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Identifizierung und Analyse der Protonenpumpe ChPma2 als Pathogenitätsfaktor der Interaktion zwischen Colletotrichum higginsianum und Arabidopsis thaliana Der Naturwissenschaftlichen Fakultät der Friedrich-Alexander Universität Erlangen-Nürnberg zur Erlangung des Doktorgrades Dr. rer. nat. vorgelegt von Martin Korn aus Annaberg-Buchholz

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Identifizierung und Analyse der Protonenpumpe ChPma2 als Pathogenitätsfaktor der Interaktion

zwischen Colletotrichum higginsianum und Arabidopsis thaliana

Der Naturwissenschaftlichen Fakultät der Friedrich-Alexander Universität Erlangen-Nürnberg

zur Erlangung des Doktorgrades Dr. rer. nat.

vorgelegt von

Martin Korn aus Annaberg-Buchholz

Als Dissertation genehmigt

von der Naturwissenschaftlichen Fakultät

der Friedrich-Alexander Universität Erlangen-Nürnberg

Tag der mündlichen Prüfung: 1.4.2016

Vorsitzender des Promotionsorgans: Prof. Dr. Jörn Wilms

Gutachter/in: Prof. Dr. Christian Koch

PD Dr. Ruth Stadler

Teile dieser Arbeit sind in folgender Publikation enthalten:

Korn M, Schmidpeter J, Dahl M, Müller S, Voll LM, Koch, C. (2015) A Genetic Screen for Pathogenicity Genes in the Hemibiotrophic Fungus Colletotrichum higginsianum Identifies the Plasma Membrane Proton Pump Pma2 Required for Host Penetration.PLoS ONE 10(5): e0125960. doi:10.1371/journal.pone.0125960

Inhaltsverzeichnis

Zusammenfassung .............................................................................................................. 1

Summary .............................................................................................................................. 3

1. Einleitung ......................................................................................................................... 5

1.1. Pilze als Phytopathogene ......................................................................................... 5

1.1.1 Die Gattung Colletotrichum ist auf eine hemibiotrophe Ernährungsstrategie spezialisiert .................................................................................................................... 7

1.1.2 Colletotrichum higginsianum als Modellorganismus für hemibiotrophe Phytopathogene ............................................................................................................. 8

1.1.3 Colletotrichum sp. bilden mit Appressorien spezialisierte Infektionsstrukturen aus 9

1.1.4 Penetration der Wirtszelle und Etablierung der biotrophen Phase ........................11

1.1.5 Nekrotrophe Phase ...............................................................................................13

1.2. Pathogen-Wirts-interaktionen .................................................................................14

1.2.1 Pathogene werden durch konservierte Muster erkannt welche eine Immunantwort auslösen ........................................................................................................................14

1.2.2 Effektoren als Unterdrücker der Immunantwort .....................................................15

1.2.3. Effektor-induzierte Immunantwort ........................................................................16

1.3. Membrangebundene Transportproteine .................................................................17

1.3.1 P-Typ-ATPasen ....................................................................................................17

1.3.2 Die Plasmamembran-gebundene Protonenpumpe ...............................................20

1.4. Ziel dieser Arbeit ......................................................................................................21

2. Resultate .........................................................................................................................22

2.1 Etablierung eines Systems für homologe Rekombination in Colletotrichum higginsianum ..................................................................................................................22

2.1.1 Identifizierung von ChKu80 ...................................................................................23

2.1.2 Etablierung der Nourseothricin-Resistenz als Selektionsmarker für die Transformation von C. higginsianum .............................................................................25

2.1.3 Generierung und Selektion von ΔChku80 Knockout Stämmen .............................26

2.1.4 Der ΔChku80 Stamm CY6021 zeigt im Vergleich zum Wildtyp keine phänotypischen Veränderungen ....................................................................................32

2.2 Identifizierung potentieller LysM-Effektorproteine von C. higginsianum und Untersuchung ihrer Bedeutung für die Infektion von A. thaliana ................................34

2.2.1 Identifizierung von Proteinen mit LysM-Domänen in C. higginsianum ...................36

2.2.2 Untersuchung der Expression und Lokalisation von ChCih1 und ChCih2 .............39

2.2.3 C. higginsianum LysM-Proteine ChCih1, ChCih2 und ChLysM3 sind für die Infektion von A. thaliana nicht erforderlich .....................................................................45

2.3 Identifikation von C. higginsianum Pathogenitätsfaktoren mittels Insertionsmutagenese ....................................................................................................55

2.3.1 Herstellung von C. higginsianum T-DNA Insertionsmutanten und Identifikation von C. higginsianum Pathogenitätsmutanten (vir-Mutanten) ................................................55

2.3.2 Analyse der T-DNA Insertionen ausgewählter C. higginsianum vir-Mutanten .......57

2.3.3 Identifikation von T-DNA Insertionsstellen von C. higginsianum vir-Mutanten mittels Genome Walking PCRs .................................................................................................62

vir-23 .........................................................................................................................64

vir-41 .........................................................................................................................65

vir-51 .........................................................................................................................67

vir-52 .........................................................................................................................68

vir-53 .........................................................................................................................70

vir-56 .........................................................................................................................71

vir-70 .........................................................................................................................72

vir-72 .........................................................................................................................73

vir-73 .........................................................................................................................73

2.3.4 Multiple vir-Mutanten haben eine T-DNA Insertion im Lokus von ChPMA2 ...........74

2.4 Die Rolle von Plasmamembran gebundenen H+-transportierenden ATPasen für die Pathogenität von C. higginsianum ..........................................................................76

2.4.1 C. higginsianum kodiert mit ChPMA1 und ChPMA2 für zwei H+-transportierende P-type ATPasen ............................................................................................................76

2.4.2 Ein Deletion von ChPMA1 war nicht möglich, während die Deletion von ChPMA2 den Verlust der Pathogenität zur Folge hat....................................................................78

2.4.3 Der Verlust von ChPMA2 korreliert mit einer verringerten pflanzlichen Abwehr von A. thaliana .....................................................................................................................82

2.4.4 ChPMA2 ist für die Appressorienbildung von C. higginsianum nicht erforderlich ..85

2.4.5 Verwertung von Kohlenstoffquellen durch ΔChPma2-Mutanten ............................88

2.4.5.1 Glukoseaufnahme von Appressorien .............................................................88

2.4.5.2 Vegetatives Wachstum in Abhängigkeit verschiedener Kohlenstoffquellen ....90

2.4.5.3 Die Katabolitrepression von C. higginsianum ist in unabhängig von ChPMA2 91

2.4.6 Expressionsanalysen von ChPMA1 und ChPMA2 ................................................93

2.4.6.1 PCR-Analysen der Expression von ChPMA1 und ChPMA2 ...........................94

2.4.6.2 Analyse der Expression von ChPMA1 und ChPMA2 mittels Reportergenen ..99

2.4.6.3 Lokalisierung von ChPma1 und ChPma2 ..................................................... 102

2.4.7 Komplementation und Suppression des Pathogenitätsphänotyps von ChPMA2 T-DNA Insertionsmutanten ............................................................................................. 111

2.4.7.1 Die ektopische Expression von ChPMA2 komplementiert den Pathogenitätsdefekt der ChPMA2 T-DNA Insertionsmutanten vir-22 und vir-24 ....... 111

2.4.7.2 Die Expression von ChPMA1 kann den Pathogenitätsdefekt von Insertionsmutanten nur teilweise supprimieren ........................................................ 113

3. Diskussion .................................................................................................................... 118

3.1 Etablierung eines Gene Targeting Systems in C. higginsianum ......................... 118

3.2 Die Rolle von Proteinen mit LysM-Domänen für die Pathogenität von C. higginsianum ................................................................................................................ 120

3.3 Die Rolle von H+-ATPasen für die Pathogenität von C. higginsianum ................ 123

3.3.1 Der ChPMA2 Lokus ist ein potentieller „Hot Spot“ für T-DNA Insertionen ........... 123

3.3.2 Wie wird die Expression von ChPMA1 und ChPMA2 reguliert? .......................... 124

3.3.3 Wird die Proteinaktivität von ChPma1 und ChPma2 unterschiedlich reguliert? ... 125

3.3.4 Was ist die Funktion von ChPma2? .................................................................... 126

3.3.5 Die Entwicklung von verschiedenen Isoformen von H+-ATPasen stellt ein mögliche konservierte Strategie pathogener Pilze dar ................................................................ 128

3.4 Ausblick ................................................................................................................... 130

4. Material und Methoden................................................................................................. 131

4.1 Organismen ............................................................................................................. 131

4.2 Verwendete Plasmide und Oligonukleotide .......................................................... 133

4.3 Enzyme .................................................................................................................... 138

4.4 DNA-Leiter ............................................................................................................... 139

4.5 Verwendete Kits ...................................................................................................... 139

4.6 Puffer, Lösungen und Kulturmedien ..................................................................... 139

4.7 Antibiotika ............................................................................................................... 142

4.8 Methoden ................................................................................................................. 143

4.8.1 Anzuchtbedingungen .......................................................................................... 143

4.8.2 Isolationen von Nukleinsäuren ............................................................................ 144

4.8.3 Transformationen ............................................................................................... 144

4.8.4 Infektion von A. thaliana mit C. higginsianum ..................................................... 145

4.8.5 Histochemische Färbungen und Mikroskopie ..................................................... 146

4.8.6 PCR-Techniken .................................................................................................. 147

Literaturverzeichnis ......................................................................................................... 150

Abbildungsverzeichnis .................................................................................................... 167

Tabellenverzeichnis ......................................................................................................... 170

Abkürzungsverzeichnis ................................................................................................... 171

1

Zusammenfassung

Colletotrichum higginsianum ist ein hemibiotropher, phytopathogener Pilz aus der Abteilung

der Schlauchpilze, welcher in der Lage ist, mit der Modellpflanze Arabidopsis thaliana

kompatible Interaktionen einzugehen. Der Infektionzyklus von C. higginsianum auf A.

thaliana beginnt, wenn der Pilz die pflanzliche Epidermis mittels spezialisierten Appresorien

penetriert. C. higginsianum bildet anschließend intrazelluläre biotrophe Hyphen aus. Nach

einer initialen biotrophen Phase geht der Pilz zu nekrotrophem Wachstum über und tötet

aktiv Wirtszellen ab. Sekundäre Hyphen werden gebildet, welche sich von abgetöteten

Zellen des Wirtes ernähren.

In dieser Arbeit konnte mit der Herstellung von Non-homologous end joining-defizienten

ΔChku80 Stämmen ein effizientes System für Knockout und Genmodifikationen etabliert

werden. Dieses System wurde verwendet, um die Rolle von potentiellen Pathogeniniäts-

Genen zu untersuchen, die zum einen in einem Vorwärts-genetischen Screen oder zum

anderen aufgrund von Homologie zu beschriebenen Effektor-Proteinen identifiziert wurden.

In der verfügbaren Genomsequenz von C. higginsianum wurden 11 Proteine mit

vorhergesagten LysM-Domänen identifiziert. Für Zwei Proteine (ChCih1 und ChCih2) mit der

größten Ähnlichkeit zu bekannten LysM-Effektorproteinen wurden Knockoutstämme

hergestellt, welche auf ihre Pathogenität hin überprüft wurden. Dabei zeigte sich, dass

ChCih1 und ChCih2 für die Infektion von A. thaliana nicht erforderlich sind. Für diese

potentiellen C. higginsianum LysM-Effektoren konnte somit, im Gegensatz zu anderen

Pathosystemen, keine Virulenzfunktion nachgewiesen werden.

Im Rahmen dieser Arbeit konnten T-DNA Insertionsorte von 14 Mutanten mit reduzierter

Pathogenität identifiziert werden. Für fünf dieser vir-Mutanten konnte die T-DNA Insertion im

Lokus der P-Type H+-ATPase ChPma2 nachgewiesen werden. Vir-Mutanten mit einer T-

DNA Insertion im ORF von ChPMA2 und Deletionsstämme von ChPMA2 bilden

Appressorien, zeigen aber einen vollständigen Arrest der Infektion von A. thaliana während

der Penetration. Zusätzlich zeigen Chpma2-Mutanten keinen Wachstumsphänotyp. Die

Expression von ChPMA2 ist in Konidien sehr schwach und wird während der

Appressorienbildung induziert. C. higginsianum besitzt mit ChPma1 eine zweite H+-ATPase,

welche sich in ihrem Expressionsmuster sehr stark von ChPMA2 unterscheidet. ChPMA1

weist in allen untersuchten Stadien hohe Expressionswerte auf und stellt vermutlich die

Hauptprotonenpumpe von C. higginsianum dar. Mittels in Lokus Reportergenfusionen beider

Proteine konnte gezeigt werden, dass ChPma1-GFP in Appressorien nicht nachweisbar ist.

2

Somit ist der Protonentransport in diesem spezialisierten Zelltyp von der Aktivität von

ChPma2 abhängig. Die Suppression des Pathogenitätsphänotyps von ChPMA2 T-DNA

Insertionsmutanten durch eine ektopische Expression von ChPMA1 unter der Kontrolle eines

ChPMA2 Promotorfragmentes war nicht erfolgreich, weswegen sich beide Protonenpumpen

vermutlich nicht nur in ihrer Expression, sondern auch in der Regulation der Proteinaktivität

unterscheiden. Entsprechende Unterschiede in möglichen regulatorischen Sequenzen von

ChPma1 und ChPma2 konnten in den Proteinsequenzen vorhergesagt werden. Das

Vorhandensein von ChPma2-ähnlichen Protonenpumpen in weiteren phytopathogenen

Pilzen deutet zudem auf eine konservierte Rolle dieser spezialisierten Form von H+-ATPasen

für die Pathogenität hin. Die Bestimmung von T-DNA Insertionsorten von weiteren vir-

Mutanten bildet die Basis für weiterführende Analysen dieser identifizierten potentiellen

Pathogenitätsfaktoren.

3

Summary

Colletotrichum higginsianum is an ascomycete hemibiotrophic plant pathogen which forms

compatible interactions with the model plant Arabidopsis thaliana. The infection process of A.

thaliana by C. higginsianum is initiated when the fungus breaches the host epidermis with a

specialized appressorium. C. higginsianum then forms intracellular biotrophic hyphae. After

the short initial biotrophic phase, during which the host cell remains alive, the fungus

switches to necrotrophic growth and actively host cells. Secondary hyphae are formed which

feed on dead host tissue.

In this thesis, an efficient system for targeted gene knockouts and gene modifications was

established by generating Non-homologous end joining-deficient ΔChku80 C. higginsianum

strains. This system was used to investigate the role of potential pathogenicity genes, which

were identified in a forward genetic screen for pathogenicity mutants or by analyzing

candidate effector genes.

The available genome of C. higginsianum encodes for 11 proteins with predicted LysM-

domains. Two of these proteins (ChCih1 and ChCIh2) show high similarity to known LysM-

effector proteins. Corresponding knockout mutants were created and checked for

pathogenicity on A. thaliana. Evaluation of infected plants showed that both ChCih1 and

ChCih2 are not required for pathogenicity. In contrast to results in other pathosystems, no

virulence function for these potential effector proteins could be verified.

The T-DNA insertion sites of 14 vir-mutants could be identified in this thesis. Five of these

mutants carry a T-DNA insertion in the locus of a P-Type H+-ATPase named ChPma2. Vir-

mutants with the T-DNA insertion in the ORF of ChPMA2 and ΔChPma2 deletion mutants

form appressoria but showed a complete arrest of the infection of A. thaliana during

penetration. In Addition Chpma2-mutants exhibit no growth phenotype when propagated on

agar plates. Expression of ChPMA2 is very week in conidia but becomes highly induced

upon appressoria formation. The genome of C. higginsianum encodes with ChPma1 for a

second H+-ATPase which is differently expressed compared to ChPMA2. The ChPMA1 gene

is highly expressed during all developmental stages and may represent the major proton

pump of C. higginsianum. In locus reporter gene fusions showed that ChPma1-GFP is not

present in appressoria and therefore the proton transport in these specialized infections

structures solely depends on ChPma2 activity. The ectopic expression of ChPMA1 under the

control of the ChPMA2 promotor could not suppress the pathogenicity phenotype of ChPMA2

T-DNA insertions mutants. Consequently, ChPMA1 and ChPMA2 not only differ in their

4

expression patterns but the proteins may also be differently regulated. Differences in

potential regulatory regions of both proteins could be identified.

The presence of ChPma2-like proton pumps in related phytopathogenic fungi implies a

conserved pathogenicity function for this group of H+-transporting ATPases. The

determination of T-DNA insertion sites in other vir-mutants forms the basis of further analysis

of these identified potential pathogenicity factors.

5

1. Einleitung

1.1. Pilze als Phytopathogene

Pflanzen sehen sich mit einer Vielzahl von Pathogenen konfrontiert. Dazu gehören neben

höheren Organismen wie Insekten und Nematoden auch Mikroorgansimen wie Bakterien,

Oomyceten, Pilze und Viren. Der globale Ernteverlust durch Pathogenbefall wird dabei auf

10 bis 30% geschätzt (Oerke, 2005; Strange and Scott, 2005). Phytopathogene Pilze

nehmen dabei an Bedeutung zu. Allein in den USA verursachen sie Schäden von circa 21

Milliarden US-Dollar pro Jahr (Rossman, 2008). Zusätzlich nehmen Fungizide mit

geschätzten 15 Milliarden US-Dollar für das Jahr 2014 (Lucintel Consulting) 40% des

globalen Pestizidmarktes ein. Ein Hauptgrund für die globale Bedeutung phytopathogener

Pilze ist ihre enorme Vielfalt. Jede Nutzpflanze dient dabei mehreren Arten als Wirt. Eine

Umfrage hinsichtlich ihrer wissenschaftlichen und wirtschaftlichen Bedeutung ergab eine Top

10 Liste phytopathogener Pilze (Dean et al., 2012), die in Tabelle 1.1 aufgeführt ist.

Tabelle 1.1: Top 10 phytopathogener Pilze

Rang Pathogen Typische Wirtspflanzen Ernährung 1 Magnaporthe

oryzae Reis hemibiotroph

2 Botrytis cinerea 200 Arten; darunter Wein und verschiedene Obst und Gemüse Arten, Zierpflanzen

nekrotroph

3 Puccinia spp. Weizen obligat biotroph 4 Fusarium

graminearum u. A. Weizen, Gerste, Mais hemibiotroph

5 Fusarium oxysporum

100 Arten; darunter Baumwolle, Banane, Melone

nekrotroph

6 Blumeria graminis

Weizen, Gerste obligat biotroph

7 Mycosphaerella graminicola

Weizen hemibiotroph

8 Colletotrichum spp.

u. A. Tabak, Tomate, Erdbeere, Gurke meist hemibiotroph*

9 Ustilago maydis Mais biotroph 10 Melampsora lini Flachs biotroph

*einige Arten wie C. acutatum und C. capsici könne ebenfalls eine nekrotrophe Ernährungsstrategie verfolgen Phytopathogene Pilze haben dabei mit Biotrophie und Nekrotrophie zwei konträre

Ernährungsstrategien entwickelt. Biotrophe Pathogene sind auf einen lebenden Wirt

angewiesen und ernähren sich von Nährstoffen, die im Apoplasten der Pflanzenzellen

verfügbar sind. Nekrotrophe Pathogene hingegen töten zum Beginn der Infektion den Wirt

aktiv ab und ernähren sich anschließend von toten Zellen (van Kan, 2006). Pathogene mit

6

biotropher Ernährungsweise sind stark auf einzelne Pflanzen spezialisiert und besitzen daher

ein sehr enges Wirtsspektrum. Der Erreger des Maisbeulenbrandes Ustilago maydis befällt

zum Beispiel nur Kulturmais (Zea mays) und die Wildform Teosinte (Euchlaena mexicana)

(Banuett, 1995). Obwohl Ustilago maydis die Wirtspflanze nicht abtötet, kann eine Infektion

durch die starke Tumorbildung zu erheblichen Ernteverlusten führen. Die verschiedenen

Arten der Familie Erysiphaceae stellen eine weitere bedeutende Gruppe biotropher Pilze dar.

Die über 100 Arten sind obligate Parasiten und die Erreger des Echten Mehltaus auf über

10.000 Wirtspflanzen (Glawe, 2008). Als charakteristische Infektionsstruktur bilden Vertreter

dieser Familie wie z.B. Blumeria graminis und Golovinomyces orontii so genannte

Haustorien aus. Haustorien dienen sowohl der Übertragung pilzlicher Effektoren, als auch

der Aufnahme von Nährstoffen (Catanzariti et al., 2006; Voegele and Mendgen, 2003). Das

Zytoplasma des Haustoriums ist dabei durch die pilzliche Plasmamembran und Zellwand und

durch die Extrahaustorial Matrix (EHMx) und Extrahaustorial Membrane (EHM) von dem

Zytoplasma der Wirtszelle getrennt (Szabo and Bushnell, 2001) (Abbildung 1.1A). Die

Extrahaustorial Membrane ist eine stark modifizierte Plasmamembran der Wirtszelle und

stellt die Interaktionsfläche zwischen Wirt und Pathogen in diesen Pathosystemen dar (Koh

et al., 2005; O’Connell et al., 2006).

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Abbildung 1.1: Infektionsstrukturen von biotrophen und hemibiotrophen Pilzen. Schematische Darstellung einer biotrophen Pflanzen-Pilz-Interaktion (A) und der biotrophen Phase der Infektion von C. higginsianum (B). K: Konidie; Ap: Appressorium; H: Haustorium; PH: Primärhyphe.

Ein phytopathogener Pilz mit nekrotropher Ernährungsweise ist der Erreger der

Grauschimmelfäule Botrytis cinerea. Im Gegensatz zu hochspezialisierten biotrophen

Pathogenen, besitzt er, wie es typisch für nekrotrophe Pathogene ist, mit über 200 Arten ein

sehr breites Wirtsspektrum (Elad, 2007).

1.1.1 Die Gattung Colletotrichum ist auf eine hemibiotrophe Ernährungsstrategie spezialisiert

Neben biotrophen und nekrotrophen phytopathogenen Pilzen gibt es noch eine Gruppe,

welche beide Ernährungsstrategien kombiniert. Hemibiotrophe Pathogene etablieren

zunächst eine initiale biotrophe Phase an die sich eine sekundäre nekrotrophe Phase

anschließt (Perfect et al., 1999). Die Gattung Colletotrichum ist dabei besonders, bis auf

wenige nekrotrophe Ausnahmen (Bailey, J.A. Jeger, 1992; Peres et al., 2005), auf diese

Ernährungsstrategie spezialisiert. Zusammen infizieren alle Colletotrichum Arten über 3200

Pflanzenarten, zu denen auch sehr viele Nutzpflanzen wie z.B. Colletotrichum musae mit

Bananen (Musa sp), C. coccodes mit Nachtschattengewächsen (Solanum sp.), C.

lindemuthianum mit Gartenbohne (Phaseolus vulgaris) und C. trifoli mit Luzerne (Medicago

sativa) als Wirtspflanzen gehören. Von besonderer wirtschaftlicher Bedeutung ist dabei das

Maispathogenen Colletotrichum graminicola, welches allein in den USA mit einer Milliarde

USD pro Jahr (Frey et al., 2011) große Schäden anrichtet. Eine genaue Definition der

großen Vielzahl von Arten ist bisher nur unvollständig erfolgt, so dass Zuordnungen von

Colletotrichum sp. oft nicht eindeutig sind (Centre et al., 2009). Dies schlägt sich in den

großen Unterschieden der Angaben über die Gesamtanzahl der einzelnen Arten nieder,

welche von 20 (Arx, 1957) über 39 (Farr et al., 1989) bis über 700 (Sutton, 1992) reichen.

Für einige Spezies wie z.B. Colletotrichum graminicola und C. cingulata wurden

homothallische und heterothallische Stämmen beschrieben (Markert, 1949; Vaillancourt et

al., 2000), wobei die sexuelle Form dieser Arten (das Telemorph) den Namen Glomerella sp.

trägt. In C. higginsianum konnte ein einzelnes Mat1-2 Mating Typ Gen nachgewiesen

werden (CH063_09403), allerdings konnte das idiomorphe Mat1-1 nicht identifiziert werden

(O’Connell et al., 2012). Zudem wurden bisher keine sexuellen Stadien beobachtet, so dass

sich C. higginsianum anscheinend nur asexuell vermehrt.

8

1.1.2 Colletotrichum higginsianum als Modellorganismus für hemibiotrophe Phytopathogene

C. higginsianum und C. destructivum sind in der Lage die Modellpflanze A. thaliana zu

infizieren (Connell et al., 2004). Dabei wird angenommen, dass beide Spezies zu einem sehr

eng verwandten Spezieskomplex (Cannon et al., 2012; O’Connell et al., 2012) oder sogar

beide zu einer Art gehören (Sun and Zhang, 2009). Für C. destructivum wurde Glomerella

glycines als Telomorph beschrieben (Manandhar, 1986). Das Colletotrichum higginsianum –

Arabidopsis thaliana Pathosystem ist aus mehrere Gründen als Modellsystem sehr attraktiv.

Als typische Colletotrichum Art besitzt C. higginsianum eine hemibiotrophe

Infektionsstrategie und erlaubt somit die Untersuchung einer initialen biotrophen und einer

sekundären nekrotrophen Phase. Der Phasenwechsel zwischen diesen beiden

Ernährungsformen weist zudem eine Vielzahl von morphologischen, biochemischen und

Pathogenitäts-assoziierten Veränderungen auf. Eine Übersicht der Infektion von A. thaliana

mit C. higginsianum ist in Abbildung 1.2 dargestellt.

9

Abbildung 1.2: Übersicht der Interaktion von A. thaliana mit C. higginsianum. C. higginsianum wird mittels Konidien (A) übertragen und bildet spezialisierte Strukturen für die Infektion der Wirtszelle. Diese Appressorien (B) sind stark melanisiert und besitzen einen hohen Turgor der die direkte Penetration der Kutikula und Zellwand der Epidermiszelle erlaubt. Die Penetrationshyphe bildet im Apoplasten des Wirtes eine biotrophe Primärhyphe (C) welche auf die erste Wirtszelle begrenzt ist. Nach ca. drei Tagen bilden sich nekrotrophe Sekundärhyphe (D) die sich in der Pflanze ausbreiten und die Wirtszellen mit der Besiedlung abtöten. In späten Stadien der Infektion bilden sich Acervuli (Fruchtkörper) die neue Konidien produzieren.

C. higginsianum ist haploid und kann im Gegensatz zu obligat biotrophen Pathogenen mittels

eines modifizierten Agrobacterium tumefaciens Transformationsprotokolls (Huser et al. 2009;

Korn et al., 2015) genetisch manipuliert werden. Die Genome beider Interaktionspartner des

Pathosystems wurden sequenziert (O’Connell et al., 2012; The Arabidopsis Genome

Initiative, 2000) und zusätzliche Stadien-spezifische Expressionsdaten während der Infektion

sind verfügbar (O’Connell et al., 2012; Takahara et al., 2009). Für A. thaliana existieren

zudem große Datenbanken mit verfügbaren T-DNA Insertionsmutanten und Ökotypen wie

z.B. die Mutantenkollektion des Arabidopsis Biological Ressource Center mit über einer

Million Einträgen.

1.1.3 Colletotrichum sp. bilden mit Appressorien spezialisierte Infektionsstrukturen aus

Asexuelle Konidien werden über relativ kurze Entfernungen durch Wind und Regentropfen

übertragen. Innerhalb von Sekunden nach Kontakt mit der Pflanze beginnen Konidien von C.

graminicola mit der ersten Phase der Adhäsion (Mercure et al., 1994a). Dafür scheint die

Sporenhülle aus gebundenen hydrophoben Glykoproteinen (Hughes et al., 1999) eine

wichtige Rolle zu spielen. Ein Entfernen oder Blockieren dieser Proteine von C. musae und

C. graminicola hat den Verlust der Adhäsion zur Folge (Mercure et al., 1994b; Sela-Buurlage

et al., 1991). In der zweiten Phase der Adhäsion werden nach ca. 30 Minuten des initialen

Kontaktes mit der Pflanzenoberfläche aktiv Proteine synthetisiert, die sich als extrazelluläre

Matrix um Konidien und Keimschläuchen von mehreren Colletotrichum Spezies anlagern

(Jones et al., 1995; Mercure et al., 1995). Mittels monoklonalen Antikörpern konnte für C.

lindemuthianum gezeigt werden, dass diese Matrix reich an Glykoproteinen ist und

vermutlich der Adhäsion dient (Hutchison et al., 2002).

Für die Infektion der Wirtszelle werden spezialisierte Infektionsstrukturen ausgebildet, die so

genannten Appressorien. Wichtige Signale für die Induktion der Keimung der Konidien sind

dabei zu einem die Beschaffenheit der Oberfläche (Kolattukudy et al., 1995; Lapp and

Skoropad, 1978) und zum anderen das Vorhandensein von spezifischen chemischen

Signalen (Parbery and Blakeman, 1978; Stahmann, 1972). Hydrophobizität und Härte der

Oberfläche sind von besonderer Bedeutung, so kann die Appressorienbildung auch auf

artifiziellen Oberflächen wie z.B. auf Petrischalen oder Glas induziert werden. Für das

10

ebenfalls Appressorien-bildende, phylogenetisch verwandte Pathogen aus der Familie der

Sordariaceae Magnaporthe grisea, konnte gezeigt werden, dass die Erkennung

extrazellulärer Signale eine cAMP (zyklisches AMP) regulierte Signalkaskade auslöst und

damit die Appressorienbildung induziert (Lee and Dean, 1993). Eine induzierende Wirkung

von cAMP wurde ebenfalls für C. lagenarium (Yamauchi et al., 2004) und C. trifolii (Yang and

Dickman, 1997) beobachteten, wohingegen eine Zugabe von cAMP die Appressorienbildung

von C. higginsianum inhibiert (Diplomarbeit Martin Korn). In der frühen Phase der

Appressorienbildung scheinen zusätzlich Calcium/Calmodulin-abhängige Signalsysteme von

Bedeutung zu sein, da die Zugabe von Ca2+-Chelatoren wie EGTA oder die Inhibierung von

Calmodulin eine hemmende Wirkung auf die Appressorienbildung von Colletotrichum

gloeosporioides (Uhm et al., 2003), C. trifolii (Warwar and Dickman, 1996) und Magnaporthe

grisea (Liu and Kolattukudy, 1999) haben. Für die weitere Differenzierung der Appressorien

spielen MAPK (mitogen activated protein kinase) Signalkaskaden eine bedeutende Rolle

(Zhao et al., 2007). So sind die entsprechenden Orthologe der MAP-Kinase Fus3p der Hefe

in Magnaporthe grisea (Pmk1) essentiell für die Differenzierung von Appressorien (Xu and

Hamer, 1996), wohingegen die MAP-Kinase Cmk1 aus C. lagenarium bereits für die

Keimung notwendig ist (Takano et al., 2000). Des Weiteren sind Orthologe der MAP-Kinase

Mpk1p, die in Hefe unter anderen in der Regulation der Zellwandintegrität beteiligt ist (Lee et

al., 1993) ebenfalls für die Infektion notwendig. So ist Maf1 in C. lagenarium (Kojima et al.,

2002) für die Appressorienbildung bzw. Mps1 in M. grisea (Xu et al., 1998) für die

Penetrationsfähigkeit der Appressorien essentiell. Potentielle downstream targets der MAPK-

Signalkaskaden sind unter anderen Gene, die für die Generierung des hohen Turgors

notwendig sind, wie z.B. Enzyme Fettstoffwechsels (Thines et al., 2000). Messungen des

Turgordruckes in Appressorien ergaben Werte von bis zu 8 MPa für Magnaporthe grisea

(Howard et al., 1991), 2,6 MPa für Colletotrichum kahawae (Chen et al., 2004) und 5,4 MPa

für C. graminicola (Ludwig et al., 2014). Diese hohen Drücke werden durch die Einlagerung

von Osmolyten und den dadurch hervorgerufenen Einstrom von Wasser erreicht. Dabei wird

angenommen, dass Glycerin das Hauptosmolyt darstellt und in Konzentrationen bis 3 M in

Appressorien vorliegt (Jong et al., 1997; Money and Howard, 1996). Um diesen hohen

Turgor zu erreichen ist es allerdings erforderlich ein Ausströmen des eingelagerten

Osmolytes zu verhindern. Diese Aufgabe wird durch eine Melaninschicht zwischen der

Zellwand und der Plasmamembran wahrgenommen (Money, 1997). Melanine sind dabei

dunkle, hochmolekulare Pigmente, die durch oxidative Phosphorylierung phenolischer

Verbindungen entstehen (Jacobson, 2000), wodurch die typische dunkle Färbung des

Appressoriums zustande kommt. Diese Melaninschicht ist impermeabel für Glycerin aber für

Wasser durchlässig (Howard and Ferrari, 1989; Jong et al., 1997), womit eine Diffusion des

Osmolytes verhindert wird. An der Penetrationspore zwischen Appressorium und Substrat

11

befindet sich dagegen kein Melanin, wodurch der Turgor gegen die zu penetrierende

Wirtszelle gerichtet wird. Mutanten von M. grisea und C. higginsianum mit Defekten in der

Melanisierung von Appressorien zeigen eine sehr stark reduzierte Pathogenität (Chumley,

1990; Huser et al., 2009; Korn et al., 2015). Die chemische Inhibierung der

Melaninbiosynthese von M. grisea durch Tricyclazol (PESTANAL) hat ebenfalls den Verlust

der Pathogenität zur Folge (Woloshuk et al., 1980), was die Wichtigkeit von Melanin

verdeutlicht.

1.1.4 Penetration der Wirtszelle und Etablierung der biotrophen Phase

Nach der vollständigen Differenzierung des Appressoriums beginnt sich an der

Penetrationspore eine Penetrationshyphe zu bilden. Für C. higginsianum konnte gezeigt

werden, dass die Penetrationspore zudem ein Ort der gezielten lokalen Freisetzung einer

Vielzahl von putativen Effektoren ist (Kleemann et al., 2012). Ob und auf welche Art diese

einen Einfluss auf die pflanzliche Abwehr ausüben ist allerdings noch nicht geklärt. Die

pflanzliche Cutikula mit ihrer Wachs-und Cutinschicht stellt die erste Barriere gegen die

Penetration dar. In phytopathogenen Pilzen ist die Sekretion von Cutinasen von

unterschiedlicher Bedeutung. Für Fusarium solani und Colletotrichum lagenarium scheinen

sie für die Infektion keine Rolle zu spielen, da eine Inhibition bzw. Knockout der Cutinasen

keinen Effekt auf die Penetration der jeweiligen Wirtspflanzen hat (Bonnen and

Hammerschmidt, 1989; Stahl and Schäfer, 1992). Gegenteilige Ergebnisse wurden

allerdings für Colletotrichum gloeosporioides (Dickman and Patil, 1986) und für Magnaporthe

grisea (Skamnioti and Gurr, 2007) erzielt, da in diesen Pathogenen Cutinasen für die volle

Virulenz notwendig sind. Dabei scheint Cut2 aus M. grisea eher eine Funktion im Erkennen

der pflanzlichen Cutikula zu erfüllen da entsprechende Knockoutmutanten Defekte in der

Differenzierung von Appressorien aufweisen. Des Weiteren besitzen phytopathogene Pilze

eine Reihe weiterer lytischer Enzyme wie Zellulasen und Pektinasen (Wattad et al., 1994).

So besitzt C. higginsianum 86 Proteine mit potentieller Pektinase-Aktivität und eine sehr

große Anzahl von carbohydrate-active enzymes (CAZymes) deren Expression während der

Appressorienbildung induziert wird (O’Connell et al., 2012).

Nach der Penetration wächst die Penetrationshyphe von C. higginsianum noch einige

Mikrometer in die Wirtszelle hinein und wird durch ein Septum von der sich bildenden

Primärhyphe abgetrennt (Connell et al., 2004). Die Primärhyphen von C. higginsianum

invaginieren, ähnlich wie Haustorien biotropher Pathogene, die Plasmamembran der

Wirtszelle und sind auf die erste infizierte Zelle beschränkt (Connell et al., 2004; Latunde-

Dada et al., 1996). Im Gegensatz zu Haustorien hat die Zellwand von Primärhyphen von C.

higginsianum einen engen Kontakt mit der Wirtszelle, ohne eine Extrahaustorial Matrix

12

(EHMx) auszubilden (Connell et al., 2004) (siehe Abbildung 1.1). Für C. lagenarium konnte

zudem gezeigt werden, dass das Interface zwischen Primärhyphe und Wirtszelle nicht die

typischen strukturellen und physiologischen Spezialisierungen von biotropher Interaktionen

aufweist (O’Connell, 1987) da unter anderem die Ausbildung eines „Neckbands“ ausbleibt

(O’Connell, 1985). Mittels DAPI-Färbungen (Takahara et al., 2009) und nukleären GFP-

Fusionsproteinen (Diplomarbeit Martin Korn) konnte gezeigt werden, dass Primärhyphen von

C. higginsianum je nach Fortschritt der Entwicklung mehrere Zellkerne enthalten. Die

infizierte Wirtszelle ist während der biotrophen Phase noch intakt (Takahara et al., 2009;

Diplomarbeit Martin Korn) und hat sehr engen Kontakt mit der pilzlichen Zellwand.

Für die erfolgreiche Etablierung einer biotrophen Wechselwirkung ist es notwendig die

pflanzliche Abwehr zu unterdrücken oder zu umgehen. Biotrophe Pathogene haben dafür

spezialisierte Effektoren entwickelt. Da die biotrophe Phase essentiell für eine erfolgreiche

Infektion ist, wird angenommen, dass Primärhyphen ähnliche Effektoren besitzen müssen

wie Hyphen biotropher Pathogene. Für die Identifizierung von Genen von C. higginsianum

die spezifisch während verschiedenen Stadien der Infektion exprimiert werden, wurden

bereits umfangreiche Transkriptomanalysen durchgeführt (Kleemann et al., 2008, 2012;

O’Connell et al., 2012; Takahara et al., 2009). Während RNA aus in vitro Appressorien relativ

leicht isoliert werden kann (Kleemann et al., 2008), ist die Gewinnung von RNA aus

Primärhyphen durch ihre, im Vergleich zu der Wirts RNA, geringen Menge, problematisch

(Takahara et al., 2009). In zwei Studien wurden Bibliotheken Stadien-spezifischer ESTs

(expressed sequence tags) angelegt (Kleemann et al., 2012, O’Connell et al., 2012) welche

für die Identifizierung von potentiellen Effektorproteinen bioinformatisch analysiert wurden.

Dadurch wurden 198 ChECs (Colletotrichum higginsianum effector candidates) erhalten, die

für sekretierte Proteine kodieren und keine Homologe außerhalb der Gattung Colletotrichum

(O’Connell et al., 2012) aufweisen. Für einige der ChECs Proteine wie ChEC3 und ChEC5

konnte gezeigt werden, dass sie bei einer transienten Expression in Tabak (N. benthamiana)

den induzierten Zelltod entgegenwirken. ChEC3-exprimeirende Pseudomonas syringae

Stämme zeigten zudem eine stärkere Vermehrung in A. thaliana. Proteinfusionen einiger

ChEC Proteine wie z.B. ChEC34 mit mRFP zeigten eine lokale Akkumulation in so

genannten interfacial bodies auf der Oberfläche von Primärhyphen. Damit zeigen sie eine

ähnliche Lokalisation wie die potentiellen Effektorproteine Bas1, Bas2 und Pwl2 von

Magnaporthe grisea, welche ebenfalls an bestimmten Stellen des Raumes zwischen Wirt

und Pathogen (biotrophic interfacial complex (BICs)) akkumulieren (Khang et al., 2010). Eine

Lokalisierung von Effektoren von Magnaporthe grisea an diesen BICs korrelierte zudem mit

ihrer Translokation in das Zytoplasma des Wirtes (Khang et al., 2010). Weitere Analysen

zeigten eine starke Induktion in der Expression von Genen des Sekundärstoffwechsels

(O’Connell et al., 2012). Dabei wurde postuliert, dass diese, ähnlich wie Effektorproteine,

13

eine Rolle für die Manipulation des Wirtes spielen. In Ustilago maydis konnte mit Srt1 ein

hoch-affiner Saccharose-Transporter identifiziert werden (Wahl et al., 2010), der aufgrund

seines sehr niedrigen KM-Wertes kompetitiv Saccharose aus dem Apoplasten des Wirtes

aufnehmen kann und somit die Versorgung des Pathogens sicherstellt. Im Gegensatz dazu

ist die Nährstoffversorgung während der biotrophen Phase von Colletotrichum higginsianum

noch weitgehend ungeklärt. In Transkriptomanalysen konnten keine Auffälligkeiten in der

Genexpression von Transportern beobachtet werden (O’Connell et al., 2012), die einen

Rückschluss auf bevorzugte Nährstoffe zulassen. In C. graminicola wurde die Expression

von fünf Hexosetransportern während der Infektion charakterisiert (Lingner et al., 2011) aber

ihre Rolle für die Infektion nicht untersucht.

1.1.5 Nekrotrophe Phase

Circa drei Tage nach der Infektion beginnt C. higginsianum mit der Bildung sekundärer

Hyphen und geht damit in die nekrotrophe Phase über. Die erste infizierte Zelle wird

während des Wechsels der Infektionsphasen wie jede weitere besiedelte Wirtszelle

abgetötet. Damit verfolgt C. higginsianum eine andere hemibiotrophe Infektionsstrategie als

C. graminicola oder M. grisea, da diese Pathogene bei der Besiedlung jeder neuen

Wirtszelle zunächst eine kurze biotrophe Phase initiieren. In der nekrotrophen Phase von C.

higginsianum wird die Expression von 44 putativen Proteasen und 146 Enzymen die den

Abbau bzw. die Synthese von Kohlenhydraten katalysieren (carbohydrate-active enzymes)

induziert (O’Connell et al., 2012). Ebenfalls konnte gezeigt werden, dass die Expression von

75 Transporter-kodierenden Genen induziert wird, wovon 18 für Zuckertransporter kodieren.

Dies impliziert ein weites Spektrum an Kohlenstoffquellen welches durch C. higginsianum

während der Nekrotrophie aufgenommen werden kann. Die Expression von putativen

Effektoren mit möglicher inhibierender Funktion auf die pflanzliche Abwehr wird eingestellt

und durch eine neue Welle von Effektoren ersetzt (Kleemann et al., 2012). Dabei konnte

gezeigt werden, dass C. higginsianum, ähnlich wie nekrotrophe Pathogene, Zelltod

induzierende Effektoren exprimiert. So enthält das Genom beispielsweise sechs homologe

Gene deren entsprechende Proteine Ähnlichkeit zu den necrosis-and ethylene-inducing

peptide 1 (Nep1) aus Fusarium oxysporum aufweisen. Von diesen konnte für ChNlp1 gezeigt

werden, dass es spezifisch während des Wechsels zu der nekrotrophen Phase exprimiert

wird und in einer transienten Expression in Nicotiana benthamiana Zelltod induziert

(Kleemann et al., 2012).

14

1.2. Pathogen-Wirts-interaktionen

Eine kompatible Pathogen-Wirtsinteraktion ist durch die Ausbildung von

Krankheitssymptomen gekennzeichnet. Dabei ist die Pflanze gegenüber dem Pathogen

suszeptibel. Wenn Pflanzen allerdings resistent gegenüber dem Pathogen sind, handelt es

sich um inkompatible Interaktionen und es kommt zu keiner Ausbildung von Symptomen. Die

Immunität kann dabei von jeder Pflanzenzelle vermittelt werden, da im Gegensatz zu

Wirbeltieren, keine spezialisierten Immunzellen existieren. Ebenfalls gibt es kein adaptives

Immunsystem, so dass das angeborene Immunsystem die einzige Verteidigung gegenüber

Pathogenen darstellt. Das pflanzliche Abwehrsystem kann dabei in die PAMP (Pathogen

assoziierte molekulare Muster)-induzierte und Effektor-induzierte Immunantwort eingeteilt

werden.

1.2.1 Pathogene werden durch konservierte Muster erkannt welche eine Immunantwort auslösen

Die non-host (nicht-Wirts) Resistenz vermittelt die Resistenz einer Pflanzenspezies

gegenüber den meisten Pathogenen und ist die häufigste Form der Inkompatibilität (Heath,

1985). Eine der wichtigsten Mechanismen dieser Interaktion ist das Erkennen von Pathogen-

assoziierten oder Beschädigungs (damage)-assoziierten molekularen Mustern

(PAMPS/DAMPS) durch entsprechende Rezeptoren (PRR; PAMP Recognition Receptors) in

der Zellmembran. Bei PAMPS handelt es sich um konservierte mikrobielle Strukturen,

während DAMPS pflanzeneigene Bestandteile sind, die durch Pathogenbefall entstehen. Zu

typischen Beispielen bakterieller PAMPS zählen Flagellin und EF-TU. Die entsprechenden

Rezeptoren in Arabidopsis thaliana FLS2 und EFR (Gómez-Gómez and Boller, 2000;

Gómez-Gómez et al., 1999; Zipfel et al., 2006) werden als Rezeptor-ähnliche Kinasen

(receptor like kinase; RLK) bezeichnet, da sie eine extrazelluläre Rezeptordomäne und eine

intrazelluläre Kinasedomäne für die Signalweiterleitung besitzen. Als Beispiel für die

Erkennung von DAMPS konnte bisher nur WAK1 aus A. thaliana (Brutus et al., 2010)

identifiziert werden. Dieser Rezeptor erkennt Spaltprodukte des Zellwandbestandteils

Homogalacturonan die durch Pathogenbefall während der Penetration entstehen. Die

Signalweiterleitung aller bisher identifizierter PAMP/DAMP-Rezeptoren erfolgt über

intrazelluläre Kinasedomänen. Diese leiten das Signal der Ligandenbindung unter anderen

an intrazelluläre MAPK-Signalkaskaden weiter und lösen multiple Abwehrreaktionen aus.

Eine der wichtigsten und zugleich frühsten Abwehrreaktionen der PAMP-triggered Imunity

(PTI) ist die Bildung und Freisetzung von ROS (reaktive Sauerstoffspezies), spezifisch an

der Stelle der Infektion (Apostol et al., 1989). Durch die Wirkung als Oxidationsmittel können

15

dabei Pathogene direkt oder durch die Bildung oxidierter Metaboliten indirekt abgetötet

werden (Chen and Schopfer, 1999). ROS dient auch als Botenstoff und kann damit

programmierten Zelltod induzieren oder die Expression von PR-Genen (Pathogen Related)

in benachbarten Zellen regulieren (Levine et al., 1994; Tanaka et al., 2003; Torres et al.,

2005). Des Weiteren kann durch die ROS-vermittelte Quervernetzung von Glykoproteinen

die pflanzliche Zellwand verstärkt werden (Bradley et al., 1992; Lamb and Dixon, 1997). Ein

weiteres Beispiel für Zellwandverstärkungen im Rahmen der PTI ist die lokale Ablagerung

des Polysaccharides Callose an der Stelle der versuchten Penetration (Donofrio and

Delaney, 2001; Ton and Mauch-Mani, 2004; Zimmerli et al., 2000). Diese Papillen enthalten

neben Callose auch Lignin und Proteine und sollen das Eindringen des Pathogens

verhindern oder zumindest verlangsamen (Stone and Clarke., 1992).

1.2.2 Effektoren als Unterdrücker der Immunantwort

Da PAMPS wie EF-TU oft essentielle und konservierte Muster des Pathogens darstellen,

können diese nicht modifiziert werden um eine Detektion durch pflanzliche Rezeptoren zu

umgehen. Daher haben vor allem biotrophe Pathogene zum einem zytoplasmatische

Effektoren entwickelt um die Abwehrreaktion der Pflanze zu unterdrücken und zum anderen

apoplastische Effektoren um die Erkennung ihrer PAMPS zu inhibieren. Für nekrotrophe

Pathogene hingegen wären Effektoren mit Zelltod-inhibierender Wirkung nachteilig, da das

Abtöten des Wirtes Bestandteil ihrer Infektionsstrategie ist, weswegen davon auch keine

bekannt sind. Bakterielle Pathogene wie z.B. Xanthomonas, Pseudomonas und

Agrobacterium können zytoplasmatische Effektoren mittels ihres Typ III bzw. Typ IV

Sekretionssystems direkt in die Wirtszelle injizieren (Christie and Vogel, 2000; Cornelis and

Van Gijsegem, 2000). Oomyceten wie z.B. Phytophthora infestans exprimieren ebenfalls

eine Vielzahl von Effektoren, die über einen, noch nicht eindeutig identifizierten

Mechanismus (Ellis and Dodds, 2011), in die Wirtszelle gelangen (Whisson et al., 2007). Für

viele dieser Effektoren wie z.B. SNE1 (Kelley et al., 2010) und AVR3a (Bos et al., 2009) aus

Phytophthora infestans, AvrPtoB (Abramovitch et al., 2003) und HopPtoD2 (Espinosa et al.,

2003) aus Pseudomonas konnte eine Unterdrückung des Pathogen induzierten

programmierten Zelltodes des Wirtes nachgewiesen werden. Dagegen konnten bisher relativ

wenige pilzliche Effekttoren und ihre Virulenzfunktion charakterisiert werden: AvrPiz-t aus

Magnaporthe oryzae (Yoshida et al., 2009) interagiert mit der E3 Ubiquitin-Ligase APIP6 aus

Reis und hat damit eine Inhibition der PTI zur Folge (Park et al., 2012). CMU1 (Djamei et al.,

2011) und TIN2 (Tanaka et al., 2014) aus Ustilago maydis können den Stoffwechsel von

infizierten Maiszellen umprogrammieren, wodurch das Level an Salizylsäure bzw. die

Produktion von Lignin gesenkt werden um die Seneszenz der Wirtszellen zu verlangsamen

16

(Djamei et al., 2011). Im Gegensatz zu Bakterien, ist der Mechanismus der Übertragung

dieser pilzlicher Effektoren in das Zytoplasma des Wirtes unbekannt. Zudem weisen pilzliche

Effektoren keine konservierten Motive auf, wie es in Oomyceten mit dem RxLR-deeR Motiv

der Fall ist (Jiang et al., 2008; Morgan and Kamoun, 2007). Neben intrazellulären Effektoren

setzen Pathogene eine große Anzahl apoplastischer Effektoren frei. Diese können die

Aktivierung der PTI verhindern indem sie unter anderem PAMPS maskieren oder direkt mit

Wirtsproteinen interferieren.

Im Gegensatz zu Effektoren mit hemmender Wirkung auf die pflanzliche Abwehr, setzen

nekrotrophe Pathogene gezielt Proteine und Toxine frei, um den pflanzlichen Zelltod zu

induzieren. So wird bei der Infektion mit Botrytis cinerea schon während der Penetration

gezielt die Produktion von ROS induziert (Tenberge et al. 2002) um eine hypersensitive

Antwort (HR) hervorzurufen. Während der Infektion produziert Botrytis cinerea Oxalsäure

(Germeier et al. 1994) die zum einen direkt HR induzieren kann (van Kan, 2006) und zum

anderem durch die Ansäuerung die Effektivität lytischer Enzyme erhöht (Manteau et al.,

2003). Zusätzlich werden phytotoxische Metaboliten wie Botrydial (Colmenares et al., 2002)

und zwei Necrosis and Ethylen-inducing proteins (NEP) sekretiert, die den Wirt aktiv abtöten.

1.2.3. Effektor-induzierte Immunantwort

Im Gegensatz zur PTI, die eine Vielzahl von Pathogenen durch konservierte Muster erkennt,

sind die Abwehrstrategien gegen Effektoren hochspezifisch, so dass man auch von einer

Gen für Gen Interaktion spricht (Flor, 1946). Wird ein Effektor durch das entsprechende

Genprodukt eines R-Gens (Resistenzgen) erkannt, kommt es zu der so genannten ETI

(effector triggered immunity), die eine schnellere und stärkere Form der PTI darstellt (Jones

and Dangl, 2006; Tao et al., 2003) und meist den induzierten Zelltod der Wirtszelle (HR;

hypersensitive response) zur Folge hat (Greenberg and Yao, 2004). Durch die Erkennung

wird der Effektor, der ursprünglich eine Virulenzfunktion erfüllte, zu einem Avirulenz (AVR)

Faktor und hat eine inkompatible Wirts-Pathogen Interaktion zur Folge. Diese Art der

Resistenz ist nur vorhanden, wenn der Wirt das entsprechende R-Gen und das Pathogen

das entsprechende AVR-Gen exprimiert und ist somit Rassen/Kultivar spezifisch. Die

meisten R-Gene kodieren dabei für NB-LLR (nucleotide-binding site leucine-rich repeat)

Proteine. Diese erkennen mit wenigen Ausnahmen den Effektor nicht direkt (Rafiqi et al.,

2010), sondern entsprechend der Guard-Hypothese (Van der Biezen and Jones, 1998) das

durch den Effektor „veränderte Selbst“. Die effektive Abwehr der ETI führt zu einem

Selektionsdruck auf das Pathogen das AVR-Gen zu „verlieren“ oder neue Effektoren zu

besitzen, die entweder durch die vorhandenen R-Gene nicht erkannt werden oder die ETI

unterdrücken können. Die hohe Dichte von Transposons und Retrotransposons in den

17

Genomen von Pathogenen erhöht die Mutationsrate und damit die Entstehung neuer

Effektoren. Circa 10% der DNA-Sequenzen von Magnaporthe grisea und Xanthomonas

oryzae und 30% bei Phytophthora infestans (Haas et al., 2009) bestehen aus transposablen

Elementen, im Vergleich zu 3,1% in Saccharomyces cerevisiae (Kim et al., 1998).

1.3. Membrangebundene Transportproteine

Verschiedene BLAST-Analysen identifizierten eine Gesamtanzahl von 754

Membrantransporter in der Genomsequenz von C. higginsianum (O’Connell et al., 2012). Ein

großer Teil dieser Transporter gehören zu den Familien der ABC-Transporter (68) oder der

Major-Facilitator-Superfamily (363). Für viele dieser Gene konnte durch

Transkriptomanalysen eine Stadien-spezifische Expression während der Infektion von A.

thaliana gezeigt werden. So wird die Expression von 131 Transporter durch Kontakt mit dem

Wirt induziert. Der Vergleich von RNA-Seq Daten zwischen in planta Appressorien und

biotrophen Hyphen zeigte eine Induktion in der Expression von 38 Genen. Weitere 75

Transporter werden in der nekrotrophen Phase induziert (O’Connell et al., 2012).

1.3.1 P-Typ-ATPasen

P-Typ-ATPasen sind eine große Gruppe von Kationen- und Lipidtransportern, welche

entsprechend ihrer Substratspezifität in fünf Klassen (I –V) mit jeweiligen Unterklassen (A/B)

eingeteilt werden (Axelsen and Palmgren, 1998). In Tabelle 1.2 sind die einzelnen Klassen

mit ihrem entsprechenden Substrat aufgeführt.

Tabelle 1.2: Klassifizierung von P-Typ ATPasen

Klasse Unterklasse Substrat

Typ 1 A K+

B Cu2+

Typ 2 A Ca2+

B Ca2+

C Na+/K+; H+/K+

D Ca2+, Na+

Typ 3 A H+

B Mg2+

Typ 4 Phospholipide

Typ 5 unbekannt

18

In einer Vielzahl von Pathosystemen konnte gezeigt werden, dass P-Typ ATPasen eine

wichtige Rolle für die Pathogenität einnehmen. So sind z.B. die Aminophospholipid

Translokasen (APTs) MgApt2 und Pde1, die als integrale Membranproteine am

Vesikeltransport beteiligt sind, essentiell für die Pathogenität von Magnaporthe oryzae

(Balhadère and Talbot, 2001; Gilbert et al., 2006). Zudem konnte für den Kupfer-Transporter

Clap1 aus C. lindemuthianum eine Beteiligung an der Appressorienbildung gezeigt werden

(Parisot et al., 2002).

Durch Vergleich von mehreren Kristallstrukturen von P-Typ-ATPasen (Kühlbrandt, Zeelen, &

Dietrich, 2002; Morth et al., 2007; Toyoshima, Nakasako, Nomura, & Ogawa, 2000) konnte

eine konservierte Domänenstruktur identifiziert werden (Morth et al., 2011; Wach, Schlesser,

& Goffeau, 1992). Die einzelnen Domänen von P-Typ-ATPasen sind dabei die A (actuator),

N (nucleotide binding), P (phosphorylation), T (transport) und die S (support) Domäne,

zusätzlich kann sich am C-bzw. am N-Terminus eine R (regulatory) Domäne befinden

(Palmgren & Nissen, 2011).

innen

außen

19

Abbildung 1.3: Domänenstruktur und Konformationswechsel von P-Typ ATPasen. (A) Schematische Darstellung der konservierten Domänenstruktur von P-Typ-ATPasen. Im Zytoplasma befinden sich die actuator (A) phoyphorylation (P) und nucleotide binding (N) Domäne. Die zehn Transmembranhelices enthalten die transport (T) und die support (S) Domäne. (B) Schematische Übersicht des Transportvorganges von P-Typ-ATPasen. In der E1 Konformation besitzt der Transporter eine hohe Affinität für das Substrat und bindet es im Zytoplasma. Durch die Spaltung von ATP wechselt der Transporter in die E2 Form. Die hochaffine Bindetasche geht dadurch verloren und das zu transportierende Ion wird außerhalb der Zelle freigesetzt. Im extrazellulären Raum werden Gegenionen gebunden und deren Freisetzung hat die erneuten Konformationsänderungen zu der E1 Form zur Folge. Abbildung wurde in abgeänderter Form übernommen aus (Palmgren and Nissen, 2011)

Ein großer Teil des Proteins befindet sich im Zytoplasma (A, N, P) und nur ein kleiner Teil im

extrazytosolischen Raum (siehe Abbildung 1.3A). Während jedes Transportzyklus wird die P-

Domäne an einem konservierten Asparaginsäure-Rest durch die N-Domäne phosphoryliert

und anschließend durch die A-Domäne dephosphoryliert. Dabei agiert die N-Domäne als

Proteinkinase, die A-Domäne als Proteinphosphatase und die P-Domäne dient beiden als

Substrat. Die Spaltung von ATP stellt, die für den Transport benötige, Energie bereit indem

chemische Energie in kinetische Energie für die Bewegung der A-Domäne umgewandelt

wird. Für den Transportprozess wird angenommen, dass sich die Bindetasche in der Mitte

der T-Domänen befindet und zwei verschiedene Konformationen mit unterschiedlichen

Affinitäten für die zu transportierenden Ionen aufweist (Post et al., 1969; Whittam and

Wheeler, 1970). Die E1 Konformation zeigt eine hohe Affinität zum Substrat und weist auf

die zytosolische Seite. In der E2-Form ist die Affinität stark reduziert und die Bindetasche

zeigt auf die andere Seite der Membran. Der Wechsel dieser Konformationen ermöglichen

die Bindung der Ionen im Zytoplasma und die Freisetzung außerhalb der Zelle und ist an die

Phosphorylierung bzw. Dephosphorylierung gekoppelt. Die Bindung des Substrates generiert

eine Bindestelle für Magnesium nahe dem konservierten Asparaginsäure-Rest und

ermöglicht dadurch dessen Phosphorylierung. Phosphorylierung der P-Domäne hat eine 90

Grad Rotation der A-Domäne zur Folge. Diese Konformationsänderung vermittelt den

Übergang von E1-P zu der E2-P Form und ist der Geschwindigkeits-limitierende Schritt des

Transportes. Die hoch-affine Substratbindestelle wird durch die Drehung zerstört und es

öffnet sich eine Ionen Austrittsstelle auf der anderen Seite der Membran. Des Weiteren

kommt das TGE-Motiv der A-Domäne in der Nähe der Phosphorylierungsstelle. Durch die

Bindung von Gegenionen wie z.B. Kalium für die Na+/K+-Pumpe kommt es zu eine weiteren

Bewegung der A-Domäne und der Abstand des TGE-Motivs zu dem phosphorylierten

Asparaginsäure-Rest ist klein genug um die Dephosphorylierung einzuleiten. Ein

Wassermolekül wird koordiniert gebunden und führt einen nucleophilen Angriff auf das

gebundene Phosphat aus. Die Dephosphorylierung und die Freisetzung des Phosphats

haben eine Rückbewegung der A-Domäne zur Folge und damit den Übergang von E2 zu der

E1 Form. Die Bindestelle der Gegenionen wird zerstört und es öffnet sich ein Austrittskanal

auf der zytoplasmatischen Seite.

20

1.3.2 Die Plasmamembran-gebundene Protonenpumpe

Von besonderer Bedeutung sind vor allem die Na+/K+ und die H+-ATPase da diese als

primäre aktive Transporter das Plasmamembranpotential aufbauen was von sekundär

aktiven Transporter verwendet wird. In tierischen Zellen transportiert der Na+/K+-Transporter

bei jedem Transportprozess drei Na+-Ionen nach außen und importiert zwei K+-Ionen in das

Zytoplasma. Die Plasmamembran Protonenpumpe von Pflanzen und Pilzen transportiert

hingegen unter der Spaltung von ATP nur ein einzelnes Protonen aus dem Zytoplasma

(Perlin et al., 1986) und verbrauchen damit bis zu 40% des zellulären ATPs (Gradmann et

al., 1978). Beide Transporter erzeugen einen Ladungs-und Konzentrationsgradient über die

Plasmamembran was zu einem Membranpotential von -30 bis -70 mV für die Na+/K+-Pumpe

und bis zu -300 mV für die H+-Pumpe führt (Neurospora crassa -200 mV (Slayman, 1965)).

In Saccharomyces cerevisiae und Schizosaccharomyces pombe konnte jeweils eine

Hauptprotonenpumpe (Pma1) identifiziert werden (Ghislain et al., 1987; Serrano et al.,

1986). Beide Organsimen besitzen allerdings noch eine zweite Protonenpumpe (Pma2)

(Ghislain and Goffeau, 1991; Schlesser et al., 1988) mit noch ungeklärter physiologischer

Funktion. Pflanzen besitzen hingegen mehrere Protonenpumpen (elf in A. thaliana, sieben in

Tomate und Tabak) die sich in Expression (Harper et al., 1994) und katalytischen

Eigenschaften (Palmgren and Christensen, 1994) unterscheiden und vermutlich somit eine

differenzielle Expression der verschiedenen Isoformen in verschiedenen Zelltypen erlauben.

Die Plasmamembran gebundene Protonenpumpe besitzt einige Besonderheiten im Aufbau,

so importiert sie keine Gegenionen und weist eine komplexe Regulation auf. In der

Substratbindetasche dient ein Asparagin als Protonenakzeptor dessen pKA durch eine

Asparaginsäure moduliert wird (Buch-Pedersen et al., 2009; Pedersen et al., 2007).

Bewegungen der A-Domäne regulieren den Abstand der beiden Aminosäuren und dadurch

auch die Bindung bzw. Freigabe des Protons. Da keine Gegenionen transportiert werden,

dient vermutlich ein positiv-geladener Arginin-Rest zur Blockierung der Bindetasche nach der

Freisetzung des Protons (Pedersen et al., 2007).

21

1.4. Ziel dieser Arbeit

Für das Arabidopsis thaliana – Colletotrichum higginsianum Pathosystems sollten

Pathogenitätsfaktoren identifiziert werden. Dies geschah zu einem durch die Konstruktion

und Analyse von T-DNA Insertionsmutanten von C. higginsianum und zum anderen durch

die Untersuchung von homologen Genen von bereits in anderen Pathosystemen

beschriebenen Pathogenitätsfaktoren. Durch die Etablierung eines Systems für Homologe

Rekombination in C. higginsianum sollten die, im Screening von T-DNA Insertionsmutanten

identifizierten Gene und potentielle Orthologe zu beschriebenen Virulenzfaktoren gezielt

ausgeschaltet werden und ihre Rolle für das C. higginsianum- A. thaliana Pathosystem

untersucht werden.

22

2. Resultate

2.1 Etablierung eines Systems für homologe Rekombination in Colletotrichum higginsianum

Für die Identifizierung von C. higginsianum Pathogenitätsfaktoren für die Infektion von A.

thaliana werden in der Arbeitsgruppe Koch zwei verschiedene Herangehensweisen

verwendet. Zum einen wurde durch ATMT eine Kollektion von Insertionsmutanten etabliert

um Pathogenitätsmutanten zu identifizieren. Zum anderen werden über bioinformatische

Vergleiche Kandidatengene identifiziert, deren Funktion getestet werden soll. Der Gen-

Knockout ist dafür eine der effizientesten Methoden und beruht auf der Integration exogener

DNA in das Genom durch Enzyme der homologen Rekombination. Durch Auswahl

flankierender Homologiebereiche kann der Insertionsort exogener DNA im Genom bestimmt

werden und ermöglicht damit den gezielten Knockout von Genen. In den Modellorganismen

Saccharomyces cerevisiae und Schizosaccharomyces pombe reichen bereits 100

Basenpaar lange flankierende Homologiebereiche aus um Zielgene effizient durch eine

Markerkassette zu ersetzten (Bähler et al., 1998; Baudin et al., 1993). Die Integration

exogener DNA beruht auf der Reparaturmaschinerie von DNA-Doppelstrangbrüchen

(Shrivastav et al., 2008) durch zwei unabhängige und konkurrierende

Reparaturmechanismen (Van Dyck et al., 1999; Shrivastav et al., 2008). Homologe

Rekombination erfordert die Interaktion von homologen Sequenzbereichen doppelsträngiger

DNA und ermöglicht damit targeted gene knockouts. Die Reparatur von DNA-

Doppelstrangbrüchen mittels Non-homologous end-joining (NHEJ) basiert hingegen auf der

direkten Ligation von DNA-Doppelsträngen, unabhängig von dem Vorhandensein homologer

Sequenzen. NHEJ erfordert die Bindung des Ku70-Ku80 Heterodimers an den Enden des

DNA-Doppelstrangbruches (Walker et al., 2001), wodurch proximale DNA-Enden überbrückt

(Cary et al., 1997) und weitere Enzyme rekrutiert werden. Darunter fallen die DNA-

abhängige Proteinkinase (DNA-PKcs) und DNA-Ligase IV (Ramsden and Gellert, 1998),

welche die Reparatur des Doppelstrangbruches katalysieren. Bei der Transformation mittels

Agrobakterien kann NHEJ für zufällige Insertionsmutagenesen ausgenutzt werden, da die T-

DNA in zufälligen Stellen im Genom inseriert wird (Bundock et al., 2002; Michielse et al.,

2005). DNA mit homologen Sequenzen hingegen kann sowohl durch Doppelcrossover

homolog rekombinieren, als auch durch NHEJ ektopisch integriert werden. Dies verhindert

oft gezielte Genmodifikationen (Weld et al., 2006). Im Gegensatz zu der Situation in Hefe, ist

in den meisten filamentösen Pilzen NHEJ der bevorzugte Reparaturmechanismus und

dadurch Gene-Targeting wenig effektiv (Weld et al., 2006). Um dennoch Knockoutmutanten

zu erhalten muss die Länge der verwendeten Homologiebereiche vergrößert (ca. 1000 bp)

23

und eine Vielzahl von Transformanten untersucht werden (Davidson et al., 2000). Um die

Rate der Prozessierung exogener DNA durch homologe Rekombination im Vergleich zu

NHEJ zu erhöhen, kann zum einen die Expression von Genen der homologen

Rekombination erhöht werden oder zum anderen die Expression von Genen des NHEJ

Mechanismus inhibiert werden. Homologe Rekombination in S. cerevisiae ist abhängig von

Rad51 (Shinohara et al., 1992). Die Überexpression des Rad51 Homologs uvsC in

Aspergillus nidulans hatte eine erhöhte Rate des Gene-Targetings zur Folge (Natsume et al.,

2004). Diese Überexpression führte allerdings auch zu einem verringerten Wachstum,

wodurch diese Herangehensweise wenig geeignet erscheint. Die Inaktivierung von Ku70

bzw. Ku80 hat eine Inhibition des NHEJ Reparaturmechanismus zur Folge. Dadurch wird

exogene DNA bevorzugt mittels homologer Rekombination integriert. Dies konnte zunächst

für Neurospora crassa (Ninomiya et al., 2004) gezeigt werden und anschließend für weitere

filamentöse Pilze wie zum Beispiel für Magnaporthe grisea (Landraud et al., 2008),

Aspergillus sojae und Aspergillus oryzae (Takahashi et al., 2006) bestätigt werden. Die

Deletion von ChKU70 aus Colletotrichum higginsianum (Ushimaru et al., 2010) hatte

ebenfalls eine Erhöhung der Effizienz des Gene-Targetings zur Folge, ohne dabei einen

Effekt auf das Wachstum oder die Pathogenität zu haben. Im Rahmen dieser Arbeit wurden

daher ChKU80 Deletionsmutanten hergestellt um gezielte Genmodifikationen wie z.B.

Knockouts in C. higginsianum zu ermöglichen.

2.1.1 Identifizierung von ChKu80

ChKu80 wurde mittels BLAST-Analysen (MPZI Colletotrichum higginsianum database

http:/gbrowse.mpiz-koeln.mpg.de/cgi-bin/gbrowse/colletotrichum_higginsianum_ public/) mit

dem Magnaporthe grisea Ku80 Ortholog MgKU80 (XP_365937.1) als „query“ Suchsequenz

identifiziert. Das entsprechende Protein (CH063_02085) hat eine Länge 730 Aminosäuren,

eine molekulare Masse von 80,4 kDa und weist dabei 59% Sequenzidentität mit MgKu80

und 55% Identität mit dem Ku80 Protein aus Neurospora crassa (NcKu80; EAA27151.3) auf

(siehe auch Abbildung 2.1). Chku80 zeigt damit vergleichbare Ähnlichkeiten wie ChKu70 mit

den entsprechen Ku70 Proteinen N. crassa mus-51 (62% Identität; NCU08290) und M.

grisea (51% Identität; MGG_01512.2) (Ushimaru et al., 2010). Des Weiteren zeigt ChKu80

19% Identität mit den Ku80 Ortholog Xrcc5 (NP_033559.2) der Maus und 18% Identität mit

dem entsprechenden Ku80-Protein von A. thaliana (NP_564520.1). Ein Alignment mit Yku80

aus S. cerevisiae ergab nur 12% identische Aminosäuren, wobei Ku80 der Hefe (S.

cerevisiae) 100 Aminosäuren kürzer ist als alle oben aufgeführten Ku80 Proteine. Eine

Analyse der Proteindomänen von ChKu80 mittels ConservedDomainSearch (Marchler-Bauer

24

et al., 2011) und InterProScan (Jones et al., 2014) zeigte die starke konservierte Ku-

Domänenstruktur (Abbildung 2.1).

Abbildung 2.1: Alignment von Ku80 Proteinen. Dargestellt ist ein Alignment von Ku80 Proteinen aus C. higginsianum (ChKU80; CH063_02085), Neurospora crassa (NcKu80; EAA27151.3) und Magnaporthe grisea (MgKu80; GGTG_01813). Konservierte Domänen in ChKu80 sind farbig markiert. Grün: von Willebrand factor type A (vWA) domain (cl00057) mit 3,41e-30; Rot: Ku-core domain, Ku80 subfamily (cd00873) mit 1,16e-99; Blau: Ku C-terminal domain like (pfam08785) mit 1,27e-10

Ku ist ein Heterodimer aus Ku70 und Ku80, die in Eukaryonten drei strukturell ähnliche

Domänen besitzen und als symmetrische Ringstruktur zwei Helixwindungen der DNA

umschließen (Walker et al., 2001). Der N-Terminus von ChKu80 zeigt Ähnlichkeiten mit einer

Van Willebrand Faktor Typ A Domäne (vWA domain; cl00057; 3,41e-30), die Protein-Protein

Interaktionen vermittelt (Whittaker and Hynes, 2002) und unter anderen mit für die

Dimerisierung von Ku70-Ku80 zuständig ist (Singleton et al., 1997). Ein großer, zentraler Teil

von Ku80 wird von der Ku-core Domäne (cd00873; 1,16e-99) eingenommen, welche die

DNA-Bindedomäne enthält (Walker et al., 2001). Zudem vermittelt diese Domäne Protein-

Protein Interaktionen mit chromosomalen Proteinen und ist essentiell für die Dimerbildung

25

(Aravind and Koonin, 2001). Ku80 Proteine enthalten im Gegensatz zu Ku70 Proteinen am

C-Terminus eine dritte Domäne (Ku C terminal domain; pfam08785; 1,27e-10), welche für

die Bindung von DNA-PKcs zuständig ist (Harris et al., 2004). Da in S. cerevisiae andere

Proteine die Funktion von DNA-PKcs erfüllen (Chen et al., 2001), erklärt sich das Fehlen

dieser Domäne in Ku80 der Hefe und die damit verbundene, im Vergleich zu ChKu80,

verringerte Größe des Proteins.

2.1.2 Etablierung der Nourseothricin-Resistenz als Selektionsmarker für die Transformation von C. higginsianum

Für die Transformation von C. higginsianum werden in der Arbeitsgruppe Koch routinemäßig

binäre Vektoren auf Basis von pPK2 (Covert et al., 2001) verwendet. Die T-DNA dieses

Vektors kodiert als Selektionsmarker eine Resistenz gegen Hygromycin unter der Kontrolle

des GAPDH Promotors aus Aspergillus nidulans (siehe Abb. 2.2A). Es sollte daher ein

weiterer dominanter Selektionsmarker für C. higginsianum etabliert werden. Die Wahl fiel

dabei auf die Nourseothricin-Resistenz (Nourseothricin Acetyltransferase; embl X73149.1)

aus Streptomyces noursei. Nourseothricin (NTC, clonNAT) ist ein Aminoglykosid-

Antibiotikum und hemmt spezifisch die Poteinbiosynthese. Die ClonNAT-Resistenz wurde

bereits erfolgreich unter anderem für die Selektion von Saccharomyces cerevisiae (100

µg/ml clonNAT) (Goldstein and McCusker, 1999) und Ustilago maydis (75 µg/ml clonNAT)

eingesetzt (Kojic and Holloman, 2000). clonNAT inhibiert das Wachstum von C.

higginsianum auf PDA-Platten bei einer Konzentration ab 100 µg/ml vollständig (siehe

Abbildung 2.2B).

Für die Konstruktion des binären Vektors (pPN, pCK2650) mit Nourseothricin-

Resistenzkassette wurde das Nourseothricin-Resistenzgen aus pMF1-N (Brachmann et al.,

2004) unter die Kontrolle des C. higginsianum TRPC Promotors und Terminators gesetzt und

in ein pPK2-Derivat kloniert, bei dem vorher die Hygromycin-Resistenzkassette entfernt

wurde. C. higginsianum Wildtypstamm (CY5535) wurde mittels ATMT mit dem entstandenen

Plasmid pPN (pCK2650) transformiert (siehe auch Material und Methoden). Dafür wurden

zunächst kompetente Agrobakterien (BAA101) mit pPN transformiert und auf Resistenz

gegenüber Kanamycin selektioniert. Erfolgreich transformierte Agrobakterien-Stämme

wurden anschließend als Einzelkolonien in Agrobakterium Minimalmedium beimpft und für

zwei Tage inkubiert. Diese Agrobakterien Kulturen wurden mit Agrobakterium

Induktionsmedium verdünnt und für weitere sechs Stunden inkubiert. Danach wurden jeweils

100 µl der Agrobakterien Kultur und 100 µl Konidiensuspension (1x106 Konidien/ml) von C.

higginsianum Wildtypstamm CY5535 gemischt und auf Platten mit Agrobakterium

Induktionsmedium und mit einem aufgelegten Nylonfilter ausplattiert. Für die Induktion der

26

vir-Gene der Agrobakterien enthalten sowohl das flüssige Agrobakterium Induktionsmedium

als auch die Platten mit Induktionsmedium Acetosyringon, da C. higginsianum als

filamentöser Pilz dieses pflanzliche Wundsignal nicht besitzt. Nach zwei Tagen Inkubation

wurde der Nylonfilter für die Selektion von C. higginsianum auf PDA Platten mit 100 µg/ml

clonNAT umgesetzt. Nach einem erneuten Umsetzten der Filter auf PDA Platten mit

clonNAT wurden nach ca. drei Tagen Kolonien sichtbar die auf selektiven Platten vereinzelt

und schließlich auf OMA-Platten propagiert wurden. Die dadurch erhaltenen Stämme (z.B.

CY5871) waren im Vergleich zum Wildtyp gegenüber clonNAT (siehe Abbildung 2.2B)

resistent, so dass die Nourseothricin-Resistenz erfolgreich als zweiter Selektionsmarker

etabliert werden konnte.

Abbildung 2.2: Nourseothricin als Selektionsmarker für C. higginsianum. (A) Plasmidkarte von pPN (pCK2650) mit eingezeichneter clonNAT-Resistenzkassette in der T-DNA; LB (Left Border); RB (Right Border); NatR (Nourseothricin Resistenz); KanR (Kanamycin Resistenz). (B) Jeweils 1x105 Konidien von C. higginsianum Wildtyp und des Stammes pPN-1 (CY5871) wurden auf PDA Platten mit 100 µg/ml clonNAT ausplattiert und nach drei Tagen fotografiert.

2.1.3 Generierung und Selektion von ΔChku80 Knockout Stämmen

Da homologe Rekombination exogener DNA in filamentösen Pilzen ineffizient ist (Weld et al.,

2006), wurde für die Deletion von ChKU80 eine Strategie mit zwei Selektionsmarkern

verwendet, um die anschließende Selektion von C. higginsianum Deletionsmutanten zu

erleichtern. Eine Nourseothricin-Resistenzkassette sollte mittels homologer Rekombination

einen großen Teil des ORF von ChKU80 ersetzen. Zusätzlich wurde eine zweite

Resistenzkassette in die T-DNA eingebracht welche außerhalb der homologen Bereiche

liegt. Dies ermöglichte eine Differenzierung von ektopischen T-DNA Insertionen und

Deletionen von ChKU80. Dafür wurden jeweils ca. 1100 bp lange PCR-Fragmente mit

Sequenzen upstream (-1132 bis +31) bzw. downstream (+2353 bis +3518) von ChKU80

27

flankierend um eine Nourseothricin-Resistenzkassette mit NatR unter der Kontrolle des

ChTRPC Promotors und Terminators kloniert. Um die ChKU80-Deletionsplasmide zu

generieren, wurde diese ChKU80-Deletionskassette anschließend in pPK2 kloniert. Da es

sich um eine „blunt-end“ Klonierung handelte, konnte die Deletionskassette in zwei

unterschiedlichen Orientierungen inseriert werden. In dem Plasmid pDel-Ku80-A (CK2830)

befindet sich der 5’Homologie-Bereich (HB) an der Right Border während in pDel-Ku80-B

(pCK2831) der 3’HB an die Right Border angrenzt (Korn et al., 2015). Im Falle einer

homologen Rekombination mit der T-DNA der Deletionsplasmide wird ein Großteil des ORF

(+31 bis +2353: Aminosäuren 11 bis 678) von ChKU80 durch die clonNAT-

Resistenzkassette ersetzt (siehe Abb. 2.3B). Das Hygromycin-Resistenzgen wird hingegen

nicht in das Genom inseriert, da es sich außerhalb der KU80-Homologiebereiche befindet.

Bei einem ektopischen Integrationsereignis (siehe Abb. 2.3C) werden hingegen beide

Selektionsmarker in das Genom inseriert und vermitteln Resistenzen gegen beide

Antibiotika. Dies wurde bei der Transformation von C. higginsianum ausgenutzt, indem auf

clonNAT-resistente Transformanten selektioniert wurde und anschließend solche gesucht

wurden, die Hygromycin sensitiv waren.

Abbildung 2.3: Strategie für die Deletion von ChKU80. (A) Schematische Darstellung der T-DNA des ChKU80-Deletionsplasmides pDel-Ku80-A (pCK2831) und des genomischen ChKU80 Lokus. Eine clonNAT-Resistenzkassette wird von ChKU80 Homologiebereichen flankiert, zusätzlich befindet sich eine Hygromycin-Resistenz auf der T-DNA. Die Positionen der homologen Bereiche sind relativ zu dem ersten Nukleotid von ChKU80 annotiert. 3’HB/5’HB: 3‘ bzw. 5‘ ChKU80 Homologiebereiche; hph: Hygromycin-Resistenz; NatR: clonNAT- Resistenz. (B/C) Schematisch Darstellung der möglichen Insertionen der T-DNA von pDel-Ku80-A/B. Im Falle von homologer Rekombination wird ChKU80 durch die clonNAT-Resistenzkassette ersetzt (B). Im Gegensatz dazu werden bei einem ektopischen Insertionsereignis (C) beide Selektionsmarker in das Genom inseriert.

28

Der C. higginsianum Wildtypstamm CY5535 wurde mittels ATMT mit den

Deletionsplasmiden pDel-Ku80-A/B transformiert und zunächst auf PDA mit clonNAT

selektioniert. 395 erhaltene Transformanten wurden auf PDA mit clonNAT vereinzelt und auf

Hygromycin-Resistenz getestet (siehe Abb. 2.4A). Von ca. 400 Stämmen waren 60 Stämme

gegenüber Hygromycin sensitiv (15%), von denen 14 zufällig ausgewählte Stämme erneut in

24-Well-Platten auf die Resistenz gegen Hygromycin überprüft wurden (siehe Abb. 2.4B).

Diese 14 Stämme wurden ebenfalls für weitere PCR-Analysen ausgewählt. Dafür wurde

chromosomale DNA isoliert und diese mittels PCRs auf das Vorhandensein des Hygromycin-

Resistenzgens (Primer CK2123/2124) sowie eines internen ChKU80-Fragmentes

(CK2903/2904) (siehe Abbildung 2.4C und D) überprüft.

29

Abbildung 2.4: Identifizierung von Chku80 Knockout Stämmen. C. higginsianum Wildtyp wurde mittels ATMT mit pDel-KU80-B (pCK28310) und pDel-Ku80-A (pCK2831) transformiert. (A) PDA Platten mit clonNAT bzw. Hygromycin wurden mit den erhaltenen Stämmen beimpft und das Wachstum nach drei Tagen dokumentiert. (B) Hygromycin sensitive Mutanten wurden auf 24well Platten mit 80 µg/ml Hygromycin erneut getestet. pPN ist ein Stamm aus der Transformation von CY5535 mit pPN und dient als Negativkontrolle. (C/D) PCR-Analyse von chromosomaler DNA aus 14 potentiellen Chku80 Knockout Stämmen. Mit den Primern CK2903/2904 wurde auf das Vorhandensein eines internen Fragmentes von ChKU80 getestet (C) und mit den Primerpaar CK2123/2124 auf das Vorhandensein des Hygromycin-Resistenzgens (D). Die erwarteten Größen der Banden liegen für (C) bei 650 bp und für (D) bei 596 bp. Wasser: Wasserkontrolle; M: 1 kbp Marker

Zusätzlich wurden PCRs für die Amplifikation der verwendeten 5‘ und 3‘ KU80

Homologiebereiche (HB) durchgeführt. Dabei wurden die Primer so gewählt, dass ein Primer

außerhalb der eingesetzten Homologiebereiche bindet und der zweite Primer innerhalb des

TRPC Promotors bzw. Terminators der Nourseothricin-Resistenzkassette. Eine

Zusammenfassung der Wachstumsexperimente und der PCR-Ergebnisse ist in Tabelle 2.1

dargestellt.

30

Tabelle2.1: Überprüfung des ChKU80 Knockouts

Wachstum auf PDA mit: PCR-Analysen:

Stamm clonNAT Hygromycin Hygromycin-Resistenz1

Internes ChKU80

Fragment2

5‘ HB3 3‘ HB4

Wildtyp

(5535)

- - - + - -

2831-1 + - - - + +

2831-3 + - - - + +

2831-6 + - - - + +

2831-11 + - - - + +

2831-22 + - - (+) - -

2830-1 + - + - + +

2830-8 + + + + + +

2830-9 + - - - + +

2830-14 + + + + - -

2830-15 + - + - + +

2830-17 + - - - + +

2830-19 + - + - + +

2830-25 + - - + - -

2830-29 + - - - + +

Primerkombinationen: 1CK2123/2124; 2CK2903/2904; 3CK2912/2913; 4CK2914/2915

Sieben von 14 untersuchten Stämmen zeigten die erwarteten PCR-Ergebnisse für einen

erfolgreichen Knockout von ChKU80. In zwei weiteren Stämmen (2830-1 und 2830-19)

konnte mittels PCR die homologe Rekombination im Lokus von ChKU80 nachgewiesen

werden, allerdings konnte auch das Hygromycin-Resistenzgen amplifiziert werden. Dies

könnte auf multiple Insertionen hindeuten, wobei eine homologe Rekombination und eine

ektopische Integration stattgefunden haben könnte. Unklar ist allerdings, warum diese

Stämme trotz des nachgewiesenen Hygromycin-Resistenzgens nicht auf entsprechenden

Platten wachsen konnten. Der Hygromycin-resistente Stamm 2830-14 zeigt das erwartete

Ergebnis für eine ektopische Integration der T-DNA. Für den Stamm 2830-8 konnten sowohl

das interne ChKU80 Fragment als auch beide Homologiebereiche amplifiziert werden.

Dieses widersprüchliche Ergebnis ist vermutlich durch Kontamination mit DNA von andere C.

higginsianum Stämmen zu erklären. Von den sieben Stämmen mit den erwarteten

Bandenmustern für einen erfolgreichen ChKU80-Knockout wurden 2831-3 und 2831-11 (in

31

Tabelle 2.1 rot markiert) als CY6021 und CY6022 als ΔChku80 Stämme in die

Stammsammlung aufgenommen.

Da die Gefahr multipler Insertionen der T-DNA in das Genom von C. higginsianum bestand,

wurden die ΔChku80 Stämme CY6021 und CY6022 mittels Southern-Blot Analysen auf

Einzelinsertionen überprüft. Chromosomale DNA wurde isoliert, mit PvuII bzw. XhoI

geschnitten und mit einem α-32P-dCTP markiertem PCR Fragment des Nourseothricin-

Resistenzgens (CK2656/2657) hybridisiert (siehe Abb. 2.5).

Abbildung 2.5: Southern-Blot Analyse von Chku80 Deletionsmutanten. (A) Schematische Darstellung des genomischen ChKU80 Lokus nach homologer Rekombination mit pDel-KU80-A/B (pCK2830/2831) und der daraus folgender Deletion von ChKU80. Zusätzlich sind die Abstände zwischen den Restriktionsschnittstellen von PvuII und XhoI annotiert. (B/C) Agarose-Gel nach der Gelelektrophorese (B) und der dazu gehörige Southern Blot mit XhoI bzw. PvuII geschnittener chromosomaler DNA von C. higginsianum Wildtyp (2) und den beiden ΔChku80 Mutanten CY6021 (3)

32

und CY6022 (4). Als Sonde diente ein α-32P-dCTP markiertes PCR-Fragment der ClonNAT (NatR) Resistenz. Als Positivkontrollen dienten jeweils 5 ng geschnittener pDel-Ku80-A (1): (1A) wurde mit PvuII geschnitten während (1B) mit XhoI geschnitten wurde

Beide analysierten ΔChku80 Stämme zeigten eine Bande der erwarteten Größe von 3400

Basenpaaren für den PvuII Restriktionsverdau und von 4500 Basenpaaren für XhoI und

bestätigten damit das PCR-Ergebnis. Da nur jeweils eine einzelne Bande sichtbar war, hat

folglich nur ein T-DNA Insertionsereignis im ChKU80 Lokus stattgefunden. Um sicher zu

stellen, dass nicht Teile der T-DNA oder des Vektors in das Genom inserierten und damit zu

unerwünschten Mutationen führten, wurde ein weiterer Southern-Blot mit dem gesamten

Deletionsplasmid pCK2831 als Sonde durchgeführt (nicht gezeigt). Auch bei diesen Blot

waren nur erwartete Banden sichtbar, wodurch keine weiteren Insertionen stattgefunden

haben.

Von den ursprünglich 400 Nourseothricin resistenten Transformanten waren 60 sensitiv

gegenüber Hygromycin und dadurch potentielle ΔChku80 Stämme. Von diesen wurden 14

näher untersucht und PCR-Analysen deuteten darauf hin, dass in sieben dieser Stämme

ChKU80 deletiert wurde, ohne das zusätzliche ektopische Insertionen vorlagen. Eine

Hochrechnung auf die 400 ursprünglichen Transformanten ergibt somit eine Rate von ca.

7,5% für den Knockout von ChKU80.

2.1.4 Der ΔChku80 Stamm CY6021 zeigt im Vergleich zum Wildtyp keine phänotypischen Veränderungen

Die erstellten ΔChku80 Knockoutstämme sollten eine effiziente Methode für gezielte

Modifikation von Genen mittels homologer Rekombination ermöglichen. Da die Stämme vor

allem zur Analyse von potentielle Pathogenitätsfaktoren genutzt werden sollten, war es

wichtig zu überprüfen, ob nicht der Knockout von ChKU80 schon zu einem veränderten

Phänotyp bei der Infektion von A. thaliana führte. Der ΔChku80 (CY6021) Stamm zeigte

einen ähnlichen Infektionsverlauf auf A. thaliana Col-0 Pflanzen bei Tropf- als auch bei

Sprühinfektionen wie der Wildtyp (Abb. 2.6A und B). Nach drei Tagen hatten 62% der

Appressorien Primärhyphen gebildet, wovon 11% bereits Sekundärhyphen bildeten. Einen

Tag später erhöhten sich diese Werte auf 74% für die Primärhyphenbildung sowie auf 70%

für die Bildung von Sekundärhyphen (Abb. 2.6C). Es wurde ebenfalls die Induktion

pflanzliche Abwehrreaktionen während der Infektion mittels Diaminobenzidin (DAB; Färbung

von ROS) und Anilinblaufärbung (Nachweis von Callose) untersucht. Dabei zeigte sich, dass

9% der Appressorien eine Callose-Ablagerung induzierten (Abb. 2.6F) und bei 4% der

infizierten Zellen war eine DAB-Färbung sichtbar (Abb. 2.6H). Diese Werte waren etwas

33

niedriger als die beobachteten Werte für C. higginsianum Wildtyp (11,2% Callose, 6,7%

ROS; Abb. 2.6E und F).

34

Abbildung 2.6: Phänotypische Charakterisierung des ΔChku80 Stammes CY6021. (A,B) Makroskopische Symptome nach fünf Tagen einer Sprühinfektion mit jeweils 1x106 Konidien/ml von C. higginsianum Wildtyp (A) und dem ΔChku80 Stamm CY6021 (B). (C, D) Trypanblau Färbungen von A. thaliana Blätter vier Tage nach der Infektion mit C. higginsianum Wildtyp (C) und CY6021 (D). (E-H) Die Induktion pflanzlicher Abwehrreaktionen drei Tage nach der Sprühinfektion mit Wildtyp bzw. CY6021. Callose Ablagerungen wurden mit Anilinblau gefärbt (E, F) und H2O2 mit Diaminobenzidin (G, H). (I, J) In vitro Appressorienbildung auf 1,16-Hexadecandiol beschichteten Petrischalen nach14 h bei 25°C von Wildtyp (I) und dem ΔChku80 Stamm CY6021 (J). (L, M) Radiales Wachstum von CY6021 (ΔChku80) im Vergleich zum Wildtyp (WT) auf Czapek Dox (L) und PDA Platten (M) nach fünf (L) beziehungsweise drei Tagen (M). Größenmarker = 50 µm.

Die in vitro Appressorienbildung auf beschichteten Petrischalen zeigte mit ca. 98% keine

Auffälligkeiten. Form und Größe der gebildeten Appressorien waren mit denen des Wildtyps

vergleichbar (Abb. 2.6I und J). Zusätzlich wurde das vegetative Wachstum auf PDA

Vollmedium und Czapek Dox Minimal Medium Platten im Vergleich zum Wildtyp überprüft,

wobei kein Unterschied im Wachstum oder Morphologie des gebildeten Myzels festgestellt

(Abb. 2.6K und L) wurde. Somit unterscheiden sich die konstruierten ΔChku80 Stämme

phänotypisch nicht von den Wildtypstamm CY5535 und eigenen sich als Ausgangsstamm für

Konstruktion von Knockoutmutanten.

2.2 Identifizierung potentieller LysM-Effektorproteine von C. higginsianum und Untersuchung ihrer Bedeutung für die Infektion von A. thaliana

Colletotrichum higginsianum besitzt als hemibiotrophes Pathogen eine initiale biotrophe

Phase. In diesem Stadium sind die Primärhyphen auf eine Epidermiszelle begrenzt und die

Wirtszelle ist intakt (Connell et al., 2004). Der induzierte Zelltod (Hypersensitive Response,

HR) während dieser frühen Stadien der Infektion stellt einen effektiven Abwehrmechanismus

der Pflanze gegenüber biotrophe und hemibiotrophe Pathogene dar (Gilchrist, 1998; Heath,

2000). In der biotrophen Phase von C. higginsianum ist es daher vermutlich erforderlich,

ähnlich wie für biotrophe Pathogene, pflanzliche Abwehrreaktion zu vermeiden oder zu

unterdrücken (O’Connell et al., 2006). Chitin ist ein Hauptbestandteil pilzlicher Zellwände und

kann als PAMP (Pathogen assoziiertes molekulares Muster) von Pflanzen erkannt werden,

wodurch Abwehrreaktionen induziert werden (Boller, 1995; Boller et al., 2009; Lee et al.,

2008). Der A. thaliana Chitin-Rezeptor CeBIP/CERK1 enthält LysM-Domänen, welche die

Bindung an Chitin-Oligosacchariden vermitteln (Miya et al., 2007). Das Lysin Motiv (LysM)

wurde zuerst im Lysozym der Bakteriophage Φ29 entdeckt (Garvey et al., 1986). Seitdem

wurden über 4000 Proteine mit LysM-Domänen identifiziert. Darunter befinden sich vor allem

sekretierte Proteine, Membranproteine und zellwandgebundene Proteine. LysM-Domänen

haben eine Länge von 44 bis 65 Aminosäuren und binden ein großes Spektrum von

Peptidoglykane und unter anderem Chitin (Buist et al., 2008). Für den sekretierten Effektor

Ecp6 von Cladosporium fulvum konnte gezeigt werden, dass er drei LysM-Domänen enthält

die Chitin-Oligomere binden. Durch die Bindung an Ecp6 kommt es zu einer Maskierung der

35

freien Chitin-Oligomere im Apoplasten wodurch die Erkennung dieser Moleküle durch den

Wirt unterdrückt wird (de Jonge et al., 2010). Potentielle Effektorproteine mit LysM-Domänen

konnten in mehreren phytopathogenen Pilzen identifiziert werden (Bolton et al., 2008). Für

Magnaporthe oryzae Slp1 (Mentlak et al., 2012) und Mycosphaerella graminicola Mg3LysM

(Marshall et al., 2011) konnte eine Unterdrückung der Chitin-vermittelten Induktion der

pflanzlichen Abwehr gezeigt werden. In Colletotrichum lindemuthianum wurde mit dem

monoklonalen Antikörper UB25 (Naomi et al., 1994; Pain et al., 1994) und anschließenden

Immunoscreening (Perfect et al., 1998) mit Cih1 (Colletotrichum intracellular hyphae 1) ein

sekretiertes Protein mit LysM-Domänen identifiziert. UB25 bindete auch an intrazelluläre

Hyphen von C. destructivum während der Infektion von Luzerne (Perfect et al., 2000). Die

Rolle von potentiellen Effektorproteinen mit LysM-Domänen für die Pathogenität von

Colletotrichum-Arten ist allerdings noch unbekannt und sollte im Rahmen dieser Arbeit an

Hand des C. higginsianum – A. thaliana Pathosystems untersucht werden.

36

2.2.1 Identifizierung von Proteinen mit LysM-Domänen in C. higginsianum

Um Ecp6 homologe Proteine und andere Proteine mit LysM-Domänen in C. higginsianum zu

identifizieren, wurde zunächst eine Gene/Feature Search mit dem Suchwort „LysM“

(Colletotrichum Sequencing Project, Broad Institute of Harvard and MIT

(http://www.broadinstitute.org/)) durchgeführt. Damit wurden 21 Proteine (siehe Tabelle 2.2)

identifiziert, die zum großen Teil als LysM-domain containing protein annotiert waren. Mit

Hilfe von InterProScan (Jones et al., 2014) wurde anschließend die Anzahl der LysM-

Domänen bestimmt und auch gleichzeitig die automatische Annotation überprüft. Da Ecp6

und Slp1 sekretiert werden um extrazelluläre Chitin-Oligomere zu binden, wurde in den

identifizierten Sequenzen mittels SignalP (Petersen et al., 2011) nach potentiellen

Signalpeptiden gesucht (siehe Abb. 2.7A). Zudem wurden für die identifizierten Transkripte

die verfügbaren RNASeq-Daten aus verschiedenen Stadien der Infektion von C.

higginsianum analysiert (O’Connell et al., 2012). Die Reads jedes Gens in jedem Stadium

wurden relativ zu der Gesamtanzahl der Reads des entsprechenden Stadiums normalisiert.

Zum Vergleich wurde Tubulin (ChTUBα, CH063_01222) in Tabelle 2.2 aufgenommen.

Tabelle 2.2: C. higginsianum Proteine mit vorhergesagten LysM-Domänen

1Anzahl von LysM-Domänen (InterProScan); 2Vorhandensein eines Signalpeptides (SignalP); 3Mittels RNASeq bestimmte Expressionsdaten (O’Connell et al., 2012): in vitro Appressorien (VA), in planta Appressorien (PA), biotrophe Phase (BP), nekrotrophe Phase (NP); *fehlendes 5‘ oder 3‘-Ende

Protein LysM1 Länge SP2 VA3 PA3 BP3 NP3 CH063_13023 2 171 AS + 2 47 1038 1412 CH063_04445 2 177 AS + 1 125 1665 1733 CH063_04323 2 302 AS + 3 12 11 413 CH063_05398 1 271 AS - 0 12 11 33 CH063_08917 2 132 AS - 0 1 1 84 CH063_06689 1 83 AS + 1 1 5 96 CH063_02233 1 187 AS - 109 79 81 50 CH063_05984 1 264 AS* - 159 44 36 66 CH063_16043 2 144 AS - 0 1 1 0 CH063_00259 2 314 AS* + 0 1 1 0 CH063_02695 - 587 AS - 112 257 220 133 CH063_04608 - 150 AS + 0 1 1 131 CH063_04710 1 122 AS - 1 2 2 0 CH063_04951 1 107 AS - 0 1 1 0 CH063_05461 2 355 AS - 0 1 1 0 CH063_08603 1 100 AS - 1 3 3 0 CH063_11929 3 226 AS* - 1 2 2 1 CH063_12049 - 69 AS* - 0 1 1 0 CH063_13294 - 371 AS + 1 1 1 1 CH063_15796 - 272 AS* + 0 1 1 1 CH063_16015 2 377 AS* - 1 2 1 1 CH063_01222 (ChTUBα) - 451 AS - 603 752 862 2048

37

Obwohl sie durch die automatische Annotation als LysM-domain containing protein benannt

wurden, konnten in fünf Treffern mittels InterProScan keine LysM-Domänen identifiziert

werden. Sie wurden daher für weitere Analysen nicht weiter betrachtet. Für CH063_05398

wurde neben einer LysM Domäne zusätzlich eine CVNH-Domäne vorhergesagt (siehe Abb.

2.7A). Diese Domäne wurde ursprünglich in Cyanovirin-N des Cyanobakteriums Nostoc

ellipsosporum identifiziert und wird mit der Bindung von verschiedenen Zuckern in

Verbindung gebracht (Percudani et al., 2005). Leider ist die Proteinsequenz in den

Genomdaten unvollständig (fehlendes 5‘ Ende) und wurde daher nicht weiter untersucht.

Bemerkenswert war der große Anteil an Genen mit sehr schwacher Expression. 11 Gene

zeigten dabei ermittelte Werte von nur 0-3 Reads was darauf hindeutet, dass diese Gene

nicht exprimiert werden. Von den ursprünglich 21 Proteinen erfüllen nur drei die

theoretischen Voraussetzungen um potentielle LysM-Effektoren zu sein (CH063_13023,

CH063_04445, CH063_04323). Diese drei Proteine weisen wie ClCih1 aus Colletotrichum

lagenarium und MoSlp1 aus Magnaporthe grisea ein vorhergesagtes Signalpeptid und zwei

putative LysM-Domänen auf (siehe Abb. 2.7A). CH063_13023 und CH063_04445 zeigen

zudem laut RNASeq Daten eine starke Expression während der biotrophen Phase. Diese

beiden Proteine zeigten ebenfalls in reziproken BLAST-Analysen mit Cih1 aus C. lagenarium

(ClCih1) die größte Übereinstimmung auf. Sie wurden in weiteren als ChCih1 (CH63_13023)

und ChCih2 (Ch063_04454) bezeichnet. ChCih1 weist folgende Identitäten zu bereits

beschriebenen Proteinen mit LysM-Domänen auf: 57% mit Magnaporthe oryzae Slp1

(MoSlp1), 28% mit C. lagenarium Cih1 (ClCih1) und 33% mit Ecp6. Für ChCih2 ergeben sich

entsprechende Übereinstimmungen von: 41% mit MoSlp1, 38% mit ClCih1, 37% mit Ecp6

und 51% mit ChCih1 (siehe Alignment in Abb. 2.7B). Das dritte potentielle LysM-

Effektorprotein CH063_4323 weist nur 11% Identität mit ClCih1 auf und wurde daher nicht in

das Alignment in Abb. 2.7B einbezogen. Aufgrund seiner sonstigen Charakteristika wurde es

im Folgenden als ChLysM3 bezeichnet und auch weiter untersucht.

38

Abbildung 2.7: C. higginsianum Proteine mit LysM-Domänen. (A) Domänenstruktur von LysM-Proteinen. Rot: Signalpeptid; Schwarz: vorhergesagte LysM Domänen; Blau: vorhergesagte CVNH-Domänen (B) Protein Alignment von Proteinen mit vorhergesagten LysM-Domänen. Das Alignment von C. lagenarium ClCih1, C. higginsianum ChCih1 und ChCih2, Magnaporthe oryzae MoSlp1 und Cladosporium fulvum Ecp6 wurde mit Hilfe der Geneious Tree-Building Software erzeugt (ClustalW Alignment; BLOSUM cost matrix). Mittels InterProScan identifizierte LysM-Domänen sind gelb markiert.

Das Alignment von ChCih1 und ChCih2 mit ClCih1, MoSlp1 und Ecp6 zeigt, dass die

Übereinstimmungen am stärksten in den vorhergesagten LysM-Domänen sind. ChCih1 und

ChCih2 haben mit MoSlp1 die größte Ähnlichkeit, alle drei Proteine haben eine vergleichbare

Größe und zwei vorhergesagte LysM-Domänen. Im Gegensatz dazu besitzt ClCih1 ein

Abschnitt von ca. 45 Aminosäuren, der in den anderen Proteinen nicht vorhanden ist. Ecp6

besitzt als einziges der untersuchten Proteine am C-Terminus eine dritte LysM-Domäne.

B

39

2.2.2 Untersuchung der Expression und Lokalisation von ChCih1 und ChCih2

Um die Expression und Lokalisation von ChCih1 und ChCih2 während verschiedener

Stadien der Infektion von A. thaliana untersuchen zu können, wurden für beide Gene

Reportergenfusionen konstruiert. Für ChCih1 wurde dabei sowohl ein Fusionsprotein mit C-

terminalen GFP (Bachelorarbeit Katharina Pracht) in pPK2 (pPK2-Cih1-GFP) als auch ein

ChCih1-mCherry Reporterkonstrukt in pPN (pPN-Cih1-mCherry) hergestellt. ChCIH1 (ohne

Stopcodon) wurde zusammen mit 1000 bp der potentiellen Promotorregion mittels PCR

amplifiziert und in Plasmiden mit bereits vorhandenen GFP bzw. mCherry kloniert. Die

dadurch entstandenen Reporterkonstrukte wurden anschließend in pPK2 oder pPN kloniert

(sieh Abb. 2.8A und B). Der C. higginsianum Wildtypstamm CY5535 wurde mittels ATMT mit

den entsprechenden Plasmiden pPK2-Cih1-GFP (pCK2783) und pPN-Cih1-mCherry

(pCK2842) transformiert und die Expression der Fusionsproteine analysiert.

40

Abbildung 2.8: Lokalisierung und Expression von ChCih1-GFP bzw. ChCih1-mCherry. (A/B) Schematische Darstellung der T-DNA von pPK2-Cih1-GFP (pCK2783; A) und pPN-Cih1-mCherry (pCK2842; B). LB/RB: Left bzw. Right Border; Pcih1: 1000 Basenpaare der potentiellen ChCIH1 Promotorregion (C/D) Fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen (C: Durchlicht und D: GFP-Filter) von in vitro Appressorien von CY5952 (Cih1-GFP) auf beschichteten Petrischalen 12 h nach der Induktion der Appressorienbildung. (E-F) A. thaliana Col-0 Pflanzen wurden mit 1x106 Konidien/ml sprühinfiziert und nach drei bzw. vier Tagen mittels konfokaler Mikroskopie untersucht. (E/F) Infektion mit CY5951 (Cih1-GFP) nach drei (E) bzw. vier Tagen (F). (G/H) Infektion mit CY5956 (Cih1-mCherry) drei (E) bzw. vier (H) Tagen. Penetrationshyphen wurden mit weißen Pfeilen markiert.

In in vitro Appressorien konnte keine Fluoreszenz für Cih1-GFP (Abb. 2.8C) und Cih1-

mCherry (Daten nicht gezeigt) beobachtet werden. Dies ist im Einklang mit den publizierten

Expressionsdaten (O’Connell et al., 2012), die nur geringe Werte in Appressorien für ChCIH1

zeigten (siehe Tabelle 2.2). Da es sich bei Cih1-GFP und Cih1-mCherry um potentiell

sekretierte Proteine handelt, könnte allerdings auch die starke Verdünnung des Proteins im

Medium eine Detektion am Fluoreszenzmikroskop verhindern. CIH1-GFP/mCherry-

exprimierende C. higginsianum Stämme zeigten bei der Infektion von A. thaliana eine mit C.

higginsianum Wildtyp (CY5535) vergleichbare Pathogenität (Daten nicht gezeigt). Drei Tage

41

nach der Infektion war mittels konfokaler Mikroskopie eine Vielzahl von Primärhyphen mit

starker Fluoreszenz an der Peripherie der Zellen zu beobachten (siehe Abbildung 2.8E und

G). Dies ist im Einklang mit der beobachteten Bindung des ClCih1-spezifischen Antikörpers

UB25 an die Zellwand von intrazellulären Hyphen von C. lagenarium (Perfect et al., 1998).

Die Stärke des GFP bzw. mCherry –Signals entspricht auch den Ergebnissen der RNA-

Sequenzierung aus der biotrophen Phase (siehe Tabelle 2.2), die in diesem Stadium hohe

Werte aufwiesen. Im Gegensatz zu dem immunologischen Nachweis in C. lagenarium,

konnte ChCih1-GFP bzw. ChCih1-mCherry als sehr starkes Signal an Septen der Hyphen

beobachtet werden. Diese Beobachtung beruht möglicherweise auf dem Aufeinandertreffen

von zwei Zellwänden an den Septen, wodurch eine, in etwa doppelt so starke, Fluoreszenz

sichtbar war als am Rest der Zellwände. Die in planta gebildeten Appressorien zeigten

keinerlei Fluoreszenz, wohingegen die aus ihnen gebildeten Penetrationshyphen ChCIH1 zu

exprimieren schienen (Siehe Markierung in Abb. 2.8E und G). In frühen sekundären Hyphen

war ebenfalls Fluoreszenz an der Zellperipherie nachweisbar (Abb. 2.8F). Das Signal schien

allerdings schwächer zu sein als in Primärhyphen. In späten Sekundärhyphen war hingegen

keine eindeutige Fluoreszenz erkennbar, was auch durch den starken Hintergrund von

nekrotischen Gewebe zu erklären sein könnte (Abb. 2.8H).

Um zu überprüfen, ob ChCih1 ein extrazelluläres, sekretiertes Protein ist, wurde versucht

Cih1-mCherry zusammen mit einem Marker für die Plasmamembran zu exprimieren. Als

membrangebundenes Fusionsprotein diente dabei GFP mit angefügter Signalsequenz für

eine posttranskriptionale Prenylierung (CAAX-Box) des humanen K-ras (Apolloni et al., 2000)

am C-Terminus (Diplomarbeit Martin Korn). Die Nourseothricin-resistenten C. higginsianum

Stämme CY5956 und CY5957 mit starker Expression von ChCIH1-mCherry wurden mittels

ATMT mit pGFP-CAAX-A (pCK2660) bzw. pGFP-CAAX-B (pCK2661) (GFP-CAAX,

Hygromycin-Resistenzkassette) transformiert. Die erhaltenen Hygromycin-resistenten

Transformanten wurden anschließend für eine Sprühinfektion von A. thaliana Col-0 Pflanzen

verwendet, um mittels konfokaler Mikroskopie die Lokalisation von Cih1-mCherry relativ zu

der GFP-markierten Plasmamembran zu analysieren (siehe Abb. 2.9).

42

Abbildung 2.9: Cih1-mCherry zeigt keine Kolokalisation mit GFP-CAAX. A. thaliana Col-0 wurde mit C. higginsianum Stämmen mit Koexpression von Cih1-mCherry und Plasmamembran-gebundenen GFP (GFP-CAAX) infiziert. Dargestellt sind konfokale Aufnahmen dieser Infektion nach vier Tagen. Die Fluoreszenzkanäle für GFP-CAAX (GFP) und Cih1-mCherry (mCherry) sind zum einen einzeln abgebildet und zum andere als Overlay beider Kanäle.

Bei der gleichzeitigen Expression von Cih1-mCherry und GFP-CAAX ergaben sich allerdings

Probleme. Die erhaltenen Transformanten zeigten oft nur entweder GFP- oder mCherry

Fluoreszenz, wobei sich das Expressionsmuster auch in den einzelnen Zellen eines

Stammes unterscheiden konnte. In einigen Transformanten war sogar keinerlei Fluoreszenz

43

erkennbar, obwohl für die Transformation mit dem GFP-CAAX Konstrukten die Cih1-

mCherry exprimierenden Stämme CY5956 und CY5957 als Ausgangsstämme verwendet

wurden. In den wenigen Hyphen mit Expression von GFP-CAAX und Cih1-mCherry zeigten

die beiden Fusionsproteine keine Kolokalisierung (siehe Abb. 2.9). Die mCherry-Fluoreszenz

von Cih1 war deutlich außerhalb der GFP-markierten Plasmamembran lokalisiert. Daher

kann man bei ChChi1 von einem sekretierten, extrazellulären Protein ausgehen, was sich

entweder in der pilzlichen Zellwand oder zwischen pilzlicher Zellwand und Plasmamembran

der Wirtszelle befindet.

Für die Untersuchung der Lokalisation von ChCih2 wurden von Dr. Marlis Dahl C.

higginsianum Stämme mit Expression eines ChCih2-GFP Fusionsproteins zur Verfügung

gestellt. In den Stämmen CY6600 und CY6601 wird ChCih2 als Fusionsprotein mit N-

terminalen GFP unter der Kontrolle des eigenen Promotors exprimiert (500 Basenpaare).

Eine schematische Darstellung der T-DNA des für die Transformation verwendeten

Plasmides pCih2-GFP (pCK3061) ist in Abbildung 2.10A dargestellt.

44

Abbildung 2.10: Lokalisierung und Expression von ChCih2-GFP. (A) Schematische Darstellung der T-DNA von PChi2-GFP (pCK3061) LB/RB: Left bzw. Right Border; Pcih2: 500 Basenpaare potentielle ChCIH2 Promotorregion, T35S: CaMV 35S Terminator. (B-E) A. thaliana Col-0 Pflanzen wurden mit 1x106 Konidien/ml von CY6600 (B/C) bzw. CY6601 (D/E) sprühinfiziert und nach vier Tagen mittels konfokaler Mikroskopie analysiert. Größenmarker = 20 µm

Die beobachtete Expression und Lokalisation von ChCih2-GFP ähnelt dabei sehr stark der

von ChCih1-GFP bzw. ChCih1-mCherry. In Konidien und in in vitro Appressorien war

keinerlei Fluoreszenz mikroskopisch detektierbar (nicht gezeigt). Ebenfalls war bei in planta

gebildeten Appressorien keine GFP-Fluoreszenz erkennbar (siehe Abb. 2.10B-E). Cih2-GFP

war an der Peripherie von Primärhyphen und jungen Sekundärhyphen lokalisiert. Der

spätere Infektionsverlauf konnte aufgrund des starken Hintergrundes (siehe Abb. 2.10E)

nicht analysiert werden, so dass keine Aussage über die Expression von ChCih2-GFP in

Sekundärhyphen getroffen werden konnte.

45

2.2.3 C. higginsianum LysM-Proteine ChCih1, ChCih2 und ChLysM3 sind für die Infektion von A. thaliana nicht erforderlich

Das Expressionsmuster und die Lokalisierung von ChCIh1 und ChCIh2 deuteten auf eine

mögliche Rolle dieser Proteine als Effektoren während der biotrophen Phase hin. Um den

Einfluss von ChCIH1 und ChCIH2 auf die Pathogenität von C. higginsianum zu untersuchen,

wurden für beide Gene Knockout Stämme hergestellt. Das entsprechende Deletionsplasmid

für ChCIH1 pDel-Cih1 (pCK3083) wurde von Dr. Marlis Dahl zur Verfügung gestellt und

enthält eine Hygromycin-Resistenzkassette, die von je 1000 bp langen ChCIH1-

Homologiebereichen (-1028 bis -23; +675 bis +1518) flankiert wird (siehe Abb. 2.11A). Die C.

higginsianum ΔChku80 Stämme CY6021 und CY6022 wurden mittels ATMT mit pDel-Cih1

transformiert. Zehn Hygromycin-resistente Stämme aus der Transformation von CY6021 und

elf aus der Transformation von CY6022 wurden anschließend mittels PCR auf den Knockout

von ChCIH1 hin überprüft.

Abbildung 2.11: Knockout von ChCIH1 mittels homologer Rekombination. (A) Schematische Übersicht der T-DNA von pDel-Cih1 und des genomischen Lokus von ChCIH1. Die Nummerierung ist relativ zum ersten Nukleotids des ORF von ChCIH1. (B) Genomischer Lokus von ChCIH1 nach erfolgreicher homologer Rekombination mit der T-DNA von pDel-Cih1. (C/D) Chromosomale DNA von jeweils vier Hygromycin-resistenten Stämmen aus der Agrobacterium tumefaciens vermittelten Transformation von CY6021 (Spuren 1-4) und von CY6022 (Spuren 5-8) mit pDel-Cih1 wurde isoliert und mittels PCR analysiert. Die Deletion eines internes Fragmentes von ChCIH1 (485 bp) wurde mit dem Primerpaar CK2808/2809 getestet (C) und die Integration der Hygromycin-Resistenzkassette in dem ChCIH1 Lokus (1582 bp) mit dem Primerpaar CK2919/3120 (D). 1-8: Chromosomale DNA von potentiellen ΔChCih1 Stämmen; WT: Chr. DNA von C. higginsianum Wildtypstamm CY5535; K: Wasserkontrolle

46

Zu einem wurde eine PCR für ein internes ChCIH1 Fragment durchgeführt (Abb. 2.11C). Im

Falle eines erfolgreichen Knockouts werden die Primerbindestellen deletiert, so dass im

Gegensatz zu chromosomaler DNA von C. higginsianum Wildtyp, kein Fragment amplifiziert

wird. In einer zweiten PCR wurde ein Primer mit Bindestelle vor dem eingesetzten 5‘-

Homologiebereich zusammen mit einem Primer mit Bindestelle innerhalb der Hygromycin-

Resistenz verwendet. Diese Primer können nur im Falle einer erfolgreichen homologen

Rekombination mit der T-DNA von pDel-Cih1 (pCK3083) ein Fragment amplifizieren. Von

acht Stämmen sind beispielhaft die Ergebnisse der PCR-Analyse in Abbildung 2.11

dargestellt. Von den insgesamt 21 untersuchten Stämmen zeigten 18 die erwarteten PCR-

Ergebnisse für einen erfolgreichen Knockout von ChCIH1. Dabei war kein Unterschied in der

Effektivität der homologen Rekombination im zwischen den beiden verwendeten ΔChku80

Ausgangsstämmen erkennbar (jeweils ca. 90%).

Das ChCIH2-Deletionsplasmid pDel-Cih2-hyg (pCK3072) wurde von Dr. Marlis Dahl zur

Verfügung gestellt und enthält in der T-DNA eine Hygromycin-Resistenzkassette, die von

ChCIH2-Homologiebreichen flankiert wird.

Abbildung 2.12: Knockout von ChCIH2 mittels homologer Rekombination. (A) Schematische Übersicht der T-DNA des ChCIH2-Deletionsplasmides pDel-Cih2-hyg (pCK3072) und des genomischen Lokus von ChCIH2. Die Nummerierung ist relativ zum ersten Nukleotid des ORF von ChCIH2. (B) Genomischer Lokus von ChCIH2 nach erfolgreicher homologer Rekombination mit der T-DNA des Deletionsplasmides pDel-Cih2-hyg (pCK3072).

Die erhaltenen ΔChcih1 und ΔChcih2 Stämme zeigten in Bezug auf das Wachstum auf

Oatmeal- oder PDA-Platten keine Auffälligkeiten im Vergleich zu den Ausgangsstämmen

(nicht gezeigt). Da die Knockoutmutanten des homologen Proteins Ecp6 von Cladosporium

fulvum eine reduzierte Pathogenität aufwiesen, wurden die ΔChcih1 und ΔChcih2 Stämme

für Sprühinfektionen von A. thaliana verwendet.

47

48

Abbildung 2.13: Infektion von A. thaliana mit ΔChcih1 und ΔChcih2 Stämmen. A. thaliana Pflanzen wurden mit jeweils 1x106 Konidien/ml von CY6090/CY6091 (ΔChcih1), CY6144/CY6145 (ΔChcih2) und den Parentalstamm CY6021 (ΔChku80) sprühinfiziert. (A) Nach drei und vier Tagen wurden einzelne Blätter mit Trypanblau gefärbt. Zusätzlich wurde nach vier Tagen die Bildung von Krankheitssymptomen makroskopisch untersucht. (B) Für die Analyse pflanzlicher Abwehrreaktionen wurden nach drei Tagen ebenfalls einzelne infizierte Blätter mit Anilinblau und Diaminobenzidin gefärbt. Größenmarker entspricht 50 µm.

Die Ausbildung makroskopischer Symptome der untersuchten Knockoutstämme war mit

denen des parentalen ΔChku80 Stammes vergleichbar. Nach vier Tagen waren sowohl auf

mit ΔChcih1 Stämmen infizierten Pflanzen, als auch auf mit ΔChcih2 Stämmen infizierten

Pflanzen deutliche nekrotische Stellen erkennbar (siehe Abb. 2.13). In den

Trypanblaufärbungen von infizierten Blättern zeigte sich keine reduzierte Ausbildung von in

49

planta gebildeten Infektionsstrukturen. Nach drei Tagen bildeten 54% der Appressorien von

CY6021 Primärhyphen aus, von denen 19% bereits Sekundärhyphen gebildet hatten. Die

ΔChcih1-Stämme CY6090 und CY6091 wiesen nach drei Tagen eine Primärhyphenbildung

von 56% und 57% auf sowie eine entsprechende Bildung von Sekundärhyphen von 25%

bzw. 17%. Die Stämme CY6144 und CY6145 mit Deletion von ChCIH2 zeigten ähnliche

Werte von 54% und 40% für die Primärhyphenbildung und 22% bzw. 19% für die

Sekundärhyphenbildung. Ein Auszählen der Trypanblaufärbungen nach vier Tagen war

aufgrund der stark fortgeschrittenen Infektion (siehe Abb. 2.13) nicht mehr möglich.

Da für das verwandte Protein Ecp6 aus Cladosporium fulvum eine direkte Bindung von

Chitinoligomeren und damit eine Maskierung von Chitin gezeigt werden konnte (de Jonge et

al., 2010), wurde vermutet, dass ein Verlust von PAMP-maskierenden LysM-

Effektorproteinen einen Einfluss auf die Erkennung von C. higginsianum durch den Wirt

haben könnte und daraus eine, im Vergleich zum Wildtyp, gesteigerte pflanzliche Abwehr

resultiert. Die Induktion pflanzlicher Abwehrreaktionen wurden deshalb durch DAB-und

Anilinblaufärbungen untersucht (Abb. 2.13B). Die Rate induzierter Papillen betrug für die

ΔChcih1 bzw. ΔChcih2 Deletionsmutanten zwischen 4% und 7% (CY6021 Ausgangsstamm

5%) und zwischen 9% und 14% der infizierten Epidermiszellen zeigten eine DAB-Färbung

(CY6021 13%). Eine Deletion von ChCIH1 oder ChCIH2 hatte damit keinen Einfluss auf die

Pathogenität von C. higginsianum oder auf die Induktion pflanzlicher Abwehrreaktionen von

A. thaliana.

ChCih1 und ChCih2 sind sich sehr ähnlich (52% Identität), besitzen beide zwei

vorhergesagte LysM-Domänen, zeigten als GFP-Fusionspotein eine ähnliche Lokalisierung

und könnten folglich redundante Funktionen besitzen. Deshalb wurde im Rahmen der

Bachelorarbeit von Moritz Hirsch Doppelmutanten hergestellt. Dafür sollte in ΔChcih1

Knockoutstämmen ChCIH2 deletiert werden. Das entsprechende ChCIH2-Deletionsplasmid

pDel-Cih2-bar wurde unter Verwendung des pOSCAR-Systems (Paz et al., 2011) kloniert.

Da der verwendete ΔChcih1-Ausgansstamm bereits gegenüber Hygromycin und

Nourseothricin resistent war, ergab sich die Notwendigkeit der Verwendung eines dritten

Selektionsmarkers. Als Abwandlung des pOSCAR-Systems wurde daher nicht pA-hyg-

OSCAR verwendet, sondern, der von Johannes Schmidpeter, konstruierte Vektor pA-bar-

OSCAR (persönliche Mitteilung). Dieser Vektor trägt eine Bialaphos-Resistenzkassette

(Phosphinothricin Acetyltransferase unter der Kontrolle eines 379 bp langen Aspergillus

nidulans TRPC-Promotors) und erlaubt damit die Generierung von Doppelmutanten. Die

ChCIH2-Deletionsplasmide pDel-Cih2-bar 1 bzw. 2 (pCK4179/pCK4180) wurden für die

Agrobacterium tumefaciens vermittelte Transformation von ΔChcih1 (CY6091) und dessen

ChKu80-defizienten Parentalstamm CY6021 verwendet. Die Selektion der Transformanten

50

erfolgte auf PDA-Platten mit Bialaphos. Die Selektion der Transformanten erfolgte auf PDA-

Platten mit Bialaphos.

Abbildung 2.14: Generierung von ΔChcIh2 und ΔChcih1/ΔChcih2 Knockoutstämmen. (A) Schematische Übersicht der T-DNA der ChCIH2-Deletionsplasmide pDel-Cih2-bar-1/2 und des genomischen Lokus von ChCIH2. Die Nummerierung ist relativ zum ersten Nukleotid des ORF von ChCIH2. (B) Genomischer Lokus von ChCIH2 nach erfolgreicher homologer Rekombination mit der T-DNA der Deletionsplasmide pDel-Cih2-bar. (C/D) Diagnostische PCRs mit isolierter chromosomaler DNA von 12 Stämmen aus der Transformation von CY6021 bzw. CY6091 mit pDel-Cih2-bar-1/2. Die erfolgreiche Integration der Bialaphos-Resistenzkassette in dem ChCIH2-Lokus wurde mit den Primerpaaren CY4225/4116 (C) und pCK4115/4163 (D) getestet. 1-6: Stämme aus der Transformation von CY6091 mit pDel-Cih2-bar-2; 7-8: CY6021 mit pDel-Cih2-bar-1; 9-10: CY6190 mit pDel-Cih2-bar-1; 11-12 CY6021 mit pDel-Cih2-bar-2; WT: chromosomale DNA aus CY6021; -; Wasserkontrolle; M: 1 kbp DNA Marker

Für sechs von acht untersuchten Stämmen aus der Transformation von CY6091 (ΔChcih1)

mit pDel-Cih2-bar 1/2 konnte die Insertion der Bialaphos-Resistenzkassette im Lokus von

ChCIH2 mittels PCR nachgewiesen werden. Die vier untersuchten Stämme aus der

51

Transformation von CY6021 (ΔChku80) wiesen alle das erwartete PCR-Ergebnis für einen

erfolgreichen Knockout von ChCIH2 auf. Zwei ΔChcih1/ΔChcih2 Stämme (CY6360

entspricht Spur 2 und CY6363 entspricht Spur 10 in Abb. 2.14C/D) wurden zusammen mit

dem ΔChcih2-Stamm (CY6367, Spur 8 in Abb. 2.14) und der parentale Stamm CY6021 für

die Sprühinfektion von A. thaliana verwendet.

Abbildung 2.15: C. higginsianum Stämme mit Deletionen von ∆Chcih1 und ∆Chcih2 zeigen keinen Pathogenitätsdefekt auf A. thaliana. A. thaliana Pflanzen wurden mit jeweils 1x106 Konidien/ml von CY6360, CY6363 (ΔChcih1ΔChcih2), CY6372 (ΔChcih3) und CY6021 (ΔChku80) sprühinfiziert. Nach drei Tagen wurden einzelne Blätter mit Trypanblau, Anilinblau und mit DAB gefärbt. Die Bildung makroskopischer Krankheitssymptome wurde nach vier Tagen untersucht. Größenmarker = 50 µm

Die Rate der Bildung von Primärhyphen nach drei Tagen war mit der des ΔChku80 Stammes

vergleichbar (>40%). Trypanblaufärbungen von infizierten Blättern von 4 dpi zeigten ein

starkes Geflecht von Sekundärhyphen (nicht gezeigt) und ein Auszählen der gebildeten

Infektionsstrukturen war nicht mehr möglich. Die Pathogenität der Stämme CY6360 und

52

CY6363 zeigte sich auch in der Ausbildung makroskopischer Symptome nach vier Tagen,

die mit denen des Kontrollstammes (CY6021) vergleichbar waren. Die Untersuchung der

induzierten pflanzlichen Abwehr in der Form von Callose-Papillen und H2O2-Freisetzung war

in den Stämmen mit Doppelknockout von ChCIH1 und ChCIH2 nicht erhöht. In Färbungen

mit Anilinblau waren Callose-Papillen unter ca. 10% aller Appressorien sichtbar. Weder die

Stämme mit ChCIH1 und ChCIH2 Doppelknockout noch die ΔChCIH2 Einzelmutante

CY6367 zeigten mehr DAB-Färbung als der ΔChku80 Kontrollstamm (<10%). Der Knockout

beider Gene hatte keine reduzierte Pathogenität oder eine verstärkte Abwehrreaktion von A.

thaliana zur Folge. Die vermutete redundante Funktion von ChCIH1 und ChCIH2 für die

Infektion von A. thaliana konnte daher nicht bestätigt werden.

Neben ChCIH1 und ChCIH2 wurde ChLYSM3 (CH063_04323) als potentieller LysM-Effektor

identifiziert. ChLysM3 enthält zwei vorhergesagte LysM-Domänen (Interproscan), zeigt aber

nur geringe Ähnlichkeiten zu ChCih1 (11% Identität) und ChCih2 (14% Identität). Im Rahmen

der Bachelorarbeit von Moritz Hirsch wurden Chlysm3 Knockoutstämme hergestellt und

analysiert. Die dafür klonierten ChLYSM3-Deletionsplasmide pDel-LysM3-1/2

(pCK4222/pCK4223; siehe Abb. 2.16A) wurden mittels des pOSCAR-Systems hergestellt. Im

Gegensatz zu den ChCIH2-Deletionsplasmid pDel-Cih2-bar wurde eine Hygromycin-

Resistenzkassette verwendet. Daher wurden auch keine Doppelknockouts mit ChCIH1 oder

ChCIH2 erstellt. pDel-Lys3-1 und pDel-Lys3-2 wurden mittels ATMT in C. higginsianum

ΔChku80 (CY6021) transformiert. Die erhaltenen Stämme wurden auf PDA-Platten mit

Hygromycin selektioniert und mittels PCR auf den Knockout von ChLYSM3 untersucht (siehe

Abb. 2.16C)

53

54

Abbildung 2.16: Generierung und Pathogenität von C. higginsianum Stämmen mit Deletion von ChLYSM3. (A) Schematische Übersicht der T-DNA der ChLYSM3-Deletionsplasmide pDel-LysM3 und des genomischen Lokus von ChLYSM3. Die Nummerierung ist relativ zum ersten Nukleotid des ORF von ChLYSM3. (B) Genomischer Lokus von ChLYSM3 nach erfolgreicher homologer Rekombination mit der T-DNA der Deletionsplasmide pDel-Lys3 1/2. (C) Diagnostische PCRs mit isolierter chromosomaler DNA von 10 Stämmen aus der Transformation von CY6021 mit pDel-LysM3-1 (Spuren1-6) und pDel-Lys3-2 (Spuren 7-10). Die erfolgreiche Integration der Hygromycin-Resistenzkassette in dem ChLYSM3-Lokus wurde mit den Primerpaar CY4164/3262 überprüft. K: chromosomale DNA aus CY6021; -; Wasserkontrolle; M: 1 kbp DNA Marker. (D) A. thaliana Pflanzen wurden mit jeweils 1x106 Konidien/ml von CY6371, CY6373 (ΔChlysm3) und CY6021 (ΔChku80) sprühinfiziert. Nach drei und vier Tagen wurden einzelne Blätter mit Trypanblau gefärbt. Die Bildung makroskopischer Krankheitssymptome ist nach vier Tagen dargestellt. Größenmarker =50 µm

Acht von zehn der untersuchten potentiellen ΔChlysm3 Stämme zeigten das erwartete PCR-

Ergebnis für eine Integration der Hygromycin-Resistenzkassette in den ChLYSM3-Lokus

(siehe Abb. 2.16C). Die Pathogenität von CY6371 (Spur 3 in Abb. 2.16B) und CY6372 (Spur

8 in Abb. 2.16B) wurde mittels Sprühinfektion von A. thaliana mit der des ΔChku80

Ausgangstammes CY6021 verglichen. Die Ausbildung von Krankheitssymptomen in Form

von makroskopisch sichtbaren Läsionen auf infizierten Blättern war für alle drei Stämme

nach vier Tagen deutlich sichtbar (siehe Abb. 2.16 D). Trypanblaufärbungen von infizierten

Blättern nach drei und vier Tagen zeigten eine vergleichbare Bildung von Primär-und

Sekundärhyphen der ΔChlysm3-Stämme CY6371 und CY6372 mit dem Ausgangsstamm

CY6021. Die Bildung von Callose-Papillen unter Appressorien wurde mittels

Anilinblaufärbung ebenfalls analysiert und zeigte keine verstärkte Induktion dieser

Abwehrreaktion auf Blättern infiziert mit CY6371 oder CY6372 (nicht gezeigt).

Die untersuchten C. higginsianum Stämme ΔChcih1, ΔChcih2, ΔChcih1/ΔChcih2 und

ΔChlysm3 zeigten bezüglich des Wachstums auf Platten mit PDA- und OMA-Medium keine

Auffälligkeiten. Die Analyse der Pathogenität auf A. thaliana dieser Stämme zeigte eine

vergleichbare Ausbildung makroskopisch sichtbarer Symptome und Ausbildung von Primär-

bzw. Sekundärhyphen zu dem ΔChku80 Ausgangsstamm.

55

2.3 Identifikation von C. higginsianum Pathogenitätsfaktoren mittels Insertionsmutagenese 2.3.1 Herstellung von C. higginsianum T-DNA Insertionsmutanten und Identifikation von C. higginsianum Pathogenitätsmutanten (vir-Mutanten)

Für die Generierung einer Kollektion von C. higginsianum Mutanten wurde in der AG Koch

eine zufällige T-DNA Insertionsmutagenese durchgeführt. Mittels ATMT wird die T-DNA in

die zu transformierende Zelle übertragen und durch non-homologous end joining (NHEJ) in

zufälligen Stellen des Genoms inseriert (Michielse et al., 2005). Im Gegensatz zur einer

chemischen Mutagenese wie zum Beispiel mit EMS (Ethylmethansulfonat) welche

Punktmutationen durch die Alkylierung von einzelnen Nukleotiden zur Folge hat, besitzt die

Insertionsmutagenese den entscheidenden Vorteil, dass durch die Kenntnis der Sequenz der

inserierten DNA der Insertionsort und damit der Mutationsort bestimmt werden kann. Durch

die Verwendung von ATMT können zudem einige Probleme anderer Techniken der

Mutagenese wie REMI (Restriction enzyme mediated insertion) umgangen bzw. minimiert

werden. So ist für die Transformation mittels Agrobakterien keine vorherige Präparation von

Protoplasten erforderlich, da direkt Konidien eingesetzt werden können. Des Weiteren ist der

berichtete Prozentsatz unmarkierter Mutationen vergleichsweise gering (Michielse et al.,

2005; Weld et al., 2006). Für Mutagenesen mit REMI wurden hingegen Raten von 20-100%

für unmarkierte Mutationen beschrieben, bei denen der Ort der Mutagenese nur schwer

bestimmt werden kann (Balhadère et al., 1999; Linnemannstöns et al., 1999; Sánchez et al.,

1998; Sweigard et al., 1998).

Für die Generierung einer Bibliothek von T-DNA Mutanten wurde der C. higginsianum

Wildtypstamm CY5535 mittels eines modifizierten Protokolls für ATMT (J. Rühl, Masterarbeit;

Material und Methoden) mit dem binären Plasmid pPK2 (Covert et al., 2001) transformiert.

Die T-DNA von pPK2 enthält eine Hygromycin-Resistenzkassette (sieh Abb. 2.17A) unter der

Kontrolle des GAPDH-Promotors und des Terminators von TRPC aus Aspergillus nidulans.

Die Selektion von Bakterien erfolgt über eine Kanamycin-Resistenz außerhalb der T-DNA.

Die erhaltenen Transformanten (sieh Abb. 2.17B) wurden auf PDA-Platten mit Hygromycin

vereinzelt und anschließend auf OMA-Medium vermehrt um Glycerinkulturen anzulegen.

Zusammen mit Susanne Müller, Marlis Dahl und Johanna Rühl wurden auf diese Weise

insgesamt über 7000 T-DNA Insertionsmutanten von C. higginsianum generiert (Korn et al.,

2015).

56

Abbildung 2.17: Herstellung einer Bibliothek von C. higginsianum T-DNA Insertionsmutanten. (A) Vektorkarte von pPK2: KanR: Kanamycin-Resistenz; Pgdp: Promotor von GAPDH aus Aspergillus nidulans; hph: Hygromycin-Resistenz; TtrpC: Terminator von TrpC aus Aspergillus nidulans; RB: „right border“; LB: „left border“. (B) Beispielhaftes Ergebnis einer Transformation von C. higginsianum; circa acht Tage nach der Transformation sind Hygromycin-resistente Transformanten auf den Selektionsplatten erkennbar. Diese wurden anschließend vereinzelt und in multi-well Platten mit OMA-Medium vermehrt (C).

Die erhaltenen Transformanten wurden mittels Tropfinfektionen von A. thaliana hinsichtlich

ihrer Pathogenität untersucht und von 7227 getesteten Stämmen zeigten 75 Stämme

reproduzierbar eine reduzierte Pathogenität (Korn et al., 2015). Da alle Stämme über

Konidiensuspensionen vermehrt wurden, konnten keine Mutanten mit Defekten in der

Bildung von Konidien isoliert werden. Ebenso konnten Mutanten mit sehr stark reduziertem

Wachstum auf PDA nicht mit einbezogen werden, da deren Kolonien auf den

Transfomationsplatten erst später sichtbar geworden wären.

Im Rahmen dieser Arbeit wurden einige dieser vir-Mutanten (virulenz) näher phänotypisch

und genotypisch charakterisiert.

57

2.3.2 Analyse der T-DNA Insertionen ausgewählter C. higginsianum vir-Mutanten

Für die Generierung der vir-Mutanten wurde eine T-DNA Insertionsmutagenese mit ATMT

als Transformationssystem verwendet. Ein großes Problem der Transformation mittels

Agrobakterien stellen multiple Insertionen, entweder als Tandem-Insertionen im gleichen

Lokus oder in verschiedenen Stellen des Genoms dar. Der Prozentsatz von T-DNA

Einzelinsertionen schwankt in der Literatur je nach Organismus und verwendeten

Transformationsparametern zwischen 20%-70% für C. graminicola (Flowers and

Vaillancourt, 2005, Münch et al., 2011), 70% für Colletotrichum acutatum (Talhinhas et al.,

2008) bis 80% für Magnaporthe grisea (Meng et al., 2007). In einer ähnlichen T-DNA

Insertionsmutagenese von C. higginsianum (Huser et al., 2009) enthielten 58% der T-DNA

Mutanten Einzelinsertionen und 72% der Mehrfach-Insertionen lagen in Tandem im gleichen

genomischen Lokus vor. Multiple Insertionen können dabei in verschiedenen Konfigurationen

vorliegen und unter anderem direkte oder invertierte Verknüpfungen von T-DNAs besitzen

oder auch Deletionen von Teilen der T-DNA aufweisen (Kwok and Nester, 1985; Spielmann

and Simpson, 1986). Die Nomenklatur bezieht sich dabei auf die jeweiligen Border Regionen

der T-DNA, wobei die Right Border als „Head“ und die left Border als „Tail“ bezeichnet wird.

Eine schematische Übersicht der möglichen Insertionen von zwei T-DNAs ist in Abbildung

2.18 dargestellt. Allerdings können auch mehrere T-DNAs (>2) in unterschiedlichen Arten

inserieren, wodurch sich die Anzahl der möglichen Konformationen stark erhöht.

58

Abbildung 2.18: Schematische Darstellung der möglichen Insertionen von zwei T-DNAs. Zwei T-DNAs können an unterschiedlichen Stellen im Genom inserieren (A) oder als Tandems zusammen in das Genom übertragen werden (B-D). Je nach Orientierung der einzelnen T-DNAs zueinander, können diese Tandems als Head to Tail (B), Head to Tail (C) oder Tail to Tail (D) Insertionen vorliegen. Ein weiteres potentielles Problem ist das ungenaue Schneiden der T-DNA an Right und Left

Border durch die virD1-virD2 Endonklease (Pansegrau et al., 1993) und die dadurch

verursachte Insertion von Sequenzbereichen des Vektors außerhalb der T-DNA in das

Genom. Der beschriebene Prozentsatz der T-DNA Insertionen mit zusätzlicher Übertragung

des gesamten Vektors erreicht dabei Werte von 50% in Fusarium circinatum (Covert et al.,

2001) und bis zu 70% in Colletotrichum graminicola (Flowers and Vaillancourt, 2005). Die

Abbildung 2.19 zeigt einen beispielhaften Southern-Blot um die Arten der erhaltenen T-DNA

Insertionen von vir-Mutanten zu demonstrieren.

59

Abbildung 2.19: Analyse der T-DNA Insertionen von neun vir-Mutanten. (A) Schematische Darstellung einer T-DNA Einzelinsertion mit eingezeichneten Schnittstellen der für den Southern Blot verwendeten Restriktionsenzyme und die daraus resultierende minimalen Bandengrößen. Rot: BamHI; Grün: SalI; Blau: NcoI. (B) Chromosomale DNA aus C. higginsianum Wildtypstamm CY5535 bzw. aus neun vir-Mutanten wurde isoliert, mit BamHI und SalI bzw. nur mit NcoI geschnitten und auf ein 0,8% Agarosegel aufgetrennt. Als Hybridisierungssonde wurde ein 32P-markiertes PCR-Fragment der Hygromycin-Resistenz (Primer pCK2123 und pCK2124) eingesetzt. Als Marker wurden jeweils 3 µl des 1 kbp DNA-Längenstandards von PeqLab verwendet, der aus unbekannten Gründen mit der eingesetzten Sonde hybridisierte. Als Positivkontrolle wurde NcoI-verdauter pPK2 verwendet. Die Belichtungszeit in der Filmkassette bei -80°C mit Verstärkerfolie betrug 22 h. NcoI schneidet innerhalb der Hygromycin-Resistenz, wodurch in einem Southern Blot bei

einer Einzelinsertion zwei Banden mit Größen von mindestens 1700 bp und 2800 bp zu

erwarten sind. Wie erwartet zeigte der Wildtyp (CY5535) keine definierten Banden, da dieser

das Resistenzgen für Hygromycin nicht enthält. Vir-55 zeigte zwei Banden, was auf eine

Einzelinsertion hindeutet. Für die Charakterisierung der Insertionen von vir-101 sind

aufgrund des nicht eindeutigen Bandenmusters zusätzliche Analysen notwendig. Die

chromosomalen DNAs der verbleibenden vir-Mutanten des gezeigten Southern Blots wurden

jeweils mit BamHI und SalI geschnitten. Die Restriktionsschnittstelle von BamHI auf der T-

DNA von pPK2 befindet sich upstream und die Schnittstelle für SalI downstream der

Hygromycin-Resistenz. Bei einer Einzelinsertion ist daher jeweils nur eine einzelne Bande

mit Mindestgrößen von 1700 bp bzw. 2800 bp zu erwarten (Abb. 2.19A), wo hingegen

multiple Banden auf dementsprechend mehrere Insertionen hindeuten. Eine Übersicht der

erwarteten Mindestgrößen der Banden ist in Tabelle 2.3 zusammengefasst.

Tabelle 2.3: Erwarte Bandengrößen für verschiedene T-DNA Insertionen

1 Angaben mit „+“ stellen Mindestgrößen dar

Vir-100 zeigte zwischen den Restriktionsverdaus mit BamHI (zwei Banden) und SalI (drei

Banden) eine ungleiche Anzahl an Banden. Dieses Bandenmuster könnte auf eine

Tandeminsertion von zwei T-DNAs mit Left Border an Left Border (Tail to Tail) und einer

zusätzlichen zweiten, unabhängigen T-DNA Insertion hindeuten. Allerdings könnte auch die

Insertion von drei T-DNAs (dabei zwei mit Tail to Tail Verbindung) im gleichen genomischen

Größen der erwarteten Banden in Basenpaaren (gerundet)1

Verdau mit BamHI Verdau mit SalI Einzelinsertion 3600+ 2400+ Zwei unabhängige Insertionen

3600+ 3600+

2400+ 2400+

Head to Tail Insertion 3600+ 4600

4500 2400+

Head to Head Insertion 3600+ 3600+

4800

Tail to Tail Insertion 7100 2400+ 2400+

60

Lokus das Bandenmuster ergeben. Das Muster von vir-54 mit jeweils zwei Banden pro

Verdau deutet auf zwei unabhängige T-DNA Insertionen hin. Die größere der zwei Banden

ist allerdings sehr groß (>10 kbp) und könnte durch insertion von großen Teilen von pPK2

(oder des gesamten Vektors) in das Genom hervorgerufen worden sein. Im Gegensatz dazu

deuten die kleinen Banden (<2000 bp) im BamHI Restriktionsverdau von vir-102 und vir-72

auf unvollständige Insertionen von T-DNAs hin. Da die restlichen Banden von vir-103 und vir-

72 der Größe der T-DNA entsprechen (4500 bp), handelt es sich dabei vermutlich um

Tandem Insertionen (Head to Tail; Right Border an Left Border) von zwei T-DNAs. Die

Bandenmuster von vir-103, vir-26 und vir-56 deuten ebenfalls auf multiple Insertionen hin,

sind aber durch eine Tandeminsertion von zwei T-DNAs nicht zu erklären und erfordern

weitere Analysen.

Viele Transformanten zeigten Banden in der Größe der T-DNA (4500 bp) oder wiesen eine

ungleiche Anzahl an Banden im SalI und BamHI-Restriktionsverdau auf (Siehe Abb. 2.19B).

Daher besitzen diese Mutanten vermutlich Tandeminsertionen in verschiedenen

Konfigurationen, wobei vor allem Head to Tail Verbindungen von zwei T-DNAs identifiziert

werden konnten. Sequenzierungen von erhaltenen Verknüpfungen zeigten, dass die

Verbindungen zweier T-DNAs nicht aus vollständigen 25 bp Left Border und Right Border

Bereichen bestehen, sondern aus chimären oder verkürzten Sequenzbereichen (siehe

Abbildung 2.20). Dieses Sequenzen einiger vir-Mutanten waren identisch mit den T-DNA

Junctions von sogenannten T-Circles wie pPIN1 (Koukolíková-Nicola et al., 1985;

Timmerman et al., 1988) und T-Circle T2 (Singer et al., 2012).

Einige Transformanten zeigten Banden in der Größe der T-DNA (z.B. vir-26, vir-56, vir-72

und vir-100) oder wiesen eine ungleiche Anzahl an Banden im SalI und BamHI-

Restriktionsverdau auf (z.B. vir-26, vir-56, vir-100 und vir-103). Solch ein Muster ist Hinweis

auf Tandeminsertionen in verschiedenen Konfigurationen Sequenzierungen von erhaltenen

Verknüpfungen zeigten vor allem Head to Tail Verbindungen von zwei T-DNAs. Die

identifizierten Verbindungen zweier T-DNAs bestanden mehrfach nicht aus vollständigen 25

bp Left Border und Right Border Bereichen, sondern aus chimären oder verkürzten

Sequenzbereichen (siehe Abbildung 2.20). Dieses Sequenzen einiger vir-Mutanten waren

identisch mit den T-DNA Junctions von sogenannten T-Circles wie pPIN1 (Koukolíková-

Nicola et al., 1985; Timmerman et al., 1988) und T-Circle T2 (Singer et al., 2012).

61

Abbildung 2.20: Sequenzen von T-DNA Junctions. Dargestellt sind die Sequenzbereiche der T-DNA Junctions von Head to Tail Tandeminsertionen von vir-50, vir-98, vir-52, vir-25, vir-27, vir-49, vir-101, vir-103 und der T-Circle pPIN1 und T-Circle T2 . Die mit der Right Border (RB) identischen Sequenzabschnitte wurden grau und einzelne, mit der Left Border (LB) übereinstimmende Nukleotide schwarz hervorgehoben. Es wird angenommen, dass im Zellkern der Wirtszelle mehrere T-DNAs miteinander

rekombinieren oder ligieren können, wodurch komplexe Strukturen gebildet werden. Diese

Strukturen können danach entweder in das Genom inserieren oder cyclisieren und T-Circles

bilden (Singer et al., 2012). T-Circle wurden bisher vor allem bei der Transformation von A.

thaliana beschrieben, aber die Verknüpfung von T-DNAs vor der Insertion könnte auch die

Bildung der beobachteten Tandeminsertionen in C. higginsianum erklären.

vir-50 TATCAGTGTTTGA----------TGTGGTGTAAACAAATTGACGCTTAG vir-98 TATCAGTGTTTGA----------TGTGGTGTAAACAAATTGACGCTTAG vir-52 TATCAGTGTT----------TATTGTGGTGTAAACAAATTGACGCTTAG pPIN1 TATCAGTGTTTGACAGGATATATTGTGGTGTAAACAAATTGACGCTTAG T-Circle T2 TATCAGTGTTTGACAGGATATATTGTGGTGTAAACAAATTGACGCTTAG vir-25 TATCAGTGTTTGACAGGATATATTGTGGTGTAAACAAATTGACGCTTAG vir-27 TATCAGTGTTTGACAGGATATATTGTGGTGTAAACAAATTGACGCTTAG vir-49 TATCAGTGTTTGACAGGATATATTGTGGTGTAAACAAATTGACGCTTAG vir-101 TATCAGTGTTTGACAGGATATATTGTGGTGTAAACAAATTGACGCTTAG vir-103 TATCAGTGTTTGACAGGATATATTGTGGTGTAAACAAATTGACGCTTAG RB TATCAGTGTTTGACAGGATATATTGGCGGGTAAAC LB TGGCAGGATATATTGTGGTGTAAACAAATTGACGCTTAG

RB/LB

RB

LB

hph

hph

62

2.3.3 Identifikation von T-DNA Insertionsstellen von C. higginsianum vir-Mutanten mittels Genome Walking PCRs

Um den Insertionsort der T-DNA im Genom von C. higginsianum zu bestimmen, wurden

Genome Walking PCRs durchgeführt. Bei dieser Technik wird die chromosomale DNA mit

blunt-schneidenden Restriktionsenzymen geschnitten und mit einem Adaptermolekül ligiert.

Die Ligation des Adapters mit bekannter Sequenz erlaubt die Durchführung von PCRs, da

nun DNA-Fragmente mit bekannten Sequenzen an beiden Enden vorliegen (T-DNA und

Adapter). In der ersten Genome Walking PCR wurden Primer eingesetzt, die zum einen an

den Adapter binden und zum anderen ihre Bindestelle in der Nähe der Left bzw. Right

Border in der T-DNA besitzen. Für die Erhöhung der Spezifität folgte eine zweite „nested“

PCR mit der ersten PCR als Template. Durch Modifizierung des Adapters mit einer

Aminogruppe und der Verwendung von relativ kurzen Adapter-spezifischen Primern wird die

Amplifikation von unerwünschten Nebenprodukten in den PCRs minimiert. Die erhaltenen

PCR-Produkte enthielten den Sequenzabschnitt zwischen der Primerbindestelle in der T-

DNA und der Schnittstelle des eingesetzten Restriktionsenzymes in der chromosomalen

DNA an den der Adapter ligierte. Da die Entfernungen zwischen der Schnittstelle in der

chromosomalen DNA und der T-DNA Insertionsstelle unbekannt sind, wurden mehrere

Restriktionsenzyme und verschiedene Primerkombinationen eingesetzt, um amplifizierbare

Fragmente zu erhalten.

63

Abbildung 2.21: Genome Walking Analyse von vir-Mutanten. (A) Schematische Darstellung des Ablaufes der Genome Walking Analyse anhand einer T-DNA Einzelinsertion. Chromosomale DNA wird isoliert, mit EcoRV geschnitten und mit einem Adapter (AP) ligiert. Die PCR-Produkte der ersten (primary; AP1 und L1 bzw. R1) und zweiten (nested; AP2 und L2 bzw. R2) PCR werden mittels Agarosegelelektrophorese analysiert. (B) Agarosegel mit aufgetragenen Genome Walker PCRs von vir-24, vir-53 und vir-52. Die erste (L1 bzw. R1) und zweite (L2 bzw. R2) Genome Walking PCR sind jeweils nebeneinander aufgetragen. M: 1kbp DNA-Leiter; L1: 1. PCR mit Primerpaar CK2611/CK2582; L2: 2. PCR mit Primerpaar CK2709/CK2583; R1: 1. PCR mit Primerpaar CK2711/CK2582; R2: 2. PCR mit Primerpaar CK2710/CK2583

Für vir-14, vir-21, vir-43, vir-98, vir-94, vir-99, vir-101 und vir-103 wurden bei Genome

Walking PCRs Fragmente erhalten, die nur Sequenzen von zwei in Tandem vorliegenden T-

DNAs enthielten und somit keine Information über den Insertionsort zuließen.

Durch Verwendung von Restriktionsenzymen ohne Schnittstelle in der T-DNA von pPK2

konnte dieses Problem teilweise umgangen werden.

Im Folgenden wird auf einige vir-Mutanten eingegangen, deren T-DNA Insertionsorte im

Rahmen dieser Arbeit identifiziert werden konnten.

64

vir-23

Abbildung 2.22: T-DNA Insertionsort von vir-23. (A) Dargestellt sind die C. higginsianum Supercontigs SC_869 und SC_2876 mit eingezeichneten T-DNA Insertionsort. Das erhaltene Genome Walking Fragment wurde rot markiert. (B) Mittels NCBI Conserved Domain Search ermittelte Domänenstrukturen von CH063_03892.

Southern Blot Analysen der Mutante vir-23 (nicht gezeigt) deuteten auf multiple T-DNA

Insertionen hin. Bisher konnte nur eine Insertion 678 bp upstream von CH063_08545 und

6651 bp downstream von CH063_03892 identifiziert werden (siehe Abb. 2.22A). Das

entsprechende hypothetische Protein CH063_08545 enthält weder konservierte Domänen,

noch ein Signalpeptid und wird laut RNA-Seq in allen Stadien schwach exprimiert (O’Connell

et al., 2012). BLAST-Analysen mit der Proteinsequenz als Suchsequenz ergaben eine

Vielzahl homologer Proteine in weiteren Colletotrichum Spezies wie z.B. das hypothetische

Protein CGGC5_4460 aus Colletotrichum gloeosporioides (E-value: 3e-109; 206/252

Identität) und verwandten filamentösen Pilzen, ohne jedoch eine Hinweis auf die Funktion zu

geben. Bei CH063_03892 handelt es sich aufgrund der Domänenstruktur vermutlich um

einen MFS-Transporter. Allerdings befindet sich die T-DNA Insertion mit über 6600 bp

wahrscheinlich zu weit entfernt um die Expression dieses Gens zu beeinflussen.

65

vir-41

Abbildung 2.23: T-DNA Insertionsorte von vir-41. (A, C) Dargestellt sind die C. higginsianum Supercontigs SC_3250 bzw. SC_8706 mit eingezeichneten T-DNA Insertionsorten. Die erhaltenen Genome Walking Fragmente wurden jeweils rot markiert. (B, D) Mittels NCBI Conserved Domain Search ermittelte Domänenstrukturen potentiell betroffener Proteine mit entsprechenden E-value.

Southern Blot Analysen der Mutante vir-41 deuteten auf zwei T-DNA Insertionen hin (Daten

nicht gezeigt). Im Rahmen eines Mastermoduls konnten beide Insertionsstellen identifiziert

werden. Eine T-DNA inserierte 2700 bp downstream von CH063_09187 bzw. 1900

downstream von CH063_00839 an Position 3662 des Supercontigs 3250 (siehe Abb. 2.23).

66

CH063_09187 ist als short-chain Dehydrogenase annotiert und enthält auch entsprechend

vorhergesagte Proteindomänen. Auffällig ist, die laut RNASeq, starke Abweichung der

Expression des Gens zwischen in vitro Appressorien (540 reads) und in planta Appressorien

(85 reads) (O’Connell et al., 2012). Das zweite potentiell beeinflusste Gen dieser T-DNA

Insertion kodiert für CH063_00839. Aufgrund der hypothetischen Zds-Domäne (siehe Abb.

2.23B) zeigt das Protein Ähnlichkeiten mit ScZds1 (E-Value 6,7e-09) und seinem Paralog

ScZds2 (E-Value 4e-08). Für beide Proteine konnte in S. cerevisiae eine Beteiligung an der

Regulation des polarisierten Wachstums gezeigt werden (Rossio and Yoshida, 2011; Yu et

al., 1996). Zudem zeigt CH063_00839 Ähnlichkeit zu Zds3 (einziger BLAST Treffer mit e-

Value 2e-11) des Humanpathogens Cryptocuccus neoformans, für das eine Virulenzfunktion

nachgewiesen werden konnte (Li et al., 2011).

Die zweite T-DNA Insertion konnte in Supercontig 8706 identifiziert werden (Abb. 2.23C). Mit

nur 260 bp zwischen CH063_15257 und der Insertion könnte der Promotorbereich dieses

Gens durch die T-DNA betroffen sein. Aufgrund der entsprechenden Domäne (Abb. 2.23D)

und der starken Homologie zu S. cerevisiae Hem12 (E-value: 8,9e-87) handelt es sich bei

CH063_15257 vermutlich um eine Coproporphyrinogen III Oxidase, welches ein Enzym der

Häm-Biosynthese darstellt. Das leicht reduzierte Wachstum von vir-41 auf Minimalmedium

(nicht gezeigt) könnte aus der reduzierten Verfügbarkeit von Häm-Gruppen für essentielle

Enzyme des Stoffwechsels resultieren. Des Weiteren konnte bereits für andere pathogene

Pilze eine Verbindung zwischen Pathogenität und des Stoffwechsels/Aufnahme von Eisen

gezeigt werden (Haas et al., 2008; Howard, 1999). Die T-DNA Insertion liegt ebenfalls

downstream von CH063_12924. Laut RNA-Seq Daten (O’Connell et al., 2012) ist dieses Gen

eines der stärksten exprimierten Gene in Appressorien (14. stärkste in in vitro Appressorien).

Das entsprechende Protein ist als autophagy-like protein 8 annotiert und ist vermutlich ein

Bestandteil des Autophagosoms. Da die Appressorienbildung in vir-41 nicht beeinflusst ist

und die T-DNA 1600 bp von CH063_12924 entfernt inserierte, ist vermutlich dessen

Expression nicht betroffen.

Auch wenn noch nicht geklärt wurde welches dieser Gene durch die Insertionen beeinflusst

ist und dadurch den beobachteten Phänotyp erzeugt, konnten mehrere interessante Gene

mit möglichen Rollen in Stoffwechsel, Zellteilung/Polarität und Autophagie identifiziert

werden.

67

vir-51

Abbildung 2.24: T-DNA Insertionsort von vir-51. Dargestellt sind die C. higginsianum Supercontigs SC_1847 und SC_5498 mit eingezeichneten T-DNA Insertionsort von vir-51. Das erhaltene Genome Walking Fragment wurden rot markiert. Eine Region mit mehreren ESTs wurde blau umklammert.

Für vir-51 konnte die einzelne T-DNA Insertion 1031 bp upstream des vorhergesagten Gens

CH063_06511 lokalisiert werden. Das entsprechende Protein mit einer Länge von 350

Aminosäuren hat kein vorhergesagtes Signalpeptid, keine konservierten Domänen und weist

laut RNA-Seq Daten eine nur sehr geringe Expression auf (O’Connell et al., 2012). Eine

BLASTp Suche mit der Proteinsequenz ergab nur Treffer in anderen Colletotrichum Spezies.

Ca. 1400 bp von der T-DNA Insertion sind im C. higginsianum Genome Browser

(http://www.broadinstitute.org/annotation/genome/colletotrichum_group/) eine Vielzahl von

Expressed Sequence Tags aufgeführt, die allerdings keinem annotierten Gen zugeordnet

wurden.

68

vir-52

Abbildung 2.25: T-DNA Insertionsort von vir-52. Dargestellt ist die T-DNA Tandeminsertion von vir-52 innerhalb des C. higginsianum Supercontigs SC_3438. Die zwei erhaltene Genome Walking Fragmente wurden rot markiert. (B) Ermittelte Domänenstruktur von CH063_12090 und CH063_159577 mit entsprechenden E-Values. Die einzelne T-DNA Insertion von vir-52 konnte zwischen CH063_12090 und CH063_15957

nachgewiesen werden. Dabei konnte gezeigt werde, dass zwei T-DNAs in Tandem in einer

Head to Tail Konfiguration inserierten, wobei die sequenzierte Junction der T-DNAs (Siehe

Abb. 2.20) eine Deletion von zehn Basenpaaren aufwies.

Bei CH063_12090 handelt es sich um eine putative FAD-abhängige Oxidoreduktase

(pfam01266) mit laut RNA-Seq (O’Connell et al., 2012) sehr schwacher Expression in allen

untersuchten Stadien. CH063_15957 wird aufgrund der Domänenstruktur und der Homologie

zu der Saccharopin Dehydrogenase ScLys1 (E-value: 3,6e-67) im Folgenden als ChLys1

bezeichnet. ScLys1 katalysiert in S. cerevisiae die finale Reaktion von Saccharopin zu Lysin

in der Lysin-Biosynthese (Ogawa and Fujioka, 1978).

Für beide Gene wurden im Rahmen der Bachelorarbeit von Stefanie Köhler C. higginsianum

Knockout-Stämme konstruiert, um ihre Rolle für die Infektion von A. thaliana zu untersuchen.

Eine Deletion von CH063_12090 hatte dabei im Vergleich zu dem ΔChku80

Ausgangsstamm keine phänotypischen Veränderungen hinsichtlich der Pathogenität oder

des Wachstum zur Folge (Daten nicht gezeigt). Im Gegensatz dazu hatte der Knockout von

ChLYS1 starke phänotypische Effekte. Die entsprechenden ΔChlys1 Stämme ΔChlys1-1

69

(CY6226) und ΔChlys1-3 (CY6228) waren nicht in der Lage auf Czapek-Dox Minimalmedium

(siehe Abb. 2.26A) zu wachsen und zeigten eine Lysin-Auxotrophie (siehe Abb. 2.26A-B).

Abbildung 2.26: Phänotyp von ΔChlys1 Stämmen.(A/B) Wachstum von C. higginsianum ΔChku80 (CY6021), ΔChlys1-1 (CY6226) und Chlys1-3 (CY6228) auf Czapek-Dox Minimalmedium (A) bzw. Czapek-Dox mit zusätzlich 76 mg/l Lysin. (C/D) Trypanblaufärbungen von A. thaliana infiziert mit vir-52 (C) bzw. ΔChlys1-1(D). Größenmarker = 50 µm

Im Gegensatz zu vir-52 (Abb. 2.26C) bildeten die ΔChlys1Stämme keine Primärhyphen aus.

Vier Tage nach der Sprühinfektion von A. thaliana mit ΔChlys1-waren nur vereinzelt

Appressorien sichtbar (Abb. 2.26D). Der beobachtete Phänotyp der ΔChlys1 Stämme ist

damit stärker ausgeprägt als der von vir-52.

70

vir-53

Abbildung 2.27: T-DNA Insertionsort von vir-53. Dargestellt ist die T-DNA Insertion von vir-53 innerhalb der C. higginsianum Supercontigs SC_1912 bzw. SC_1608. Das erhaltene Genome Walking Fragment wurde rot markiert.

Southern Blot Analysen für vir-53 deuten auf eine Head to Head Tandeminsertion hin. Mittels

Genome Walking konnte der Insertionsort einer T-DNA 434 bp vor CH063_13555 identifiziert

werden. Das entsprechende Protein besitzt keine konservierten Domänen (E-value > 3e-6)

und kein vorhergesagtes Signalpeptid. BLAST-Analysen mit der Proteinsequenz ergaben nur

Treffer in anderen Colletotrichum Spezies mit der stärksten Übereinstimmung zu dem

hypothetischen Protein CSUB01_05700 aus Colletotrichum sublineola (E-value: 3e-109).

71

vir-56

Abbildung 2.28: T-DNA Insertionsort von vir-56. (A) Dargestellt ist die identifizierte T-DNA Insertion von vir-56 innerhalb der C. higginsianum Supercontigs SC_66. Das erhaltene Genome Walking Fragment wurde rot markiert. (B) Übersicht der Identifizierten Proteindomäne von CH063_00495.

Die erhaltenen Southern Blot Banden von vir-56 deuten auf Tandeminsertion mehrerer T-

DNAs hin (siehe Abb. 2.19B). Die lokalisierte Insertion befindet sich 77 Basenpaare vor dem

vorhergesagten Gen CH063_00495 bzw. 943 bp upstream von CH063_00494 (Abb. 2.28A).

Eine Suche nach konservierten Domänen in CH063_00494 ergab Ähnlichkeit zu der

Tim17/Tim22/Tim23/peroxisomal protein PMP24 Motiv Domäne (Abb. 2.28B). Verschiedene

Peroxine wurden bereits in verwandten Pathosystemen als Pathogenitätsfaktoren

beschrieben, wie zum Beispiel Colletotrichum lagenarium Pex6 (Asakura et al., 2006) C.

orbiculare Pex13 (Fujihara et al., 2010) und Fusarium oxysporum Pex1/10/12/26 (Michielse

et al., 2009). Diese vorhergesagte Proteindomäne ist allerdings auch Bestandteil von

Proteinen mit Funktionen für den Transport in die innere Membran von Mitochondrien (TIM:

Translocase of the Inner Mitochondrial membrane). Das ursprünglich identifizierte Pex24 aus

Yarrowia lipolytica (Tam and Rachubinski, 2002) ist zudem über 250 Aminosäuren größer als

das vorhergesagte Protein CH063_00495. Erstaunlicher Weise konnten keine homologen

Proteine in S. cerevisiae identifiziert werden, was bei der konservierten Funktion als Peroxin,

bzw. als mitochondriales Transportprotein zu erwarten gewesen wäre.

Das hypothetische Protein CH063_00494 besitzt eine schwach konservierte Arylesterase-

Domäne pfam01731 (E-value: 1.38e-05), wobei homologe Proteine wie z.B. XP_007275589

(75% Identität; E-Value: 0) aus Colletotrichum gloeosporioides ebenfalls als Aryesterasen

annotiert sind. Auffällig ist zu dem, der laut RNA-Seq (O’Connell et al., 2012), starke

Unterschied der Expression zwischen in vitro (18 Reads) und in planta Appressorien (349

Reads).

72

vir-70

Abbildung 2.29: T-DNA Insertionsorte von vir-70. (A, C) Dargestellt sind die C. higginsianum Supercontigs SC_4395 bzw. SC_1520 mit eingezeichneten T-DNA Insertionsorten. Die erhaltenen Genome Walking Fragmente wurden jeweils rot markiert. (B, D) Mittels NCBI Conserved Domain Search ermittelte Domänenstrukturen potentiell betroffener Proteine mit entsprechenden E-values. Für vir-70 konnten zwei T-DNA Insertionsstellen identifiziert werden. Die erste befindet sich

innerhalb des ORF des vorhergesagten Gens CH063_10921. Das entsprechende Protein

besitzt keine konservierten Domänen aber eine Vielzahl von homologen Proteinen in

anderen filamentösen Pilzen. Eine BLASTp Suche in S. cerevisiae blieb allerdings ohne

Treffer. 750 bp upstream von der ersten Insertion entfernt, befindet sich das Gen der

Anthranilate Synthase (TRPC; CH063_10922). Da das Wachstum von vir-70 auf

Minimalmedium (Daten nicht gezeigt) dem des Wildtyps entsprach, scheint die Tryptophan-

Biosynthese nicht beeinträchtigt zu sein. Eine zweite Insertion befindet sich innerhalb des

ORF von CH063_05741. Aufgrund der gefunden Proteindomänen (Siehe Abb. 2.29D) und

der Homologie zu ScRit1 (E-value: 1,2e-50) kodiert das Gen vermutlich eine Initiator tRNA

73

Phosphoribosyl Transferase. ScRit1 ribosyliert die Initiator Methionin tRNA, wodurch diese

von der Elongator Methionin tRNA unterschieden werden kann (Astrom and Bystrom, 1994).

vir-72

Abbildung 2.30: T-DNA Insertionsort von vir-72. Dargestellt ist die identifizierte T-DNA Insertion von vir-72 innerhalb des C. higginsianum Supercontigs SC_4116. Das erhaltene Genome Walking Fragment wurde rot markiert.

Southern Blot Analysen von vir-72 deuten auf mehrere T-DNA Insertionen hin (siehe Abb.

2.19 B), wobei die erhaltenen Banden auf eine unvollständige Insertion hinweisen. Mittels

Genome Walking konnte eine Insertion innerhalb des Supercontigs SC_4116 identifiziert

werden. Der Insertionsort enthält keine annotierten Gene in der BROAD-Datenbank. Im C.

higginsianum Genome Browser des Max-Planck-Instituts für Pflanzenzüchtungsforschung

(https://gbrowse.mpipz.mpg.de/cgi-bin/gbrowse/colletotrichum_higginsianum_public/)

befindet sich am Insertionsort eine automatisch annotierte Conrad Prediction. Das

entsprechende Protein hat eine Länge von 272 Aminosäuren und besitzt keine konservierten

Domänen und kein Signalpeptid. Eine BLASTp Suche in den Datenbanken von NCBI bzw.

BROAD lieferte keine Treffer.

vir-73

Abbildung 2.31: T-DNA Insertionsort von vir-73. Dargestellt ist die identifizierte T-DNA Insertion von vir-73 innerhalb des C. higginsianum Supercontigs SC_4482. Das erhaltene Genome Walking Fragment wurde rot markiert. Eine Region mit mehreren annotierten ESTs wurde blau umklammert. Southern Blot Analysen von vir-73 (nicht gezeigt) deuteten auf eine T-DNA Einzelinsertion

hin. Wie für vir-72, befinden sich am identifizierten T-DNA Insertionsort keine annotierten

Gene in der BRAOD-Datenbank, sondern eine Vielzahl von Expressed Sequence Tags

74

(siehe Abb.2.31). Im Genome Browser des MPIPZ ist 20 bp downstream der Insertion eine

Conrad Prediction annotiert.

2.3.4 Multiple vir-Mutanten haben eine T-DNA Insertion im Lokus von ChPMA2

Mittels Genome Walking Analysen konnten die T-DNA Insertionsstellen von vir-97, vir-102,

vir-19, vir-24, vir-22 und vir-12 identifiziert werden. Interessanter Weise befinden sich alle im

gleichen genomischen Lokus (Abb. 2.32). Deshalb habe ich mich im Folgenden auf die

Analyse des betroffenen Gens (CH063_09060.1) konzentriert.

75

Abbildung 2.32: Sechs vir-Mutanten haben eine T-DNA Insertion im Lokus von ChPMA2. (A) Schematische Übersicht des ChPMA2 Gens mit den T-DNA Insertionsstellen von vir-97, vir-102, vir-12, vir-24, vir-19 und vir-22 relativ zu ATG (=1). (B) Makroskopische Symptome und Trypanblau Färbung von infizierten Blättern von A. thaliana vier Tage nach der Sprühinfektion mit C. higginsianum Wildtyp und ChPMA2 T-DNA Insertionsmutanten. Größenmarker = 50 µm.

CH063_09060 kodiert für ein 1017 Aminosäure langes Protein mit hoher Ähnlichkeit zu der

Plasmamembran gebundenen Protonen P-Typ ATPase Pma1 aus Saccharomyces

cerevisiae (43% Sequenzidentität) und wurde daher ChPMA2 genannt. Die T-DNA

Insertionsstellen von vir-22, vir-24 und vir-19 befinden sich in den offenen Leserahmen von

ChPMA2 (vir-24; +130; vir-22: +454; vir-19: +138). In Southern Blot Analysen von vir-24 und

vir-22 konnte nur jeweils eine einzelne T-DNA Insertion nachgewiesen werden (nicht

gezeigt). Das erhaltene Bandenmuster für vir-19 weist hingegen auf mehrere T-DNA

Insertionen hin, die aufgrund der Größe allerdings auch gekoppelt vorliegen könnten (Head

to Tail). Diese drei vir-Mutanten zeigen eine, mit C. higginsianum Wildtyp vergleichbare, in

vitro und in planta Appressorienbildung. Allerdings zeigen sie bei der Sprühinfektion von A.

thaliana keinerlei Symptome und bilden weder Sekundär-noch Primärhyphen. Selbst nach

sechs Tagen werden weder makroskopische Symptome noch Hyphen gebildet. Die anderen

T-DNA Insertionsmutanten vir-102, vir-97 und vir-12 haben die T-DNA in der upstream

Region von ChPMA2. Für vir-12, die erste Mutante dieser Klasse, war durch S. Müller die

Insertionsstelle -139 bp (relativ zum Startcodon von ChPMA2) bestimmt worden. Der

Phänotyp dieser Mutante entspricht dabei den Mutanten mit Insertion im offenen

Leserahmen, was auf eine starke oder vollständige Verminderung der Transkription von

ChPMA2 hindeutet. Vir-102 hat eine T-DNA Insertion 502 Nukleotide upstream des

Startcodons von ChPMA2 und zeigt einen weniger stark ausgeprägten Effekt auf die

Pathogenität. Appressorien von vir-102 konnten A. thaliana penetrieren und bildeten

erfolgreich Primär-und Sekundärhyphen. Jedoch war die Ausbildung makroskopischer

Symptome im Vergleich zum Wildtyp reduziert, was darauf hindeutet, dass in dieser Mutante

die Expression von ChPMA2 vermindert ist. Interessanter Weise zeigt vir-97 einen viel

stärker reduzierte Pathogenität als vir-102, obwohl sich nur 20 Nukleotide zwischen den T-

DNA Insertionsstellen befinden. Allerdings besitzt vir-97 eine zweite T-DNA Insertion die

bisher noch nicht identifiziert werden konnte. Zudem sind für vir-97 und vir-102 nur jeweils

die Left Border-Bereiche analysiert worden, daher könnten bisher unbekannte Deletionen

oder Umordnungen an der Right Border stattgefunden haben, die einen Einfluss auf die

Transkription von ChPMA2 haben könnten.

76

2.4 Die Rolle von Plasmamembran gebundenen H+-transportierenden ATPasen für die Pathogenität von C. higginsianum

2.4.1 C. higginsianum kodiert mit ChPMA1 und ChPMA2 für zwei H+-transportierende P-type ATPasen

Die Proteinsequenz von ChPma2 wurde unter GenBank Accession Nr. AJW67919 in die

NCBI-Datenbank hinterlegt. BLAST-Analysen mit der Genomsequenz von C. higginsianum

(Colletotrichum Sequencing Project, Broad Institute of Harvard and MIT

(http://www.broadinstitute.org/)) ergaben zusätzliche Treffer mit starker Ähnlichkeit zu

ChPma2. Die identifizierten Proteine CH063_02576 (Identities=351/729 (48%)) und

CH063_00553 (Identities=104/262 (39%)) sind jedoch fehlerhaft bzw. unvollständig annotiert.

Beide vorhergesagte Proteine bilden zusammen eine P-Typ ATPase mit insgesamt 45%

Identität mit ChPma2. Die überarbeite Proteinsequenz wurde ChPma1 genannt und trägt die

GenBank Accession Nr. AJW67921. Um Rückschlüsse auf die Funktion der P-Typ ATPasen

ChPma1 und ChPma2 zu schließen wurden Sequenzvergleiche zusammen mit weiteren P-

Typ ATPasen mit bekannten Substrat durchgeführt. Für diese Analysen wurde die P-Typ

ATPase CH063_11329 ebenfalls einbezogen, da es nach den beiden ChPma1 Fragmenten

von allen Proteine von C. higginsianum die höchste Ähnlichkeit zu ChPma2 von aufwies. Tabelle 2.4: BLAST-Analysen von C. higginsianum P-Typ ATPasen

1Die verwendeten Abkürzungen stehen für folgende Organsimen: Sc - Saccharomyces cerevisiae; Nc – Neurospora crassa; Sp – Schizosaccharomyces pombe; At – Arabidopsis thaliana; Mo – Magnaporthe oryzae *CH063_11329 und ELQ423021 wurde durch eine automatische Annotationen als Sodium transport ATPase 5 bzw. Calcium-transporting ATPase 3 betitelt, experimentelle Nachweise dieser Funktion sind nicht verfügbar ChPma1 und ChPma2 zeigten die stärkste Ähnlichkeit (>40%) mit Plasmamembran-

gebundenen Protonen ATPasen wie z.B. ScPma1 und ScPma2 und NcPmaA (Siehe Tabelle

Identität mit: Protein1 Accession Nr. Substrat ChPma1 ChPma2 CH063_11329 ChPma1 AJW67921 H+ - 44,8% 17,9% ChPma2 AJW67919 H+ 44,8% - 17%

CH063_11329 CCF40882 Na+* 17,9% 18,2% - NcPmaA AAA33563 H+ 88% 44,2% 17,4% ScPma1 NP_011507 H+ 73,8% 43,3% 17,9% ScPma2 NP_015289 H+ 73,4% 42,9% 17,6% SpPma1 CAB59886 H+ 72,1% 43,5% 17,9% AtAha6 AEC06056 H+ 32,6% 29,2% 17,3% AtECA3

NP_563860 Ca2+

(ER) 18,7% 17,1% 24,8%

ScPmr1 NP_011348 Ca2+, Mn2+ (Golgi)

19% 17% 23,2%

MoATPase3 ELQ423021 Ca2+ ° 18,4% 17% 63,5% ScEna2 NP_010324 Na+ 18,2% 16,7% 47,2% ScPmc1 NP_011509 Ca2+

(Vakuole) 13,8% 13,4% 18,3%

77

2.4) oder Protonenpumpe Aha6 aus A. thaliana (30%). Im Gegensatz dazu zeigten Calcium

oder Natrium-transportierende ATPasen wie Ena3 und Pmc1 aus S. cerevisiae nur 13-19%

Sequenzidentität mit ChPma1 und ChPma2. Die dritte untersuchte ATPase CH63_11329

zeigte eine geringe Ähnlichkeit mit Protonenpumpen (<20% Identität) aber eine starke

Identität (47%) mit der Natrium-transportierenden ATPase ScEna2, wodurch vermutlich auch

die automatische Annotation als Sodium transport ATPase ihren Ursprung hat.

*

78

Abbildung 2.33: Domänenstruktur von ChPma1 und ChPma2. Das Alignment von ChPma1, ChPma2 und NcPmaA (Neurospora crassa) wurde mittels ClustalW erstellt (www.ebi.ac.uk/ Tools/msa/clustalw2/) und mit BoxShade (http://www.ch.embnet.org/software/BOX_form.html) grafisch dargestellt. Die Annotationen der Domänenstruktur und der Transmembrandomänen (TM) von ChPma1 und ChPma2 erfolgten auf Basis der publizierten Daten für NcPmaA. Die Phosphorylierungsstelle innerhalb der P-Domäne (Asp) wurde mit einem roten Stern markiert.

Ein Alignment von ChPma1 und ChPma2 mit der Proteinsequenz von PmaA aus Neurospora

crassa (Siehe Abb. 2.33) zeigte für beide Proteine die konservierte P-Typ ATPasen

Domänenstruktur mit Aktuator-Domäne (A), Nukleotid-Bindedomäne (N), Phosphorylierungs-

Domäne (P) und zehn Transmembrandomänen (Kühlbrandt, 2004).

Diese ersten Sequenzvergleiche von ATPasen deuten darauf hin, dass es sich bei ChPma1

und ChPma2 um P-Typ ATPasen handelt die aufgrund ihrer stärksten Ähnlichkeit zu

Protonenpumpen vermutlich ebenfalls Protonen transportieren.

2.4.2 Ein Deletion von ChPMA1 war nicht möglich, während die Deletion von ChPMA2 den Verlust der Pathogenität zur Folge hat

Um die Rolle der Plasmamembran gebunden H+-ATPasen ChPma1 und ChPma2 für die

Pathogenität von C. higginsianum zu untersuchen, wurde versucht Knockout-Stämme beider

ATPasen zu erstellen. Die Deletionsplasmide pDel-Pma1-1 (pCK3349) und pDel-Pma1-2

(pCK3350) wurden mittels dem pOSCAR System hergestellt (Korn et al., 2015) Durch

homologe Rekombination sollten 2287 bp von ChPMA1 durch eine Hygromycin-

Resistenzkassette ersetzt werden (Siehe Abb. 2.34A).

79

Abbildung 2.34: Die Deletion von ChPMA1 war nicht möglich. (A) Schematische Darstellung der Deletionsstrategie von ChPMA1. 2287 bp von ChPMA1 sollten mittels homologer Rekombination durch eine Hygromycin-Resistenzkassette auf der T-DNA von pDel-Pma1-1/2 ersetzt werden. (B) Ergebnis der ATMT von C. higginsianum Wildtyp (WT; CY5533) und ΔChku80 (CY6021) mit den ChPMA1-Deletionsplasmiden pDel-Pma1-1 bzw. pDel-Pma1-2. Abgebildet sind die Selektionsplatten (PDA mit Hygromycin) drei Tage nach dem Auflegen der Nylonfilter.

Die konstruierten Deletionsplasmide für ChPMA1 wurden anschließend mittels ATMT in C.

higginsianum Wildtyp und in den ΔChku80 Stamm (CY6021) transformiert. Die als Kontrolle

durchgeführte Transformation des Wildtyps resultierte in einer Vielzahl von Hygromycin-

resistenten Transformanten. Bei der ATMT des ΔChku80 Stammes wurden allerdings keine

oder nur sehr wenige Transformanten erhalten (Siehe Abb. 2.34B). In allen Transformanten

war die T-DNA ektopisch integriert (PCR-Daten nicht gezeigt). Dies deutet darauf hin, dass

es sich bei ChPMA1 um ein essentielles Gen handelt oder der resultierende Phänotyp einer

Deletion von ChPMA1 die Selektion auf Platten mit PDA-Medium verhinderte.

Die Konstruktion der ChPMA2-Deletionsplasmide pDel-Pma2-1 (pCK3349) und pDel-Pma2-

2 (pCK3350) erfolgte ebenfalls mittels des pOSCAR-Systems (Siehe Material und

Methoden). Durch homologe Rekombination sollten 2222 bp von ChPMA2 durch eine

Hygromycin-Resistenzkassette ersetzt werden (Siehe Abb. 2.35A).

Abbildung 2.35: Generierung von ΔChpma2 Knockout-Stämmen. (A) Schematische Darstellung der Deletionsstrategie von ChPMA2. 2222 bp von ChPMA2 sollten mittels homologer Rekombination durch eine Hygromycin-Resistenzkassette auf der T-DNA von pDel-Pma2-1/2 ersetzt werden. (B) Ergebnis der ATMT von C. higginsianum Wildtyp (WT; CY5533) und ΔChku80 (CY6021) mit den ChPMA2-Deletionsplasmiden pDel-Pma2-1 bzw. pDel-Pma2-2. Abgebildet sind die Selektionsplatten (PDA mit Hygromycin) vier Tage nach dem Auflegen der Nylonfilter.

Die Agrobacterium tumefaciens vermittelte Transformation von C. higginsianum ΔChku80

(CY6021) mit den ChPMA2-Deletionsplasmiden pDel-Pma2-1/2 resultierte, im Gegensatz zu

80

den Transformationen mit pDel-Pma1-1/2, in einer Vielzahl von Hygromycin-resistenten

Kolonien auf den Selektionsplatten (Siehe Abb. 2.35 B). Aus der Transformation von

ΔChku80 mit pDel-Pma2-1 wurden neun und aus der Transformation mit pDel-Pma2-2

sieben Stämme mittels PCR auf die Deletion von ChPMA2 analysiert. Zusätzlich wurden

jeweils zwei Stämme aus der ATMT von C. higginsianum Wildtyp mit pDel-Pma2-1 bzw.

pDel-Pma1-2 mittels PCR untersucht.

Abbildung 2.36: Überprüfung des ΔChpma2 Knockouts. (A/B) Schematische Darstellung des genomischen Lokus von ChPMA2 vor (A) und nach (B) der homologen Rekombination mit der T-DNA von pDel-Pma2-1/2. Zusätzlich wurden die verwendeten Primer der PCR-Analysen annotiert. (C) PCR für die Amplifikation eines internen ChPMA2-Fragmentes mit den Primerpaar a/b (Primer CK2746 und CK2747). (D) Diagnostische PCR zum Nachweis des Hygromycin-Resistenzgens mit den Primern c und d (CK2123 und CK2124). (E) PCR für den Nachweis der Insertion der Hygromycin-Resistenzkassette in den ChPMA2 Lokus (Primer e und f; CK2777/CK3262). M: 1kbp DNA-Leiter; K1-K4: CY5535 transformiert mit pDel-Pma2-1/2; 1-9: CY6021 transformiert mit pDel-Pma1-1; 10-17: CY6021 transformiert mit pDel-Pma1-2; 0: Wasserkontrolle; 17=CY6150; 1=CY6151; 10=CY6152; 14=CY6135

Die vier untersuchten Transformanten (K1-K4) aus der Kontrolltransformation des Wildtyp-

Stammes (CY5535) zeigten keine Deletion von ChPMA2. Dem gegenüber konnte für

fünfzehn der siebzehn untersuchten Stämme aus der Transformation von CY6021 mit pDel-

Pma2-1/2 die Insertion der Hygromycin-Resistenzkassette am ChPMA2-Lokus mit

geeigneten Primern nachgewiesen werden (Siehe Abb. 2.36E). In nur zwei Stämmen

81

(Spuren 3 und 8 in Abb. 2.36C) konnte ein internes Fragment von ChPMA2 amplifiziert

werden, wobei für einer dieser Stämme ebenso die erwartete Bande für eine erfolgreiche

homologe Rekombination erhalten wurde (Spur 8 in Abb. 2.36E). Dies könnte bedeuten,

dass ein Gemisch von Transformanten vorlag oder unvorhergesehene Deletionen

stattgefunden haben und wurde nicht weiter verfolgt.

Die erfolgreiche Inaktivierung von ChPMA2 zeigt, dass ChPMA2 kein essentielles Gen

darstellt. Die C. higginsianum ΔChpma2 Stämme CY6151, CY6152 und CY6153 wurden für

die Sprühinfektion von A. thaliana verwendet (Siehe Abb. 2.37). Als Kontrollen dienten der

ΔChku80 Ausgangsstamm CY6021 und ein Stamm mit ektopischer Integration der T-DNA

(CY6150).

Abbildung 2.37: Der Knockout von ChPMA2 führt zum Verlust der Pathogenität. (A) A. thaliana infiziert mit drei ΔChpma2 Stämmen (CY6151, CY6152 und CY6153), dem ΔChku80 Ausgangsstamm (CY6021) und einem Stamm mit ektopischer insertion der T-DNA von pDel-Pma2-2 (CY6150); abgebildet sind infizierte Blätter nach sieben Tagen und Trypanblaufärbungen von infizierten Blättern nach fünf Tagen. Größenmarker = 50 µm.

82

A. thaliana Pflanzen, die mit ΔChpma2 Stämmen infiziert wurden, zeigten selbst nach sieben

Tagen keine makroskopischen Symptome. In Trypanblaufärbungen waren nur Appressorien

sichtbar, aber weder Primär-noch Sekundärhyphen erkennbar (Abb. 2.37). Die drei

untersuchten ΔChpma2 Stämme zeigten damit einen ähnlichen Phänotyp wie die T-DNA

Insertionsmutanten vir-19, vir-22 und vir-24 mit Insertion der T-DNA im ORF von ChPMA2.

Im Gegensatz dazu war für den Stamm CY6150 mit ektopischer Integration der ChPMA2-

Deletionskassette kein, vom Kontrollstamm CY6021 abweichender, Phänotyp erkennbar.

2.4.3 Der Verlust von ChPMA2 korreliert mit einer verringerten pflanzlichen Abwehr von A. thaliana

Der beobachtete Phänotyp von ChPMA2 T-DNA Insertionsmutanten und von ΔChpma2

Knockoutmutanten während der Infektion von A. thaliana deutete auf einen Arrest der

Infektion während der Penetration hin. Eine mögliche Erklärung für die Unfähigkeit der

ΔChpma2 Mutanten für die Ausbildung von in planta Primär-bzw. Sekundärhyphen könnte

eine starke pflanzliche Abwehr darstellen. Vor allem eine starke Induktion von Callose-

Papillen unter Appressorien könnte den Pathogenitätsdefekt erklären, da dadurch die

Infektion im Stadium der Penetration verhindert wird (Birker et al., 2009; Ellinger et al., 2013).

Zudem wäre auch eine Hypersensitivität von ΔChpma2 Mutanten gegenüber freigesetzten

Abwehrstoffen wie z.B. H2O2 denkbar (Mellersh et al., 2002). Um zu testen, ob die

beobachtete Apathogenität von ΔChpma2 Stämmen und der ChPMA2 T-DNA

Insertionsmutanten aus einer starken Induktion der pflanzlichen Abwehr resultierte, wurde

diese mittels Färbungen mit Anilinblau und DAB (Diaminobenzidin) näher untersucht (siehe

Abb. 2.38) und in Tabelle 2.5 zusammengefasst.

83

Abbildung 2.38: Der Verlust von ChPMA2 korreliert mit einer verringerten pflanzlichen Abwehr von A. thaliana. A. thaliana Col-0 wurde mit ΔChku80 (CY6021) und ΔChpma2 (CY6151) (A) bzw. C. higginsianum Wildtyp (CY5535) und den ChPMA2 T-DNA Insertionsmutanten vir-12, vir-19, vir-22, vir-24, vir-97 und vir-102 infiziert (B). Nach drei Tagen wurden einzelne Blätter mit Anilinblau und DAB gefärbt und fotografiert. Für eine deutlichere Darstellung wurde die Helligkeit der Anilinblau Abbildungen nachträglich stark erhöht. Größenmarker = 50 µm.

Färbungen mit Anilinblau zeigten, dass keine Papillen unter den Appressorien von ΔChpma2

(CY6151) gebildet wurden, während bei 10% der Appressorien des Ausgangsstammes

CY6021 diese Abwehrreaktion zu beobachten war. Eine Färbung von reaktiven

Sauerstoffspezies mit DAB war für CY6151 nicht erkennbar (0%), wobei 5% der mit

ΔChku80 infizierten Epidermiszellen von A. thaliana eine Braunfärbung zeigten. Die

Induktion dieser Abwehrreaktionen durch ChPMA2 vir-Mutanten war unterschiedlich stark

ausgeprägt und schien vom Insertionsort der T-DNA abhängig zu sein.

84

Tabelle 2.5: Induktion der pflanzlichen Abwehr durch ChPMA2 vir-Mutanten und ΔChpma2

1Zahl in Klammern gibt T-DNA Insertionsort relativ zum ersten möglichen Startcodon von ChPMA2 an 2Quotient zwischen Appressorien mit darunter liegender Papille und Gesamtanzahl von Appressorien 3Quotient zwischen DAB gefärbten Epidermiszellen mit aufliegenden Appressorium und Gesamtanzahl von Appressorien

Die Bildung von Papillen war im Vergleich zum Wildtyp für alle vir-Mutanten reduziert (siehe

Abb. 2.38B). Dabei zeigte sich, dass besonders vir-24, vir-19 und vir-22 mit der T-DNA

Insertion innerhalb des ORF von ChPMA2 kaum Callosebalagerungen induzierten und mit

ΔChpma2 vergleichbare Werte aufwiesen. Die mittels DAB-Färbung analysierte Produktion

von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) war bei Infektionen mit vir-24, vir-19 und vir-22

ebenfalls sehr stark reduziert (1%). Die vir Mutanten vir-97 und vir-102 mit der T-DNA

Insertion ca. 500 bp upstream von ChPMA2 zeigten im Vergleich zu dem Wildtyp eine, in

etwa halb so starke, Induktion von ROS, aber mit 5 bzw. 6% noch deutlich häufiger als für

vir-19 und vir-22.

Auch wenn keine weiteren pflanzlichen Abwehrreaktionen wie z.B. die Expression PR-Genen

analysiert wurden, scheint der Verlust der Pathogenität von ΔChpma2-Mutanten nicht durch

eine verstärkte pflanzliche Abwehr hervorgerufen worden zu sein. Vor allem die vollständige

Abwesenheit von ROS deutet darauf hin, dass für diese Abwehrreaktion eine Penetration der

Wirtszelle erfolgen muss.

Stamm1 Anilinblau² DAB3 ΔChku80 (CY6021) 8,3% 5,3% ΔChpma2 (CY6151) 1% 0% Wildtyp (CY5535) 11,2% 6,7% vir-97 (-502) 5,3% 1,3% vir-102 (-483) 6,4% 1,7% vir-12 (-139) 5,6% 0% vir-24 (+130) 3,9% 0,3% vir-19 (+138) 1,1% 0,8% vir-22 (+454) 1,7% 1,1%

85

2.4.4 ChPMA2 ist für die Appressorienbildung von C. higginsianum nicht erforderlich

In Trypanblaufärbungen von A. thaliana Pflanzen infiziert mit ΔChpma2-Stämmen waren

nach sieben Tagen nur Appressorien sichtbar aber keinerlei Hyphen. Eine mögliche

Erklärung dafür könnte ein Defekt der Appressorienbildung und die dadurch resultierende

Unfähigkeit zur Penetration von ΔChpma2 Knockoutmutanten darstellen. Im Folgenden

wurde daher besonders die Appressorienbildung von ΔChpma2-Stämmen untersucht.

In der Rate der in vitro Appressorienbildung zwischen ΔChpma2-Mutanten und den ΔChku80

Ausgangsstamm konnten keine Unterschiede festgestellt werden. Auf 1,16-Hexadecandiol

beschichteten Petrischalen bildeten Konidien beider Stämme nach 12 Stunden zu >95%

Appressorien aus (Abbildung 2.39A). Da vermutlich Konidien ohne gebildeten Appressorium

im Rahmen der Trypanblaufärbung von den Blättern gewaschen wurden, war eine

Quantifizierung der in planta Appressorienbildung nicht möglich.

Abbildung 2.39: Appressorienbildung von ΔChpma2. (A) Appressorienbildung von ΔChpma2 (CY6151) und ΔChku80 (CY6021) nach 12 h auf Hexadekandiol beschichteten Petrischalen (in vitro) bzw. nach 24 h auf A. thaliana (in planta). (B) Mittels konfokaler Mikroskopie aufgenommene Appressorien-und Hyphenbildung von ΔChpma2 und ΔChku80 auf Zellulose (Dialyseschlauch) 48 h nach der Beimpfung. Abgebildet sind jeweils zwei Fokusebenen des gleichen Bildausschnittes. Größenmarker = 20 µm

Ein Vergleich von Trypanblaufärbungen von Infektionen (jeweils 1x106 Konidien/ml) mit

ΔChpma2- und ΔChku80 Stämmen nach 24 Stunden zeigte jedoch eine vergleichbare

Anzahl von Appressorien pro Bildausschnitt. Ein offensichtlicher morphologischer Defekt der

in planta und in vitro gebildeten Appressorien von ΔChpma2 Mutanten war ebenfalls nicht

erkennbar (siehe Abb. 2.39A). Sowohl die Größe und Form, als auch die Melanisierung von

Appressorien von ΔChpma2 entsprachen den von gebildeten Appressorien des

Ausgangsstammes. Die Fähigkeit zur Penetration von künstlichen Oberflächen durch

Appressorien wurde auf Zellophan (Zellulose Regenerat) getestet. Dazu wurden ca. 1 cm²

86

große Stücke Dialyseschlauch auf 1% Agarose gebettet und mit jeweils 1x105 Konidien von

ΔChku80 (CY6021) bzw. ΔChpma2 (CY6151) beimpft. Nach 48 Stunden hatten beide

Stämme auf der Oberfläche Appressorien gebildet (siehe Abb. 2.39B links). Aus diesen

Appressorien wuchsen zudem Hyphen, die ein verzweigtes Geflecht innerhalb des

Dialyseschlauches bildeten (siehe Abb. 2.39B rechts). Die Penetration der Oberfläche

erfolgte dabei immer mittels Appressorien, da unter Konidien ohne gebildeten Appressorium

keine Hyphen erkennbar waren. Dies weist darauf hin, dass ΔChpma2-Stämme weiterhin die

Fähigkeit besitzen künstliche Oberflächen mit Hilfe von Appressorien zu penetrieren. Nach

der Penetration waren die Stämme auch in der Lage mycelartig das Substrat zu kolonisieren,

wobei sich die Hyphen morphologisch stark von in planta gebildeten Primärhyphen

unterschieden.

Der beobachtete Unterschied von Stämmen mit Deletion von ChPMA2 zwischen der

Penetration von Dialyseschläuchen mit anschließender Hyphenbildung und das Fehlen

jeglicher Bildung von Hyphen in planta könnte aus einem unzureichenden Turgordruck der

Appressorien resultieren. Appressorien besitzen einen sehr hohen Turgordruck, der gezielt

gegen die pflanzliche Cuticula und Zellwand gerichtet wird und damit deren Penetration

ermöglicht (Deising et al., 2000). Dabei wird angenommen, dass die Melaninschicht eine

Diffusionsbarriere für die angereicherten Osmolyte im Appressorium darstellt (Jong et al.,

1997) und zusätzlich die pilzliche Zellwand verstärkt. Die Aufrechterhaltung der hohen

intrazellulären Konzentrationen der Osmolyte erfordert dabei vermutlich einen aktiven

Rücktransport nach deren Diffusion in dem Apoplasten durch z.B. H+/Glycerin Symporter

(Money, 1997).

Um zu überprüfen, ob die Generierung/Aufrechterhaltung des Turgors in Appressorien von

ΔChpma2 Mutanten beeinflusst ist, wurde versucht diesen mittels eines indirekten

Cytorrhyse Test zu bestimmen (Chen et al., 2004; Howard et al., 1991). Die

Appressorienbildung wurde in 1,16-Hexadecandiol beschichteten Petrischalen induziert und

nach 24 Stunden wurden verschiedene Konzentrationen des Osmolyten PEG-6000

hinzugegeben. PEG-6000 kann aufgrund seiner Größe nicht durch die Zellwand von

Appressorien diffundieren und führt zum sichtbaren Kollaps der Appressorien sobald der

externe osmotische Druck den Turgor übersteigt. Nach zehn Minuten Inkubationszeit mit den

PEG-Lösungen wurde die Anzahl der intakten und kollabierten Appressorien am Mikroskop

bestimmt (n>100). Das Ergebnis von drei unabhängigen Experimenten mit Appressorien von

ΔChku80 (CY6021) und ΔChpma2 (CY6151) ist grafisch in Abbildung 2.40 dargestellt.

87

Abbildung 2.40: Bestimmung des Turgors von Appressorien von ΔChku80 und ΔChpma2. 1x106 Konidien des jeweiligen Stammes wurden in 1,16-Hexadecandiol beschichteten Petrischalen für 24 h bei 25°C inkubiert. Das Wasser wurde anschließend durch 5 ml Lösungen von PEG60000 mit unterschiedlichen Konzentrationen ersetzt. (A) Nach zehn Minuten Inkubationszeit wurde die Cytorrhyse am Mikroskop dokumentiert. Dargestellt ist die Wasserkontrolle und der Effekt von 400 mg/ml PEG6000 auf Appressorien von CY6021 (ΔChpma2) und CY6151 (Kontrolle) bzw. der Effekt von 200 mg/ml PEG6000 auf Appressorien von vir-28. Der Größenmarker entspricht 10 µM. (B) Grafische Auswertung des Cytorrhse-Assays. Dargestellt sind die Ergebnisse dreier, unabhängiger Experimente mit jeweils mindestens 100 ausgezählten Appressorien pro Stamm (CY6021 und CY6151) und PEG6000 Konzentration.

Bis zu einer PEG6000 Konzentration von 300 mg/ml zeigten der ΔChpma2 Stamm CY6151

als auch der ΔChku80 Ausgangsstamm nur zu einem sehr geringen Prozentsatz (siehe Abb.

2.40B) kollabierte Appressorien. Im Gegensatz dazu kollabierten die Appressorien des

Kontrollstammes (vir-28) schon zu 100% bei einer Konzentration von 200 mg/ml (siehe Abb.

2.40A). Appressorien von vir-28 zeigen keinerlei Melanisierung (Korn et al., 2015) und sind

daher anscheinend nicht in der Lage einen hohen Turgor aufzubauen. 80% aller

Appressorien von CY6021 und CY6151 kollabierten bei einer PEG6000 Konzentration von

350 mg/ml. Diese Konzentration entspricht einem osmolytischen Druck von 2,6 MPa (Money,

1989). Dieser Wert ist mit den beschriebenen Wert von 2,4 MPa für C. graminicola

88

vergleichbar (Ludwig et al., 2014), aber viel geringer als der beschriebene Turgor der

Appressorien von Magnaporthe grisea von 8 MPa (Howard et al., 1991).

Die Experimente deuten darauf hin, dass die Appressorienbildung von ΔChpma2-Mutanten

nicht beeinflusst ist und ebenfalls, der für die Penetration erforderliche, Turgor aufgebaut und

aufrechterhalten wird.

2.4.5 Verwertung von Kohlenstoffquellen durch ΔChPma2-Mutanten

Die Restriktion der Infektion von ΔChpma2-Mutanten im Stadium der Penetration konnte

weder durch eine verstärkte pflanzliche Abwehr, noch durch Defekte in der

Appressorienbildung erklärt werden. Daher wurden Prozesse untersucht, die von der

Aktivität von Protonen ATPasen abhängig sind. Durch H+-ATPasen wird unter ATP-

Verbrauch das Membranpotenzial in Pflanzen, Pilzen und Bakterien aufgebaut. Die

Aufnahme vieler Nährstoffe erfolgt durch ein Kotransport des entsprechenden Substrats mit

Protonen. Im Folgenden wurde untersucht, ob der Verlust von ChPMA2 durch T-DNA

Insertionen oder durch eine gerichtete Deletion einen Einfluss auf die Aufnahme von

Glukose oder auf das vegetative Wachstum der entsprechenden C. higginsianum Stämme

ausübt.

2.4.5.1 Glukoseaufnahme von Appressorien

Das Genom von C. higginsianum kodiert für 363 putative MFS (Major Facilitator Superfamily)

Transportproteine von denen 94 zu der Gruppe der Zuckertransporter gehören. Mittels RNA-

Seq konnte gezeigt werden, dass während der Appressorienbildung die Expression von 14

Zuckertransporter induziert wird (O’Connell et al., 2012). Ein großer Teil der MFS-

Transporter nutzt dabei das Membranpotential der Zelle und fungiert als H+/Substrat-

Symporter (Pao et al., 1998). Eine mögliche Absenkung des Protonengradienten durch eine

Reduktion des Protonentransportes durch den Knockout von ChPMA2 hätte vermutlich eine

verminderte Aufnahmerate dieser Transporter zur Folge. Da ΔChpma2-Mutanten während

der Infektion von A. thaliana im Stadium der Penetration einen Defekt zu haben scheinen,

wurde die Aufnahme von Glukose als Testsubstrat im Vergleich zu dem ΔChku80

Ausgangsstamm in Appressorien untersucht.

In vitro gebildete Appressorien der Stämme CY6151 (ΔChpma2) und CY6021 (ΔChku80)

wurden in einer 0,1 mM Glukoselösung mit 0,2 µl 14C Glukose (entspricht 0,2 µCi) inkubiert.

Zu unterschiedlichen Zeitpunkten wurden die Appressorien gewaschen und anschließend

mittels Lysepuffer und Spatel aufgeschlossen. Ein Aliquot der erhaltenen Lysate wurde im

Szintillationszähler vermessen. Das Ergebnis ist in Abbildung 2.41 grafisch dargestellt.

89

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

1800

2000

0 2 5 10 20 30 30+10 mMGlukose

30+10 µMCCCP

cpm

t in Minuten

CY6021

CY6151

Abbildung 2.41: Aufnahme von 14C markierter Glukose. Jeweils 1x106 Konidien von CY6021 (ΔChku80) und CY6151 (ΔChpma2) wurden in 1,16-Hexadecandiol beschichteten Petrischalen inkubiert. Die Rate der Appressorienbildung der beiden Stämme lag nach 16 h bei circa 96%. Anschließend wurden die Appressorien in 0,1mM 14C markierter Glukoselösung (0,2 µCi) inkubiert. Zu unterschiedlichen Zeitpunkten wurden jeweils die Appressorien einer Petrischale mit Spatel und Lysepuffer aufgeschlossen und die Aufnahme der markierten Glukose mittels eines Szintillationszählers bestimmt. cpm: counts per minute

Wie aus dem Graphen der Abbildung 2.41 ersichtlich, enthielten Appressorien beider

getesteten C. higginsianum Stämme im ungefähr gleichen Maße 14C markierte Glukose.

Sowohl im zeitlichen Verlauf, als auch in der gemessenen Radioaktivität nach 30 Minuten

zeigen sich zwischen ΔChpma2 (CY6151) und den ΔChku80 Ausgangsstamm (CY6021) nur

geringfügige Abweichungen. Die Aufnahme der markierten Glukose konnte durch 10 mM

nicht markierter Glukose (50.000facher Überschuss) kompetitiv gehemmt werden. Die

Zugabe von CCCP (Carbonyl-cyanid-m-chlorophenyl-hydrazon) als Entkoppler des

Protonengradienten (Kasianowicz et al., 1984) inhibierte zudem die Aufnahme von Glukose

vollständig. Dies deutete auf eine aktive Aufnahme von Glukose durch einen gleichzeitigen

Transport mit Protonen hin, der in beiden Stämmen im ähnlichen Maße stattfand. Die

Aufnahme der Glukose erfolgte dabei vermutlich hauptsächlich durch das ehemalige

Konidium, da die Melaninschicht des Appressoriums wahrscheinlich für Glukose

impermeabel ist. Für das ehemalige Konidium wurde allerdings vorgeschlagen, dass es nach

einer erfolgreichen Bildung eines Appressoriums biologisch inaktiv ist und Apoptose einleitet

(Veneault-Fourrey et al., 2006).

90

2.4.5.2 Vegetatives Wachstum in Abhängigkeit verschiedener Kohlenstoffquellen

Um zu analysieren, ob der Verlust von ChPma2-Aktivität zu einer verringerten Aufnahme von

Kohlenhydraten und damit zu einem verringerten radialen Wachstum führt, wurde das

Wachstum von ChPMA2 Knockout und T-DNA Insertionsmutanten auf Medien mit

unterschiedlichen Kohlenstoffquellen mit dem des Ausgangsstammes verglichen. Als

Medium diente dafür zum einen PDA als Vollmedium und zum anderen Yeast Nitrogen Base

(YNB) Minimalmedium, was mit 2% Glukose, Saccharose, Ammoniumacetat, oder Galaktose

als Kohlenstoffquelle versetzt wurde.

Abbildung 2.42: Radiales Wachstum von ΔChpma2 und ChPMA2 T-DNA Insertionsmutanten in Abhängigkeit von der Kohlenstoffquelle. Das Wachstum der T-DNA Insertionsmutanten vir-12, vir-22, vir-24, vir-97 und vir-102 wurde im Vergleich zum Wildtyp (CY5535) analysiert. Für die ΔChpma2 Mutante diente der parentale ΔChku80 Stamm CY6021 als Kontrolle. Platten mit PDA und YNB mit unterschiedlicher Kohlenstoffquelle wurde mit 500 Konidien der entsprechenden C. higginsianum Stämme betropft und nach fünf Tagen fotografiert.

Im Vergleich zum parentalen ΔChku80 (CY6021) Stamm zeigte sich ein leicht verringertes

Wachstum der ΔChpma2 Mutante (CY6151) auf Platten mit PDA und auf Platten mit

Minimalmedium mit Glukose, Saccharose bzw. Ammoniumacetat (siehe Abb. 2.42).

91

Die ChPMA2 T-DNA Insertionsmutanten unterschieden sich untereinander im Durchmesser

der gebildeten Kolonien. Mutanten mit der T-DNA Insertion nahe (vir-12) oder direkt im ORF

(vir-22, vir-24) zeigten ein reduziertes Wachstum auf PDA und auf YNB-Platten mit

Saccharose, Glukose bzw. Ammoniumacetat und verhielten sich damit wie die ΔChpma2

Deletionsmutante CY6151. Im Unterschied dazu, zeigten die Mutanten vir-97 und vir-102 mit

der T-DNA Insertion upstream von ChPMA2 ein, mit dem des Wildtyps, vergleichbares

Wachstum. Damit korreliert der Pathogenitätsphänotyp mit einem leicht verminderten

vegetativen Wachstum auf Glukose und Saccharose als Kohlenstoffquelle, obwohl in

vorangegangenen Experimenten kein Unterschied in der Aufnahme von Glukose zwischen

CY6021 und CY6151 beobachtet werden konnte.

Interessanter Weise zeigte die ΔChpma2 Deletionsmutante CY6151 ein stärkeres Wachstum

als der parentale ΔChku80 Stamm auf Minimalmedium mit Galaktose als Kohlenstoffquelle.

Die apathogenen T-DNA Insertionsmutanten unterschieden sich ebenfalls im Durchmesser

der Kolonien vom Wildtyp und den T-DNA Mutanten mit nur reduzierter Pathogenität.

Morphologisch schienen die Kolonien von ΔChpma2 und vir-12, vir-22 und vir-24 ein

stärkeres Hyphenwachstum auf Galaktose aufzuweisen und aufgrund der beginnenden

Orangefärbung eher mit der Neubildung von Konidien zu beginnen.

2.4.5.3 Die Katabolitrepression von C. higginsianum ist in unabhängig von ChPMA2

Die Katabolitrepression stellt in vielen Mikroorganismen die bevorzugte Aufnahme und

Verwertung von energetisch günstigen Zuckern gegenüber weniger bevorzugten

Kohlenstoffquellen sicher. Glukose als bevorzugtes Kohlenhydrat reguliert dabei die

Expression einer Vielzahl von katabolischen Enzymen und Transportern, darunter auch die

des Galaktose-Stoffwechsels (Gancedo, 1998; Matern and Holzer, 1977). Das stärkere

Wachstum von Chpma2-Mutanten auf Galaktose könnte auf eine Beeinflussung der

Katabolitrepression durch den Verlust von ChPma2-Aktivität hindeuten. Stämme mit

deregulierter Expression der GAL-Gene könnten diese eher verwerten und hätten dadurch

gegenüber dem Wildtyp einen Wachstumsvorteil. Für andere pilzliche Pathogene wie

Magnaporthe oryzae (Fernandez and Wilson, 2012), Sclerotinia sclerotiorum (Reymond-

Cotton et al., 1996), Cochliobolus carbonum (Tonukari et al., 2000), Gibberella fujikuroi und

Botrytis cinerea (Tudzynski et al., 2000) konnte eine mögliche Verbindung der

Katabolitrepression mit der Pathogenität gezeigt werden.

Um diese Hypothese zu überprüfen, wurde mittels Allylalkohol getestet, ob in ΔChpma2-

Stämmen die Katabolitrepression beeinflusst ist. Durch die Alkoholdehydrogenase wird

Allylalkohol zu Acrolein oxidiert. Das gebildete Acrolein ist sehr reaktiv und dadurch stark

toxisch. In Anwesenheit von Glukose unterliegt die Alkoholdehydrogenase ADH2 von S.

92

cerevisiae der Katabolitrepression (Laudano et al., 1992). In Anwesenheit von Glukose im

Medium ist daher Allylalkohol nicht toxisch, da es nicht verstoffwechselt wird. In Anwesenheit

einer nicht-reprimierenden Kohlenstoffquelle wie z.B. Galaktose wird hingegen ADH

exprimiert und die Umsetzung von Allylalkohol führt zum Zelltod. Ein vermutliches C.

higginsianum Ortholog für Adh1 aus S. cerevisiae wurde mittels BLAST-Analysen

identifiziert. CH063_07198 zeigte dabei 60% Sequenzidentität mit ScAdh1.

Die zu testenden C. higginsianum Stämme wurden zunächst auf Platten mit Minimalmedium

mit Glukose bzw. Galaktose angezogen. Jeweils zwei frische Minimalmedium-Platten mit 2%

Glukose bzw. 2% Galaktose wurden anschließend mit dem gebildeten Myzel der

entsprechenden C. higginsianum Stämme beimpft. Eine dieser Platten diente als Kontrolle,

während auf der zweiten ein Papierfilter mit Allylalkohol aufgelegt wurde. Nach fünf Tagen

wurde das Wachstum dokumentiert (siehe Abb. 2.43).

Abbildung 2.43: Katabolitrepression von C. higginsianum. Minimalmedium Platten (YNB) mit 2% Glukose bzw. Galaktose als Kohlenstoffquelle wurden mit Myzel von Wildtyp (CY5525), ΔChku80, ΔChpma2 und den T-DNA Insertionsmutanten vir-22, vir-24, vir-12, vir-102 und vir-97 beimpft. Platten mit Galaktose wurden dabei mit Myzel von Galaktose-Platten und Platten mit Glukose mit Myzel von Glukose-Platten beimpft. Auf jeweils eine Platte wurde ein mit 25 µl Allylalkohol getränkten Papierfilter gegeben. Nach fünf Tagen wurden die Platten fotografiert.

T-DNA Mutanten mit Insertion der T-DNA im ORF von ChPMA2 und der ΔChpma2

Knockoutstamm CY6151 zeigten erneut stärkeres Wachstum auf Platten mit Galaktose als

der Wildtyp bzw. T-DNA Insertionsmutanten mit Insertion im potentiellen Promotorbereich

von ChPMA2 (vir-97, vir-102). Auf Platten mit Glukose war hingegen kein offensichtlicher

93

Unterschied im Wachstum erkennbar. Eine Zugabe von Allylalkohol auf Platten mit Glukose

hatte keine Reduktion des Wachstums zur Folge. Dies deutet darauf hin, dass die

Alkoholdehydrogenase von C. higginsianum der Katabolitrepression durch Glukose

unterliegt. Auf Platten mit Galaktose hingegen wurde das Wachstum aller getesteten

Stämme durch Allylalkohol inhibiert. Der Verlust von ChPma2 scheint keinen Einfluss auf die

Katabolitrepression zu haben, da auch die ΔChpma2 Knockoutmutante auf Platten mit

Glukose und Allylalkohol normales Wachstum zeigte. Die Ursache des verstärkten

Wachstums von Chpma2-Mutanten auf Galaktose konnte nicht geklärt werden. Für Ustilago

maydis wurde allerdings eine wachstumshemmende Wirkung von Galaktose impliziert

(Schuler et al. 2015). Das leicht reduzierte Wachstum von Chpma2-Mutanten auf Medien mit

Glukose deutet auf eine reduzierte Aufnahme dieses Kohlenhydrates hin. Eine ebenfalls

reduzierte Aufnahme von möglicherweise wachstumshemmender Galaktose durch Chpma2-

Stämme könnte eine Erklärung für das beobachtete stärkere Wachstum darstellen.

2.4.6 Expressionsanalysen von ChPMA1 und ChPMA2

Der Verlust von ChPMA2 durch T-DNA Insertion im ORF bzw. durch gezielten Knockout

führt zur Verlust der Pathogenität dieser Stämme im Stadion der Penetration. Das vegetative

Wachstum zeigte im Vergleich zum Wildtyp je nach verwendeter Kohlenstoffquelle nur

leichte Unterschiede auf (sieh Abb. 2.42). ChPMA2 scheint daher eine spezifische Rolle für

die Pathogenität zu besitzen und ist sonst für C. higginsianum nicht von wesentlicher

Bedeutung. Im Gegensatz dazu war ein gezielter Knockout von ChPMA1 nicht erfolgreich,

was darauf hindeutet, dass diese Protonenpumpe eine essentielle Funktion für das

Wachstum für C. higginsianum besitzt. Im Folgenden wurde die Expression beider H+-

ATPasen während verschiedenen Stadien näher untersucht und miteinander verglichen. Die

publizierten RNA-Seq Werte (O’Connell et al., 2012) beider Protonenpumpen sind in Tabelle

2.6 dargestellt. Die Annotation des Genoms

(http://www.broadinstitute.org/annotation/genome/ colletotrichum_group/ MultiHome.html) ist

leider für ChPMA1 fehlerhaft, da das Gen auf zwei Contigs verteilt ist. Folglich gibt es zwei

Gene IDS für ChPMA1 wobei CH063_02576 den Amino-Terminus enthält während

CH063_00553 das Carboxylende kodiert. Tabelle 2.6: RNA-Seq Daten der Expression von ChPMA1 und ChPMA2

Gene IDa VAb PAb BPb NPb ChPMA1a CH063_00553 92 372 555 1572 ChPMA1b CH063_02576 198 864 1247 3401 ChPMA2 CH063_09060 8142 3785 7780 10440 ChTUBα CH063_01222 603 752 862 2048

94

aGene ID entsprechend der Annotation des Colletotrichum Sequencing Project, Broad Institute of Harvard and MIT (http://www.broadinstitute.org/) b Durchschnittlicher Messwert von drei biologischen Replikaten für jedes Entwicklungsstadium (O’Connell et al., 2012) (VA: in vitro Appressorien; PA: in planta Appressorien; BP: biotrophe Phase; NP: nekrotrophe Phase). Die Werte wurden zu der Gesamtzahl der Messwerte des entsprechenden Stadiums normalisiert.

Die fehlerhafte Annotation von ChPMA1 wird in den RNA-Seq Expressionswerten ersichtlich

(O’Connell et al., 2012). Die Expression des 5‘-Bereichs (Gene ID CH063_00553) beträgt

nur ca. 50% der erhaltenen Expressionswerte für den 3‘-Bereich (Gene ID CH063_02576).

Dieser Unterschied beruht vermutlich auf der unterschiedlichen Effektivität der cDNA-

Synthese dieser Bereiche. Die Expression von ChPMA2 ist laut den RNA-Seq Daten in allen

untersuchten Stadien höher als die Summe beider Teile von ChPMA1. Besonders in in vitro

Appressorien (VA) beträgt der Unterschied Faktor 40. Der Expressionswert von ChPMA2

während der nekrotrophen Phase ist der neunt stärkste Wert aller Gene von C. higginsianum

für dieses Stadium. Die sehr starke Expression von ChPMA2 steht damit im Widerspruch zu

der Annahme, dass ChPma1 die Hauptprotonenpumpe in C. higginsianum darstellt. Es war

folglich wichtig die Expression dieser beiden Gene zu überprüfen.

2.4.6.1 PCR-Analysen der Expression von ChPMA1 und ChPMA2

Die Expression von ChPMA1 und ChPMA2 wurde mittels semiquantitativer RT-PCR und

Real Time Quantitative RT-PCR untersucht. Damit sollte zum einen die publizierten RNA-

Seq Daten überprüft werden, vor allem mit Berücksichtigung der fehlerhaften Annotation von

ChPMA1. Zum anderen sollte die Expression in Stadien von C. higginsianum analysiert

werden, die in der RNA Sequenzierung (O’Connell et al., 2012) nicht berücksichtig wurden.

Da RNA-Seq Daten nur für wenige Pathogenitäts-relevanten Proben vorlagen, wurde initial

die Expression beider Protonenpumpen während der Myzelbildung in Flüssigkultur

analysiert. Nach 24, 48, 72 und 96 h Wachstum von C. higginsianum Wildtyp (CY5535) in

modifizierten Mathur-Flüssigmedium wurden Proben genommen aus denen anschließend

RNA isoliert wurde. Für die Expressionsanalyse wurde cDNA generiert und eine

semiquantitative PCR für ChPMA1 und ChPMA2 durchgeführt. Die Expression von ChTUBα

(CH063_01222) wurde ebenfalls bestimmt, da für Tubulin eine konstante Expression

angenommen wurde. Die verwendeten Primer sollten Fragmente mit vergleichbarer Länge

im 3‘-Bereich der jeweiligen Gene amplifizieren. Eine Amplifikation von DNA wurde durch

das Design der Oligonukleotide ausgeschlossen, da 5‘-und 3‘-Ende der Targetsequenz

jeweils eines Primers durch ein Intron getrennt sind. Das Ergebnis der semiquantitativen

PCR mit drei biologischen Replikaten ist in Abbildung 2.44 dargestellt.

95

Abbildung 2.44: PCR-Analyse der Expression von ChPMA1 und ChPMA2 während des Wachstums in Flüssigmedium. Aus jeweils drei Replikaten pro Zeitpunkt (24 h, 48 h, 72 h und 96 h) des Wachstums von C. higginsianum Wildtyp in Flüssigmedium (modifiziertes Mathur-Medium) wurde RNA isoliert und in cDNA umgeschrieben. Die erhaltenen cDNA wurde in einer semiquantitativen PCR mit folgenden Primerpaaren verwendet: ChPMA1 (CK4279/CK4280); ChPMA2 (CK4281/CK4282); ChTUBα (CK3959/CK3960). Abgebildet sind 1,8% Agarosegele mit den aufgetragenen PCR-Produkten. Die Aufnahmen erfolgten mit identischen Einstellungen. M = 50 bp Marker; K = Kontrollansatz mit chromosomaler DNA als Template

Die erhaltenen Banden für ChPMA1 sind in allen untersuchten Zeitpunkten intensiver als die

Banden für ChPMA2 und ChTUBα. Dies deutet darauf hin, dass ChPMA1 in Myzel stärker

exprimiert wird als ChPMA2. Die Intensität der Banden für ChPMA1 schien zudem im

zeitlichen Verlauf zuzunehmen. Im Gegensatz dazu wurden die erhaltenen Banden für

ChPMA2 in ihrer Intensität schwächer. Die Banden für Tubulin deuteten auf eine eher

gleichbleibende Expression dieses Kontrollgens hin. Mittels semiquantitativer PCR war es

allerdings schwierig die Expression von ChPMA1 direkt mit der von ChPMA2 zu vergleichen,

da sich Unterschiede in der Intensitäten von Banden kaum in absolute Werte abschätzen

lassen.

Für eine direkte Quantifizierung der Transkriptmengen von ChPMA1 und ChMA2 wurden

daher quantitative Real Time PCRs durchgeführt deren Ergebnisse in Abbildung 2.45

zusammengefasst sind. Als Template dienten dafür jeweils drei biologische Replikate von

Konidien, in vitro Appressorien, Myzelproben nach 48 h und 72 h (Mathur-Flüssigmedium)

des C. higginsianum Wildtypstammes (CY5535). Zudem wurden bereitgestellte RNA-Proben

aus der Infektion von A. thaliana Col-0 (zwei und drei dpi) (P. Gebauer, persönliche

Mitteilung).gemessen

96

Abbildung 2.45 Bestimmung der Expression von ChPMA1 und ChPMA2 mittels quantitativer Real Time PCR. (A) Mittels quantitativer Real Time PCR ermittelte Transkriptmenge (drei biologische Replikate mit jeweils drei technischen Replikaten) von ChPMA1 und ChPMA2 in Konidien (K), in vitro Appressorien (AP), Myzel (24 h bzw. 48 h in Mathur-Flüssigmedium) und während der Infektion von A. thaliana Col-0 nach drei und vier Tagen (3 dpi, 4 dpi). Jeweils 1 µg RNA wurde mittels Reverse Transkriptase und Oligo dT-Primer in cDNA umgeschrieben. Für die qPCR wurden folgende Primerpaare verwendet: ChPMA1 (CK4279/CK4280); ChPMA2 (CK4281/CK4282); ChTUBα (CK3959/CK3960). Die Daten wurden relativ zu der Expression von ChTUBα dargestellt. (B) ChPMA2 Expression relativ zu der ChPMA2 mRNA Menge in Konidien (K=1).

In Konidien zeigte ChPMA1 mit der circa achtfachen Transkriptmenge im Vergleich zu

ChTUBα eine sehr starke Expression auf (siehe Abb. 2.48A). Dem gegenüber war ChPMA2

in Konidien mit circa 1/64 der Expression von ChTUBα nur sehr schwach exprimiert.

Aufgrund des starken Unterschiedes der Transkriptmengen scheint ChPma1 in Konidien für

die Generierung des Plasmamembranpotenzials zuständig zu sein. In Appressorien steigt im

Vergleich zu Konidien die gemessene Transkriptmenge von ChPMA2 stark an (>100fach)

und erreicht in etwa die Hälfte der Menge des Transkriptes von ChPMA1. Das Verhältnis der

Transkriptmengen von ChPMA1 und ChPMA2 steht damit im Widerspruch zu den

Expressionsdaten der RNA-Seq (O’Connell et al., 2012), in denen ChPMA2 in in vitro

Appressorien 20mal höhere Werte aufwies als ChPMA1 (siehe Tabelle 2.6). Im Vergleich zu

97

Konidien zeigten die Myzelproben eine stärkere Expression von ChPMA1 und erreichten

nach 72 h die 32fache Transkriptmenge von ChTUBα. Die gemessenen Expressionswerte

von ChPMA2 erreichten in 48 Stunden alten Myzel die 50fache Transkriptmenge wie in

Konidien, zeigten aber einen deutlichen Rückgang der Expression nach 72 Stunden. Diese

Werte für die Transkriptmengen von ChPMA1 und ChPMA2 stehen im Einklang mit den

Ergebnissen der semiquantitativen PCR (siehe Abb. 2.44), bei welchen im zeitlichen Verlauf

der Myzelbildung ebenfalls eine Zunahme der ChPMA1 Expression und ein Rückgang der

Expression von ChPMA2beobachtet wurde. Die starke Expression von Protonenpumpen

könnte durch das starke Wachstum erklärbar sein, welches eine erhöhte Aufnahme von

Nährstoffen und dadurch eine starke Protonentransportkapazität erfordert. Für die Infektion

von A. thaliana wurden keine Proben mit sehr frühen Stadien (1 dpi) analysiert, da die

absoluten RNA-Mengen von C. higginsianum in diesen Proben sehr gering sind und eine

Quantifizierung verhindern. In den in planta Proben nach drei und vier Tagen nach der

Sprühinfektion zeigten ChPMA2 und ChPMA1 vergleichbare Werte auf. Die gemessene

Transkriptmenge von ChPMA1 ist allerdings erneut viel höher als die Expressionswerte der

RNA-Seq, was vermutlich auf die inkorrekte Auswertung der RNA-Seq aufgrund der

fehlerhaften Annotation von ChPMA1 zurückzuführen ist.

Die Werte der quantitativen Real Time PCR bestätigen die Annahmen, dass ChPma1 die

essentielle Hauptprotonenpumpe darstellt, während ChPma2 eine spezifische Rolle für die

Infektion besitzt. Vor allem der starke Unterschied der Transkriptmengen dieser Gene in

Konidien und Myzel bietet eine Erklärung warum die Versuche des Knockouts von ChPMA1

nicht erfolgreich waren, während das Wachstum von ΔChpma2 Stämmen sich nur schwach

von dem des Ausgangstammes unterschieden hat.

Da eine Induktion der ChPMA2-Expression in Appressorien im Vergleich zu Konidien

beobachtet werden konnte, wurde versucht das Expressionsmuster von ChPMA1 und

ChPMA2 im zeitlichen Verlauf der in vitro Appressorienbildung näher zu untersuchen. Dazu

wurden RNA-Proben eines Zeitverlaufes der in vitro Appressorien von C. higginsianum

Wildtypstamm CY5535 mittels quantitativer Real Time RT-PCR analysiert. Das Ergebnis von

zwei Messungen ist in Abb. 2.46 dargestellt.

98

Abbildung 2.46: Quantitative Real Time PCR der Expression von ChPMA1 und ChPMA2 während der in vitro Appressorienbildung. Mittels quantitativer Real Time PCR ermittelte Transkriptmenge (zwei Messungen mit jeweils drei technischen Replikaten) von ChPMA1 und ChPMA2 während der in vitro Appressorienbildung auf beschichteten Petrischalen. Die Daten wurden relativ zu der Expression von ChTUBα dargestellt. Für die qPCR wurden folgende Primerpaare verwendet: ChPMA1 (CK3761/CK3762); ChPMA2 (CK3763/CK3764) ChTUBα (CK3959/CK3960).

Zwischen null (entspricht Konidien) und vier Stunden der Appressorienbildung liegt das

Verhältnis der Transkriptmengen von ChPMA1 und ChPMA2 bei über Faktor 100 zugunsten

von ChPMA1 und bestätigt damit den Wert von Konidien der vorherigen qPCR (siehe Abb.

2.45). Acht Stunden nach der Induktion der Appressorienbildung wird die Expression von

ChPMA2 stark induziert (>110fach im Vergleich zu 0 h). Die Expression von ChPMA1 wird

nach acht Stunden um Faktor drei induziert. Der acht Stunden Wert entspricht einen

Zeitpunkt, an den die in vitro Appressorienbildung weitgehend abgeschlossen ist und das

neu gebildete Appressorium melanisiert. Die qPCR-Daten zeigen, dass die Expression

ChPMA2 erst am Ende der in vitro Appressorienbildung induziert wird. Diese

Expressionsdaten sind auch im Einklang mit dem beobachteten Phänotyp von ΔChpma2

Stämmen, bei denen die initiale Appressorienbildung keine Auffälligkeiten zeigten. ChPMA2

scheint daher für die Induktion der Bildung von Appressorien und der eigentlichen

Appressorienbildung nicht beteiligt zu sein, sondern erst für den folgenden Infektionsprozess

eine essentielle Rolle zu spielen.

99

2.4.6.2 Analyse der Expression von ChPMA1 und ChPMA2 mittels Reportergenen

Die Expression von ChPMA1 und ChPMA2 wurde weiter durch Reportergenfusionen

untersucht. Die Expression von Fluoreszenzproteinen unter der Kontrolle der Promotoren

von ChPMA1 und ChPMA2 erlaubte im Gegensatz zu den PCR-Analysen eine

Unterscheidung des Expressionsmuster in individuellen Zellen.

Die T-DNA des Plasmides pPN-Ppma2-mCherry (pCK3880) enthält mCherry unter der

Kontrolle des ChPMA2-Promotors (bis -1024 bp vor dem ORF von ChPMA2) exprimiert wird.

Durch die verwendete Klonierungsstrategie wurden drei Nukleotide zwischen

Promotorfragment und mCherry eingefügt (siehe Abb. 2.47A). Ebenso wurden durch die

Konstruktion von pPK2-Ppma1-GFP (pCK3973) zusätzliche Basenpaare zwischen Promoter

(bis -647 bp vor dem ORF von ChPMA1) und GFP eingefügt. Die T-DNA der Plasmide pPN-

Ppma2-mCherry und pPK2-Ppma1-GFP wurden über ATMT ektopisch in C. higginsianum

Wildtyp integriert. Von den erhaltenen Transformanten wurden CY6434 (Ppma1-GFP) und

CY6269 (Ppma2-mCherry) wurden während verschiedener Stadien mittels konfokaler

Mikroskopie analysiert.

100

Abbildung 2.47 Expression von mCherry und GFP unter der Kontrolle des ChPMA1 bzw. ChPMA2 Promotors. (A) Schematische Darstellung der T-DNAs von pPN-Ppma2-mCherry (pCK3880) und pPK2-Ppma1-GFP (pCK3973). Schwarz eingerahmt sind Nukleotide die durch die Klonierungsstrategie hinzugefügt wurden. Die angegebenen Zahlen spiegeln die Position der eingesetzten Promotorfragmente relativ zu den Startcodon von ChPMA1 bzw. ChPMA2 in C. higginsianum Wildtyp wieder. (B-D) Fluoreszenzmikroskopische (CLSM) Aufnahmen von CY6363 (Ppma1-GFP) und CY6269 (Ppma2-mCherry) während des vegetativen Wachstums in Mathur Flüssigmedium (B), der in vitro Appressorienbildung in IBIDI µDishes (C) und während der Infektion von A. thaliana Col-0 (D). Größenmarker entspricht 10 µm.

Während des Myzelwachstums in Mathur-Flüssigmedium von CY6363 (Ppma1-GFP) war

GFP-Fluoreszenz und damit ChPMA1-Promotoraktivität in allen Zellen sichtbar (Abb. 2.47B).

Die Stärke der beobachteten Fluoreszenz von GFP schien dabei im zeitlichen Verlauf

zuzunehmen. ChPMA2-Promotoraktivität war ebenfalls durch ein starkes mCherry-Signal in

dem gebildeten Myzel von CY6269 (Ppma2-mCherrry) nachweisbar. Im Gegensatz zu den

Beobachtungen für GFP nahm die Fluoreszenz von mCherry während der Myzelbildung ab.

Sowohl die Intensität, als auch der Anteil der Zellen mit Expression von mCherry ging im

101

zeitlichen Verlauf zurück. Die Zunahme bzw. die Abnahme des beobachteten

Fluoreszenzsignals ist damit im Einklang mit der quantitativen Real-Time PCR der

Expression von ChPMA1 und ChPMA2 (siehe Abb. 2.45A). Während der in vitro

Appressorienbildung war ein deutliches GFP-Signal sowohl in Konidien (0 h), als auch in den

neu gebildeten Appressorien (ab 8 h) sichtbar (Abb. 2.47C). Dem gegenüber war keine

ChPMA2-Promotoraktvität in Konidien und unmelansierten Appressorien (8 h) sichtbar. Erst

nach zehn Stunden war Fluoreszenz von mCherry sichtbar, welche allerdings auf das

Appressorium beschränkt war. Im Vergleich zu den Ergebnissen der PCR-Analysen gab es

im Zeitpunkt der Induktion der Expression von ChPMA2 von acht Stunden in der qRT-PCR

(Abb. 2.46) und zehn Stunden bis zu einem mCherry-Signal eine Differenz von zwei

Stunden. Dieser Unterschied könnte zum Teil in der benötigten Zeit für die Translation und

Faltung von mCherry zurückzuführen sein, da in Real Time PCR Analysen die Menge der

RNA quantifiziert wurde. Des Weiteren unterschieden sich aus technischen Gründen die

Parameter der Appressorienbildung zwischen beiden Experimenten. Während der Infektion

von A. thaliana mit CY6363 (Ppma1-GFP) zeigte sich GFP-Fluoreszenz in allen in planta

gebildeten Infektionsstrukturen. Das GFP-Signal war in Sekundärhyphen intensiver als in

Primärhyphen, was auf eine Zunahme der Aktivität des ChPMA1-Promotors in späteren

Stadien der Infektion hinweist (siehe auch Abb. 2.45A). Die mCherry-Fluoreszenz vom

Ppma2-mCherry war ebenfalls in allen Primär-und Sekundärhyphen sichtbar. Das Verhältnis

der Fluoreszenzintensität zwischen Primär-und Sekundärhyphen war aber eher

ausgeglichen. Das in planta Expressionsmuster von mCherry ähnelte damit sehr stark dem

von GFP. Die ehemaligen Konidien auf der Pflanzenoberfläche zeigten im Gegensatz zu den

Beobachtungen während der in vitro Appressorienbildung (Abb. 2.47C) weder GFP noch

mCherry-Fluoreszenz. Allerdings ist unklar ob Konidien von C. higginsianum nach einer

erfolgreichen Penetration des Wirtes wie Konidien von Magnaporthe oryzae Autophagie

einleiten (Veneault-Fourrey et al., 2006) oder auch in späteren Infektionsprozess noch aktiv

sind, wie es bei Colletotrichum gloeosporioides (Nesher et al., 2008) der Fall ist.

Die Promotoraktivität von ChPMA2 war während der Appressorienbildung auf das neu

gebildete Appressorium begrenzt war. Dies bekräftigt die Annahme einer speziellen Funktion

von ChPma2 während der frühen Phasen der Infektion. ChPMA1 scheint hingegen in allen

Zellen von C. higginsianum exprimiert zu werden. Eine Quantifizierung der Promotoraktivität

von ChPMA1 und ChPMA2 war allerdings durch die Analyse dieser Stämme nicht möglich,

da eine Vielzahl von Parametern das beobachtete Fluoreszenzsignal beeinflusste. Sowohl

die Anzahl, als auch der Insertionsort der T-DNAs in den entsprechenden C. higginsianum

Stämmen könnte einen starken Einfluss auf die Expression von GFP und mCherry besitzen,

was auch durch unterschiedliche Intensitäten der Fluoreszenzsignale zwischen den

Transformanten (nicht gezeigt) deutlich wurde. Ebenso weisen GFP und mCherry

102

unterschiedliche spektrale Eigenschaften wie z.B. Photostabilität und Helligkeit auf (Shaner

et al., 2005), wodurch ein stärkeres Fluoreszenzsignal von GFP im Vergleich zu mCherry

nicht gleichbedeutend mit einer stärkeren Expression des Fluoreszenzproteins ist.

2.4.6.3 Lokalisierung von ChPma1 und ChPma2

ChPMA1 und ChPMA2 zeigten unterschiedliche Regulation auf der der Transkript-Ebene.

Die Expression von mCherry unter der Kontrolle des ChPMA2-Promotors zeigte zudem eine

spezifische Aktivität des ChPMA2-Promotors in Appressorien. Um zu analysieren, ob sich

die beiden ATPasen nicht nur in ihrer mRNA-Expression, sondern auch in ihrer

Proteinakkumulation und Lokalisation unterscheiden, wurde versucht ChPma1 bzw. ChPma2

als Fusionsproteine mit GFP oder mCherry in C. higginsianum zu exprimieren. Die initialen

Versuche einer ektopischen Expression von ChPMA2 mit C- bzw. N-terminaler GFP-Fusion

schlugen allerdings fehl (Daten nicht gezeigt). Erst durch die Verwendung eines von

Johannes Schmidpeter modifizierten pOSCAR-Systems konnten entsprechende C.

higginsianum Transformanten erhalten werden.

C. higginsianum Stämme mit in Lokus Fusionen von GFP an ChPMA1 und mCherry an

ChPMA2 wurden von Dr. Marlis Dahl zur Verfügung gestellt. Die Konstruktion der dafür

verwendeten Plasmide pPMA2-mCherry und pPMA1-GFP ist in Abbildung 2.48A

schematisch dargestellt. Nach der ATMT von C. higginsianum liegen die beiden Genloci wie

in Abbildung 2.48B dargestellt vor. Auf diese Art und Weise wurden Stämme hergestellt,

deren einzige Quelle von ChPMA1 und ChPMA2 mCherry bzw. GFP Fusionen sind.

103

Abbildung 2.48: Konstruktion von C. higginsianum Stämmen mit Expression von ChPMA2-mCherry und ChPMA1-GFP. (A) Schematische Übersicht der Klonierungsstrategie von Marlis Dahl für pPMA2-mCherry (pCK4375) und pPMA1-GFP (pCK448) mittels eines modifizierten pOSCAR-Systems. Die Zahlen geben die Position der verwendeten Homologiebereiche von ChPMA1 und ChPMA2 relativ zu dem entsprechenden Startcodon an. (B) Darstellung der homologen Rekombination zwischen den T-DNAs von pPMA2-mCherry und pPMA1-GFP mit der genomischen DNA von C. higginsianum. T: 122 bp Downstream Region von CH063_11345.1

Diese Technik hat den entscheidenden Vorteil, dass sich die entstanden Reporterkonstrukte

im genomischen Lokus von ChPMA1 und ChPMA2 befinden und somit unter der Kontrolle

der nativen Promotoren exprimiert werden. Des Weiteren haben multiple Insertionen der T-

DNAs keinen Einfluss auf die Expression von mCherry bzw. GFP, wodurch alle erhaltenen

Transformanten theoretisch die gleiche Intensität der Fluoreszenz aufweisen. Die

Verwendung verschiedener Resistenzkassetten zwischen pPMA1-GFP und pPMA2-mCherry

erlaubte die Herstellung von C. higginsianum Stämmen mit Expression beider

Reporterkonstrukte. Die konstruierten Stämmen mit in Lokus-Fusionen von ChPma1 sowie

ChPma2 zeigten im Vergleich zu C. higginsianum Wildtyp weder für das vegetativen

Wachstum auf Platten mit Oatmeal oder PDA-Medium, noch für die Bildung von Konidien

Auffälligkeiten (Daten nicht gezeigt). Da ChPma1 vermutlich ein essentielles Protein darstellt,

scheint das ChPma1-GFP Fusionsprotein funktional zu sein und eine ähnliche Protonen-

Transportaktivität wie das Wildtyp-Protein aufzuweisen. Die Funktionalität von ChPma2-

mCherry wurde mittels Sprühinfektionen von A. thaliana mit zwei Stämmen (CY6490 und

CY6493) untersucht. Aufgrund der Beobachtung, das der Verlust von ChPma2 zu einem

Arrest der Infektion im Stadium der Penetration führt, hätte eine fehlerhafte Lokalisierung

oder eine geringe Aktivität von ChPma2-mCherry vermutlich einen starken Effekt auf die

Pathogenität dieser Stämme.

104

105

Abbildung 2.49: ChPma1-GFP und ChPma2-mCherry haben keinen Einfluss auf die Pathogenität. (A/B) A. thaliana Col-0 Pflanzen wurden mit C. higginsianum Wildtyp (WT, CY5535), CY6490 und CY6493 (PMA1-GFP PMA2-mCherry 1 bzw. 2) sprühinfiziert (1x106 Konidien/ml). Nach drei und vier Tagen wurden je drei Blätter von zwei Pflanzen mit Trypanblau gefärbt (A) und die gebildeten Infektionsstrukturen ausgezählt (B). Primärhyphen sind als Prozentsatz zu der Anzahl der Appressorien angeben während die Bildung von Sekundärhyphen relativ zu Primärhyphen berechnet wurde. Der Fehlerbalken entspricht der Standardabweichung der drei Blätter. (C) Nach drei Tagen wurden jeweils drei Blätter pro infizierten C. higginsianum Stamm mit Anilinblau und DAB gefärbt. Größenmarker = 20 µm

Die lichtmikroskopische Auswertung von Trypanblaufärbungen zeigte, dass drei Tage nach

der Infektion 63% (Pma1-GFP Pma2-mCherry 1) bzw. 53% (Pma1-GFP Pma2-mCherry 2)

der Appressorien Primärhyphen gebildet hatten (siehe Abb. 2.49A und B). Während nach

drei Tagen für den Wildtyp nur eine Bildung von Sekundärhyphen von 1% zu beobachten

war, hatten bereits 12% der Primärhyphen von CY6490 Sekundärhyphen gebildet. Neben

den gebildeten Infektionsstrukturen wurden ebenfalls pflanzliche Abwehrreaktionen in der

Form von Callosebalagerungen und der Freisetzung von H2O2 untersucht (Abb. 2.49C). In

Färbungen von infizierten Blättern (3 dpi) mit Anilinblau waren unter 10% der Appressorien

des parentalen Stammes CY6021 (ΔChku80) Papillen sichtbar und 7% der infizierten Zellen

zeigten eine Farbreaktion bei der Färbung mit DAB. Die beiden untersuchten Stämme mit

Expression von ChPMA1-GFP ChPMA2-mCherry induzierten zu 8% (CY6490) bzw. 10%

(CY6493) Callosebalagerungen und zeigten zu 8% (CY6490) bzw. 7% (CY6493) DAB-

gefärbte Epidermiszellen.

Der Austausch von ChPma1 und ChPma2 durch mCherry- bzw. GFP-Fusionsproteine hatte

keinen Verlust der Pathogenität zur Folge. Beide untersuchten Stämme (CY6490 und

CY6493) bildeten sehr erfolgreich Primär-und Sekundärhyphen aus. Die Induktion

pflanzlicher Abwehrreaktionen war ebenso mit der des parentalen Stammes vergleichbar.

Die Fusionsproteine scheinen daher funktionsfähig zu sein. Im Folgenden wurden die

Stämme Pma1-GFP Pma2-mCherry 1 (CY6490) und Pma1-GFP Pma2-mCherry 2 (CY6493)

mittels konfokaler Mikroskopie analysiert um sowohl die Expression als auch die Lokalisation

beider Fusionsproteine zu untersuchen. In Konidien von CY6490 (ChPma1-GFP, ChPma2-

mCherry 1) war, wie durch die vorangegangen Experimente zu erwarten, keinerlei

Fluoreszenz des ChPma2-mCherry Fusionsproteins nachweisbar. ChPma1-GFP zeigte

hingegen eine starke Fluoreszenz an der Plasmamembran (Abb. 2.50A). Zusätzlich zeigten

verschiedenartige intrazellulären Strukturen ebenfalls ein Signal für Pma1-GFP. Als Kontrolle

diente eine Färbung von C. higginsianum Wildtyp CY5535 mit dem lipophilen Farbstoff FM4-

64. FM4-64 bindet an die Plasmamembran und gelangt nach längeren Inkubationszeiten in

das Innere der Zelle wo der Farbstoff auch intrazellulären Membranen von Vakuolen,

Mitochondrien und Vesikeln färbt (Fischer-Parton et al., 2000). Nach 30 Minuten

Inkubationszeit zeigte fast ausschließlich die Plasmamembran der Konidien ein

Fluoreszenzsignal. Nach 60 Minuten waren auch intrazelluläre Membranen gefärbt. Einige

106

dieser kleineren gefärbten Strukturen ähnelten den beobachteten Strukturen von ChPma1-

GFP. Die größeren Strukturen mit Fluoreszenz von ChPma1-GFP könnten Aggregate des

Fusionsproteins darstellen.

Abbildung 2.50: Lokalisierung von ChPma1-GFP in Konidien. (A) Fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen (CLSM) von Konidien des C. higginsianum Stammes CY6490 (ChPma1-GFP, ChPma2-mCherry). Die einzelnen Kanäle einer Aufnahme (Durchlicht, GFP, mCherry) wurden separat dargestellt. (B) Aufnahmen von C. higginsianum Wildtyp CY5535 gefärbt mit FM4-64 (17 µM) bei einer Inkubationszeit des Farbstoffes für 30 bzw. 60 Minuten. Die Helligkeit des FM4-64 Kanals wurde für die 60 Minuten Probe reduziert. Größenmarker entspricht 10 µm.

107

Um die Expression und Lokalisation von ChPma1 und ChPma2 in Myzel zu untersuchen,

wurden Konidien des C. higginsianum Stammes CY6490 (ChPma1-GFP, ChPma2-mCherry

1) auf Objektträgern mit Fries-Medium inkubiert. Nach 12 Stunden hatten die Konidien

begonnen Hyphen zu bilden (Abbildung 2.51A).

108

Abbildung 2.51: Lokalisierung von ChPma1-GFP und ChPma2-mCherry während der Myzelbildung. (A) Fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen des Stammes CY6490 (ChPma1-GFP, ChPma2-mCherry 1) nach 12 h Inkubation auf Objektträgen mit Fies-Medium. Die einzelnen Kanäle einer Aufnahme (Durchlicht/DIC, GFP, mCherry) wurden separat dargestellt. (B) Konfokal mikroskopische Aufnahmen von Myzel des Stammes CY6490 nach zwei Tagen Inkubation in Mathur-Medium. Dargestellt sind die einzelnen GFP bzw. mCherry-Kanäle und der Overlay dieser beiden. Größenmarker = 20 µm.

Dabei zeigte sich, dass die ehemaligen Konidien stark angeschwollen waren und intensive

GFP- und mCherry-Fluoreszenz zeigten. Ein Teil des Signals war an der Plasmamembran

lokalisiert, während ein Großteil innerhalb der Zelle als rundliche Struktur vorlag. Eine

eindeutige Zuordnung auf bestimmte Organellen war dabei nicht möglich, es könnte sich

auch um Aggregate des Fusionsproteins innerhalb des ehemaligen Konidium handeln. Im

Gegensatz dazu war in den neu gebildeten Hyphen der Großteil von ChPma1-GFP in der

Plasmamembran lokalisiert. Die Fluoreszenz von ChPma1-GFP war auch in den Spitzen der

Hyphen sichtbar. ChPma2-mCherry war ebenfalls in der Plasmamembran lokalisiert,

allerdings zeigten die Spitzen der Hyphen keine Fluoreszenz von mCherry und die Stärke

der Fluoreszenz von ChPma2-mCherry war insgesamt schwächer als die von ChPma1-GFP.

Älteres Myzel (24 h) von Pma1-GFP Pma2-mCherry 1 (CY6490) wurde mittels Konfokal

Mikroskopie analysiert (Abb. 2.51B). Alle gebildeten Hyphen zeigten Expression von

ChPMA1-GFP wobei das Protein in der Plasmamembran als auch innerhalb der einzelnen

Zellen der Hyphen lokalisiert war. ChPma2-mCherry war nur in einigen Hyphen sichtbar und

war zum Großteil in der Plasmamembran lokalisiert. Diese Ergebnisse sind im Einklang mit

den Promotorfusionen und den quantitativen Real Time PCRs. In Myzel scheint die

Expression von ChPMA2 auf einzelne Hyphen begrenzt zu sein, während alle Zellen

ChPMA1 exprimieren.

Die Lokalisierung von ChPma1-GFP und ChPma2-mCherry in in vitro Appressorien und

während der Infektion von A. thaliana wurde mittels konfokaler Mikroskopie analysiert.

ChPMA2-mcherry war nur in den neu gebildeten Appressorium detektierbar aber nicht in den

ehamaligen Konidien (Abb. 2.52A). Das ChPma2-mCherry Fusionsprotein war allerdings

zum größten Teil in Strukturen innerhalb des Appressoriums lokalisiert und zeigte damit

einen starken Unterschied zu der präferentiellen Lokalisierung in der Plasmamembran von

Hyphen (Abb. 2.51). Die Fluoreszenz von ChPma1-GFP war sowohl in der Plasmamembran

sowie als schwächeres Signal im Zytoplasma sichtbar. Besonders deutlich war die

Fluoreszenz am Septum innerhalb der ehemaligen Konidie. Diese Beobachtung beruht

möglicherweise auf das Aufeinandertreffen von zwei Zellmembranen an dieser Stelle

wodurch eine, in etwa doppelt so starke, Fluoreszenz sichtbar war als am Rest der

Membran. Besonders auffällig war allerdings, dass kein ChPma1-GFP in dem neu gebildeten

Appressorium detektierbar war. Das beobachtete Expressionsmuster des Fusionsproteins

steht damit im Widerspruch zu der Expression von GFP unter der Kontrolle eines 650

109

Basenpaar langen ChPMA1-Promotors, da bei diesen Experimenten GFP-Fluoreszenz

sowohl im ehemaligen Konidium als auch im Appressorium sichtbar war (Abb.2.47).

110

Abbildung 2.52: Lokalisierung von ChPma1-GFP und ChPma2-mCherry in Infektionsstrukturen. (A) Konfokal mikroskopische Aufnahmen von in vitro Appressorien des C. higginsianum Stammes CY6490 (ChPma1-GFP, ChPma2-mCherry) auf beschichteten IBIDI Discs nach 6 bzw 12 Stunden. Die einzelnen Fluoreszenzkanäle einer Aufnahme (GFP, mCherry) wurden separat als auch als Overlay dargestellt. (B) A. thaliana Col-0 wurde mit 1x106 Konidien pro ml der Stämme CY6490 bzw. CY6493 infiziert. Nach drei Tagen wurden die gebildeten Infektionsstrukturen mittels konfokaler Mikroskopie analysiert. Dargestellt sind die einzelnen Kanäle (GFP und mCherry Fluoreszenzkanal sowie Durchlicht) der Aufnahmen. Größenmarker = 10 µm.

In in planta gebildeten Appressorien war eine starke Fluoreszenz von ChPma2-mCherry

detektierbar (Abb. 2.52B) während ChPma1-GFP nur ein sehr schwache Fluoreszenz zeigte.

ChPma2 scheint daher die einzige der beiden Protonenpumpen von C. higginsianum zu sein

111

die in Appressorien (in vitro und in planta) lokalisiert ist. Die Appressorien von C.

higginsianum Stämmen mit Expression von ChPMA1-GFP und ChPMA2-mCherry konnten

erfolgreich A. thaliana penetrieren und bildeten in planta Infektionsstrukturen. In

Primärhyphen von CY6490 bzw. CY6493 (beide Stämme mit ChPma1-GFP und ChPma2-

mCherry) waren beide Fluoreszenzproteine sowohl an der Plasmamembran, als auch in

intrazellulären Strukturen lokalisiert. Eine Analyse von Sekundärhyphen mittels konfokaler

Mikroskopie war aufgrund des starken Hintergrundes von nekrotischen Pflanzengewebe

(Daten nicht gezeigt) nicht eindeutig möglich. Die konfokal-mikroskopische Analyse von

Stämmen mit ChPma1-GFP, ChPma2-mCherry in Lokus zeigte, dass beide Fusionsproteine

Unterscheide in der Expression und Lokalisation aufweisen. In Appressorien war nur

ChPma2-mCherry nachweisbar, was auf eine spezielle Rolle von ChPma2 in diesen Zelltyp

hindeutet. Da die untersuchten Stämme keine Auffälligkeiten hinsichtlich Wachstum oder

Pathogenität zeigten, scheinen beide Protonenpumpen funktional zu sein und die Ergebnisse

keine Folge von mislokaliserten Fusionsproteinen.

2.4.7 Komplementation und Suppression des Pathogenitätsphänotyps von ChPMA2 T-DNA Insertionsmutanten

Mittels Expressionsanalysen und Reportergenfusionen konnten für ChPMA1 und ChPMA2

eine unterschiedliche Expression und Lokalisation während der Appressorienbildung gezeigt

werden. ChPMA1-GFP wird in dem ehemaligen Konidium exprimiert, konnte aber nicht in

den neu gebildeten Appressorium detektiert werden. Im Gegensatz dazu war das

Fluoreszenzsignal von ChPma2-mCherry in melanisierten Appressorien nachweisbar aber

nicht in Konidien. In Appressorien scheint daher der Protonentransport zum Großteil von der

Aktivität von ChPma2 abhängig zu sein. Unklar war allerdings, ob sich nur die Expression

der beiden Protonenpumpen unterscheidet oder ob sie sich auch funktionell unterscheiden.

Dazu wurden im Folgenden Komplementations- und Suppressionsanalysen mit verscheiden

PMA Konstrukten durchgeführt.

2.4.7.1 Die ektopische Expression von ChPMA2 komplementiert den Pathogenitätsdefekt der ChPMA2 T-DNA Insertionsmutanten vir-22 und vir-24

Um zu überprüfen ob der Phänotyp von ChPMA2 T-DNA Insertionsmutanten

komplementiert werden kann, wurden die vir-Mutanten vir-22 und vir-24 mittels ATMT

mit dem Plasmid pPN-ChPMA2 transformiert. Sowohl vir-22 als auch vir-24 tragen

die T-DNA Insertion innerhalb des ORF von ChPMA2 (+130 bzw. +454 relativ zum

1. ATG) und sind vollständig apathogen. Die T-DNA von pPN-ChPMA2 (siehe Abb.

2.53 A) enthält eine Nourseothricin-Resistenzkassette und ChPMA2 unter der

112

Kontrolle des potentiellen Promotors von ChPMA2 (1044 bp; -2 bis -1046 relativ zum

Startcodon). Erhaltene Nourseothricin-resistente Transformanten wurden für die

Sprühinfektion von A. thaliana Col-0 Pflanzen verwendet und auf ihre Pathogenität

hin untersucht.

113

Abbildung 2.53: Komplementation von ChPMA2 T-DNA Insertionsmutanten vir-22 und vir-24. (A) Schematische Darstellung der T-DNA des für die ATMT verwendeten Plasmids pPN-ChPMA2 (pCK3883). (B/C) Ergebnisse der Sprühinfektion von A. thaliana Col-0 nach fünf Tagen in Form von makroskopischen Aufnahmen und Trypanblaufärbungen. Für die Komplementanten in (A) diente vir-22 als Ausgansstamm für die Transformation mit pPN-ChPMA2, während für die Transformanten in (C) vir-24 als parentaler Stamm verwendet wurde. WT: C. higginsianum Wildtyp Stamm CY5535; Größenmarker entspricht 50 µm

Die mit vir-22 und vir-24 infizierten A. thaliana Pflanzen zeigten nach fünf Tagen keinerlei

makroskopisch sichtbare Symptome. In den entsprechenden Trypanblaufärbungen waren

nur Appressorien sichtbar, aber keine Primär-oder Sekundärhyphen. Dem gegenüber

zeigten mit C. higginsianum Wildtyp (CY5535) infizierte Pflanzen deutlich sichtbare Nekrosen

und ein verzweigtes Netz von Sekundärhyphen. Die drei untersuchten pPN-ChPMA2

Transformanten mit vir-22 als Ausgangsstamm (vir-22 Pma2 A/B/C) zeigten eine

unterschiedliche Pathogenität (Abb. 2.53B). So war vir-22 Pma2-B (CY6571) nicht in der

Lage Primär- oder Sekundärhyphen zu bilden. Im Gegensatz dazu zeigten die Stämme vir-

22 Pma2-A (CY6570) und vir-22 Pma2-C (CY6572) eine Komplementation des

Pathogenitätsdefektes von vir-22. Fünf Tage nach der Sprühinfektion mit diesen Stämmen

waren deutliche makroskopische Symptome sichtbar und Trypanblaufärbungen zeigten eine

erfolgreiche Bildung von Infektionshyphen. Die drei Stämme mit vir-24 als parentalen Stamm

waren ebenfalls in der Lage sowohl Primär- als auch Sekundärhyphen zu bilden (sieh Abb.

2.53). Vor allem vir-24 Pma2-A (CY6569) zeigte eine, mit dem Wildtypstamm (CY5535)

vergleichbare, Pathogenität.

Fünf von sechs untersuchten Stämmen waren durch die ektopische Expression von

ChPMA2 wieder in der Lage A. thaliana zu infizieren. Die Komplementation des

Pathogenitätsdefektes von vir-22 und vir-24 deutete auf eine erfolgreiche Expression von

ChPMA2 durch den verwendeten Promotor hin.

2.4.7.2 Die Expression von ChPMA1 kann den Pathogenitätsdefekt von Insertionsmutanten nur teilweise supprimieren

Nach der erfolgreichen Wiederherstellung der Pathogenität der Chpma2 Nullallele von vir-22

und vir-24 durch Expression von ChPMA2, sollte überprüft werden ob eine Kopie von

ChPMA1 unter der Kontrolle des ChPMA2 Promoters in der Lage ist ChPMA2 zu ersetzen.

Eine erfolgreiche Suppression des Pathogenitätsphänotyps von vir-22 und vir-24 durch

ChPMA1 würde bedeuten, dass der Pathogenitäts-relevante ChPma2-vermittelte

Protonentransport in Appressorien auch durch ChPma1 wahrgenommen werden könnte und

sich beide Protonenpumpen nur in der Expression unterscheiden.

Das dafür konstruierte Plasmid pPN-ChPMA1 enthält als Promotor für die Expression von

ChPMA1 das gleiche ChPMA2 Promotor-Fragment das bereits in pPN-ChPMA2 zum Einsatz

114

kam. Zunächst wurde vir-24 mittels ATMT mit pPN-ChPMA1 transformiert und vier

Nourseothricin-resistente Stämme wurden mittels Sprühinfektion von A. thaliana Col-0

Pflanzen auf ihre Pathogenität hin überprüft.

Abbildung 2.54: Suppression des Phänotyps von vir-24. (A) Schematische Darstellung der T-DNA des für die ATMT verwendeten Plasmids pPN-ChPMA1. Die Zahlen geben die Position der verwendeten Fragmente relativ zu den Startcodon von ChPMA1 bzw. ChPMA2 an. (B) Ergebnisse der Sprühinfektion von A. thaliana Col-0 (5 dpi) mit C. higginsianum Wildtyp (CY5535), den Ausgangsstamm vir-24, vir-24 Pma1-A (CY6582), vir-24 Pma1-B (CY6583), vir-24 Pma1-C (CY6584) und vir-24 Pma1-D (CY6585) in Form von makroskopischen Aufnahmen und Trypanblaufärbungen. Größenmarker = 50 µm

Fünf Tage nach der Sprühinfektion zeigte der C. higginsianum Wildtypstamm eine effektive

Infektion von A. thaliana. Die infizierten Blätter zeigten großflächige Nekrosen welche von

einen starken Geflecht aus Sekundärhyphen durchzogen waren. Die ChPMA2 T-DNA

Insertionsmutante vir-24 zeigte hingegen keinerlei makroskopischen Symptome und keine

Bildung von Primärhyphen. Die vier untersuchten Transformanten zeigten eine sehr

unterschiedliche Pathogenität. Während vir-24 Pma1-B keinerlei Infektionshyphen ausbildete

115

und sich somit wie der Ausgangsstamm verhielt, zeigten die anderen drei Stämme eine

teilweise Suppression des Phänotyps von vir-24. Die Stämme vir-24 Pma1-C (CY6583) und

vir-24 Pma1-D (CY6585) bildeten vereinzelt Primärhyphen aus (5% für CY6584, <1% für

CY6585) und ebenso waren kleinere Nekrosen auf den infizierten Blättern erkennbar (Abb.

2.54). Circa 30% der gebildeten Primärhyphen von CY6584 bildeten Sekundärhyphen aus,

während in Trypanblaufärbungen von CY6585 keine Sekundärhyphen sichtbar waren. Die

stärkste Pathogenität zeigte die Transformante CY6582. Dieser Stamm bildete stellenweise

deutliche makroskopische Symptome auf den infizierten Blättern aus die allerdings deutlich

kleiner waren als die des Wildtypstammes. Trypanblaufärbungen dieser Stellen zeigten eine

effiziente Bildung von Primär-und auch Sekundärhyphen (Quantifizierung kaum möglich aber

vergleichbar mit Wildtyp).

In einem zweiten Experiment diente vir-22 als Ausgangstamm für die ATMT mit pPN-

ChPMA1. Neun der erhaltenen Transformanten wurden mittels Sprühinfektion und

anschließender Auswertung von Trypanblaufärbungen infizierter Blätter auf ihre Pathogenität

hin untersucht. Der Prozentsatz gebildeter Infektionsstrukturen ist in Tabelle 2.7

zusammengefasst.

Tabelle 2.7: Suppression des Pathogenitätsphänotyps von vir-22

Stamm Primärhyphen1 Sekundärhyphen2

vir-22 pPN-ChPMA1-1 (CY7226) <1% 0%

vir-22 pPN-ChPMA1-2 (CY7227) 9% 20%

vir-22 pPN-ChPMA1-3 (CY7228) 0% -

vir-22 pPN-ChPMA1-4 (CY7229) 0% -

vir-22 pPN-ChPMA1-5 (CY7230) <1% 0%

vir-22 pPN-ChPMA1-6 (CY7231) <1% 0%

vir-22 pPN-ChPMA1-7 (CY7232) <1% 80%

vir-22 pPN-ChPMA1-8 (CY7233) <1% 20%

vir-22 pPN-ChPMA1-9 (CY7234) 11% 20%

Wildtyp CY5535 36% 72%

vir-22 0% -

vir-22 pPN-1 (CY7235) 0% -

vir-22 pPN-2 (CY7236) 0% - 1Gebildete Primärhyphen als Prozentsatz zu der Gesamtanzahl von Appressorien 2Gebildete

Primärhyphen als Prozentsatz zu der Anzahl von Primärhyphen

Sowohl der Ausgangstamm vir-22, als auch zwei Stämme aus der Transformation von vir-22

mit dem Leervektor pPN (CY7235 und CY7236) bildeten keinerlei Primärhyphen aus. Fünf

116

Transformanten (CY7226, CY7230, CY7231, CY7232 und CY7233) waren sehr vereinzelt

(<1%) in der Lage die Wirtspflanze zu penetrieren und Infektionshyphen zu bilden. Zwei

Stämme (CY7227 und CY7234) zeigten eine Primärhyphenbildung von ≥ 9% und in den

Trypanblaufärbungen waren Anzeichen von ausgeprägten Nekrosen erkennbar (nicht

gezeigt). Für diese Stämme wurde die Induktion pflanzlicher Abwehrreaktionen in der Form

von Callose-Ablagerungen und der Freisetzung von H2O2 untersucht (siehe Abb. 2.56).

Abbildung 2.55: Die Suppression des Phänotyps von vir-22 hat eine verstärkte Abwehr zur Folge. Mikroskopische Aufnahmen von DAB bzw. Anilinblau-gefärbten Blättern aus der Infektion von A. thaliana Col-0 mit vir-22, CY7227 und CY7234. Größenmarker = 100 µm

Dabei zeigte sich, dass eine Infektion mit diesen Transformanten eine Induktion der

pflanzlichen Abwehr zur Folge hatte. CY7234 zeigte mit 5% ROS und 6% Anilinblau eine

ähnliche und CY7227 mit 19% ROS und 15% Anilinblau-gefärbten Epidermiszellen eine

stärkere induzierte Abwehr als der C. higginsianum Wildtypstamm CY5535 (7% ROS, 11,2%

Callose). Dies ist von besonderen Interesse, da eine Infektion mit vir-22 fast keine

Abwehrreaktionen zur Folge hatte (<1% DAB und Callose).

DAB

vir-

22

Anilinblau

CY7

227

vir-

22 p

PN

-ChP

MA1

-2

CY7

234

vir-

22 p

PN

-ChP

MA1

-9

117

Durch die Expression von ChPMA1 unter der Kontrolle eines ChPMA2 Promotors konnte der

Pathogenitätsphänotyp von vir-22 und vir-24 nur teilweise supprimiert werden. Die einzelnen

Transformanten zeigten starke Unterschiede in ihrer Fähigkeit zur Ausbildung von

Infektionshyphen. Nur Drei von 14 analysierten Transformanten konnten stellenweise

makroskopisch sichtbare Nekrosen ausbilden welche in Trypanblaufärbungen Primär-und

auch Sekundärhyphen zeigten. Dabei konnte für CY7227 und CY7234 eine verstärkte

Induktion pflanzlicher Abwehrreaktionen beobachtet werden. Dies deutet darauf hin, dass

sich ChPma1 und ChPma2 nicht nur in ihrer Expression unterscheiden sondern auch

funktionale Unterschiede aufweisen.

118

3. Diskussion

3.1 Etablierung eines Gene Targeting Systems in C. higginsianum

Ein Ziel dieser Arbeit war es C. higginsianum Stämme für ein effizientes Gene-Targeting

System durch das Ausschalten des NHEJ-Mechanismus zu generieren. Das C. higginsianum

Ku80-Ortholog von MgKu80 wurde mittels BLAST-Analysen in den verfügbaren

Genomsequenzen identifiziert. Durch die Verwendung von zwei Selektionsmarkern in der T-

DNA der ChKU80-Deletionsplasmide konnten entsprechende Chku80-Deletionsmutanten

selektioniert werden. Southern Blot und PCR-Analysen dieser Stämme zeigten einen

erfolgreichen Austausch des Großteils des ORF von ChKU80 mit einer Nourseothricin-

Resistenzkassette ohne zusätzliche, ektopische T-DNA Insertionen aufzuweisen. Zudem

wurden wie für NHEJ-defiziente Mutanten der Ascomyceten Aspergillus nidulans (Nayak,

2005), Neurospora crassa (Ninomiya et al., 2004) und Magnaporthe grisea (Villalba et al.,

2008) keine unerwünschten Phänotypen für die ΔChku80-Stämme beobachtet.

Die ΔChku80 Stämme zeigten in Agrobacterium tumefaciens vermittelten Transformationen

mit Plasmiden ohne C. higginsianum Homologiebereiche im Vergleich zu den Wildtypstamm

eine verringerte Anzahl erhaltener Transformanten (<10%). Die ektopische Integration

exogener DNA ist wie in ChKU70-defizienten Stämmen (Ushimaru et al., 2010) stark

reduziert. Damit scheint in C. higginsianum, ähnlich wie in Pflanzen (Jia et al., 2012; Saika et

al., 2014) und in S. cerevisiae (Attikum et al., 2001), die ektopische Insertion von T-DNA

größtenteils abhängig von Enzymen der NHEJ-Maschinerie zu sein. Bei ATMTs von

ΔChku80 Stämmen wurden allerdings auch Transformanten mit ektopischen T-DNA

Insertionen erhalten (siehe Abb. 2.36). Ähnliche Beobachtungen von NHEJ-defizienten

Stämmen von N. crassa (Ishibashi et al., 2006) und M. grisea (Kito et al., 2008) deuteten auf

das Vorhandensein eines Ku-unabhängigen Mechanismus hin, der in C. higginsianum

ebenfalls an der Insertion exogener DNA beteiligt sein könnte. Obwohl in ΔChku80-Stämmen

ektopische Integrationen nicht vollständig blockiert sind, ermöglichen sie einen effizienten

Knockout von Zielgenen. So konnten im Rahmen dieser Arbeit durch Transformation von

ChKU80-defizienten Stämmen erfolgreich Knockout-Mutanten für mehrere Gene hergestellt

werden. So zeigten z.B. 18 von 21 Stämme aus der ATMT mit dem pDel-Cih1 (pCK3083)

den Austausch des ORF von ChCIH1 mit einer Hygromycin Resistenzkassette. Durch die

Verwendung einer Bialaphos-Resistenzkassette als dritter Selektionsmarker konnten zudem

C. higginsianum Stämme mit Deletionen von ChCIH1 und ChCIH2 erhalten werden (siehe

Abb. 2.14).

Die konstruierten ΔChku80 Stämme ermöglichen neben den targeted Knockout von

Zielgenen weitere Anwendungen wie z.B. in Lokus Reportergenfusionen (siehe ChPMA1 und

119

ChPMA2). Ein häufig auftretendes Problem während dieser Arbeit waren sich stark

voneinander unterscheidende Transformanten, die z.B. eine unterschiedlich starke

Expression von Reporterkonstrukten oder eine unterschiedliche Pathogenität aufwiesen.

Eine gerichtete Insertion der entsprechenden Konstrukte in den ΔChku80 Lokus könnte die

Homogenität der Transformanten erhöhen, da ein möglicher Einfluss von Anzahl und

Insertionsort der T-DNAs minimiert werden könnte. Die erhaltenen Transformanten wären

zudem nicht mehr gegenüber Nourseothricin resistent, was eine weitere Methode der

Selektion ermöglichen würde. Abbildung 3.1 fasst schematisch einige der

Verwendungsmöglichkeiten von NHEJ-defizienten C. higginsianum Stämmen zusammen

Abbildung 3.1: Anwendungen für NHEJ-defiziente C. higginsianum Stämme. Durch Inaktivierung des NHEJ-Reparaturmechanismus wurde die Rate der Integration exogener DNA durch Homologe Rekombination in das Genom von C. higginsianum stark erhöht was vielfältige Anwendungen ermöglicht:(A) Target Gene Knockout von Genes of Interest und anschließender Analyse des resultierenden Phänotyps; (B) in Lokus Fusionen von Zielgenen mit Reportergenen oder Tags; (C) Expression von Reportergenkonstrukten oder Genes of Interest (GOI) in definierten genomischen Loci.

Auch wenn für die generierten ΔChku80 Stämme keine phänotypischen Veränderungen zu

dem Wildtyp erkennbar waren, könnte die Verwendung von Stämmen mit inaktiverten NHEJ-

120

Reperaturmechanismus für einige Anwendungen ungeeignet sein. In solchen Fällen wäre

eine Komplemenation durch ein funktionales Allel von ChKU80 als Bestandteil der T-DNA

denkbar.

3.2 Die Rolle von Proteinen mit LysM-Domänen für die Pathogenität von C. higginsianum

Proteine mit LysM-Domänen wurden in mehreren phytopathogenen Pilzen als

Virulenzfaktoren identifiziert. Darunter zählen Ecp6 aus Cladosporium fulvum (Bolton et al.,

2008), Magnaporthe oryzae Slp1 (Mentlak et al., 2012) und Mg3LysM aus Mycosphaerella

graminicola (Marshall et al., 2011). Der Verlust dieser LysM-Effektorproteine hat einen

starken Einfluss auf die Pathogenität der entsprechenden Pilze und führt zu verstärkten

Abwehrreaktionen des Wirtes. Für diese drei Proteine konnte ebenso gezeigt werden, dass

sie Chitinoligomere binden und dadurch vermutlich ein Auslösen der Chitin-induzierten

Immunantwort der Wirtspflanzen verhindern (de Jonge and Thomma, 2009; de Jonge et al.,

2010; Lee et al., 2013; Mentlak et al., 2012).

Im Rahmen dieser Arbeit wurde überprüft ob C. higginsianum als hemibiotrophes Pathogen

ebenfalls derartige LysM-Effektorproteine besitzt um eine Erkennung durch die Wirtszellen

zu verhindern. Durch Analysen der verfügbaren C. higginsianum Genomsequenz konnten 16

Proteine mit vorhergesagten LysM-Domänen identifiziert werden. Auf Basis von

Expressionsdaten (O’Connell et al., 2012) wurden von diesen 16 Proteinen drei (ChCih1,

ChCih2 und ChLysM3) ausgewählt und näher untersucht. ChCih1 und ChCih2 zeigten von

allen identifizierten C. higginsianum Proteinen mit vorhergesagten LysM-Domänen die

stärkste Ähnlichkeiten zu den beschriebenen Effektorproteinen Slp1, Ecp6 und Mg3LysM

Beide Proteine wurden als C. higginsianum Effector Candidates ChEC90 und ChEC90a

beschrieben aber nicht näher untersucht (Kleemann et al., 2012).

In phylogenetischen Analysen von Proteinen mit LysM-Domänen aus C. higginsianum,

Magnaporthe oryzae und Fusarium graminearum (siehe Abb. 3.2) bilden ChCih1, ChCih2

zusammen mit Cih1 aus C. lagenarium, Mg1LysM, Mg2LysM aus Mycosphaerella

graminicola, und Slp1 und Slp2 aus Magnaporthe oryzae eine Gruppe „Cih-ähnlicher

Proteine“. Als Auffälligkeit enthält diese Gruppe keines der 12 LysM-Proteinen aus F.

graminearum, obwohl für FGSG_02255 eine mit Ecp6 ähnliche Proteinstruktur berichtet

wurde (Sperschneider et al., 2015). Im Gegensatz zu M. oryzae Slp1 konnte für Slp2 keine

Expression während der Infektion detektiert werden und entsprechende Δslp2-Mutanten

zeigten keinen Phänotyp (Mentlak et al., 2012). Auf Basis der relativ hohen Expression

während der nekrotrophen Phase (O’Connell et al., 2012) wurde ChLysM3 ebenfalls

analysiert obwohl das Protein eine schwächere Ähnlichkeit zu Slp1 oder Ecp6 aufweist.

121

Abbildung 3.2: Phylogenie von LysM-Proteinen. Proteinsequenzen wurden mit ClustalW aligned und mittels Geneious treebuilding als phylogenetischer Baum grafisch dargestellt; prozentuale Bootstrap Werte (1000 Replikate) befinden sich jeweils links an den Verzweigungen.

GFP-bzw. mCherry-Fusionsproteine von ChCih1 und ChCih2 zeigten eine starke

Fluoreszenz an der Peripherie von Primärhyphen. In Konidien und Appressorien war

hingegen für beide Fusionsproteine keine Fluoreszenz detektierbar. Das Vorhandensein von

LysM-Domänen, die Homologie zu beschriebenen Effektorproteinen, die Expression in

Primärhyphen und die vermutliche Sekretion im Apoplasten des Wirtes implizierten eine

mögliche Rolle von ChCih1 und ChCih2 für die Pathogenität von C. higginsianum während

der biotrophen Phase. Die untersuchten C. higginsianum Stämme mit Deletion von ChCIH1

oder ChCIH2 zeigten allerdings gegenüber A. thaliana keine verringerte Pathogenität. Auch

eine erhöhte Induktion pflanzlicher Abwehrreaktionen in der Form von Callose-Ablagerungen

oder der Freisetzung von H2O2 konnte bei Infektionen mit diesen Stämmen nicht beobachtet

werden. Aufgrund einer möglichen redundanten Funktion von ChCih1 und ChCih2 wurden C.

higginsianum Stämme mit Deletion beider Gene hergestellt, welche ebenfalls einen, mit dem

Wildtyp vergleichbaren, Infektionsverlauf auf A. thaliana Pflanzen zeigten. Somit sind die

Cih-ähnliche Proteine ChCih1 und ChCIh2 für eine erfolgreiche Infektion von A. thaliana

122

Pflanzen nicht erforderlich. Da entsprechende Knockout Stämme keinen Phänotyp während

der Infektion zeigten, ist ChLysM3 ebenfalls für die Pathogenität nicht erforderlich.

Das Ausbleiben eines Virulenz-Phänotyps für ΔChCih1 und ΔChCih2 Stämme steht damit im

Widerspruch zu der Annahme einer möglichen konservierten Rolle von Ecp6-ähnlichen

LysM-Proteine für die Pathogenität phytopathogener Pilze (de Jonge et al., 2010). Allerdings

wurde der Infektionsverlauf nur auf A. thaliana Pflanzen untersucht. Damit ist nicht

auszuschließen, dass ChCih1 oder ChCih2 eine essentielle Rolle bei der Infektion anderer

Wirtspflanzen z.B. aus den Gattungen Brassica oder Raphanus einnehmen. Zudem wurden

mit der Induktion von Callose Papillen und der Freisetzung von H2O2 nur zwei pflanzliche

Abwehrreaktionen untersucht. Zusätzliche Messungen wie z.B. die Bestimmung der

Expression von pflanzlichen Chitinasen während der Infektion mit ΔChCih1 und ΔChCih2

Stämmen wären daher von Interesse. Für Mg1LysM und Mg3LysM konnte eine mögliche

zusätzliche Funktion bei dem Selbstschutz von pilzlichen Hyphen gegenüber der Hydrolyse

durch pflanzliche Enzyme identifiziert werden (Marshall et al., 2011). Eine derartige Aktivität

von ChCih1 und ChCih2 wurde im Rahmen dieser Arbeit nicht getestet und könnte die Basis

für weiterführende Analysen dieser Proteine darstellen.

Trotz den Charakteristika möglicher Effektorproteine bleibt die Funktion von ChCih1 und

ChCih2 ungeklärt. Die erhaltenen Ergebnisse deuten darauf hin, dass beide Proteine für die

Pathogenität von C. higginsianum nicht erforderlich sind. Im Gegensatz zu Mg3LysM und

Ecp6 besitzen ChCih1 und ChCih2 nur zwei statt drei LysM-Domänen. Durch eine

unvollständige Sequenzierung oder einer fehlerhaften automatischen Annotation könnte das

Genom von C. higginsianum weitere, bisher unentdeckte LysM-Proteine enthalten, die

redundante Funktionen mit ChChi1 oder ChCih2 besitzen könnten. Daneben bietet sich

CH063_05984 für weitere Analysen an. Dieses Protein enthält sowohl vorhergesagte LysM,

als auch eine CVNH-Domäne und zeigt eine starke Ähnlichkeit zu MGG_03307 für welches

eine Funktion in frühen Stadien der Infektion von Magnaporthe oryzae impliziert wurde

(Koharudin et al., 2011).

123

3.3 Die Rolle von H+-ATPasen für die Pathogenität von C. higginsianum

3.3.1 Der ChPMA2 Lokus ist ein potentieller „Hot Spot“ für T-DNA Insertionen

Mittels Genome Walker Analysen konnten die T-DNA Insertionen von sechs (vir-12, vir-19,

vir-22, vir-24, vir-97 und vir-102) der 75 vir-Mutanten in dem genomischen Lokus von

ChPMA2 identifiziert werden. In drei dieser vir-Mutanten inserierte die T-DNA im

Promotorbereich, die anderen hatten Insertionen in der kodierenden Region von ChPMA2.

Bei einer Genomgröße von 53,4 Mb (O’Connell et al., 2012) steht die Insertion von sechs T-

DNAs in einem Bereich von ca. 1000 bp (von -502 in vir-97 bis +454 in vir-22) im

Widerspruch zu der ursprünglichen Annahme, dass der Agrobacterium tumefaciens

vermittelte Transfer von T-DNAs in das Genom der transformierten Zelle zufällig erfolgt

(Bundock et al., 2002; Michielse et al., 2005). Pathogenitätsscreens von phytopathogenen

Pilzen zeigen oftmals eine mehrmalige Identifizierung von bestimmten potentiellen

Pathogenitätsfaktoren. Eine Kollektion von 106 Pathogenitätsmutanten von Fusarium

oxysporum enthielt für fünf potentielle Pathogenitätsloci jeweils mehrere unabhängige T-DNA

Insertionen (Michielse et al., 2009). Von 12 isolierten C. higginsianum Mutanten enthielten

zwei eine T-DNA Insertion in einem Importin-β2 Homolog (Huser et al., 2009). Bestimmte

DNA-Bereiche könnten daher für T-DNA Insertionen bevorzugte Eigenschaften aufweisen

und „Hot Spots“ für Insertionen darstellen. In Agrobacterium tumefaciens vermittelten

Transformationen von A. thaliana und Reis konnten vermehrt T-DNA Insertionen in

chromosomalen Regionen mit hoher Gendichte nachgewiesen werden, während in

centromeren Regionen signifikant weniger Insertionsereignisse stattfanden („cold spots“)

(Alonso et al., 2003; Zhang et al., 2007). Für Magnaporthe oryzae konnte zudem eine

präferentielle Integration von T-DNAs in Promotorbereichen gezeigt werden (Choi et al.,

2007; Meng et al., 2007), wobei die Flexibilität der DNA (DNA-Bending) als möglicher Faktor

für eine präferentielle T-DNA Integration in diesen Bereichen impliziert (Choi et al., 2007)

wurde. Mehrere dieser Faktoren könnten einen positiven Einfluss auf die Zugänglichkeit des

ChPMA2 Lokus für T-DNA Insertionen haben, wodurch dieser ein potentieller „Hot Spot“

darstellen könnte. Dies könnte eine mögliche Erklärung für dem überproportional großen

Anteil von ChPMA2 T-DNA Insertionsmutanten in den ca. 7000 generierten Mutanten sein.

Als zusätzlicher Faktor weisen ChPMA2 Mutanten keine Defekte im Wachstum oder in der

Bildung von Konidien auf. Somit zeigen sie keinen Phänotyp der eine Auswahl dieser

Mutanten im Screening-Prozess nachteilig beeinflusst hätte. Ihre Identifizierung im

Pathogenitätsscreening wurde zudem stark von den ausgeprägten Pathogenitäsdefekt

begünstigt.

124

3.3.2 Wie wird die Expression von ChPMA1 und ChPMA2 reguliert?

Im Rahmen dieser Arbeit konnte ChPma2 als Pathogenitätsfaktor für das A. thaliana – C.

higginsianum Pathosystem identifiziert werden. Neben ChPma2 besitzt C. higginsianum mit

ChPma1 eine zweite H+-ATPasen. Die stärkere Expression von ChPMA1 in Konidien und

während der Myzelbildung spricht dafür, dass die Aufrechterhaltung des Protonengradienten

hauptsächlich von der Aktivität von ChPma1 abhängig zu sein scheint. Dies würde auch das

Ausbleiben eines ausgeprägten Phänotyps der entsprechenden ΔChPma2-Stämme in

diesen Stadien erklären. Des Weiteren war der gezielte Knockout von ChPMA1 nicht

erfolgreich, was darauf hindeutet, dass ChPma2 den Verlust der ChPma1 Aktivität nicht

kompensieren kann. Reportergenfusionen zeigten, dass ChPMA2-mCherry aber nicht

ChPMA1-GFP in neu gebildeten Appressorien exprimiert wird und somit der

Protonentransport in diesen Zelltyp allein von der Aktivität von ChPma2 abhängig ist. Der

Verlust von ChPMA2 durch T-DNA Insertionen oder gezielten Knockout hat somit vermutlich

den vollständigen Ausfall der Protonentransportaktivität in Appressorien zur Folge was zu

einem Arrest der Infektion von A. thaliana im Stadium der Penetration führt. Bioinformatische

Analysen der Promotorsequenzen von ChPMA1 und ChPMA2 deuten auf eine

unterschiedliche Regulation der Expression beider Gene hin. So enthält der Promotorbereich

von ChPMA2 vorhergesagte Bindestellen (Farre, 2003; Messeguer et al., 2002) für die

Transkriptionsfaktoren PacC (-550, -810 bp relativ zum ATG) und AbaA (-90 bp) die im

upstream Bereich von ChPMA1 nicht vorhanden sind. PacC ist ein Regulator der pH-

abhängigen Transkription in Aspergillus nidulans und A. fumigatus (Bertuzzi et al., 2014;

Bignell et al., 2005) und in Colletotrichum gleosporoides und Botrytis cinerea konnte eine pH-

abhängige Regulation einer Vielzahl von Pathogenitäts-relevanten Gene durch PacC gezeigt

werden (Alkan et al., 2013; Manteau et al., 2003). Das Vorhandensein von Bindestellen von

PacC deutet somit auf eine Regulation der Expression von ChPMA2 in Abhängigkeit des pH-

Wertes hin. Da C. higginsianum mittels der Freisetzung von Ammonium während der

Infektion aktiv den pH-Wert der Umgebung erhöht (O’Connell et al., 2012), könnte diese

Alkanisierung ein Signal für die Induktion der Expression von ChPMA2 darstellen. Für den

Transkriptionsfaktor AbaA konnte eine Beteiligung an der Regulation des Zellzyklus in

Konidien von Aspergillus nidulans und Fusarium graminaerum gezeigt werden (Son et al.,

2013; Ye et al., 1999) wodurch ChPMA2 vielleicht ebenfalls im Rahmen des Zellzyklus

exprimiert wird. Der ChPMA1 Promotor weist demgegenüber eine vorhergesagte Bindestelle

für StuA auf (-620 bp) auf. In Aspergillus reguliert StuA die Konidienbildung unter anderen

durch die Kontrolle der Expression von AbaA (Miller et al., 1992). Die Deletion von StuA-

Orthologen in Fusarium graminearum (Lysøe et al., 2011), Glomerella cingulata (Tong et al.,

2007) und Stagonospora nodorum (Cho et al., 2010) hatte den Verlust der Pathogenität zur

125

Folge. Eine Zellzyklus-abhängige Regulation der Expression während der Bildung von

Appressorien durch AbaA und StuA könnte ein Grund der differentiellen Expression von

ChPMA1 und ChPMA2 in Konidien und Appressorien darstellen.

3.3.3 Wird die Proteinaktivität von ChPma1 und ChPma2 unterschiedlich reguliert?

Der Pathogenitätsdefekt von ChPMA2 T-DNA Insertionsmutanten konnte nur teilweise durch

die Expression von ChPMA1 in Appressorien supprimiert werden. ChPma1 und ChPma2

unterscheiden sich somit nicht nur in ihrer Expression, sondern scheinen sich auch in

weiteren Eigenschaften zu unterscheiden. So zeigt ein Alignement mit den Protonenpumpen

aus Saccharomyces cerevisiae, Neurospora crassa und den potentiellen Orthologen von

ChPma1 und ChPma2 aus C. graminicola (siehe Abb. 3.4) drei Bereiche mit starken

Unterschieden zwischen ChPma2 bzw. CgPma2 und den andern ATPasen auf.

Abbildung 3.3: Unterschiede in den Proteinsequenzen von ChPma1 und ChPma2. (A) Schematische Darstellung der Domänenstruktur von ChPma2 (A: Aktuator-Domäne; N: Nukleotid-binde Domäne; P: Phosphorilierungsdomäne, TM1-TM10: Transmembrandomänen). Im Vergleich zu ChPma1 zusätzliche Bereiche wurden rot markiert. (B) Drei Bereiche von ChPma2 weisen im Vergleich mit ChPma1 zusätzliche Aminosäuren auf. Konservierte Serin und Threonine wurden mit einem roten Stern markiert. Nc: Neurospora crassa; Sc: Saccharomyces cerevisiae; Cg: Colletotrichum graminicola

**

**

*

*

126

ChPma2 und CgPma2 besitzen zwischen den Transmembrandomänen zwei und drei einen

Bereich von 40 Aminosäuren auf, der in dieser Form, sowohl in ChPma1 und CgPma1 als

auch in den Protonenpumpen aus S. cerevisiae und N. crassa nicht vorkommt. Weitere

Bereiche mit zusätzlichen Sequenzen befinden sich zwischen den Transmembrandomänen

neun und 10, sowie direkt am C-Terminus von ChPma2 und CgPma2. Besonders die

Sequenzunterschiede am C-Terminus sind von Interesse, da sich dort regulatorische

Elemente der Enzymaktivität von Protonenpumpen befinden (Portillo, 2000). Die Zugabe von

Glukose in das Wachstumsmedium von S. cerevisiae hat sowohl eine reversible Erhöhung

von Vmax als auch eine Erniedrigung des KM-Wertes für ATP von ScPma1 zur Folge

(Serrano, 1983). Diese Aktivierung von ScPma1 durch Glukose konnte auf die

Phosphorylierung von Threonin und Serin (S899, S911, T912) zurückgeführt werden (Eraso et

al., 2006; Lecchi et al., 2007) und das Entfernen der C-terminalen Region führte zu einem

konstitutiv aktivierten ScPma1 (Eraso and Portillo, 1994). Die Neurospora crassa

Plasmamembran H+-ATPase (NcPma1) besitzt ebenfalls diese potentiellen

Phosphorylierungsstellen und die Deletion der 38 carboxy-terminalen Aminosäuren erhöhte

die ATPase-Aktivität um Faktor 10 (Kühlbrandt et al., 2002). Die regulatorischen

Aminosäuren (S899, S911, T912) sind auch in den Proteinsequenzen von ChPma1 und CgPma1

enthalten (Abb. 3.3B, rote Markierung). Im Gegensatz dazu besitzt ChPma2 und sein

potenzielles Ortholog CgPma2 diese Aminosäuren nicht. Die Abwesenheit dieser

Phosphorylierungsstellen deutet darauf hin, dass die Regulation durch Glukose in ChPma2

nicht vorhanden ist. Dem gegenüber impliziert das Vorhandensein dieser Threonin und Serin

Reste eine ähnliche Regulation von ChPma1 wie in S. cerevisiae und somit einen

induzierenden Einfluss von Glukose auf die Protonentransportkapazität.

3.3.4 Was ist die Funktion von ChPma2?

Während der frühen Stadien der Infektion sehen sich Konidien von C. higginsianum auf der

Oberfläche von A. thaliana nährstoffarmen Bedingungen ausgesetzt. Auch während der

biotrophen Phase sind Primärhyphen von dem Zytoplasma der Wirtszellen abgetrennt

(Connell et al., 2004). Dennoch konnte gezeigt werde, dass in Appressorien eine Fülle von

Transportprozessen stattfinden. Darunter zählen unter anderem die Sekretion einer Vielzahl

von potentiellen Effektoren (Kleemann et al., 2012) und die Induktion der Expression einer

großen Anzahl von sekretierten carbohydrate-active enzymes (CAZymes) und von Proteinen

mit potentieller Pektinase-Aktivität (O’Connell et al., 2012). Da eine Vielzahl von

Transportprozessen von dem Plasmamembranpotential der Zelle abhängig sind, hat

vermutlich vor allem die Aktivität von H+-ATPasen einen starken Einfluss auf eine

erfolgreiche Infektion. Bei einer zu ScPma1 analogen Regulation von ChPma1 läge ChPma1

127

ohne induzierende Glukose in einer wenig aktiven Konformation vor. Eine H+-ATPase ohne

diese Form der Regulation hätte hingegen auch unter nährstoffarmen Umweltbedingungen

die, für die Aufrechterhaltung des für Transportprozesse erforderlichen Protonengradienten,

benötigte Aktivität. Diese Hypothese wird durch Beobachtungen aus Uromyces fabae und

Ustilago maydis unterstützt, da die Aktivität der H+-ATPasen dieser obligat biotrophen

Pathogene unabhängig von Glukose reguliert wird (Robles-Martínez et al., 2013; Struck et

al., 1996, 1998). Die Abwesenheit von ChPma1 und die starke Expression von ChPMA2 in

Appressorien von C. higginsianum deutet darauf hin, dass es sich bei ChPma2 um eine

Isoenzym von ChPma1 handelt, welches unter nährstoffarmen Bedingungen den

Protonentransport übernimmt. Leider gibt es keinen direkt Beweis dafür das ChPma2

Protonen transloziert aber mehrere Beobachtungen sprechen dafür. So weist ChPma2 die

stärkste Sequenzidentität mit bekannten Protonenpumpen auf (43% ScPma1), während z.B.

Ca2+ und Na+-transportierende ATPasen geringere Identitäten mit Pma2 zeigen (14%

ScPmc1, 18% ScEna2; siehe auch Tabelle 2.4). Des Weiteren weisen Vorhersagen der

Sekundärstruktur von ChPma2 die typische Topologie und Domänenstruktur von

Plasmamembran-gebundenen Protonenpumpen auf. So besitzt ChPma2 zehn

Transmembrandomänen und die konservierten Phosphorylierung- (CSDKTGTLT) und ATP-

Bindemotive (KGAP, DPPR, TGD und GDGVNDAP) (Ambesi et al., 2000; Portillo, 2000). Die

beobachtete Lokalisation von ChPma2-mCherry an der Peripherie von Hyphen bestätigt

zudem die Annahme, dass es sich bei ChPma2 um ein Plasmamembran-gebundenes

Protein handelt. Einige der Transformanten mit ektopische Expression von ChPMA1 unter

der Kontrolle des ChPMA2 Promotors zeigten eine vereinzelte Bildung von Primärhyphen.

Wenn ChPma1 und ChPma2 unterschiedliche Substrate transportieren würden, wäre diese

teilweise Suppression des Phänotyps eher unwahrscheinlich.

In Abbildung 3.4 ist das Modell der Regulation und Funktion von ChPma2 schematisch

zusammengefasst.

Glukose

Pma1

H+

Pma1

Pma2

A

P

P

B

H+

H+

128

Abbildung 3.4: Schematische Darstellung der Funktion von ChPma2. (A) Während der Myzelbildung im nährstoffreichen Medium liegt ChPma1 in der Glukose-induzierten aktiven Form vor. (B) Unter nährstoffarmen Bedingungen wie z.B. in Appressorien besitzt ChPma1 nur eine geringen Protonentransportaktivität. Durch die Expression der unter diesen Bedingungen aktiven Protonenpumpe ChPma2 wird das Plasmamembranpotential aufrechterhalten.

3.3.5 Die Entwicklung von verschiedenen Isoformen von H+-ATPasen stellt ein mögliche konservierte Strategie pathogener Pilze dar

Neben Colletotrichum higginsianum und C. graminicola findet man in einer Vielzahl von

pathogenen Pilzen mehrere, unterschiedlich exprimierte H+-ATPasen (Korn et al., 2015). Die

meisten untersuchten Pilze kodieren für zwei Protonenpumpen, Ausnahmen stellen

Neurospora crassa mit PmaA als singuläres Protein und Aspergillus Arten mit jeweils drei

Protonenpumpen dar.

Abbildung 3.5: Phylogenie von pilzlichen H+-ATPasen. Proteinsequenzen wurden mit ClustalW aligned und mittels Geneious treebuilding (Jukes-Cantor; Neighbor-joining) als phylogenetischer Baum grafisch dargestellt; als Outgroup diente Die Na+-ATPase Ena1 aus S. cerevisiae. Prozentuale Bootstrap Werte (1000 Replikate) befinden sich jeweils links an den Verzweigungen.

Die Protonenpumpen aus S. cerevisiae (ScPma1, ScPma2) und S. pombe (NP_594360,

NP_011507) zeigen untereinander ein hohen Prozentsatz identischer Aminosäuren auf (S.

ChPma1-ähnliche

Proteine

ChPma2-ähnliche

Proteine

129

cerevisiae: 89%; S. pombe: 75%) und sind vermutlich durch Genomduplikationen entstanden

(Kellis et al., 2004). Im Gegensatz dazu unterscheiden sich die H+-ATPasen aus

phytopathogenen Pilzen deutlich (Magnaporthe oryzae: 45% Identität; Fusarium oxysporum:

43% Identität) und bilden in phylogenetischen Analysen verschiedene Gruppen (siehe Abb.

3.6). Jeweils eine Protonenpumpe der in den Analysen einbezogenen phytopathogener

Pilzen zeigt eine starke Ähnlichkeit mit Pma1 und Pma2 aus S. cerevisiae und bildet

zusammen mit PmaA aus N. crasse die Gruppe der ChPma1-ähnlichen Proteine. Eine

Ausnahme stellen die Protonenpumpen aus Ustilago maydis dar (Robles-Martínez et al.,

2013), von denen XP_757352 eine starke Ähnlichkeit zu pflanzlichen Proteinen wie Aha2

aus A. thaliana zeigt, während die zweite Protonenpumpe (XP_758728) zu den ChPma2-

ähnlichen Proteinen gehört. Zu dem ChPma2-Cluster gehört auch jeweils die zweite

Protonenpumpe aus den aufgeführten phytopathogenen Pilzen. Interessanter Weise

besitzen Aspergillus Arten drei H+-ATPasen, wovon zwei in einer Gruppe mit ChPma2

clustern. Die stärkste Ähnlichkeit zu ChPma2 zeigen Protonenpumpen aus weiteren

Colletotrichum Arten, sowie aus Magnaporthe und Togninia minima (Errerger der Esca

Krankheit von Weinreben). Neben einer engen Verwandtschaft weisen diese Pathogene

auch eine Infektionsstrategie mittels Appressorien auf. Das Expressionsmuster der

Protonenpumpen aus M. grisea zeigt zudem Analogien zu der Expression von ChPMA1 bzw.

ChPMA2. So konnte für das ChPma2-Ortholog MGG_04994 nur eine sehr schwache

Expression in Konidien aber eine starke Induktion der Expression während der

Appressorienbildung beobachtet werden (Franck et al., 2013). MGG_07200 zeigte hingegen

zwischen diesen Stadien, ähnlich wie ChPMA1, keine gesteigerte Expression. Zu der

Gruppe der Pma2-ähnlichen Proteine gehört ebenfalls LmPma1 aus Leptosphaeria

maculans. Diese H+-ATPase wurden in einen Screen von T-DNA Insertionsmutanten als

Pathogenitätsfaktor identifiziert und entsprechende Knockout Mutanten arretieren im

Stadium der Penetration (Remy et al., 2008). Das publizierte Muster und Niveau der

Expression von LmPMA1 ähnelt aber eher dem vom ChPMA1. Remy et. al schlugen zudem

eine Rolle von LmPma1 für den Aufbau des Turgors von Penetrationshyphen vor,

wohingegen Appressorien von ΔChPma2 Knockoutmutanten sich im Turgor nicht von denen

des Wildtyps unterscheiden. Neben phytopathogenen Pilzen besitzt auch Glomus mossae

als arbuskulärer Mykorrhizapilz (AM) mindestens zwei H+-ATPasen, welche hinsichtlich der

Infektion und der Verfügbarkeit von Nährstoffen unterschiedlich exprimiert werden (Ferrol et

al., 2000; Requena et al., 2003). Auch auf der pflanzlichen Seite der symbiotischen

Interaktion scheinen H+-ATPasen eine essentielle Rolle einzunehmen. Für die H+-ATPasen

HA1 bzw. Os-HA1 aus Medicago truncatula und Oryzae sativa und konnte eine Induktion der

Expression während der Interaktion mit AM gezeigt werden (Wang et al., 2014). Der Verlust

dieser Protonenpumpen hatte eine geringere Aufnahme von Phosphat durch die

130

Wirtspflanze zur Folge. Die Expression von spezialisierten H+-ATPasen stellt vermutlich eine

Anpassung an verschiedene Umweltbedingungen dar und ermöglicht sowohl symbiontische

als auch parasitäre Pflanzen-Pilz-Interaktionen.

3.4 Ausblick

Im Rahmen dieser Arbeit konnte zum ersten Mal in einem Appressorien-bildenden

Phytopathogen eine H+-ATPase als Pathogenitätsfaktor identifiziert werden. ChPma2 gehört

zu einer Gruppe von Protonenpumpen, welche aufgrund ihrer Expression und ihrer

Regulation spezielle Aufgaben während definierten Stadien der Infektion wahrnehmen.

ChPma2-ähnliche Protonenpumpen stellen durch ihre potentielle Bedeutung für die

Pathogenität interessante Ziele für Fungizide dar, wobei derartige Wirkstoffe ein

spezifischeres Wirkungsspektrum besitzen würden als generelle Inhibitoren von

Protonenpumpen. Eine Analyse des Promotorbereiches von ChPMA2 könnte zudem dazu

beitragen mögliche Transkriptionsfaktoren von C. higginsianum zu identifizieren welche an

der Regulation weiterer Pathogenitätsgenen beteiligt sind.

Anschließende Untersuchungen der gefundenen T-DNA markierten Gene von vir-Mutanten

könnten zudem zu einer Identifizierung weiterer interessanter C. higginsianum

Pathogenitätsfaktoren führen.

131

4. Material und Methoden 4.1 Organismen

Bakterienstämme

Für die Amplifikation von Plasmiden und Vektoren wurden die E. coli Stämme XL-1, Cl-10,

DH5α und DB3 verwendet. Für die Transformation von TOPA-TA Vektoren wurden TOP10

Zellen verwendet. Für die Agrobacterium tumefaciens vermittelte Transformation von C.

higginsianum wurde der A. tumefaciens Stamm AGL1 (BAA 101) verwendet.

Tabelle 4.1: Verwendete Bakterienstämme Stamm Genotyp Herkunft XL-1 Blue endA1 gyrA96(nalR) thi-1 recA1 relA1 lac glnV44

F'[ ::Tn10 proAB+ lacIq Δ(lacZ)M15] hsdR17(rK- mK

+) Stratagene

XL-10 Gold endA1 glnV44 recA1 thi-1 gyrA96 relA1 lac Hte Δ(mcrA)183 Δ(mcrCB-hsdSMR-mrr)173 tetR F'[proAB lacIqZΔM15 Tn10(TetR Amy CmR)]

Stratagene

DH5α F- endA1 glnV44 thi-1 recA1 relA1 gyrA96 deoR nupG Φ80dlacZΔM15 Δ(lacZYA-argF)U169, hsdR17(rK

- mK+), λ–

Life Technologies

DB3.1 F- gyrA462 endA1 glnV44 Δ(sr1-recA) mcrB mrr hsdS20(rB

-, mB-) ara14 galK2 lacY1 proA2

rpsL20(Smr) xyl5 Δleu mtl1

Invitrogen

AGL1 AGLO recA::bla pTiBo542ΔT Mop+ CbR (Lazo et al., 1991) TOP10 F– mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC) Φ80lacZΔM15

lacX74 recA1 araD139 Δ(ara leu) 7697 galU galK rpsL (StrR) endA1 nupG

Life Technologies

Arabidopsis thaliana

Infektionen von C. higginsianum wurden mit A. thaliana Pflanzen des Ökotyp Columbia (Col-

0) durchgeführt.

Colletotrichum higginsianum

Als C. higginsianum Wildtypstramm CY5535 diente MAFF 305635 (NIAS)

132

Tabelle 4.2: Verwendete C. higginsianum Stämme Stamm Beschreibung Herkunft CY5871 CY5535 transformiert mit pCK2650 (pPN) Diese Arbeit CY6021, CY6022 CY5535 transformiert mit pCK2831;

ΔChku80 (Korn et al., 2015)

CY5951, CY5952 CY5535 transformiert mit pCK2783 (pPK2-Cih1-GFP)

AG Koch

CY5956, CY5857 CY5535 transformiert mit pCK2842 (pPN2-Cih1-mCherry)

Diese Arbeit

CY6091, CY6091 CY6021 transformiert mit pCK3083, ΔChcih1 AG Koch CY6144, CY6145 CY6021 transformiert mit pCK3072, ΔChcih2 AG Koch CY6360, CY6363 CY6091 transformiert mit pCK4179, ΔChcih1

ΔChcih2 AG Koch

CY6367 CY6021 transformiert mit pCK4179, ΔChcih2 AG Koch CY6371 CY6021 transformiert mit pCK4222,

ΔChlysm3 AG Koch

CY6372 CY6021 transformiert mit pCK4223, ΔChlys,3 AG Koch CY6150 CY6021 transformiert mit pCK3449 (Korn et al., 2015) CY6151, CY6152, CY6153

CY6021 transformiert mit pCK3449, ΔChpma2

(Korn et al., 2015)

CY6269 CY5535 transformiert mit pCK3880 (pPN-Ppma2-mCherry)

(Korn et al., 2015)

CY6369 CY5535 transformiert mit pCK3973 (pPK2-Ppma1-GFP)

(Korn et al., 2015)

CY6490, CY6493 CY6021, pma2::pma2-mCherry, pma1::pma1-GFP

AG Koch

CY6570, CY6571, CY6572

vir-22 transformiert mit pCK3883 Diese Arbeit

CY6569, CY6580, CY6587

vir-24 transformiert mit pCK3883 Diese Arbeit

CY6582, CY6583, CY6584, CY6585

vir-24 transformiert mit pCK3598 Diese Arbeit

CY7226, CY7227, CY7228, CY7229, CY7230, CY7231, CY7232, CY7233, CY7234

vir-22 transformiert mit pCK3598 Diese Arbeit

CY7235, CY7236 vir-22 transformiert mit pCK2650 (pPN) Diese Arbeit Analysierte C. higginsianum vir-Mutanten (Korn et al., 2015) (Korn et al., 2015)(Korn et al.,

2015)(Korn et al., 2015):

vir-12, vir-19, vir-22, vir-23, vir-24, vir-41, vir-51, vir-52, vir-53, vir-56, vir-70, vir-72, vir-72, vir-

81, vir-97, vir-102

133

4.2 Verwendete Plasmide und Oligonukleotide

Tabelle 4.3: Verwendete Plasmide und Vektoren

Plasmid Beschreibung Referenz pPK2 Binärer Vektor mit hph Resistenzkassette ( Covert et al.,

2001) pSL1180 Klonierungsvektor mit Polylinker Amersham pSP72 Klonierungsvektor mit Polylinker Promega pM-RB Quelle von mCherry ORF (Nelson et al.,

2007) pMF280 Nelson et al., 2007) (Freitag et al.,

2004) pK7FWG2 Binärer Gateway(TM) Vektor (Karimi et al.,

2007) pCR8/GW/TOPO TOPO Entry Vektor Life

Technologies pCSN44 hph unter der Kontrolle von NcTRPC (Staben et al.,

1989) pA-Hyg-OSCAR Hygromycin-Resistenzkassette mit P1r and P4

Attachment Sites (Paz et al., 2011)

pA-Bar-OSCAR Bialaphos-Resistenzkassette mit P1r and P4 Attachment Sites

AG Koch

pOSCAR Binärer Vektor, ccdB Gen mit P2r and P3 Attachment Sites

(Paz et al., 2011)

pCK2321 Yeplac181 Derivat mit 4 kb ChTRPC AG Koch pCK2367 pPK2 Derivat, hph Reistenzkassette durch

Polylinker ersetzt AG Koch

pCK2524 pSL1180 Derivat mit Pccg1 H1-GFP M. Korn Diplomarbeit

pCK2560 pSL1180 Derivat mit Pccg1 GFP M. Korn Diplomarbeit

pCK2565 pPK2 Derivat mit Pccg1 GFP M. Korn Diplomarbeit

pCK2643 pSP72 Derivat mit Pccg1 GFP M. Korn Diplomarbeit

pCK2650 pPK2 Derivat, hph wurde durch nat ersetzt (Korn et al., 2015)

pCK2651 pSL1180 Derivat mit nat Resistenzkassette (Korn et al., 2015)

pCK2653 pSL1180 Derivat mit nat (Korn et al., 2015)

pCK2658 pSP72 Derivat mit Pccg1 GFP-CAAX M. Korn Diplomarbeit

pCK2660/2661 pPK2 Derivat mit Pccg1 GFP-CAAX M. Korn Diplomarbeit

pCK2762 pSL1180 Derivat mit Pcih1 ChCih1-GFP AG Koch pCK2783 pPK2 Derivat mit Pcih1 ChCih1-GFP AG Koch pCK2797 pSL1180 Derivat mit ChKU80 Deletionskassette (Korn et al.,

2015) pCK2830/pCK2831 pPK2 Derivat mit ChKU80 Deletionskassette (Korn et al.,

2015) pCK2834 pSL1180 Derivat mit Pcih1 ChCih1-mCherry Diese Arbeit

134

pCK2842 pPN Derivat mit Pcih1 ChCih1-mCherry Diese Arbeit pCK2994 pPK2 Derivat mit Hygromycin-Resistenzkassette

und Polylinker Diese Arbeit

pCK3057 pCR8/GW/TOPO mit Pcih2 ChCIH2 AG Koch pCK3061 pPK2 Derivat mit Pcih2 ChCih2-GFP Diese Arbeit pCK3072

pPK2 Derivat mit ChCIH2-Deletionskassette AG Koch

pCK3083 pPK2 Derivat mit ChCIH1-Deletionskassette AG Koch pCK3495 pOSCAR mit ChPMA1-Deletionskassette (Korn et al.,

2015) pCK3499 pOSCAR mit ChPMA2-Deletionskassette (Korn et al.,

2015) pCK3538 pSL1180 Derivat mit Ppma2 Diese Arbeit pCK3598 pPN mit Ppma2 ChPMA1 Diese Arbeit pCK3650 pOSCAR mit ChLys1-Deletionskassette (Korn et al.,

2015) pCK3652 pOSCAR mit Deletionskassette für CH063_12090 (Korn et al.,

2015) pCK3769 pPK2 Derivat mit TtrpC AG Koch pCK3786 pPK2 Derivat mit TtrpC und GFP AG Koch pCK3880 pPN Derivat mit Ppma2-mCherry (Korn et al.,

2015) pCK3882 pSL1180 Derivat mit Ppma2-mCherry (Korn et al.,

2015) pCK3883 pPN Derivat mit Ppma2 und ChPMA2 Diese Arbeit pCK3937 pPK2 Derivat mit Ppma1-GFP (Korn et al.,

2015) pCK4122 pINLOCUS-mCherry, pBluescript Derivat für in

Lokus mCherry-Fusionen AG Koch

pCK4179 pOSCAR mit ChCIH2-Deletionskassette, bar AG Koch pCK4180 pOSCAR mit ChCIH2-Deletionskassette, bar AG Koch pCK4222/pCK4223 pOSCAR mit ChLYSM3-Deletionskassette AG Koch pCK4370 pCK4122 Derivat, ChPMA2 AG Koch pCK4375 pOSCAR für ChPMA2-mCherry in Lokus Fusion AG Koch pCK4387 pINLOCUS-GFP, pBluescript Derivat für in Lokus

GFP-Fusionen AG Koch

pCK4445 pCK4387 Derivat, ChPMA1 AG Koch pCK4448 pOSCAR für ChPMA1-GFP in Lokus Fusion AG Koch

135

Alle Oligonukleotide wurden bei den Firmen Metabion International AG (Martinsried) und

Sigma-Aldrich (Traufkirchen) bezogen.

Tabelle 4.4: Verwendete Oligonukleotide Name DNA Sequenz 5’-3’ Verwendung CK2123 CGTGCTTTCAGCTTCGATGTAGG Forward Primer für hph CK2124 AAGATGTTGGCGACCTCGTATTG Reverse Primer für hph CK2562 GCTTAATTAACATGGTGAGCAAGGGCGA Forward Primer für

mCherry (PacI) CK2563 GGAATTCTTACTTGTACAGCTCGTCCATG Reverse Primer für

mCherry (EcoRI) CK2580 GTAATACGACTCACTATAGGGCACGCGTGGTCGACGGC

CCGGGCTGGT Oligo 2 für die Adaptor-Synthese

CK2581 ACCAGCCC-NH2 Oligo 2 für die Adaptor-Synthese 3’-amino-C7 Linker

CK2582 GTAATACGACTCACTATAGGGC Genome Walker Adaptor Primer 1

CK2583 ACTATAGGGCACGCGTGGT Genome Walker Adaptor Primer 2

CK2621 GGGCGGCCGC ATCATCTTGAAGAAACTGTACA Forward Primer für PtrpC (NotI)

CK2622 TAGGATCCTTAAGCACAGAGATATGCTTGTGT Reverse Primer für PtrpC (BamHI)

CK2640 TTGGATCCTAGAAGGAGCAGTCCATCT Forward Primer für Pccg1 (BamHI)

CK2641 GGCTGAGACCCGGGAATTCGGCTTGTACAGCTCGTCCATG

Reverse Primer für GFP ohne Stopcodon

CK2644 AGAAAAAGAAGTCAAAGACAAAGTGTGTAATTATGTAAA 1. Synthese Oligo für CAAX-Box

CK2645 GATCTTTACATAATTACACACTTTGTCTTTGACTTCT 2. Synthese Oligo für CAAX-Box

CK2646 AATTCCCGGGTCAAGATGAGCAAAGATGGTAAAAAGA 3. Synthese Oligo für CAAX-Box

CK2647 TTTTCTTCTTTTTACCATCTTTGCTCATCTTGACCCGGG 4. Synthese Oligo für CAAX-Box

CK2656 AACATATGACCACTCTTGACGA Forward Primer fur nat (NdeI)

CK2657 AGATATCGACAAAGGAAAAGGG Reverse Primer fur nat (EcoRV)

CK2689 CTGGATGGTGAAGTAGACGGG Forward Primer für 5'-UTR von ChKU80

CK2690 GACCGTGGTCGATATCTTGT Reverse Primer für 5'-UTR von ChKU80

CK2691 AATCTAGGATCCTCAAGGGGAAGATCCTCTC Forward Primer für 3'-UTR von ChKU80 (BamHI)

CK2692 TTGTAGGGATCCGCTCTGGATAAGCCGTTGC Reverse Primer für 3'-UTR von ChKU80 (BamHI)

CK2750 AAAACTGCAGGCGTTCGGACGACACAGT Forward Primer für Pcih1 (PstI):

CK2751 CCTTAATTAAACAGACGGGGATGTTGATGACAT Reverse Primer für ChCIH1 (PacI)

CK2746 TCACTTCAAGGCCATCATGAAC forward Primer für ChPMA2

CK2747 AAATCTGGCGAGACAGCTTGAT Reverse Primer für ChPMA2

136

CK2777 CGCATCTGTTTTGATGCTTGTAA Forward Primer upstream der verwendeten 5’-Flank

CK2808 TGGCTGTCGTCGGCGTTGCCGC Forward Primer für ChCIH1

CK2809 CGCAGGTATCGCTGCCCTCCTT Reverse Primer für ChCIH1

CK2903 ATGGAGGGAGTTGAGTCGGTGTC Forward Primer für hph CK2904 CAGGTCCATGGAATCGACGTAGT Reverse Primer für hph CK2912 CGTACCGGGCCTTCATGACGGT Forward Primer upstream

der 5‘-UTR von ChKU80 CK2913 GGAATGTCTGAATGGAGACACTAT Reverse Primer in TtrpC CK2914 TCATCGCGGCTGCTGGTGAGTTTCC Forward Primer in TtrpC CK2915 CCAAGAGCAGCAAGAAGAAGCAG Reverse Primer

downstream der 3’-UTR von ChKU80

CK2923 CACACTACATGACTTGTCAAGGGCAC Forward Primer für Pcih2 CK3007 GTGTACTTGCGAGATCTTCCGA Forward Primer für 5’-

UTR von ChCIH2 (BglII) CK3008 GGAGGTACCGTTACGGAATTATGA Reverse Primer für 5’-

UTR von ChCIH2 (KpnI) CK3009 GTGTTTAAACTGTATGCATGTGACACAGCCTTG Forward Primer für 3’-

UTR von ChCIH2 (SacI) CK3010 GTGTTTAAACTGTATGCATGTGACACAGCCTTG Reverse Primer für 3’-

UTR von ChCIH2 (PmeI) CK3028 ATACTCGAGTTTCGCGTTGGTTACAGGGT Forward Primer für 3’-

UTR von ChCIH1 (XhoI) CK3029 ATAGTTAAACCCTCTTCGATAGGCGGTAAA G Reverse Primer für 3’-

UTR von ChCIH1 (PmeI) CK3030 ATAAGATCTCGGGATGGGACAGGCGTTCG Forward Primer für 5’-

UTR von ChCIH1 (BglII) CK3031 ATAGGTACCAAAAAGATTAAAGGTTGGGTAAAG Reverse Primer für 5’-

UTR von ChCIH1 (KpnI) CK3032 ACACACAGGGACGTTGATGACCTG Reverse Primer für

ChCIH2 CK3120 ACAGACGTCGCGGTGAGTTCAGGC Forward Primer in hph CK3262 GCCGATGCAAAGTGCCGATAAACA Reverse Primer in hph CK3319 GGGGACAGCTTTCTTGTACAAAGTGGAACTCCATTGCCG

CGCTGTACTTCG attB2r für die Deletion von ChPMA2

CK3320 GGGGACTGCTTTTTTGTACAAACTTGTGAATGGGACCACGGAAGAAACCGA

attB1r für die Deletion von ChPMA2

CK3321 GGGGACAACTTTGTATAGAAAAGTTGTTTCCATCGTCCTCGGTGGTCTTCTC

attB4 für die Deletion von ChPMA2

CK3329 GGGGACAACTTTGTATAATAAAGTTGTCATTAGTGACAGTCGTATGATGTCGC

attB3r für die Deletion von ChPMA2

CK3383 GGGGACAGCTTTCTTGTACAAAGTGGAAACCAAACTTTCCTCTCCCTCC

attB2r für die Deletion von ChPMA1

CK3384 GGGGACTGCTTTTTTGTACAAACTTGTACGAACTGGATAGGACCAACG

attB1r für die Deletion von ChPMA1

CK3385 GGGGACAACTTTGTATAGAAAAGTTGTTATCTGGATCTTCTCCTTCGGC

attB4 für die Deletion von ChPMA1

CK3386 GGGGACAACTTTGTATAATAAAGTTGTCATCTCGAGAACCCCTACTGG

attB3r für die Deletion von ChPMA1

CK3529 GCTGAGAGACTTGACATTTACCCC Forward Primer für Ppma2

CK3530 TTGGCATATGAAACTGTCGGAAAAGGATTACAGTCC Reverse Primer für Ppma2 (NdeI)

CK3609 GGGGACAGCTTTCTTGTACAAAGTGGAAACGGCTTGGGACACCCTGCTC

attB2r für die Deletion von ChLYS1

CK3610 GGGGACTGCTTTTTTGTACAAACTTGTCCGCAGACACCACCAACCC

attb1r für die Deletion von ChLYS1

137

CK3611 GGGGACAACTTTGTATAGAAAAGTTGTTCCGAGAGTCTTCTCGAAACCACC

attB4 für die Deletion von ChLYS1

CK3612 GGGGACAACTTTGTATAATAAAGTTGTGCACCTGAGTATCTACTCTTGGC

attB3 für die Deletion von ChLYS1

CK3613 GGGGACAGCTTTCTTGTACAAAGTGGAAGGGATGGCGTGTGGGGC

attB2r für die Deletion von CH063_12090

CK3614 GGGGACTGCTTTTTTGTACAAACTTGTGCTGAAGGATTTTGTCGCGACG

attb1r für die Deletion von CH063_12090

CK3615 GGGGACAACTTTGTATAGAAAAGTTGTTCTGATGTTGCGAAAGGGCCTAC

attB4 für die Deletion von CH063_12090

CK3616 GGGGACAACTTTGTATAATAAAGTTGTCTGCGAGTGAAGCTAGTCTGGC

attB3 für die Deletion von CH063_12090

CK3706 GGTTTAAACATGAGCCGCAGTTCGTGGGTGAGT Forward Primer für TtrpC (PmeI)

CK3709 AGTAGGGTTTAAACATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTT

Forward Primer für GFP (PmeI)

CK3726 GGATATCAGTAAAATTGAATTGTCGGAAGC Reverse Primer für TtrpC (EcoRV)

CK3747 AATGCCGGCTTACTTGTACAGCTCGTCCATGC Reverse Primer für GFP (NaeI)

CK3820 CCACGATCTTTGCGAGCGCGCCGACGG Forward Primer für ChPMA2

CK3870 AACCCATATGGTGAGCAAGGGCGAGGA Reverse Primer für mCherry (NdeI)

CK3871 TAAGCGGCCGCTTACTTGTACAGCTCGTCCATG Forward Primer für mCherry (NotI)

CK3928 AAAAGATATC CACTTGCAGTCAATCGCGCC Forward Primer für Ppma1 (EcoRV)

CK3930 AAAAGATATC TGCGGTGGTTGCGAGACAGA Reverse Primer für Ppma1 (EcoRV)

CK3959 ACAACGAGGCCATCTACGA Forward qRT-PCR Primer für α-Tubulin

CK3960 GGAGGAAACGACCTGAGCA Reverse qRT-PCR Primer für α-Tubulin

CK4115 GGTCTGCACCATCGTCAACCAC Forward Primer für bar CK4116 TGCCAGAAACCCACGTCATGCC Reverse Primer für bar CK4139 GGGGACAGCTTTCTTGTACAAAGTGGAAGTGTACTTGCG

AGATCTTCCGA attB2r für die Deletion von ChCIH2

CK4140 GGGGACTGCTTTTTTGTACAAACTTGTGGAGGAACCGTTACGGAATTATGA

attb1r für die Deletion von ChCIH2

CK4141 GGGGACAACTTTGTATAGAAAAGTTGTTGTGGGCATATTTGGGCCTACCG

attB4 für die Deletion von ChCIH2

CK4142 GGGGACAACTTTGTATAATAAAGTTGTTGTATGCATGTGACACAGCCTTG

attB3 für die Deletion von ChCIH2

CK4163 AGAAAAGTAGATGCCCCTTAGC Reverse Primer außerhalb der 3'-Flank von ChCIH2

CK4164 CGCCGAGGACGGGAAGGATT Reverse Primer außerhalb der 5'-Flank von ChLYSM3

CK4168 GGGGACAGCTTTCTTGTACAAAGTGGAAATCTGGGACGTTTGGATGTG

attB2r für die Deletion von ChLYS3

CK4169 GGGGACTGCTTTTTTGTACAAACTTGTTTCAAGGAGCACGACTGAGC

attb1r für die Deletion von ChLYSM3

CK4170 GGGGACAACTTTGTATAGAAAAGTTGTTTGGTAACGGGGAGACTTGAC

attB4 für die Deletion von ChLYSM3

CK4171 GGGGACAACTTTGTATAATAAAGTTGTGGGTACTTGGACGGCTCCT

attB3 für die Deletion von ChLYSM3

CK4225 TGGAAAAGCTGATTTAGTGGCG Forward Primer upstream der verwendeten 5‘-Flank

138

von ChCIH2 CK4279 CGCCGGTGTCTACTACCTCCTT Forward qRT-PCR

Primer für ChPMA1 CK4280 CGCTGCATAGAGACGACGAAG Reverse qRT-PCR

Primer für ChPMA1 CK4281 CTTTGCTTGCACTTGGAGATCTAC Forward qRT-PCR

Primer für ChPMA2 CK4282 GTGAGCGTTGTCGTAGGCAA Reverse qRT-PCR

Primer für ChPMA2 CK4358 GGGGACAACTTTGTATAGAAAAGTTGTTAAGGACGACAA

GGGCGAGCG attB4 ChPMA2 in Lokus mCherry-Fusion

CK4361 CCCTCCTCGACAACGGCGCGG Reverse Primer für ChPMA2

CK4426 GGGGACAACTTTGTATAATAAAGTTGTCGAGACCGAGTTTGTAAGTTGCTGGT

attB3 ChPMA1in Lokus GFP-Fusion

CK4427 GGGGACAACTTTGTATAGAAAAGTTGTTAGAGGGATATCTGGGCAGAGTCGG

attB4 ChPMA1in Lokus GFP-Fusion

4.3 Enzyme Die folgende Tabelle 4.5 gibt eine Übersicht der verwendeten Enzyme. Tabelle 4.5: Verwendete Enzyme Enzym Hersteller Restriktionsenzyme Thermo Scientific, New England Biolabs Phusion DNA-Polymerase Finnzymes Taq DNA-Polymerase Laborpräparation AG Koch Pfu DNA-Polymerase Promega BP-Clonase Enzyme Mix Invitrogen T4 DNA-Polymerase Thermo Scientific T4 DNA-Ligase Thermo Scientific LR Clonase Enzyme Mix Invitrogen TOPO-TA Thermo Scientific FastAP Alkaline Phosphatase

Thermo Scientific

Heat Inactivated Alkaline Phosphatase

Thermo Scientific

Klenow Fragment Thermo Scientific T4 Polynukleotid Kinase New England Biolabs RNAase Thermo Scientific Revert Aid H Minus Reverse Transcriptase

Thermo Scientific

DNAse Ambion Brilliant II SYBR Green QPCR mastermix

Agilent Technologies

TaKaRa ExTaq TaKaRa Proteinase K Invitrogen Zymolyase

139

4.4 DNA-Leiter

GeneRulerTM 1 kb DNA Ladder (Thermo Scientific):

250-500-750-1000-1500-2000-2500-3000-3500-4000-5000-6000-8000-10000 bp

GeneRulerTM 50 bp DNA Ladder (Thermo Scientific):

50-100-150-200-250-300-400-500-600-700-800-900-1000 bp

4.5 Verwendete Kits

QIAquick PCR Purification Kit (Quiagen)

QIAquick Gel Extraction Kit (Quiagen)

QIAGEN Plasmid Mini Kit (Quiagen)

QIAGEN Plasmid Maxi Kit (Quiagen)

RiboPure™ RNA Purification Kit, yeast (Ambion)

High Prime Labelling Kit (Roche)

4.6 Puffer, Lösungen und Kulturmedien

Tabelle 4.6: Verwendete Puffer und Lösungen

Bezeichnung Zusammensetzung Modified Church and Gilbert Buffer 60,85 g/l Na2HPO4

24,65 g/l NaH2PO4 70 g/l SDS 20 ml EDTA, 0,5 M Lösung Lagerung bei -20°C; vor Gebrauch Zugabe von 1% BSA

DNA-Auftragspuffer mit Bromphonolblau 10 mM Tris-HCl (pH7.6) 60 mM EDTA 60% Glycerin 0,03% Bromphenolblau

DNA-Auftragspuffer mit Xylencyanol 10mM Tris-HCl (pH7.6) 60 mM EDTA 60% Glycerin 0,03% Xylencyanol

GTE-Puffer 25 mM Tris/HCl (pH 8,0) 50 mM Glukose 10 mM EDTA

NaOH/SDS Lösung 200 mM NaOH 1% SDS

20xSSC 175,32 g/l NaCl 88,22 g/l Trtinatriumzitrat-2-hydrat

140

50xTAE-Puffer 2 M Tris-Base 1 M Essigsäure 50 mM EDTA

10xTE-Puffer 100 mM Tris-HCl (pH 7,5) 10 mM EDTA

Diethylpyrocarbonate (DEPC)-Wasser: 0,1 % (v/v) DEPC 2mal für 15 Minuten autoklavieren

Trypanblau-Färbelösung 10 g Phenol 10 mg Trypanblau 10 ml Milchsäure 10 ml Wasser

Trypanblau-Entfärbe Lösung 2,5 g/ml Chloralhydrat Yeast Lysis Puffer 2% Triton X100

1% SDS 100 mM NaCl 10 mM TrisHCl (pH 8,0) 1 mM EDTA

TB-Puffer 15 mM CaCl2x2H2O 25 mM KCl 10 mM PIPES Mit Wasser auf 450 ml auffüllen, mit NaOH pH 6,7 einstellen

20x Salt Solution 2 g NH4Cl 0,6 g MgSO4x7H2O 0,3 g/l KCl 0,026 g CaCl2x2H2O 1,1 ml FeSO4 (2,5 mg/ml) Mit Wasser auf 100 ml auffüllen

200 mM Acetosyringon 196 mg Acetosyringon 5 ml DMSO

Saccharose-Wasser 50 g/l Saccharose 20xPuffer für A. tumefaciens 60g/l K2HPO4

20 g/l NaH2PO4 pH 7,0

10xPCR-Reaktionspuffer Y 200 mM Tris-HCl (pH 8.55) 160 mM Ammoniumsulfat 20 mM Magnesiumchlorid 0,1% Tween20

10xTBE 108 g/l Tris Base 9,3 g/l EDTA 55 g/l Borsäure

500 mM EDTA 185 g/l EDTA Mit 5 M NaOH (ca. 120 ml) auf pH 8,0 einstellen

2xCTAB Extraction Buffer 200ml 1M Tris-HCl (pH 7,5) 81,82 g NaCl 40 ml 500 mM EDTA (pH 8.0) 20g CTAB

SDS-Solution 2% SDS 0,1M Tris-HCl (pH9,0) 0,05M EDTA

SCE 1M Sorbitol 0,1M Na-Citrate 0,06M EDTA mit NaOH pH 7 einstellen

141

SCE/Zymolyase/2-Mercaptoethanol 1 ml SCE 3 mg Zymolyase (T20) 8 µl 2-Mercaptoethanol

KAc/HAc 250 g Kaliumacetat 150 g Essigsäure

DAB-Stammlösung 10 mg/ml DAB in 1 mM HCL DAB-Färbelösung DAB-Stammlösung 1:10 in 100 mM K3PO4,

(pH 5.8) verdünnen Natriumphosphat Puffer 6,23 g Na2HPO4 x2H2O mit MQ auf 500 ml

(enstpricht 0.07 M) auffüllen -pH Wert mit 0,07 M NaH2PO4x2H2O (0,966 g/100 ml H2O) auf 9 einstellen

Anilinblau-Färbelösung 0,05% Anilinblau (wässrige Lösung) 1/10 mit 0,07M Natrium-Phosphat Puffer pH9 verdünnen

1 M MES 19,52 g MES Mit Wasser auf 100 ml auffüllen, pH auf 5.6 mit KOH einstellen, steril filtrieren

1 M Glukose 180 g/l Glukose 50% Glyzerin 50 g Glyzerin

Zugabe von 60 ml Wasser Saccharose-Wasser 25 g Saccharose,

ad 450 ml Wasser Hexadekandiol 10 mM 1,16-Hexadekandiol in Methanol

Tabelle 4.7: Verwendete Medien

Bezeichnung Zusammensetzung TYE-Medium 5 g/l Hefeextrakt

10 g/l Trypton 8 g/l NaCl 15 g/l Agar für Festmedium

Oatmeal Medium 50 g/l geschrote Haferflocken 12 g/l Agar als 250 ml Portionen in 1 Liter Erlenmeyerkolben 45 Minuten autoklavieren

LB-Medium 10 g/l Trypton 5 g/l Hefeextrakt 10 g/l NaCl mit 5 M NaOH auf pH 7,5 einstellen

Czapek Dox Minimalmedium 50 g/l Czapek Dox (Fluka) Kartoffelextrakt-Glucose-Agar (PDA) 39 g/l PDA (Carl Roth) Modifiziertes Mathur‘s-Medium 2.8 g/l Glukose

1,5 g/l Trypton 0,5 g/l Hefeextrakt 1,2 g/l Mg2SO4x7H2O 2,7 g/KH2PO4l 30 g/l Agar für Festmedium

Fries-Medium 30 g/l Saccharose 5 g/l Ammonium-Tartrat 1 g/l Ammoniumnitrat 1 g/l KH2PO4 0,48 g/l MgSO4x7H2O 1 g/l NaCl

142

0,13 g/l CaCl2x2H2O 1 g/l Hefeextrakt

Yeast Minimalmedium 2g/l Yeast Nitrogen Base 5,5 g/l Ammoniumsulfat 15 g/l Agar 100 ml/l einer 20% Lösung des entsprechenden Kohlenhydrats

YEB-Medium 5 g/l Rinderextrakt 1 g/l Hefeextrakt 5 g/l Pepton aus Casein 5 g/l Saccharose 2 mM MgSO4 (2ml aus 1M MgSO4) 15 g/l Agar

NSY-Glycerin 5 g/l Pepton 3 g/l Rinderextrakt 1 g/l Hefeextrakt 5 g/l Saccharose 70% Glycerin Endkonzentration

SOC-Medium 20 g/l Trypton 5 g/l Hefeextrakt 0,58 g/l NaCl l 0,19 g/l KCl 10 mM MgCl2 2,46 g/l MgSO4 4 g/l Glukose

Induktions-Medium (fest) Wasseragar (3,75 g Agar in 222,5 ml H2O) 12,5 ml Salt Solution für A. tumefaciens 10 ml MES (1 M Lösung, pH 5,6) 2,5 ml Glyzerin (50% Lösung) 2,5 ml Glukose (1 M Lösung) 250 µl Acetosyringon (200 mM Lösung)

Induktions Medium (flüssig) 2,8 g/l Glukose 1,5 g/l Pepton 0,5 g/l Hefeextrakt 1,2 g/l MgSO4x7H2O 2,7 g/l KH2PO4

Minimal Medium für Agrobakterien 450 ml Saccharose-Wasser, 25 ml 20x Salt Solution, 25 ml 20x Puffer für A. tumefaciens

4.7 Antibiotika Tabelle 4.8: Verwendete Antibiotika Name Bezugsquelle Endkonzentration Ampicillin Carl Roth 100 µg/ml für E. coli Kanamycin Carl Roth 75 µg/ml für A. tumefaciens;

50 µg/ml für E. coli Hygromycin Wako 80 µg/ml für C. higginsianum Bialaphos Wako 20 µg/ml für C. higginsianum Nourseothricin Jena Bioscience GmbH 80 µg/ml für C. higginsianum: Spectinomycin Sigma-Aldrich 100 µg/ml Cefotaxime Duchefa Biochemicals 100 µg/ml

143

4.8 Methoden

4.8.1 Anzuchtbedingungen

Anzucht von C. higginsianum

Für die Gewinnung von Konidien wurde C. higginsianum auf Oatmeal-Platten für sechs bis

sieben Tage bei 25°C in einem Inkubator (12 h Licht / 12h Dunkelheit) kultiviert. Für

Stammkulturen von C. higginsianum wurden Konidien mit Wasser von Oatmeal-Platten

abgespült und 1:1 mit NSY-Glycerin gemischt. Je 1 ml der Konidiensuspensionen wurde in

Cryovials bei -80°C gelagert.

Die Anzucht von Myzel erfolgte in Mathur oder Fries-Medium (2x106 Konidien pro 100 ml

Medium) in einem Inkubator (28°C; 300 rpm).

Anzucht von A. thaliana

Saatgut wurde auf Arabidopsis Erdmischung (65% Fruhstorfer Erde Typ P (Fa. Hawita,

Vechta), 25% Sand, 10% Liadrain Blähton (Fa. Liapor, Pautzfeld)) ausgebracht und für die

Stratifizierung anschließend für 48 h bei 4°C dunkel und feucht inkubiert. Anschließend

wurden die Sämlinge 2 Wochen unter Kurztag-Bedingungen (8 h (22°C)/16 h (19°C) Licht-

/Dunkelrhythmus) in Arabidopsis Chambers (Percival Scientific) angezogen. Nach dem

Pikieren mit Arabidopsis Erdmischung wurden die Pflanzen fünf Wochen in Phytokammern

(Gro-Bank; CLF, Weilheim) unter definierten Bedingungen (12 h Licht (22°C) / 12 h

Dunkelheit (19°C); 91 µE/m²s; 70%Luftfeuchtigkeit) angezogen. Pro Woche wurden die

Pflanzen zweimal gegossen, einmal davon mit 0,1% WUXAL-Super Dünger (Aglukon,

Düsseldorf).

in vitro Appressorienbildung von C. higginsianum

Sechs bis sieben Tage alte Oatmeal-Platten mit C. higginsianum wurden mindestens für

einen Tag bei 4°C gelagert. Konidien wurden mit destilliertem Wasser abgespült und der

Titer mittels eines Casy Cell Counters (Schärfe-Systems) bestimmt. Für eine verbesserte

Reproduzierbarkeit der Appressorienbildung wurden die verwendeten Petrischalen mit

Hexadekandiol beschichtet (10 mM 1,16-Hexadecanediol; 1:100 verdünnt in Methanol). Eine

Übersicht der verwendeten Petrischalen ist in Tabelle 4.9 zusammengefasst.

144

Tabelle 4.9: Verwendete Petrischalen für die in vitro Appressorienbildung von C. higginsianum

Petrischale Art-Nr. und Bezugsquelle

Hexadekandiol Lösung (100 µM in Methanol)

Anzahl der Konidien

60x15 mm Cell Culture Disc

#83.1801.002; Sarstedt

1 ml 1x106 in 5 ml Wasser

145x20 mm Petrischale

#639102; Greiner bio-one

5 ml 2x107 Konidien in 40 ml Wasser

µ-Dish 35mm, high # 80131; ibidi 100 µl 1,2x105 in 1 ml Wasser

µ-Slide 18 Well, uncoated

#81821; ibidi 8 µl 2000 in 25 µl Wasser

Für die in vitro Appressorienbildung auf Dialyseschläuchen wurden kleine, einlagige Stücke

Dialyseschlauch (Visking 36/32, Carl Roth) autoklaviert und auf einen Objektträger mittels

Agarose (1,2%) fixiert. Je nach Größe des verwendeten Stückchens wurde eine angepasste

Anzahl von Konidien verwenden (ca. 1x105/cm²).Die Inkubation erfolgte in Dunkelheit bei

25°C mit hoher Luftfeuchtigkeit. Nach einen Tag hatten sich Appressorien gebildet und ab

zwei Tagen war Myzel innerhalb des Dialyseschlauchs sichtbar. Für die Mikroskopie wurde

der Dialyseschlauch von der Agarose entfernt.

Für die Bestimmung des Turgors von in vitro Appressorien wurde ein Cytorrhysis-Assay

angewendet. 60 mm Culture Discs wurden mit Hexadekandiol beschichtet und pro Schale

wurden 1x106 Konidien in 5 ml Wasser hinzugegeben. Nach 24 Stunden wurde das Wasser

entfernt und durch Lösungen von PEG6000 (100 mg bis 500 mg/ml) mit entsprechenden

osmotischen Drücken von 70 Pa bis 5.8 MPa (Money, 1989) ersetzt. Nach 10 Minuten

Inkubationszeit wurde lichtmikroskopisch der prozentuelle Anteil kollabierter Appressorien

pro PEG6000 Konzentration bestimmt (3 Replikate mit je n>100).

4.8.2 Isolationen von Nukleinsäuren

Für detaillierte Protokolle der DNA-und RNA-Extraktion aus C. higginsianum siehe (Korn et

al., 2015)

4.8.3 Transformationen

Transformation von Agrobakterien

Reaktionsgefäße mit kompetenten Agrobakterien wurden aufgetaut und mit der zu

transformierenden DNA gemischt (3-4 µg). Nach 30 Minuten bei 0°C erfolgte ein Kältschock

durch Einfrieren der Ansätze in flüssigen Stickstoff und ein Wärmeschock durch sofortiges

Auftauen bei 37°C. Pro Ansatz wurden 500 µl YEB-Medium hinzugegeben und bei 28°C für 5

Stunden inkubiert. Die Zellen wurden anschließend abzentrifugiert (1 Minute, 13.000 rpm)

145

und der Überstand wurde bis auf 200 µl verworfen. Der restliche Ansatz wurde gemsicht und

komplett auf YEB-Platten mit entsprechenden Antibiotika ausplattiert und für 2 Tage bei 28°C

inkubiert.

Agrobakterium tumefaciens vermittelte Transformation von C. higginsianum (ATMT)

Zwei Tage vor der Transformation von C. higginsianum wurden 5 ml Minimal Medium für

Agrobakterien mit Einzelkolonien der entsprechenden A. tumefaciens Stämme beimpft und

für 2 Tage bei 28°C und 300 rpm inkubiert. Am Morgen der Transformation wurde die oD600

der Kultur bestimmt, auf 0,15 mit Induktions Medium eingestellt und 6 Stunden bei 28°C

inkubiert. Während der Inkubationszeit wurden Platten mit Induktions Medium gegossen.

Nach dem Abkühlen der Platten wurden zugeschnittene und autoklavierte Nylon-Filter

aufgelegt. Konidien des zu transformierenden C. higginsianum Stammes wurden mit Minimal

Medium für Agrobakterien von 6 bis 7 Tage alte Oatmeal Platten abgespült und auf

Konzentration (Casy Cell Counter) von 1x106/ml mit Induktionsmedium verdünnt. Jeweils 100

µl der entsprechenden Konidien-und Agrobakteriensuspensionen wurden gemischt und auf

die vorbereitet Platten mir Induktions Medium ausplattiert. Nach 2 Tagen bei 28°C wurde der

Nylonfilter von den Platten mit Induktions Medium auf PDA-Selektionsplatten mit

entsprechenden Antibiotika umgesetzt. Nach 2 Tagen im Lichtschrank bei 25°C wurden die

Filter erneut auf PDA Platten umgesetzt und diese wurden inkubiert bis Kolonien sichtbar

waren (6 bis 7 Tage nach Transformation). Die erhaltenen Transformanten wurden auf PDA-

Selektionsplatten vereinzelt. Die erhaltenen Einzelkolonien wurden anschließend auf Platten

mit Oatmeal Medium ausgestrichen und weitere 6 bis 7 Tage bei 25°C inkubiert.

4.8.4 Infektion von A. thaliana mit C. higginsianum Platten mit Oatmeal Medium wurden mit den entsprechenden C. higginsianum Stämmen

beimpft und bei 25°C inkubiert bis diese eine vollständige orangene Färbung durch die

gebildeten. Konidien aufwiesen (5 bis 7 Tage). Anschließend wurden die Platten für

mindestens einen Tag bei 4°C gelagert. Die Konidien von C. higginsianum wurden mit

Wasser von den Platten abgespült und deren Konzentration mittels eines Casy Cell

Counters bestimmt.

Sprühinfektion:

Die Konidiensuspensionen wurden in einer 20 ml Pump-Sprühflasche (20ml) auf eine

Konzentration von 1x106/ml eingestellt. Ca. 5-6 Wochen alte A. thaliana Pflanzen wurden in

eine, mit nassen Papiertüchern abgedichteten, Pflanzenschalen gestellt und gleichmäßig mit

den Konidiensuspensionen besprüht (ca. 4-5 Pumpstöße á 100 µl pro Pflanze). Die

146

Pflanzschalen wurden mit Wasser gegossen (Boden bedeckt) und mit abgedichteten Hauben

bedeckt. Für eine bessere Aufrechterhaltung der Luftfeuchtigkeit innerhalb der Schale

wurden befeuchtete Papiertücher zwischen Schale und Haube gelegt. Die infizierten

Pflanzen wurden bis zu der Auswertung weiter in der A. thaliana Growth Chamber (siehe

4.9.1.3) inkubiert.

Tropfinfektion von abgetrennten A. thaliana Blättern:

Einzelne Blätter von 5-6 Wochen alte A. thaliana Pflanzen wurden in eine mit nassen

Papiertüchern ausgelegten viereckige Petrischalen gegeben und mit jeweils 4 Tropfen (500

Konidien pro Tropfen) der C. higginsianum Konidiensuspensionen infiziert. Die Inkubation bis

zu der Auswertung erfolgte ebenfalls in Growth Chambers.

Pathogenitäts-Assay für C. higginsianum vir-Mutanten:

Konidien von Mutanten wurden von Platten mit Oatmeal Medium abgespült und auf eine

Konzentration von 1x105/ml eingestellt. A. thaliana Col-0 Pflanzen wurden für 5 Wochen in

24 Well Anzuchtschalen angezogen. Pro Mutante wurden drei Blätter von unterschiedlichen

Pflanzen betropft (4 Tropfen mit 5 µl). Makroskopische Symptome wurden nach 6 Tagen in

Growth Chambers untersucht. Mutanten ohne oder mit reduzierten Symptomen wurden in

unabhängigen Experimenten erneut in Tropfinfektionen eingesetzt. Mutanten mit

reproduzierbaren Pathogenitätsdefekten (vir-Mutanten) wurden in Sprühinfektionen von A.

thaliana Col-0 (siehe oben) weiter analysiert.

4.8.5 Histochemische Färbungen und Mikroskopie Alle histochemischen Analysen wurden an einem Leica DMR HC Mikroskop (Leica

Microsystems, Wetzlar, Germany) durchgeführt. Für Konfokalmikroskopopische Aufnahmen

wurde ein Leica TCS SP5 II (Leica Microsystems, Wetzlar, Germany) mit einem HCX PL

APO lambda blue 63.0 x 1.20 Water UV Objektiv verwendet. GFP wurde mit der 488 mm

Bande des Argon Lasers angeregt und zwischen 496 nm und 556 nm detektiert. Für

mCherry und FM4-64 wurde ein 561 nm DPS Laser für die Anregung verwendet und die

Emission wurde zwischen 569 nm und 637 nm detektiert.

Bestimmung der gebildeten Infektionsstrukturen mittels Trypanblaufärbungen

Die zu färbenden A. thaliana Blätter wurden in 2 ml Safelock-Reaktionsgefäßen mit

eingestochenem Deckel gelegt und mit Trypanblaufärbelösung überschichtet. Der Ansatz

wurde im Heizblock für 90 Sekunden bei 95°C erhitzt und anschließend für maximal 24

Stunden bei Raumtemperatur stehen gelassen. Anschließend wurde die Färbelösung

entnommen und durch Chloralhydrat ersetzt. Nach mindestens 24 Stunden wurden die

147

Blätter mit Wasser gewaschen und mit Phasenkontrast oder Hellfeld-Mikroskopie untersucht.

Die prozentuelle Verteilung der gebildeten Infektionsstrukturen von C. higginsianum wurde

für mindestens 100 Appressorien pro Stamm bestimmt.

Detektion von reaktiven Sauerstoffspezies

Drei Tage nach der Sprühinfektion von A. thaliana mit C. higginsianum wurden einzelne

Blätter in 50 ml Zentrifugenröhrchen mit DAB-Färbelösung Überschichtet. Für die

Färbelösung wurden 10 mg 3,3’-Diaminobenzidine in 1 ml HCl (1 mM) gelöst und

anschließend 1:10 mit 100 mM Kaliumphosphat-Puffer pH 5,8 verdünnt (Thordal-

Christensen, Zhang, Wei, & Collinge, 1997). Nach 12 Stunden wurde die Färbelösung

entfernt und die Blätter wurden für 10 Minuten in 99% Ethanol entfärbt. Die Quantifizierung

der DAB-Färbung erfolgte durch Hellfeldmikroskopie und basiert auf das Verhältnis zwischen

gefärbten Epidermiszellen von A. thaliana und der Gesamtanzahl der gebildeten

Appressorien.

Detektion von Callose-Ablagerungen

Die histochemische Färbung von Papillen erfolgte durch Färbungen mit Anilinblau

(Fernandez & Heath, 1986; Shimada, Lipka, Connell, Okuno, & Schulze-lefert, 2006). Drei

Tage nach der Sprühinfektion wurden einzelne Blätter für 12 Stunden mit 99% Ethanol

entfärbt. Anschließend wurde der Ethanol durch Anilinblau-Färbelösung ersetzt. Nach 1

Stunde die Blätter dreimal mit Wasser gewaschen und mittels Epifluoreszenz-Mikroskopie

(Leica UV filter cube A; BP 340-380 nm, LP 425 nm) untersucht. Die Quantifizierung der

Induktion von Papillen basiert auf das Verhältnis zwischen der Anzahl von Appressorien mit

unterliegender Callose-Ablagerung und der Gesamtanzahl der Appressorien.

4.8.6 PCR-Techniken

Analyse der Genexpression mittels quantitativer Realtime PCR

Die Synthese von cDNA erfolgte mit RevertAid H Minus RT (Thermo Scientific) Reverse

Transkriptase entsprechend des Herstellerprotokolls.

Als Gerät für alle Messungen diente eine MX300 (Strategene) und alle Proben wurden mit

technischen Triplikaten vermessen. Die Effizienz der verwendeten Primer für quantitative

Realtime PCRs wurde mittels einer Amplifikation einer Verdünnungsreihe von Template und

der automatischen Effizienzberechnung mittels Standardkurven der MxPro Software

(Stratagene) bestimmt.

148

Für die Messungen wurde folgender Ansatz verwendet:

10 µl 2xBrilliant II SYBR Green qPCR MM (Agilent Technologies)

0,4 µl (200 nM) Primer 1 (10 µM stock)

0,4 µl (200 nM) Primer 2 (10 µM stock)

4,2 µl H2O

5 µL DNA Template (1:5 verdünnt)

Die Berechnung der relativen Expressionswerte erfolgte nach Pfaffl (Pfaffl, 2001). Für die

Standardisierung wurde das Expressionslevel von α-Tubulin (CH063_01222) verwendet.

Identifizierung von T-DNA Insertionsstellen von vir-Mutanten mittels Genome-Walker PCRs

Der verwendete Adapter (25 µM) wurde durch Annealing von zwei Oligonukleotiden

(CK2580, CK2581) hergestellt. Zuvor wurde allerdings an CK2581 mit folgen Ansatz ein 5‘-

Phosphat angefügt.

12,5 µl pCK2581(100pmol/µl)

3,75 µl 10X T4 DNA Ligase buffer (Fermentas)

1 µl Polynucleotidkinase (New England Biolabs, 10 U/µl)

20,25 µl H2O

Inkubation für 1 Stunde bei 37°C und anschließender Hitzeinaktivierung bei 65°C für 20

Minuten.

Jeweils 12,5 µl CK2850 und 37,5 µl phosphorylierter CK2581 wurden miteinander gemischt

und für 5 Minuten bei 95°C erhitz. Der Verdau der zu analysierenden chromosomalen DNA

erfolgte über Nacht in 100 µl Ansätzen mit 1 µg chromosomaler DNA und 50 U des

verwendeten Restriktionsenzyms. Nach dem Restriktionsverdau wurde die geschnittene

DNA mittels zweimaligen Phenolisieren mit Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol und

anschließender Ethanolfällung unter Zugabe von 20 µg Glykogen aufgereinigt und in 10 µl

TE aufgenommen. Jeweils 4 µl der DNAs wurden zusammen mit 2,6 µl des Adapters (25

µM) in 8 µl Ansätzen über Nacht bei 16°C ligiert. Am nächsten Tag wurden die Proben für 5

min auf 70°C erhitzt und anschließend 72 µl 1 x TE zugegeben. Die verwendeten Ansätze

und Programme der beiden Genome Walker PCRs sind in Tabelle 4.1 0 zusammengefasst.

149

Tabelle 4.10: Genome Walker PCRs PCR-Ansatz PCR-Programm

1. PCR

1 µl Taq-Polymerase (Laborpräparation, 7.5 U/µl) 5 µl 10 x Y Puffer 1 µl dNTPs (jeweils 10 mM) 1 µl AP1 (10 µM) 1 µl T-DNA spezifischer nested primer 1 (10 µM) 1 µl Ligationsansatz 40,75 µl H2O

7x 94°C 25 s 72°C 3 min 32x 94°C 25 s 66°C 3 min 10 min bei 66°C 4°C ∞

2. PCR

1 µl Taq-Polymerase (Laborpräparation, 7.5 U/µl) 5 µl 10 x Y Puffer 1 µl dNTPs (jeweils 10 mM) 1 µl AP2 (10µM) 1 µl T-DNA spezifischer nested primer 2 1 µl 1/50 Verdünnung des ersten PCR Ansatzes 40,75 µl H2O

5x 94°C 25 s 72°C 3 min 20x 94°C 25 s 66°C 3 min 10 min bei 66°C 4°C ∞

5 µl des ersten PCR Ansatzes und 5 µl des zweiten PCR Ansatzes werden auf ein 1,5%

Agarosegel aufgetragen und analysiert. Die zu sequnzierenden PCR-Produkte wurden

mittels des QIAquick PCR Purification Kit (Quiagen) aufgereinigt und in pJet2.1 (Thermo

Scientific) oder pGEM T-Easy (Promega) kloniert.

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Abbildungsverzeichnis

Abbildung 1.1: Infektionsstrukturen von biotrophen und hemibiotrophen Pilzen 6

Abbildung 1.2: Übersicht der Infektion von A. thaliana mit C. higginsianum 8

Abbildung 1.3: Domänenstruktur und Konformationswechsel von P-Typ-ATPasen 18

Abbildung 2.1: Alignment von Ku80 Proteinen 24

Abbildung 2.2: Nourseothricin als Selektionsmarker für C. higginsianum 26

Abbildung 2.3: Strategie für die Deletion von ChKU80 27

Abbildung 2.4: Selektion von Chku80 Knockout Stämmen 28-29

Abbildung 2.5: Southern-Blot Analyse von Chku80 Deletionsmutanten 31

Abbildung 2.6: Phänotypische Charakterisierung des ΔChku80 Stammes CY6021 33

Abbildung 2.7: C. higginsianum Proteine mit LysM Domänen 37-38

Abbildung 2.8: Lokalisierung und Expression von ChCih1-GFP bzw. ChCih1-mCherry 39-40

Abbildung 2.9: Cih1-mCherry zeigt keine Kolokalisation mit GFP-CAAX 42

Abbildung 2.10: Lokalisierung und Expression von ChCih2-GFP 43-44

Abbildung 2.11: Knockout von ChCIH1 mittels homologer Rekombination 45

Abbildung 2.12: Knockout von ChCIH2 mittels homologer Rekombination 46

Abbildung 2.13: Infektion von A. thaliana mit ΔChcih1 und ΔChcih2 Stämmen 47-48

Abbildung 2.14: Generierung von ΔChCIh2 und ΔChCih1/ΔChCih2 Knockoutstämmen 50

Abbildung 2.15: C. higginsianum Stämme mit Deletionen von ΔChcih1 ΔChcih2 zeigen keinen Pathogenitätsdefekt auf A. thaliana 51

Abbildung 2.16: Generierung und Pathogenität von C. higginsianum Stämmen mit Deletion von ChLYS3 53

Abbildung 2.17: Abbildung 2.17: Herstellung einer Bibliothek von C. higginsianum T-DNA Insertionsmutanten 56

Abbildung 2.18: Schematische Darstellung der möglichen Insertionen von zwei T-DNAs 57

Abbildung 2.19: Analyse der T-DNA Insertionen von neun vir-Mutanten 58

Abbildung 2.20: Sequenzen von T-DNA Junctions 61

Abbildung 2.21: Genome Walker Analyse von vir-Mutanten 62

Abbildung 2.22: T-DNA Insertionsort von vir-23 64

168

Abbildung 2.23: T-DNA Insertionsorte von vir-41 65

Abbildung 2.24: T-DNA Insertionsort von vir-51 67

Abbildung 2.25: T-DNA Insertionsort von vir-52 68

Abbildung 2.26: Phänotyp von ΔChLys1 Stämmen 69

Abbildung 2.27: T-DNA Insertionsort von vir-53 70

Abbildung 2.28: T-DNA Insertionsort von vir-56 71

Abbildung 2.29: T-DNA Insertionsorte von vir-70 72

Abbildung 2.30: T-DNA Insertionsort von vir-72 73

Abbildung 2.31: T-DNA Insertionsort von vir-73 73

Abbildung 2.32: Sechs vir-Mutanten haben eine T-DNA Insertion im ChPMA2 Lokus 74

Abbildung 2.33: Domänenstruktur von ChPma1 und ChPma2 77

Abbildung 2.34: Die Deletion von ChPMA1 war nicht möglich 79

Abbildung 2.35: Generierung von ΔChpma2 Knockout-Stämmen 79

Abbildung 2.36: Überprüfung des ΔChpma2 Knockouts 80

Abbildung 2.37: Knockout von ChPMA2 führt zum Verlust der Pathogenität 81

Abbildung 2.38: Der Verlust von ChPMA2 korreliert mit einer verringerten pflanzlichen Abwehr von A. thaliana 72-83

Abbildung 2.39: Appressorienbildung von ΔChpma2 85

Abbildung 2.40: Bestimmung des Turgors von Appressorien von ΔChku80 und ΔChpma2 87

Abbildung 2.41: Aufnahme von 14C markierter Glukose 89

Abbildung 2.42: Radiales Wachstum von ΔChpma2 und ChPMA2 T-DNA Insertionsmutanten in Abhängigkeit von der Kohlenstoffquelle 90

Abbildung 2.43: Katabolitrepression von C. higginsianum 92

Abbildung 2.44: PCR-Analyse der Expression von ChPMA1 und ChPMA2 während des Wachstums in Flüssigmedium 95

Abbildung 2.45 Bestimmung der Expression von ChPMA1 und ChPMA2 mittels Quantitativer Real Time PCR 96

Abbildung 2.46: Quantitative Real Time PCR der Expression von ChPMA1 und ChPMA2 während der in vitro Appressorienbildung 98

Abbildung 2.47 Expression von mCherry und GFP unter der Kontrolle des ChPMA1 bzw. ChPMA2 Promotors 99-100

169

Abbildung 2.48: Konstruktion von C. higginsianum Stämmen mit Expression von ChPMA2-mCherry und ChPMA1-GFP 102-103

Abbildung 2.49: ChPma1-GFP und ChPma2-mCherry haben keinen Einfluss auf die Pathogenität 104

Abbildung 2.50: Lokalisierung von ChPma1-GFP in Konidien 106

Abbildung 2.51: Lokalisierung von ChPma1-GFP und ChPma2-mCherry während der Myzelbildung 107

Abbildung 2.52: Lokalisierung von ChPma1-GFP und ChPma2-mCherry in Infektionsstrukturen 109-110

Abbildung 2.53: Komplementation von ChPMA2 T-DNA Insertionsmutanten vir-22 und vir-24 112

Abbildung 2.54: Suppression des Phänotyps von vir-24 114

Abbildung 2.55: Die Suppression des Phänotyps von vir-22 hat eine verstärkte Abwehr zur Folge 116

Abbildung 3.1: Anwendungen für NHEJ-defiziente C. higginsianum Stämme 119

Abbildung 3.2: Phylogenie von LysM-Proteinen 121

Ab0ildung 3.3: Unterschiede in den Proteinsequenzen von ChPma1 und ChPma2 125

Abbildung 3.4: Schematische Darstellung der Funktion von ChPma2 127

Abbildung 3.5: Phylogenie von pilzlichen H+-ATPasen 128

170

Tabellenverzeichnis

Tabelle 1.1: Top 10 phytopathogener Pilze 5

Tabelle 1.2: Klassifizierung von P-Typ- ATPasen 17

Tabelle 2.1: Überprüfung des ChKU80 Knockouts 30

Tabelle 2.2: C. higginsianum Proteine mit vorhergesagten LysM-Domänen 36

Tabelle 2.3: Erwarte Bandengrößen für verschiedene T-DNA Insertionen 59

Tabelle 2.4: BLAST-Analysen von C. higginsianum P-Typ ATPasen 76

Tabelle 2.5: Induktion der pflanzlichen Abwehr durch ChPMA2 vir-Mutanten und ΔChpma2 84

Tabelle 2.6: RNA-Seq Daten der Expression von ChPMA1 und ChPMA2 93

Tabelle 2.7: Suppression des Pathogenitätsphänotyps von vir-22 115

Tabelle 4.1: Verwendete Bakterienstämme 131

Tabelle 4.2: Verwendete C. higginsianum Stämme 132

Tabelle 4.3: Verwendete Plasmide und Vektoren 133-134

Tabelle 4.4: Verwendete Oligonukleotide 135-138

Tabelle 4.5: Verwendete Enzyme 138

Tabelle 4.6: Verwendete Puffer und Lösungen 139-141

Tabelle 4.7: Verwendete Medien 141-142

Tabelle 4.8: Verwendete Antibiotika 142

Tabelle 4.9: Verwendete Petrischalen für die in vitro Appressorienbildung von C. higginsianum 140

Tabelle 4.10: Genome Walker PCRs 149

171

Abkürzungsverzeichnis

A. thaliana Arabidopsis thaliana

A. tumefaciens Agrobacterium tumefaciens

AM Arbuskulärer Mykorrhizapilz

ATMT Agrobacterium tumefaciens vermittelte Transformation

bp Basenbaar

C. higginsianum Colletotrichum higginsianum

C. graminicola Colletotrichum graminicola

Col-0 Columbia

CLSM Confocal laser scanning microscopy

DAB 3,3‘-Diaminobenzidin

E. coli Escherichia coli

NHEJ Non-homologous end joining

S. cerevisiae Saccharomyces cerevisiae

S. pombe Schizosaccharomyces pombe

UTR untranslatierter Bereich

ORF Open Reading Frame

rpm Umdrehungen pro Minute

Wt Wildtyp

PEG Polyethylen Glykol 6000

ROS Reaktive Sauerstoffspezies

ADH Alkoholdehydrogenase

172

Lebenslauf Persönliche Daten Name: Martin Korn

Geburtsdatum: 24.12.1984

Nationalität: deutsch

Ausbildung 1990 – 1994 Grundschule Adam-Ries Annaberg

1994 – 2003 Landkreis Gymnasium Annaberg

2004 – 2009 Friedrich-Alexander Universität Erlangen-Nürnberg

Studium Biologie Diplom (Hauptfach Biochemie)

seit Oktober 2009 Friedrich-Alexander Universität Erlangen-Nürnberg

Dissertation am Lehrstuhl für Biochemie

Wehrdienst 2003 – 2004 Grundwehrdienst mit anschließender Wehrübung Panzerbataillon 393 Bad Salzungen

173

Danksagung An dieser Stelle möchte ich mich bei allen Kollegen bedanken, die mich in der Zeit meiner

Doktorarbeit begleitet haben.

Herzlich bedanken möchte ich mich bei Prof. Dr. Koch für die Bereitstellung dieses

interessanten Projektes. Auch wenn sein Terminplan überzuquellen schien, hatte er immer

ein offenes Ohr für auftretende Probleme und einen wissenschaftlichen Rat für deren

Lösung.

Ich danke Dr. Ruth Stadler für die kurzfristige Übernahme des Zweitgutachtens.

Bedanken möchte ich mich bei allen Laborkollegen, die immer für eine angenehme

Arbeitsatmosphäre gesorgt haben:

Dr. Marlis Dahl für fachliche und menschliche Unterstützung und des Sponsorings von

Hanutas.

Meinen Doktorandenkollegen Johannes Schmidpeter danke ich für seinen unermüdlichen

Einsatz für den täglichen Besuch in der Mensa und für die unvergessenen Timecourse-

Experimente am „Seelensauger“.

Ein weiterer Dank gilt auch meinen ehemaligen Doktorandenkollegen Susanne Müller,

Johanna Rühl und Dr. Octavian Stephan.

Bedanken möchte ich mich auch bei den ehemaligen Diplom-und Masterstudenten des

Koch-Labors: Iris, Linda, Katharina, Daria, und Sonja und meinen Bachelor-Studenten

Moritz, Stefanie und Enrico.

Ebenfalls möchte ich mich bei Prof. Dr. Sonnewald und den gesamten Lehrstuhl für

Biochemie bedanken, insbesondere bei Dr. Lars Voll, Pierre Gebauer und Dr. Timo

Engelsdorf für Anregungen im Rahmen der Fungi-Meetings.