung der spektralen Eigensehaften, und es gibt Hinweise daf/ir, dal3 es sich bei derartigen ~mderungen um eine Bindung der Substr~te an mikrosomale Cytoehrome handelt (I~AI U. SAGO, 1966b) : Anilin reagiert nieht nur mit isolierten Mikrosomen, sondern aneh mit teilweise gereinigtem Cyto- chrom P420, wobei die gleiehen spektralen ~nderungen auftreten. Die mit Anilin gemessene ~nderung ist proportional dem Gehalt der isolierten Mikrosomen an Cytoehrom P4s0- Sie kann dureh -4thylisocyanid vermin- dert werden, das um das oxydierte Pigment aerober Mikrosomen konkur- riert. SehlieBlieh hat die optiseh gemessene Bindungskonstante (Ks) fiir Anilin die gleiche GrSl3enordnung wie die Michaelis-Konstante (KM) der p-Hydroxylierung yon Anilin. Diese Ubereinstimmung wurde jedoeh nur bei Kaninehen-Lebermikrosomen gefunden, nieht bei l~atten-Leber- inikrosomen (ScHENKMAN, R ] ~ E l a u. ESTABI~OOK).

N-~4thylanilin bewirkt eine andere spektrale Anderung als Anilin. Anilin reagiert unter Bfldung eines Maximums bei 431 m~, N-~thylanilin unter Bildung eines Minimums bei 422 rag. Der mit N-J~thylanilin be- obaehtete Effekt entsprieht demnaeh dem sogenannten ,,tIexobarbital- Typ" der dureh Zugabe yon Substraten bedingten spektralen ~nderun- gen (SCI~NKMA~ ~ U. Mitarb. ; I~AI u. SATO, 1966b; McLeAn).

Die mit Anilin gemessene J~nderung nahm ebenso stark zu wie der Gehal~ der isolierten Mikrosomen an Cytochrom Paso. Die Gr6Be des durch Anflin bedingten optischen Effekts war zwisehen pI-I 6,5 und 9,0 unabhangig yon der Wasserstoffionenkonzentration. Beide Befunde spreehen dafiir, dab Anflin an das Cytoehrom P~5o gebunden wird, denn aueh die Ext. im Maximum 450 m~ naeh Reduktion und Zugabe yon CO ist in diesem pH-Bereich weitgehend unabhangig yon der Wasserstoff- ionenkonzentration (IMAI u. SATO, 1966a).

Die mit N-Athylanilin gemessene ~mderung nahm dagegen starker zu als der Gehalt der isolierten Mikrosomen an Cytoehrom Paso; sie nahm zu

236 G. LANCE:

wie die AIC-Verbindung 455. Die Ext. im Maximum dieser J~IC-Verbin- dung war abh~ngig yon der Wasserstoffionenkonzentration; die optisch gemessene Bindung yon N-J~thylanilin an isolierte Lebermikrosomen war es ebenfalls. Allerdings lag das Optimum der Bindung nicht in einem Bereich der Wasserstoffionenkonzentration, bei der die Ext. im Maximum der ~IC-Verbindung 455 grSl]er war als die Ext. im Maximum der ~IC- Verbindung 430, sondern bei p H 7,9, d.h. bei einer Wasserstoffionen- konzentration, bei der die Ext. in beiden Maxima nahezu gleich grofi war. Dieses pH-Opt imum st immte ann~hernd iiberein mit dem p i t -Opt imum der p-Hydroxylierung yon N-~thylanilin, die w~hrend der Behandlung mit Phenobarbital ebenso stark zunahm wie die J~IC-Verbindung 455 bzw. wie die optisch gemessene Bindung yon N-~thy]anilin.

Eine i~hnliche pIt-Abh~ngigkeit wie die des optischen Effekts yon N-J~thyl- anilin wurde mit isolierten Kaninchen-Lebermikrosomen auch bei anderen Substra~- Effekten vom ,,Hexobarbital-Typ" (Hexobarbital, Phenacetin) gefunden, w~hrend Substrat-Effekte vom ,,Anflin-Typ" (Phenobarbital, Aminopyrin, Nicotins~ure- amid, Athylisocyanid) wie der Effekt yon Anilin keine ptt-Abh~ngigkeit zeigten (unverSffentlichte Versuche).

Von den gemessenen Hydroxylierungen ~nderte sich die N-Hydroxy- lierung yon Anih'n w~hrend der 19 t~gigen Behandlung mit Phenobarbital wesentlich st£rker als der Geha]t der isolierten Mikrosomen an den ge- messenen Cytochromen, w~hrend die N-Hydroxy]ierung yon N-Athyl- anilin nicht vermehrt wurde. Diese beiden N-Hydroxylierungsreaktionen sind wahrscheinlich nicht yon den mikrosomalen Cytochromen abh~ngig. Beide Re~ktionen sind auch nicht dutch CO hemmbar (KI]~SE).

~ i T Z u. STAU])I~G~ fanden bei einer dutch CO hemmbaren Reaktion keine Ubereinstimmung zwischen Enzymaktivit~t und Cytochrom Paso. Diese Autoren verglichen die ~nderungen der Cumarin-Hydroxylierung durch isolierte Leber- mikrosomen mit deren Gehal~ an Cytochrom P~0 nach 6t~igiger Behandlmlg yon Kaninchen mit Phenobarbital. Sie fanden keine Zunahme der spezifischen Cumarin- tIydroxylierung, obwohl der spezifische Gehalt an Cytochrom P450 auf das Doppelte anstieg.

Die Dealkylierung yon N-J~thylanilin und die p-Hydroxylierung yon Anflin nahmen etwas weniger stark zu als der Gehalt der isolierten Mikro- somen an Cytochrom Paso. Diese Reaktionen kSnnen yore Cytochrom P450 abh~ngen, insbesondere wenn das gesamte Cytochrom P45o nicht allen mikrosomalen Hydroxylasen als gemeinsame terminale Oxydase dient, sondern kompart imentier t ist, so dal] zu verschiedenen Enzymen immer nut ein Teil des gesamten Cytochrom P450 gehSrt.

Eine Beteiligung yon Cytochrom b 5 an den in dieser Arbeit gemesse- hen mikrosomalen Hydroxylierungen ist wenig wahrscheinlich. Ledig- lich die p-Hydroxylierung yon Anflin nahm etwas weniger stark zu als das Cytochrom bs, k6nnte ~lso durch dieses limitiert werden. Diese Reaktion verlicf abet mit NADH wesentlich langsamer als mit einem

Hydroxylase-Aktivit~it yon Mikrosomen 237

N A D P H - b i l d e n d e n Sys tem. Al lerdings konn te die Reakt ionsgeschwindig- ke i t bei gleiehzei t iger Anwesenhe i t eines N A D P H - b i l d e n d e n Sys tems du tch N A D H etwas e rh6ht werden. Dieser Befund en t sp r i eh t den Ergeb- nissen yon NrLsso~¢ u. JOHNSON, welehe bei der Un te r suehung der O-De- methy l i e rung , p - H y d r o x y l i e r u n g und N-Deme thy l i e rung du tch Leber- mik rosomen yon R a t t e n und M/~usen max ima le Reakt ionsgesehwindig- ke i t en bei g le iehzei t igem Zusatz yon N A D P H und N A D H fanden.

Die p - H y d r o x y l i e r u n g yon N - ~ t h y l a n i l i n , welehe sich w/ihrend der Behand lung mi t P h e n o b a r b i t a l wie der Geha l t an der AIC-Verb indung 455 bzw. wie die opt i seh gemessene B indung yon N-~ thy lan i l i n /~nde r t e , kSnnte schlieglich m i t einer besonderen Zus t ands fo rm des Cytoehrom P450 zusammenh~ngen , welche durch das M a x i m u m bei 455 m~ naeh Reduk- t ion und Zugabe yon J~thyl isoeyanid eha rak te r i s i e r t ist.

Alle Befunde s t f i tzen die Armahme, dag die p- und die N - H y d r o x y - l ierungen yon Ani l in u n d N-J~thylanfl in dureh verschiedene E n z y m e k a t a l y s i e r t werden (vgl. Kiv~sw; LANCe,).

Frl. ROSE~IXRIE KESER, Frl. EVELYN I{IIWERTZ und Herrn cand. med. FRANK KROBER danke ich fiir ihre Mitarbeit.

L i t e ra tu r BRODIE, B.B., and J. AXELROD: The estimation of acetanilide and its meta-

bolic products, aniline, N-aeetyl-p-aminophenol and p-aminophenol (free and total conjugated) in biological fluids and tissues. J. Pharmaeol. exp. Ther. 94, 22 (1948).

FOLCH, J., M. LEES, and G. H. S. STANL]~Y: A simple method for the isolation and purification of total lipids from animal tissue. J. biol. Chem. 226, 497 (1957).

GO~NALL, A. G., C.J.B.~DAWm~, and M. M. DAVID : Determination of serum proteins by means of the biuret reaction. J. biol. Chem. 177, 751 (1949).

tIER~,F., U. M. KIESm Bestimmung yon Nitrosobenzol im Blute. Naunyn- Schmiedebergs Arch. exp. Path. Pharmak. 287, 319 (1959).

IMAI, Y., and R. SATe: Evidence for two forms of P-450 hemoprotein in micro- somM membranes. Biochem. biophys. Res. Commun. 28, 5 (19669).

-- - - Substrate interaction with hydroxylase system in liver micresomes. Bio- chem. biophys. Res. Commun. 22, 620 (1966b).

JACXSON, H. L., and B. C. ~V[cKuslCK: In: Organic Syntheses, ed. by T. L. CL.~NS, Vol. 35, p. 62. New York: John Wiley and Sons, Inc. 1955.

KrESE, M. : The biochemical production of ferrihemoglobin-forming derivates from aromatic amines, and mechanisms of ferrihemoglobin formation. Pharmacol. Rev. 18, i091 (1966).

KRATz, F., u. HJ. STAU])X~¢]m: Zur Frage der Induzierbarkeit mikrosomMer Enzyme am Beispiel tier Cumarinhydroxylierung in der Kaninehenleber. Hoppe- Seylers Z. physiol. Chem. 848, 568 (1967).

LANCE, G.: Versehiedene Induktion der mikrosomalen N- und p-Hydroxylierung yon Anilin und N-~_thylanilin bei Kaninehen. Naunyn-Schmiedebergs Arch. Pharmak. exp. Path. 257, 230 (1967).

McLEAN, A. E. M. : Effect of halogenated hydrocarbons on mierosomal cytoehrome (P-450). Biochem. J. 108, 13P (1967).

17 Naunyn-Schmiedebergs Arch. Pharmak. exp. Path., Bd. 259

238 G. LANG.: Hydroxylase-Aktivit~t yon Mikrosomen

N~sso~, A., and B. C. Jon-~soN: Cofactor requirements of the O-demethylating liver microsomal enzyme system. Arch. Biochem. 101, 494 (1963).

NIsm~xYAs~, It., T. OMVRA, and R. SATO: The binding of the ethyl isoeyanide by hepatic microsomal hemoprotein. Biochim. biophys. Aeta (Amst.) 118, 651 (1966).

Sc~x~L~¢ , J. B., H. REM~ER, and R. W. ES~ABROOX: Spectral studies of drug interaction with hepatic microsomal cytochrome. Mol. Pharmacol. 8, 113 (1967).

Sr~A])Ex, N. E., and G. g. MAN~E~ING: Evidence for a new P-450 hemoprotein in hepatic microsomes from methylcholanthrene treated rats. Biochem. biophys. Res. Commun. 24, 668 (1966).

STAUDINGER, I-L, U. Z. ZUBRZYC:KX : Zur Kinetik der mikrosomalen NADPH-Oxyda- tion bei verschiedenen Sauerstoffdrucken. Hoppe-Seylers Z. physiol. Chem. 840, 191 (1965).

Priv.-Doz. Dr. G. LANGE Pharmakologischeslnstitut derUniversit~t 8000 Mfinehen 15 NullbaumstraBe 26