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Identifizierung von Proteinen mittels Massenspektrometrie lock Molekulare Arbeitstechniken Julia Knöckel

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Identifizierung von Proteinen mittels Massenspektrometrie

Block Molekulare Arbeitstechniken Julia Knöckel

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Gliederung

• Massenspektrometrie • MALDI• Vor- und Nachteile massenspektrometrischer

Analysen

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Massenspektrometrie

• Analysetechnik zur Bestimmung der Molekülmasse freier Ionen im Hochvakuum

• seit Ende der 80er Jahre eine der wichtigsten Analysemethoden für die

Protein- und Peptidanalytik

•man erhält strukturelle Informationen von Proteinen ( Peptidmassen, Aminosäuresequenzen )

• ermöglicht Identifikation von Proteinen und Ermittlung von Typ und Lage von Modifikationen

3 Stufen der Analyse:

1. Probenvorbereitung: 1D- / 2D- Gelelektrophorese

Extraktion eines Proteins aus dem Gel

Reinigung der Probe

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Ionenquelle

Aus einer Substanz- probe wird ein Strahl gasförmiger Ionen erzeugt

Massenanalysator

Auftrennung der Ionen nach Masse/ Ladungs- Quotienten (m/z)

Detektor

Liefert Massenspektrum, aus dem abgelesen werden kann, welche Ionen in welchen relativen Mengen gebildet worden sind

2. Ionisierung 3. Massenanalyse

Quelle: Lottspeich: Bioanalytik, 1998

Aufbau eines Massenspektrometers:

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•Beschuss der Probe mit Elektronen (Elektronenstoß- Ionisation, EI)

• Beschuss mit Atomen oder Ionen ( Fast- Atom- Bombardement, FAB)

• Beschuss mit Photonen (Laserdesorption/ Ionisation, LDI)

• Versprühen der Probe in einem elektrischen Feld (Elektrospray- Ionisation, ESI)

Trennung und Nachweis der Analytionen

Mehrere Analysatoren mit entsprechend geeigneten Detektoren

Ionentrennung erfolgt

1. Durch Kombination eines Magnetfeldes mit einem elektrischen Feld ( Sektorinstrumente )

2. Im Hochfrequenzfeld eines Quadrupol- Stabsystems (Quadrupolinstrumente)

3. Nach ihrer Flugzeit in einem Messrohr in Verbindung mit einer gepulsten Ionenerzeugung ( time- of- flight (TOF)- Instrumente )

Ionisierung der Analytmoleküle durch Aufnahme oder Verlust eines Elektrons

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Zur Sequenzierung von Peptiden:

zwei Stufen von MS nötig „tandem MS“ oder MS/MS

• es kann das Selbe Separationsprinzip oder eine Kombination aus verschiedenen MS- Prinzipien verwendet werden

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MALDI

Matrix- unterstützte (assisted) Laserdesorptions/ Ionisations- Massenspektrometrie

Eine von zwei „soft- Ionisations- Methoden“ ( neben ESI)

Probensubstanz wird in eine Matrix eingebaut

Matrixsubstanz muss bei der ausgewählten Laserwellenlänge absorbieren

Im Gemisch: 1000- 10000facher Überschuss an Matrixsubstanz

Matrixsubstanzen: kleine organische Moleküle

Standardpräparation mit α-Cyano-4-hydroxyzimtsäure oder Dihydrobenzoesäure (DHB)

α-Cyano-4-hydroxyzimtsäureDHB Quelle: Lottspeich:

Bioanalytik, 1998

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Vorgehen:

Proben- und Matrixsubstanz werden auf einem metallischen Probenteller gemischt

Lösungsmittel aus der Matrixsubstanz verdunstet

Kokristallisation von Matrix und Analyt

Probenmoleküle werden in das Matrix- Kristallgitter eingebaut

Kristall wird mit kurzen Laserpulsen beschossen ( wenige ns lang )

Normalerweise Verwendung von N- Lasern mit Wellenlänge 337 nm

Quelle: Lottspeich: Bioanalytik, 1998

EM-Aufnahme einer Standardpräparation von Cytochrom C in DHB- Matrix

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Gegenüber der Probe: Elektrode

Erzeugt ein elektrisches Feld von einigen 100- 1000 V/mm

Je nach Polarität der Elektrode werden positive oder negative Ionen von der Probenoberfläche in Richtung des Analysators beschleunigt

Probe ist auf einem beweglichen Tisch montiert und kann so systematisch abgefahren werden

Quelle: Lottspeich: Bioanalytik, 1998

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Massenanalyse:

• Flugzeit- Massenspektrometer ( Time- of- flight- Analysatoren)

• Genaue Messung der Zeit, die zwischen Start der Elektronen in der Quelle bis zum Eintreffen auf dem Detektor vergeht

Kleine Ionen sind schneller als große

Da m/z ~ t², lässt sich die Masse aus der Flugzeit berechnen

• Kalibrierung über Referenzsubstanzen mit bekannter Masse

• Typische Flugzeiten: wenige μs bis einige 100 μs

• Länge der Driftstrecken 1- 4 m

Quelle: Lottspeich: Bioanalytik, 1998

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Problem: nicht alle Ionen einer Masse haben die gleiche Startenergie

• Umlenken des Probenstrahls über einen Reflektor ( elektrisches Gegenfeld)

• Ionen mit höherer Startenergie dringen weiter ins Reflektorfeld ein

der Weg wird weiter

• Ausgleich der Energiedifferenz

Quelle: Lottspeich: Bioanalytik, 1998

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Detektion der Ionen

Erzeugung einer Elektronenkaskade in einem Sekundärelektronenvervielfacher

( SEV) analoges Signal

Analoges Signal wird digitalisiert und an einen PC geleitet

Analyse der Messergebnisse durch Vergleich mit Datenbanken

Datenbank- Typen:

1. Vollständige Proteinsequenzen

2. Expressed- sequence- tag Databases ( EST): kurze Sequenzen aus zufälliger Sequenzierung von cDNA- Bibliotheken

3. Genom- Datenbanken

Quelle: Lottspeich: Bioanalytik, 1998

MALDI-TOF-Spektrum des Peptids Angiotensin II

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Vorteile

Nachteile

• massenspektrometrische Analysen laufen vollständig automatisiert ab

• Identifikation und Quantifizierung in einem Schritt

• Ermöglicht schnelle Identifikation, wenn ein vollständig decodiertes Genom verfügbar ist

• Proben können direkt nach in- Gel- Verdau verwendet werden

• Allgemein: hohe Sensitivität

• Toleranz von Proteingemischen

• angewiesen auf Datenbanken mit Daten des untersuchten Organismus

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Danke für die Aufmerksamk

eit