Identifizierung von Proteinen mittels Massenspektrometrie Block Molekulare ArbeitstechnikenJulia...
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Identifizierung von Proteinen mittels Massenspektrometrie
Block Molekulare Arbeitstechniken Julia Knöckel
Gliederung
• Massenspektrometrie • MALDI• Vor- und Nachteile massenspektrometrischer
Analysen
Massenspektrometrie
• Analysetechnik zur Bestimmung der Molekülmasse freier Ionen im Hochvakuum
• seit Ende der 80er Jahre eine der wichtigsten Analysemethoden für die
Protein- und Peptidanalytik
•man erhält strukturelle Informationen von Proteinen ( Peptidmassen, Aminosäuresequenzen )
• ermöglicht Identifikation von Proteinen und Ermittlung von Typ und Lage von Modifikationen
3 Stufen der Analyse:
1. Probenvorbereitung: 1D- / 2D- Gelelektrophorese
Extraktion eines Proteins aus dem Gel
Reinigung der Probe
Ionenquelle
Aus einer Substanz- probe wird ein Strahl gasförmiger Ionen erzeugt
Massenanalysator
Auftrennung der Ionen nach Masse/ Ladungs- Quotienten (m/z)
Detektor
Liefert Massenspektrum, aus dem abgelesen werden kann, welche Ionen in welchen relativen Mengen gebildet worden sind
2. Ionisierung 3. Massenanalyse
Quelle: Lottspeich: Bioanalytik, 1998
Aufbau eines Massenspektrometers:
•Beschuss der Probe mit Elektronen (Elektronenstoß- Ionisation, EI)
• Beschuss mit Atomen oder Ionen ( Fast- Atom- Bombardement, FAB)
• Beschuss mit Photonen (Laserdesorption/ Ionisation, LDI)
• Versprühen der Probe in einem elektrischen Feld (Elektrospray- Ionisation, ESI)
Trennung und Nachweis der Analytionen
Mehrere Analysatoren mit entsprechend geeigneten Detektoren
Ionentrennung erfolgt
1. Durch Kombination eines Magnetfeldes mit einem elektrischen Feld ( Sektorinstrumente )
2. Im Hochfrequenzfeld eines Quadrupol- Stabsystems (Quadrupolinstrumente)
3. Nach ihrer Flugzeit in einem Messrohr in Verbindung mit einer gepulsten Ionenerzeugung ( time- of- flight (TOF)- Instrumente )
Ionisierung der Analytmoleküle durch Aufnahme oder Verlust eines Elektrons
Zur Sequenzierung von Peptiden:
zwei Stufen von MS nötig „tandem MS“ oder MS/MS
• es kann das Selbe Separationsprinzip oder eine Kombination aus verschiedenen MS- Prinzipien verwendet werden
MALDI
Matrix- unterstützte (assisted) Laserdesorptions/ Ionisations- Massenspektrometrie
Eine von zwei „soft- Ionisations- Methoden“ ( neben ESI)
Probensubstanz wird in eine Matrix eingebaut
Matrixsubstanz muss bei der ausgewählten Laserwellenlänge absorbieren
Im Gemisch: 1000- 10000facher Überschuss an Matrixsubstanz
Matrixsubstanzen: kleine organische Moleküle
Standardpräparation mit α-Cyano-4-hydroxyzimtsäure oder Dihydrobenzoesäure (DHB)
α-Cyano-4-hydroxyzimtsäureDHB Quelle: Lottspeich:
Bioanalytik, 1998
Vorgehen:
Proben- und Matrixsubstanz werden auf einem metallischen Probenteller gemischt
Lösungsmittel aus der Matrixsubstanz verdunstet
Kokristallisation von Matrix und Analyt
Probenmoleküle werden in das Matrix- Kristallgitter eingebaut
Kristall wird mit kurzen Laserpulsen beschossen ( wenige ns lang )
Normalerweise Verwendung von N- Lasern mit Wellenlänge 337 nm
Quelle: Lottspeich: Bioanalytik, 1998
EM-Aufnahme einer Standardpräparation von Cytochrom C in DHB- Matrix
Gegenüber der Probe: Elektrode
Erzeugt ein elektrisches Feld von einigen 100- 1000 V/mm
Je nach Polarität der Elektrode werden positive oder negative Ionen von der Probenoberfläche in Richtung des Analysators beschleunigt
Probe ist auf einem beweglichen Tisch montiert und kann so systematisch abgefahren werden
Quelle: Lottspeich: Bioanalytik, 1998
Massenanalyse:
• Flugzeit- Massenspektrometer ( Time- of- flight- Analysatoren)
• Genaue Messung der Zeit, die zwischen Start der Elektronen in der Quelle bis zum Eintreffen auf dem Detektor vergeht
Kleine Ionen sind schneller als große
Da m/z ~ t², lässt sich die Masse aus der Flugzeit berechnen
• Kalibrierung über Referenzsubstanzen mit bekannter Masse
• Typische Flugzeiten: wenige μs bis einige 100 μs
• Länge der Driftstrecken 1- 4 m
Quelle: Lottspeich: Bioanalytik, 1998
Problem: nicht alle Ionen einer Masse haben die gleiche Startenergie
• Umlenken des Probenstrahls über einen Reflektor ( elektrisches Gegenfeld)
• Ionen mit höherer Startenergie dringen weiter ins Reflektorfeld ein
der Weg wird weiter
• Ausgleich der Energiedifferenz
Quelle: Lottspeich: Bioanalytik, 1998
Detektion der Ionen
Erzeugung einer Elektronenkaskade in einem Sekundärelektronenvervielfacher
( SEV) analoges Signal
Analoges Signal wird digitalisiert und an einen PC geleitet
Analyse der Messergebnisse durch Vergleich mit Datenbanken
Datenbank- Typen:
1. Vollständige Proteinsequenzen
2. Expressed- sequence- tag Databases ( EST): kurze Sequenzen aus zufälliger Sequenzierung von cDNA- Bibliotheken
3. Genom- Datenbanken
Quelle: Lottspeich: Bioanalytik, 1998
MALDI-TOF-Spektrum des Peptids Angiotensin II
Vorteile
Nachteile
• massenspektrometrische Analysen laufen vollständig automatisiert ab
• Identifikation und Quantifizierung in einem Schritt
• Ermöglicht schnelle Identifikation, wenn ein vollständig decodiertes Genom verfügbar ist
• Proben können direkt nach in- Gel- Verdau verwendet werden
• Allgemein: hohe Sensitivität
• Toleranz von Proteingemischen
• angewiesen auf Datenbanken mit Daten des untersuchten Organismus
Danke für die Aufmerksamk
eit