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Identifizierung und Analyse der Protonenpumpe ChPma2 als Pathogenitätsfaktor der Interaktion
zwischen Colletotrichum higginsianum und Arabidopsis thaliana
Der Naturwissenschaftlichen Fakultät der Friedrich-Alexander Universität Erlangen-Nürnberg
zur Erlangung des Doktorgrades Dr. rer. nat.
vorgelegt von
Martin Korn aus Annaberg-Buchholz
Als Dissertation genehmigt
von der Naturwissenschaftlichen Fakultät
der Friedrich-Alexander Universität Erlangen-Nürnberg
Tag der mündlichen Prüfung: 1.4.2016
Vorsitzender des Promotionsorgans: Prof. Dr. Jörn Wilms
Gutachter/in: Prof. Dr. Christian Koch
PD Dr. Ruth Stadler
Teile dieser Arbeit sind in folgender Publikation enthalten:
Korn M, Schmidpeter J, Dahl M, Müller S, Voll LM, Koch, C. (2015) A Genetic Screen for Pathogenicity Genes in the Hemibiotrophic Fungus Colletotrichum higginsianum Identifies the Plasma Membrane Proton Pump Pma2 Required for Host Penetration.PLoS ONE 10(5): e0125960. doi:10.1371/journal.pone.0125960
Inhaltsverzeichnis
Zusammenfassung .............................................................................................................. 1
Summary .............................................................................................................................. 3
1. Einleitung ......................................................................................................................... 5
1.1. Pilze als Phytopathogene ......................................................................................... 5
1.1.1 Die Gattung Colletotrichum ist auf eine hemibiotrophe Ernährungsstrategie spezialisiert .................................................................................................................... 7
1.1.2 Colletotrichum higginsianum als Modellorganismus für hemibiotrophe Phytopathogene ............................................................................................................. 8
1.1.3 Colletotrichum sp. bilden mit Appressorien spezialisierte Infektionsstrukturen aus 9
1.1.4 Penetration der Wirtszelle und Etablierung der biotrophen Phase ........................11
1.1.5 Nekrotrophe Phase ...............................................................................................13
1.2. Pathogen-Wirts-interaktionen .................................................................................14
1.2.1 Pathogene werden durch konservierte Muster erkannt welche eine Immunantwort auslösen ........................................................................................................................14
1.2.2 Effektoren als Unterdrücker der Immunantwort .....................................................15
1.2.3. Effektor-induzierte Immunantwort ........................................................................16
1.3. Membrangebundene Transportproteine .................................................................17
1.3.1 P-Typ-ATPasen ....................................................................................................17
1.3.2 Die Plasmamembran-gebundene Protonenpumpe ...............................................20
1.4. Ziel dieser Arbeit ......................................................................................................21
2. Resultate .........................................................................................................................22
2.1 Etablierung eines Systems für homologe Rekombination in Colletotrichum higginsianum ..................................................................................................................22
2.1.1 Identifizierung von ChKu80 ...................................................................................23
2.1.2 Etablierung der Nourseothricin-Resistenz als Selektionsmarker für die Transformation von C. higginsianum .............................................................................25
2.1.3 Generierung und Selektion von ΔChku80 Knockout Stämmen .............................26
2.1.4 Der ΔChku80 Stamm CY6021 zeigt im Vergleich zum Wildtyp keine phänotypischen Veränderungen ....................................................................................32
2.2 Identifizierung potentieller LysM-Effektorproteine von C. higginsianum und Untersuchung ihrer Bedeutung für die Infektion von A. thaliana ................................34
2.2.1 Identifizierung von Proteinen mit LysM-Domänen in C. higginsianum ...................36
2.2.2 Untersuchung der Expression und Lokalisation von ChCih1 und ChCih2 .............39
2.2.3 C. higginsianum LysM-Proteine ChCih1, ChCih2 und ChLysM3 sind für die Infektion von A. thaliana nicht erforderlich .....................................................................45
2.3 Identifikation von C. higginsianum Pathogenitätsfaktoren mittels Insertionsmutagenese ....................................................................................................55
2.3.1 Herstellung von C. higginsianum T-DNA Insertionsmutanten und Identifikation von C. higginsianum Pathogenitätsmutanten (vir-Mutanten) ................................................55
2.3.2 Analyse der T-DNA Insertionen ausgewählter C. higginsianum vir-Mutanten .......57
2.3.3 Identifikation von T-DNA Insertionsstellen von C. higginsianum vir-Mutanten mittels Genome Walking PCRs .................................................................................................62
vir-23 .........................................................................................................................64
vir-41 .........................................................................................................................65
vir-51 .........................................................................................................................67
vir-52 .........................................................................................................................68
vir-53 .........................................................................................................................70
vir-56 .........................................................................................................................71
vir-70 .........................................................................................................................72
vir-72 .........................................................................................................................73
vir-73 .........................................................................................................................73
2.3.4 Multiple vir-Mutanten haben eine T-DNA Insertion im Lokus von ChPMA2 ...........74
2.4 Die Rolle von Plasmamembran gebundenen H+-transportierenden ATPasen für die Pathogenität von C. higginsianum ..........................................................................76
2.4.1 C. higginsianum kodiert mit ChPMA1 und ChPMA2 für zwei H+-transportierende P-type ATPasen ............................................................................................................76
2.4.2 Ein Deletion von ChPMA1 war nicht möglich, während die Deletion von ChPMA2 den Verlust der Pathogenität zur Folge hat....................................................................78
2.4.3 Der Verlust von ChPMA2 korreliert mit einer verringerten pflanzlichen Abwehr von A. thaliana .....................................................................................................................82
2.4.4 ChPMA2 ist für die Appressorienbildung von C. higginsianum nicht erforderlich ..85
2.4.5 Verwertung von Kohlenstoffquellen durch ΔChPma2-Mutanten ............................88
2.4.5.1 Glukoseaufnahme von Appressorien .............................................................88
2.4.5.2 Vegetatives Wachstum in Abhängigkeit verschiedener Kohlenstoffquellen ....90
2.4.5.3 Die Katabolitrepression von C. higginsianum ist in unabhängig von ChPMA2 91
2.4.6 Expressionsanalysen von ChPMA1 und ChPMA2 ................................................93
2.4.6.1 PCR-Analysen der Expression von ChPMA1 und ChPMA2 ...........................94
2.4.6.2 Analyse der Expression von ChPMA1 und ChPMA2 mittels Reportergenen ..99
2.4.6.3 Lokalisierung von ChPma1 und ChPma2 ..................................................... 102
2.4.7 Komplementation und Suppression des Pathogenitätsphänotyps von ChPMA2 T-DNA Insertionsmutanten ............................................................................................. 111
2.4.7.1 Die ektopische Expression von ChPMA2 komplementiert den Pathogenitätsdefekt der ChPMA2 T-DNA Insertionsmutanten vir-22 und vir-24 ....... 111
2.4.7.2 Die Expression von ChPMA1 kann den Pathogenitätsdefekt von Insertionsmutanten nur teilweise supprimieren ........................................................ 113
3. Diskussion .................................................................................................................... 118
3.1 Etablierung eines Gene Targeting Systems in C. higginsianum ......................... 118
3.2 Die Rolle von Proteinen mit LysM-Domänen für die Pathogenität von C. higginsianum ................................................................................................................ 120
3.3 Die Rolle von H+-ATPasen für die Pathogenität von C. higginsianum ................ 123
3.3.1 Der ChPMA2 Lokus ist ein potentieller „Hot Spot“ für T-DNA Insertionen ........... 123
3.3.2 Wie wird die Expression von ChPMA1 und ChPMA2 reguliert? .......................... 124
3.3.3 Wird die Proteinaktivität von ChPma1 und ChPma2 unterschiedlich reguliert? ... 125
3.3.4 Was ist die Funktion von ChPma2? .................................................................... 126
3.3.5 Die Entwicklung von verschiedenen Isoformen von H+-ATPasen stellt ein mögliche konservierte Strategie pathogener Pilze dar ................................................................ 128
3.4 Ausblick ................................................................................................................... 130
4. Material und Methoden................................................................................................. 131
4.1 Organismen ............................................................................................................. 131
4.2 Verwendete Plasmide und Oligonukleotide .......................................................... 133
4.3 Enzyme .................................................................................................................... 138
4.4 DNA-Leiter ............................................................................................................... 139
4.5 Verwendete Kits ...................................................................................................... 139
4.6 Puffer, Lösungen und Kulturmedien ..................................................................... 139
4.7 Antibiotika ............................................................................................................... 142
4.8 Methoden ................................................................................................................. 143
4.8.1 Anzuchtbedingungen .......................................................................................... 143
4.8.2 Isolationen von Nukleinsäuren ............................................................................ 144
4.8.3 Transformationen ............................................................................................... 144
4.8.4 Infektion von A. thaliana mit C. higginsianum ..................................................... 145
4.8.5 Histochemische Färbungen und Mikroskopie ..................................................... 146
4.8.6 PCR-Techniken .................................................................................................. 147
Literaturverzeichnis ......................................................................................................... 150
Abbildungsverzeichnis .................................................................................................... 167
Tabellenverzeichnis ......................................................................................................... 170
Abkürzungsverzeichnis ................................................................................................... 171
1
Zusammenfassung
Colletotrichum higginsianum ist ein hemibiotropher, phytopathogener Pilz aus der Abteilung
der Schlauchpilze, welcher in der Lage ist, mit der Modellpflanze Arabidopsis thaliana
kompatible Interaktionen einzugehen. Der Infektionzyklus von C. higginsianum auf A.
thaliana beginnt, wenn der Pilz die pflanzliche Epidermis mittels spezialisierten Appresorien
penetriert. C. higginsianum bildet anschließend intrazelluläre biotrophe Hyphen aus. Nach
einer initialen biotrophen Phase geht der Pilz zu nekrotrophem Wachstum über und tötet
aktiv Wirtszellen ab. Sekundäre Hyphen werden gebildet, welche sich von abgetöteten
Zellen des Wirtes ernähren.
In dieser Arbeit konnte mit der Herstellung von Non-homologous end joining-defizienten
ΔChku80 Stämmen ein effizientes System für Knockout und Genmodifikationen etabliert
werden. Dieses System wurde verwendet, um die Rolle von potentiellen Pathogeniniäts-
Genen zu untersuchen, die zum einen in einem Vorwärts-genetischen Screen oder zum
anderen aufgrund von Homologie zu beschriebenen Effektor-Proteinen identifiziert wurden.
In der verfügbaren Genomsequenz von C. higginsianum wurden 11 Proteine mit
vorhergesagten LysM-Domänen identifiziert. Für Zwei Proteine (ChCih1 und ChCih2) mit der
größten Ähnlichkeit zu bekannten LysM-Effektorproteinen wurden Knockoutstämme
hergestellt, welche auf ihre Pathogenität hin überprüft wurden. Dabei zeigte sich, dass
ChCih1 und ChCih2 für die Infektion von A. thaliana nicht erforderlich sind. Für diese
potentiellen C. higginsianum LysM-Effektoren konnte somit, im Gegensatz zu anderen
Pathosystemen, keine Virulenzfunktion nachgewiesen werden.
Im Rahmen dieser Arbeit konnten T-DNA Insertionsorte von 14 Mutanten mit reduzierter
Pathogenität identifiziert werden. Für fünf dieser vir-Mutanten konnte die T-DNA Insertion im
Lokus der P-Type H+-ATPase ChPma2 nachgewiesen werden. Vir-Mutanten mit einer T-
DNA Insertion im ORF von ChPMA2 und Deletionsstämme von ChPMA2 bilden
Appressorien, zeigen aber einen vollständigen Arrest der Infektion von A. thaliana während
der Penetration. Zusätzlich zeigen Chpma2-Mutanten keinen Wachstumsphänotyp. Die
Expression von ChPMA2 ist in Konidien sehr schwach und wird während der
Appressorienbildung induziert. C. higginsianum besitzt mit ChPma1 eine zweite H+-ATPase,
welche sich in ihrem Expressionsmuster sehr stark von ChPMA2 unterscheidet. ChPMA1
weist in allen untersuchten Stadien hohe Expressionswerte auf und stellt vermutlich die
Hauptprotonenpumpe von C. higginsianum dar. Mittels in Lokus Reportergenfusionen beider
Proteine konnte gezeigt werden, dass ChPma1-GFP in Appressorien nicht nachweisbar ist.
2
Somit ist der Protonentransport in diesem spezialisierten Zelltyp von der Aktivität von
ChPma2 abhängig. Die Suppression des Pathogenitätsphänotyps von ChPMA2 T-DNA
Insertionsmutanten durch eine ektopische Expression von ChPMA1 unter der Kontrolle eines
ChPMA2 Promotorfragmentes war nicht erfolgreich, weswegen sich beide Protonenpumpen
vermutlich nicht nur in ihrer Expression, sondern auch in der Regulation der Proteinaktivität
unterscheiden. Entsprechende Unterschiede in möglichen regulatorischen Sequenzen von
ChPma1 und ChPma2 konnten in den Proteinsequenzen vorhergesagt werden. Das
Vorhandensein von ChPma2-ähnlichen Protonenpumpen in weiteren phytopathogenen
Pilzen deutet zudem auf eine konservierte Rolle dieser spezialisierten Form von H+-ATPasen
für die Pathogenität hin. Die Bestimmung von T-DNA Insertionsorten von weiteren vir-
Mutanten bildet die Basis für weiterführende Analysen dieser identifizierten potentiellen
Pathogenitätsfaktoren.
3
Summary
Colletotrichum higginsianum is an ascomycete hemibiotrophic plant pathogen which forms
compatible interactions with the model plant Arabidopsis thaliana. The infection process of A.
thaliana by C. higginsianum is initiated when the fungus breaches the host epidermis with a
specialized appressorium. C. higginsianum then forms intracellular biotrophic hyphae. After
the short initial biotrophic phase, during which the host cell remains alive, the fungus
switches to necrotrophic growth and actively host cells. Secondary hyphae are formed which
feed on dead host tissue.
In this thesis, an efficient system for targeted gene knockouts and gene modifications was
established by generating Non-homologous end joining-deficient ΔChku80 C. higginsianum
strains. This system was used to investigate the role of potential pathogenicity genes, which
were identified in a forward genetic screen for pathogenicity mutants or by analyzing
candidate effector genes.
The available genome of C. higginsianum encodes for 11 proteins with predicted LysM-
domains. Two of these proteins (ChCih1 and ChCIh2) show high similarity to known LysM-
effector proteins. Corresponding knockout mutants were created and checked for
pathogenicity on A. thaliana. Evaluation of infected plants showed that both ChCih1 and
ChCih2 are not required for pathogenicity. In contrast to results in other pathosystems, no
virulence function for these potential effector proteins could be verified.
The T-DNA insertion sites of 14 vir-mutants could be identified in this thesis. Five of these
mutants carry a T-DNA insertion in the locus of a P-Type H+-ATPase named ChPma2. Vir-
mutants with the T-DNA insertion in the ORF of ChPMA2 and ΔChPma2 deletion mutants
form appressoria but showed a complete arrest of the infection of A. thaliana during
penetration. In Addition Chpma2-mutants exhibit no growth phenotype when propagated on
agar plates. Expression of ChPMA2 is very week in conidia but becomes highly induced
upon appressoria formation. The genome of C. higginsianum encodes with ChPma1 for a
second H+-ATPase which is differently expressed compared to ChPMA2. The ChPMA1 gene
is highly expressed during all developmental stages and may represent the major proton
pump of C. higginsianum. In locus reporter gene fusions showed that ChPma1-GFP is not
present in appressoria and therefore the proton transport in these specialized infections
structures solely depends on ChPma2 activity. The ectopic expression of ChPMA1 under the
control of the ChPMA2 promotor could not suppress the pathogenicity phenotype of ChPMA2
T-DNA insertions mutants. Consequently, ChPMA1 and ChPMA2 not only differ in their
4
expression patterns but the proteins may also be differently regulated. Differences in
potential regulatory regions of both proteins could be identified.
The presence of ChPma2-like proton pumps in related phytopathogenic fungi implies a
conserved pathogenicity function for this group of H+-transporting ATPases. The
determination of T-DNA insertion sites in other vir-mutants forms the basis of further analysis
of these identified potential pathogenicity factors.
5
1. Einleitung
1.1. Pilze als Phytopathogene
Pflanzen sehen sich mit einer Vielzahl von Pathogenen konfrontiert. Dazu gehören neben
höheren Organismen wie Insekten und Nematoden auch Mikroorgansimen wie Bakterien,
Oomyceten, Pilze und Viren. Der globale Ernteverlust durch Pathogenbefall wird dabei auf
10 bis 30% geschätzt (Oerke, 2005; Strange and Scott, 2005). Phytopathogene Pilze
nehmen dabei an Bedeutung zu. Allein in den USA verursachen sie Schäden von circa 21
Milliarden US-Dollar pro Jahr (Rossman, 2008). Zusätzlich nehmen Fungizide mit
geschätzten 15 Milliarden US-Dollar für das Jahr 2014 (Lucintel Consulting) 40% des
globalen Pestizidmarktes ein. Ein Hauptgrund für die globale Bedeutung phytopathogener
Pilze ist ihre enorme Vielfalt. Jede Nutzpflanze dient dabei mehreren Arten als Wirt. Eine
Umfrage hinsichtlich ihrer wissenschaftlichen und wirtschaftlichen Bedeutung ergab eine Top
10 Liste phytopathogener Pilze (Dean et al., 2012), die in Tabelle 1.1 aufgeführt ist.
Tabelle 1.1: Top 10 phytopathogener Pilze
Rang Pathogen Typische Wirtspflanzen Ernährung 1 Magnaporthe
oryzae Reis hemibiotroph
2 Botrytis cinerea 200 Arten; darunter Wein und verschiedene Obst und Gemüse Arten, Zierpflanzen
nekrotroph
3 Puccinia spp. Weizen obligat biotroph 4 Fusarium
graminearum u. A. Weizen, Gerste, Mais hemibiotroph
5 Fusarium oxysporum
100 Arten; darunter Baumwolle, Banane, Melone
nekrotroph
6 Blumeria graminis
Weizen, Gerste obligat biotroph
7 Mycosphaerella graminicola
Weizen hemibiotroph
8 Colletotrichum spp.
u. A. Tabak, Tomate, Erdbeere, Gurke meist hemibiotroph*
9 Ustilago maydis Mais biotroph 10 Melampsora lini Flachs biotroph
*einige Arten wie C. acutatum und C. capsici könne ebenfalls eine nekrotrophe Ernährungsstrategie verfolgen Phytopathogene Pilze haben dabei mit Biotrophie und Nekrotrophie zwei konträre
Ernährungsstrategien entwickelt. Biotrophe Pathogene sind auf einen lebenden Wirt
angewiesen und ernähren sich von Nährstoffen, die im Apoplasten der Pflanzenzellen
verfügbar sind. Nekrotrophe Pathogene hingegen töten zum Beginn der Infektion den Wirt
aktiv ab und ernähren sich anschließend von toten Zellen (van Kan, 2006). Pathogene mit
6
biotropher Ernährungsweise sind stark auf einzelne Pflanzen spezialisiert und besitzen daher
ein sehr enges Wirtsspektrum. Der Erreger des Maisbeulenbrandes Ustilago maydis befällt
zum Beispiel nur Kulturmais (Zea mays) und die Wildform Teosinte (Euchlaena mexicana)
(Banuett, 1995). Obwohl Ustilago maydis die Wirtspflanze nicht abtötet, kann eine Infektion
durch die starke Tumorbildung zu erheblichen Ernteverlusten führen. Die verschiedenen
Arten der Familie Erysiphaceae stellen eine weitere bedeutende Gruppe biotropher Pilze dar.
Die über 100 Arten sind obligate Parasiten und die Erreger des Echten Mehltaus auf über
10.000 Wirtspflanzen (Glawe, 2008). Als charakteristische Infektionsstruktur bilden Vertreter
dieser Familie wie z.B. Blumeria graminis und Golovinomyces orontii so genannte
Haustorien aus. Haustorien dienen sowohl der Übertragung pilzlicher Effektoren, als auch
der Aufnahme von Nährstoffen (Catanzariti et al., 2006; Voegele and Mendgen, 2003). Das
Zytoplasma des Haustoriums ist dabei durch die pilzliche Plasmamembran und Zellwand und
durch die Extrahaustorial Matrix (EHMx) und Extrahaustorial Membrane (EHM) von dem
Zytoplasma der Wirtszelle getrennt (Szabo and Bushnell, 2001) (Abbildung 1.1A). Die
Extrahaustorial Membrane ist eine stark modifizierte Plasmamembran der Wirtszelle und
stellt die Interaktionsfläche zwischen Wirt und Pathogen in diesen Pathosystemen dar (Koh
et al., 2005; O’Connell et al., 2006).
7
Abbildung 1.1: Infektionsstrukturen von biotrophen und hemibiotrophen Pilzen. Schematische Darstellung einer biotrophen Pflanzen-Pilz-Interaktion (A) und der biotrophen Phase der Infektion von C. higginsianum (B). K: Konidie; Ap: Appressorium; H: Haustorium; PH: Primärhyphe.
Ein phytopathogener Pilz mit nekrotropher Ernährungsweise ist der Erreger der
Grauschimmelfäule Botrytis cinerea. Im Gegensatz zu hochspezialisierten biotrophen
Pathogenen, besitzt er, wie es typisch für nekrotrophe Pathogene ist, mit über 200 Arten ein
sehr breites Wirtsspektrum (Elad, 2007).
1.1.1 Die Gattung Colletotrichum ist auf eine hemibiotrophe Ernährungsstrategie spezialisiert
Neben biotrophen und nekrotrophen phytopathogenen Pilzen gibt es noch eine Gruppe,
welche beide Ernährungsstrategien kombiniert. Hemibiotrophe Pathogene etablieren
zunächst eine initiale biotrophe Phase an die sich eine sekundäre nekrotrophe Phase
anschließt (Perfect et al., 1999). Die Gattung Colletotrichum ist dabei besonders, bis auf
wenige nekrotrophe Ausnahmen (Bailey, J.A. Jeger, 1992; Peres et al., 2005), auf diese
Ernährungsstrategie spezialisiert. Zusammen infizieren alle Colletotrichum Arten über 3200
Pflanzenarten, zu denen auch sehr viele Nutzpflanzen wie z.B. Colletotrichum musae mit
Bananen (Musa sp), C. coccodes mit Nachtschattengewächsen (Solanum sp.), C.
lindemuthianum mit Gartenbohne (Phaseolus vulgaris) und C. trifoli mit Luzerne (Medicago
sativa) als Wirtspflanzen gehören. Von besonderer wirtschaftlicher Bedeutung ist dabei das
Maispathogenen Colletotrichum graminicola, welches allein in den USA mit einer Milliarde
USD pro Jahr (Frey et al., 2011) große Schäden anrichtet. Eine genaue Definition der
großen Vielzahl von Arten ist bisher nur unvollständig erfolgt, so dass Zuordnungen von
Colletotrichum sp. oft nicht eindeutig sind (Centre et al., 2009). Dies schlägt sich in den
großen Unterschieden der Angaben über die Gesamtanzahl der einzelnen Arten nieder,
welche von 20 (Arx, 1957) über 39 (Farr et al., 1989) bis über 700 (Sutton, 1992) reichen.
Für einige Spezies wie z.B. Colletotrichum graminicola und C. cingulata wurden
homothallische und heterothallische Stämmen beschrieben (Markert, 1949; Vaillancourt et
al., 2000), wobei die sexuelle Form dieser Arten (das Telemorph) den Namen Glomerella sp.
trägt. In C. higginsianum konnte ein einzelnes Mat1-2 Mating Typ Gen nachgewiesen
werden (CH063_09403), allerdings konnte das idiomorphe Mat1-1 nicht identifiziert werden
(O’Connell et al., 2012). Zudem wurden bisher keine sexuellen Stadien beobachtet, so dass
sich C. higginsianum anscheinend nur asexuell vermehrt.
8
1.1.2 Colletotrichum higginsianum als Modellorganismus für hemibiotrophe Phytopathogene
C. higginsianum und C. destructivum sind in der Lage die Modellpflanze A. thaliana zu
infizieren (Connell et al., 2004). Dabei wird angenommen, dass beide Spezies zu einem sehr
eng verwandten Spezieskomplex (Cannon et al., 2012; O’Connell et al., 2012) oder sogar
beide zu einer Art gehören (Sun and Zhang, 2009). Für C. destructivum wurde Glomerella
glycines als Telomorph beschrieben (Manandhar, 1986). Das Colletotrichum higginsianum –
Arabidopsis thaliana Pathosystem ist aus mehrere Gründen als Modellsystem sehr attraktiv.
Als typische Colletotrichum Art besitzt C. higginsianum eine hemibiotrophe
Infektionsstrategie und erlaubt somit die Untersuchung einer initialen biotrophen und einer
sekundären nekrotrophen Phase. Der Phasenwechsel zwischen diesen beiden
Ernährungsformen weist zudem eine Vielzahl von morphologischen, biochemischen und
Pathogenitäts-assoziierten Veränderungen auf. Eine Übersicht der Infektion von A. thaliana
mit C. higginsianum ist in Abbildung 1.2 dargestellt.
9
Abbildung 1.2: Übersicht der Interaktion von A. thaliana mit C. higginsianum. C. higginsianum wird mittels Konidien (A) übertragen und bildet spezialisierte Strukturen für die Infektion der Wirtszelle. Diese Appressorien (B) sind stark melanisiert und besitzen einen hohen Turgor der die direkte Penetration der Kutikula und Zellwand der Epidermiszelle erlaubt. Die Penetrationshyphe bildet im Apoplasten des Wirtes eine biotrophe Primärhyphe (C) welche auf die erste Wirtszelle begrenzt ist. Nach ca. drei Tagen bilden sich nekrotrophe Sekundärhyphe (D) die sich in der Pflanze ausbreiten und die Wirtszellen mit der Besiedlung abtöten. In späten Stadien der Infektion bilden sich Acervuli (Fruchtkörper) die neue Konidien produzieren.
C. higginsianum ist haploid und kann im Gegensatz zu obligat biotrophen Pathogenen mittels
eines modifizierten Agrobacterium tumefaciens Transformationsprotokolls (Huser et al. 2009;
Korn et al., 2015) genetisch manipuliert werden. Die Genome beider Interaktionspartner des
Pathosystems wurden sequenziert (O’Connell et al., 2012; The Arabidopsis Genome
Initiative, 2000) und zusätzliche Stadien-spezifische Expressionsdaten während der Infektion
sind verfügbar (O’Connell et al., 2012; Takahara et al., 2009). Für A. thaliana existieren
zudem große Datenbanken mit verfügbaren T-DNA Insertionsmutanten und Ökotypen wie
z.B. die Mutantenkollektion des Arabidopsis Biological Ressource Center mit über einer
Million Einträgen.
1.1.3 Colletotrichum sp. bilden mit Appressorien spezialisierte Infektionsstrukturen aus
Asexuelle Konidien werden über relativ kurze Entfernungen durch Wind und Regentropfen
übertragen. Innerhalb von Sekunden nach Kontakt mit der Pflanze beginnen Konidien von C.
graminicola mit der ersten Phase der Adhäsion (Mercure et al., 1994a). Dafür scheint die
Sporenhülle aus gebundenen hydrophoben Glykoproteinen (Hughes et al., 1999) eine
wichtige Rolle zu spielen. Ein Entfernen oder Blockieren dieser Proteine von C. musae und
C. graminicola hat den Verlust der Adhäsion zur Folge (Mercure et al., 1994b; Sela-Buurlage
et al., 1991). In der zweiten Phase der Adhäsion werden nach ca. 30 Minuten des initialen
Kontaktes mit der Pflanzenoberfläche aktiv Proteine synthetisiert, die sich als extrazelluläre
Matrix um Konidien und Keimschläuchen von mehreren Colletotrichum Spezies anlagern
(Jones et al., 1995; Mercure et al., 1995). Mittels monoklonalen Antikörpern konnte für C.
lindemuthianum gezeigt werden, dass diese Matrix reich an Glykoproteinen ist und
vermutlich der Adhäsion dient (Hutchison et al., 2002).
Für die Infektion der Wirtszelle werden spezialisierte Infektionsstrukturen ausgebildet, die so
genannten Appressorien. Wichtige Signale für die Induktion der Keimung der Konidien sind
dabei zu einem die Beschaffenheit der Oberfläche (Kolattukudy et al., 1995; Lapp and
Skoropad, 1978) und zum anderen das Vorhandensein von spezifischen chemischen
Signalen (Parbery and Blakeman, 1978; Stahmann, 1972). Hydrophobizität und Härte der
Oberfläche sind von besonderer Bedeutung, so kann die Appressorienbildung auch auf
artifiziellen Oberflächen wie z.B. auf Petrischalen oder Glas induziert werden. Für das
10
ebenfalls Appressorien-bildende, phylogenetisch verwandte Pathogen aus der Familie der
Sordariaceae Magnaporthe grisea, konnte gezeigt werden, dass die Erkennung
extrazellulärer Signale eine cAMP (zyklisches AMP) regulierte Signalkaskade auslöst und
damit die Appressorienbildung induziert (Lee and Dean, 1993). Eine induzierende Wirkung
von cAMP wurde ebenfalls für C. lagenarium (Yamauchi et al., 2004) und C. trifolii (Yang and
Dickman, 1997) beobachteten, wohingegen eine Zugabe von cAMP die Appressorienbildung
von C. higginsianum inhibiert (Diplomarbeit Martin Korn). In der frühen Phase der
Appressorienbildung scheinen zusätzlich Calcium/Calmodulin-abhängige Signalsysteme von
Bedeutung zu sein, da die Zugabe von Ca2+-Chelatoren wie EGTA oder die Inhibierung von
Calmodulin eine hemmende Wirkung auf die Appressorienbildung von Colletotrichum
gloeosporioides (Uhm et al., 2003), C. trifolii (Warwar and Dickman, 1996) und Magnaporthe
grisea (Liu and Kolattukudy, 1999) haben. Für die weitere Differenzierung der Appressorien
spielen MAPK (mitogen activated protein kinase) Signalkaskaden eine bedeutende Rolle
(Zhao et al., 2007). So sind die entsprechenden Orthologe der MAP-Kinase Fus3p der Hefe
in Magnaporthe grisea (Pmk1) essentiell für die Differenzierung von Appressorien (Xu and
Hamer, 1996), wohingegen die MAP-Kinase Cmk1 aus C. lagenarium bereits für die
Keimung notwendig ist (Takano et al., 2000). Des Weiteren sind Orthologe der MAP-Kinase
Mpk1p, die in Hefe unter anderen in der Regulation der Zellwandintegrität beteiligt ist (Lee et
al., 1993) ebenfalls für die Infektion notwendig. So ist Maf1 in C. lagenarium (Kojima et al.,
2002) für die Appressorienbildung bzw. Mps1 in M. grisea (Xu et al., 1998) für die
Penetrationsfähigkeit der Appressorien essentiell. Potentielle downstream targets der MAPK-
Signalkaskaden sind unter anderen Gene, die für die Generierung des hohen Turgors
notwendig sind, wie z.B. Enzyme Fettstoffwechsels (Thines et al., 2000). Messungen des
Turgordruckes in Appressorien ergaben Werte von bis zu 8 MPa für Magnaporthe grisea
(Howard et al., 1991), 2,6 MPa für Colletotrichum kahawae (Chen et al., 2004) und 5,4 MPa
für C. graminicola (Ludwig et al., 2014). Diese hohen Drücke werden durch die Einlagerung
von Osmolyten und den dadurch hervorgerufenen Einstrom von Wasser erreicht. Dabei wird
angenommen, dass Glycerin das Hauptosmolyt darstellt und in Konzentrationen bis 3 M in
Appressorien vorliegt (Jong et al., 1997; Money and Howard, 1996). Um diesen hohen
Turgor zu erreichen ist es allerdings erforderlich ein Ausströmen des eingelagerten
Osmolytes zu verhindern. Diese Aufgabe wird durch eine Melaninschicht zwischen der
Zellwand und der Plasmamembran wahrgenommen (Money, 1997). Melanine sind dabei
dunkle, hochmolekulare Pigmente, die durch oxidative Phosphorylierung phenolischer
Verbindungen entstehen (Jacobson, 2000), wodurch die typische dunkle Färbung des
Appressoriums zustande kommt. Diese Melaninschicht ist impermeabel für Glycerin aber für
Wasser durchlässig (Howard and Ferrari, 1989; Jong et al., 1997), womit eine Diffusion des
Osmolytes verhindert wird. An der Penetrationspore zwischen Appressorium und Substrat
11
befindet sich dagegen kein Melanin, wodurch der Turgor gegen die zu penetrierende
Wirtszelle gerichtet wird. Mutanten von M. grisea und C. higginsianum mit Defekten in der
Melanisierung von Appressorien zeigen eine sehr stark reduzierte Pathogenität (Chumley,
1990; Huser et al., 2009; Korn et al., 2015). Die chemische Inhibierung der
Melaninbiosynthese von M. grisea durch Tricyclazol (PESTANAL) hat ebenfalls den Verlust
der Pathogenität zur Folge (Woloshuk et al., 1980), was die Wichtigkeit von Melanin
verdeutlicht.
1.1.4 Penetration der Wirtszelle und Etablierung der biotrophen Phase
Nach der vollständigen Differenzierung des Appressoriums beginnt sich an der
Penetrationspore eine Penetrationshyphe zu bilden. Für C. higginsianum konnte gezeigt
werden, dass die Penetrationspore zudem ein Ort der gezielten lokalen Freisetzung einer
Vielzahl von putativen Effektoren ist (Kleemann et al., 2012). Ob und auf welche Art diese
einen Einfluss auf die pflanzliche Abwehr ausüben ist allerdings noch nicht geklärt. Die
pflanzliche Cutikula mit ihrer Wachs-und Cutinschicht stellt die erste Barriere gegen die
Penetration dar. In phytopathogenen Pilzen ist die Sekretion von Cutinasen von
unterschiedlicher Bedeutung. Für Fusarium solani und Colletotrichum lagenarium scheinen
sie für die Infektion keine Rolle zu spielen, da eine Inhibition bzw. Knockout der Cutinasen
keinen Effekt auf die Penetration der jeweiligen Wirtspflanzen hat (Bonnen and
Hammerschmidt, 1989; Stahl and Schäfer, 1992). Gegenteilige Ergebnisse wurden
allerdings für Colletotrichum gloeosporioides (Dickman and Patil, 1986) und für Magnaporthe
grisea (Skamnioti and Gurr, 2007) erzielt, da in diesen Pathogenen Cutinasen für die volle
Virulenz notwendig sind. Dabei scheint Cut2 aus M. grisea eher eine Funktion im Erkennen
der pflanzlichen Cutikula zu erfüllen da entsprechende Knockoutmutanten Defekte in der
Differenzierung von Appressorien aufweisen. Des Weiteren besitzen phytopathogene Pilze
eine Reihe weiterer lytischer Enzyme wie Zellulasen und Pektinasen (Wattad et al., 1994).
So besitzt C. higginsianum 86 Proteine mit potentieller Pektinase-Aktivität und eine sehr
große Anzahl von carbohydrate-active enzymes (CAZymes) deren Expression während der
Appressorienbildung induziert wird (O’Connell et al., 2012).
Nach der Penetration wächst die Penetrationshyphe von C. higginsianum noch einige
Mikrometer in die Wirtszelle hinein und wird durch ein Septum von der sich bildenden
Primärhyphe abgetrennt (Connell et al., 2004). Die Primärhyphen von C. higginsianum
invaginieren, ähnlich wie Haustorien biotropher Pathogene, die Plasmamembran der
Wirtszelle und sind auf die erste infizierte Zelle beschränkt (Connell et al., 2004; Latunde-
Dada et al., 1996). Im Gegensatz zu Haustorien hat die Zellwand von Primärhyphen von C.
higginsianum einen engen Kontakt mit der Wirtszelle, ohne eine Extrahaustorial Matrix
12
(EHMx) auszubilden (Connell et al., 2004) (siehe Abbildung 1.1). Für C. lagenarium konnte
zudem gezeigt werden, dass das Interface zwischen Primärhyphe und Wirtszelle nicht die
typischen strukturellen und physiologischen Spezialisierungen von biotropher Interaktionen
aufweist (O’Connell, 1987) da unter anderem die Ausbildung eines „Neckbands“ ausbleibt
(O’Connell, 1985). Mittels DAPI-Färbungen (Takahara et al., 2009) und nukleären GFP-
Fusionsproteinen (Diplomarbeit Martin Korn) konnte gezeigt werden, dass Primärhyphen von
C. higginsianum je nach Fortschritt der Entwicklung mehrere Zellkerne enthalten. Die
infizierte Wirtszelle ist während der biotrophen Phase noch intakt (Takahara et al., 2009;
Diplomarbeit Martin Korn) und hat sehr engen Kontakt mit der pilzlichen Zellwand.
Für die erfolgreiche Etablierung einer biotrophen Wechselwirkung ist es notwendig die
pflanzliche Abwehr zu unterdrücken oder zu umgehen. Biotrophe Pathogene haben dafür
spezialisierte Effektoren entwickelt. Da die biotrophe Phase essentiell für eine erfolgreiche
Infektion ist, wird angenommen, dass Primärhyphen ähnliche Effektoren besitzen müssen
wie Hyphen biotropher Pathogene. Für die Identifizierung von Genen von C. higginsianum
die spezifisch während verschiedenen Stadien der Infektion exprimiert werden, wurden
bereits umfangreiche Transkriptomanalysen durchgeführt (Kleemann et al., 2008, 2012;
O’Connell et al., 2012; Takahara et al., 2009). Während RNA aus in vitro Appressorien relativ
leicht isoliert werden kann (Kleemann et al., 2008), ist die Gewinnung von RNA aus
Primärhyphen durch ihre, im Vergleich zu der Wirts RNA, geringen Menge, problematisch
(Takahara et al., 2009). In zwei Studien wurden Bibliotheken Stadien-spezifischer ESTs
(expressed sequence tags) angelegt (Kleemann et al., 2012, O’Connell et al., 2012) welche
für die Identifizierung von potentiellen Effektorproteinen bioinformatisch analysiert wurden.
Dadurch wurden 198 ChECs (Colletotrichum higginsianum effector candidates) erhalten, die
für sekretierte Proteine kodieren und keine Homologe außerhalb der Gattung Colletotrichum
(O’Connell et al., 2012) aufweisen. Für einige der ChECs Proteine wie ChEC3 und ChEC5
konnte gezeigt werden, dass sie bei einer transienten Expression in Tabak (N. benthamiana)
den induzierten Zelltod entgegenwirken. ChEC3-exprimeirende Pseudomonas syringae
Stämme zeigten zudem eine stärkere Vermehrung in A. thaliana. Proteinfusionen einiger
ChEC Proteine wie z.B. ChEC34 mit mRFP zeigten eine lokale Akkumulation in so
genannten interfacial bodies auf der Oberfläche von Primärhyphen. Damit zeigen sie eine
ähnliche Lokalisation wie die potentiellen Effektorproteine Bas1, Bas2 und Pwl2 von
Magnaporthe grisea, welche ebenfalls an bestimmten Stellen des Raumes zwischen Wirt
und Pathogen (biotrophic interfacial complex (BICs)) akkumulieren (Khang et al., 2010). Eine
Lokalisierung von Effektoren von Magnaporthe grisea an diesen BICs korrelierte zudem mit
ihrer Translokation in das Zytoplasma des Wirtes (Khang et al., 2010). Weitere Analysen
zeigten eine starke Induktion in der Expression von Genen des Sekundärstoffwechsels
(O’Connell et al., 2012). Dabei wurde postuliert, dass diese, ähnlich wie Effektorproteine,
13
eine Rolle für die Manipulation des Wirtes spielen. In Ustilago maydis konnte mit Srt1 ein
hoch-affiner Saccharose-Transporter identifiziert werden (Wahl et al., 2010), der aufgrund
seines sehr niedrigen KM-Wertes kompetitiv Saccharose aus dem Apoplasten des Wirtes
aufnehmen kann und somit die Versorgung des Pathogens sicherstellt. Im Gegensatz dazu
ist die Nährstoffversorgung während der biotrophen Phase von Colletotrichum higginsianum
noch weitgehend ungeklärt. In Transkriptomanalysen konnten keine Auffälligkeiten in der
Genexpression von Transportern beobachtet werden (O’Connell et al., 2012), die einen
Rückschluss auf bevorzugte Nährstoffe zulassen. In C. graminicola wurde die Expression
von fünf Hexosetransportern während der Infektion charakterisiert (Lingner et al., 2011) aber
ihre Rolle für die Infektion nicht untersucht.
1.1.5 Nekrotrophe Phase
Circa drei Tage nach der Infektion beginnt C. higginsianum mit der Bildung sekundärer
Hyphen und geht damit in die nekrotrophe Phase über. Die erste infizierte Zelle wird
während des Wechsels der Infektionsphasen wie jede weitere besiedelte Wirtszelle
abgetötet. Damit verfolgt C. higginsianum eine andere hemibiotrophe Infektionsstrategie als
C. graminicola oder M. grisea, da diese Pathogene bei der Besiedlung jeder neuen
Wirtszelle zunächst eine kurze biotrophe Phase initiieren. In der nekrotrophen Phase von C.
higginsianum wird die Expression von 44 putativen Proteasen und 146 Enzymen die den
Abbau bzw. die Synthese von Kohlenhydraten katalysieren (carbohydrate-active enzymes)
induziert (O’Connell et al., 2012). Ebenfalls konnte gezeigt werden, dass die Expression von
75 Transporter-kodierenden Genen induziert wird, wovon 18 für Zuckertransporter kodieren.
Dies impliziert ein weites Spektrum an Kohlenstoffquellen welches durch C. higginsianum
während der Nekrotrophie aufgenommen werden kann. Die Expression von putativen
Effektoren mit möglicher inhibierender Funktion auf die pflanzliche Abwehr wird eingestellt
und durch eine neue Welle von Effektoren ersetzt (Kleemann et al., 2012). Dabei konnte
gezeigt werden, dass C. higginsianum, ähnlich wie nekrotrophe Pathogene, Zelltod
induzierende Effektoren exprimiert. So enthält das Genom beispielsweise sechs homologe
Gene deren entsprechende Proteine Ähnlichkeit zu den necrosis-and ethylene-inducing
peptide 1 (Nep1) aus Fusarium oxysporum aufweisen. Von diesen konnte für ChNlp1 gezeigt
werden, dass es spezifisch während des Wechsels zu der nekrotrophen Phase exprimiert
wird und in einer transienten Expression in Nicotiana benthamiana Zelltod induziert
(Kleemann et al., 2012).
14
1.2. Pathogen-Wirts-interaktionen
Eine kompatible Pathogen-Wirtsinteraktion ist durch die Ausbildung von
Krankheitssymptomen gekennzeichnet. Dabei ist die Pflanze gegenüber dem Pathogen
suszeptibel. Wenn Pflanzen allerdings resistent gegenüber dem Pathogen sind, handelt es
sich um inkompatible Interaktionen und es kommt zu keiner Ausbildung von Symptomen. Die
Immunität kann dabei von jeder Pflanzenzelle vermittelt werden, da im Gegensatz zu
Wirbeltieren, keine spezialisierten Immunzellen existieren. Ebenfalls gibt es kein adaptives
Immunsystem, so dass das angeborene Immunsystem die einzige Verteidigung gegenüber
Pathogenen darstellt. Das pflanzliche Abwehrsystem kann dabei in die PAMP (Pathogen
assoziierte molekulare Muster)-induzierte und Effektor-induzierte Immunantwort eingeteilt
werden.
1.2.1 Pathogene werden durch konservierte Muster erkannt welche eine Immunantwort auslösen
Die non-host (nicht-Wirts) Resistenz vermittelt die Resistenz einer Pflanzenspezies
gegenüber den meisten Pathogenen und ist die häufigste Form der Inkompatibilität (Heath,
1985). Eine der wichtigsten Mechanismen dieser Interaktion ist das Erkennen von Pathogen-
assoziierten oder Beschädigungs (damage)-assoziierten molekularen Mustern
(PAMPS/DAMPS) durch entsprechende Rezeptoren (PRR; PAMP Recognition Receptors) in
der Zellmembran. Bei PAMPS handelt es sich um konservierte mikrobielle Strukturen,
während DAMPS pflanzeneigene Bestandteile sind, die durch Pathogenbefall entstehen. Zu
typischen Beispielen bakterieller PAMPS zählen Flagellin und EF-TU. Die entsprechenden
Rezeptoren in Arabidopsis thaliana FLS2 und EFR (Gómez-Gómez and Boller, 2000;
Gómez-Gómez et al., 1999; Zipfel et al., 2006) werden als Rezeptor-ähnliche Kinasen
(receptor like kinase; RLK) bezeichnet, da sie eine extrazelluläre Rezeptordomäne und eine
intrazelluläre Kinasedomäne für die Signalweiterleitung besitzen. Als Beispiel für die
Erkennung von DAMPS konnte bisher nur WAK1 aus A. thaliana (Brutus et al., 2010)
identifiziert werden. Dieser Rezeptor erkennt Spaltprodukte des Zellwandbestandteils
Homogalacturonan die durch Pathogenbefall während der Penetration entstehen. Die
Signalweiterleitung aller bisher identifizierter PAMP/DAMP-Rezeptoren erfolgt über
intrazelluläre Kinasedomänen. Diese leiten das Signal der Ligandenbindung unter anderen
an intrazelluläre MAPK-Signalkaskaden weiter und lösen multiple Abwehrreaktionen aus.
Eine der wichtigsten und zugleich frühsten Abwehrreaktionen der PAMP-triggered Imunity
(PTI) ist die Bildung und Freisetzung von ROS (reaktive Sauerstoffspezies), spezifisch an
der Stelle der Infektion (Apostol et al., 1989). Durch die Wirkung als Oxidationsmittel können
15
dabei Pathogene direkt oder durch die Bildung oxidierter Metaboliten indirekt abgetötet
werden (Chen and Schopfer, 1999). ROS dient auch als Botenstoff und kann damit
programmierten Zelltod induzieren oder die Expression von PR-Genen (Pathogen Related)
in benachbarten Zellen regulieren (Levine et al., 1994; Tanaka et al., 2003; Torres et al.,
2005). Des Weiteren kann durch die ROS-vermittelte Quervernetzung von Glykoproteinen
die pflanzliche Zellwand verstärkt werden (Bradley et al., 1992; Lamb and Dixon, 1997). Ein
weiteres Beispiel für Zellwandverstärkungen im Rahmen der PTI ist die lokale Ablagerung
des Polysaccharides Callose an der Stelle der versuchten Penetration (Donofrio and
Delaney, 2001; Ton and Mauch-Mani, 2004; Zimmerli et al., 2000). Diese Papillen enthalten
neben Callose auch Lignin und Proteine und sollen das Eindringen des Pathogens
verhindern oder zumindest verlangsamen (Stone and Clarke., 1992).
1.2.2 Effektoren als Unterdrücker der Immunantwort
Da PAMPS wie EF-TU oft essentielle und konservierte Muster des Pathogens darstellen,
können diese nicht modifiziert werden um eine Detektion durch pflanzliche Rezeptoren zu
umgehen. Daher haben vor allem biotrophe Pathogene zum einem zytoplasmatische
Effektoren entwickelt um die Abwehrreaktion der Pflanze zu unterdrücken und zum anderen
apoplastische Effektoren um die Erkennung ihrer PAMPS zu inhibieren. Für nekrotrophe
Pathogene hingegen wären Effektoren mit Zelltod-inhibierender Wirkung nachteilig, da das
Abtöten des Wirtes Bestandteil ihrer Infektionsstrategie ist, weswegen davon auch keine
bekannt sind. Bakterielle Pathogene wie z.B. Xanthomonas, Pseudomonas und
Agrobacterium können zytoplasmatische Effektoren mittels ihres Typ III bzw. Typ IV
Sekretionssystems direkt in die Wirtszelle injizieren (Christie and Vogel, 2000; Cornelis and
Van Gijsegem, 2000). Oomyceten wie z.B. Phytophthora infestans exprimieren ebenfalls
eine Vielzahl von Effektoren, die über einen, noch nicht eindeutig identifizierten
Mechanismus (Ellis and Dodds, 2011), in die Wirtszelle gelangen (Whisson et al., 2007). Für
viele dieser Effektoren wie z.B. SNE1 (Kelley et al., 2010) und AVR3a (Bos et al., 2009) aus
Phytophthora infestans, AvrPtoB (Abramovitch et al., 2003) und HopPtoD2 (Espinosa et al.,
2003) aus Pseudomonas konnte eine Unterdrückung des Pathogen induzierten
programmierten Zelltodes des Wirtes nachgewiesen werden. Dagegen konnten bisher relativ
wenige pilzliche Effekttoren und ihre Virulenzfunktion charakterisiert werden: AvrPiz-t aus
Magnaporthe oryzae (Yoshida et al., 2009) interagiert mit der E3 Ubiquitin-Ligase APIP6 aus
Reis und hat damit eine Inhibition der PTI zur Folge (Park et al., 2012). CMU1 (Djamei et al.,
2011) und TIN2 (Tanaka et al., 2014) aus Ustilago maydis können den Stoffwechsel von
infizierten Maiszellen umprogrammieren, wodurch das Level an Salizylsäure bzw. die
Produktion von Lignin gesenkt werden um die Seneszenz der Wirtszellen zu verlangsamen
16
(Djamei et al., 2011). Im Gegensatz zu Bakterien, ist der Mechanismus der Übertragung
dieser pilzlicher Effektoren in das Zytoplasma des Wirtes unbekannt. Zudem weisen pilzliche
Effektoren keine konservierten Motive auf, wie es in Oomyceten mit dem RxLR-deeR Motiv
der Fall ist (Jiang et al., 2008; Morgan and Kamoun, 2007). Neben intrazellulären Effektoren
setzen Pathogene eine große Anzahl apoplastischer Effektoren frei. Diese können die
Aktivierung der PTI verhindern indem sie unter anderem PAMPS maskieren oder direkt mit
Wirtsproteinen interferieren.
Im Gegensatz zu Effektoren mit hemmender Wirkung auf die pflanzliche Abwehr, setzen
nekrotrophe Pathogene gezielt Proteine und Toxine frei, um den pflanzlichen Zelltod zu
induzieren. So wird bei der Infektion mit Botrytis cinerea schon während der Penetration
gezielt die Produktion von ROS induziert (Tenberge et al. 2002) um eine hypersensitive
Antwort (HR) hervorzurufen. Während der Infektion produziert Botrytis cinerea Oxalsäure
(Germeier et al. 1994) die zum einen direkt HR induzieren kann (van Kan, 2006) und zum
anderem durch die Ansäuerung die Effektivität lytischer Enzyme erhöht (Manteau et al.,
2003). Zusätzlich werden phytotoxische Metaboliten wie Botrydial (Colmenares et al., 2002)
und zwei Necrosis and Ethylen-inducing proteins (NEP) sekretiert, die den Wirt aktiv abtöten.
1.2.3. Effektor-induzierte Immunantwort
Im Gegensatz zur PTI, die eine Vielzahl von Pathogenen durch konservierte Muster erkennt,
sind die Abwehrstrategien gegen Effektoren hochspezifisch, so dass man auch von einer
Gen für Gen Interaktion spricht (Flor, 1946). Wird ein Effektor durch das entsprechende
Genprodukt eines R-Gens (Resistenzgen) erkannt, kommt es zu der so genannten ETI
(effector triggered immunity), die eine schnellere und stärkere Form der PTI darstellt (Jones
and Dangl, 2006; Tao et al., 2003) und meist den induzierten Zelltod der Wirtszelle (HR;
hypersensitive response) zur Folge hat (Greenberg and Yao, 2004). Durch die Erkennung
wird der Effektor, der ursprünglich eine Virulenzfunktion erfüllte, zu einem Avirulenz (AVR)
Faktor und hat eine inkompatible Wirts-Pathogen Interaktion zur Folge. Diese Art der
Resistenz ist nur vorhanden, wenn der Wirt das entsprechende R-Gen und das Pathogen
das entsprechende AVR-Gen exprimiert und ist somit Rassen/Kultivar spezifisch. Die
meisten R-Gene kodieren dabei für NB-LLR (nucleotide-binding site leucine-rich repeat)
Proteine. Diese erkennen mit wenigen Ausnahmen den Effektor nicht direkt (Rafiqi et al.,
2010), sondern entsprechend der Guard-Hypothese (Van der Biezen and Jones, 1998) das
durch den Effektor „veränderte Selbst“. Die effektive Abwehr der ETI führt zu einem
Selektionsdruck auf das Pathogen das AVR-Gen zu „verlieren“ oder neue Effektoren zu
besitzen, die entweder durch die vorhandenen R-Gene nicht erkannt werden oder die ETI
unterdrücken können. Die hohe Dichte von Transposons und Retrotransposons in den
17
Genomen von Pathogenen erhöht die Mutationsrate und damit die Entstehung neuer
Effektoren. Circa 10% der DNA-Sequenzen von Magnaporthe grisea und Xanthomonas
oryzae und 30% bei Phytophthora infestans (Haas et al., 2009) bestehen aus transposablen
Elementen, im Vergleich zu 3,1% in Saccharomyces cerevisiae (Kim et al., 1998).
1.3. Membrangebundene Transportproteine
Verschiedene BLAST-Analysen identifizierten eine Gesamtanzahl von 754
Membrantransporter in der Genomsequenz von C. higginsianum (O’Connell et al., 2012). Ein
großer Teil dieser Transporter gehören zu den Familien der ABC-Transporter (68) oder der
Major-Facilitator-Superfamily (363). Für viele dieser Gene konnte durch
Transkriptomanalysen eine Stadien-spezifische Expression während der Infektion von A.
thaliana gezeigt werden. So wird die Expression von 131 Transporter durch Kontakt mit dem
Wirt induziert. Der Vergleich von RNA-Seq Daten zwischen in planta Appressorien und
biotrophen Hyphen zeigte eine Induktion in der Expression von 38 Genen. Weitere 75
Transporter werden in der nekrotrophen Phase induziert (O’Connell et al., 2012).
1.3.1 P-Typ-ATPasen
P-Typ-ATPasen sind eine große Gruppe von Kationen- und Lipidtransportern, welche
entsprechend ihrer Substratspezifität in fünf Klassen (I –V) mit jeweiligen Unterklassen (A/B)
eingeteilt werden (Axelsen and Palmgren, 1998). In Tabelle 1.2 sind die einzelnen Klassen
mit ihrem entsprechenden Substrat aufgeführt.
Tabelle 1.2: Klassifizierung von P-Typ ATPasen
Klasse Unterklasse Substrat
Typ 1 A K+
B Cu2+
Typ 2 A Ca2+
B Ca2+
C Na+/K+; H+/K+
D Ca2+, Na+
Typ 3 A H+
B Mg2+
Typ 4 Phospholipide
Typ 5 unbekannt
18
In einer Vielzahl von Pathosystemen konnte gezeigt werden, dass P-Typ ATPasen eine
wichtige Rolle für die Pathogenität einnehmen. So sind z.B. die Aminophospholipid
Translokasen (APTs) MgApt2 und Pde1, die als integrale Membranproteine am
Vesikeltransport beteiligt sind, essentiell für die Pathogenität von Magnaporthe oryzae
(Balhadère and Talbot, 2001; Gilbert et al., 2006). Zudem konnte für den Kupfer-Transporter
Clap1 aus C. lindemuthianum eine Beteiligung an der Appressorienbildung gezeigt werden
(Parisot et al., 2002).
Durch Vergleich von mehreren Kristallstrukturen von P-Typ-ATPasen (Kühlbrandt, Zeelen, &
Dietrich, 2002; Morth et al., 2007; Toyoshima, Nakasako, Nomura, & Ogawa, 2000) konnte
eine konservierte Domänenstruktur identifiziert werden (Morth et al., 2011; Wach, Schlesser,
& Goffeau, 1992). Die einzelnen Domänen von P-Typ-ATPasen sind dabei die A (actuator),
N (nucleotide binding), P (phosphorylation), T (transport) und die S (support) Domäne,
zusätzlich kann sich am C-bzw. am N-Terminus eine R (regulatory) Domäne befinden
(Palmgren & Nissen, 2011).
innen
außen
19
Abbildung 1.3: Domänenstruktur und Konformationswechsel von P-Typ ATPasen. (A) Schematische Darstellung der konservierten Domänenstruktur von P-Typ-ATPasen. Im Zytoplasma befinden sich die actuator (A) phoyphorylation (P) und nucleotide binding (N) Domäne. Die zehn Transmembranhelices enthalten die transport (T) und die support (S) Domäne. (B) Schematische Übersicht des Transportvorganges von P-Typ-ATPasen. In der E1 Konformation besitzt der Transporter eine hohe Affinität für das Substrat und bindet es im Zytoplasma. Durch die Spaltung von ATP wechselt der Transporter in die E2 Form. Die hochaffine Bindetasche geht dadurch verloren und das zu transportierende Ion wird außerhalb der Zelle freigesetzt. Im extrazellulären Raum werden Gegenionen gebunden und deren Freisetzung hat die erneuten Konformationsänderungen zu der E1 Form zur Folge. Abbildung wurde in abgeänderter Form übernommen aus (Palmgren and Nissen, 2011)
Ein großer Teil des Proteins befindet sich im Zytoplasma (A, N, P) und nur ein kleiner Teil im
extrazytosolischen Raum (siehe Abbildung 1.3A). Während jedes Transportzyklus wird die P-
Domäne an einem konservierten Asparaginsäure-Rest durch die N-Domäne phosphoryliert
und anschließend durch die A-Domäne dephosphoryliert. Dabei agiert die N-Domäne als
Proteinkinase, die A-Domäne als Proteinphosphatase und die P-Domäne dient beiden als
Substrat. Die Spaltung von ATP stellt, die für den Transport benötige, Energie bereit indem
chemische Energie in kinetische Energie für die Bewegung der A-Domäne umgewandelt
wird. Für den Transportprozess wird angenommen, dass sich die Bindetasche in der Mitte
der T-Domänen befindet und zwei verschiedene Konformationen mit unterschiedlichen
Affinitäten für die zu transportierenden Ionen aufweist (Post et al., 1969; Whittam and
Wheeler, 1970). Die E1 Konformation zeigt eine hohe Affinität zum Substrat und weist auf
die zytosolische Seite. In der E2-Form ist die Affinität stark reduziert und die Bindetasche
zeigt auf die andere Seite der Membran. Der Wechsel dieser Konformationen ermöglichen
die Bindung der Ionen im Zytoplasma und die Freisetzung außerhalb der Zelle und ist an die
Phosphorylierung bzw. Dephosphorylierung gekoppelt. Die Bindung des Substrates generiert
eine Bindestelle für Magnesium nahe dem konservierten Asparaginsäure-Rest und
ermöglicht dadurch dessen Phosphorylierung. Phosphorylierung der P-Domäne hat eine 90
Grad Rotation der A-Domäne zur Folge. Diese Konformationsänderung vermittelt den
Übergang von E1-P zu der E2-P Form und ist der Geschwindigkeits-limitierende Schritt des
Transportes. Die hoch-affine Substratbindestelle wird durch die Drehung zerstört und es
öffnet sich eine Ionen Austrittsstelle auf der anderen Seite der Membran. Des Weiteren
kommt das TGE-Motiv der A-Domäne in der Nähe der Phosphorylierungsstelle. Durch die
Bindung von Gegenionen wie z.B. Kalium für die Na+/K+-Pumpe kommt es zu eine weiteren
Bewegung der A-Domäne und der Abstand des TGE-Motivs zu dem phosphorylierten
Asparaginsäure-Rest ist klein genug um die Dephosphorylierung einzuleiten. Ein
Wassermolekül wird koordiniert gebunden und führt einen nucleophilen Angriff auf das
gebundene Phosphat aus. Die Dephosphorylierung und die Freisetzung des Phosphats
haben eine Rückbewegung der A-Domäne zur Folge und damit den Übergang von E2 zu der
E1 Form. Die Bindestelle der Gegenionen wird zerstört und es öffnet sich ein Austrittskanal
auf der zytoplasmatischen Seite.
20
1.3.2 Die Plasmamembran-gebundene Protonenpumpe
Von besonderer Bedeutung sind vor allem die Na+/K+ und die H+-ATPase da diese als
primäre aktive Transporter das Plasmamembranpotential aufbauen was von sekundär
aktiven Transporter verwendet wird. In tierischen Zellen transportiert der Na+/K+-Transporter
bei jedem Transportprozess drei Na+-Ionen nach außen und importiert zwei K+-Ionen in das
Zytoplasma. Die Plasmamembran Protonenpumpe von Pflanzen und Pilzen transportiert
hingegen unter der Spaltung von ATP nur ein einzelnes Protonen aus dem Zytoplasma
(Perlin et al., 1986) und verbrauchen damit bis zu 40% des zellulären ATPs (Gradmann et
al., 1978). Beide Transporter erzeugen einen Ladungs-und Konzentrationsgradient über die
Plasmamembran was zu einem Membranpotential von -30 bis -70 mV für die Na+/K+-Pumpe
und bis zu -300 mV für die H+-Pumpe führt (Neurospora crassa -200 mV (Slayman, 1965)).
In Saccharomyces cerevisiae und Schizosaccharomyces pombe konnte jeweils eine
Hauptprotonenpumpe (Pma1) identifiziert werden (Ghislain et al., 1987; Serrano et al.,
1986). Beide Organsimen besitzen allerdings noch eine zweite Protonenpumpe (Pma2)
(Ghislain and Goffeau, 1991; Schlesser et al., 1988) mit noch ungeklärter physiologischer
Funktion. Pflanzen besitzen hingegen mehrere Protonenpumpen (elf in A. thaliana, sieben in
Tomate und Tabak) die sich in Expression (Harper et al., 1994) und katalytischen
Eigenschaften (Palmgren and Christensen, 1994) unterscheiden und vermutlich somit eine
differenzielle Expression der verschiedenen Isoformen in verschiedenen Zelltypen erlauben.
Die Plasmamembran gebundene Protonenpumpe besitzt einige Besonderheiten im Aufbau,
so importiert sie keine Gegenionen und weist eine komplexe Regulation auf. In der
Substratbindetasche dient ein Asparagin als Protonenakzeptor dessen pKA durch eine
Asparaginsäure moduliert wird (Buch-Pedersen et al., 2009; Pedersen et al., 2007).
Bewegungen der A-Domäne regulieren den Abstand der beiden Aminosäuren und dadurch
auch die Bindung bzw. Freigabe des Protons. Da keine Gegenionen transportiert werden,
dient vermutlich ein positiv-geladener Arginin-Rest zur Blockierung der Bindetasche nach der
Freisetzung des Protons (Pedersen et al., 2007).
21
1.4. Ziel dieser Arbeit
Für das Arabidopsis thaliana – Colletotrichum higginsianum Pathosystems sollten
Pathogenitätsfaktoren identifiziert werden. Dies geschah zu einem durch die Konstruktion
und Analyse von T-DNA Insertionsmutanten von C. higginsianum und zum anderen durch
die Untersuchung von homologen Genen von bereits in anderen Pathosystemen
beschriebenen Pathogenitätsfaktoren. Durch die Etablierung eines Systems für Homologe
Rekombination in C. higginsianum sollten die, im Screening von T-DNA Insertionsmutanten
identifizierten Gene und potentielle Orthologe zu beschriebenen Virulenzfaktoren gezielt
ausgeschaltet werden und ihre Rolle für das C. higginsianum- A. thaliana Pathosystem
untersucht werden.
22
2. Resultate
2.1 Etablierung eines Systems für homologe Rekombination in Colletotrichum higginsianum
Für die Identifizierung von C. higginsianum Pathogenitätsfaktoren für die Infektion von A.
thaliana werden in der Arbeitsgruppe Koch zwei verschiedene Herangehensweisen
verwendet. Zum einen wurde durch ATMT eine Kollektion von Insertionsmutanten etabliert
um Pathogenitätsmutanten zu identifizieren. Zum anderen werden über bioinformatische
Vergleiche Kandidatengene identifiziert, deren Funktion getestet werden soll. Der Gen-
Knockout ist dafür eine der effizientesten Methoden und beruht auf der Integration exogener
DNA in das Genom durch Enzyme der homologen Rekombination. Durch Auswahl
flankierender Homologiebereiche kann der Insertionsort exogener DNA im Genom bestimmt
werden und ermöglicht damit den gezielten Knockout von Genen. In den Modellorganismen
Saccharomyces cerevisiae und Schizosaccharomyces pombe reichen bereits 100
Basenpaar lange flankierende Homologiebereiche aus um Zielgene effizient durch eine
Markerkassette zu ersetzten (Bähler et al., 1998; Baudin et al., 1993). Die Integration
exogener DNA beruht auf der Reparaturmaschinerie von DNA-Doppelstrangbrüchen
(Shrivastav et al., 2008) durch zwei unabhängige und konkurrierende
Reparaturmechanismen (Van Dyck et al., 1999; Shrivastav et al., 2008). Homologe
Rekombination erfordert die Interaktion von homologen Sequenzbereichen doppelsträngiger
DNA und ermöglicht damit targeted gene knockouts. Die Reparatur von DNA-
Doppelstrangbrüchen mittels Non-homologous end-joining (NHEJ) basiert hingegen auf der
direkten Ligation von DNA-Doppelsträngen, unabhängig von dem Vorhandensein homologer
Sequenzen. NHEJ erfordert die Bindung des Ku70-Ku80 Heterodimers an den Enden des
DNA-Doppelstrangbruches (Walker et al., 2001), wodurch proximale DNA-Enden überbrückt
(Cary et al., 1997) und weitere Enzyme rekrutiert werden. Darunter fallen die DNA-
abhängige Proteinkinase (DNA-PKcs) und DNA-Ligase IV (Ramsden and Gellert, 1998),
welche die Reparatur des Doppelstrangbruches katalysieren. Bei der Transformation mittels
Agrobakterien kann NHEJ für zufällige Insertionsmutagenesen ausgenutzt werden, da die T-
DNA in zufälligen Stellen im Genom inseriert wird (Bundock et al., 2002; Michielse et al.,
2005). DNA mit homologen Sequenzen hingegen kann sowohl durch Doppelcrossover
homolog rekombinieren, als auch durch NHEJ ektopisch integriert werden. Dies verhindert
oft gezielte Genmodifikationen (Weld et al., 2006). Im Gegensatz zu der Situation in Hefe, ist
in den meisten filamentösen Pilzen NHEJ der bevorzugte Reparaturmechanismus und
dadurch Gene-Targeting wenig effektiv (Weld et al., 2006). Um dennoch Knockoutmutanten
zu erhalten muss die Länge der verwendeten Homologiebereiche vergrößert (ca. 1000 bp)
23
und eine Vielzahl von Transformanten untersucht werden (Davidson et al., 2000). Um die
Rate der Prozessierung exogener DNA durch homologe Rekombination im Vergleich zu
NHEJ zu erhöhen, kann zum einen die Expression von Genen der homologen
Rekombination erhöht werden oder zum anderen die Expression von Genen des NHEJ
Mechanismus inhibiert werden. Homologe Rekombination in S. cerevisiae ist abhängig von
Rad51 (Shinohara et al., 1992). Die Überexpression des Rad51 Homologs uvsC in
Aspergillus nidulans hatte eine erhöhte Rate des Gene-Targetings zur Folge (Natsume et al.,
2004). Diese Überexpression führte allerdings auch zu einem verringerten Wachstum,
wodurch diese Herangehensweise wenig geeignet erscheint. Die Inaktivierung von Ku70
bzw. Ku80 hat eine Inhibition des NHEJ Reparaturmechanismus zur Folge. Dadurch wird
exogene DNA bevorzugt mittels homologer Rekombination integriert. Dies konnte zunächst
für Neurospora crassa (Ninomiya et al., 2004) gezeigt werden und anschließend für weitere
filamentöse Pilze wie zum Beispiel für Magnaporthe grisea (Landraud et al., 2008),
Aspergillus sojae und Aspergillus oryzae (Takahashi et al., 2006) bestätigt werden. Die
Deletion von ChKU70 aus Colletotrichum higginsianum (Ushimaru et al., 2010) hatte
ebenfalls eine Erhöhung der Effizienz des Gene-Targetings zur Folge, ohne dabei einen
Effekt auf das Wachstum oder die Pathogenität zu haben. Im Rahmen dieser Arbeit wurden
daher ChKU80 Deletionsmutanten hergestellt um gezielte Genmodifikationen wie z.B.
Knockouts in C. higginsianum zu ermöglichen.
2.1.1 Identifizierung von ChKu80
ChKu80 wurde mittels BLAST-Analysen (MPZI Colletotrichum higginsianum database
http:/gbrowse.mpiz-koeln.mpg.de/cgi-bin/gbrowse/colletotrichum_higginsianum_ public/) mit
dem Magnaporthe grisea Ku80 Ortholog MgKU80 (XP_365937.1) als „query“ Suchsequenz
identifiziert. Das entsprechende Protein (CH063_02085) hat eine Länge 730 Aminosäuren,
eine molekulare Masse von 80,4 kDa und weist dabei 59% Sequenzidentität mit MgKu80
und 55% Identität mit dem Ku80 Protein aus Neurospora crassa (NcKu80; EAA27151.3) auf
(siehe auch Abbildung 2.1). Chku80 zeigt damit vergleichbare Ähnlichkeiten wie ChKu70 mit
den entsprechen Ku70 Proteinen N. crassa mus-51 (62% Identität; NCU08290) und M.
grisea (51% Identität; MGG_01512.2) (Ushimaru et al., 2010). Des Weiteren zeigt ChKu80
19% Identität mit den Ku80 Ortholog Xrcc5 (NP_033559.2) der Maus und 18% Identität mit
dem entsprechenden Ku80-Protein von A. thaliana (NP_564520.1). Ein Alignment mit Yku80
aus S. cerevisiae ergab nur 12% identische Aminosäuren, wobei Ku80 der Hefe (S.
cerevisiae) 100 Aminosäuren kürzer ist als alle oben aufgeführten Ku80 Proteine. Eine
Analyse der Proteindomänen von ChKu80 mittels ConservedDomainSearch (Marchler-Bauer
24
et al., 2011) und InterProScan (Jones et al., 2014) zeigte die starke konservierte Ku-
Domänenstruktur (Abbildung 2.1).
Abbildung 2.1: Alignment von Ku80 Proteinen. Dargestellt ist ein Alignment von Ku80 Proteinen aus C. higginsianum (ChKU80; CH063_02085), Neurospora crassa (NcKu80; EAA27151.3) und Magnaporthe grisea (MgKu80; GGTG_01813). Konservierte Domänen in ChKu80 sind farbig markiert. Grün: von Willebrand factor type A (vWA) domain (cl00057) mit 3,41e-30; Rot: Ku-core domain, Ku80 subfamily (cd00873) mit 1,16e-99; Blau: Ku C-terminal domain like (pfam08785) mit 1,27e-10
Ku ist ein Heterodimer aus Ku70 und Ku80, die in Eukaryonten drei strukturell ähnliche
Domänen besitzen und als symmetrische Ringstruktur zwei Helixwindungen der DNA
umschließen (Walker et al., 2001). Der N-Terminus von ChKu80 zeigt Ähnlichkeiten mit einer
Van Willebrand Faktor Typ A Domäne (vWA domain; cl00057; 3,41e-30), die Protein-Protein
Interaktionen vermittelt (Whittaker and Hynes, 2002) und unter anderen mit für die
Dimerisierung von Ku70-Ku80 zuständig ist (Singleton et al., 1997). Ein großer, zentraler Teil
von Ku80 wird von der Ku-core Domäne (cd00873; 1,16e-99) eingenommen, welche die
DNA-Bindedomäne enthält (Walker et al., 2001). Zudem vermittelt diese Domäne Protein-
Protein Interaktionen mit chromosomalen Proteinen und ist essentiell für die Dimerbildung
25
(Aravind and Koonin, 2001). Ku80 Proteine enthalten im Gegensatz zu Ku70 Proteinen am
C-Terminus eine dritte Domäne (Ku C terminal domain; pfam08785; 1,27e-10), welche für
die Bindung von DNA-PKcs zuständig ist (Harris et al., 2004). Da in S. cerevisiae andere
Proteine die Funktion von DNA-PKcs erfüllen (Chen et al., 2001), erklärt sich das Fehlen
dieser Domäne in Ku80 der Hefe und die damit verbundene, im Vergleich zu ChKu80,
verringerte Größe des Proteins.
2.1.2 Etablierung der Nourseothricin-Resistenz als Selektionsmarker für die Transformation von C. higginsianum
Für die Transformation von C. higginsianum werden in der Arbeitsgruppe Koch routinemäßig
binäre Vektoren auf Basis von pPK2 (Covert et al., 2001) verwendet. Die T-DNA dieses
Vektors kodiert als Selektionsmarker eine Resistenz gegen Hygromycin unter der Kontrolle
des GAPDH Promotors aus Aspergillus nidulans (siehe Abb. 2.2A). Es sollte daher ein
weiterer dominanter Selektionsmarker für C. higginsianum etabliert werden. Die Wahl fiel
dabei auf die Nourseothricin-Resistenz (Nourseothricin Acetyltransferase; embl X73149.1)
aus Streptomyces noursei. Nourseothricin (NTC, clonNAT) ist ein Aminoglykosid-
Antibiotikum und hemmt spezifisch die Poteinbiosynthese. Die ClonNAT-Resistenz wurde
bereits erfolgreich unter anderem für die Selektion von Saccharomyces cerevisiae (100
µg/ml clonNAT) (Goldstein and McCusker, 1999) und Ustilago maydis (75 µg/ml clonNAT)
eingesetzt (Kojic and Holloman, 2000). clonNAT inhibiert das Wachstum von C.
higginsianum auf PDA-Platten bei einer Konzentration ab 100 µg/ml vollständig (siehe
Abbildung 2.2B).
Für die Konstruktion des binären Vektors (pPN, pCK2650) mit Nourseothricin-
Resistenzkassette wurde das Nourseothricin-Resistenzgen aus pMF1-N (Brachmann et al.,
2004) unter die Kontrolle des C. higginsianum TRPC Promotors und Terminators gesetzt und
in ein pPK2-Derivat kloniert, bei dem vorher die Hygromycin-Resistenzkassette entfernt
wurde. C. higginsianum Wildtypstamm (CY5535) wurde mittels ATMT mit dem entstandenen
Plasmid pPN (pCK2650) transformiert (siehe auch Material und Methoden). Dafür wurden
zunächst kompetente Agrobakterien (BAA101) mit pPN transformiert und auf Resistenz
gegenüber Kanamycin selektioniert. Erfolgreich transformierte Agrobakterien-Stämme
wurden anschließend als Einzelkolonien in Agrobakterium Minimalmedium beimpft und für
zwei Tage inkubiert. Diese Agrobakterien Kulturen wurden mit Agrobakterium
Induktionsmedium verdünnt und für weitere sechs Stunden inkubiert. Danach wurden jeweils
100 µl der Agrobakterien Kultur und 100 µl Konidiensuspension (1x106 Konidien/ml) von C.
higginsianum Wildtypstamm CY5535 gemischt und auf Platten mit Agrobakterium
Induktionsmedium und mit einem aufgelegten Nylonfilter ausplattiert. Für die Induktion der
26
vir-Gene der Agrobakterien enthalten sowohl das flüssige Agrobakterium Induktionsmedium
als auch die Platten mit Induktionsmedium Acetosyringon, da C. higginsianum als
filamentöser Pilz dieses pflanzliche Wundsignal nicht besitzt. Nach zwei Tagen Inkubation
wurde der Nylonfilter für die Selektion von C. higginsianum auf PDA Platten mit 100 µg/ml
clonNAT umgesetzt. Nach einem erneuten Umsetzten der Filter auf PDA Platten mit
clonNAT wurden nach ca. drei Tagen Kolonien sichtbar die auf selektiven Platten vereinzelt
und schließlich auf OMA-Platten propagiert wurden. Die dadurch erhaltenen Stämme (z.B.
CY5871) waren im Vergleich zum Wildtyp gegenüber clonNAT (siehe Abbildung 2.2B)
resistent, so dass die Nourseothricin-Resistenz erfolgreich als zweiter Selektionsmarker
etabliert werden konnte.
Abbildung 2.2: Nourseothricin als Selektionsmarker für C. higginsianum. (A) Plasmidkarte von pPN (pCK2650) mit eingezeichneter clonNAT-Resistenzkassette in der T-DNA; LB (Left Border); RB (Right Border); NatR (Nourseothricin Resistenz); KanR (Kanamycin Resistenz). (B) Jeweils 1x105 Konidien von C. higginsianum Wildtyp und des Stammes pPN-1 (CY5871) wurden auf PDA Platten mit 100 µg/ml clonNAT ausplattiert und nach drei Tagen fotografiert.
2.1.3 Generierung und Selektion von ΔChku80 Knockout Stämmen
Da homologe Rekombination exogener DNA in filamentösen Pilzen ineffizient ist (Weld et al.,
2006), wurde für die Deletion von ChKU80 eine Strategie mit zwei Selektionsmarkern
verwendet, um die anschließende Selektion von C. higginsianum Deletionsmutanten zu
erleichtern. Eine Nourseothricin-Resistenzkassette sollte mittels homologer Rekombination
einen großen Teil des ORF von ChKU80 ersetzen. Zusätzlich wurde eine zweite
Resistenzkassette in die T-DNA eingebracht welche außerhalb der homologen Bereiche
liegt. Dies ermöglichte eine Differenzierung von ektopischen T-DNA Insertionen und
Deletionen von ChKU80. Dafür wurden jeweils ca. 1100 bp lange PCR-Fragmente mit
Sequenzen upstream (-1132 bis +31) bzw. downstream (+2353 bis +3518) von ChKU80
27
flankierend um eine Nourseothricin-Resistenzkassette mit NatR unter der Kontrolle des
ChTRPC Promotors und Terminators kloniert. Um die ChKU80-Deletionsplasmide zu
generieren, wurde diese ChKU80-Deletionskassette anschließend in pPK2 kloniert. Da es
sich um eine „blunt-end“ Klonierung handelte, konnte die Deletionskassette in zwei
unterschiedlichen Orientierungen inseriert werden. In dem Plasmid pDel-Ku80-A (CK2830)
befindet sich der 5’Homologie-Bereich (HB) an der Right Border während in pDel-Ku80-B
(pCK2831) der 3’HB an die Right Border angrenzt (Korn et al., 2015). Im Falle einer
homologen Rekombination mit der T-DNA der Deletionsplasmide wird ein Großteil des ORF
(+31 bis +2353: Aminosäuren 11 bis 678) von ChKU80 durch die clonNAT-
Resistenzkassette ersetzt (siehe Abb. 2.3B). Das Hygromycin-Resistenzgen wird hingegen
nicht in das Genom inseriert, da es sich außerhalb der KU80-Homologiebereiche befindet.
Bei einem ektopischen Integrationsereignis (siehe Abb. 2.3C) werden hingegen beide
Selektionsmarker in das Genom inseriert und vermitteln Resistenzen gegen beide
Antibiotika. Dies wurde bei der Transformation von C. higginsianum ausgenutzt, indem auf
clonNAT-resistente Transformanten selektioniert wurde und anschließend solche gesucht
wurden, die Hygromycin sensitiv waren.
Abbildung 2.3: Strategie für die Deletion von ChKU80. (A) Schematische Darstellung der T-DNA des ChKU80-Deletionsplasmides pDel-Ku80-A (pCK2831) und des genomischen ChKU80 Lokus. Eine clonNAT-Resistenzkassette wird von ChKU80 Homologiebereichen flankiert, zusätzlich befindet sich eine Hygromycin-Resistenz auf der T-DNA. Die Positionen der homologen Bereiche sind relativ zu dem ersten Nukleotid von ChKU80 annotiert. 3’HB/5’HB: 3‘ bzw. 5‘ ChKU80 Homologiebereiche; hph: Hygromycin-Resistenz; NatR: clonNAT- Resistenz. (B/C) Schematisch Darstellung der möglichen Insertionen der T-DNA von pDel-Ku80-A/B. Im Falle von homologer Rekombination wird ChKU80 durch die clonNAT-Resistenzkassette ersetzt (B). Im Gegensatz dazu werden bei einem ektopischen Insertionsereignis (C) beide Selektionsmarker in das Genom inseriert.
28
Der C. higginsianum Wildtypstamm CY5535 wurde mittels ATMT mit den
Deletionsplasmiden pDel-Ku80-A/B transformiert und zunächst auf PDA mit clonNAT
selektioniert. 395 erhaltene Transformanten wurden auf PDA mit clonNAT vereinzelt und auf
Hygromycin-Resistenz getestet (siehe Abb. 2.4A). Von ca. 400 Stämmen waren 60 Stämme
gegenüber Hygromycin sensitiv (15%), von denen 14 zufällig ausgewählte Stämme erneut in
24-Well-Platten auf die Resistenz gegen Hygromycin überprüft wurden (siehe Abb. 2.4B).
Diese 14 Stämme wurden ebenfalls für weitere PCR-Analysen ausgewählt. Dafür wurde
chromosomale DNA isoliert und diese mittels PCRs auf das Vorhandensein des Hygromycin-
Resistenzgens (Primer CK2123/2124) sowie eines internen ChKU80-Fragmentes
(CK2903/2904) (siehe Abbildung 2.4C und D) überprüft.
29
Abbildung 2.4: Identifizierung von Chku80 Knockout Stämmen. C. higginsianum Wildtyp wurde mittels ATMT mit pDel-KU80-B (pCK28310) und pDel-Ku80-A (pCK2831) transformiert. (A) PDA Platten mit clonNAT bzw. Hygromycin wurden mit den erhaltenen Stämmen beimpft und das Wachstum nach drei Tagen dokumentiert. (B) Hygromycin sensitive Mutanten wurden auf 24well Platten mit 80 µg/ml Hygromycin erneut getestet. pPN ist ein Stamm aus der Transformation von CY5535 mit pPN und dient als Negativkontrolle. (C/D) PCR-Analyse von chromosomaler DNA aus 14 potentiellen Chku80 Knockout Stämmen. Mit den Primern CK2903/2904 wurde auf das Vorhandensein eines internen Fragmentes von ChKU80 getestet (C) und mit den Primerpaar CK2123/2124 auf das Vorhandensein des Hygromycin-Resistenzgens (D). Die erwarteten Größen der Banden liegen für (C) bei 650 bp und für (D) bei 596 bp. Wasser: Wasserkontrolle; M: 1 kbp Marker
Zusätzlich wurden PCRs für die Amplifikation der verwendeten 5‘ und 3‘ KU80
Homologiebereiche (HB) durchgeführt. Dabei wurden die Primer so gewählt, dass ein Primer
außerhalb der eingesetzten Homologiebereiche bindet und der zweite Primer innerhalb des
TRPC Promotors bzw. Terminators der Nourseothricin-Resistenzkassette. Eine
Zusammenfassung der Wachstumsexperimente und der PCR-Ergebnisse ist in Tabelle 2.1
dargestellt.
30
Tabelle2.1: Überprüfung des ChKU80 Knockouts
Wachstum auf PDA mit: PCR-Analysen:
Stamm clonNAT Hygromycin Hygromycin-Resistenz1
Internes ChKU80
Fragment2
5‘ HB3 3‘ HB4
Wildtyp
(5535)
- - - + - -
2831-1 + - - - + +
2831-3 + - - - + +
2831-6 + - - - + +
2831-11 + - - - + +
2831-22 + - - (+) - -
2830-1 + - + - + +
2830-8 + + + + + +
2830-9 + - - - + +
2830-14 + + + + - -
2830-15 + - + - + +
2830-17 + - - - + +
2830-19 + - + - + +
2830-25 + - - + - -
2830-29 + - - - + +
Primerkombinationen: 1CK2123/2124; 2CK2903/2904; 3CK2912/2913; 4CK2914/2915
Sieben von 14 untersuchten Stämmen zeigten die erwarteten PCR-Ergebnisse für einen
erfolgreichen Knockout von ChKU80. In zwei weiteren Stämmen (2830-1 und 2830-19)
konnte mittels PCR die homologe Rekombination im Lokus von ChKU80 nachgewiesen
werden, allerdings konnte auch das Hygromycin-Resistenzgen amplifiziert werden. Dies
könnte auf multiple Insertionen hindeuten, wobei eine homologe Rekombination und eine
ektopische Integration stattgefunden haben könnte. Unklar ist allerdings, warum diese
Stämme trotz des nachgewiesenen Hygromycin-Resistenzgens nicht auf entsprechenden
Platten wachsen konnten. Der Hygromycin-resistente Stamm 2830-14 zeigt das erwartete
Ergebnis für eine ektopische Integration der T-DNA. Für den Stamm 2830-8 konnten sowohl
das interne ChKU80 Fragment als auch beide Homologiebereiche amplifiziert werden.
Dieses widersprüchliche Ergebnis ist vermutlich durch Kontamination mit DNA von andere C.
higginsianum Stämmen zu erklären. Von den sieben Stämmen mit den erwarteten
Bandenmustern für einen erfolgreichen ChKU80-Knockout wurden 2831-3 und 2831-11 (in
31
Tabelle 2.1 rot markiert) als CY6021 und CY6022 als ΔChku80 Stämme in die
Stammsammlung aufgenommen.
Da die Gefahr multipler Insertionen der T-DNA in das Genom von C. higginsianum bestand,
wurden die ΔChku80 Stämme CY6021 und CY6022 mittels Southern-Blot Analysen auf
Einzelinsertionen überprüft. Chromosomale DNA wurde isoliert, mit PvuII bzw. XhoI
geschnitten und mit einem α-32P-dCTP markiertem PCR Fragment des Nourseothricin-
Resistenzgens (CK2656/2657) hybridisiert (siehe Abb. 2.5).
Abbildung 2.5: Southern-Blot Analyse von Chku80 Deletionsmutanten. (A) Schematische Darstellung des genomischen ChKU80 Lokus nach homologer Rekombination mit pDel-KU80-A/B (pCK2830/2831) und der daraus folgender Deletion von ChKU80. Zusätzlich sind die Abstände zwischen den Restriktionsschnittstellen von PvuII und XhoI annotiert. (B/C) Agarose-Gel nach der Gelelektrophorese (B) und der dazu gehörige Southern Blot mit XhoI bzw. PvuII geschnittener chromosomaler DNA von C. higginsianum Wildtyp (2) und den beiden ΔChku80 Mutanten CY6021 (3)
32
und CY6022 (4). Als Sonde diente ein α-32P-dCTP markiertes PCR-Fragment der ClonNAT (NatR) Resistenz. Als Positivkontrollen dienten jeweils 5 ng geschnittener pDel-Ku80-A (1): (1A) wurde mit PvuII geschnitten während (1B) mit XhoI geschnitten wurde
Beide analysierten ΔChku80 Stämme zeigten eine Bande der erwarteten Größe von 3400
Basenpaaren für den PvuII Restriktionsverdau und von 4500 Basenpaaren für XhoI und
bestätigten damit das PCR-Ergebnis. Da nur jeweils eine einzelne Bande sichtbar war, hat
folglich nur ein T-DNA Insertionsereignis im ChKU80 Lokus stattgefunden. Um sicher zu
stellen, dass nicht Teile der T-DNA oder des Vektors in das Genom inserierten und damit zu
unerwünschten Mutationen führten, wurde ein weiterer Southern-Blot mit dem gesamten
Deletionsplasmid pCK2831 als Sonde durchgeführt (nicht gezeigt). Auch bei diesen Blot
waren nur erwartete Banden sichtbar, wodurch keine weiteren Insertionen stattgefunden
haben.
Von den ursprünglich 400 Nourseothricin resistenten Transformanten waren 60 sensitiv
gegenüber Hygromycin und dadurch potentielle ΔChku80 Stämme. Von diesen wurden 14
näher untersucht und PCR-Analysen deuteten darauf hin, dass in sieben dieser Stämme
ChKU80 deletiert wurde, ohne das zusätzliche ektopische Insertionen vorlagen. Eine
Hochrechnung auf die 400 ursprünglichen Transformanten ergibt somit eine Rate von ca.
7,5% für den Knockout von ChKU80.
2.1.4 Der ΔChku80 Stamm CY6021 zeigt im Vergleich zum Wildtyp keine phänotypischen Veränderungen
Die erstellten ΔChku80 Knockoutstämme sollten eine effiziente Methode für gezielte
Modifikation von Genen mittels homologer Rekombination ermöglichen. Da die Stämme vor
allem zur Analyse von potentielle Pathogenitätsfaktoren genutzt werden sollten, war es
wichtig zu überprüfen, ob nicht der Knockout von ChKU80 schon zu einem veränderten
Phänotyp bei der Infektion von A. thaliana führte. Der ΔChku80 (CY6021) Stamm zeigte
einen ähnlichen Infektionsverlauf auf A. thaliana Col-0 Pflanzen bei Tropf- als auch bei
Sprühinfektionen wie der Wildtyp (Abb. 2.6A und B). Nach drei Tagen hatten 62% der
Appressorien Primärhyphen gebildet, wovon 11% bereits Sekundärhyphen bildeten. Einen
Tag später erhöhten sich diese Werte auf 74% für die Primärhyphenbildung sowie auf 70%
für die Bildung von Sekundärhyphen (Abb. 2.6C). Es wurde ebenfalls die Induktion
pflanzliche Abwehrreaktionen während der Infektion mittels Diaminobenzidin (DAB; Färbung
von ROS) und Anilinblaufärbung (Nachweis von Callose) untersucht. Dabei zeigte sich, dass
9% der Appressorien eine Callose-Ablagerung induzierten (Abb. 2.6F) und bei 4% der
infizierten Zellen war eine DAB-Färbung sichtbar (Abb. 2.6H). Diese Werte waren etwas
33
niedriger als die beobachteten Werte für C. higginsianum Wildtyp (11,2% Callose, 6,7%
ROS; Abb. 2.6E und F).
34
Abbildung 2.6: Phänotypische Charakterisierung des ΔChku80 Stammes CY6021. (A,B) Makroskopische Symptome nach fünf Tagen einer Sprühinfektion mit jeweils 1x106 Konidien/ml von C. higginsianum Wildtyp (A) und dem ΔChku80 Stamm CY6021 (B). (C, D) Trypanblau Färbungen von A. thaliana Blätter vier Tage nach der Infektion mit C. higginsianum Wildtyp (C) und CY6021 (D). (E-H) Die Induktion pflanzlicher Abwehrreaktionen drei Tage nach der Sprühinfektion mit Wildtyp bzw. CY6021. Callose Ablagerungen wurden mit Anilinblau gefärbt (E, F) und H2O2 mit Diaminobenzidin (G, H). (I, J) In vitro Appressorienbildung auf 1,16-Hexadecandiol beschichteten Petrischalen nach14 h bei 25°C von Wildtyp (I) und dem ΔChku80 Stamm CY6021 (J). (L, M) Radiales Wachstum von CY6021 (ΔChku80) im Vergleich zum Wildtyp (WT) auf Czapek Dox (L) und PDA Platten (M) nach fünf (L) beziehungsweise drei Tagen (M). Größenmarker = 50 µm.
Die in vitro Appressorienbildung auf beschichteten Petrischalen zeigte mit ca. 98% keine
Auffälligkeiten. Form und Größe der gebildeten Appressorien waren mit denen des Wildtyps
vergleichbar (Abb. 2.6I und J). Zusätzlich wurde das vegetative Wachstum auf PDA
Vollmedium und Czapek Dox Minimal Medium Platten im Vergleich zum Wildtyp überprüft,
wobei kein Unterschied im Wachstum oder Morphologie des gebildeten Myzels festgestellt
(Abb. 2.6K und L) wurde. Somit unterscheiden sich die konstruierten ΔChku80 Stämme
phänotypisch nicht von den Wildtypstamm CY5535 und eigenen sich als Ausgangsstamm für
Konstruktion von Knockoutmutanten.
2.2 Identifizierung potentieller LysM-Effektorproteine von C. higginsianum und Untersuchung ihrer Bedeutung für die Infektion von A. thaliana
Colletotrichum higginsianum besitzt als hemibiotrophes Pathogen eine initiale biotrophe
Phase. In diesem Stadium sind die Primärhyphen auf eine Epidermiszelle begrenzt und die
Wirtszelle ist intakt (Connell et al., 2004). Der induzierte Zelltod (Hypersensitive Response,
HR) während dieser frühen Stadien der Infektion stellt einen effektiven Abwehrmechanismus
der Pflanze gegenüber biotrophe und hemibiotrophe Pathogene dar (Gilchrist, 1998; Heath,
2000). In der biotrophen Phase von C. higginsianum ist es daher vermutlich erforderlich,
ähnlich wie für biotrophe Pathogene, pflanzliche Abwehrreaktion zu vermeiden oder zu
unterdrücken (O’Connell et al., 2006). Chitin ist ein Hauptbestandteil pilzlicher Zellwände und
kann als PAMP (Pathogen assoziiertes molekulares Muster) von Pflanzen erkannt werden,
wodurch Abwehrreaktionen induziert werden (Boller, 1995; Boller et al., 2009; Lee et al.,
2008). Der A. thaliana Chitin-Rezeptor CeBIP/CERK1 enthält LysM-Domänen, welche die
Bindung an Chitin-Oligosacchariden vermitteln (Miya et al., 2007). Das Lysin Motiv (LysM)
wurde zuerst im Lysozym der Bakteriophage Φ29 entdeckt (Garvey et al., 1986). Seitdem
wurden über 4000 Proteine mit LysM-Domänen identifiziert. Darunter befinden sich vor allem
sekretierte Proteine, Membranproteine und zellwandgebundene Proteine. LysM-Domänen
haben eine Länge von 44 bis 65 Aminosäuren und binden ein großes Spektrum von
Peptidoglykane und unter anderem Chitin (Buist et al., 2008). Für den sekretierten Effektor
Ecp6 von Cladosporium fulvum konnte gezeigt werden, dass er drei LysM-Domänen enthält
die Chitin-Oligomere binden. Durch die Bindung an Ecp6 kommt es zu einer Maskierung der
35
freien Chitin-Oligomere im Apoplasten wodurch die Erkennung dieser Moleküle durch den
Wirt unterdrückt wird (de Jonge et al., 2010). Potentielle Effektorproteine mit LysM-Domänen
konnten in mehreren phytopathogenen Pilzen identifiziert werden (Bolton et al., 2008). Für
Magnaporthe oryzae Slp1 (Mentlak et al., 2012) und Mycosphaerella graminicola Mg3LysM
(Marshall et al., 2011) konnte eine Unterdrückung der Chitin-vermittelten Induktion der
pflanzlichen Abwehr gezeigt werden. In Colletotrichum lindemuthianum wurde mit dem
monoklonalen Antikörper UB25 (Naomi et al., 1994; Pain et al., 1994) und anschließenden
Immunoscreening (Perfect et al., 1998) mit Cih1 (Colletotrichum intracellular hyphae 1) ein
sekretiertes Protein mit LysM-Domänen identifiziert. UB25 bindete auch an intrazelluläre
Hyphen von C. destructivum während der Infektion von Luzerne (Perfect et al., 2000). Die
Rolle von potentiellen Effektorproteinen mit LysM-Domänen für die Pathogenität von
Colletotrichum-Arten ist allerdings noch unbekannt und sollte im Rahmen dieser Arbeit an
Hand des C. higginsianum – A. thaliana Pathosystems untersucht werden.
36
2.2.1 Identifizierung von Proteinen mit LysM-Domänen in C. higginsianum
Um Ecp6 homologe Proteine und andere Proteine mit LysM-Domänen in C. higginsianum zu
identifizieren, wurde zunächst eine Gene/Feature Search mit dem Suchwort „LysM“
(Colletotrichum Sequencing Project, Broad Institute of Harvard and MIT
(http://www.broadinstitute.org/)) durchgeführt. Damit wurden 21 Proteine (siehe Tabelle 2.2)
identifiziert, die zum großen Teil als LysM-domain containing protein annotiert waren. Mit
Hilfe von InterProScan (Jones et al., 2014) wurde anschließend die Anzahl der LysM-
Domänen bestimmt und auch gleichzeitig die automatische Annotation überprüft. Da Ecp6
und Slp1 sekretiert werden um extrazelluläre Chitin-Oligomere zu binden, wurde in den
identifizierten Sequenzen mittels SignalP (Petersen et al., 2011) nach potentiellen
Signalpeptiden gesucht (siehe Abb. 2.7A). Zudem wurden für die identifizierten Transkripte
die verfügbaren RNASeq-Daten aus verschiedenen Stadien der Infektion von C.
higginsianum analysiert (O’Connell et al., 2012). Die Reads jedes Gens in jedem Stadium
wurden relativ zu der Gesamtanzahl der Reads des entsprechenden Stadiums normalisiert.
Zum Vergleich wurde Tubulin (ChTUBα, CH063_01222) in Tabelle 2.2 aufgenommen.
Tabelle 2.2: C. higginsianum Proteine mit vorhergesagten LysM-Domänen
1Anzahl von LysM-Domänen (InterProScan); 2Vorhandensein eines Signalpeptides (SignalP); 3Mittels RNASeq bestimmte Expressionsdaten (O’Connell et al., 2012): in vitro Appressorien (VA), in planta Appressorien (PA), biotrophe Phase (BP), nekrotrophe Phase (NP); *fehlendes 5‘ oder 3‘-Ende
Protein LysM1 Länge SP2 VA3 PA3 BP3 NP3 CH063_13023 2 171 AS + 2 47 1038 1412 CH063_04445 2 177 AS + 1 125 1665 1733 CH063_04323 2 302 AS + 3 12 11 413 CH063_05398 1 271 AS - 0 12 11 33 CH063_08917 2 132 AS - 0 1 1 84 CH063_06689 1 83 AS + 1 1 5 96 CH063_02233 1 187 AS - 109 79 81 50 CH063_05984 1 264 AS* - 159 44 36 66 CH063_16043 2 144 AS - 0 1 1 0 CH063_00259 2 314 AS* + 0 1 1 0 CH063_02695 - 587 AS - 112 257 220 133 CH063_04608 - 150 AS + 0 1 1 131 CH063_04710 1 122 AS - 1 2 2 0 CH063_04951 1 107 AS - 0 1 1 0 CH063_05461 2 355 AS - 0 1 1 0 CH063_08603 1 100 AS - 1 3 3 0 CH063_11929 3 226 AS* - 1 2 2 1 CH063_12049 - 69 AS* - 0 1 1 0 CH063_13294 - 371 AS + 1 1 1 1 CH063_15796 - 272 AS* + 0 1 1 1 CH063_16015 2 377 AS* - 1 2 1 1 CH063_01222 (ChTUBα) - 451 AS - 603 752 862 2048
37
Obwohl sie durch die automatische Annotation als LysM-domain containing protein benannt
wurden, konnten in fünf Treffern mittels InterProScan keine LysM-Domänen identifiziert
werden. Sie wurden daher für weitere Analysen nicht weiter betrachtet. Für CH063_05398
wurde neben einer LysM Domäne zusätzlich eine CVNH-Domäne vorhergesagt (siehe Abb.
2.7A). Diese Domäne wurde ursprünglich in Cyanovirin-N des Cyanobakteriums Nostoc
ellipsosporum identifiziert und wird mit der Bindung von verschiedenen Zuckern in
Verbindung gebracht (Percudani et al., 2005). Leider ist die Proteinsequenz in den
Genomdaten unvollständig (fehlendes 5‘ Ende) und wurde daher nicht weiter untersucht.
Bemerkenswert war der große Anteil an Genen mit sehr schwacher Expression. 11 Gene
zeigten dabei ermittelte Werte von nur 0-3 Reads was darauf hindeutet, dass diese Gene
nicht exprimiert werden. Von den ursprünglich 21 Proteinen erfüllen nur drei die
theoretischen Voraussetzungen um potentielle LysM-Effektoren zu sein (CH063_13023,
CH063_04445, CH063_04323). Diese drei Proteine weisen wie ClCih1 aus Colletotrichum
lagenarium und MoSlp1 aus Magnaporthe grisea ein vorhergesagtes Signalpeptid und zwei
putative LysM-Domänen auf (siehe Abb. 2.7A). CH063_13023 und CH063_04445 zeigen
zudem laut RNASeq Daten eine starke Expression während der biotrophen Phase. Diese
beiden Proteine zeigten ebenfalls in reziproken BLAST-Analysen mit Cih1 aus C. lagenarium
(ClCih1) die größte Übereinstimmung auf. Sie wurden in weiteren als ChCih1 (CH63_13023)
und ChCih2 (Ch063_04454) bezeichnet. ChCih1 weist folgende Identitäten zu bereits
beschriebenen Proteinen mit LysM-Domänen auf: 57% mit Magnaporthe oryzae Slp1
(MoSlp1), 28% mit C. lagenarium Cih1 (ClCih1) und 33% mit Ecp6. Für ChCih2 ergeben sich
entsprechende Übereinstimmungen von: 41% mit MoSlp1, 38% mit ClCih1, 37% mit Ecp6
und 51% mit ChCih1 (siehe Alignment in Abb. 2.7B). Das dritte potentielle LysM-
Effektorprotein CH063_4323 weist nur 11% Identität mit ClCih1 auf und wurde daher nicht in
das Alignment in Abb. 2.7B einbezogen. Aufgrund seiner sonstigen Charakteristika wurde es
im Folgenden als ChLysM3 bezeichnet und auch weiter untersucht.
38
Abbildung 2.7: C. higginsianum Proteine mit LysM-Domänen. (A) Domänenstruktur von LysM-Proteinen. Rot: Signalpeptid; Schwarz: vorhergesagte LysM Domänen; Blau: vorhergesagte CVNH-Domänen (B) Protein Alignment von Proteinen mit vorhergesagten LysM-Domänen. Das Alignment von C. lagenarium ClCih1, C. higginsianum ChCih1 und ChCih2, Magnaporthe oryzae MoSlp1 und Cladosporium fulvum Ecp6 wurde mit Hilfe der Geneious Tree-Building Software erzeugt (ClustalW Alignment; BLOSUM cost matrix). Mittels InterProScan identifizierte LysM-Domänen sind gelb markiert.
Das Alignment von ChCih1 und ChCih2 mit ClCih1, MoSlp1 und Ecp6 zeigt, dass die
Übereinstimmungen am stärksten in den vorhergesagten LysM-Domänen sind. ChCih1 und
ChCih2 haben mit MoSlp1 die größte Ähnlichkeit, alle drei Proteine haben eine vergleichbare
Größe und zwei vorhergesagte LysM-Domänen. Im Gegensatz dazu besitzt ClCih1 ein
Abschnitt von ca. 45 Aminosäuren, der in den anderen Proteinen nicht vorhanden ist. Ecp6
besitzt als einziges der untersuchten Proteine am C-Terminus eine dritte LysM-Domäne.
B
39
2.2.2 Untersuchung der Expression und Lokalisation von ChCih1 und ChCih2
Um die Expression und Lokalisation von ChCih1 und ChCih2 während verschiedener
Stadien der Infektion von A. thaliana untersuchen zu können, wurden für beide Gene
Reportergenfusionen konstruiert. Für ChCih1 wurde dabei sowohl ein Fusionsprotein mit C-
terminalen GFP (Bachelorarbeit Katharina Pracht) in pPK2 (pPK2-Cih1-GFP) als auch ein
ChCih1-mCherry Reporterkonstrukt in pPN (pPN-Cih1-mCherry) hergestellt. ChCIH1 (ohne
Stopcodon) wurde zusammen mit 1000 bp der potentiellen Promotorregion mittels PCR
amplifiziert und in Plasmiden mit bereits vorhandenen GFP bzw. mCherry kloniert. Die
dadurch entstandenen Reporterkonstrukte wurden anschließend in pPK2 oder pPN kloniert
(sieh Abb. 2.8A und B). Der C. higginsianum Wildtypstamm CY5535 wurde mittels ATMT mit
den entsprechenden Plasmiden pPK2-Cih1-GFP (pCK2783) und pPN-Cih1-mCherry
(pCK2842) transformiert und die Expression der Fusionsproteine analysiert.
40
Abbildung 2.8: Lokalisierung und Expression von ChCih1-GFP bzw. ChCih1-mCherry. (A/B) Schematische Darstellung der T-DNA von pPK2-Cih1-GFP (pCK2783; A) und pPN-Cih1-mCherry (pCK2842; B). LB/RB: Left bzw. Right Border; Pcih1: 1000 Basenpaare der potentiellen ChCIH1 Promotorregion (C/D) Fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen (C: Durchlicht und D: GFP-Filter) von in vitro Appressorien von CY5952 (Cih1-GFP) auf beschichteten Petrischalen 12 h nach der Induktion der Appressorienbildung. (E-F) A. thaliana Col-0 Pflanzen wurden mit 1x106 Konidien/ml sprühinfiziert und nach drei bzw. vier Tagen mittels konfokaler Mikroskopie untersucht. (E/F) Infektion mit CY5951 (Cih1-GFP) nach drei (E) bzw. vier Tagen (F). (G/H) Infektion mit CY5956 (Cih1-mCherry) drei (E) bzw. vier (H) Tagen. Penetrationshyphen wurden mit weißen Pfeilen markiert.
In in vitro Appressorien konnte keine Fluoreszenz für Cih1-GFP (Abb. 2.8C) und Cih1-
mCherry (Daten nicht gezeigt) beobachtet werden. Dies ist im Einklang mit den publizierten
Expressionsdaten (O’Connell et al., 2012), die nur geringe Werte in Appressorien für ChCIH1
zeigten (siehe Tabelle 2.2). Da es sich bei Cih1-GFP und Cih1-mCherry um potentiell
sekretierte Proteine handelt, könnte allerdings auch die starke Verdünnung des Proteins im
Medium eine Detektion am Fluoreszenzmikroskop verhindern. CIH1-GFP/mCherry-
exprimierende C. higginsianum Stämme zeigten bei der Infektion von A. thaliana eine mit C.
higginsianum Wildtyp (CY5535) vergleichbare Pathogenität (Daten nicht gezeigt). Drei Tage
41
nach der Infektion war mittels konfokaler Mikroskopie eine Vielzahl von Primärhyphen mit
starker Fluoreszenz an der Peripherie der Zellen zu beobachten (siehe Abbildung 2.8E und
G). Dies ist im Einklang mit der beobachteten Bindung des ClCih1-spezifischen Antikörpers
UB25 an die Zellwand von intrazellulären Hyphen von C. lagenarium (Perfect et al., 1998).
Die Stärke des GFP bzw. mCherry –Signals entspricht auch den Ergebnissen der RNA-
Sequenzierung aus der biotrophen Phase (siehe Tabelle 2.2), die in diesem Stadium hohe
Werte aufwiesen. Im Gegensatz zu dem immunologischen Nachweis in C. lagenarium,
konnte ChCih1-GFP bzw. ChCih1-mCherry als sehr starkes Signal an Septen der Hyphen
beobachtet werden. Diese Beobachtung beruht möglicherweise auf dem Aufeinandertreffen
von zwei Zellwänden an den Septen, wodurch eine, in etwa doppelt so starke, Fluoreszenz
sichtbar war als am Rest der Zellwände. Die in planta gebildeten Appressorien zeigten
keinerlei Fluoreszenz, wohingegen die aus ihnen gebildeten Penetrationshyphen ChCIH1 zu
exprimieren schienen (Siehe Markierung in Abb. 2.8E und G). In frühen sekundären Hyphen
war ebenfalls Fluoreszenz an der Zellperipherie nachweisbar (Abb. 2.8F). Das Signal schien
allerdings schwächer zu sein als in Primärhyphen. In späten Sekundärhyphen war hingegen
keine eindeutige Fluoreszenz erkennbar, was auch durch den starken Hintergrund von
nekrotischen Gewebe zu erklären sein könnte (Abb. 2.8H).
Um zu überprüfen, ob ChCih1 ein extrazelluläres, sekretiertes Protein ist, wurde versucht
Cih1-mCherry zusammen mit einem Marker für die Plasmamembran zu exprimieren. Als
membrangebundenes Fusionsprotein diente dabei GFP mit angefügter Signalsequenz für
eine posttranskriptionale Prenylierung (CAAX-Box) des humanen K-ras (Apolloni et al., 2000)
am C-Terminus (Diplomarbeit Martin Korn). Die Nourseothricin-resistenten C. higginsianum
Stämme CY5956 und CY5957 mit starker Expression von ChCIH1-mCherry wurden mittels
ATMT mit pGFP-CAAX-A (pCK2660) bzw. pGFP-CAAX-B (pCK2661) (GFP-CAAX,
Hygromycin-Resistenzkassette) transformiert. Die erhaltenen Hygromycin-resistenten
Transformanten wurden anschließend für eine Sprühinfektion von A. thaliana Col-0 Pflanzen
verwendet, um mittels konfokaler Mikroskopie die Lokalisation von Cih1-mCherry relativ zu
der GFP-markierten Plasmamembran zu analysieren (siehe Abb. 2.9).
42
Abbildung 2.9: Cih1-mCherry zeigt keine Kolokalisation mit GFP-CAAX. A. thaliana Col-0 wurde mit C. higginsianum Stämmen mit Koexpression von Cih1-mCherry und Plasmamembran-gebundenen GFP (GFP-CAAX) infiziert. Dargestellt sind konfokale Aufnahmen dieser Infektion nach vier Tagen. Die Fluoreszenzkanäle für GFP-CAAX (GFP) und Cih1-mCherry (mCherry) sind zum einen einzeln abgebildet und zum andere als Overlay beider Kanäle.
Bei der gleichzeitigen Expression von Cih1-mCherry und GFP-CAAX ergaben sich allerdings
Probleme. Die erhaltenen Transformanten zeigten oft nur entweder GFP- oder mCherry
Fluoreszenz, wobei sich das Expressionsmuster auch in den einzelnen Zellen eines
Stammes unterscheiden konnte. In einigen Transformanten war sogar keinerlei Fluoreszenz
43
erkennbar, obwohl für die Transformation mit dem GFP-CAAX Konstrukten die Cih1-
mCherry exprimierenden Stämme CY5956 und CY5957 als Ausgangsstämme verwendet
wurden. In den wenigen Hyphen mit Expression von GFP-CAAX und Cih1-mCherry zeigten
die beiden Fusionsproteine keine Kolokalisierung (siehe Abb. 2.9). Die mCherry-Fluoreszenz
von Cih1 war deutlich außerhalb der GFP-markierten Plasmamembran lokalisiert. Daher
kann man bei ChChi1 von einem sekretierten, extrazellulären Protein ausgehen, was sich
entweder in der pilzlichen Zellwand oder zwischen pilzlicher Zellwand und Plasmamembran
der Wirtszelle befindet.
Für die Untersuchung der Lokalisation von ChCih2 wurden von Dr. Marlis Dahl C.
higginsianum Stämme mit Expression eines ChCih2-GFP Fusionsproteins zur Verfügung
gestellt. In den Stämmen CY6600 und CY6601 wird ChCih2 als Fusionsprotein mit N-
terminalen GFP unter der Kontrolle des eigenen Promotors exprimiert (500 Basenpaare).
Eine schematische Darstellung der T-DNA des für die Transformation verwendeten
Plasmides pCih2-GFP (pCK3061) ist in Abbildung 2.10A dargestellt.
44
Abbildung 2.10: Lokalisierung und Expression von ChCih2-GFP. (A) Schematische Darstellung der T-DNA von PChi2-GFP (pCK3061) LB/RB: Left bzw. Right Border; Pcih2: 500 Basenpaare potentielle ChCIH2 Promotorregion, T35S: CaMV 35S Terminator. (B-E) A. thaliana Col-0 Pflanzen wurden mit 1x106 Konidien/ml von CY6600 (B/C) bzw. CY6601 (D/E) sprühinfiziert und nach vier Tagen mittels konfokaler Mikroskopie analysiert. Größenmarker = 20 µm
Die beobachtete Expression und Lokalisation von ChCih2-GFP ähnelt dabei sehr stark der
von ChCih1-GFP bzw. ChCih1-mCherry. In Konidien und in in vitro Appressorien war
keinerlei Fluoreszenz mikroskopisch detektierbar (nicht gezeigt). Ebenfalls war bei in planta
gebildeten Appressorien keine GFP-Fluoreszenz erkennbar (siehe Abb. 2.10B-E). Cih2-GFP
war an der Peripherie von Primärhyphen und jungen Sekundärhyphen lokalisiert. Der
spätere Infektionsverlauf konnte aufgrund des starken Hintergrundes (siehe Abb. 2.10E)
nicht analysiert werden, so dass keine Aussage über die Expression von ChCih2-GFP in
Sekundärhyphen getroffen werden konnte.
45
2.2.3 C. higginsianum LysM-Proteine ChCih1, ChCih2 und ChLysM3 sind für die Infektion von A. thaliana nicht erforderlich
Das Expressionsmuster und die Lokalisierung von ChCIh1 und ChCIh2 deuteten auf eine
mögliche Rolle dieser Proteine als Effektoren während der biotrophen Phase hin. Um den
Einfluss von ChCIH1 und ChCIH2 auf die Pathogenität von C. higginsianum zu untersuchen,
wurden für beide Gene Knockout Stämme hergestellt. Das entsprechende Deletionsplasmid
für ChCIH1 pDel-Cih1 (pCK3083) wurde von Dr. Marlis Dahl zur Verfügung gestellt und
enthält eine Hygromycin-Resistenzkassette, die von je 1000 bp langen ChCIH1-
Homologiebereichen (-1028 bis -23; +675 bis +1518) flankiert wird (siehe Abb. 2.11A). Die C.
higginsianum ΔChku80 Stämme CY6021 und CY6022 wurden mittels ATMT mit pDel-Cih1
transformiert. Zehn Hygromycin-resistente Stämme aus der Transformation von CY6021 und
elf aus der Transformation von CY6022 wurden anschließend mittels PCR auf den Knockout
von ChCIH1 hin überprüft.
Abbildung 2.11: Knockout von ChCIH1 mittels homologer Rekombination. (A) Schematische Übersicht der T-DNA von pDel-Cih1 und des genomischen Lokus von ChCIH1. Die Nummerierung ist relativ zum ersten Nukleotids des ORF von ChCIH1. (B) Genomischer Lokus von ChCIH1 nach erfolgreicher homologer Rekombination mit der T-DNA von pDel-Cih1. (C/D) Chromosomale DNA von jeweils vier Hygromycin-resistenten Stämmen aus der Agrobacterium tumefaciens vermittelten Transformation von CY6021 (Spuren 1-4) und von CY6022 (Spuren 5-8) mit pDel-Cih1 wurde isoliert und mittels PCR analysiert. Die Deletion eines internes Fragmentes von ChCIH1 (485 bp) wurde mit dem Primerpaar CK2808/2809 getestet (C) und die Integration der Hygromycin-Resistenzkassette in dem ChCIH1 Lokus (1582 bp) mit dem Primerpaar CK2919/3120 (D). 1-8: Chromosomale DNA von potentiellen ΔChCih1 Stämmen; WT: Chr. DNA von C. higginsianum Wildtypstamm CY5535; K: Wasserkontrolle
46
Zu einem wurde eine PCR für ein internes ChCIH1 Fragment durchgeführt (Abb. 2.11C). Im
Falle eines erfolgreichen Knockouts werden die Primerbindestellen deletiert, so dass im
Gegensatz zu chromosomaler DNA von C. higginsianum Wildtyp, kein Fragment amplifiziert
wird. In einer zweiten PCR wurde ein Primer mit Bindestelle vor dem eingesetzten 5‘-
Homologiebereich zusammen mit einem Primer mit Bindestelle innerhalb der Hygromycin-
Resistenz verwendet. Diese Primer können nur im Falle einer erfolgreichen homologen
Rekombination mit der T-DNA von pDel-Cih1 (pCK3083) ein Fragment amplifizieren. Von
acht Stämmen sind beispielhaft die Ergebnisse der PCR-Analyse in Abbildung 2.11
dargestellt. Von den insgesamt 21 untersuchten Stämmen zeigten 18 die erwarteten PCR-
Ergebnisse für einen erfolgreichen Knockout von ChCIH1. Dabei war kein Unterschied in der
Effektivität der homologen Rekombination im zwischen den beiden verwendeten ΔChku80
Ausgangsstämmen erkennbar (jeweils ca. 90%).
Das ChCIH2-Deletionsplasmid pDel-Cih2-hyg (pCK3072) wurde von Dr. Marlis Dahl zur
Verfügung gestellt und enthält in der T-DNA eine Hygromycin-Resistenzkassette, die von
ChCIH2-Homologiebreichen flankiert wird.
Abbildung 2.12: Knockout von ChCIH2 mittels homologer Rekombination. (A) Schematische Übersicht der T-DNA des ChCIH2-Deletionsplasmides pDel-Cih2-hyg (pCK3072) und des genomischen Lokus von ChCIH2. Die Nummerierung ist relativ zum ersten Nukleotid des ORF von ChCIH2. (B) Genomischer Lokus von ChCIH2 nach erfolgreicher homologer Rekombination mit der T-DNA des Deletionsplasmides pDel-Cih2-hyg (pCK3072).
Die erhaltenen ΔChcih1 und ΔChcih2 Stämme zeigten in Bezug auf das Wachstum auf
Oatmeal- oder PDA-Platten keine Auffälligkeiten im Vergleich zu den Ausgangsstämmen
(nicht gezeigt). Da die Knockoutmutanten des homologen Proteins Ecp6 von Cladosporium
fulvum eine reduzierte Pathogenität aufwiesen, wurden die ΔChcih1 und ΔChcih2 Stämme
für Sprühinfektionen von A. thaliana verwendet.
48
Abbildung 2.13: Infektion von A. thaliana mit ΔChcih1 und ΔChcih2 Stämmen. A. thaliana Pflanzen wurden mit jeweils 1x106 Konidien/ml von CY6090/CY6091 (ΔChcih1), CY6144/CY6145 (ΔChcih2) und den Parentalstamm CY6021 (ΔChku80) sprühinfiziert. (A) Nach drei und vier Tagen wurden einzelne Blätter mit Trypanblau gefärbt. Zusätzlich wurde nach vier Tagen die Bildung von Krankheitssymptomen makroskopisch untersucht. (B) Für die Analyse pflanzlicher Abwehrreaktionen wurden nach drei Tagen ebenfalls einzelne infizierte Blätter mit Anilinblau und Diaminobenzidin gefärbt. Größenmarker entspricht 50 µm.
Die Ausbildung makroskopischer Symptome der untersuchten Knockoutstämme war mit
denen des parentalen ΔChku80 Stammes vergleichbar. Nach vier Tagen waren sowohl auf
mit ΔChcih1 Stämmen infizierten Pflanzen, als auch auf mit ΔChcih2 Stämmen infizierten
Pflanzen deutliche nekrotische Stellen erkennbar (siehe Abb. 2.13). In den
Trypanblaufärbungen von infizierten Blättern zeigte sich keine reduzierte Ausbildung von in
49
planta gebildeten Infektionsstrukturen. Nach drei Tagen bildeten 54% der Appressorien von
CY6021 Primärhyphen aus, von denen 19% bereits Sekundärhyphen gebildet hatten. Die
ΔChcih1-Stämme CY6090 und CY6091 wiesen nach drei Tagen eine Primärhyphenbildung
von 56% und 57% auf sowie eine entsprechende Bildung von Sekundärhyphen von 25%
bzw. 17%. Die Stämme CY6144 und CY6145 mit Deletion von ChCIH2 zeigten ähnliche
Werte von 54% und 40% für die Primärhyphenbildung und 22% bzw. 19% für die
Sekundärhyphenbildung. Ein Auszählen der Trypanblaufärbungen nach vier Tagen war
aufgrund der stark fortgeschrittenen Infektion (siehe Abb. 2.13) nicht mehr möglich.
Da für das verwandte Protein Ecp6 aus Cladosporium fulvum eine direkte Bindung von
Chitinoligomeren und damit eine Maskierung von Chitin gezeigt werden konnte (de Jonge et
al., 2010), wurde vermutet, dass ein Verlust von PAMP-maskierenden LysM-
Effektorproteinen einen Einfluss auf die Erkennung von C. higginsianum durch den Wirt
haben könnte und daraus eine, im Vergleich zum Wildtyp, gesteigerte pflanzliche Abwehr
resultiert. Die Induktion pflanzlicher Abwehrreaktionen wurden deshalb durch DAB-und
Anilinblaufärbungen untersucht (Abb. 2.13B). Die Rate induzierter Papillen betrug für die
ΔChcih1 bzw. ΔChcih2 Deletionsmutanten zwischen 4% und 7% (CY6021 Ausgangsstamm
5%) und zwischen 9% und 14% der infizierten Epidermiszellen zeigten eine DAB-Färbung
(CY6021 13%). Eine Deletion von ChCIH1 oder ChCIH2 hatte damit keinen Einfluss auf die
Pathogenität von C. higginsianum oder auf die Induktion pflanzlicher Abwehrreaktionen von
A. thaliana.
ChCih1 und ChCih2 sind sich sehr ähnlich (52% Identität), besitzen beide zwei
vorhergesagte LysM-Domänen, zeigten als GFP-Fusionspotein eine ähnliche Lokalisierung
und könnten folglich redundante Funktionen besitzen. Deshalb wurde im Rahmen der
Bachelorarbeit von Moritz Hirsch Doppelmutanten hergestellt. Dafür sollte in ΔChcih1
Knockoutstämmen ChCIH2 deletiert werden. Das entsprechende ChCIH2-Deletionsplasmid
pDel-Cih2-bar wurde unter Verwendung des pOSCAR-Systems (Paz et al., 2011) kloniert.
Da der verwendete ΔChcih1-Ausgansstamm bereits gegenüber Hygromycin und
Nourseothricin resistent war, ergab sich die Notwendigkeit der Verwendung eines dritten
Selektionsmarkers. Als Abwandlung des pOSCAR-Systems wurde daher nicht pA-hyg-
OSCAR verwendet, sondern, der von Johannes Schmidpeter, konstruierte Vektor pA-bar-
OSCAR (persönliche Mitteilung). Dieser Vektor trägt eine Bialaphos-Resistenzkassette
(Phosphinothricin Acetyltransferase unter der Kontrolle eines 379 bp langen Aspergillus
nidulans TRPC-Promotors) und erlaubt damit die Generierung von Doppelmutanten. Die
ChCIH2-Deletionsplasmide pDel-Cih2-bar 1 bzw. 2 (pCK4179/pCK4180) wurden für die
Agrobacterium tumefaciens vermittelte Transformation von ΔChcih1 (CY6091) und dessen
ChKu80-defizienten Parentalstamm CY6021 verwendet. Die Selektion der Transformanten
50
erfolgte auf PDA-Platten mit Bialaphos. Die Selektion der Transformanten erfolgte auf PDA-
Platten mit Bialaphos.
Abbildung 2.14: Generierung von ΔChcIh2 und ΔChcih1/ΔChcih2 Knockoutstämmen. (A) Schematische Übersicht der T-DNA der ChCIH2-Deletionsplasmide pDel-Cih2-bar-1/2 und des genomischen Lokus von ChCIH2. Die Nummerierung ist relativ zum ersten Nukleotid des ORF von ChCIH2. (B) Genomischer Lokus von ChCIH2 nach erfolgreicher homologer Rekombination mit der T-DNA der Deletionsplasmide pDel-Cih2-bar. (C/D) Diagnostische PCRs mit isolierter chromosomaler DNA von 12 Stämmen aus der Transformation von CY6021 bzw. CY6091 mit pDel-Cih2-bar-1/2. Die erfolgreiche Integration der Bialaphos-Resistenzkassette in dem ChCIH2-Lokus wurde mit den Primerpaaren CY4225/4116 (C) und pCK4115/4163 (D) getestet. 1-6: Stämme aus der Transformation von CY6091 mit pDel-Cih2-bar-2; 7-8: CY6021 mit pDel-Cih2-bar-1; 9-10: CY6190 mit pDel-Cih2-bar-1; 11-12 CY6021 mit pDel-Cih2-bar-2; WT: chromosomale DNA aus CY6021; -; Wasserkontrolle; M: 1 kbp DNA Marker
Für sechs von acht untersuchten Stämmen aus der Transformation von CY6091 (ΔChcih1)
mit pDel-Cih2-bar 1/2 konnte die Insertion der Bialaphos-Resistenzkassette im Lokus von
ChCIH2 mittels PCR nachgewiesen werden. Die vier untersuchten Stämme aus der
51
Transformation von CY6021 (ΔChku80) wiesen alle das erwartete PCR-Ergebnis für einen
erfolgreichen Knockout von ChCIH2 auf. Zwei ΔChcih1/ΔChcih2 Stämme (CY6360
entspricht Spur 2 und CY6363 entspricht Spur 10 in Abb. 2.14C/D) wurden zusammen mit
dem ΔChcih2-Stamm (CY6367, Spur 8 in Abb. 2.14) und der parentale Stamm CY6021 für
die Sprühinfektion von A. thaliana verwendet.
Abbildung 2.15: C. higginsianum Stämme mit Deletionen von ∆Chcih1 und ∆Chcih2 zeigen keinen Pathogenitätsdefekt auf A. thaliana. A. thaliana Pflanzen wurden mit jeweils 1x106 Konidien/ml von CY6360, CY6363 (ΔChcih1ΔChcih2), CY6372 (ΔChcih3) und CY6021 (ΔChku80) sprühinfiziert. Nach drei Tagen wurden einzelne Blätter mit Trypanblau, Anilinblau und mit DAB gefärbt. Die Bildung makroskopischer Krankheitssymptome wurde nach vier Tagen untersucht. Größenmarker = 50 µm
Die Rate der Bildung von Primärhyphen nach drei Tagen war mit der des ΔChku80 Stammes
vergleichbar (>40%). Trypanblaufärbungen von infizierten Blättern von 4 dpi zeigten ein
starkes Geflecht von Sekundärhyphen (nicht gezeigt) und ein Auszählen der gebildeten
Infektionsstrukturen war nicht mehr möglich. Die Pathogenität der Stämme CY6360 und
52
CY6363 zeigte sich auch in der Ausbildung makroskopischer Symptome nach vier Tagen,
die mit denen des Kontrollstammes (CY6021) vergleichbar waren. Die Untersuchung der
induzierten pflanzlichen Abwehr in der Form von Callose-Papillen und H2O2-Freisetzung war
in den Stämmen mit Doppelknockout von ChCIH1 und ChCIH2 nicht erhöht. In Färbungen
mit Anilinblau waren Callose-Papillen unter ca. 10% aller Appressorien sichtbar. Weder die
Stämme mit ChCIH1 und ChCIH2 Doppelknockout noch die ΔChCIH2 Einzelmutante
CY6367 zeigten mehr DAB-Färbung als der ΔChku80 Kontrollstamm (<10%). Der Knockout
beider Gene hatte keine reduzierte Pathogenität oder eine verstärkte Abwehrreaktion von A.
thaliana zur Folge. Die vermutete redundante Funktion von ChCIH1 und ChCIH2 für die
Infektion von A. thaliana konnte daher nicht bestätigt werden.
Neben ChCIH1 und ChCIH2 wurde ChLYSM3 (CH063_04323) als potentieller LysM-Effektor
identifiziert. ChLysM3 enthält zwei vorhergesagte LysM-Domänen (Interproscan), zeigt aber
nur geringe Ähnlichkeiten zu ChCih1 (11% Identität) und ChCih2 (14% Identität). Im Rahmen
der Bachelorarbeit von Moritz Hirsch wurden Chlysm3 Knockoutstämme hergestellt und
analysiert. Die dafür klonierten ChLYSM3-Deletionsplasmide pDel-LysM3-1/2
(pCK4222/pCK4223; siehe Abb. 2.16A) wurden mittels des pOSCAR-Systems hergestellt. Im
Gegensatz zu den ChCIH2-Deletionsplasmid pDel-Cih2-bar wurde eine Hygromycin-
Resistenzkassette verwendet. Daher wurden auch keine Doppelknockouts mit ChCIH1 oder
ChCIH2 erstellt. pDel-Lys3-1 und pDel-Lys3-2 wurden mittels ATMT in C. higginsianum
ΔChku80 (CY6021) transformiert. Die erhaltenen Stämme wurden auf PDA-Platten mit
Hygromycin selektioniert und mittels PCR auf den Knockout von ChLYSM3 untersucht (siehe
Abb. 2.16C)
54
Abbildung 2.16: Generierung und Pathogenität von C. higginsianum Stämmen mit Deletion von ChLYSM3. (A) Schematische Übersicht der T-DNA der ChLYSM3-Deletionsplasmide pDel-LysM3 und des genomischen Lokus von ChLYSM3. Die Nummerierung ist relativ zum ersten Nukleotid des ORF von ChLYSM3. (B) Genomischer Lokus von ChLYSM3 nach erfolgreicher homologer Rekombination mit der T-DNA der Deletionsplasmide pDel-Lys3 1/2. (C) Diagnostische PCRs mit isolierter chromosomaler DNA von 10 Stämmen aus der Transformation von CY6021 mit pDel-LysM3-1 (Spuren1-6) und pDel-Lys3-2 (Spuren 7-10). Die erfolgreiche Integration der Hygromycin-Resistenzkassette in dem ChLYSM3-Lokus wurde mit den Primerpaar CY4164/3262 überprüft. K: chromosomale DNA aus CY6021; -; Wasserkontrolle; M: 1 kbp DNA Marker. (D) A. thaliana Pflanzen wurden mit jeweils 1x106 Konidien/ml von CY6371, CY6373 (ΔChlysm3) und CY6021 (ΔChku80) sprühinfiziert. Nach drei und vier Tagen wurden einzelne Blätter mit Trypanblau gefärbt. Die Bildung makroskopischer Krankheitssymptome ist nach vier Tagen dargestellt. Größenmarker =50 µm
Acht von zehn der untersuchten potentiellen ΔChlysm3 Stämme zeigten das erwartete PCR-
Ergebnis für eine Integration der Hygromycin-Resistenzkassette in den ChLYSM3-Lokus
(siehe Abb. 2.16C). Die Pathogenität von CY6371 (Spur 3 in Abb. 2.16B) und CY6372 (Spur
8 in Abb. 2.16B) wurde mittels Sprühinfektion von A. thaliana mit der des ΔChku80
Ausgangstammes CY6021 verglichen. Die Ausbildung von Krankheitssymptomen in Form
von makroskopisch sichtbaren Läsionen auf infizierten Blättern war für alle drei Stämme
nach vier Tagen deutlich sichtbar (siehe Abb. 2.16 D). Trypanblaufärbungen von infizierten
Blättern nach drei und vier Tagen zeigten eine vergleichbare Bildung von Primär-und
Sekundärhyphen der ΔChlysm3-Stämme CY6371 und CY6372 mit dem Ausgangsstamm
CY6021. Die Bildung von Callose-Papillen unter Appressorien wurde mittels
Anilinblaufärbung ebenfalls analysiert und zeigte keine verstärkte Induktion dieser
Abwehrreaktion auf Blättern infiziert mit CY6371 oder CY6372 (nicht gezeigt).
Die untersuchten C. higginsianum Stämme ΔChcih1, ΔChcih2, ΔChcih1/ΔChcih2 und
ΔChlysm3 zeigten bezüglich des Wachstums auf Platten mit PDA- und OMA-Medium keine
Auffälligkeiten. Die Analyse der Pathogenität auf A. thaliana dieser Stämme zeigte eine
vergleichbare Ausbildung makroskopisch sichtbarer Symptome und Ausbildung von Primär-
bzw. Sekundärhyphen zu dem ΔChku80 Ausgangsstamm.
55
2.3 Identifikation von C. higginsianum Pathogenitätsfaktoren mittels Insertionsmutagenese 2.3.1 Herstellung von C. higginsianum T-DNA Insertionsmutanten und Identifikation von C. higginsianum Pathogenitätsmutanten (vir-Mutanten)
Für die Generierung einer Kollektion von C. higginsianum Mutanten wurde in der AG Koch
eine zufällige T-DNA Insertionsmutagenese durchgeführt. Mittels ATMT wird die T-DNA in
die zu transformierende Zelle übertragen und durch non-homologous end joining (NHEJ) in
zufälligen Stellen des Genoms inseriert (Michielse et al., 2005). Im Gegensatz zur einer
chemischen Mutagenese wie zum Beispiel mit EMS (Ethylmethansulfonat) welche
Punktmutationen durch die Alkylierung von einzelnen Nukleotiden zur Folge hat, besitzt die
Insertionsmutagenese den entscheidenden Vorteil, dass durch die Kenntnis der Sequenz der
inserierten DNA der Insertionsort und damit der Mutationsort bestimmt werden kann. Durch
die Verwendung von ATMT können zudem einige Probleme anderer Techniken der
Mutagenese wie REMI (Restriction enzyme mediated insertion) umgangen bzw. minimiert
werden. So ist für die Transformation mittels Agrobakterien keine vorherige Präparation von
Protoplasten erforderlich, da direkt Konidien eingesetzt werden können. Des Weiteren ist der
berichtete Prozentsatz unmarkierter Mutationen vergleichsweise gering (Michielse et al.,
2005; Weld et al., 2006). Für Mutagenesen mit REMI wurden hingegen Raten von 20-100%
für unmarkierte Mutationen beschrieben, bei denen der Ort der Mutagenese nur schwer
bestimmt werden kann (Balhadère et al., 1999; Linnemannstöns et al., 1999; Sánchez et al.,
1998; Sweigard et al., 1998).
Für die Generierung einer Bibliothek von T-DNA Mutanten wurde der C. higginsianum
Wildtypstamm CY5535 mittels eines modifizierten Protokolls für ATMT (J. Rühl, Masterarbeit;
Material und Methoden) mit dem binären Plasmid pPK2 (Covert et al., 2001) transformiert.
Die T-DNA von pPK2 enthält eine Hygromycin-Resistenzkassette (sieh Abb. 2.17A) unter der
Kontrolle des GAPDH-Promotors und des Terminators von TRPC aus Aspergillus nidulans.
Die Selektion von Bakterien erfolgt über eine Kanamycin-Resistenz außerhalb der T-DNA.
Die erhaltenen Transformanten (sieh Abb. 2.17B) wurden auf PDA-Platten mit Hygromycin
vereinzelt und anschließend auf OMA-Medium vermehrt um Glycerinkulturen anzulegen.
Zusammen mit Susanne Müller, Marlis Dahl und Johanna Rühl wurden auf diese Weise
insgesamt über 7000 T-DNA Insertionsmutanten von C. higginsianum generiert (Korn et al.,
2015).
56
Abbildung 2.17: Herstellung einer Bibliothek von C. higginsianum T-DNA Insertionsmutanten. (A) Vektorkarte von pPK2: KanR: Kanamycin-Resistenz; Pgdp: Promotor von GAPDH aus Aspergillus nidulans; hph: Hygromycin-Resistenz; TtrpC: Terminator von TrpC aus Aspergillus nidulans; RB: „right border“; LB: „left border“. (B) Beispielhaftes Ergebnis einer Transformation von C. higginsianum; circa acht Tage nach der Transformation sind Hygromycin-resistente Transformanten auf den Selektionsplatten erkennbar. Diese wurden anschließend vereinzelt und in multi-well Platten mit OMA-Medium vermehrt (C).
Die erhaltenen Transformanten wurden mittels Tropfinfektionen von A. thaliana hinsichtlich
ihrer Pathogenität untersucht und von 7227 getesteten Stämmen zeigten 75 Stämme
reproduzierbar eine reduzierte Pathogenität (Korn et al., 2015). Da alle Stämme über
Konidiensuspensionen vermehrt wurden, konnten keine Mutanten mit Defekten in der
Bildung von Konidien isoliert werden. Ebenso konnten Mutanten mit sehr stark reduziertem
Wachstum auf PDA nicht mit einbezogen werden, da deren Kolonien auf den
Transfomationsplatten erst später sichtbar geworden wären.
Im Rahmen dieser Arbeit wurden einige dieser vir-Mutanten (virulenz) näher phänotypisch
und genotypisch charakterisiert.
57
2.3.2 Analyse der T-DNA Insertionen ausgewählter C. higginsianum vir-Mutanten
Für die Generierung der vir-Mutanten wurde eine T-DNA Insertionsmutagenese mit ATMT
als Transformationssystem verwendet. Ein großes Problem der Transformation mittels
Agrobakterien stellen multiple Insertionen, entweder als Tandem-Insertionen im gleichen
Lokus oder in verschiedenen Stellen des Genoms dar. Der Prozentsatz von T-DNA
Einzelinsertionen schwankt in der Literatur je nach Organismus und verwendeten
Transformationsparametern zwischen 20%-70% für C. graminicola (Flowers and
Vaillancourt, 2005, Münch et al., 2011), 70% für Colletotrichum acutatum (Talhinhas et al.,
2008) bis 80% für Magnaporthe grisea (Meng et al., 2007). In einer ähnlichen T-DNA
Insertionsmutagenese von C. higginsianum (Huser et al., 2009) enthielten 58% der T-DNA
Mutanten Einzelinsertionen und 72% der Mehrfach-Insertionen lagen in Tandem im gleichen
genomischen Lokus vor. Multiple Insertionen können dabei in verschiedenen Konfigurationen
vorliegen und unter anderem direkte oder invertierte Verknüpfungen von T-DNAs besitzen
oder auch Deletionen von Teilen der T-DNA aufweisen (Kwok and Nester, 1985; Spielmann
and Simpson, 1986). Die Nomenklatur bezieht sich dabei auf die jeweiligen Border Regionen
der T-DNA, wobei die Right Border als „Head“ und die left Border als „Tail“ bezeichnet wird.
Eine schematische Übersicht der möglichen Insertionen von zwei T-DNAs ist in Abbildung
2.18 dargestellt. Allerdings können auch mehrere T-DNAs (>2) in unterschiedlichen Arten
inserieren, wodurch sich die Anzahl der möglichen Konformationen stark erhöht.
58
Abbildung 2.18: Schematische Darstellung der möglichen Insertionen von zwei T-DNAs. Zwei T-DNAs können an unterschiedlichen Stellen im Genom inserieren (A) oder als Tandems zusammen in das Genom übertragen werden (B-D). Je nach Orientierung der einzelnen T-DNAs zueinander, können diese Tandems als Head to Tail (B), Head to Tail (C) oder Tail to Tail (D) Insertionen vorliegen. Ein weiteres potentielles Problem ist das ungenaue Schneiden der T-DNA an Right und Left
Border durch die virD1-virD2 Endonklease (Pansegrau et al., 1993) und die dadurch
verursachte Insertion von Sequenzbereichen des Vektors außerhalb der T-DNA in das
Genom. Der beschriebene Prozentsatz der T-DNA Insertionen mit zusätzlicher Übertragung
des gesamten Vektors erreicht dabei Werte von 50% in Fusarium circinatum (Covert et al.,
2001) und bis zu 70% in Colletotrichum graminicola (Flowers and Vaillancourt, 2005). Die
Abbildung 2.19 zeigt einen beispielhaften Southern-Blot um die Arten der erhaltenen T-DNA
Insertionen von vir-Mutanten zu demonstrieren.
59
Abbildung 2.19: Analyse der T-DNA Insertionen von neun vir-Mutanten. (A) Schematische Darstellung einer T-DNA Einzelinsertion mit eingezeichneten Schnittstellen der für den Southern Blot verwendeten Restriktionsenzyme und die daraus resultierende minimalen Bandengrößen. Rot: BamHI; Grün: SalI; Blau: NcoI. (B) Chromosomale DNA aus C. higginsianum Wildtypstamm CY5535 bzw. aus neun vir-Mutanten wurde isoliert, mit BamHI und SalI bzw. nur mit NcoI geschnitten und auf ein 0,8% Agarosegel aufgetrennt. Als Hybridisierungssonde wurde ein 32P-markiertes PCR-Fragment der Hygromycin-Resistenz (Primer pCK2123 und pCK2124) eingesetzt. Als Marker wurden jeweils 3 µl des 1 kbp DNA-Längenstandards von PeqLab verwendet, der aus unbekannten Gründen mit der eingesetzten Sonde hybridisierte. Als Positivkontrolle wurde NcoI-verdauter pPK2 verwendet. Die Belichtungszeit in der Filmkassette bei -80°C mit Verstärkerfolie betrug 22 h. NcoI schneidet innerhalb der Hygromycin-Resistenz, wodurch in einem Southern Blot bei
einer Einzelinsertion zwei Banden mit Größen von mindestens 1700 bp und 2800 bp zu
erwarten sind. Wie erwartet zeigte der Wildtyp (CY5535) keine definierten Banden, da dieser
das Resistenzgen für Hygromycin nicht enthält. Vir-55 zeigte zwei Banden, was auf eine
Einzelinsertion hindeutet. Für die Charakterisierung der Insertionen von vir-101 sind
aufgrund des nicht eindeutigen Bandenmusters zusätzliche Analysen notwendig. Die
chromosomalen DNAs der verbleibenden vir-Mutanten des gezeigten Southern Blots wurden
jeweils mit BamHI und SalI geschnitten. Die Restriktionsschnittstelle von BamHI auf der T-
DNA von pPK2 befindet sich upstream und die Schnittstelle für SalI downstream der
Hygromycin-Resistenz. Bei einer Einzelinsertion ist daher jeweils nur eine einzelne Bande
mit Mindestgrößen von 1700 bp bzw. 2800 bp zu erwarten (Abb. 2.19A), wo hingegen
multiple Banden auf dementsprechend mehrere Insertionen hindeuten. Eine Übersicht der
erwarteten Mindestgrößen der Banden ist in Tabelle 2.3 zusammengefasst.
Tabelle 2.3: Erwarte Bandengrößen für verschiedene T-DNA Insertionen
1 Angaben mit „+“ stellen Mindestgrößen dar
Vir-100 zeigte zwischen den Restriktionsverdaus mit BamHI (zwei Banden) und SalI (drei
Banden) eine ungleiche Anzahl an Banden. Dieses Bandenmuster könnte auf eine
Tandeminsertion von zwei T-DNAs mit Left Border an Left Border (Tail to Tail) und einer
zusätzlichen zweiten, unabhängigen T-DNA Insertion hindeuten. Allerdings könnte auch die
Insertion von drei T-DNAs (dabei zwei mit Tail to Tail Verbindung) im gleichen genomischen
Größen der erwarteten Banden in Basenpaaren (gerundet)1
Verdau mit BamHI Verdau mit SalI Einzelinsertion 3600+ 2400+ Zwei unabhängige Insertionen
3600+ 3600+
2400+ 2400+
Head to Tail Insertion 3600+ 4600
4500 2400+
Head to Head Insertion 3600+ 3600+
4800
Tail to Tail Insertion 7100 2400+ 2400+
60
Lokus das Bandenmuster ergeben. Das Muster von vir-54 mit jeweils zwei Banden pro
Verdau deutet auf zwei unabhängige T-DNA Insertionen hin. Die größere der zwei Banden
ist allerdings sehr groß (>10 kbp) und könnte durch insertion von großen Teilen von pPK2
(oder des gesamten Vektors) in das Genom hervorgerufen worden sein. Im Gegensatz dazu
deuten die kleinen Banden (<2000 bp) im BamHI Restriktionsverdau von vir-102 und vir-72
auf unvollständige Insertionen von T-DNAs hin. Da die restlichen Banden von vir-103 und vir-
72 der Größe der T-DNA entsprechen (4500 bp), handelt es sich dabei vermutlich um
Tandem Insertionen (Head to Tail; Right Border an Left Border) von zwei T-DNAs. Die
Bandenmuster von vir-103, vir-26 und vir-56 deuten ebenfalls auf multiple Insertionen hin,
sind aber durch eine Tandeminsertion von zwei T-DNAs nicht zu erklären und erfordern
weitere Analysen.
Viele Transformanten zeigten Banden in der Größe der T-DNA (4500 bp) oder wiesen eine
ungleiche Anzahl an Banden im SalI und BamHI-Restriktionsverdau auf (Siehe Abb. 2.19B).
Daher besitzen diese Mutanten vermutlich Tandeminsertionen in verschiedenen
Konfigurationen, wobei vor allem Head to Tail Verbindungen von zwei T-DNAs identifiziert
werden konnten. Sequenzierungen von erhaltenen Verknüpfungen zeigten, dass die
Verbindungen zweier T-DNAs nicht aus vollständigen 25 bp Left Border und Right Border
Bereichen bestehen, sondern aus chimären oder verkürzten Sequenzbereichen (siehe
Abbildung 2.20). Dieses Sequenzen einiger vir-Mutanten waren identisch mit den T-DNA
Junctions von sogenannten T-Circles wie pPIN1 (Koukolíková-Nicola et al., 1985;
Timmerman et al., 1988) und T-Circle T2 (Singer et al., 2012).
Einige Transformanten zeigten Banden in der Größe der T-DNA (z.B. vir-26, vir-56, vir-72
und vir-100) oder wiesen eine ungleiche Anzahl an Banden im SalI und BamHI-
Restriktionsverdau auf (z.B. vir-26, vir-56, vir-100 und vir-103). Solch ein Muster ist Hinweis
auf Tandeminsertionen in verschiedenen Konfigurationen Sequenzierungen von erhaltenen
Verknüpfungen zeigten vor allem Head to Tail Verbindungen von zwei T-DNAs. Die
identifizierten Verbindungen zweier T-DNAs bestanden mehrfach nicht aus vollständigen 25
bp Left Border und Right Border Bereichen, sondern aus chimären oder verkürzten
Sequenzbereichen (siehe Abbildung 2.20). Dieses Sequenzen einiger vir-Mutanten waren
identisch mit den T-DNA Junctions von sogenannten T-Circles wie pPIN1 (Koukolíková-
Nicola et al., 1985; Timmerman et al., 1988) und T-Circle T2 (Singer et al., 2012).
61
Abbildung 2.20: Sequenzen von T-DNA Junctions. Dargestellt sind die Sequenzbereiche der T-DNA Junctions von Head to Tail Tandeminsertionen von vir-50, vir-98, vir-52, vir-25, vir-27, vir-49, vir-101, vir-103 und der T-Circle pPIN1 und T-Circle T2 . Die mit der Right Border (RB) identischen Sequenzabschnitte wurden grau und einzelne, mit der Left Border (LB) übereinstimmende Nukleotide schwarz hervorgehoben. Es wird angenommen, dass im Zellkern der Wirtszelle mehrere T-DNAs miteinander
rekombinieren oder ligieren können, wodurch komplexe Strukturen gebildet werden. Diese
Strukturen können danach entweder in das Genom inserieren oder cyclisieren und T-Circles
bilden (Singer et al., 2012). T-Circle wurden bisher vor allem bei der Transformation von A.
thaliana beschrieben, aber die Verknüpfung von T-DNAs vor der Insertion könnte auch die
Bildung der beobachteten Tandeminsertionen in C. higginsianum erklären.
vir-50 TATCAGTGTTTGA----------TGTGGTGTAAACAAATTGACGCTTAG vir-98 TATCAGTGTTTGA----------TGTGGTGTAAACAAATTGACGCTTAG vir-52 TATCAGTGTT----------TATTGTGGTGTAAACAAATTGACGCTTAG pPIN1 TATCAGTGTTTGACAGGATATATTGTGGTGTAAACAAATTGACGCTTAG T-Circle T2 TATCAGTGTTTGACAGGATATATTGTGGTGTAAACAAATTGACGCTTAG vir-25 TATCAGTGTTTGACAGGATATATTGTGGTGTAAACAAATTGACGCTTAG vir-27 TATCAGTGTTTGACAGGATATATTGTGGTGTAAACAAATTGACGCTTAG vir-49 TATCAGTGTTTGACAGGATATATTGTGGTGTAAACAAATTGACGCTTAG vir-101 TATCAGTGTTTGACAGGATATATTGTGGTGTAAACAAATTGACGCTTAG vir-103 TATCAGTGTTTGACAGGATATATTGTGGTGTAAACAAATTGACGCTTAG RB TATCAGTGTTTGACAGGATATATTGGCGGGTAAAC LB TGGCAGGATATATTGTGGTGTAAACAAATTGACGCTTAG
RB/LB
RB
LB
hph
hph
62
2.3.3 Identifikation von T-DNA Insertionsstellen von C. higginsianum vir-Mutanten mittels Genome Walking PCRs
Um den Insertionsort der T-DNA im Genom von C. higginsianum zu bestimmen, wurden
Genome Walking PCRs durchgeführt. Bei dieser Technik wird die chromosomale DNA mit
blunt-schneidenden Restriktionsenzymen geschnitten und mit einem Adaptermolekül ligiert.
Die Ligation des Adapters mit bekannter Sequenz erlaubt die Durchführung von PCRs, da
nun DNA-Fragmente mit bekannten Sequenzen an beiden Enden vorliegen (T-DNA und
Adapter). In der ersten Genome Walking PCR wurden Primer eingesetzt, die zum einen an
den Adapter binden und zum anderen ihre Bindestelle in der Nähe der Left bzw. Right
Border in der T-DNA besitzen. Für die Erhöhung der Spezifität folgte eine zweite „nested“
PCR mit der ersten PCR als Template. Durch Modifizierung des Adapters mit einer
Aminogruppe und der Verwendung von relativ kurzen Adapter-spezifischen Primern wird die
Amplifikation von unerwünschten Nebenprodukten in den PCRs minimiert. Die erhaltenen
PCR-Produkte enthielten den Sequenzabschnitt zwischen der Primerbindestelle in der T-
DNA und der Schnittstelle des eingesetzten Restriktionsenzymes in der chromosomalen
DNA an den der Adapter ligierte. Da die Entfernungen zwischen der Schnittstelle in der
chromosomalen DNA und der T-DNA Insertionsstelle unbekannt sind, wurden mehrere
Restriktionsenzyme und verschiedene Primerkombinationen eingesetzt, um amplifizierbare
Fragmente zu erhalten.
63
Abbildung 2.21: Genome Walking Analyse von vir-Mutanten. (A) Schematische Darstellung des Ablaufes der Genome Walking Analyse anhand einer T-DNA Einzelinsertion. Chromosomale DNA wird isoliert, mit EcoRV geschnitten und mit einem Adapter (AP) ligiert. Die PCR-Produkte der ersten (primary; AP1 und L1 bzw. R1) und zweiten (nested; AP2 und L2 bzw. R2) PCR werden mittels Agarosegelelektrophorese analysiert. (B) Agarosegel mit aufgetragenen Genome Walker PCRs von vir-24, vir-53 und vir-52. Die erste (L1 bzw. R1) und zweite (L2 bzw. R2) Genome Walking PCR sind jeweils nebeneinander aufgetragen. M: 1kbp DNA-Leiter; L1: 1. PCR mit Primerpaar CK2611/CK2582; L2: 2. PCR mit Primerpaar CK2709/CK2583; R1: 1. PCR mit Primerpaar CK2711/CK2582; R2: 2. PCR mit Primerpaar CK2710/CK2583
Für vir-14, vir-21, vir-43, vir-98, vir-94, vir-99, vir-101 und vir-103 wurden bei Genome
Walking PCRs Fragmente erhalten, die nur Sequenzen von zwei in Tandem vorliegenden T-
DNAs enthielten und somit keine Information über den Insertionsort zuließen.
Durch Verwendung von Restriktionsenzymen ohne Schnittstelle in der T-DNA von pPK2
konnte dieses Problem teilweise umgangen werden.
Im Folgenden wird auf einige vir-Mutanten eingegangen, deren T-DNA Insertionsorte im
Rahmen dieser Arbeit identifiziert werden konnten.
64
vir-23
Abbildung 2.22: T-DNA Insertionsort von vir-23. (A) Dargestellt sind die C. higginsianum Supercontigs SC_869 und SC_2876 mit eingezeichneten T-DNA Insertionsort. Das erhaltene Genome Walking Fragment wurde rot markiert. (B) Mittels NCBI Conserved Domain Search ermittelte Domänenstrukturen von CH063_03892.
Southern Blot Analysen der Mutante vir-23 (nicht gezeigt) deuteten auf multiple T-DNA
Insertionen hin. Bisher konnte nur eine Insertion 678 bp upstream von CH063_08545 und
6651 bp downstream von CH063_03892 identifiziert werden (siehe Abb. 2.22A). Das
entsprechende hypothetische Protein CH063_08545 enthält weder konservierte Domänen,
noch ein Signalpeptid und wird laut RNA-Seq in allen Stadien schwach exprimiert (O’Connell
et al., 2012). BLAST-Analysen mit der Proteinsequenz als Suchsequenz ergaben eine
Vielzahl homologer Proteine in weiteren Colletotrichum Spezies wie z.B. das hypothetische
Protein CGGC5_4460 aus Colletotrichum gloeosporioides (E-value: 3e-109; 206/252
Identität) und verwandten filamentösen Pilzen, ohne jedoch eine Hinweis auf die Funktion zu
geben. Bei CH063_03892 handelt es sich aufgrund der Domänenstruktur vermutlich um
einen MFS-Transporter. Allerdings befindet sich die T-DNA Insertion mit über 6600 bp
wahrscheinlich zu weit entfernt um die Expression dieses Gens zu beeinflussen.
65
vir-41
Abbildung 2.23: T-DNA Insertionsorte von vir-41. (A, C) Dargestellt sind die C. higginsianum Supercontigs SC_3250 bzw. SC_8706 mit eingezeichneten T-DNA Insertionsorten. Die erhaltenen Genome Walking Fragmente wurden jeweils rot markiert. (B, D) Mittels NCBI Conserved Domain Search ermittelte Domänenstrukturen potentiell betroffener Proteine mit entsprechenden E-value.
Southern Blot Analysen der Mutante vir-41 deuteten auf zwei T-DNA Insertionen hin (Daten
nicht gezeigt). Im Rahmen eines Mastermoduls konnten beide Insertionsstellen identifiziert
werden. Eine T-DNA inserierte 2700 bp downstream von CH063_09187 bzw. 1900
downstream von CH063_00839 an Position 3662 des Supercontigs 3250 (siehe Abb. 2.23).
66
CH063_09187 ist als short-chain Dehydrogenase annotiert und enthält auch entsprechend
vorhergesagte Proteindomänen. Auffällig ist, die laut RNASeq, starke Abweichung der
Expression des Gens zwischen in vitro Appressorien (540 reads) und in planta Appressorien
(85 reads) (O’Connell et al., 2012). Das zweite potentiell beeinflusste Gen dieser T-DNA
Insertion kodiert für CH063_00839. Aufgrund der hypothetischen Zds-Domäne (siehe Abb.
2.23B) zeigt das Protein Ähnlichkeiten mit ScZds1 (E-Value 6,7e-09) und seinem Paralog
ScZds2 (E-Value 4e-08). Für beide Proteine konnte in S. cerevisiae eine Beteiligung an der
Regulation des polarisierten Wachstums gezeigt werden (Rossio and Yoshida, 2011; Yu et
al., 1996). Zudem zeigt CH063_00839 Ähnlichkeit zu Zds3 (einziger BLAST Treffer mit e-
Value 2e-11) des Humanpathogens Cryptocuccus neoformans, für das eine Virulenzfunktion
nachgewiesen werden konnte (Li et al., 2011).
Die zweite T-DNA Insertion konnte in Supercontig 8706 identifiziert werden (Abb. 2.23C). Mit
nur 260 bp zwischen CH063_15257 und der Insertion könnte der Promotorbereich dieses
Gens durch die T-DNA betroffen sein. Aufgrund der entsprechenden Domäne (Abb. 2.23D)
und der starken Homologie zu S. cerevisiae Hem12 (E-value: 8,9e-87) handelt es sich bei
CH063_15257 vermutlich um eine Coproporphyrinogen III Oxidase, welches ein Enzym der
Häm-Biosynthese darstellt. Das leicht reduzierte Wachstum von vir-41 auf Minimalmedium
(nicht gezeigt) könnte aus der reduzierten Verfügbarkeit von Häm-Gruppen für essentielle
Enzyme des Stoffwechsels resultieren. Des Weiteren konnte bereits für andere pathogene
Pilze eine Verbindung zwischen Pathogenität und des Stoffwechsels/Aufnahme von Eisen
gezeigt werden (Haas et al., 2008; Howard, 1999). Die T-DNA Insertion liegt ebenfalls
downstream von CH063_12924. Laut RNA-Seq Daten (O’Connell et al., 2012) ist dieses Gen
eines der stärksten exprimierten Gene in Appressorien (14. stärkste in in vitro Appressorien).
Das entsprechende Protein ist als autophagy-like protein 8 annotiert und ist vermutlich ein
Bestandteil des Autophagosoms. Da die Appressorienbildung in vir-41 nicht beeinflusst ist
und die T-DNA 1600 bp von CH063_12924 entfernt inserierte, ist vermutlich dessen
Expression nicht betroffen.
Auch wenn noch nicht geklärt wurde welches dieser Gene durch die Insertionen beeinflusst
ist und dadurch den beobachteten Phänotyp erzeugt, konnten mehrere interessante Gene
mit möglichen Rollen in Stoffwechsel, Zellteilung/Polarität und Autophagie identifiziert
werden.
67
vir-51
Abbildung 2.24: T-DNA Insertionsort von vir-51. Dargestellt sind die C. higginsianum Supercontigs SC_1847 und SC_5498 mit eingezeichneten T-DNA Insertionsort von vir-51. Das erhaltene Genome Walking Fragment wurden rot markiert. Eine Region mit mehreren ESTs wurde blau umklammert.
Für vir-51 konnte die einzelne T-DNA Insertion 1031 bp upstream des vorhergesagten Gens
CH063_06511 lokalisiert werden. Das entsprechende Protein mit einer Länge von 350
Aminosäuren hat kein vorhergesagtes Signalpeptid, keine konservierten Domänen und weist
laut RNA-Seq Daten eine nur sehr geringe Expression auf (O’Connell et al., 2012). Eine
BLASTp Suche mit der Proteinsequenz ergab nur Treffer in anderen Colletotrichum Spezies.
Ca. 1400 bp von der T-DNA Insertion sind im C. higginsianum Genome Browser
(http://www.broadinstitute.org/annotation/genome/colletotrichum_group/) eine Vielzahl von
Expressed Sequence Tags aufgeführt, die allerdings keinem annotierten Gen zugeordnet
wurden.
68
vir-52
Abbildung 2.25: T-DNA Insertionsort von vir-52. Dargestellt ist die T-DNA Tandeminsertion von vir-52 innerhalb des C. higginsianum Supercontigs SC_3438. Die zwei erhaltene Genome Walking Fragmente wurden rot markiert. (B) Ermittelte Domänenstruktur von CH063_12090 und CH063_159577 mit entsprechenden E-Values. Die einzelne T-DNA Insertion von vir-52 konnte zwischen CH063_12090 und CH063_15957
nachgewiesen werden. Dabei konnte gezeigt werde, dass zwei T-DNAs in Tandem in einer
Head to Tail Konfiguration inserierten, wobei die sequenzierte Junction der T-DNAs (Siehe
Abb. 2.20) eine Deletion von zehn Basenpaaren aufwies.
Bei CH063_12090 handelt es sich um eine putative FAD-abhängige Oxidoreduktase
(pfam01266) mit laut RNA-Seq (O’Connell et al., 2012) sehr schwacher Expression in allen
untersuchten Stadien. CH063_15957 wird aufgrund der Domänenstruktur und der Homologie
zu der Saccharopin Dehydrogenase ScLys1 (E-value: 3,6e-67) im Folgenden als ChLys1
bezeichnet. ScLys1 katalysiert in S. cerevisiae die finale Reaktion von Saccharopin zu Lysin
in der Lysin-Biosynthese (Ogawa and Fujioka, 1978).
Für beide Gene wurden im Rahmen der Bachelorarbeit von Stefanie Köhler C. higginsianum
Knockout-Stämme konstruiert, um ihre Rolle für die Infektion von A. thaliana zu untersuchen.
Eine Deletion von CH063_12090 hatte dabei im Vergleich zu dem ΔChku80
Ausgangsstamm keine phänotypischen Veränderungen hinsichtlich der Pathogenität oder
des Wachstum zur Folge (Daten nicht gezeigt). Im Gegensatz dazu hatte der Knockout von
ChLYS1 starke phänotypische Effekte. Die entsprechenden ΔChlys1 Stämme ΔChlys1-1
69
(CY6226) und ΔChlys1-3 (CY6228) waren nicht in der Lage auf Czapek-Dox Minimalmedium
(siehe Abb. 2.26A) zu wachsen und zeigten eine Lysin-Auxotrophie (siehe Abb. 2.26A-B).
Abbildung 2.26: Phänotyp von ΔChlys1 Stämmen.(A/B) Wachstum von C. higginsianum ΔChku80 (CY6021), ΔChlys1-1 (CY6226) und Chlys1-3 (CY6228) auf Czapek-Dox Minimalmedium (A) bzw. Czapek-Dox mit zusätzlich 76 mg/l Lysin. (C/D) Trypanblaufärbungen von A. thaliana infiziert mit vir-52 (C) bzw. ΔChlys1-1(D). Größenmarker = 50 µm
Im Gegensatz zu vir-52 (Abb. 2.26C) bildeten die ΔChlys1Stämme keine Primärhyphen aus.
Vier Tage nach der Sprühinfektion von A. thaliana mit ΔChlys1-waren nur vereinzelt
Appressorien sichtbar (Abb. 2.26D). Der beobachtete Phänotyp der ΔChlys1 Stämme ist
damit stärker ausgeprägt als der von vir-52.
70
vir-53
Abbildung 2.27: T-DNA Insertionsort von vir-53. Dargestellt ist die T-DNA Insertion von vir-53 innerhalb der C. higginsianum Supercontigs SC_1912 bzw. SC_1608. Das erhaltene Genome Walking Fragment wurde rot markiert.
Southern Blot Analysen für vir-53 deuten auf eine Head to Head Tandeminsertion hin. Mittels
Genome Walking konnte der Insertionsort einer T-DNA 434 bp vor CH063_13555 identifiziert
werden. Das entsprechende Protein besitzt keine konservierten Domänen (E-value > 3e-6)
und kein vorhergesagtes Signalpeptid. BLAST-Analysen mit der Proteinsequenz ergaben nur
Treffer in anderen Colletotrichum Spezies mit der stärksten Übereinstimmung zu dem
hypothetischen Protein CSUB01_05700 aus Colletotrichum sublineola (E-value: 3e-109).
71
vir-56
Abbildung 2.28: T-DNA Insertionsort von vir-56. (A) Dargestellt ist die identifizierte T-DNA Insertion von vir-56 innerhalb der C. higginsianum Supercontigs SC_66. Das erhaltene Genome Walking Fragment wurde rot markiert. (B) Übersicht der Identifizierten Proteindomäne von CH063_00495.
Die erhaltenen Southern Blot Banden von vir-56 deuten auf Tandeminsertion mehrerer T-
DNAs hin (siehe Abb. 2.19B). Die lokalisierte Insertion befindet sich 77 Basenpaare vor dem
vorhergesagten Gen CH063_00495 bzw. 943 bp upstream von CH063_00494 (Abb. 2.28A).
Eine Suche nach konservierten Domänen in CH063_00494 ergab Ähnlichkeit zu der
Tim17/Tim22/Tim23/peroxisomal protein PMP24 Motiv Domäne (Abb. 2.28B). Verschiedene
Peroxine wurden bereits in verwandten Pathosystemen als Pathogenitätsfaktoren
beschrieben, wie zum Beispiel Colletotrichum lagenarium Pex6 (Asakura et al., 2006) C.
orbiculare Pex13 (Fujihara et al., 2010) und Fusarium oxysporum Pex1/10/12/26 (Michielse
et al., 2009). Diese vorhergesagte Proteindomäne ist allerdings auch Bestandteil von
Proteinen mit Funktionen für den Transport in die innere Membran von Mitochondrien (TIM:
Translocase of the Inner Mitochondrial membrane). Das ursprünglich identifizierte Pex24 aus
Yarrowia lipolytica (Tam and Rachubinski, 2002) ist zudem über 250 Aminosäuren größer als
das vorhergesagte Protein CH063_00495. Erstaunlicher Weise konnten keine homologen
Proteine in S. cerevisiae identifiziert werden, was bei der konservierten Funktion als Peroxin,
bzw. als mitochondriales Transportprotein zu erwarten gewesen wäre.
Das hypothetische Protein CH063_00494 besitzt eine schwach konservierte Arylesterase-
Domäne pfam01731 (E-value: 1.38e-05), wobei homologe Proteine wie z.B. XP_007275589
(75% Identität; E-Value: 0) aus Colletotrichum gloeosporioides ebenfalls als Aryesterasen
annotiert sind. Auffällig ist zu dem, der laut RNA-Seq (O’Connell et al., 2012), starke
Unterschied der Expression zwischen in vitro (18 Reads) und in planta Appressorien (349
Reads).
72
vir-70
Abbildung 2.29: T-DNA Insertionsorte von vir-70. (A, C) Dargestellt sind die C. higginsianum Supercontigs SC_4395 bzw. SC_1520 mit eingezeichneten T-DNA Insertionsorten. Die erhaltenen Genome Walking Fragmente wurden jeweils rot markiert. (B, D) Mittels NCBI Conserved Domain Search ermittelte Domänenstrukturen potentiell betroffener Proteine mit entsprechenden E-values. Für vir-70 konnten zwei T-DNA Insertionsstellen identifiziert werden. Die erste befindet sich
innerhalb des ORF des vorhergesagten Gens CH063_10921. Das entsprechende Protein
besitzt keine konservierten Domänen aber eine Vielzahl von homologen Proteinen in
anderen filamentösen Pilzen. Eine BLASTp Suche in S. cerevisiae blieb allerdings ohne
Treffer. 750 bp upstream von der ersten Insertion entfernt, befindet sich das Gen der
Anthranilate Synthase (TRPC; CH063_10922). Da das Wachstum von vir-70 auf
Minimalmedium (Daten nicht gezeigt) dem des Wildtyps entsprach, scheint die Tryptophan-
Biosynthese nicht beeinträchtigt zu sein. Eine zweite Insertion befindet sich innerhalb des
ORF von CH063_05741. Aufgrund der gefunden Proteindomänen (Siehe Abb. 2.29D) und
der Homologie zu ScRit1 (E-value: 1,2e-50) kodiert das Gen vermutlich eine Initiator tRNA
73
Phosphoribosyl Transferase. ScRit1 ribosyliert die Initiator Methionin tRNA, wodurch diese
von der Elongator Methionin tRNA unterschieden werden kann (Astrom and Bystrom, 1994).
vir-72
Abbildung 2.30: T-DNA Insertionsort von vir-72. Dargestellt ist die identifizierte T-DNA Insertion von vir-72 innerhalb des C. higginsianum Supercontigs SC_4116. Das erhaltene Genome Walking Fragment wurde rot markiert.
Southern Blot Analysen von vir-72 deuten auf mehrere T-DNA Insertionen hin (siehe Abb.
2.19 B), wobei die erhaltenen Banden auf eine unvollständige Insertion hinweisen. Mittels
Genome Walking konnte eine Insertion innerhalb des Supercontigs SC_4116 identifiziert
werden. Der Insertionsort enthält keine annotierten Gene in der BROAD-Datenbank. Im C.
higginsianum Genome Browser des Max-Planck-Instituts für Pflanzenzüchtungsforschung
(https://gbrowse.mpipz.mpg.de/cgi-bin/gbrowse/colletotrichum_higginsianum_public/)
befindet sich am Insertionsort eine automatisch annotierte Conrad Prediction. Das
entsprechende Protein hat eine Länge von 272 Aminosäuren und besitzt keine konservierten
Domänen und kein Signalpeptid. Eine BLASTp Suche in den Datenbanken von NCBI bzw.
BROAD lieferte keine Treffer.
vir-73
Abbildung 2.31: T-DNA Insertionsort von vir-73. Dargestellt ist die identifizierte T-DNA Insertion von vir-73 innerhalb des C. higginsianum Supercontigs SC_4482. Das erhaltene Genome Walking Fragment wurde rot markiert. Eine Region mit mehreren annotierten ESTs wurde blau umklammert. Southern Blot Analysen von vir-73 (nicht gezeigt) deuteten auf eine T-DNA Einzelinsertion
hin. Wie für vir-72, befinden sich am identifizierten T-DNA Insertionsort keine annotierten
Gene in der BRAOD-Datenbank, sondern eine Vielzahl von Expressed Sequence Tags
74
(siehe Abb.2.31). Im Genome Browser des MPIPZ ist 20 bp downstream der Insertion eine
Conrad Prediction annotiert.
2.3.4 Multiple vir-Mutanten haben eine T-DNA Insertion im Lokus von ChPMA2
Mittels Genome Walking Analysen konnten die T-DNA Insertionsstellen von vir-97, vir-102,
vir-19, vir-24, vir-22 und vir-12 identifiziert werden. Interessanter Weise befinden sich alle im
gleichen genomischen Lokus (Abb. 2.32). Deshalb habe ich mich im Folgenden auf die
Analyse des betroffenen Gens (CH063_09060.1) konzentriert.
75
Abbildung 2.32: Sechs vir-Mutanten haben eine T-DNA Insertion im Lokus von ChPMA2. (A) Schematische Übersicht des ChPMA2 Gens mit den T-DNA Insertionsstellen von vir-97, vir-102, vir-12, vir-24, vir-19 und vir-22 relativ zu ATG (=1). (B) Makroskopische Symptome und Trypanblau Färbung von infizierten Blättern von A. thaliana vier Tage nach der Sprühinfektion mit C. higginsianum Wildtyp und ChPMA2 T-DNA Insertionsmutanten. Größenmarker = 50 µm.
CH063_09060 kodiert für ein 1017 Aminosäure langes Protein mit hoher Ähnlichkeit zu der
Plasmamembran gebundenen Protonen P-Typ ATPase Pma1 aus Saccharomyces
cerevisiae (43% Sequenzidentität) und wurde daher ChPMA2 genannt. Die T-DNA
Insertionsstellen von vir-22, vir-24 und vir-19 befinden sich in den offenen Leserahmen von
ChPMA2 (vir-24; +130; vir-22: +454; vir-19: +138). In Southern Blot Analysen von vir-24 und
vir-22 konnte nur jeweils eine einzelne T-DNA Insertion nachgewiesen werden (nicht
gezeigt). Das erhaltene Bandenmuster für vir-19 weist hingegen auf mehrere T-DNA
Insertionen hin, die aufgrund der Größe allerdings auch gekoppelt vorliegen könnten (Head
to Tail). Diese drei vir-Mutanten zeigen eine, mit C. higginsianum Wildtyp vergleichbare, in
vitro und in planta Appressorienbildung. Allerdings zeigen sie bei der Sprühinfektion von A.
thaliana keinerlei Symptome und bilden weder Sekundär-noch Primärhyphen. Selbst nach
sechs Tagen werden weder makroskopische Symptome noch Hyphen gebildet. Die anderen
T-DNA Insertionsmutanten vir-102, vir-97 und vir-12 haben die T-DNA in der upstream
Region von ChPMA2. Für vir-12, die erste Mutante dieser Klasse, war durch S. Müller die
Insertionsstelle -139 bp (relativ zum Startcodon von ChPMA2) bestimmt worden. Der
Phänotyp dieser Mutante entspricht dabei den Mutanten mit Insertion im offenen
Leserahmen, was auf eine starke oder vollständige Verminderung der Transkription von
ChPMA2 hindeutet. Vir-102 hat eine T-DNA Insertion 502 Nukleotide upstream des
Startcodons von ChPMA2 und zeigt einen weniger stark ausgeprägten Effekt auf die
Pathogenität. Appressorien von vir-102 konnten A. thaliana penetrieren und bildeten
erfolgreich Primär-und Sekundärhyphen. Jedoch war die Ausbildung makroskopischer
Symptome im Vergleich zum Wildtyp reduziert, was darauf hindeutet, dass in dieser Mutante
die Expression von ChPMA2 vermindert ist. Interessanter Weise zeigt vir-97 einen viel
stärker reduzierte Pathogenität als vir-102, obwohl sich nur 20 Nukleotide zwischen den T-
DNA Insertionsstellen befinden. Allerdings besitzt vir-97 eine zweite T-DNA Insertion die
bisher noch nicht identifiziert werden konnte. Zudem sind für vir-97 und vir-102 nur jeweils
die Left Border-Bereiche analysiert worden, daher könnten bisher unbekannte Deletionen
oder Umordnungen an der Right Border stattgefunden haben, die einen Einfluss auf die
Transkription von ChPMA2 haben könnten.
76
2.4 Die Rolle von Plasmamembran gebundenen H+-transportierenden ATPasen für die Pathogenität von C. higginsianum
2.4.1 C. higginsianum kodiert mit ChPMA1 und ChPMA2 für zwei H+-transportierende P-type ATPasen
Die Proteinsequenz von ChPma2 wurde unter GenBank Accession Nr. AJW67919 in die
NCBI-Datenbank hinterlegt. BLAST-Analysen mit der Genomsequenz von C. higginsianum
(Colletotrichum Sequencing Project, Broad Institute of Harvard and MIT
(http://www.broadinstitute.org/)) ergaben zusätzliche Treffer mit starker Ähnlichkeit zu
ChPma2. Die identifizierten Proteine CH063_02576 (Identities=351/729 (48%)) und
CH063_00553 (Identities=104/262 (39%)) sind jedoch fehlerhaft bzw. unvollständig annotiert.
Beide vorhergesagte Proteine bilden zusammen eine P-Typ ATPase mit insgesamt 45%
Identität mit ChPma2. Die überarbeite Proteinsequenz wurde ChPma1 genannt und trägt die
GenBank Accession Nr. AJW67921. Um Rückschlüsse auf die Funktion der P-Typ ATPasen
ChPma1 und ChPma2 zu schließen wurden Sequenzvergleiche zusammen mit weiteren P-
Typ ATPasen mit bekannten Substrat durchgeführt. Für diese Analysen wurde die P-Typ
ATPase CH063_11329 ebenfalls einbezogen, da es nach den beiden ChPma1 Fragmenten
von allen Proteine von C. higginsianum die höchste Ähnlichkeit zu ChPma2 von aufwies. Tabelle 2.4: BLAST-Analysen von C. higginsianum P-Typ ATPasen
1Die verwendeten Abkürzungen stehen für folgende Organsimen: Sc - Saccharomyces cerevisiae; Nc – Neurospora crassa; Sp – Schizosaccharomyces pombe; At – Arabidopsis thaliana; Mo – Magnaporthe oryzae *CH063_11329 und ELQ423021 wurde durch eine automatische Annotationen als Sodium transport ATPase 5 bzw. Calcium-transporting ATPase 3 betitelt, experimentelle Nachweise dieser Funktion sind nicht verfügbar ChPma1 und ChPma2 zeigten die stärkste Ähnlichkeit (>40%) mit Plasmamembran-
gebundenen Protonen ATPasen wie z.B. ScPma1 und ScPma2 und NcPmaA (Siehe Tabelle
Identität mit: Protein1 Accession Nr. Substrat ChPma1 ChPma2 CH063_11329 ChPma1 AJW67921 H+ - 44,8% 17,9% ChPma2 AJW67919 H+ 44,8% - 17%
CH063_11329 CCF40882 Na+* 17,9% 18,2% - NcPmaA AAA33563 H+ 88% 44,2% 17,4% ScPma1 NP_011507 H+ 73,8% 43,3% 17,9% ScPma2 NP_015289 H+ 73,4% 42,9% 17,6% SpPma1 CAB59886 H+ 72,1% 43,5% 17,9% AtAha6 AEC06056 H+ 32,6% 29,2% 17,3% AtECA3
NP_563860 Ca2+
(ER) 18,7% 17,1% 24,8%
ScPmr1 NP_011348 Ca2+, Mn2+ (Golgi)
19% 17% 23,2%
MoATPase3 ELQ423021 Ca2+ ° 18,4% 17% 63,5% ScEna2 NP_010324 Na+ 18,2% 16,7% 47,2% ScPmc1 NP_011509 Ca2+
(Vakuole) 13,8% 13,4% 18,3%
77
2.4) oder Protonenpumpe Aha6 aus A. thaliana (30%). Im Gegensatz dazu zeigten Calcium
oder Natrium-transportierende ATPasen wie Ena3 und Pmc1 aus S. cerevisiae nur 13-19%
Sequenzidentität mit ChPma1 und ChPma2. Die dritte untersuchte ATPase CH63_11329
zeigte eine geringe Ähnlichkeit mit Protonenpumpen (<20% Identität) aber eine starke
Identität (47%) mit der Natrium-transportierenden ATPase ScEna2, wodurch vermutlich auch
die automatische Annotation als Sodium transport ATPase ihren Ursprung hat.
*
78
Abbildung 2.33: Domänenstruktur von ChPma1 und ChPma2. Das Alignment von ChPma1, ChPma2 und NcPmaA (Neurospora crassa) wurde mittels ClustalW erstellt (www.ebi.ac.uk/ Tools/msa/clustalw2/) und mit BoxShade (http://www.ch.embnet.org/software/BOX_form.html) grafisch dargestellt. Die Annotationen der Domänenstruktur und der Transmembrandomänen (TM) von ChPma1 und ChPma2 erfolgten auf Basis der publizierten Daten für NcPmaA. Die Phosphorylierungsstelle innerhalb der P-Domäne (Asp) wurde mit einem roten Stern markiert.
Ein Alignment von ChPma1 und ChPma2 mit der Proteinsequenz von PmaA aus Neurospora
crassa (Siehe Abb. 2.33) zeigte für beide Proteine die konservierte P-Typ ATPasen
Domänenstruktur mit Aktuator-Domäne (A), Nukleotid-Bindedomäne (N), Phosphorylierungs-
Domäne (P) und zehn Transmembrandomänen (Kühlbrandt, 2004).
Diese ersten Sequenzvergleiche von ATPasen deuten darauf hin, dass es sich bei ChPma1
und ChPma2 um P-Typ ATPasen handelt die aufgrund ihrer stärksten Ähnlichkeit zu
Protonenpumpen vermutlich ebenfalls Protonen transportieren.
2.4.2 Ein Deletion von ChPMA1 war nicht möglich, während die Deletion von ChPMA2 den Verlust der Pathogenität zur Folge hat
Um die Rolle der Plasmamembran gebunden H+-ATPasen ChPma1 und ChPma2 für die
Pathogenität von C. higginsianum zu untersuchen, wurde versucht Knockout-Stämme beider
ATPasen zu erstellen. Die Deletionsplasmide pDel-Pma1-1 (pCK3349) und pDel-Pma1-2
(pCK3350) wurden mittels dem pOSCAR System hergestellt (Korn et al., 2015) Durch
homologe Rekombination sollten 2287 bp von ChPMA1 durch eine Hygromycin-
Resistenzkassette ersetzt werden (Siehe Abb. 2.34A).
79
Abbildung 2.34: Die Deletion von ChPMA1 war nicht möglich. (A) Schematische Darstellung der Deletionsstrategie von ChPMA1. 2287 bp von ChPMA1 sollten mittels homologer Rekombination durch eine Hygromycin-Resistenzkassette auf der T-DNA von pDel-Pma1-1/2 ersetzt werden. (B) Ergebnis der ATMT von C. higginsianum Wildtyp (WT; CY5533) und ΔChku80 (CY6021) mit den ChPMA1-Deletionsplasmiden pDel-Pma1-1 bzw. pDel-Pma1-2. Abgebildet sind die Selektionsplatten (PDA mit Hygromycin) drei Tage nach dem Auflegen der Nylonfilter.
Die konstruierten Deletionsplasmide für ChPMA1 wurden anschließend mittels ATMT in C.
higginsianum Wildtyp und in den ΔChku80 Stamm (CY6021) transformiert. Die als Kontrolle
durchgeführte Transformation des Wildtyps resultierte in einer Vielzahl von Hygromycin-
resistenten Transformanten. Bei der ATMT des ΔChku80 Stammes wurden allerdings keine
oder nur sehr wenige Transformanten erhalten (Siehe Abb. 2.34B). In allen Transformanten
war die T-DNA ektopisch integriert (PCR-Daten nicht gezeigt). Dies deutet darauf hin, dass
es sich bei ChPMA1 um ein essentielles Gen handelt oder der resultierende Phänotyp einer
Deletion von ChPMA1 die Selektion auf Platten mit PDA-Medium verhinderte.
Die Konstruktion der ChPMA2-Deletionsplasmide pDel-Pma2-1 (pCK3349) und pDel-Pma2-
2 (pCK3350) erfolgte ebenfalls mittels des pOSCAR-Systems (Siehe Material und
Methoden). Durch homologe Rekombination sollten 2222 bp von ChPMA2 durch eine
Hygromycin-Resistenzkassette ersetzt werden (Siehe Abb. 2.35A).
Abbildung 2.35: Generierung von ΔChpma2 Knockout-Stämmen. (A) Schematische Darstellung der Deletionsstrategie von ChPMA2. 2222 bp von ChPMA2 sollten mittels homologer Rekombination durch eine Hygromycin-Resistenzkassette auf der T-DNA von pDel-Pma2-1/2 ersetzt werden. (B) Ergebnis der ATMT von C. higginsianum Wildtyp (WT; CY5533) und ΔChku80 (CY6021) mit den ChPMA2-Deletionsplasmiden pDel-Pma2-1 bzw. pDel-Pma2-2. Abgebildet sind die Selektionsplatten (PDA mit Hygromycin) vier Tage nach dem Auflegen der Nylonfilter.
Die Agrobacterium tumefaciens vermittelte Transformation von C. higginsianum ΔChku80
(CY6021) mit den ChPMA2-Deletionsplasmiden pDel-Pma2-1/2 resultierte, im Gegensatz zu
80
den Transformationen mit pDel-Pma1-1/2, in einer Vielzahl von Hygromycin-resistenten
Kolonien auf den Selektionsplatten (Siehe Abb. 2.35 B). Aus der Transformation von
ΔChku80 mit pDel-Pma2-1 wurden neun und aus der Transformation mit pDel-Pma2-2
sieben Stämme mittels PCR auf die Deletion von ChPMA2 analysiert. Zusätzlich wurden
jeweils zwei Stämme aus der ATMT von C. higginsianum Wildtyp mit pDel-Pma2-1 bzw.
pDel-Pma1-2 mittels PCR untersucht.
Abbildung 2.36: Überprüfung des ΔChpma2 Knockouts. (A/B) Schematische Darstellung des genomischen Lokus von ChPMA2 vor (A) und nach (B) der homologen Rekombination mit der T-DNA von pDel-Pma2-1/2. Zusätzlich wurden die verwendeten Primer der PCR-Analysen annotiert. (C) PCR für die Amplifikation eines internen ChPMA2-Fragmentes mit den Primerpaar a/b (Primer CK2746 und CK2747). (D) Diagnostische PCR zum Nachweis des Hygromycin-Resistenzgens mit den Primern c und d (CK2123 und CK2124). (E) PCR für den Nachweis der Insertion der Hygromycin-Resistenzkassette in den ChPMA2 Lokus (Primer e und f; CK2777/CK3262). M: 1kbp DNA-Leiter; K1-K4: CY5535 transformiert mit pDel-Pma2-1/2; 1-9: CY6021 transformiert mit pDel-Pma1-1; 10-17: CY6021 transformiert mit pDel-Pma1-2; 0: Wasserkontrolle; 17=CY6150; 1=CY6151; 10=CY6152; 14=CY6135
Die vier untersuchten Transformanten (K1-K4) aus der Kontrolltransformation des Wildtyp-
Stammes (CY5535) zeigten keine Deletion von ChPMA2. Dem gegenüber konnte für
fünfzehn der siebzehn untersuchten Stämme aus der Transformation von CY6021 mit pDel-
Pma2-1/2 die Insertion der Hygromycin-Resistenzkassette am ChPMA2-Lokus mit
geeigneten Primern nachgewiesen werden (Siehe Abb. 2.36E). In nur zwei Stämmen
81
(Spuren 3 und 8 in Abb. 2.36C) konnte ein internes Fragment von ChPMA2 amplifiziert
werden, wobei für einer dieser Stämme ebenso die erwartete Bande für eine erfolgreiche
homologe Rekombination erhalten wurde (Spur 8 in Abb. 2.36E). Dies könnte bedeuten,
dass ein Gemisch von Transformanten vorlag oder unvorhergesehene Deletionen
stattgefunden haben und wurde nicht weiter verfolgt.
Die erfolgreiche Inaktivierung von ChPMA2 zeigt, dass ChPMA2 kein essentielles Gen
darstellt. Die C. higginsianum ΔChpma2 Stämme CY6151, CY6152 und CY6153 wurden für
die Sprühinfektion von A. thaliana verwendet (Siehe Abb. 2.37). Als Kontrollen dienten der
ΔChku80 Ausgangsstamm CY6021 und ein Stamm mit ektopischer Integration der T-DNA
(CY6150).
Abbildung 2.37: Der Knockout von ChPMA2 führt zum Verlust der Pathogenität. (A) A. thaliana infiziert mit drei ΔChpma2 Stämmen (CY6151, CY6152 und CY6153), dem ΔChku80 Ausgangsstamm (CY6021) und einem Stamm mit ektopischer insertion der T-DNA von pDel-Pma2-2 (CY6150); abgebildet sind infizierte Blätter nach sieben Tagen und Trypanblaufärbungen von infizierten Blättern nach fünf Tagen. Größenmarker = 50 µm.
82
A. thaliana Pflanzen, die mit ΔChpma2 Stämmen infiziert wurden, zeigten selbst nach sieben
Tagen keine makroskopischen Symptome. In Trypanblaufärbungen waren nur Appressorien
sichtbar, aber weder Primär-noch Sekundärhyphen erkennbar (Abb. 2.37). Die drei
untersuchten ΔChpma2 Stämme zeigten damit einen ähnlichen Phänotyp wie die T-DNA
Insertionsmutanten vir-19, vir-22 und vir-24 mit Insertion der T-DNA im ORF von ChPMA2.
Im Gegensatz dazu war für den Stamm CY6150 mit ektopischer Integration der ChPMA2-
Deletionskassette kein, vom Kontrollstamm CY6021 abweichender, Phänotyp erkennbar.
2.4.3 Der Verlust von ChPMA2 korreliert mit einer verringerten pflanzlichen Abwehr von A. thaliana
Der beobachtete Phänotyp von ChPMA2 T-DNA Insertionsmutanten und von ΔChpma2
Knockoutmutanten während der Infektion von A. thaliana deutete auf einen Arrest der
Infektion während der Penetration hin. Eine mögliche Erklärung für die Unfähigkeit der
ΔChpma2 Mutanten für die Ausbildung von in planta Primär-bzw. Sekundärhyphen könnte
eine starke pflanzliche Abwehr darstellen. Vor allem eine starke Induktion von Callose-
Papillen unter Appressorien könnte den Pathogenitätsdefekt erklären, da dadurch die
Infektion im Stadium der Penetration verhindert wird (Birker et al., 2009; Ellinger et al., 2013).
Zudem wäre auch eine Hypersensitivität von ΔChpma2 Mutanten gegenüber freigesetzten
Abwehrstoffen wie z.B. H2O2 denkbar (Mellersh et al., 2002). Um zu testen, ob die
beobachtete Apathogenität von ΔChpma2 Stämmen und der ChPMA2 T-DNA
Insertionsmutanten aus einer starken Induktion der pflanzlichen Abwehr resultierte, wurde
diese mittels Färbungen mit Anilinblau und DAB (Diaminobenzidin) näher untersucht (siehe
Abb. 2.38) und in Tabelle 2.5 zusammengefasst.
83
Abbildung 2.38: Der Verlust von ChPMA2 korreliert mit einer verringerten pflanzlichen Abwehr von A. thaliana. A. thaliana Col-0 wurde mit ΔChku80 (CY6021) und ΔChpma2 (CY6151) (A) bzw. C. higginsianum Wildtyp (CY5535) und den ChPMA2 T-DNA Insertionsmutanten vir-12, vir-19, vir-22, vir-24, vir-97 und vir-102 infiziert (B). Nach drei Tagen wurden einzelne Blätter mit Anilinblau und DAB gefärbt und fotografiert. Für eine deutlichere Darstellung wurde die Helligkeit der Anilinblau Abbildungen nachträglich stark erhöht. Größenmarker = 50 µm.
Färbungen mit Anilinblau zeigten, dass keine Papillen unter den Appressorien von ΔChpma2
(CY6151) gebildet wurden, während bei 10% der Appressorien des Ausgangsstammes
CY6021 diese Abwehrreaktion zu beobachten war. Eine Färbung von reaktiven
Sauerstoffspezies mit DAB war für CY6151 nicht erkennbar (0%), wobei 5% der mit
ΔChku80 infizierten Epidermiszellen von A. thaliana eine Braunfärbung zeigten. Die
Induktion dieser Abwehrreaktionen durch ChPMA2 vir-Mutanten war unterschiedlich stark
ausgeprägt und schien vom Insertionsort der T-DNA abhängig zu sein.
84
Tabelle 2.5: Induktion der pflanzlichen Abwehr durch ChPMA2 vir-Mutanten und ΔChpma2
1Zahl in Klammern gibt T-DNA Insertionsort relativ zum ersten möglichen Startcodon von ChPMA2 an 2Quotient zwischen Appressorien mit darunter liegender Papille und Gesamtanzahl von Appressorien 3Quotient zwischen DAB gefärbten Epidermiszellen mit aufliegenden Appressorium und Gesamtanzahl von Appressorien
Die Bildung von Papillen war im Vergleich zum Wildtyp für alle vir-Mutanten reduziert (siehe
Abb. 2.38B). Dabei zeigte sich, dass besonders vir-24, vir-19 und vir-22 mit der T-DNA
Insertion innerhalb des ORF von ChPMA2 kaum Callosebalagerungen induzierten und mit
ΔChpma2 vergleichbare Werte aufwiesen. Die mittels DAB-Färbung analysierte Produktion
von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) war bei Infektionen mit vir-24, vir-19 und vir-22
ebenfalls sehr stark reduziert (1%). Die vir Mutanten vir-97 und vir-102 mit der T-DNA
Insertion ca. 500 bp upstream von ChPMA2 zeigten im Vergleich zu dem Wildtyp eine, in
etwa halb so starke, Induktion von ROS, aber mit 5 bzw. 6% noch deutlich häufiger als für
vir-19 und vir-22.
Auch wenn keine weiteren pflanzlichen Abwehrreaktionen wie z.B. die Expression PR-Genen
analysiert wurden, scheint der Verlust der Pathogenität von ΔChpma2-Mutanten nicht durch
eine verstärkte pflanzliche Abwehr hervorgerufen worden zu sein. Vor allem die vollständige
Abwesenheit von ROS deutet darauf hin, dass für diese Abwehrreaktion eine Penetration der
Wirtszelle erfolgen muss.
Stamm1 Anilinblau² DAB3 ΔChku80 (CY6021) 8,3% 5,3% ΔChpma2 (CY6151) 1% 0% Wildtyp (CY5535) 11,2% 6,7% vir-97 (-502) 5,3% 1,3% vir-102 (-483) 6,4% 1,7% vir-12 (-139) 5,6% 0% vir-24 (+130) 3,9% 0,3% vir-19 (+138) 1,1% 0,8% vir-22 (+454) 1,7% 1,1%
85
2.4.4 ChPMA2 ist für die Appressorienbildung von C. higginsianum nicht erforderlich
In Trypanblaufärbungen von A. thaliana Pflanzen infiziert mit ΔChpma2-Stämmen waren
nach sieben Tagen nur Appressorien sichtbar aber keinerlei Hyphen. Eine mögliche
Erklärung dafür könnte ein Defekt der Appressorienbildung und die dadurch resultierende
Unfähigkeit zur Penetration von ΔChpma2 Knockoutmutanten darstellen. Im Folgenden
wurde daher besonders die Appressorienbildung von ΔChpma2-Stämmen untersucht.
In der Rate der in vitro Appressorienbildung zwischen ΔChpma2-Mutanten und den ΔChku80
Ausgangsstamm konnten keine Unterschiede festgestellt werden. Auf 1,16-Hexadecandiol
beschichteten Petrischalen bildeten Konidien beider Stämme nach 12 Stunden zu >95%
Appressorien aus (Abbildung 2.39A). Da vermutlich Konidien ohne gebildeten Appressorium
im Rahmen der Trypanblaufärbung von den Blättern gewaschen wurden, war eine
Quantifizierung der in planta Appressorienbildung nicht möglich.
Abbildung 2.39: Appressorienbildung von ΔChpma2. (A) Appressorienbildung von ΔChpma2 (CY6151) und ΔChku80 (CY6021) nach 12 h auf Hexadekandiol beschichteten Petrischalen (in vitro) bzw. nach 24 h auf A. thaliana (in planta). (B) Mittels konfokaler Mikroskopie aufgenommene Appressorien-und Hyphenbildung von ΔChpma2 und ΔChku80 auf Zellulose (Dialyseschlauch) 48 h nach der Beimpfung. Abgebildet sind jeweils zwei Fokusebenen des gleichen Bildausschnittes. Größenmarker = 20 µm
Ein Vergleich von Trypanblaufärbungen von Infektionen (jeweils 1x106 Konidien/ml) mit
ΔChpma2- und ΔChku80 Stämmen nach 24 Stunden zeigte jedoch eine vergleichbare
Anzahl von Appressorien pro Bildausschnitt. Ein offensichtlicher morphologischer Defekt der
in planta und in vitro gebildeten Appressorien von ΔChpma2 Mutanten war ebenfalls nicht
erkennbar (siehe Abb. 2.39A). Sowohl die Größe und Form, als auch die Melanisierung von
Appressorien von ΔChpma2 entsprachen den von gebildeten Appressorien des
Ausgangsstammes. Die Fähigkeit zur Penetration von künstlichen Oberflächen durch
Appressorien wurde auf Zellophan (Zellulose Regenerat) getestet. Dazu wurden ca. 1 cm²
86
große Stücke Dialyseschlauch auf 1% Agarose gebettet und mit jeweils 1x105 Konidien von
ΔChku80 (CY6021) bzw. ΔChpma2 (CY6151) beimpft. Nach 48 Stunden hatten beide
Stämme auf der Oberfläche Appressorien gebildet (siehe Abb. 2.39B links). Aus diesen
Appressorien wuchsen zudem Hyphen, die ein verzweigtes Geflecht innerhalb des
Dialyseschlauches bildeten (siehe Abb. 2.39B rechts). Die Penetration der Oberfläche
erfolgte dabei immer mittels Appressorien, da unter Konidien ohne gebildeten Appressorium
keine Hyphen erkennbar waren. Dies weist darauf hin, dass ΔChpma2-Stämme weiterhin die
Fähigkeit besitzen künstliche Oberflächen mit Hilfe von Appressorien zu penetrieren. Nach
der Penetration waren die Stämme auch in der Lage mycelartig das Substrat zu kolonisieren,
wobei sich die Hyphen morphologisch stark von in planta gebildeten Primärhyphen
unterschieden.
Der beobachtete Unterschied von Stämmen mit Deletion von ChPMA2 zwischen der
Penetration von Dialyseschläuchen mit anschließender Hyphenbildung und das Fehlen
jeglicher Bildung von Hyphen in planta könnte aus einem unzureichenden Turgordruck der
Appressorien resultieren. Appressorien besitzen einen sehr hohen Turgordruck, der gezielt
gegen die pflanzliche Cuticula und Zellwand gerichtet wird und damit deren Penetration
ermöglicht (Deising et al., 2000). Dabei wird angenommen, dass die Melaninschicht eine
Diffusionsbarriere für die angereicherten Osmolyte im Appressorium darstellt (Jong et al.,
1997) und zusätzlich die pilzliche Zellwand verstärkt. Die Aufrechterhaltung der hohen
intrazellulären Konzentrationen der Osmolyte erfordert dabei vermutlich einen aktiven
Rücktransport nach deren Diffusion in dem Apoplasten durch z.B. H+/Glycerin Symporter
(Money, 1997).
Um zu überprüfen, ob die Generierung/Aufrechterhaltung des Turgors in Appressorien von
ΔChpma2 Mutanten beeinflusst ist, wurde versucht diesen mittels eines indirekten
Cytorrhyse Test zu bestimmen (Chen et al., 2004; Howard et al., 1991). Die
Appressorienbildung wurde in 1,16-Hexadecandiol beschichteten Petrischalen induziert und
nach 24 Stunden wurden verschiedene Konzentrationen des Osmolyten PEG-6000
hinzugegeben. PEG-6000 kann aufgrund seiner Größe nicht durch die Zellwand von
Appressorien diffundieren und führt zum sichtbaren Kollaps der Appressorien sobald der
externe osmotische Druck den Turgor übersteigt. Nach zehn Minuten Inkubationszeit mit den
PEG-Lösungen wurde die Anzahl der intakten und kollabierten Appressorien am Mikroskop
bestimmt (n>100). Das Ergebnis von drei unabhängigen Experimenten mit Appressorien von
ΔChku80 (CY6021) und ΔChpma2 (CY6151) ist grafisch in Abbildung 2.40 dargestellt.
87
Abbildung 2.40: Bestimmung des Turgors von Appressorien von ΔChku80 und ΔChpma2. 1x106 Konidien des jeweiligen Stammes wurden in 1,16-Hexadecandiol beschichteten Petrischalen für 24 h bei 25°C inkubiert. Das Wasser wurde anschließend durch 5 ml Lösungen von PEG60000 mit unterschiedlichen Konzentrationen ersetzt. (A) Nach zehn Minuten Inkubationszeit wurde die Cytorrhyse am Mikroskop dokumentiert. Dargestellt ist die Wasserkontrolle und der Effekt von 400 mg/ml PEG6000 auf Appressorien von CY6021 (ΔChpma2) und CY6151 (Kontrolle) bzw. der Effekt von 200 mg/ml PEG6000 auf Appressorien von vir-28. Der Größenmarker entspricht 10 µM. (B) Grafische Auswertung des Cytorrhse-Assays. Dargestellt sind die Ergebnisse dreier, unabhängiger Experimente mit jeweils mindestens 100 ausgezählten Appressorien pro Stamm (CY6021 und CY6151) und PEG6000 Konzentration.
Bis zu einer PEG6000 Konzentration von 300 mg/ml zeigten der ΔChpma2 Stamm CY6151
als auch der ΔChku80 Ausgangsstamm nur zu einem sehr geringen Prozentsatz (siehe Abb.
2.40B) kollabierte Appressorien. Im Gegensatz dazu kollabierten die Appressorien des
Kontrollstammes (vir-28) schon zu 100% bei einer Konzentration von 200 mg/ml (siehe Abb.
2.40A). Appressorien von vir-28 zeigen keinerlei Melanisierung (Korn et al., 2015) und sind
daher anscheinend nicht in der Lage einen hohen Turgor aufzubauen. 80% aller
Appressorien von CY6021 und CY6151 kollabierten bei einer PEG6000 Konzentration von
350 mg/ml. Diese Konzentration entspricht einem osmolytischen Druck von 2,6 MPa (Money,
1989). Dieser Wert ist mit den beschriebenen Wert von 2,4 MPa für C. graminicola
88
vergleichbar (Ludwig et al., 2014), aber viel geringer als der beschriebene Turgor der
Appressorien von Magnaporthe grisea von 8 MPa (Howard et al., 1991).
Die Experimente deuten darauf hin, dass die Appressorienbildung von ΔChpma2-Mutanten
nicht beeinflusst ist und ebenfalls, der für die Penetration erforderliche, Turgor aufgebaut und
aufrechterhalten wird.
2.4.5 Verwertung von Kohlenstoffquellen durch ΔChPma2-Mutanten
Die Restriktion der Infektion von ΔChpma2-Mutanten im Stadium der Penetration konnte
weder durch eine verstärkte pflanzliche Abwehr, noch durch Defekte in der
Appressorienbildung erklärt werden. Daher wurden Prozesse untersucht, die von der
Aktivität von Protonen ATPasen abhängig sind. Durch H+-ATPasen wird unter ATP-
Verbrauch das Membranpotenzial in Pflanzen, Pilzen und Bakterien aufgebaut. Die
Aufnahme vieler Nährstoffe erfolgt durch ein Kotransport des entsprechenden Substrats mit
Protonen. Im Folgenden wurde untersucht, ob der Verlust von ChPMA2 durch T-DNA
Insertionen oder durch eine gerichtete Deletion einen Einfluss auf die Aufnahme von
Glukose oder auf das vegetative Wachstum der entsprechenden C. higginsianum Stämme
ausübt.
2.4.5.1 Glukoseaufnahme von Appressorien
Das Genom von C. higginsianum kodiert für 363 putative MFS (Major Facilitator Superfamily)
Transportproteine von denen 94 zu der Gruppe der Zuckertransporter gehören. Mittels RNA-
Seq konnte gezeigt werden, dass während der Appressorienbildung die Expression von 14
Zuckertransporter induziert wird (O’Connell et al., 2012). Ein großer Teil der MFS-
Transporter nutzt dabei das Membranpotential der Zelle und fungiert als H+/Substrat-
Symporter (Pao et al., 1998). Eine mögliche Absenkung des Protonengradienten durch eine
Reduktion des Protonentransportes durch den Knockout von ChPMA2 hätte vermutlich eine
verminderte Aufnahmerate dieser Transporter zur Folge. Da ΔChpma2-Mutanten während
der Infektion von A. thaliana im Stadium der Penetration einen Defekt zu haben scheinen,
wurde die Aufnahme von Glukose als Testsubstrat im Vergleich zu dem ΔChku80
Ausgangsstamm in Appressorien untersucht.
In vitro gebildete Appressorien der Stämme CY6151 (ΔChpma2) und CY6021 (ΔChku80)
wurden in einer 0,1 mM Glukoselösung mit 0,2 µl 14C Glukose (entspricht 0,2 µCi) inkubiert.
Zu unterschiedlichen Zeitpunkten wurden die Appressorien gewaschen und anschließend
mittels Lysepuffer und Spatel aufgeschlossen. Ein Aliquot der erhaltenen Lysate wurde im
Szintillationszähler vermessen. Das Ergebnis ist in Abbildung 2.41 grafisch dargestellt.
89
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
1800
2000
0 2 5 10 20 30 30+10 mMGlukose
30+10 µMCCCP
cpm
t in Minuten
CY6021
CY6151
Abbildung 2.41: Aufnahme von 14C markierter Glukose. Jeweils 1x106 Konidien von CY6021 (ΔChku80) und CY6151 (ΔChpma2) wurden in 1,16-Hexadecandiol beschichteten Petrischalen inkubiert. Die Rate der Appressorienbildung der beiden Stämme lag nach 16 h bei circa 96%. Anschließend wurden die Appressorien in 0,1mM 14C markierter Glukoselösung (0,2 µCi) inkubiert. Zu unterschiedlichen Zeitpunkten wurden jeweils die Appressorien einer Petrischale mit Spatel und Lysepuffer aufgeschlossen und die Aufnahme der markierten Glukose mittels eines Szintillationszählers bestimmt. cpm: counts per minute
Wie aus dem Graphen der Abbildung 2.41 ersichtlich, enthielten Appressorien beider
getesteten C. higginsianum Stämme im ungefähr gleichen Maße 14C markierte Glukose.
Sowohl im zeitlichen Verlauf, als auch in der gemessenen Radioaktivität nach 30 Minuten
zeigen sich zwischen ΔChpma2 (CY6151) und den ΔChku80 Ausgangsstamm (CY6021) nur
geringfügige Abweichungen. Die Aufnahme der markierten Glukose konnte durch 10 mM
nicht markierter Glukose (50.000facher Überschuss) kompetitiv gehemmt werden. Die
Zugabe von CCCP (Carbonyl-cyanid-m-chlorophenyl-hydrazon) als Entkoppler des
Protonengradienten (Kasianowicz et al., 1984) inhibierte zudem die Aufnahme von Glukose
vollständig. Dies deutete auf eine aktive Aufnahme von Glukose durch einen gleichzeitigen
Transport mit Protonen hin, der in beiden Stämmen im ähnlichen Maße stattfand. Die
Aufnahme der Glukose erfolgte dabei vermutlich hauptsächlich durch das ehemalige
Konidium, da die Melaninschicht des Appressoriums wahrscheinlich für Glukose
impermeabel ist. Für das ehemalige Konidium wurde allerdings vorgeschlagen, dass es nach
einer erfolgreichen Bildung eines Appressoriums biologisch inaktiv ist und Apoptose einleitet
(Veneault-Fourrey et al., 2006).
90
2.4.5.2 Vegetatives Wachstum in Abhängigkeit verschiedener Kohlenstoffquellen
Um zu analysieren, ob der Verlust von ChPma2-Aktivität zu einer verringerten Aufnahme von
Kohlenhydraten und damit zu einem verringerten radialen Wachstum führt, wurde das
Wachstum von ChPMA2 Knockout und T-DNA Insertionsmutanten auf Medien mit
unterschiedlichen Kohlenstoffquellen mit dem des Ausgangsstammes verglichen. Als
Medium diente dafür zum einen PDA als Vollmedium und zum anderen Yeast Nitrogen Base
(YNB) Minimalmedium, was mit 2% Glukose, Saccharose, Ammoniumacetat, oder Galaktose
als Kohlenstoffquelle versetzt wurde.
Abbildung 2.42: Radiales Wachstum von ΔChpma2 und ChPMA2 T-DNA Insertionsmutanten in Abhängigkeit von der Kohlenstoffquelle. Das Wachstum der T-DNA Insertionsmutanten vir-12, vir-22, vir-24, vir-97 und vir-102 wurde im Vergleich zum Wildtyp (CY5535) analysiert. Für die ΔChpma2 Mutante diente der parentale ΔChku80 Stamm CY6021 als Kontrolle. Platten mit PDA und YNB mit unterschiedlicher Kohlenstoffquelle wurde mit 500 Konidien der entsprechenden C. higginsianum Stämme betropft und nach fünf Tagen fotografiert.
Im Vergleich zum parentalen ΔChku80 (CY6021) Stamm zeigte sich ein leicht verringertes
Wachstum der ΔChpma2 Mutante (CY6151) auf Platten mit PDA und auf Platten mit
Minimalmedium mit Glukose, Saccharose bzw. Ammoniumacetat (siehe Abb. 2.42).
91
Die ChPMA2 T-DNA Insertionsmutanten unterschieden sich untereinander im Durchmesser
der gebildeten Kolonien. Mutanten mit der T-DNA Insertion nahe (vir-12) oder direkt im ORF
(vir-22, vir-24) zeigten ein reduziertes Wachstum auf PDA und auf YNB-Platten mit
Saccharose, Glukose bzw. Ammoniumacetat und verhielten sich damit wie die ΔChpma2
Deletionsmutante CY6151. Im Unterschied dazu, zeigten die Mutanten vir-97 und vir-102 mit
der T-DNA Insertion upstream von ChPMA2 ein, mit dem des Wildtyps, vergleichbares
Wachstum. Damit korreliert der Pathogenitätsphänotyp mit einem leicht verminderten
vegetativen Wachstum auf Glukose und Saccharose als Kohlenstoffquelle, obwohl in
vorangegangenen Experimenten kein Unterschied in der Aufnahme von Glukose zwischen
CY6021 und CY6151 beobachtet werden konnte.
Interessanter Weise zeigte die ΔChpma2 Deletionsmutante CY6151 ein stärkeres Wachstum
als der parentale ΔChku80 Stamm auf Minimalmedium mit Galaktose als Kohlenstoffquelle.
Die apathogenen T-DNA Insertionsmutanten unterschieden sich ebenfalls im Durchmesser
der Kolonien vom Wildtyp und den T-DNA Mutanten mit nur reduzierter Pathogenität.
Morphologisch schienen die Kolonien von ΔChpma2 und vir-12, vir-22 und vir-24 ein
stärkeres Hyphenwachstum auf Galaktose aufzuweisen und aufgrund der beginnenden
Orangefärbung eher mit der Neubildung von Konidien zu beginnen.
2.4.5.3 Die Katabolitrepression von C. higginsianum ist in unabhängig von ChPMA2
Die Katabolitrepression stellt in vielen Mikroorganismen die bevorzugte Aufnahme und
Verwertung von energetisch günstigen Zuckern gegenüber weniger bevorzugten
Kohlenstoffquellen sicher. Glukose als bevorzugtes Kohlenhydrat reguliert dabei die
Expression einer Vielzahl von katabolischen Enzymen und Transportern, darunter auch die
des Galaktose-Stoffwechsels (Gancedo, 1998; Matern and Holzer, 1977). Das stärkere
Wachstum von Chpma2-Mutanten auf Galaktose könnte auf eine Beeinflussung der
Katabolitrepression durch den Verlust von ChPma2-Aktivität hindeuten. Stämme mit
deregulierter Expression der GAL-Gene könnten diese eher verwerten und hätten dadurch
gegenüber dem Wildtyp einen Wachstumsvorteil. Für andere pilzliche Pathogene wie
Magnaporthe oryzae (Fernandez and Wilson, 2012), Sclerotinia sclerotiorum (Reymond-
Cotton et al., 1996), Cochliobolus carbonum (Tonukari et al., 2000), Gibberella fujikuroi und
Botrytis cinerea (Tudzynski et al., 2000) konnte eine mögliche Verbindung der
Katabolitrepression mit der Pathogenität gezeigt werden.
Um diese Hypothese zu überprüfen, wurde mittels Allylalkohol getestet, ob in ΔChpma2-
Stämmen die Katabolitrepression beeinflusst ist. Durch die Alkoholdehydrogenase wird
Allylalkohol zu Acrolein oxidiert. Das gebildete Acrolein ist sehr reaktiv und dadurch stark
toxisch. In Anwesenheit von Glukose unterliegt die Alkoholdehydrogenase ADH2 von S.
92
cerevisiae der Katabolitrepression (Laudano et al., 1992). In Anwesenheit von Glukose im
Medium ist daher Allylalkohol nicht toxisch, da es nicht verstoffwechselt wird. In Anwesenheit
einer nicht-reprimierenden Kohlenstoffquelle wie z.B. Galaktose wird hingegen ADH
exprimiert und die Umsetzung von Allylalkohol führt zum Zelltod. Ein vermutliches C.
higginsianum Ortholog für Adh1 aus S. cerevisiae wurde mittels BLAST-Analysen
identifiziert. CH063_07198 zeigte dabei 60% Sequenzidentität mit ScAdh1.
Die zu testenden C. higginsianum Stämme wurden zunächst auf Platten mit Minimalmedium
mit Glukose bzw. Galaktose angezogen. Jeweils zwei frische Minimalmedium-Platten mit 2%
Glukose bzw. 2% Galaktose wurden anschließend mit dem gebildeten Myzel der
entsprechenden C. higginsianum Stämme beimpft. Eine dieser Platten diente als Kontrolle,
während auf der zweiten ein Papierfilter mit Allylalkohol aufgelegt wurde. Nach fünf Tagen
wurde das Wachstum dokumentiert (siehe Abb. 2.43).
Abbildung 2.43: Katabolitrepression von C. higginsianum. Minimalmedium Platten (YNB) mit 2% Glukose bzw. Galaktose als Kohlenstoffquelle wurden mit Myzel von Wildtyp (CY5525), ΔChku80, ΔChpma2 und den T-DNA Insertionsmutanten vir-22, vir-24, vir-12, vir-102 und vir-97 beimpft. Platten mit Galaktose wurden dabei mit Myzel von Galaktose-Platten und Platten mit Glukose mit Myzel von Glukose-Platten beimpft. Auf jeweils eine Platte wurde ein mit 25 µl Allylalkohol getränkten Papierfilter gegeben. Nach fünf Tagen wurden die Platten fotografiert.
T-DNA Mutanten mit Insertion der T-DNA im ORF von ChPMA2 und der ΔChpma2
Knockoutstamm CY6151 zeigten erneut stärkeres Wachstum auf Platten mit Galaktose als
der Wildtyp bzw. T-DNA Insertionsmutanten mit Insertion im potentiellen Promotorbereich
von ChPMA2 (vir-97, vir-102). Auf Platten mit Glukose war hingegen kein offensichtlicher
93
Unterschied im Wachstum erkennbar. Eine Zugabe von Allylalkohol auf Platten mit Glukose
hatte keine Reduktion des Wachstums zur Folge. Dies deutet darauf hin, dass die
Alkoholdehydrogenase von C. higginsianum der Katabolitrepression durch Glukose
unterliegt. Auf Platten mit Galaktose hingegen wurde das Wachstum aller getesteten
Stämme durch Allylalkohol inhibiert. Der Verlust von ChPma2 scheint keinen Einfluss auf die
Katabolitrepression zu haben, da auch die ΔChpma2 Knockoutmutante auf Platten mit
Glukose und Allylalkohol normales Wachstum zeigte. Die Ursache des verstärkten
Wachstums von Chpma2-Mutanten auf Galaktose konnte nicht geklärt werden. Für Ustilago
maydis wurde allerdings eine wachstumshemmende Wirkung von Galaktose impliziert
(Schuler et al. 2015). Das leicht reduzierte Wachstum von Chpma2-Mutanten auf Medien mit
Glukose deutet auf eine reduzierte Aufnahme dieses Kohlenhydrates hin. Eine ebenfalls
reduzierte Aufnahme von möglicherweise wachstumshemmender Galaktose durch Chpma2-
Stämme könnte eine Erklärung für das beobachtete stärkere Wachstum darstellen.
2.4.6 Expressionsanalysen von ChPMA1 und ChPMA2
Der Verlust von ChPMA2 durch T-DNA Insertion im ORF bzw. durch gezielten Knockout
führt zur Verlust der Pathogenität dieser Stämme im Stadion der Penetration. Das vegetative
Wachstum zeigte im Vergleich zum Wildtyp je nach verwendeter Kohlenstoffquelle nur
leichte Unterschiede auf (sieh Abb. 2.42). ChPMA2 scheint daher eine spezifische Rolle für
die Pathogenität zu besitzen und ist sonst für C. higginsianum nicht von wesentlicher
Bedeutung. Im Gegensatz dazu war ein gezielter Knockout von ChPMA1 nicht erfolgreich,
was darauf hindeutet, dass diese Protonenpumpe eine essentielle Funktion für das
Wachstum für C. higginsianum besitzt. Im Folgenden wurde die Expression beider H+-
ATPasen während verschiedenen Stadien näher untersucht und miteinander verglichen. Die
publizierten RNA-Seq Werte (O’Connell et al., 2012) beider Protonenpumpen sind in Tabelle
2.6 dargestellt. Die Annotation des Genoms
(http://www.broadinstitute.org/annotation/genome/ colletotrichum_group/ MultiHome.html) ist
leider für ChPMA1 fehlerhaft, da das Gen auf zwei Contigs verteilt ist. Folglich gibt es zwei
Gene IDS für ChPMA1 wobei CH063_02576 den Amino-Terminus enthält während
CH063_00553 das Carboxylende kodiert. Tabelle 2.6: RNA-Seq Daten der Expression von ChPMA1 und ChPMA2
Gene IDa VAb PAb BPb NPb ChPMA1a CH063_00553 92 372 555 1572 ChPMA1b CH063_02576 198 864 1247 3401 ChPMA2 CH063_09060 8142 3785 7780 10440 ChTUBα CH063_01222 603 752 862 2048
94
aGene ID entsprechend der Annotation des Colletotrichum Sequencing Project, Broad Institute of Harvard and MIT (http://www.broadinstitute.org/) b Durchschnittlicher Messwert von drei biologischen Replikaten für jedes Entwicklungsstadium (O’Connell et al., 2012) (VA: in vitro Appressorien; PA: in planta Appressorien; BP: biotrophe Phase; NP: nekrotrophe Phase). Die Werte wurden zu der Gesamtzahl der Messwerte des entsprechenden Stadiums normalisiert.
Die fehlerhafte Annotation von ChPMA1 wird in den RNA-Seq Expressionswerten ersichtlich
(O’Connell et al., 2012). Die Expression des 5‘-Bereichs (Gene ID CH063_00553) beträgt
nur ca. 50% der erhaltenen Expressionswerte für den 3‘-Bereich (Gene ID CH063_02576).
Dieser Unterschied beruht vermutlich auf der unterschiedlichen Effektivität der cDNA-
Synthese dieser Bereiche. Die Expression von ChPMA2 ist laut den RNA-Seq Daten in allen
untersuchten Stadien höher als die Summe beider Teile von ChPMA1. Besonders in in vitro
Appressorien (VA) beträgt der Unterschied Faktor 40. Der Expressionswert von ChPMA2
während der nekrotrophen Phase ist der neunt stärkste Wert aller Gene von C. higginsianum
für dieses Stadium. Die sehr starke Expression von ChPMA2 steht damit im Widerspruch zu
der Annahme, dass ChPma1 die Hauptprotonenpumpe in C. higginsianum darstellt. Es war
folglich wichtig die Expression dieser beiden Gene zu überprüfen.
2.4.6.1 PCR-Analysen der Expression von ChPMA1 und ChPMA2
Die Expression von ChPMA1 und ChPMA2 wurde mittels semiquantitativer RT-PCR und
Real Time Quantitative RT-PCR untersucht. Damit sollte zum einen die publizierten RNA-
Seq Daten überprüft werden, vor allem mit Berücksichtigung der fehlerhaften Annotation von
ChPMA1. Zum anderen sollte die Expression in Stadien von C. higginsianum analysiert
werden, die in der RNA Sequenzierung (O’Connell et al., 2012) nicht berücksichtig wurden.
Da RNA-Seq Daten nur für wenige Pathogenitäts-relevanten Proben vorlagen, wurde initial
die Expression beider Protonenpumpen während der Myzelbildung in Flüssigkultur
analysiert. Nach 24, 48, 72 und 96 h Wachstum von C. higginsianum Wildtyp (CY5535) in
modifizierten Mathur-Flüssigmedium wurden Proben genommen aus denen anschließend
RNA isoliert wurde. Für die Expressionsanalyse wurde cDNA generiert und eine
semiquantitative PCR für ChPMA1 und ChPMA2 durchgeführt. Die Expression von ChTUBα
(CH063_01222) wurde ebenfalls bestimmt, da für Tubulin eine konstante Expression
angenommen wurde. Die verwendeten Primer sollten Fragmente mit vergleichbarer Länge
im 3‘-Bereich der jeweiligen Gene amplifizieren. Eine Amplifikation von DNA wurde durch
das Design der Oligonukleotide ausgeschlossen, da 5‘-und 3‘-Ende der Targetsequenz
jeweils eines Primers durch ein Intron getrennt sind. Das Ergebnis der semiquantitativen
PCR mit drei biologischen Replikaten ist in Abbildung 2.44 dargestellt.
95
Abbildung 2.44: PCR-Analyse der Expression von ChPMA1 und ChPMA2 während des Wachstums in Flüssigmedium. Aus jeweils drei Replikaten pro Zeitpunkt (24 h, 48 h, 72 h und 96 h) des Wachstums von C. higginsianum Wildtyp in Flüssigmedium (modifiziertes Mathur-Medium) wurde RNA isoliert und in cDNA umgeschrieben. Die erhaltenen cDNA wurde in einer semiquantitativen PCR mit folgenden Primerpaaren verwendet: ChPMA1 (CK4279/CK4280); ChPMA2 (CK4281/CK4282); ChTUBα (CK3959/CK3960). Abgebildet sind 1,8% Agarosegele mit den aufgetragenen PCR-Produkten. Die Aufnahmen erfolgten mit identischen Einstellungen. M = 50 bp Marker; K = Kontrollansatz mit chromosomaler DNA als Template
Die erhaltenen Banden für ChPMA1 sind in allen untersuchten Zeitpunkten intensiver als die
Banden für ChPMA2 und ChTUBα. Dies deutet darauf hin, dass ChPMA1 in Myzel stärker
exprimiert wird als ChPMA2. Die Intensität der Banden für ChPMA1 schien zudem im
zeitlichen Verlauf zuzunehmen. Im Gegensatz dazu wurden die erhaltenen Banden für
ChPMA2 in ihrer Intensität schwächer. Die Banden für Tubulin deuteten auf eine eher
gleichbleibende Expression dieses Kontrollgens hin. Mittels semiquantitativer PCR war es
allerdings schwierig die Expression von ChPMA1 direkt mit der von ChPMA2 zu vergleichen,
da sich Unterschiede in der Intensitäten von Banden kaum in absolute Werte abschätzen
lassen.
Für eine direkte Quantifizierung der Transkriptmengen von ChPMA1 und ChMA2 wurden
daher quantitative Real Time PCRs durchgeführt deren Ergebnisse in Abbildung 2.45
zusammengefasst sind. Als Template dienten dafür jeweils drei biologische Replikate von
Konidien, in vitro Appressorien, Myzelproben nach 48 h und 72 h (Mathur-Flüssigmedium)
des C. higginsianum Wildtypstammes (CY5535). Zudem wurden bereitgestellte RNA-Proben
aus der Infektion von A. thaliana Col-0 (zwei und drei dpi) (P. Gebauer, persönliche
Mitteilung).gemessen
96
Abbildung 2.45 Bestimmung der Expression von ChPMA1 und ChPMA2 mittels quantitativer Real Time PCR. (A) Mittels quantitativer Real Time PCR ermittelte Transkriptmenge (drei biologische Replikate mit jeweils drei technischen Replikaten) von ChPMA1 und ChPMA2 in Konidien (K), in vitro Appressorien (AP), Myzel (24 h bzw. 48 h in Mathur-Flüssigmedium) und während der Infektion von A. thaliana Col-0 nach drei und vier Tagen (3 dpi, 4 dpi). Jeweils 1 µg RNA wurde mittels Reverse Transkriptase und Oligo dT-Primer in cDNA umgeschrieben. Für die qPCR wurden folgende Primerpaare verwendet: ChPMA1 (CK4279/CK4280); ChPMA2 (CK4281/CK4282); ChTUBα (CK3959/CK3960). Die Daten wurden relativ zu der Expression von ChTUBα dargestellt. (B) ChPMA2 Expression relativ zu der ChPMA2 mRNA Menge in Konidien (K=1).
In Konidien zeigte ChPMA1 mit der circa achtfachen Transkriptmenge im Vergleich zu
ChTUBα eine sehr starke Expression auf (siehe Abb. 2.48A). Dem gegenüber war ChPMA2
in Konidien mit circa 1/64 der Expression von ChTUBα nur sehr schwach exprimiert.
Aufgrund des starken Unterschiedes der Transkriptmengen scheint ChPma1 in Konidien für
die Generierung des Plasmamembranpotenzials zuständig zu sein. In Appressorien steigt im
Vergleich zu Konidien die gemessene Transkriptmenge von ChPMA2 stark an (>100fach)
und erreicht in etwa die Hälfte der Menge des Transkriptes von ChPMA1. Das Verhältnis der
Transkriptmengen von ChPMA1 und ChPMA2 steht damit im Widerspruch zu den
Expressionsdaten der RNA-Seq (O’Connell et al., 2012), in denen ChPMA2 in in vitro
Appressorien 20mal höhere Werte aufwies als ChPMA1 (siehe Tabelle 2.6). Im Vergleich zu
97
Konidien zeigten die Myzelproben eine stärkere Expression von ChPMA1 und erreichten
nach 72 h die 32fache Transkriptmenge von ChTUBα. Die gemessenen Expressionswerte
von ChPMA2 erreichten in 48 Stunden alten Myzel die 50fache Transkriptmenge wie in
Konidien, zeigten aber einen deutlichen Rückgang der Expression nach 72 Stunden. Diese
Werte für die Transkriptmengen von ChPMA1 und ChPMA2 stehen im Einklang mit den
Ergebnissen der semiquantitativen PCR (siehe Abb. 2.44), bei welchen im zeitlichen Verlauf
der Myzelbildung ebenfalls eine Zunahme der ChPMA1 Expression und ein Rückgang der
Expression von ChPMA2beobachtet wurde. Die starke Expression von Protonenpumpen
könnte durch das starke Wachstum erklärbar sein, welches eine erhöhte Aufnahme von
Nährstoffen und dadurch eine starke Protonentransportkapazität erfordert. Für die Infektion
von A. thaliana wurden keine Proben mit sehr frühen Stadien (1 dpi) analysiert, da die
absoluten RNA-Mengen von C. higginsianum in diesen Proben sehr gering sind und eine
Quantifizierung verhindern. In den in planta Proben nach drei und vier Tagen nach der
Sprühinfektion zeigten ChPMA2 und ChPMA1 vergleichbare Werte auf. Die gemessene
Transkriptmenge von ChPMA1 ist allerdings erneut viel höher als die Expressionswerte der
RNA-Seq, was vermutlich auf die inkorrekte Auswertung der RNA-Seq aufgrund der
fehlerhaften Annotation von ChPMA1 zurückzuführen ist.
Die Werte der quantitativen Real Time PCR bestätigen die Annahmen, dass ChPma1 die
essentielle Hauptprotonenpumpe darstellt, während ChPma2 eine spezifische Rolle für die
Infektion besitzt. Vor allem der starke Unterschied der Transkriptmengen dieser Gene in
Konidien und Myzel bietet eine Erklärung warum die Versuche des Knockouts von ChPMA1
nicht erfolgreich waren, während das Wachstum von ΔChpma2 Stämmen sich nur schwach
von dem des Ausgangstammes unterschieden hat.
Da eine Induktion der ChPMA2-Expression in Appressorien im Vergleich zu Konidien
beobachtet werden konnte, wurde versucht das Expressionsmuster von ChPMA1 und
ChPMA2 im zeitlichen Verlauf der in vitro Appressorienbildung näher zu untersuchen. Dazu
wurden RNA-Proben eines Zeitverlaufes der in vitro Appressorien von C. higginsianum
Wildtypstamm CY5535 mittels quantitativer Real Time RT-PCR analysiert. Das Ergebnis von
zwei Messungen ist in Abb. 2.46 dargestellt.
98
Abbildung 2.46: Quantitative Real Time PCR der Expression von ChPMA1 und ChPMA2 während der in vitro Appressorienbildung. Mittels quantitativer Real Time PCR ermittelte Transkriptmenge (zwei Messungen mit jeweils drei technischen Replikaten) von ChPMA1 und ChPMA2 während der in vitro Appressorienbildung auf beschichteten Petrischalen. Die Daten wurden relativ zu der Expression von ChTUBα dargestellt. Für die qPCR wurden folgende Primerpaare verwendet: ChPMA1 (CK3761/CK3762); ChPMA2 (CK3763/CK3764) ChTUBα (CK3959/CK3960).
Zwischen null (entspricht Konidien) und vier Stunden der Appressorienbildung liegt das
Verhältnis der Transkriptmengen von ChPMA1 und ChPMA2 bei über Faktor 100 zugunsten
von ChPMA1 und bestätigt damit den Wert von Konidien der vorherigen qPCR (siehe Abb.
2.45). Acht Stunden nach der Induktion der Appressorienbildung wird die Expression von
ChPMA2 stark induziert (>110fach im Vergleich zu 0 h). Die Expression von ChPMA1 wird
nach acht Stunden um Faktor drei induziert. Der acht Stunden Wert entspricht einen
Zeitpunkt, an den die in vitro Appressorienbildung weitgehend abgeschlossen ist und das
neu gebildete Appressorium melanisiert. Die qPCR-Daten zeigen, dass die Expression
ChPMA2 erst am Ende der in vitro Appressorienbildung induziert wird. Diese
Expressionsdaten sind auch im Einklang mit dem beobachteten Phänotyp von ΔChpma2
Stämmen, bei denen die initiale Appressorienbildung keine Auffälligkeiten zeigten. ChPMA2
scheint daher für die Induktion der Bildung von Appressorien und der eigentlichen
Appressorienbildung nicht beteiligt zu sein, sondern erst für den folgenden Infektionsprozess
eine essentielle Rolle zu spielen.
99
2.4.6.2 Analyse der Expression von ChPMA1 und ChPMA2 mittels Reportergenen
Die Expression von ChPMA1 und ChPMA2 wurde weiter durch Reportergenfusionen
untersucht. Die Expression von Fluoreszenzproteinen unter der Kontrolle der Promotoren
von ChPMA1 und ChPMA2 erlaubte im Gegensatz zu den PCR-Analysen eine
Unterscheidung des Expressionsmuster in individuellen Zellen.
Die T-DNA des Plasmides pPN-Ppma2-mCherry (pCK3880) enthält mCherry unter der
Kontrolle des ChPMA2-Promotors (bis -1024 bp vor dem ORF von ChPMA2) exprimiert wird.
Durch die verwendete Klonierungsstrategie wurden drei Nukleotide zwischen
Promotorfragment und mCherry eingefügt (siehe Abb. 2.47A). Ebenso wurden durch die
Konstruktion von pPK2-Ppma1-GFP (pCK3973) zusätzliche Basenpaare zwischen Promoter
(bis -647 bp vor dem ORF von ChPMA1) und GFP eingefügt. Die T-DNA der Plasmide pPN-
Ppma2-mCherry und pPK2-Ppma1-GFP wurden über ATMT ektopisch in C. higginsianum
Wildtyp integriert. Von den erhaltenen Transformanten wurden CY6434 (Ppma1-GFP) und
CY6269 (Ppma2-mCherry) wurden während verschiedener Stadien mittels konfokaler
Mikroskopie analysiert.
100
Abbildung 2.47 Expression von mCherry und GFP unter der Kontrolle des ChPMA1 bzw. ChPMA2 Promotors. (A) Schematische Darstellung der T-DNAs von pPN-Ppma2-mCherry (pCK3880) und pPK2-Ppma1-GFP (pCK3973). Schwarz eingerahmt sind Nukleotide die durch die Klonierungsstrategie hinzugefügt wurden. Die angegebenen Zahlen spiegeln die Position der eingesetzten Promotorfragmente relativ zu den Startcodon von ChPMA1 bzw. ChPMA2 in C. higginsianum Wildtyp wieder. (B-D) Fluoreszenzmikroskopische (CLSM) Aufnahmen von CY6363 (Ppma1-GFP) und CY6269 (Ppma2-mCherry) während des vegetativen Wachstums in Mathur Flüssigmedium (B), der in vitro Appressorienbildung in IBIDI µDishes (C) und während der Infektion von A. thaliana Col-0 (D). Größenmarker entspricht 10 µm.
Während des Myzelwachstums in Mathur-Flüssigmedium von CY6363 (Ppma1-GFP) war
GFP-Fluoreszenz und damit ChPMA1-Promotoraktivität in allen Zellen sichtbar (Abb. 2.47B).
Die Stärke der beobachteten Fluoreszenz von GFP schien dabei im zeitlichen Verlauf
zuzunehmen. ChPMA2-Promotoraktivität war ebenfalls durch ein starkes mCherry-Signal in
dem gebildeten Myzel von CY6269 (Ppma2-mCherrry) nachweisbar. Im Gegensatz zu den
Beobachtungen für GFP nahm die Fluoreszenz von mCherry während der Myzelbildung ab.
Sowohl die Intensität, als auch der Anteil der Zellen mit Expression von mCherry ging im
101
zeitlichen Verlauf zurück. Die Zunahme bzw. die Abnahme des beobachteten
Fluoreszenzsignals ist damit im Einklang mit der quantitativen Real-Time PCR der
Expression von ChPMA1 und ChPMA2 (siehe Abb. 2.45A). Während der in vitro
Appressorienbildung war ein deutliches GFP-Signal sowohl in Konidien (0 h), als auch in den
neu gebildeten Appressorien (ab 8 h) sichtbar (Abb. 2.47C). Dem gegenüber war keine
ChPMA2-Promotoraktvität in Konidien und unmelansierten Appressorien (8 h) sichtbar. Erst
nach zehn Stunden war Fluoreszenz von mCherry sichtbar, welche allerdings auf das
Appressorium beschränkt war. Im Vergleich zu den Ergebnissen der PCR-Analysen gab es
im Zeitpunkt der Induktion der Expression von ChPMA2 von acht Stunden in der qRT-PCR
(Abb. 2.46) und zehn Stunden bis zu einem mCherry-Signal eine Differenz von zwei
Stunden. Dieser Unterschied könnte zum Teil in der benötigten Zeit für die Translation und
Faltung von mCherry zurückzuführen sein, da in Real Time PCR Analysen die Menge der
RNA quantifiziert wurde. Des Weiteren unterschieden sich aus technischen Gründen die
Parameter der Appressorienbildung zwischen beiden Experimenten. Während der Infektion
von A. thaliana mit CY6363 (Ppma1-GFP) zeigte sich GFP-Fluoreszenz in allen in planta
gebildeten Infektionsstrukturen. Das GFP-Signal war in Sekundärhyphen intensiver als in
Primärhyphen, was auf eine Zunahme der Aktivität des ChPMA1-Promotors in späteren
Stadien der Infektion hinweist (siehe auch Abb. 2.45A). Die mCherry-Fluoreszenz vom
Ppma2-mCherry war ebenfalls in allen Primär-und Sekundärhyphen sichtbar. Das Verhältnis
der Fluoreszenzintensität zwischen Primär-und Sekundärhyphen war aber eher
ausgeglichen. Das in planta Expressionsmuster von mCherry ähnelte damit sehr stark dem
von GFP. Die ehemaligen Konidien auf der Pflanzenoberfläche zeigten im Gegensatz zu den
Beobachtungen während der in vitro Appressorienbildung (Abb. 2.47C) weder GFP noch
mCherry-Fluoreszenz. Allerdings ist unklar ob Konidien von C. higginsianum nach einer
erfolgreichen Penetration des Wirtes wie Konidien von Magnaporthe oryzae Autophagie
einleiten (Veneault-Fourrey et al., 2006) oder auch in späteren Infektionsprozess noch aktiv
sind, wie es bei Colletotrichum gloeosporioides (Nesher et al., 2008) der Fall ist.
Die Promotoraktivität von ChPMA2 war während der Appressorienbildung auf das neu
gebildete Appressorium begrenzt war. Dies bekräftigt die Annahme einer speziellen Funktion
von ChPma2 während der frühen Phasen der Infektion. ChPMA1 scheint hingegen in allen
Zellen von C. higginsianum exprimiert zu werden. Eine Quantifizierung der Promotoraktivität
von ChPMA1 und ChPMA2 war allerdings durch die Analyse dieser Stämme nicht möglich,
da eine Vielzahl von Parametern das beobachtete Fluoreszenzsignal beeinflusste. Sowohl
die Anzahl, als auch der Insertionsort der T-DNAs in den entsprechenden C. higginsianum
Stämmen könnte einen starken Einfluss auf die Expression von GFP und mCherry besitzen,
was auch durch unterschiedliche Intensitäten der Fluoreszenzsignale zwischen den
Transformanten (nicht gezeigt) deutlich wurde. Ebenso weisen GFP und mCherry
102
unterschiedliche spektrale Eigenschaften wie z.B. Photostabilität und Helligkeit auf (Shaner
et al., 2005), wodurch ein stärkeres Fluoreszenzsignal von GFP im Vergleich zu mCherry
nicht gleichbedeutend mit einer stärkeren Expression des Fluoreszenzproteins ist.
2.4.6.3 Lokalisierung von ChPma1 und ChPma2
ChPMA1 und ChPMA2 zeigten unterschiedliche Regulation auf der der Transkript-Ebene.
Die Expression von mCherry unter der Kontrolle des ChPMA2-Promotors zeigte zudem eine
spezifische Aktivität des ChPMA2-Promotors in Appressorien. Um zu analysieren, ob sich
die beiden ATPasen nicht nur in ihrer mRNA-Expression, sondern auch in ihrer
Proteinakkumulation und Lokalisation unterscheiden, wurde versucht ChPma1 bzw. ChPma2
als Fusionsproteine mit GFP oder mCherry in C. higginsianum zu exprimieren. Die initialen
Versuche einer ektopischen Expression von ChPMA2 mit C- bzw. N-terminaler GFP-Fusion
schlugen allerdings fehl (Daten nicht gezeigt). Erst durch die Verwendung eines von
Johannes Schmidpeter modifizierten pOSCAR-Systems konnten entsprechende C.
higginsianum Transformanten erhalten werden.
C. higginsianum Stämme mit in Lokus Fusionen von GFP an ChPMA1 und mCherry an
ChPMA2 wurden von Dr. Marlis Dahl zur Verfügung gestellt. Die Konstruktion der dafür
verwendeten Plasmide pPMA2-mCherry und pPMA1-GFP ist in Abbildung 2.48A
schematisch dargestellt. Nach der ATMT von C. higginsianum liegen die beiden Genloci wie
in Abbildung 2.48B dargestellt vor. Auf diese Art und Weise wurden Stämme hergestellt,
deren einzige Quelle von ChPMA1 und ChPMA2 mCherry bzw. GFP Fusionen sind.
103
Abbildung 2.48: Konstruktion von C. higginsianum Stämmen mit Expression von ChPMA2-mCherry und ChPMA1-GFP. (A) Schematische Übersicht der Klonierungsstrategie von Marlis Dahl für pPMA2-mCherry (pCK4375) und pPMA1-GFP (pCK448) mittels eines modifizierten pOSCAR-Systems. Die Zahlen geben die Position der verwendeten Homologiebereiche von ChPMA1 und ChPMA2 relativ zu dem entsprechenden Startcodon an. (B) Darstellung der homologen Rekombination zwischen den T-DNAs von pPMA2-mCherry und pPMA1-GFP mit der genomischen DNA von C. higginsianum. T: 122 bp Downstream Region von CH063_11345.1
Diese Technik hat den entscheidenden Vorteil, dass sich die entstanden Reporterkonstrukte
im genomischen Lokus von ChPMA1 und ChPMA2 befinden und somit unter der Kontrolle
der nativen Promotoren exprimiert werden. Des Weiteren haben multiple Insertionen der T-
DNAs keinen Einfluss auf die Expression von mCherry bzw. GFP, wodurch alle erhaltenen
Transformanten theoretisch die gleiche Intensität der Fluoreszenz aufweisen. Die
Verwendung verschiedener Resistenzkassetten zwischen pPMA1-GFP und pPMA2-mCherry
erlaubte die Herstellung von C. higginsianum Stämmen mit Expression beider
Reporterkonstrukte. Die konstruierten Stämmen mit in Lokus-Fusionen von ChPma1 sowie
ChPma2 zeigten im Vergleich zu C. higginsianum Wildtyp weder für das vegetativen
Wachstum auf Platten mit Oatmeal oder PDA-Medium, noch für die Bildung von Konidien
Auffälligkeiten (Daten nicht gezeigt). Da ChPma1 vermutlich ein essentielles Protein darstellt,
scheint das ChPma1-GFP Fusionsprotein funktional zu sein und eine ähnliche Protonen-
Transportaktivität wie das Wildtyp-Protein aufzuweisen. Die Funktionalität von ChPma2-
mCherry wurde mittels Sprühinfektionen von A. thaliana mit zwei Stämmen (CY6490 und
CY6493) untersucht. Aufgrund der Beobachtung, das der Verlust von ChPma2 zu einem
Arrest der Infektion im Stadium der Penetration führt, hätte eine fehlerhafte Lokalisierung
oder eine geringe Aktivität von ChPma2-mCherry vermutlich einen starken Effekt auf die
Pathogenität dieser Stämme.
105
Abbildung 2.49: ChPma1-GFP und ChPma2-mCherry haben keinen Einfluss auf die Pathogenität. (A/B) A. thaliana Col-0 Pflanzen wurden mit C. higginsianum Wildtyp (WT, CY5535), CY6490 und CY6493 (PMA1-GFP PMA2-mCherry 1 bzw. 2) sprühinfiziert (1x106 Konidien/ml). Nach drei und vier Tagen wurden je drei Blätter von zwei Pflanzen mit Trypanblau gefärbt (A) und die gebildeten Infektionsstrukturen ausgezählt (B). Primärhyphen sind als Prozentsatz zu der Anzahl der Appressorien angeben während die Bildung von Sekundärhyphen relativ zu Primärhyphen berechnet wurde. Der Fehlerbalken entspricht der Standardabweichung der drei Blätter. (C) Nach drei Tagen wurden jeweils drei Blätter pro infizierten C. higginsianum Stamm mit Anilinblau und DAB gefärbt. Größenmarker = 20 µm
Die lichtmikroskopische Auswertung von Trypanblaufärbungen zeigte, dass drei Tage nach
der Infektion 63% (Pma1-GFP Pma2-mCherry 1) bzw. 53% (Pma1-GFP Pma2-mCherry 2)
der Appressorien Primärhyphen gebildet hatten (siehe Abb. 2.49A und B). Während nach
drei Tagen für den Wildtyp nur eine Bildung von Sekundärhyphen von 1% zu beobachten
war, hatten bereits 12% der Primärhyphen von CY6490 Sekundärhyphen gebildet. Neben
den gebildeten Infektionsstrukturen wurden ebenfalls pflanzliche Abwehrreaktionen in der
Form von Callosebalagerungen und der Freisetzung von H2O2 untersucht (Abb. 2.49C). In
Färbungen von infizierten Blättern (3 dpi) mit Anilinblau waren unter 10% der Appressorien
des parentalen Stammes CY6021 (ΔChku80) Papillen sichtbar und 7% der infizierten Zellen
zeigten eine Farbreaktion bei der Färbung mit DAB. Die beiden untersuchten Stämme mit
Expression von ChPMA1-GFP ChPMA2-mCherry induzierten zu 8% (CY6490) bzw. 10%
(CY6493) Callosebalagerungen und zeigten zu 8% (CY6490) bzw. 7% (CY6493) DAB-
gefärbte Epidermiszellen.
Der Austausch von ChPma1 und ChPma2 durch mCherry- bzw. GFP-Fusionsproteine hatte
keinen Verlust der Pathogenität zur Folge. Beide untersuchten Stämme (CY6490 und
CY6493) bildeten sehr erfolgreich Primär-und Sekundärhyphen aus. Die Induktion
pflanzlicher Abwehrreaktionen war ebenso mit der des parentalen Stammes vergleichbar.
Die Fusionsproteine scheinen daher funktionsfähig zu sein. Im Folgenden wurden die
Stämme Pma1-GFP Pma2-mCherry 1 (CY6490) und Pma1-GFP Pma2-mCherry 2 (CY6493)
mittels konfokaler Mikroskopie analysiert um sowohl die Expression als auch die Lokalisation
beider Fusionsproteine zu untersuchen. In Konidien von CY6490 (ChPma1-GFP, ChPma2-
mCherry 1) war, wie durch die vorangegangen Experimente zu erwarten, keinerlei
Fluoreszenz des ChPma2-mCherry Fusionsproteins nachweisbar. ChPma1-GFP zeigte
hingegen eine starke Fluoreszenz an der Plasmamembran (Abb. 2.50A). Zusätzlich zeigten
verschiedenartige intrazellulären Strukturen ebenfalls ein Signal für Pma1-GFP. Als Kontrolle
diente eine Färbung von C. higginsianum Wildtyp CY5535 mit dem lipophilen Farbstoff FM4-
64. FM4-64 bindet an die Plasmamembran und gelangt nach längeren Inkubationszeiten in
das Innere der Zelle wo der Farbstoff auch intrazellulären Membranen von Vakuolen,
Mitochondrien und Vesikeln färbt (Fischer-Parton et al., 2000). Nach 30 Minuten
Inkubationszeit zeigte fast ausschließlich die Plasmamembran der Konidien ein
Fluoreszenzsignal. Nach 60 Minuten waren auch intrazelluläre Membranen gefärbt. Einige
106
dieser kleineren gefärbten Strukturen ähnelten den beobachteten Strukturen von ChPma1-
GFP. Die größeren Strukturen mit Fluoreszenz von ChPma1-GFP könnten Aggregate des
Fusionsproteins darstellen.
Abbildung 2.50: Lokalisierung von ChPma1-GFP in Konidien. (A) Fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen (CLSM) von Konidien des C. higginsianum Stammes CY6490 (ChPma1-GFP, ChPma2-mCherry). Die einzelnen Kanäle einer Aufnahme (Durchlicht, GFP, mCherry) wurden separat dargestellt. (B) Aufnahmen von C. higginsianum Wildtyp CY5535 gefärbt mit FM4-64 (17 µM) bei einer Inkubationszeit des Farbstoffes für 30 bzw. 60 Minuten. Die Helligkeit des FM4-64 Kanals wurde für die 60 Minuten Probe reduziert. Größenmarker entspricht 10 µm.
107
Um die Expression und Lokalisation von ChPma1 und ChPma2 in Myzel zu untersuchen,
wurden Konidien des C. higginsianum Stammes CY6490 (ChPma1-GFP, ChPma2-mCherry
1) auf Objektträgern mit Fries-Medium inkubiert. Nach 12 Stunden hatten die Konidien
begonnen Hyphen zu bilden (Abbildung 2.51A).
108
Abbildung 2.51: Lokalisierung von ChPma1-GFP und ChPma2-mCherry während der Myzelbildung. (A) Fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen des Stammes CY6490 (ChPma1-GFP, ChPma2-mCherry 1) nach 12 h Inkubation auf Objektträgen mit Fies-Medium. Die einzelnen Kanäle einer Aufnahme (Durchlicht/DIC, GFP, mCherry) wurden separat dargestellt. (B) Konfokal mikroskopische Aufnahmen von Myzel des Stammes CY6490 nach zwei Tagen Inkubation in Mathur-Medium. Dargestellt sind die einzelnen GFP bzw. mCherry-Kanäle und der Overlay dieser beiden. Größenmarker = 20 µm.
Dabei zeigte sich, dass die ehemaligen Konidien stark angeschwollen waren und intensive
GFP- und mCherry-Fluoreszenz zeigten. Ein Teil des Signals war an der Plasmamembran
lokalisiert, während ein Großteil innerhalb der Zelle als rundliche Struktur vorlag. Eine
eindeutige Zuordnung auf bestimmte Organellen war dabei nicht möglich, es könnte sich
auch um Aggregate des Fusionsproteins innerhalb des ehemaligen Konidium handeln. Im
Gegensatz dazu war in den neu gebildeten Hyphen der Großteil von ChPma1-GFP in der
Plasmamembran lokalisiert. Die Fluoreszenz von ChPma1-GFP war auch in den Spitzen der
Hyphen sichtbar. ChPma2-mCherry war ebenfalls in der Plasmamembran lokalisiert,
allerdings zeigten die Spitzen der Hyphen keine Fluoreszenz von mCherry und die Stärke
der Fluoreszenz von ChPma2-mCherry war insgesamt schwächer als die von ChPma1-GFP.
Älteres Myzel (24 h) von Pma1-GFP Pma2-mCherry 1 (CY6490) wurde mittels Konfokal
Mikroskopie analysiert (Abb. 2.51B). Alle gebildeten Hyphen zeigten Expression von
ChPMA1-GFP wobei das Protein in der Plasmamembran als auch innerhalb der einzelnen
Zellen der Hyphen lokalisiert war. ChPma2-mCherry war nur in einigen Hyphen sichtbar und
war zum Großteil in der Plasmamembran lokalisiert. Diese Ergebnisse sind im Einklang mit
den Promotorfusionen und den quantitativen Real Time PCRs. In Myzel scheint die
Expression von ChPMA2 auf einzelne Hyphen begrenzt zu sein, während alle Zellen
ChPMA1 exprimieren.
Die Lokalisierung von ChPma1-GFP und ChPma2-mCherry in in vitro Appressorien und
während der Infektion von A. thaliana wurde mittels konfokaler Mikroskopie analysiert.
ChPMA2-mcherry war nur in den neu gebildeten Appressorium detektierbar aber nicht in den
ehamaligen Konidien (Abb. 2.52A). Das ChPma2-mCherry Fusionsprotein war allerdings
zum größten Teil in Strukturen innerhalb des Appressoriums lokalisiert und zeigte damit
einen starken Unterschied zu der präferentiellen Lokalisierung in der Plasmamembran von
Hyphen (Abb. 2.51). Die Fluoreszenz von ChPma1-GFP war sowohl in der Plasmamembran
sowie als schwächeres Signal im Zytoplasma sichtbar. Besonders deutlich war die
Fluoreszenz am Septum innerhalb der ehemaligen Konidie. Diese Beobachtung beruht
möglicherweise auf das Aufeinandertreffen von zwei Zellmembranen an dieser Stelle
wodurch eine, in etwa doppelt so starke, Fluoreszenz sichtbar war als am Rest der
Membran. Besonders auffällig war allerdings, dass kein ChPma1-GFP in dem neu gebildeten
Appressorium detektierbar war. Das beobachtete Expressionsmuster des Fusionsproteins
steht damit im Widerspruch zu der Expression von GFP unter der Kontrolle eines 650
109
Basenpaar langen ChPMA1-Promotors, da bei diesen Experimenten GFP-Fluoreszenz
sowohl im ehemaligen Konidium als auch im Appressorium sichtbar war (Abb.2.47).
110
Abbildung 2.52: Lokalisierung von ChPma1-GFP und ChPma2-mCherry in Infektionsstrukturen. (A) Konfokal mikroskopische Aufnahmen von in vitro Appressorien des C. higginsianum Stammes CY6490 (ChPma1-GFP, ChPma2-mCherry) auf beschichteten IBIDI Discs nach 6 bzw 12 Stunden. Die einzelnen Fluoreszenzkanäle einer Aufnahme (GFP, mCherry) wurden separat als auch als Overlay dargestellt. (B) A. thaliana Col-0 wurde mit 1x106 Konidien pro ml der Stämme CY6490 bzw. CY6493 infiziert. Nach drei Tagen wurden die gebildeten Infektionsstrukturen mittels konfokaler Mikroskopie analysiert. Dargestellt sind die einzelnen Kanäle (GFP und mCherry Fluoreszenzkanal sowie Durchlicht) der Aufnahmen. Größenmarker = 10 µm.
In in planta gebildeten Appressorien war eine starke Fluoreszenz von ChPma2-mCherry
detektierbar (Abb. 2.52B) während ChPma1-GFP nur ein sehr schwache Fluoreszenz zeigte.
ChPma2 scheint daher die einzige der beiden Protonenpumpen von C. higginsianum zu sein
111
die in Appressorien (in vitro und in planta) lokalisiert ist. Die Appressorien von C.
higginsianum Stämmen mit Expression von ChPMA1-GFP und ChPMA2-mCherry konnten
erfolgreich A. thaliana penetrieren und bildeten in planta Infektionsstrukturen. In
Primärhyphen von CY6490 bzw. CY6493 (beide Stämme mit ChPma1-GFP und ChPma2-
mCherry) waren beide Fluoreszenzproteine sowohl an der Plasmamembran, als auch in
intrazellulären Strukturen lokalisiert. Eine Analyse von Sekundärhyphen mittels konfokaler
Mikroskopie war aufgrund des starken Hintergrundes von nekrotischen Pflanzengewebe
(Daten nicht gezeigt) nicht eindeutig möglich. Die konfokal-mikroskopische Analyse von
Stämmen mit ChPma1-GFP, ChPma2-mCherry in Lokus zeigte, dass beide Fusionsproteine
Unterscheide in der Expression und Lokalisation aufweisen. In Appressorien war nur
ChPma2-mCherry nachweisbar, was auf eine spezielle Rolle von ChPma2 in diesen Zelltyp
hindeutet. Da die untersuchten Stämme keine Auffälligkeiten hinsichtlich Wachstum oder
Pathogenität zeigten, scheinen beide Protonenpumpen funktional zu sein und die Ergebnisse
keine Folge von mislokaliserten Fusionsproteinen.
2.4.7 Komplementation und Suppression des Pathogenitätsphänotyps von ChPMA2 T-DNA Insertionsmutanten
Mittels Expressionsanalysen und Reportergenfusionen konnten für ChPMA1 und ChPMA2
eine unterschiedliche Expression und Lokalisation während der Appressorienbildung gezeigt
werden. ChPMA1-GFP wird in dem ehemaligen Konidium exprimiert, konnte aber nicht in
den neu gebildeten Appressorium detektiert werden. Im Gegensatz dazu war das
Fluoreszenzsignal von ChPma2-mCherry in melanisierten Appressorien nachweisbar aber
nicht in Konidien. In Appressorien scheint daher der Protonentransport zum Großteil von der
Aktivität von ChPma2 abhängig zu sein. Unklar war allerdings, ob sich nur die Expression
der beiden Protonenpumpen unterscheidet oder ob sie sich auch funktionell unterscheiden.
Dazu wurden im Folgenden Komplementations- und Suppressionsanalysen mit verscheiden
PMA Konstrukten durchgeführt.
2.4.7.1 Die ektopische Expression von ChPMA2 komplementiert den Pathogenitätsdefekt der ChPMA2 T-DNA Insertionsmutanten vir-22 und vir-24
Um zu überprüfen ob der Phänotyp von ChPMA2 T-DNA Insertionsmutanten
komplementiert werden kann, wurden die vir-Mutanten vir-22 und vir-24 mittels ATMT
mit dem Plasmid pPN-ChPMA2 transformiert. Sowohl vir-22 als auch vir-24 tragen
die T-DNA Insertion innerhalb des ORF von ChPMA2 (+130 bzw. +454 relativ zum
1. ATG) und sind vollständig apathogen. Die T-DNA von pPN-ChPMA2 (siehe Abb.
2.53 A) enthält eine Nourseothricin-Resistenzkassette und ChPMA2 unter der
112
Kontrolle des potentiellen Promotors von ChPMA2 (1044 bp; -2 bis -1046 relativ zum
Startcodon). Erhaltene Nourseothricin-resistente Transformanten wurden für die
Sprühinfektion von A. thaliana Col-0 Pflanzen verwendet und auf ihre Pathogenität
hin untersucht.
113
Abbildung 2.53: Komplementation von ChPMA2 T-DNA Insertionsmutanten vir-22 und vir-24. (A) Schematische Darstellung der T-DNA des für die ATMT verwendeten Plasmids pPN-ChPMA2 (pCK3883). (B/C) Ergebnisse der Sprühinfektion von A. thaliana Col-0 nach fünf Tagen in Form von makroskopischen Aufnahmen und Trypanblaufärbungen. Für die Komplementanten in (A) diente vir-22 als Ausgansstamm für die Transformation mit pPN-ChPMA2, während für die Transformanten in (C) vir-24 als parentaler Stamm verwendet wurde. WT: C. higginsianum Wildtyp Stamm CY5535; Größenmarker entspricht 50 µm
Die mit vir-22 und vir-24 infizierten A. thaliana Pflanzen zeigten nach fünf Tagen keinerlei
makroskopisch sichtbare Symptome. In den entsprechenden Trypanblaufärbungen waren
nur Appressorien sichtbar, aber keine Primär-oder Sekundärhyphen. Dem gegenüber
zeigten mit C. higginsianum Wildtyp (CY5535) infizierte Pflanzen deutlich sichtbare Nekrosen
und ein verzweigtes Netz von Sekundärhyphen. Die drei untersuchten pPN-ChPMA2
Transformanten mit vir-22 als Ausgangsstamm (vir-22 Pma2 A/B/C) zeigten eine
unterschiedliche Pathogenität (Abb. 2.53B). So war vir-22 Pma2-B (CY6571) nicht in der
Lage Primär- oder Sekundärhyphen zu bilden. Im Gegensatz dazu zeigten die Stämme vir-
22 Pma2-A (CY6570) und vir-22 Pma2-C (CY6572) eine Komplementation des
Pathogenitätsdefektes von vir-22. Fünf Tage nach der Sprühinfektion mit diesen Stämmen
waren deutliche makroskopische Symptome sichtbar und Trypanblaufärbungen zeigten eine
erfolgreiche Bildung von Infektionshyphen. Die drei Stämme mit vir-24 als parentalen Stamm
waren ebenfalls in der Lage sowohl Primär- als auch Sekundärhyphen zu bilden (sieh Abb.
2.53). Vor allem vir-24 Pma2-A (CY6569) zeigte eine, mit dem Wildtypstamm (CY5535)
vergleichbare, Pathogenität.
Fünf von sechs untersuchten Stämmen waren durch die ektopische Expression von
ChPMA2 wieder in der Lage A. thaliana zu infizieren. Die Komplementation des
Pathogenitätsdefektes von vir-22 und vir-24 deutete auf eine erfolgreiche Expression von
ChPMA2 durch den verwendeten Promotor hin.
2.4.7.2 Die Expression von ChPMA1 kann den Pathogenitätsdefekt von Insertionsmutanten nur teilweise supprimieren
Nach der erfolgreichen Wiederherstellung der Pathogenität der Chpma2 Nullallele von vir-22
und vir-24 durch Expression von ChPMA2, sollte überprüft werden ob eine Kopie von
ChPMA1 unter der Kontrolle des ChPMA2 Promoters in der Lage ist ChPMA2 zu ersetzen.
Eine erfolgreiche Suppression des Pathogenitätsphänotyps von vir-22 und vir-24 durch
ChPMA1 würde bedeuten, dass der Pathogenitäts-relevante ChPma2-vermittelte
Protonentransport in Appressorien auch durch ChPma1 wahrgenommen werden könnte und
sich beide Protonenpumpen nur in der Expression unterscheiden.
Das dafür konstruierte Plasmid pPN-ChPMA1 enthält als Promotor für die Expression von
ChPMA1 das gleiche ChPMA2 Promotor-Fragment das bereits in pPN-ChPMA2 zum Einsatz
114
kam. Zunächst wurde vir-24 mittels ATMT mit pPN-ChPMA1 transformiert und vier
Nourseothricin-resistente Stämme wurden mittels Sprühinfektion von A. thaliana Col-0
Pflanzen auf ihre Pathogenität hin überprüft.
Abbildung 2.54: Suppression des Phänotyps von vir-24. (A) Schematische Darstellung der T-DNA des für die ATMT verwendeten Plasmids pPN-ChPMA1. Die Zahlen geben die Position der verwendeten Fragmente relativ zu den Startcodon von ChPMA1 bzw. ChPMA2 an. (B) Ergebnisse der Sprühinfektion von A. thaliana Col-0 (5 dpi) mit C. higginsianum Wildtyp (CY5535), den Ausgangsstamm vir-24, vir-24 Pma1-A (CY6582), vir-24 Pma1-B (CY6583), vir-24 Pma1-C (CY6584) und vir-24 Pma1-D (CY6585) in Form von makroskopischen Aufnahmen und Trypanblaufärbungen. Größenmarker = 50 µm
Fünf Tage nach der Sprühinfektion zeigte der C. higginsianum Wildtypstamm eine effektive
Infektion von A. thaliana. Die infizierten Blätter zeigten großflächige Nekrosen welche von
einen starken Geflecht aus Sekundärhyphen durchzogen waren. Die ChPMA2 T-DNA
Insertionsmutante vir-24 zeigte hingegen keinerlei makroskopischen Symptome und keine
Bildung von Primärhyphen. Die vier untersuchten Transformanten zeigten eine sehr
unterschiedliche Pathogenität. Während vir-24 Pma1-B keinerlei Infektionshyphen ausbildete
115
und sich somit wie der Ausgangsstamm verhielt, zeigten die anderen drei Stämme eine
teilweise Suppression des Phänotyps von vir-24. Die Stämme vir-24 Pma1-C (CY6583) und
vir-24 Pma1-D (CY6585) bildeten vereinzelt Primärhyphen aus (5% für CY6584, <1% für
CY6585) und ebenso waren kleinere Nekrosen auf den infizierten Blättern erkennbar (Abb.
2.54). Circa 30% der gebildeten Primärhyphen von CY6584 bildeten Sekundärhyphen aus,
während in Trypanblaufärbungen von CY6585 keine Sekundärhyphen sichtbar waren. Die
stärkste Pathogenität zeigte die Transformante CY6582. Dieser Stamm bildete stellenweise
deutliche makroskopische Symptome auf den infizierten Blättern aus die allerdings deutlich
kleiner waren als die des Wildtypstammes. Trypanblaufärbungen dieser Stellen zeigten eine
effiziente Bildung von Primär-und auch Sekundärhyphen (Quantifizierung kaum möglich aber
vergleichbar mit Wildtyp).
In einem zweiten Experiment diente vir-22 als Ausgangstamm für die ATMT mit pPN-
ChPMA1. Neun der erhaltenen Transformanten wurden mittels Sprühinfektion und
anschließender Auswertung von Trypanblaufärbungen infizierter Blätter auf ihre Pathogenität
hin untersucht. Der Prozentsatz gebildeter Infektionsstrukturen ist in Tabelle 2.7
zusammengefasst.
Tabelle 2.7: Suppression des Pathogenitätsphänotyps von vir-22
Stamm Primärhyphen1 Sekundärhyphen2
vir-22 pPN-ChPMA1-1 (CY7226) <1% 0%
vir-22 pPN-ChPMA1-2 (CY7227) 9% 20%
vir-22 pPN-ChPMA1-3 (CY7228) 0% -
vir-22 pPN-ChPMA1-4 (CY7229) 0% -
vir-22 pPN-ChPMA1-5 (CY7230) <1% 0%
vir-22 pPN-ChPMA1-6 (CY7231) <1% 0%
vir-22 pPN-ChPMA1-7 (CY7232) <1% 80%
vir-22 pPN-ChPMA1-8 (CY7233) <1% 20%
vir-22 pPN-ChPMA1-9 (CY7234) 11% 20%
Wildtyp CY5535 36% 72%
vir-22 0% -
vir-22 pPN-1 (CY7235) 0% -
vir-22 pPN-2 (CY7236) 0% - 1Gebildete Primärhyphen als Prozentsatz zu der Gesamtanzahl von Appressorien 2Gebildete
Primärhyphen als Prozentsatz zu der Anzahl von Primärhyphen
Sowohl der Ausgangstamm vir-22, als auch zwei Stämme aus der Transformation von vir-22
mit dem Leervektor pPN (CY7235 und CY7236) bildeten keinerlei Primärhyphen aus. Fünf
116
Transformanten (CY7226, CY7230, CY7231, CY7232 und CY7233) waren sehr vereinzelt
(<1%) in der Lage die Wirtspflanze zu penetrieren und Infektionshyphen zu bilden. Zwei
Stämme (CY7227 und CY7234) zeigten eine Primärhyphenbildung von ≥ 9% und in den
Trypanblaufärbungen waren Anzeichen von ausgeprägten Nekrosen erkennbar (nicht
gezeigt). Für diese Stämme wurde die Induktion pflanzlicher Abwehrreaktionen in der Form
von Callose-Ablagerungen und der Freisetzung von H2O2 untersucht (siehe Abb. 2.56).
Abbildung 2.55: Die Suppression des Phänotyps von vir-22 hat eine verstärkte Abwehr zur Folge. Mikroskopische Aufnahmen von DAB bzw. Anilinblau-gefärbten Blättern aus der Infektion von A. thaliana Col-0 mit vir-22, CY7227 und CY7234. Größenmarker = 100 µm
Dabei zeigte sich, dass eine Infektion mit diesen Transformanten eine Induktion der
pflanzlichen Abwehr zur Folge hatte. CY7234 zeigte mit 5% ROS und 6% Anilinblau eine
ähnliche und CY7227 mit 19% ROS und 15% Anilinblau-gefärbten Epidermiszellen eine
stärkere induzierte Abwehr als der C. higginsianum Wildtypstamm CY5535 (7% ROS, 11,2%
Callose). Dies ist von besonderen Interesse, da eine Infektion mit vir-22 fast keine
Abwehrreaktionen zur Folge hatte (<1% DAB und Callose).
DAB
vir-
22
Anilinblau
CY7
227
vir-
22 p
PN
-ChP
MA1
-2
CY7
234
vir-
22 p
PN
-ChP
MA1
-9
117
Durch die Expression von ChPMA1 unter der Kontrolle eines ChPMA2 Promotors konnte der
Pathogenitätsphänotyp von vir-22 und vir-24 nur teilweise supprimiert werden. Die einzelnen
Transformanten zeigten starke Unterschiede in ihrer Fähigkeit zur Ausbildung von
Infektionshyphen. Nur Drei von 14 analysierten Transformanten konnten stellenweise
makroskopisch sichtbare Nekrosen ausbilden welche in Trypanblaufärbungen Primär-und
auch Sekundärhyphen zeigten. Dabei konnte für CY7227 und CY7234 eine verstärkte
Induktion pflanzlicher Abwehrreaktionen beobachtet werden. Dies deutet darauf hin, dass
sich ChPma1 und ChPma2 nicht nur in ihrer Expression unterscheiden sondern auch
funktionale Unterschiede aufweisen.
118
3. Diskussion
3.1 Etablierung eines Gene Targeting Systems in C. higginsianum
Ein Ziel dieser Arbeit war es C. higginsianum Stämme für ein effizientes Gene-Targeting
System durch das Ausschalten des NHEJ-Mechanismus zu generieren. Das C. higginsianum
Ku80-Ortholog von MgKu80 wurde mittels BLAST-Analysen in den verfügbaren
Genomsequenzen identifiziert. Durch die Verwendung von zwei Selektionsmarkern in der T-
DNA der ChKU80-Deletionsplasmide konnten entsprechende Chku80-Deletionsmutanten
selektioniert werden. Southern Blot und PCR-Analysen dieser Stämme zeigten einen
erfolgreichen Austausch des Großteils des ORF von ChKU80 mit einer Nourseothricin-
Resistenzkassette ohne zusätzliche, ektopische T-DNA Insertionen aufzuweisen. Zudem
wurden wie für NHEJ-defiziente Mutanten der Ascomyceten Aspergillus nidulans (Nayak,
2005), Neurospora crassa (Ninomiya et al., 2004) und Magnaporthe grisea (Villalba et al.,
2008) keine unerwünschten Phänotypen für die ΔChku80-Stämme beobachtet.
Die ΔChku80 Stämme zeigten in Agrobacterium tumefaciens vermittelten Transformationen
mit Plasmiden ohne C. higginsianum Homologiebereiche im Vergleich zu den Wildtypstamm
eine verringerte Anzahl erhaltener Transformanten (<10%). Die ektopische Integration
exogener DNA ist wie in ChKU70-defizienten Stämmen (Ushimaru et al., 2010) stark
reduziert. Damit scheint in C. higginsianum, ähnlich wie in Pflanzen (Jia et al., 2012; Saika et
al., 2014) und in S. cerevisiae (Attikum et al., 2001), die ektopische Insertion von T-DNA
größtenteils abhängig von Enzymen der NHEJ-Maschinerie zu sein. Bei ATMTs von
ΔChku80 Stämmen wurden allerdings auch Transformanten mit ektopischen T-DNA
Insertionen erhalten (siehe Abb. 2.36). Ähnliche Beobachtungen von NHEJ-defizienten
Stämmen von N. crassa (Ishibashi et al., 2006) und M. grisea (Kito et al., 2008) deuteten auf
das Vorhandensein eines Ku-unabhängigen Mechanismus hin, der in C. higginsianum
ebenfalls an der Insertion exogener DNA beteiligt sein könnte. Obwohl in ΔChku80-Stämmen
ektopische Integrationen nicht vollständig blockiert sind, ermöglichen sie einen effizienten
Knockout von Zielgenen. So konnten im Rahmen dieser Arbeit durch Transformation von
ChKU80-defizienten Stämmen erfolgreich Knockout-Mutanten für mehrere Gene hergestellt
werden. So zeigten z.B. 18 von 21 Stämme aus der ATMT mit dem pDel-Cih1 (pCK3083)
den Austausch des ORF von ChCIH1 mit einer Hygromycin Resistenzkassette. Durch die
Verwendung einer Bialaphos-Resistenzkassette als dritter Selektionsmarker konnten zudem
C. higginsianum Stämme mit Deletionen von ChCIH1 und ChCIH2 erhalten werden (siehe
Abb. 2.14).
Die konstruierten ΔChku80 Stämme ermöglichen neben den targeted Knockout von
Zielgenen weitere Anwendungen wie z.B. in Lokus Reportergenfusionen (siehe ChPMA1 und
119
ChPMA2). Ein häufig auftretendes Problem während dieser Arbeit waren sich stark
voneinander unterscheidende Transformanten, die z.B. eine unterschiedlich starke
Expression von Reporterkonstrukten oder eine unterschiedliche Pathogenität aufwiesen.
Eine gerichtete Insertion der entsprechenden Konstrukte in den ΔChku80 Lokus könnte die
Homogenität der Transformanten erhöhen, da ein möglicher Einfluss von Anzahl und
Insertionsort der T-DNAs minimiert werden könnte. Die erhaltenen Transformanten wären
zudem nicht mehr gegenüber Nourseothricin resistent, was eine weitere Methode der
Selektion ermöglichen würde. Abbildung 3.1 fasst schematisch einige der
Verwendungsmöglichkeiten von NHEJ-defizienten C. higginsianum Stämmen zusammen
Abbildung 3.1: Anwendungen für NHEJ-defiziente C. higginsianum Stämme. Durch Inaktivierung des NHEJ-Reparaturmechanismus wurde die Rate der Integration exogener DNA durch Homologe Rekombination in das Genom von C. higginsianum stark erhöht was vielfältige Anwendungen ermöglicht:(A) Target Gene Knockout von Genes of Interest und anschließender Analyse des resultierenden Phänotyps; (B) in Lokus Fusionen von Zielgenen mit Reportergenen oder Tags; (C) Expression von Reportergenkonstrukten oder Genes of Interest (GOI) in definierten genomischen Loci.
Auch wenn für die generierten ΔChku80 Stämme keine phänotypischen Veränderungen zu
dem Wildtyp erkennbar waren, könnte die Verwendung von Stämmen mit inaktiverten NHEJ-
120
Reperaturmechanismus für einige Anwendungen ungeeignet sein. In solchen Fällen wäre
eine Komplemenation durch ein funktionales Allel von ChKU80 als Bestandteil der T-DNA
denkbar.
3.2 Die Rolle von Proteinen mit LysM-Domänen für die Pathogenität von C. higginsianum
Proteine mit LysM-Domänen wurden in mehreren phytopathogenen Pilzen als
Virulenzfaktoren identifiziert. Darunter zählen Ecp6 aus Cladosporium fulvum (Bolton et al.,
2008), Magnaporthe oryzae Slp1 (Mentlak et al., 2012) und Mg3LysM aus Mycosphaerella
graminicola (Marshall et al., 2011). Der Verlust dieser LysM-Effektorproteine hat einen
starken Einfluss auf die Pathogenität der entsprechenden Pilze und führt zu verstärkten
Abwehrreaktionen des Wirtes. Für diese drei Proteine konnte ebenso gezeigt werden, dass
sie Chitinoligomere binden und dadurch vermutlich ein Auslösen der Chitin-induzierten
Immunantwort der Wirtspflanzen verhindern (de Jonge and Thomma, 2009; de Jonge et al.,
2010; Lee et al., 2013; Mentlak et al., 2012).
Im Rahmen dieser Arbeit wurde überprüft ob C. higginsianum als hemibiotrophes Pathogen
ebenfalls derartige LysM-Effektorproteine besitzt um eine Erkennung durch die Wirtszellen
zu verhindern. Durch Analysen der verfügbaren C. higginsianum Genomsequenz konnten 16
Proteine mit vorhergesagten LysM-Domänen identifiziert werden. Auf Basis von
Expressionsdaten (O’Connell et al., 2012) wurden von diesen 16 Proteinen drei (ChCih1,
ChCih2 und ChLysM3) ausgewählt und näher untersucht. ChCih1 und ChCih2 zeigten von
allen identifizierten C. higginsianum Proteinen mit vorhergesagten LysM-Domänen die
stärkste Ähnlichkeiten zu den beschriebenen Effektorproteinen Slp1, Ecp6 und Mg3LysM
Beide Proteine wurden als C. higginsianum Effector Candidates ChEC90 und ChEC90a
beschrieben aber nicht näher untersucht (Kleemann et al., 2012).
In phylogenetischen Analysen von Proteinen mit LysM-Domänen aus C. higginsianum,
Magnaporthe oryzae und Fusarium graminearum (siehe Abb. 3.2) bilden ChCih1, ChCih2
zusammen mit Cih1 aus C. lagenarium, Mg1LysM, Mg2LysM aus Mycosphaerella
graminicola, und Slp1 und Slp2 aus Magnaporthe oryzae eine Gruppe „Cih-ähnlicher
Proteine“. Als Auffälligkeit enthält diese Gruppe keines der 12 LysM-Proteinen aus F.
graminearum, obwohl für FGSG_02255 eine mit Ecp6 ähnliche Proteinstruktur berichtet
wurde (Sperschneider et al., 2015). Im Gegensatz zu M. oryzae Slp1 konnte für Slp2 keine
Expression während der Infektion detektiert werden und entsprechende Δslp2-Mutanten
zeigten keinen Phänotyp (Mentlak et al., 2012). Auf Basis der relativ hohen Expression
während der nekrotrophen Phase (O’Connell et al., 2012) wurde ChLysM3 ebenfalls
analysiert obwohl das Protein eine schwächere Ähnlichkeit zu Slp1 oder Ecp6 aufweist.
121
Abbildung 3.2: Phylogenie von LysM-Proteinen. Proteinsequenzen wurden mit ClustalW aligned und mittels Geneious treebuilding als phylogenetischer Baum grafisch dargestellt; prozentuale Bootstrap Werte (1000 Replikate) befinden sich jeweils links an den Verzweigungen.
GFP-bzw. mCherry-Fusionsproteine von ChCih1 und ChCih2 zeigten eine starke
Fluoreszenz an der Peripherie von Primärhyphen. In Konidien und Appressorien war
hingegen für beide Fusionsproteine keine Fluoreszenz detektierbar. Das Vorhandensein von
LysM-Domänen, die Homologie zu beschriebenen Effektorproteinen, die Expression in
Primärhyphen und die vermutliche Sekretion im Apoplasten des Wirtes implizierten eine
mögliche Rolle von ChCih1 und ChCih2 für die Pathogenität von C. higginsianum während
der biotrophen Phase. Die untersuchten C. higginsianum Stämme mit Deletion von ChCIH1
oder ChCIH2 zeigten allerdings gegenüber A. thaliana keine verringerte Pathogenität. Auch
eine erhöhte Induktion pflanzlicher Abwehrreaktionen in der Form von Callose-Ablagerungen
oder der Freisetzung von H2O2 konnte bei Infektionen mit diesen Stämmen nicht beobachtet
werden. Aufgrund einer möglichen redundanten Funktion von ChCih1 und ChCih2 wurden C.
higginsianum Stämme mit Deletion beider Gene hergestellt, welche ebenfalls einen, mit dem
Wildtyp vergleichbaren, Infektionsverlauf auf A. thaliana Pflanzen zeigten. Somit sind die
Cih-ähnliche Proteine ChCih1 und ChCIh2 für eine erfolgreiche Infektion von A. thaliana
122
Pflanzen nicht erforderlich. Da entsprechende Knockout Stämme keinen Phänotyp während
der Infektion zeigten, ist ChLysM3 ebenfalls für die Pathogenität nicht erforderlich.
Das Ausbleiben eines Virulenz-Phänotyps für ΔChCih1 und ΔChCih2 Stämme steht damit im
Widerspruch zu der Annahme einer möglichen konservierten Rolle von Ecp6-ähnlichen
LysM-Proteine für die Pathogenität phytopathogener Pilze (de Jonge et al., 2010). Allerdings
wurde der Infektionsverlauf nur auf A. thaliana Pflanzen untersucht. Damit ist nicht
auszuschließen, dass ChCih1 oder ChCih2 eine essentielle Rolle bei der Infektion anderer
Wirtspflanzen z.B. aus den Gattungen Brassica oder Raphanus einnehmen. Zudem wurden
mit der Induktion von Callose Papillen und der Freisetzung von H2O2 nur zwei pflanzliche
Abwehrreaktionen untersucht. Zusätzliche Messungen wie z.B. die Bestimmung der
Expression von pflanzlichen Chitinasen während der Infektion mit ΔChCih1 und ΔChCih2
Stämmen wären daher von Interesse. Für Mg1LysM und Mg3LysM konnte eine mögliche
zusätzliche Funktion bei dem Selbstschutz von pilzlichen Hyphen gegenüber der Hydrolyse
durch pflanzliche Enzyme identifiziert werden (Marshall et al., 2011). Eine derartige Aktivität
von ChCih1 und ChCih2 wurde im Rahmen dieser Arbeit nicht getestet und könnte die Basis
für weiterführende Analysen dieser Proteine darstellen.
Trotz den Charakteristika möglicher Effektorproteine bleibt die Funktion von ChCih1 und
ChCih2 ungeklärt. Die erhaltenen Ergebnisse deuten darauf hin, dass beide Proteine für die
Pathogenität von C. higginsianum nicht erforderlich sind. Im Gegensatz zu Mg3LysM und
Ecp6 besitzen ChCih1 und ChCih2 nur zwei statt drei LysM-Domänen. Durch eine
unvollständige Sequenzierung oder einer fehlerhaften automatischen Annotation könnte das
Genom von C. higginsianum weitere, bisher unentdeckte LysM-Proteine enthalten, die
redundante Funktionen mit ChChi1 oder ChCih2 besitzen könnten. Daneben bietet sich
CH063_05984 für weitere Analysen an. Dieses Protein enthält sowohl vorhergesagte LysM,
als auch eine CVNH-Domäne und zeigt eine starke Ähnlichkeit zu MGG_03307 für welches
eine Funktion in frühen Stadien der Infektion von Magnaporthe oryzae impliziert wurde
(Koharudin et al., 2011).
123
3.3 Die Rolle von H+-ATPasen für die Pathogenität von C. higginsianum
3.3.1 Der ChPMA2 Lokus ist ein potentieller „Hot Spot“ für T-DNA Insertionen
Mittels Genome Walker Analysen konnten die T-DNA Insertionen von sechs (vir-12, vir-19,
vir-22, vir-24, vir-97 und vir-102) der 75 vir-Mutanten in dem genomischen Lokus von
ChPMA2 identifiziert werden. In drei dieser vir-Mutanten inserierte die T-DNA im
Promotorbereich, die anderen hatten Insertionen in der kodierenden Region von ChPMA2.
Bei einer Genomgröße von 53,4 Mb (O’Connell et al., 2012) steht die Insertion von sechs T-
DNAs in einem Bereich von ca. 1000 bp (von -502 in vir-97 bis +454 in vir-22) im
Widerspruch zu der ursprünglichen Annahme, dass der Agrobacterium tumefaciens
vermittelte Transfer von T-DNAs in das Genom der transformierten Zelle zufällig erfolgt
(Bundock et al., 2002; Michielse et al., 2005). Pathogenitätsscreens von phytopathogenen
Pilzen zeigen oftmals eine mehrmalige Identifizierung von bestimmten potentiellen
Pathogenitätsfaktoren. Eine Kollektion von 106 Pathogenitätsmutanten von Fusarium
oxysporum enthielt für fünf potentielle Pathogenitätsloci jeweils mehrere unabhängige T-DNA
Insertionen (Michielse et al., 2009). Von 12 isolierten C. higginsianum Mutanten enthielten
zwei eine T-DNA Insertion in einem Importin-β2 Homolog (Huser et al., 2009). Bestimmte
DNA-Bereiche könnten daher für T-DNA Insertionen bevorzugte Eigenschaften aufweisen
und „Hot Spots“ für Insertionen darstellen. In Agrobacterium tumefaciens vermittelten
Transformationen von A. thaliana und Reis konnten vermehrt T-DNA Insertionen in
chromosomalen Regionen mit hoher Gendichte nachgewiesen werden, während in
centromeren Regionen signifikant weniger Insertionsereignisse stattfanden („cold spots“)
(Alonso et al., 2003; Zhang et al., 2007). Für Magnaporthe oryzae konnte zudem eine
präferentielle Integration von T-DNAs in Promotorbereichen gezeigt werden (Choi et al.,
2007; Meng et al., 2007), wobei die Flexibilität der DNA (DNA-Bending) als möglicher Faktor
für eine präferentielle T-DNA Integration in diesen Bereichen impliziert (Choi et al., 2007)
wurde. Mehrere dieser Faktoren könnten einen positiven Einfluss auf die Zugänglichkeit des
ChPMA2 Lokus für T-DNA Insertionen haben, wodurch dieser ein potentieller „Hot Spot“
darstellen könnte. Dies könnte eine mögliche Erklärung für dem überproportional großen
Anteil von ChPMA2 T-DNA Insertionsmutanten in den ca. 7000 generierten Mutanten sein.
Als zusätzlicher Faktor weisen ChPMA2 Mutanten keine Defekte im Wachstum oder in der
Bildung von Konidien auf. Somit zeigen sie keinen Phänotyp der eine Auswahl dieser
Mutanten im Screening-Prozess nachteilig beeinflusst hätte. Ihre Identifizierung im
Pathogenitätsscreening wurde zudem stark von den ausgeprägten Pathogenitäsdefekt
begünstigt.
124
3.3.2 Wie wird die Expression von ChPMA1 und ChPMA2 reguliert?
Im Rahmen dieser Arbeit konnte ChPma2 als Pathogenitätsfaktor für das A. thaliana – C.
higginsianum Pathosystem identifiziert werden. Neben ChPma2 besitzt C. higginsianum mit
ChPma1 eine zweite H+-ATPasen. Die stärkere Expression von ChPMA1 in Konidien und
während der Myzelbildung spricht dafür, dass die Aufrechterhaltung des Protonengradienten
hauptsächlich von der Aktivität von ChPma1 abhängig zu sein scheint. Dies würde auch das
Ausbleiben eines ausgeprägten Phänotyps der entsprechenden ΔChPma2-Stämme in
diesen Stadien erklären. Des Weiteren war der gezielte Knockout von ChPMA1 nicht
erfolgreich, was darauf hindeutet, dass ChPma2 den Verlust der ChPma1 Aktivität nicht
kompensieren kann. Reportergenfusionen zeigten, dass ChPMA2-mCherry aber nicht
ChPMA1-GFP in neu gebildeten Appressorien exprimiert wird und somit der
Protonentransport in diesen Zelltyp allein von der Aktivität von ChPma2 abhängig ist. Der
Verlust von ChPMA2 durch T-DNA Insertionen oder gezielten Knockout hat somit vermutlich
den vollständigen Ausfall der Protonentransportaktivität in Appressorien zur Folge was zu
einem Arrest der Infektion von A. thaliana im Stadium der Penetration führt. Bioinformatische
Analysen der Promotorsequenzen von ChPMA1 und ChPMA2 deuten auf eine
unterschiedliche Regulation der Expression beider Gene hin. So enthält der Promotorbereich
von ChPMA2 vorhergesagte Bindestellen (Farre, 2003; Messeguer et al., 2002) für die
Transkriptionsfaktoren PacC (-550, -810 bp relativ zum ATG) und AbaA (-90 bp) die im
upstream Bereich von ChPMA1 nicht vorhanden sind. PacC ist ein Regulator der pH-
abhängigen Transkription in Aspergillus nidulans und A. fumigatus (Bertuzzi et al., 2014;
Bignell et al., 2005) und in Colletotrichum gleosporoides und Botrytis cinerea konnte eine pH-
abhängige Regulation einer Vielzahl von Pathogenitäts-relevanten Gene durch PacC gezeigt
werden (Alkan et al., 2013; Manteau et al., 2003). Das Vorhandensein von Bindestellen von
PacC deutet somit auf eine Regulation der Expression von ChPMA2 in Abhängigkeit des pH-
Wertes hin. Da C. higginsianum mittels der Freisetzung von Ammonium während der
Infektion aktiv den pH-Wert der Umgebung erhöht (O’Connell et al., 2012), könnte diese
Alkanisierung ein Signal für die Induktion der Expression von ChPMA2 darstellen. Für den
Transkriptionsfaktor AbaA konnte eine Beteiligung an der Regulation des Zellzyklus in
Konidien von Aspergillus nidulans und Fusarium graminaerum gezeigt werden (Son et al.,
2013; Ye et al., 1999) wodurch ChPMA2 vielleicht ebenfalls im Rahmen des Zellzyklus
exprimiert wird. Der ChPMA1 Promotor weist demgegenüber eine vorhergesagte Bindestelle
für StuA auf (-620 bp) auf. In Aspergillus reguliert StuA die Konidienbildung unter anderen
durch die Kontrolle der Expression von AbaA (Miller et al., 1992). Die Deletion von StuA-
Orthologen in Fusarium graminearum (Lysøe et al., 2011), Glomerella cingulata (Tong et al.,
2007) und Stagonospora nodorum (Cho et al., 2010) hatte den Verlust der Pathogenität zur
125
Folge. Eine Zellzyklus-abhängige Regulation der Expression während der Bildung von
Appressorien durch AbaA und StuA könnte ein Grund der differentiellen Expression von
ChPMA1 und ChPMA2 in Konidien und Appressorien darstellen.
3.3.3 Wird die Proteinaktivität von ChPma1 und ChPma2 unterschiedlich reguliert?
Der Pathogenitätsdefekt von ChPMA2 T-DNA Insertionsmutanten konnte nur teilweise durch
die Expression von ChPMA1 in Appressorien supprimiert werden. ChPma1 und ChPma2
unterscheiden sich somit nicht nur in ihrer Expression, sondern scheinen sich auch in
weiteren Eigenschaften zu unterscheiden. So zeigt ein Alignement mit den Protonenpumpen
aus Saccharomyces cerevisiae, Neurospora crassa und den potentiellen Orthologen von
ChPma1 und ChPma2 aus C. graminicola (siehe Abb. 3.4) drei Bereiche mit starken
Unterschieden zwischen ChPma2 bzw. CgPma2 und den andern ATPasen auf.
Abbildung 3.3: Unterschiede in den Proteinsequenzen von ChPma1 und ChPma2. (A) Schematische Darstellung der Domänenstruktur von ChPma2 (A: Aktuator-Domäne; N: Nukleotid-binde Domäne; P: Phosphorilierungsdomäne, TM1-TM10: Transmembrandomänen). Im Vergleich zu ChPma1 zusätzliche Bereiche wurden rot markiert. (B) Drei Bereiche von ChPma2 weisen im Vergleich mit ChPma1 zusätzliche Aminosäuren auf. Konservierte Serin und Threonine wurden mit einem roten Stern markiert. Nc: Neurospora crassa; Sc: Saccharomyces cerevisiae; Cg: Colletotrichum graminicola
**
**
*
*
126
ChPma2 und CgPma2 besitzen zwischen den Transmembrandomänen zwei und drei einen
Bereich von 40 Aminosäuren auf, der in dieser Form, sowohl in ChPma1 und CgPma1 als
auch in den Protonenpumpen aus S. cerevisiae und N. crassa nicht vorkommt. Weitere
Bereiche mit zusätzlichen Sequenzen befinden sich zwischen den Transmembrandomänen
neun und 10, sowie direkt am C-Terminus von ChPma2 und CgPma2. Besonders die
Sequenzunterschiede am C-Terminus sind von Interesse, da sich dort regulatorische
Elemente der Enzymaktivität von Protonenpumpen befinden (Portillo, 2000). Die Zugabe von
Glukose in das Wachstumsmedium von S. cerevisiae hat sowohl eine reversible Erhöhung
von Vmax als auch eine Erniedrigung des KM-Wertes für ATP von ScPma1 zur Folge
(Serrano, 1983). Diese Aktivierung von ScPma1 durch Glukose konnte auf die
Phosphorylierung von Threonin und Serin (S899, S911, T912) zurückgeführt werden (Eraso et
al., 2006; Lecchi et al., 2007) und das Entfernen der C-terminalen Region führte zu einem
konstitutiv aktivierten ScPma1 (Eraso and Portillo, 1994). Die Neurospora crassa
Plasmamembran H+-ATPase (NcPma1) besitzt ebenfalls diese potentiellen
Phosphorylierungsstellen und die Deletion der 38 carboxy-terminalen Aminosäuren erhöhte
die ATPase-Aktivität um Faktor 10 (Kühlbrandt et al., 2002). Die regulatorischen
Aminosäuren (S899, S911, T912) sind auch in den Proteinsequenzen von ChPma1 und CgPma1
enthalten (Abb. 3.3B, rote Markierung). Im Gegensatz dazu besitzt ChPma2 und sein
potenzielles Ortholog CgPma2 diese Aminosäuren nicht. Die Abwesenheit dieser
Phosphorylierungsstellen deutet darauf hin, dass die Regulation durch Glukose in ChPma2
nicht vorhanden ist. Dem gegenüber impliziert das Vorhandensein dieser Threonin und Serin
Reste eine ähnliche Regulation von ChPma1 wie in S. cerevisiae und somit einen
induzierenden Einfluss von Glukose auf die Protonentransportkapazität.
3.3.4 Was ist die Funktion von ChPma2?
Während der frühen Stadien der Infektion sehen sich Konidien von C. higginsianum auf der
Oberfläche von A. thaliana nährstoffarmen Bedingungen ausgesetzt. Auch während der
biotrophen Phase sind Primärhyphen von dem Zytoplasma der Wirtszellen abgetrennt
(Connell et al., 2004). Dennoch konnte gezeigt werde, dass in Appressorien eine Fülle von
Transportprozessen stattfinden. Darunter zählen unter anderem die Sekretion einer Vielzahl
von potentiellen Effektoren (Kleemann et al., 2012) und die Induktion der Expression einer
großen Anzahl von sekretierten carbohydrate-active enzymes (CAZymes) und von Proteinen
mit potentieller Pektinase-Aktivität (O’Connell et al., 2012). Da eine Vielzahl von
Transportprozessen von dem Plasmamembranpotential der Zelle abhängig sind, hat
vermutlich vor allem die Aktivität von H+-ATPasen einen starken Einfluss auf eine
erfolgreiche Infektion. Bei einer zu ScPma1 analogen Regulation von ChPma1 läge ChPma1
127
ohne induzierende Glukose in einer wenig aktiven Konformation vor. Eine H+-ATPase ohne
diese Form der Regulation hätte hingegen auch unter nährstoffarmen Umweltbedingungen
die, für die Aufrechterhaltung des für Transportprozesse erforderlichen Protonengradienten,
benötigte Aktivität. Diese Hypothese wird durch Beobachtungen aus Uromyces fabae und
Ustilago maydis unterstützt, da die Aktivität der H+-ATPasen dieser obligat biotrophen
Pathogene unabhängig von Glukose reguliert wird (Robles-Martínez et al., 2013; Struck et
al., 1996, 1998). Die Abwesenheit von ChPma1 und die starke Expression von ChPMA2 in
Appressorien von C. higginsianum deutet darauf hin, dass es sich bei ChPma2 um eine
Isoenzym von ChPma1 handelt, welches unter nährstoffarmen Bedingungen den
Protonentransport übernimmt. Leider gibt es keinen direkt Beweis dafür das ChPma2
Protonen transloziert aber mehrere Beobachtungen sprechen dafür. So weist ChPma2 die
stärkste Sequenzidentität mit bekannten Protonenpumpen auf (43% ScPma1), während z.B.
Ca2+ und Na+-transportierende ATPasen geringere Identitäten mit Pma2 zeigen (14%
ScPmc1, 18% ScEna2; siehe auch Tabelle 2.4). Des Weiteren weisen Vorhersagen der
Sekundärstruktur von ChPma2 die typische Topologie und Domänenstruktur von
Plasmamembran-gebundenen Protonenpumpen auf. So besitzt ChPma2 zehn
Transmembrandomänen und die konservierten Phosphorylierung- (CSDKTGTLT) und ATP-
Bindemotive (KGAP, DPPR, TGD und GDGVNDAP) (Ambesi et al., 2000; Portillo, 2000). Die
beobachtete Lokalisation von ChPma2-mCherry an der Peripherie von Hyphen bestätigt
zudem die Annahme, dass es sich bei ChPma2 um ein Plasmamembran-gebundenes
Protein handelt. Einige der Transformanten mit ektopische Expression von ChPMA1 unter
der Kontrolle des ChPMA2 Promotors zeigten eine vereinzelte Bildung von Primärhyphen.
Wenn ChPma1 und ChPma2 unterschiedliche Substrate transportieren würden, wäre diese
teilweise Suppression des Phänotyps eher unwahrscheinlich.
In Abbildung 3.4 ist das Modell der Regulation und Funktion von ChPma2 schematisch
zusammengefasst.
Glukose
Pma1
H+
Pma1
Pma2
A
P
P
B
H+
H+
128
Abbildung 3.4: Schematische Darstellung der Funktion von ChPma2. (A) Während der Myzelbildung im nährstoffreichen Medium liegt ChPma1 in der Glukose-induzierten aktiven Form vor. (B) Unter nährstoffarmen Bedingungen wie z.B. in Appressorien besitzt ChPma1 nur eine geringen Protonentransportaktivität. Durch die Expression der unter diesen Bedingungen aktiven Protonenpumpe ChPma2 wird das Plasmamembranpotential aufrechterhalten.
3.3.5 Die Entwicklung von verschiedenen Isoformen von H+-ATPasen stellt ein mögliche konservierte Strategie pathogener Pilze dar
Neben Colletotrichum higginsianum und C. graminicola findet man in einer Vielzahl von
pathogenen Pilzen mehrere, unterschiedlich exprimierte H+-ATPasen (Korn et al., 2015). Die
meisten untersuchten Pilze kodieren für zwei Protonenpumpen, Ausnahmen stellen
Neurospora crassa mit PmaA als singuläres Protein und Aspergillus Arten mit jeweils drei
Protonenpumpen dar.
Abbildung 3.5: Phylogenie von pilzlichen H+-ATPasen. Proteinsequenzen wurden mit ClustalW aligned und mittels Geneious treebuilding (Jukes-Cantor; Neighbor-joining) als phylogenetischer Baum grafisch dargestellt; als Outgroup diente Die Na+-ATPase Ena1 aus S. cerevisiae. Prozentuale Bootstrap Werte (1000 Replikate) befinden sich jeweils links an den Verzweigungen.
Die Protonenpumpen aus S. cerevisiae (ScPma1, ScPma2) und S. pombe (NP_594360,
NP_011507) zeigen untereinander ein hohen Prozentsatz identischer Aminosäuren auf (S.
ChPma1-ähnliche
Proteine
ChPma2-ähnliche
Proteine
129
cerevisiae: 89%; S. pombe: 75%) und sind vermutlich durch Genomduplikationen entstanden
(Kellis et al., 2004). Im Gegensatz dazu unterscheiden sich die H+-ATPasen aus
phytopathogenen Pilzen deutlich (Magnaporthe oryzae: 45% Identität; Fusarium oxysporum:
43% Identität) und bilden in phylogenetischen Analysen verschiedene Gruppen (siehe Abb.
3.6). Jeweils eine Protonenpumpe der in den Analysen einbezogenen phytopathogener
Pilzen zeigt eine starke Ähnlichkeit mit Pma1 und Pma2 aus S. cerevisiae und bildet
zusammen mit PmaA aus N. crasse die Gruppe der ChPma1-ähnlichen Proteine. Eine
Ausnahme stellen die Protonenpumpen aus Ustilago maydis dar (Robles-Martínez et al.,
2013), von denen XP_757352 eine starke Ähnlichkeit zu pflanzlichen Proteinen wie Aha2
aus A. thaliana zeigt, während die zweite Protonenpumpe (XP_758728) zu den ChPma2-
ähnlichen Proteinen gehört. Zu dem ChPma2-Cluster gehört auch jeweils die zweite
Protonenpumpe aus den aufgeführten phytopathogenen Pilzen. Interessanter Weise
besitzen Aspergillus Arten drei H+-ATPasen, wovon zwei in einer Gruppe mit ChPma2
clustern. Die stärkste Ähnlichkeit zu ChPma2 zeigen Protonenpumpen aus weiteren
Colletotrichum Arten, sowie aus Magnaporthe und Togninia minima (Errerger der Esca
Krankheit von Weinreben). Neben einer engen Verwandtschaft weisen diese Pathogene
auch eine Infektionsstrategie mittels Appressorien auf. Das Expressionsmuster der
Protonenpumpen aus M. grisea zeigt zudem Analogien zu der Expression von ChPMA1 bzw.
ChPMA2. So konnte für das ChPma2-Ortholog MGG_04994 nur eine sehr schwache
Expression in Konidien aber eine starke Induktion der Expression während der
Appressorienbildung beobachtet werden (Franck et al., 2013). MGG_07200 zeigte hingegen
zwischen diesen Stadien, ähnlich wie ChPMA1, keine gesteigerte Expression. Zu der
Gruppe der Pma2-ähnlichen Proteine gehört ebenfalls LmPma1 aus Leptosphaeria
maculans. Diese H+-ATPase wurden in einen Screen von T-DNA Insertionsmutanten als
Pathogenitätsfaktor identifiziert und entsprechende Knockout Mutanten arretieren im
Stadium der Penetration (Remy et al., 2008). Das publizierte Muster und Niveau der
Expression von LmPMA1 ähnelt aber eher dem vom ChPMA1. Remy et. al schlugen zudem
eine Rolle von LmPma1 für den Aufbau des Turgors von Penetrationshyphen vor,
wohingegen Appressorien von ΔChPma2 Knockoutmutanten sich im Turgor nicht von denen
des Wildtyps unterscheiden. Neben phytopathogenen Pilzen besitzt auch Glomus mossae
als arbuskulärer Mykorrhizapilz (AM) mindestens zwei H+-ATPasen, welche hinsichtlich der
Infektion und der Verfügbarkeit von Nährstoffen unterschiedlich exprimiert werden (Ferrol et
al., 2000; Requena et al., 2003). Auch auf der pflanzlichen Seite der symbiotischen
Interaktion scheinen H+-ATPasen eine essentielle Rolle einzunehmen. Für die H+-ATPasen
HA1 bzw. Os-HA1 aus Medicago truncatula und Oryzae sativa und konnte eine Induktion der
Expression während der Interaktion mit AM gezeigt werden (Wang et al., 2014). Der Verlust
dieser Protonenpumpen hatte eine geringere Aufnahme von Phosphat durch die
130
Wirtspflanze zur Folge. Die Expression von spezialisierten H+-ATPasen stellt vermutlich eine
Anpassung an verschiedene Umweltbedingungen dar und ermöglicht sowohl symbiontische
als auch parasitäre Pflanzen-Pilz-Interaktionen.
3.4 Ausblick
Im Rahmen dieser Arbeit konnte zum ersten Mal in einem Appressorien-bildenden
Phytopathogen eine H+-ATPase als Pathogenitätsfaktor identifiziert werden. ChPma2 gehört
zu einer Gruppe von Protonenpumpen, welche aufgrund ihrer Expression und ihrer
Regulation spezielle Aufgaben während definierten Stadien der Infektion wahrnehmen.
ChPma2-ähnliche Protonenpumpen stellen durch ihre potentielle Bedeutung für die
Pathogenität interessante Ziele für Fungizide dar, wobei derartige Wirkstoffe ein
spezifischeres Wirkungsspektrum besitzen würden als generelle Inhibitoren von
Protonenpumpen. Eine Analyse des Promotorbereiches von ChPMA2 könnte zudem dazu
beitragen mögliche Transkriptionsfaktoren von C. higginsianum zu identifizieren welche an
der Regulation weiterer Pathogenitätsgenen beteiligt sind.
Anschließende Untersuchungen der gefundenen T-DNA markierten Gene von vir-Mutanten
könnten zudem zu einer Identifizierung weiterer interessanter C. higginsianum
Pathogenitätsfaktoren führen.
131
4. Material und Methoden 4.1 Organismen
Bakterienstämme
Für die Amplifikation von Plasmiden und Vektoren wurden die E. coli Stämme XL-1, Cl-10,
DH5α und DB3 verwendet. Für die Transformation von TOPA-TA Vektoren wurden TOP10
Zellen verwendet. Für die Agrobacterium tumefaciens vermittelte Transformation von C.
higginsianum wurde der A. tumefaciens Stamm AGL1 (BAA 101) verwendet.
Tabelle 4.1: Verwendete Bakterienstämme Stamm Genotyp Herkunft XL-1 Blue endA1 gyrA96(nalR) thi-1 recA1 relA1 lac glnV44
F'[ ::Tn10 proAB+ lacIq Δ(lacZ)M15] hsdR17(rK- mK
+) Stratagene
XL-10 Gold endA1 glnV44 recA1 thi-1 gyrA96 relA1 lac Hte Δ(mcrA)183 Δ(mcrCB-hsdSMR-mrr)173 tetR F'[proAB lacIqZΔM15 Tn10(TetR Amy CmR)]
Stratagene
DH5α F- endA1 glnV44 thi-1 recA1 relA1 gyrA96 deoR nupG Φ80dlacZΔM15 Δ(lacZYA-argF)U169, hsdR17(rK
- mK+), λ–
Life Technologies
DB3.1 F- gyrA462 endA1 glnV44 Δ(sr1-recA) mcrB mrr hsdS20(rB
-, mB-) ara14 galK2 lacY1 proA2
rpsL20(Smr) xyl5 Δleu mtl1
Invitrogen
AGL1 AGLO recA::bla pTiBo542ΔT Mop+ CbR (Lazo et al., 1991) TOP10 F– mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC) Φ80lacZΔM15
lacX74 recA1 araD139 Δ(ara leu) 7697 galU galK rpsL (StrR) endA1 nupG
Life Technologies
Arabidopsis thaliana
Infektionen von C. higginsianum wurden mit A. thaliana Pflanzen des Ökotyp Columbia (Col-
0) durchgeführt.
Colletotrichum higginsianum
Als C. higginsianum Wildtypstramm CY5535 diente MAFF 305635 (NIAS)
132
Tabelle 4.2: Verwendete C. higginsianum Stämme Stamm Beschreibung Herkunft CY5871 CY5535 transformiert mit pCK2650 (pPN) Diese Arbeit CY6021, CY6022 CY5535 transformiert mit pCK2831;
ΔChku80 (Korn et al., 2015)
CY5951, CY5952 CY5535 transformiert mit pCK2783 (pPK2-Cih1-GFP)
AG Koch
CY5956, CY5857 CY5535 transformiert mit pCK2842 (pPN2-Cih1-mCherry)
Diese Arbeit
CY6091, CY6091 CY6021 transformiert mit pCK3083, ΔChcih1 AG Koch CY6144, CY6145 CY6021 transformiert mit pCK3072, ΔChcih2 AG Koch CY6360, CY6363 CY6091 transformiert mit pCK4179, ΔChcih1
ΔChcih2 AG Koch
CY6367 CY6021 transformiert mit pCK4179, ΔChcih2 AG Koch CY6371 CY6021 transformiert mit pCK4222,
ΔChlysm3 AG Koch
CY6372 CY6021 transformiert mit pCK4223, ΔChlys,3 AG Koch CY6150 CY6021 transformiert mit pCK3449 (Korn et al., 2015) CY6151, CY6152, CY6153
CY6021 transformiert mit pCK3449, ΔChpma2
(Korn et al., 2015)
CY6269 CY5535 transformiert mit pCK3880 (pPN-Ppma2-mCherry)
(Korn et al., 2015)
CY6369 CY5535 transformiert mit pCK3973 (pPK2-Ppma1-GFP)
(Korn et al., 2015)
CY6490, CY6493 CY6021, pma2::pma2-mCherry, pma1::pma1-GFP
AG Koch
CY6570, CY6571, CY6572
vir-22 transformiert mit pCK3883 Diese Arbeit
CY6569, CY6580, CY6587
vir-24 transformiert mit pCK3883 Diese Arbeit
CY6582, CY6583, CY6584, CY6585
vir-24 transformiert mit pCK3598 Diese Arbeit
CY7226, CY7227, CY7228, CY7229, CY7230, CY7231, CY7232, CY7233, CY7234
vir-22 transformiert mit pCK3598 Diese Arbeit
CY7235, CY7236 vir-22 transformiert mit pCK2650 (pPN) Diese Arbeit Analysierte C. higginsianum vir-Mutanten (Korn et al., 2015) (Korn et al., 2015)(Korn et al.,
2015)(Korn et al., 2015):
vir-12, vir-19, vir-22, vir-23, vir-24, vir-41, vir-51, vir-52, vir-53, vir-56, vir-70, vir-72, vir-72, vir-
81, vir-97, vir-102
133
4.2 Verwendete Plasmide und Oligonukleotide
Tabelle 4.3: Verwendete Plasmide und Vektoren
Plasmid Beschreibung Referenz pPK2 Binärer Vektor mit hph Resistenzkassette ( Covert et al.,
2001) pSL1180 Klonierungsvektor mit Polylinker Amersham pSP72 Klonierungsvektor mit Polylinker Promega pM-RB Quelle von mCherry ORF (Nelson et al.,
2007) pMF280 Nelson et al., 2007) (Freitag et al.,
2004) pK7FWG2 Binärer Gateway(TM) Vektor (Karimi et al.,
2007) pCR8/GW/TOPO TOPO Entry Vektor Life
Technologies pCSN44 hph unter der Kontrolle von NcTRPC (Staben et al.,
1989) pA-Hyg-OSCAR Hygromycin-Resistenzkassette mit P1r and P4
Attachment Sites (Paz et al., 2011)
pA-Bar-OSCAR Bialaphos-Resistenzkassette mit P1r and P4 Attachment Sites
AG Koch
pOSCAR Binärer Vektor, ccdB Gen mit P2r and P3 Attachment Sites
(Paz et al., 2011)
pCK2321 Yeplac181 Derivat mit 4 kb ChTRPC AG Koch pCK2367 pPK2 Derivat, hph Reistenzkassette durch
Polylinker ersetzt AG Koch
pCK2524 pSL1180 Derivat mit Pccg1 H1-GFP M. Korn Diplomarbeit
pCK2560 pSL1180 Derivat mit Pccg1 GFP M. Korn Diplomarbeit
pCK2565 pPK2 Derivat mit Pccg1 GFP M. Korn Diplomarbeit
pCK2643 pSP72 Derivat mit Pccg1 GFP M. Korn Diplomarbeit
pCK2650 pPK2 Derivat, hph wurde durch nat ersetzt (Korn et al., 2015)
pCK2651 pSL1180 Derivat mit nat Resistenzkassette (Korn et al., 2015)
pCK2653 pSL1180 Derivat mit nat (Korn et al., 2015)
pCK2658 pSP72 Derivat mit Pccg1 GFP-CAAX M. Korn Diplomarbeit
pCK2660/2661 pPK2 Derivat mit Pccg1 GFP-CAAX M. Korn Diplomarbeit
pCK2762 pSL1180 Derivat mit Pcih1 ChCih1-GFP AG Koch pCK2783 pPK2 Derivat mit Pcih1 ChCih1-GFP AG Koch pCK2797 pSL1180 Derivat mit ChKU80 Deletionskassette (Korn et al.,
2015) pCK2830/pCK2831 pPK2 Derivat mit ChKU80 Deletionskassette (Korn et al.,
2015) pCK2834 pSL1180 Derivat mit Pcih1 ChCih1-mCherry Diese Arbeit
134
pCK2842 pPN Derivat mit Pcih1 ChCih1-mCherry Diese Arbeit pCK2994 pPK2 Derivat mit Hygromycin-Resistenzkassette
und Polylinker Diese Arbeit
pCK3057 pCR8/GW/TOPO mit Pcih2 ChCIH2 AG Koch pCK3061 pPK2 Derivat mit Pcih2 ChCih2-GFP Diese Arbeit pCK3072
pPK2 Derivat mit ChCIH2-Deletionskassette AG Koch
pCK3083 pPK2 Derivat mit ChCIH1-Deletionskassette AG Koch pCK3495 pOSCAR mit ChPMA1-Deletionskassette (Korn et al.,
2015) pCK3499 pOSCAR mit ChPMA2-Deletionskassette (Korn et al.,
2015) pCK3538 pSL1180 Derivat mit Ppma2 Diese Arbeit pCK3598 pPN mit Ppma2 ChPMA1 Diese Arbeit pCK3650 pOSCAR mit ChLys1-Deletionskassette (Korn et al.,
2015) pCK3652 pOSCAR mit Deletionskassette für CH063_12090 (Korn et al.,
2015) pCK3769 pPK2 Derivat mit TtrpC AG Koch pCK3786 pPK2 Derivat mit TtrpC und GFP AG Koch pCK3880 pPN Derivat mit Ppma2-mCherry (Korn et al.,
2015) pCK3882 pSL1180 Derivat mit Ppma2-mCherry (Korn et al.,
2015) pCK3883 pPN Derivat mit Ppma2 und ChPMA2 Diese Arbeit pCK3937 pPK2 Derivat mit Ppma1-GFP (Korn et al.,
2015) pCK4122 pINLOCUS-mCherry, pBluescript Derivat für in
Lokus mCherry-Fusionen AG Koch
pCK4179 pOSCAR mit ChCIH2-Deletionskassette, bar AG Koch pCK4180 pOSCAR mit ChCIH2-Deletionskassette, bar AG Koch pCK4222/pCK4223 pOSCAR mit ChLYSM3-Deletionskassette AG Koch pCK4370 pCK4122 Derivat, ChPMA2 AG Koch pCK4375 pOSCAR für ChPMA2-mCherry in Lokus Fusion AG Koch pCK4387 pINLOCUS-GFP, pBluescript Derivat für in Lokus
GFP-Fusionen AG Koch
pCK4445 pCK4387 Derivat, ChPMA1 AG Koch pCK4448 pOSCAR für ChPMA1-GFP in Lokus Fusion AG Koch
135
Alle Oligonukleotide wurden bei den Firmen Metabion International AG (Martinsried) und
Sigma-Aldrich (Traufkirchen) bezogen.
Tabelle 4.4: Verwendete Oligonukleotide Name DNA Sequenz 5’-3’ Verwendung CK2123 CGTGCTTTCAGCTTCGATGTAGG Forward Primer für hph CK2124 AAGATGTTGGCGACCTCGTATTG Reverse Primer für hph CK2562 GCTTAATTAACATGGTGAGCAAGGGCGA Forward Primer für
mCherry (PacI) CK2563 GGAATTCTTACTTGTACAGCTCGTCCATG Reverse Primer für
mCherry (EcoRI) CK2580 GTAATACGACTCACTATAGGGCACGCGTGGTCGACGGC
CCGGGCTGGT Oligo 2 für die Adaptor-Synthese
CK2581 ACCAGCCC-NH2 Oligo 2 für die Adaptor-Synthese 3’-amino-C7 Linker
CK2582 GTAATACGACTCACTATAGGGC Genome Walker Adaptor Primer 1
CK2583 ACTATAGGGCACGCGTGGT Genome Walker Adaptor Primer 2
CK2621 GGGCGGCCGC ATCATCTTGAAGAAACTGTACA Forward Primer für PtrpC (NotI)
CK2622 TAGGATCCTTAAGCACAGAGATATGCTTGTGT Reverse Primer für PtrpC (BamHI)
CK2640 TTGGATCCTAGAAGGAGCAGTCCATCT Forward Primer für Pccg1 (BamHI)
CK2641 GGCTGAGACCCGGGAATTCGGCTTGTACAGCTCGTCCATG
Reverse Primer für GFP ohne Stopcodon
CK2644 AGAAAAAGAAGTCAAAGACAAAGTGTGTAATTATGTAAA 1. Synthese Oligo für CAAX-Box
CK2645 GATCTTTACATAATTACACACTTTGTCTTTGACTTCT 2. Synthese Oligo für CAAX-Box
CK2646 AATTCCCGGGTCAAGATGAGCAAAGATGGTAAAAAGA 3. Synthese Oligo für CAAX-Box
CK2647 TTTTCTTCTTTTTACCATCTTTGCTCATCTTGACCCGGG 4. Synthese Oligo für CAAX-Box
CK2656 AACATATGACCACTCTTGACGA Forward Primer fur nat (NdeI)
CK2657 AGATATCGACAAAGGAAAAGGG Reverse Primer fur nat (EcoRV)
CK2689 CTGGATGGTGAAGTAGACGGG Forward Primer für 5'-UTR von ChKU80
CK2690 GACCGTGGTCGATATCTTGT Reverse Primer für 5'-UTR von ChKU80
CK2691 AATCTAGGATCCTCAAGGGGAAGATCCTCTC Forward Primer für 3'-UTR von ChKU80 (BamHI)
CK2692 TTGTAGGGATCCGCTCTGGATAAGCCGTTGC Reverse Primer für 3'-UTR von ChKU80 (BamHI)
CK2750 AAAACTGCAGGCGTTCGGACGACACAGT Forward Primer für Pcih1 (PstI):
CK2751 CCTTAATTAAACAGACGGGGATGTTGATGACAT Reverse Primer für ChCIH1 (PacI)
CK2746 TCACTTCAAGGCCATCATGAAC forward Primer für ChPMA2
CK2747 AAATCTGGCGAGACAGCTTGAT Reverse Primer für ChPMA2
136
CK2777 CGCATCTGTTTTGATGCTTGTAA Forward Primer upstream der verwendeten 5’-Flank
CK2808 TGGCTGTCGTCGGCGTTGCCGC Forward Primer für ChCIH1
CK2809 CGCAGGTATCGCTGCCCTCCTT Reverse Primer für ChCIH1
CK2903 ATGGAGGGAGTTGAGTCGGTGTC Forward Primer für hph CK2904 CAGGTCCATGGAATCGACGTAGT Reverse Primer für hph CK2912 CGTACCGGGCCTTCATGACGGT Forward Primer upstream
der 5‘-UTR von ChKU80 CK2913 GGAATGTCTGAATGGAGACACTAT Reverse Primer in TtrpC CK2914 TCATCGCGGCTGCTGGTGAGTTTCC Forward Primer in TtrpC CK2915 CCAAGAGCAGCAAGAAGAAGCAG Reverse Primer
downstream der 3’-UTR von ChKU80
CK2923 CACACTACATGACTTGTCAAGGGCAC Forward Primer für Pcih2 CK3007 GTGTACTTGCGAGATCTTCCGA Forward Primer für 5’-
UTR von ChCIH2 (BglII) CK3008 GGAGGTACCGTTACGGAATTATGA Reverse Primer für 5’-
UTR von ChCIH2 (KpnI) CK3009 GTGTTTAAACTGTATGCATGTGACACAGCCTTG Forward Primer für 3’-
UTR von ChCIH2 (SacI) CK3010 GTGTTTAAACTGTATGCATGTGACACAGCCTTG Reverse Primer für 3’-
UTR von ChCIH2 (PmeI) CK3028 ATACTCGAGTTTCGCGTTGGTTACAGGGT Forward Primer für 3’-
UTR von ChCIH1 (XhoI) CK3029 ATAGTTAAACCCTCTTCGATAGGCGGTAAA G Reverse Primer für 3’-
UTR von ChCIH1 (PmeI) CK3030 ATAAGATCTCGGGATGGGACAGGCGTTCG Forward Primer für 5’-
UTR von ChCIH1 (BglII) CK3031 ATAGGTACCAAAAAGATTAAAGGTTGGGTAAAG Reverse Primer für 5’-
UTR von ChCIH1 (KpnI) CK3032 ACACACAGGGACGTTGATGACCTG Reverse Primer für
ChCIH2 CK3120 ACAGACGTCGCGGTGAGTTCAGGC Forward Primer in hph CK3262 GCCGATGCAAAGTGCCGATAAACA Reverse Primer in hph CK3319 GGGGACAGCTTTCTTGTACAAAGTGGAACTCCATTGCCG
CGCTGTACTTCG attB2r für die Deletion von ChPMA2
CK3320 GGGGACTGCTTTTTTGTACAAACTTGTGAATGGGACCACGGAAGAAACCGA
attB1r für die Deletion von ChPMA2
CK3321 GGGGACAACTTTGTATAGAAAAGTTGTTTCCATCGTCCTCGGTGGTCTTCTC
attB4 für die Deletion von ChPMA2
CK3329 GGGGACAACTTTGTATAATAAAGTTGTCATTAGTGACAGTCGTATGATGTCGC
attB3r für die Deletion von ChPMA2
CK3383 GGGGACAGCTTTCTTGTACAAAGTGGAAACCAAACTTTCCTCTCCCTCC
attB2r für die Deletion von ChPMA1
CK3384 GGGGACTGCTTTTTTGTACAAACTTGTACGAACTGGATAGGACCAACG
attB1r für die Deletion von ChPMA1
CK3385 GGGGACAACTTTGTATAGAAAAGTTGTTATCTGGATCTTCTCCTTCGGC
attB4 für die Deletion von ChPMA1
CK3386 GGGGACAACTTTGTATAATAAAGTTGTCATCTCGAGAACCCCTACTGG
attB3r für die Deletion von ChPMA1
CK3529 GCTGAGAGACTTGACATTTACCCC Forward Primer für Ppma2
CK3530 TTGGCATATGAAACTGTCGGAAAAGGATTACAGTCC Reverse Primer für Ppma2 (NdeI)
CK3609 GGGGACAGCTTTCTTGTACAAAGTGGAAACGGCTTGGGACACCCTGCTC
attB2r für die Deletion von ChLYS1
CK3610 GGGGACTGCTTTTTTGTACAAACTTGTCCGCAGACACCACCAACCC
attb1r für die Deletion von ChLYS1
137
CK3611 GGGGACAACTTTGTATAGAAAAGTTGTTCCGAGAGTCTTCTCGAAACCACC
attB4 für die Deletion von ChLYS1
CK3612 GGGGACAACTTTGTATAATAAAGTTGTGCACCTGAGTATCTACTCTTGGC
attB3 für die Deletion von ChLYS1
CK3613 GGGGACAGCTTTCTTGTACAAAGTGGAAGGGATGGCGTGTGGGGC
attB2r für die Deletion von CH063_12090
CK3614 GGGGACTGCTTTTTTGTACAAACTTGTGCTGAAGGATTTTGTCGCGACG
attb1r für die Deletion von CH063_12090
CK3615 GGGGACAACTTTGTATAGAAAAGTTGTTCTGATGTTGCGAAAGGGCCTAC
attB4 für die Deletion von CH063_12090
CK3616 GGGGACAACTTTGTATAATAAAGTTGTCTGCGAGTGAAGCTAGTCTGGC
attB3 für die Deletion von CH063_12090
CK3706 GGTTTAAACATGAGCCGCAGTTCGTGGGTGAGT Forward Primer für TtrpC (PmeI)
CK3709 AGTAGGGTTTAAACATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTT
Forward Primer für GFP (PmeI)
CK3726 GGATATCAGTAAAATTGAATTGTCGGAAGC Reverse Primer für TtrpC (EcoRV)
CK3747 AATGCCGGCTTACTTGTACAGCTCGTCCATGC Reverse Primer für GFP (NaeI)
CK3820 CCACGATCTTTGCGAGCGCGCCGACGG Forward Primer für ChPMA2
CK3870 AACCCATATGGTGAGCAAGGGCGAGGA Reverse Primer für mCherry (NdeI)
CK3871 TAAGCGGCCGCTTACTTGTACAGCTCGTCCATG Forward Primer für mCherry (NotI)
CK3928 AAAAGATATC CACTTGCAGTCAATCGCGCC Forward Primer für Ppma1 (EcoRV)
CK3930 AAAAGATATC TGCGGTGGTTGCGAGACAGA Reverse Primer für Ppma1 (EcoRV)
CK3959 ACAACGAGGCCATCTACGA Forward qRT-PCR Primer für α-Tubulin
CK3960 GGAGGAAACGACCTGAGCA Reverse qRT-PCR Primer für α-Tubulin
CK4115 GGTCTGCACCATCGTCAACCAC Forward Primer für bar CK4116 TGCCAGAAACCCACGTCATGCC Reverse Primer für bar CK4139 GGGGACAGCTTTCTTGTACAAAGTGGAAGTGTACTTGCG
AGATCTTCCGA attB2r für die Deletion von ChCIH2
CK4140 GGGGACTGCTTTTTTGTACAAACTTGTGGAGGAACCGTTACGGAATTATGA
attb1r für die Deletion von ChCIH2
CK4141 GGGGACAACTTTGTATAGAAAAGTTGTTGTGGGCATATTTGGGCCTACCG
attB4 für die Deletion von ChCIH2
CK4142 GGGGACAACTTTGTATAATAAAGTTGTTGTATGCATGTGACACAGCCTTG
attB3 für die Deletion von ChCIH2
CK4163 AGAAAAGTAGATGCCCCTTAGC Reverse Primer außerhalb der 3'-Flank von ChCIH2
CK4164 CGCCGAGGACGGGAAGGATT Reverse Primer außerhalb der 5'-Flank von ChLYSM3
CK4168 GGGGACAGCTTTCTTGTACAAAGTGGAAATCTGGGACGTTTGGATGTG
attB2r für die Deletion von ChLYS3
CK4169 GGGGACTGCTTTTTTGTACAAACTTGTTTCAAGGAGCACGACTGAGC
attb1r für die Deletion von ChLYSM3
CK4170 GGGGACAACTTTGTATAGAAAAGTTGTTTGGTAACGGGGAGACTTGAC
attB4 für die Deletion von ChLYSM3
CK4171 GGGGACAACTTTGTATAATAAAGTTGTGGGTACTTGGACGGCTCCT
attB3 für die Deletion von ChLYSM3
CK4225 TGGAAAAGCTGATTTAGTGGCG Forward Primer upstream der verwendeten 5‘-Flank
138
von ChCIH2 CK4279 CGCCGGTGTCTACTACCTCCTT Forward qRT-PCR
Primer für ChPMA1 CK4280 CGCTGCATAGAGACGACGAAG Reverse qRT-PCR
Primer für ChPMA1 CK4281 CTTTGCTTGCACTTGGAGATCTAC Forward qRT-PCR
Primer für ChPMA2 CK4282 GTGAGCGTTGTCGTAGGCAA Reverse qRT-PCR
Primer für ChPMA2 CK4358 GGGGACAACTTTGTATAGAAAAGTTGTTAAGGACGACAA
GGGCGAGCG attB4 ChPMA2 in Lokus mCherry-Fusion
CK4361 CCCTCCTCGACAACGGCGCGG Reverse Primer für ChPMA2
CK4426 GGGGACAACTTTGTATAATAAAGTTGTCGAGACCGAGTTTGTAAGTTGCTGGT
attB3 ChPMA1in Lokus GFP-Fusion
CK4427 GGGGACAACTTTGTATAGAAAAGTTGTTAGAGGGATATCTGGGCAGAGTCGG
attB4 ChPMA1in Lokus GFP-Fusion
4.3 Enzyme Die folgende Tabelle 4.5 gibt eine Übersicht der verwendeten Enzyme. Tabelle 4.5: Verwendete Enzyme Enzym Hersteller Restriktionsenzyme Thermo Scientific, New England Biolabs Phusion DNA-Polymerase Finnzymes Taq DNA-Polymerase Laborpräparation AG Koch Pfu DNA-Polymerase Promega BP-Clonase Enzyme Mix Invitrogen T4 DNA-Polymerase Thermo Scientific T4 DNA-Ligase Thermo Scientific LR Clonase Enzyme Mix Invitrogen TOPO-TA Thermo Scientific FastAP Alkaline Phosphatase
Thermo Scientific
Heat Inactivated Alkaline Phosphatase
Thermo Scientific
Klenow Fragment Thermo Scientific T4 Polynukleotid Kinase New England Biolabs RNAase Thermo Scientific Revert Aid H Minus Reverse Transcriptase
Thermo Scientific
DNAse Ambion Brilliant II SYBR Green QPCR mastermix
Agilent Technologies
TaKaRa ExTaq TaKaRa Proteinase K Invitrogen Zymolyase
139
4.4 DNA-Leiter
GeneRulerTM 1 kb DNA Ladder (Thermo Scientific):
250-500-750-1000-1500-2000-2500-3000-3500-4000-5000-6000-8000-10000 bp
GeneRulerTM 50 bp DNA Ladder (Thermo Scientific):
50-100-150-200-250-300-400-500-600-700-800-900-1000 bp
4.5 Verwendete Kits
QIAquick PCR Purification Kit (Quiagen)
QIAquick Gel Extraction Kit (Quiagen)
QIAGEN Plasmid Mini Kit (Quiagen)
QIAGEN Plasmid Maxi Kit (Quiagen)
RiboPure™ RNA Purification Kit, yeast (Ambion)
High Prime Labelling Kit (Roche)
4.6 Puffer, Lösungen und Kulturmedien
Tabelle 4.6: Verwendete Puffer und Lösungen
Bezeichnung Zusammensetzung Modified Church and Gilbert Buffer 60,85 g/l Na2HPO4
24,65 g/l NaH2PO4 70 g/l SDS 20 ml EDTA, 0,5 M Lösung Lagerung bei -20°C; vor Gebrauch Zugabe von 1% BSA
DNA-Auftragspuffer mit Bromphonolblau 10 mM Tris-HCl (pH7.6) 60 mM EDTA 60% Glycerin 0,03% Bromphenolblau
DNA-Auftragspuffer mit Xylencyanol 10mM Tris-HCl (pH7.6) 60 mM EDTA 60% Glycerin 0,03% Xylencyanol
GTE-Puffer 25 mM Tris/HCl (pH 8,0) 50 mM Glukose 10 mM EDTA
NaOH/SDS Lösung 200 mM NaOH 1% SDS
20xSSC 175,32 g/l NaCl 88,22 g/l Trtinatriumzitrat-2-hydrat
140
50xTAE-Puffer 2 M Tris-Base 1 M Essigsäure 50 mM EDTA
10xTE-Puffer 100 mM Tris-HCl (pH 7,5) 10 mM EDTA
Diethylpyrocarbonate (DEPC)-Wasser: 0,1 % (v/v) DEPC 2mal für 15 Minuten autoklavieren
Trypanblau-Färbelösung 10 g Phenol 10 mg Trypanblau 10 ml Milchsäure 10 ml Wasser
Trypanblau-Entfärbe Lösung 2,5 g/ml Chloralhydrat Yeast Lysis Puffer 2% Triton X100
1% SDS 100 mM NaCl 10 mM TrisHCl (pH 8,0) 1 mM EDTA
TB-Puffer 15 mM CaCl2x2H2O 25 mM KCl 10 mM PIPES Mit Wasser auf 450 ml auffüllen, mit NaOH pH 6,7 einstellen
20x Salt Solution 2 g NH4Cl 0,6 g MgSO4x7H2O 0,3 g/l KCl 0,026 g CaCl2x2H2O 1,1 ml FeSO4 (2,5 mg/ml) Mit Wasser auf 100 ml auffüllen
200 mM Acetosyringon 196 mg Acetosyringon 5 ml DMSO
Saccharose-Wasser 50 g/l Saccharose 20xPuffer für A. tumefaciens 60g/l K2HPO4
20 g/l NaH2PO4 pH 7,0
10xPCR-Reaktionspuffer Y 200 mM Tris-HCl (pH 8.55) 160 mM Ammoniumsulfat 20 mM Magnesiumchlorid 0,1% Tween20
10xTBE 108 g/l Tris Base 9,3 g/l EDTA 55 g/l Borsäure
500 mM EDTA 185 g/l EDTA Mit 5 M NaOH (ca. 120 ml) auf pH 8,0 einstellen
2xCTAB Extraction Buffer 200ml 1M Tris-HCl (pH 7,5) 81,82 g NaCl 40 ml 500 mM EDTA (pH 8.0) 20g CTAB
SDS-Solution 2% SDS 0,1M Tris-HCl (pH9,0) 0,05M EDTA
SCE 1M Sorbitol 0,1M Na-Citrate 0,06M EDTA mit NaOH pH 7 einstellen
141
SCE/Zymolyase/2-Mercaptoethanol 1 ml SCE 3 mg Zymolyase (T20) 8 µl 2-Mercaptoethanol
KAc/HAc 250 g Kaliumacetat 150 g Essigsäure
DAB-Stammlösung 10 mg/ml DAB in 1 mM HCL DAB-Färbelösung DAB-Stammlösung 1:10 in 100 mM K3PO4,
(pH 5.8) verdünnen Natriumphosphat Puffer 6,23 g Na2HPO4 x2H2O mit MQ auf 500 ml
(enstpricht 0.07 M) auffüllen -pH Wert mit 0,07 M NaH2PO4x2H2O (0,966 g/100 ml H2O) auf 9 einstellen
Anilinblau-Färbelösung 0,05% Anilinblau (wässrige Lösung) 1/10 mit 0,07M Natrium-Phosphat Puffer pH9 verdünnen
1 M MES 19,52 g MES Mit Wasser auf 100 ml auffüllen, pH auf 5.6 mit KOH einstellen, steril filtrieren
1 M Glukose 180 g/l Glukose 50% Glyzerin 50 g Glyzerin
Zugabe von 60 ml Wasser Saccharose-Wasser 25 g Saccharose,
ad 450 ml Wasser Hexadekandiol 10 mM 1,16-Hexadekandiol in Methanol
Tabelle 4.7: Verwendete Medien
Bezeichnung Zusammensetzung TYE-Medium 5 g/l Hefeextrakt
10 g/l Trypton 8 g/l NaCl 15 g/l Agar für Festmedium
Oatmeal Medium 50 g/l geschrote Haferflocken 12 g/l Agar als 250 ml Portionen in 1 Liter Erlenmeyerkolben 45 Minuten autoklavieren
LB-Medium 10 g/l Trypton 5 g/l Hefeextrakt 10 g/l NaCl mit 5 M NaOH auf pH 7,5 einstellen
Czapek Dox Minimalmedium 50 g/l Czapek Dox (Fluka) Kartoffelextrakt-Glucose-Agar (PDA) 39 g/l PDA (Carl Roth) Modifiziertes Mathur‘s-Medium 2.8 g/l Glukose
1,5 g/l Trypton 0,5 g/l Hefeextrakt 1,2 g/l Mg2SO4x7H2O 2,7 g/KH2PO4l 30 g/l Agar für Festmedium
Fries-Medium 30 g/l Saccharose 5 g/l Ammonium-Tartrat 1 g/l Ammoniumnitrat 1 g/l KH2PO4 0,48 g/l MgSO4x7H2O 1 g/l NaCl
142
0,13 g/l CaCl2x2H2O 1 g/l Hefeextrakt
Yeast Minimalmedium 2g/l Yeast Nitrogen Base 5,5 g/l Ammoniumsulfat 15 g/l Agar 100 ml/l einer 20% Lösung des entsprechenden Kohlenhydrats
YEB-Medium 5 g/l Rinderextrakt 1 g/l Hefeextrakt 5 g/l Pepton aus Casein 5 g/l Saccharose 2 mM MgSO4 (2ml aus 1M MgSO4) 15 g/l Agar
NSY-Glycerin 5 g/l Pepton 3 g/l Rinderextrakt 1 g/l Hefeextrakt 5 g/l Saccharose 70% Glycerin Endkonzentration
SOC-Medium 20 g/l Trypton 5 g/l Hefeextrakt 0,58 g/l NaCl l 0,19 g/l KCl 10 mM MgCl2 2,46 g/l MgSO4 4 g/l Glukose
Induktions-Medium (fest) Wasseragar (3,75 g Agar in 222,5 ml H2O) 12,5 ml Salt Solution für A. tumefaciens 10 ml MES (1 M Lösung, pH 5,6) 2,5 ml Glyzerin (50% Lösung) 2,5 ml Glukose (1 M Lösung) 250 µl Acetosyringon (200 mM Lösung)
Induktions Medium (flüssig) 2,8 g/l Glukose 1,5 g/l Pepton 0,5 g/l Hefeextrakt 1,2 g/l MgSO4x7H2O 2,7 g/l KH2PO4
Minimal Medium für Agrobakterien 450 ml Saccharose-Wasser, 25 ml 20x Salt Solution, 25 ml 20x Puffer für A. tumefaciens
4.7 Antibiotika Tabelle 4.8: Verwendete Antibiotika Name Bezugsquelle Endkonzentration Ampicillin Carl Roth 100 µg/ml für E. coli Kanamycin Carl Roth 75 µg/ml für A. tumefaciens;
50 µg/ml für E. coli Hygromycin Wako 80 µg/ml für C. higginsianum Bialaphos Wako 20 µg/ml für C. higginsianum Nourseothricin Jena Bioscience GmbH 80 µg/ml für C. higginsianum: Spectinomycin Sigma-Aldrich 100 µg/ml Cefotaxime Duchefa Biochemicals 100 µg/ml
143
4.8 Methoden
4.8.1 Anzuchtbedingungen
Anzucht von C. higginsianum
Für die Gewinnung von Konidien wurde C. higginsianum auf Oatmeal-Platten für sechs bis
sieben Tage bei 25°C in einem Inkubator (12 h Licht / 12h Dunkelheit) kultiviert. Für
Stammkulturen von C. higginsianum wurden Konidien mit Wasser von Oatmeal-Platten
abgespült und 1:1 mit NSY-Glycerin gemischt. Je 1 ml der Konidiensuspensionen wurde in
Cryovials bei -80°C gelagert.
Die Anzucht von Myzel erfolgte in Mathur oder Fries-Medium (2x106 Konidien pro 100 ml
Medium) in einem Inkubator (28°C; 300 rpm).
Anzucht von A. thaliana
Saatgut wurde auf Arabidopsis Erdmischung (65% Fruhstorfer Erde Typ P (Fa. Hawita,
Vechta), 25% Sand, 10% Liadrain Blähton (Fa. Liapor, Pautzfeld)) ausgebracht und für die
Stratifizierung anschließend für 48 h bei 4°C dunkel und feucht inkubiert. Anschließend
wurden die Sämlinge 2 Wochen unter Kurztag-Bedingungen (8 h (22°C)/16 h (19°C) Licht-
/Dunkelrhythmus) in Arabidopsis Chambers (Percival Scientific) angezogen. Nach dem
Pikieren mit Arabidopsis Erdmischung wurden die Pflanzen fünf Wochen in Phytokammern
(Gro-Bank; CLF, Weilheim) unter definierten Bedingungen (12 h Licht (22°C) / 12 h
Dunkelheit (19°C); 91 µE/m²s; 70%Luftfeuchtigkeit) angezogen. Pro Woche wurden die
Pflanzen zweimal gegossen, einmal davon mit 0,1% WUXAL-Super Dünger (Aglukon,
Düsseldorf).
in vitro Appressorienbildung von C. higginsianum
Sechs bis sieben Tage alte Oatmeal-Platten mit C. higginsianum wurden mindestens für
einen Tag bei 4°C gelagert. Konidien wurden mit destilliertem Wasser abgespült und der
Titer mittels eines Casy Cell Counters (Schärfe-Systems) bestimmt. Für eine verbesserte
Reproduzierbarkeit der Appressorienbildung wurden die verwendeten Petrischalen mit
Hexadekandiol beschichtet (10 mM 1,16-Hexadecanediol; 1:100 verdünnt in Methanol). Eine
Übersicht der verwendeten Petrischalen ist in Tabelle 4.9 zusammengefasst.
144
Tabelle 4.9: Verwendete Petrischalen für die in vitro Appressorienbildung von C. higginsianum
Petrischale Art-Nr. und Bezugsquelle
Hexadekandiol Lösung (100 µM in Methanol)
Anzahl der Konidien
60x15 mm Cell Culture Disc
#83.1801.002; Sarstedt
1 ml 1x106 in 5 ml Wasser
145x20 mm Petrischale
#639102; Greiner bio-one
5 ml 2x107 Konidien in 40 ml Wasser
µ-Dish 35mm, high # 80131; ibidi 100 µl 1,2x105 in 1 ml Wasser
µ-Slide 18 Well, uncoated
#81821; ibidi 8 µl 2000 in 25 µl Wasser
Für die in vitro Appressorienbildung auf Dialyseschläuchen wurden kleine, einlagige Stücke
Dialyseschlauch (Visking 36/32, Carl Roth) autoklaviert und auf einen Objektträger mittels
Agarose (1,2%) fixiert. Je nach Größe des verwendeten Stückchens wurde eine angepasste
Anzahl von Konidien verwenden (ca. 1x105/cm²).Die Inkubation erfolgte in Dunkelheit bei
25°C mit hoher Luftfeuchtigkeit. Nach einen Tag hatten sich Appressorien gebildet und ab
zwei Tagen war Myzel innerhalb des Dialyseschlauchs sichtbar. Für die Mikroskopie wurde
der Dialyseschlauch von der Agarose entfernt.
Für die Bestimmung des Turgors von in vitro Appressorien wurde ein Cytorrhysis-Assay
angewendet. 60 mm Culture Discs wurden mit Hexadekandiol beschichtet und pro Schale
wurden 1x106 Konidien in 5 ml Wasser hinzugegeben. Nach 24 Stunden wurde das Wasser
entfernt und durch Lösungen von PEG6000 (100 mg bis 500 mg/ml) mit entsprechenden
osmotischen Drücken von 70 Pa bis 5.8 MPa (Money, 1989) ersetzt. Nach 10 Minuten
Inkubationszeit wurde lichtmikroskopisch der prozentuelle Anteil kollabierter Appressorien
pro PEG6000 Konzentration bestimmt (3 Replikate mit je n>100).
4.8.2 Isolationen von Nukleinsäuren
Für detaillierte Protokolle der DNA-und RNA-Extraktion aus C. higginsianum siehe (Korn et
al., 2015)
4.8.3 Transformationen
Transformation von Agrobakterien
Reaktionsgefäße mit kompetenten Agrobakterien wurden aufgetaut und mit der zu
transformierenden DNA gemischt (3-4 µg). Nach 30 Minuten bei 0°C erfolgte ein Kältschock
durch Einfrieren der Ansätze in flüssigen Stickstoff und ein Wärmeschock durch sofortiges
Auftauen bei 37°C. Pro Ansatz wurden 500 µl YEB-Medium hinzugegeben und bei 28°C für 5
Stunden inkubiert. Die Zellen wurden anschließend abzentrifugiert (1 Minute, 13.000 rpm)
145
und der Überstand wurde bis auf 200 µl verworfen. Der restliche Ansatz wurde gemsicht und
komplett auf YEB-Platten mit entsprechenden Antibiotika ausplattiert und für 2 Tage bei 28°C
inkubiert.
Agrobakterium tumefaciens vermittelte Transformation von C. higginsianum (ATMT)
Zwei Tage vor der Transformation von C. higginsianum wurden 5 ml Minimal Medium für
Agrobakterien mit Einzelkolonien der entsprechenden A. tumefaciens Stämme beimpft und
für 2 Tage bei 28°C und 300 rpm inkubiert. Am Morgen der Transformation wurde die oD600
der Kultur bestimmt, auf 0,15 mit Induktions Medium eingestellt und 6 Stunden bei 28°C
inkubiert. Während der Inkubationszeit wurden Platten mit Induktions Medium gegossen.
Nach dem Abkühlen der Platten wurden zugeschnittene und autoklavierte Nylon-Filter
aufgelegt. Konidien des zu transformierenden C. higginsianum Stammes wurden mit Minimal
Medium für Agrobakterien von 6 bis 7 Tage alte Oatmeal Platten abgespült und auf
Konzentration (Casy Cell Counter) von 1x106/ml mit Induktionsmedium verdünnt. Jeweils 100
µl der entsprechenden Konidien-und Agrobakteriensuspensionen wurden gemischt und auf
die vorbereitet Platten mir Induktions Medium ausplattiert. Nach 2 Tagen bei 28°C wurde der
Nylonfilter von den Platten mit Induktions Medium auf PDA-Selektionsplatten mit
entsprechenden Antibiotika umgesetzt. Nach 2 Tagen im Lichtschrank bei 25°C wurden die
Filter erneut auf PDA Platten umgesetzt und diese wurden inkubiert bis Kolonien sichtbar
waren (6 bis 7 Tage nach Transformation). Die erhaltenen Transformanten wurden auf PDA-
Selektionsplatten vereinzelt. Die erhaltenen Einzelkolonien wurden anschließend auf Platten
mit Oatmeal Medium ausgestrichen und weitere 6 bis 7 Tage bei 25°C inkubiert.
4.8.4 Infektion von A. thaliana mit C. higginsianum Platten mit Oatmeal Medium wurden mit den entsprechenden C. higginsianum Stämmen
beimpft und bei 25°C inkubiert bis diese eine vollständige orangene Färbung durch die
gebildeten. Konidien aufwiesen (5 bis 7 Tage). Anschließend wurden die Platten für
mindestens einen Tag bei 4°C gelagert. Die Konidien von C. higginsianum wurden mit
Wasser von den Platten abgespült und deren Konzentration mittels eines Casy Cell
Counters bestimmt.
Sprühinfektion:
Die Konidiensuspensionen wurden in einer 20 ml Pump-Sprühflasche (20ml) auf eine
Konzentration von 1x106/ml eingestellt. Ca. 5-6 Wochen alte A. thaliana Pflanzen wurden in
eine, mit nassen Papiertüchern abgedichteten, Pflanzenschalen gestellt und gleichmäßig mit
den Konidiensuspensionen besprüht (ca. 4-5 Pumpstöße á 100 µl pro Pflanze). Die
146
Pflanzschalen wurden mit Wasser gegossen (Boden bedeckt) und mit abgedichteten Hauben
bedeckt. Für eine bessere Aufrechterhaltung der Luftfeuchtigkeit innerhalb der Schale
wurden befeuchtete Papiertücher zwischen Schale und Haube gelegt. Die infizierten
Pflanzen wurden bis zu der Auswertung weiter in der A. thaliana Growth Chamber (siehe
4.9.1.3) inkubiert.
Tropfinfektion von abgetrennten A. thaliana Blättern:
Einzelne Blätter von 5-6 Wochen alte A. thaliana Pflanzen wurden in eine mit nassen
Papiertüchern ausgelegten viereckige Petrischalen gegeben und mit jeweils 4 Tropfen (500
Konidien pro Tropfen) der C. higginsianum Konidiensuspensionen infiziert. Die Inkubation bis
zu der Auswertung erfolgte ebenfalls in Growth Chambers.
Pathogenitäts-Assay für C. higginsianum vir-Mutanten:
Konidien von Mutanten wurden von Platten mit Oatmeal Medium abgespült und auf eine
Konzentration von 1x105/ml eingestellt. A. thaliana Col-0 Pflanzen wurden für 5 Wochen in
24 Well Anzuchtschalen angezogen. Pro Mutante wurden drei Blätter von unterschiedlichen
Pflanzen betropft (4 Tropfen mit 5 µl). Makroskopische Symptome wurden nach 6 Tagen in
Growth Chambers untersucht. Mutanten ohne oder mit reduzierten Symptomen wurden in
unabhängigen Experimenten erneut in Tropfinfektionen eingesetzt. Mutanten mit
reproduzierbaren Pathogenitätsdefekten (vir-Mutanten) wurden in Sprühinfektionen von A.
thaliana Col-0 (siehe oben) weiter analysiert.
4.8.5 Histochemische Färbungen und Mikroskopie Alle histochemischen Analysen wurden an einem Leica DMR HC Mikroskop (Leica
Microsystems, Wetzlar, Germany) durchgeführt. Für Konfokalmikroskopopische Aufnahmen
wurde ein Leica TCS SP5 II (Leica Microsystems, Wetzlar, Germany) mit einem HCX PL
APO lambda blue 63.0 x 1.20 Water UV Objektiv verwendet. GFP wurde mit der 488 mm
Bande des Argon Lasers angeregt und zwischen 496 nm und 556 nm detektiert. Für
mCherry und FM4-64 wurde ein 561 nm DPS Laser für die Anregung verwendet und die
Emission wurde zwischen 569 nm und 637 nm detektiert.
Bestimmung der gebildeten Infektionsstrukturen mittels Trypanblaufärbungen
Die zu färbenden A. thaliana Blätter wurden in 2 ml Safelock-Reaktionsgefäßen mit
eingestochenem Deckel gelegt und mit Trypanblaufärbelösung überschichtet. Der Ansatz
wurde im Heizblock für 90 Sekunden bei 95°C erhitzt und anschließend für maximal 24
Stunden bei Raumtemperatur stehen gelassen. Anschließend wurde die Färbelösung
entnommen und durch Chloralhydrat ersetzt. Nach mindestens 24 Stunden wurden die
147
Blätter mit Wasser gewaschen und mit Phasenkontrast oder Hellfeld-Mikroskopie untersucht.
Die prozentuelle Verteilung der gebildeten Infektionsstrukturen von C. higginsianum wurde
für mindestens 100 Appressorien pro Stamm bestimmt.
Detektion von reaktiven Sauerstoffspezies
Drei Tage nach der Sprühinfektion von A. thaliana mit C. higginsianum wurden einzelne
Blätter in 50 ml Zentrifugenröhrchen mit DAB-Färbelösung Überschichtet. Für die
Färbelösung wurden 10 mg 3,3’-Diaminobenzidine in 1 ml HCl (1 mM) gelöst und
anschließend 1:10 mit 100 mM Kaliumphosphat-Puffer pH 5,8 verdünnt (Thordal-
Christensen, Zhang, Wei, & Collinge, 1997). Nach 12 Stunden wurde die Färbelösung
entfernt und die Blätter wurden für 10 Minuten in 99% Ethanol entfärbt. Die Quantifizierung
der DAB-Färbung erfolgte durch Hellfeldmikroskopie und basiert auf das Verhältnis zwischen
gefärbten Epidermiszellen von A. thaliana und der Gesamtanzahl der gebildeten
Appressorien.
Detektion von Callose-Ablagerungen
Die histochemische Färbung von Papillen erfolgte durch Färbungen mit Anilinblau
(Fernandez & Heath, 1986; Shimada, Lipka, Connell, Okuno, & Schulze-lefert, 2006). Drei
Tage nach der Sprühinfektion wurden einzelne Blätter für 12 Stunden mit 99% Ethanol
entfärbt. Anschließend wurde der Ethanol durch Anilinblau-Färbelösung ersetzt. Nach 1
Stunde die Blätter dreimal mit Wasser gewaschen und mittels Epifluoreszenz-Mikroskopie
(Leica UV filter cube A; BP 340-380 nm, LP 425 nm) untersucht. Die Quantifizierung der
Induktion von Papillen basiert auf das Verhältnis zwischen der Anzahl von Appressorien mit
unterliegender Callose-Ablagerung und der Gesamtanzahl der Appressorien.
4.8.6 PCR-Techniken
Analyse der Genexpression mittels quantitativer Realtime PCR
Die Synthese von cDNA erfolgte mit RevertAid H Minus RT (Thermo Scientific) Reverse
Transkriptase entsprechend des Herstellerprotokolls.
Als Gerät für alle Messungen diente eine MX300 (Strategene) und alle Proben wurden mit
technischen Triplikaten vermessen. Die Effizienz der verwendeten Primer für quantitative
Realtime PCRs wurde mittels einer Amplifikation einer Verdünnungsreihe von Template und
der automatischen Effizienzberechnung mittels Standardkurven der MxPro Software
(Stratagene) bestimmt.
148
Für die Messungen wurde folgender Ansatz verwendet:
10 µl 2xBrilliant II SYBR Green qPCR MM (Agilent Technologies)
0,4 µl (200 nM) Primer 1 (10 µM stock)
0,4 µl (200 nM) Primer 2 (10 µM stock)
4,2 µl H2O
5 µL DNA Template (1:5 verdünnt)
Die Berechnung der relativen Expressionswerte erfolgte nach Pfaffl (Pfaffl, 2001). Für die
Standardisierung wurde das Expressionslevel von α-Tubulin (CH063_01222) verwendet.
Identifizierung von T-DNA Insertionsstellen von vir-Mutanten mittels Genome-Walker PCRs
Der verwendete Adapter (25 µM) wurde durch Annealing von zwei Oligonukleotiden
(CK2580, CK2581) hergestellt. Zuvor wurde allerdings an CK2581 mit folgen Ansatz ein 5‘-
Phosphat angefügt.
12,5 µl pCK2581(100pmol/µl)
3,75 µl 10X T4 DNA Ligase buffer (Fermentas)
1 µl Polynucleotidkinase (New England Biolabs, 10 U/µl)
20,25 µl H2O
Inkubation für 1 Stunde bei 37°C und anschließender Hitzeinaktivierung bei 65°C für 20
Minuten.
Jeweils 12,5 µl CK2850 und 37,5 µl phosphorylierter CK2581 wurden miteinander gemischt
und für 5 Minuten bei 95°C erhitz. Der Verdau der zu analysierenden chromosomalen DNA
erfolgte über Nacht in 100 µl Ansätzen mit 1 µg chromosomaler DNA und 50 U des
verwendeten Restriktionsenzyms. Nach dem Restriktionsverdau wurde die geschnittene
DNA mittels zweimaligen Phenolisieren mit Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol und
anschließender Ethanolfällung unter Zugabe von 20 µg Glykogen aufgereinigt und in 10 µl
TE aufgenommen. Jeweils 4 µl der DNAs wurden zusammen mit 2,6 µl des Adapters (25
µM) in 8 µl Ansätzen über Nacht bei 16°C ligiert. Am nächsten Tag wurden die Proben für 5
min auf 70°C erhitzt und anschließend 72 µl 1 x TE zugegeben. Die verwendeten Ansätze
und Programme der beiden Genome Walker PCRs sind in Tabelle 4.1 0 zusammengefasst.
149
Tabelle 4.10: Genome Walker PCRs PCR-Ansatz PCR-Programm
1. PCR
1 µl Taq-Polymerase (Laborpräparation, 7.5 U/µl) 5 µl 10 x Y Puffer 1 µl dNTPs (jeweils 10 mM) 1 µl AP1 (10 µM) 1 µl T-DNA spezifischer nested primer 1 (10 µM) 1 µl Ligationsansatz 40,75 µl H2O
7x 94°C 25 s 72°C 3 min 32x 94°C 25 s 66°C 3 min 10 min bei 66°C 4°C ∞
2. PCR
1 µl Taq-Polymerase (Laborpräparation, 7.5 U/µl) 5 µl 10 x Y Puffer 1 µl dNTPs (jeweils 10 mM) 1 µl AP2 (10µM) 1 µl T-DNA spezifischer nested primer 2 1 µl 1/50 Verdünnung des ersten PCR Ansatzes 40,75 µl H2O
5x 94°C 25 s 72°C 3 min 20x 94°C 25 s 66°C 3 min 10 min bei 66°C 4°C ∞
5 µl des ersten PCR Ansatzes und 5 µl des zweiten PCR Ansatzes werden auf ein 1,5%
Agarosegel aufgetragen und analysiert. Die zu sequnzierenden PCR-Produkte wurden
mittels des QIAquick PCR Purification Kit (Quiagen) aufgereinigt und in pJet2.1 (Thermo
Scientific) oder pGEM T-Easy (Promega) kloniert.
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Abbildungsverzeichnis
Abbildung 1.1: Infektionsstrukturen von biotrophen und hemibiotrophen Pilzen 6
Abbildung 1.2: Übersicht der Infektion von A. thaliana mit C. higginsianum 8
Abbildung 1.3: Domänenstruktur und Konformationswechsel von P-Typ-ATPasen 18
Abbildung 2.1: Alignment von Ku80 Proteinen 24
Abbildung 2.2: Nourseothricin als Selektionsmarker für C. higginsianum 26
Abbildung 2.3: Strategie für die Deletion von ChKU80 27
Abbildung 2.4: Selektion von Chku80 Knockout Stämmen 28-29
Abbildung 2.5: Southern-Blot Analyse von Chku80 Deletionsmutanten 31
Abbildung 2.6: Phänotypische Charakterisierung des ΔChku80 Stammes CY6021 33
Abbildung 2.7: C. higginsianum Proteine mit LysM Domänen 37-38
Abbildung 2.8: Lokalisierung und Expression von ChCih1-GFP bzw. ChCih1-mCherry 39-40
Abbildung 2.9: Cih1-mCherry zeigt keine Kolokalisation mit GFP-CAAX 42
Abbildung 2.10: Lokalisierung und Expression von ChCih2-GFP 43-44
Abbildung 2.11: Knockout von ChCIH1 mittels homologer Rekombination 45
Abbildung 2.12: Knockout von ChCIH2 mittels homologer Rekombination 46
Abbildung 2.13: Infektion von A. thaliana mit ΔChcih1 und ΔChcih2 Stämmen 47-48
Abbildung 2.14: Generierung von ΔChCIh2 und ΔChCih1/ΔChCih2 Knockoutstämmen 50
Abbildung 2.15: C. higginsianum Stämme mit Deletionen von ΔChcih1 ΔChcih2 zeigen keinen Pathogenitätsdefekt auf A. thaliana 51
Abbildung 2.16: Generierung und Pathogenität von C. higginsianum Stämmen mit Deletion von ChLYS3 53
Abbildung 2.17: Abbildung 2.17: Herstellung einer Bibliothek von C. higginsianum T-DNA Insertionsmutanten 56
Abbildung 2.18: Schematische Darstellung der möglichen Insertionen von zwei T-DNAs 57
Abbildung 2.19: Analyse der T-DNA Insertionen von neun vir-Mutanten 58
Abbildung 2.20: Sequenzen von T-DNA Junctions 61
Abbildung 2.21: Genome Walker Analyse von vir-Mutanten 62
Abbildung 2.22: T-DNA Insertionsort von vir-23 64
168
Abbildung 2.23: T-DNA Insertionsorte von vir-41 65
Abbildung 2.24: T-DNA Insertionsort von vir-51 67
Abbildung 2.25: T-DNA Insertionsort von vir-52 68
Abbildung 2.26: Phänotyp von ΔChLys1 Stämmen 69
Abbildung 2.27: T-DNA Insertionsort von vir-53 70
Abbildung 2.28: T-DNA Insertionsort von vir-56 71
Abbildung 2.29: T-DNA Insertionsorte von vir-70 72
Abbildung 2.30: T-DNA Insertionsort von vir-72 73
Abbildung 2.31: T-DNA Insertionsort von vir-73 73
Abbildung 2.32: Sechs vir-Mutanten haben eine T-DNA Insertion im ChPMA2 Lokus 74
Abbildung 2.33: Domänenstruktur von ChPma1 und ChPma2 77
Abbildung 2.34: Die Deletion von ChPMA1 war nicht möglich 79
Abbildung 2.35: Generierung von ΔChpma2 Knockout-Stämmen 79
Abbildung 2.36: Überprüfung des ΔChpma2 Knockouts 80
Abbildung 2.37: Knockout von ChPMA2 führt zum Verlust der Pathogenität 81
Abbildung 2.38: Der Verlust von ChPMA2 korreliert mit einer verringerten pflanzlichen Abwehr von A. thaliana 72-83
Abbildung 2.39: Appressorienbildung von ΔChpma2 85
Abbildung 2.40: Bestimmung des Turgors von Appressorien von ΔChku80 und ΔChpma2 87
Abbildung 2.41: Aufnahme von 14C markierter Glukose 89
Abbildung 2.42: Radiales Wachstum von ΔChpma2 und ChPMA2 T-DNA Insertionsmutanten in Abhängigkeit von der Kohlenstoffquelle 90
Abbildung 2.43: Katabolitrepression von C. higginsianum 92
Abbildung 2.44: PCR-Analyse der Expression von ChPMA1 und ChPMA2 während des Wachstums in Flüssigmedium 95
Abbildung 2.45 Bestimmung der Expression von ChPMA1 und ChPMA2 mittels Quantitativer Real Time PCR 96
Abbildung 2.46: Quantitative Real Time PCR der Expression von ChPMA1 und ChPMA2 während der in vitro Appressorienbildung 98
Abbildung 2.47 Expression von mCherry und GFP unter der Kontrolle des ChPMA1 bzw. ChPMA2 Promotors 99-100
169
Abbildung 2.48: Konstruktion von C. higginsianum Stämmen mit Expression von ChPMA2-mCherry und ChPMA1-GFP 102-103
Abbildung 2.49: ChPma1-GFP und ChPma2-mCherry haben keinen Einfluss auf die Pathogenität 104
Abbildung 2.50: Lokalisierung von ChPma1-GFP in Konidien 106
Abbildung 2.51: Lokalisierung von ChPma1-GFP und ChPma2-mCherry während der Myzelbildung 107
Abbildung 2.52: Lokalisierung von ChPma1-GFP und ChPma2-mCherry in Infektionsstrukturen 109-110
Abbildung 2.53: Komplementation von ChPMA2 T-DNA Insertionsmutanten vir-22 und vir-24 112
Abbildung 2.54: Suppression des Phänotyps von vir-24 114
Abbildung 2.55: Die Suppression des Phänotyps von vir-22 hat eine verstärkte Abwehr zur Folge 116
Abbildung 3.1: Anwendungen für NHEJ-defiziente C. higginsianum Stämme 119
Abbildung 3.2: Phylogenie von LysM-Proteinen 121
Ab0ildung 3.3: Unterschiede in den Proteinsequenzen von ChPma1 und ChPma2 125
Abbildung 3.4: Schematische Darstellung der Funktion von ChPma2 127
Abbildung 3.5: Phylogenie von pilzlichen H+-ATPasen 128
170
Tabellenverzeichnis
Tabelle 1.1: Top 10 phytopathogener Pilze 5
Tabelle 1.2: Klassifizierung von P-Typ- ATPasen 17
Tabelle 2.1: Überprüfung des ChKU80 Knockouts 30
Tabelle 2.2: C. higginsianum Proteine mit vorhergesagten LysM-Domänen 36
Tabelle 2.3: Erwarte Bandengrößen für verschiedene T-DNA Insertionen 59
Tabelle 2.4: BLAST-Analysen von C. higginsianum P-Typ ATPasen 76
Tabelle 2.5: Induktion der pflanzlichen Abwehr durch ChPMA2 vir-Mutanten und ΔChpma2 84
Tabelle 2.6: RNA-Seq Daten der Expression von ChPMA1 und ChPMA2 93
Tabelle 2.7: Suppression des Pathogenitätsphänotyps von vir-22 115
Tabelle 4.1: Verwendete Bakterienstämme 131
Tabelle 4.2: Verwendete C. higginsianum Stämme 132
Tabelle 4.3: Verwendete Plasmide und Vektoren 133-134
Tabelle 4.4: Verwendete Oligonukleotide 135-138
Tabelle 4.5: Verwendete Enzyme 138
Tabelle 4.6: Verwendete Puffer und Lösungen 139-141
Tabelle 4.7: Verwendete Medien 141-142
Tabelle 4.8: Verwendete Antibiotika 142
Tabelle 4.9: Verwendete Petrischalen für die in vitro Appressorienbildung von C. higginsianum 140
Tabelle 4.10: Genome Walker PCRs 149
171
Abkürzungsverzeichnis
A. thaliana Arabidopsis thaliana
A. tumefaciens Agrobacterium tumefaciens
AM Arbuskulärer Mykorrhizapilz
ATMT Agrobacterium tumefaciens vermittelte Transformation
bp Basenbaar
C. higginsianum Colletotrichum higginsianum
C. graminicola Colletotrichum graminicola
Col-0 Columbia
CLSM Confocal laser scanning microscopy
DAB 3,3‘-Diaminobenzidin
E. coli Escherichia coli
NHEJ Non-homologous end joining
S. cerevisiae Saccharomyces cerevisiae
S. pombe Schizosaccharomyces pombe
UTR untranslatierter Bereich
ORF Open Reading Frame
rpm Umdrehungen pro Minute
Wt Wildtyp
PEG Polyethylen Glykol 6000
ROS Reaktive Sauerstoffspezies
ADH Alkoholdehydrogenase
172
Lebenslauf Persönliche Daten Name: Martin Korn
Geburtsdatum: 24.12.1984
Nationalität: deutsch
Ausbildung 1990 – 1994 Grundschule Adam-Ries Annaberg
1994 – 2003 Landkreis Gymnasium Annaberg
2004 – 2009 Friedrich-Alexander Universität Erlangen-Nürnberg
Studium Biologie Diplom (Hauptfach Biochemie)
seit Oktober 2009 Friedrich-Alexander Universität Erlangen-Nürnberg
Dissertation am Lehrstuhl für Biochemie
Wehrdienst 2003 – 2004 Grundwehrdienst mit anschließender Wehrübung Panzerbataillon 393 Bad Salzungen
173
Danksagung An dieser Stelle möchte ich mich bei allen Kollegen bedanken, die mich in der Zeit meiner
Doktorarbeit begleitet haben.
Herzlich bedanken möchte ich mich bei Prof. Dr. Koch für die Bereitstellung dieses
interessanten Projektes. Auch wenn sein Terminplan überzuquellen schien, hatte er immer
ein offenes Ohr für auftretende Probleme und einen wissenschaftlichen Rat für deren
Lösung.
Ich danke Dr. Ruth Stadler für die kurzfristige Übernahme des Zweitgutachtens.
Bedanken möchte ich mich bei allen Laborkollegen, die immer für eine angenehme
Arbeitsatmosphäre gesorgt haben:
Dr. Marlis Dahl für fachliche und menschliche Unterstützung und des Sponsorings von
Hanutas.
Meinen Doktorandenkollegen Johannes Schmidpeter danke ich für seinen unermüdlichen
Einsatz für den täglichen Besuch in der Mensa und für die unvergessenen Timecourse-
Experimente am „Seelensauger“.
Ein weiterer Dank gilt auch meinen ehemaligen Doktorandenkollegen Susanne Müller,
Johanna Rühl und Dr. Octavian Stephan.
Bedanken möchte ich mich auch bei den ehemaligen Diplom-und Masterstudenten des
Koch-Labors: Iris, Linda, Katharina, Daria, und Sonja und meinen Bachelor-Studenten
Moritz, Stefanie und Enrico.
Ebenfalls möchte ich mich bei Prof. Dr. Sonnewald und den gesamten Lehrstuhl für
Biochemie bedanken, insbesondere bei Dr. Lars Voll, Pierre Gebauer und Dr. Timo
Engelsdorf für Anregungen im Rahmen der Fungi-Meetings.