Identifizierung von Proteinen Genom bekannt, Proteinsequenzen in der Datenbank abgelegt:

- Identifizierung von Proteinen mit Hilfe der Massenspektrometrie

Methode der Wahl, sehr empfindlich, in der Regel einige Femtomol eines Proteins ausreichend

- N-terminale Sequenzierung und/oder Sequenzierung von Peptiden mit Edman-Abbau, nur noch selten durchgeführt in der Regel einige picomol eines Proteins erforderlich

Genom nicht sequenziert:

Aufklärung der kompletten Primärstrukur erforderlich,

häufigste Strategie: Peptidsequenzen Oligonukleotide PCR cDNA-Klon Screenen einer Genbank Sequenzieren von cDNA-Klonen

Erstellen von Protein-/Peptidsequenzen

Edman-Abbau (erste Wahl) Massenspektrometrische Sequenzierung (de novo Sequenzierung, häufig problematisch)

Isolierung und Identifizierung von Proteinen im Mikromaßstab: 1. Anreicherung

(Methode abhängig von dem jeweiligen Protein)

- Subzelluläre Fraktionierung (z.B. Isolierung von Mitochondrien, Zellkerne durch Zentrifugation)

- Differenzielle Extraktion/Fällung - Chromatographie

1. Affinitäts-Chromatographie 2. Ionenaustausch-Chromatographie 3. Adsorptions-/Verteilungschromatographie 4. Gel Filtration

2. Trennung durch Gel-Elektrophorese (universell anwendbar)

- SDS- Gel-Elektrophorese - 2D- Gel-Elektrophorese

3. Analyse der Banden / Spots durch Massenspektrometrie

Protein-Gemisch

Trennung aufSDS-Gel/ 2D-Gel

Blot auf PVDF-Membran

N-terminale SequenzEdman-Abbau

In-Gel Verdaumit Proteasen

Extraktion der Peptide

HPLC-Trennung

Massenspektrometrie

Datenbanksuche mitMS-/MS/MS-Daten

PeptidsequenzenEdman-Abbau

Bande/Spotausschneiden

> 5 pmol

> 50 pmol<< 1pmol

Strategien zur Identifizierung/Sequenzierung vonProteinen und Peptiden

N C S NH

C

S

NH

CH C

O

NH

CH

C

O

NH

R R

H+

NH

C

S

NH CH

C

O

NH

CH

C

O

NH

R

R

+

NH

C

S

NH CH

C O

R

NH2

CH

C

O

NH

R

NH

CS

NH CH

C O

R

OH

N

CS

NH CH

C O

R

NH2

CH C

O

NH

CH

C

O

NH

R R

NH

C

S

N CH

C O

R

Edman-Abbau

+

neuer Zyklus

Base

H+

(wasserfrei)+

intermediäreRingöffnung

Phenylthiohydantoin

PTH-Aminosäure

Thiazolinon

H+-

-

+

Reagents in

Reagents out

Glass block

Glass fibrefilter disc

NH2

CH C

O

CH2

CH2

CONH

2

NH ....

NH3

CH C

O

CH2

CH2

C

O

NHNH ....

NH2

CH C

O

RNH ....

CH3

C

O

NH CH C

O

RNH ....

häufige N-terminale Blockierung von Proteinen:

Bildung von Pyroglutamat

Acetylierung/Acylierung

Frequently used enzymes for fragmentation of proteins

Enzyms (major sources) EC-number Specificity (X-↓-Y) pH optimum Enzymes of high specificity

Endoproteinase Arg-C (Clostridium histolyticum)

3.4.22.8 Arg-↓-Y 7 - 8

Endoproteinase Lys-C (Achromobacter lyticus, (Lysobacter enzymogenes)

3.4.21.50 Lys-↓-Y 8 - 9

Trypsin (Bos taurus) 3.4.21.4 Lys-↓-Y, Arg-↓-Y 7 - 9

Endoproteinase Glu-C (Staphylococcus aureus)

3.4.21.19 Glu-↓-Y, (Asp-↓-Y) * 8 (4)

Endoproteinase Asp-N (Pseudomonas fragi)

3.4.24.33 X-↓-Asp 7 - 8

Enzymes of lower specificity Major cleaved bonds:

Chymotrypsin (Bos taurus) 3.4.21.1 X = Tyr, Phe, Trp, (Leu) 7 - 9

Pepsin (sus scrofa) 3.4.23.1 X,Y = aromatic, large aliphatic aa 1.8 - 2.5

Elastase (sus scrofa) 3.4.21.36 X = Ala, uncharged, non-aromatic aa, 8 - 9

Thermolysin (Bacillus thermoproteolyticus)

3.4.24.27 Y = L, F and other aromatic or large hydrophobic aa

8

* Glu-: ammonium bicarbonate, pH 7.8, ammonium acetate, pH 4.0, Glu-, Asp-:phosphate buffer, pH 7.8, (cleavage at Asp often slow) aa = amino acid

-NH CH

C NH

O

CH C NH

O

CH2

CH2

S

CH3

Br

NC

R-NH C

HC N

H

O

CH C NH

O

CH2

CH2

S

CH3

CN+

R-Br

-NH CH

C NH

O

CH C NH

O

CH2

CH2

+

R

S

CH3

CN-NH CH

C NH

O

CH C NH

O

CH2

CH2

OH

R

-NH CH

C

OCH2

CH2

O

NH2

CH C NH

O

R

-NH CH

C

OH

CH2

CH2

O

OH

BrCN-Spaltung

-NH CH

C NH

O

CH C NH

O

CH2

CH2

S

CH3

CN+

R

OH2+

Homoserin-lacton

Homoserin

+

+

-

H+-

Reversed-Phase-Chromatographie

Derivatisierung des Kieselgels mit Silanen: Oberfläche wird unpolar

stationäre Phase mobile Phase

unpolar polar

Die Phasen sind im Vergleich zur“normalen” Chromatographie an Kieselgelumgekehrt, daher der NameReversed-Phase-Chromatogaphie(RP-Chromatogaphie)

+ ClSi OH Si

R

R

2( )CH 17 CH3 Si O Si

R

R

2( )CH 17 CH3

HCl

R

Si O

O

Si O

SiR

R2

( )CH 17 CH3

SiR

2( )CH 17 CH3

CH3 CN H O2/

Silan

Analyt

-

Theorie/Definitionen

Zeit

Det

ekto

r-S

igna

l

t0

t R1

t R2

t R2t R1t 0

Injektion

Retentionskoeffizient: k =tRn t0

n-

t0

Auflösung: R =tR2 - tR1

w1 w2-

-

w1 w2

´Bödenzahl: N = 16

tR

w

2

Bodenhöhe: H =LN

L = Säulenlänge

Selektivität: � =k 2́

k 1́

Zeit

Det

ekto

r-S

igna

l

t R2t R1t 0

Zeit

Det

ekto

r-S

igna

l

t R2t R1t 0

Zeit

Det

ekto

r-S

igna

l

t R2t R1t 0

schlechte Auflösung

gute Auflösung aufgrundhöherer Bödenzahl

gute Auflösung aufgrundhöherer Selektivität

Faktoren, die zur Peakverbreiterung führen

Eddy-Diffusion

longitudinale Diffusion

Massentransport zwischenmobiler und stationärer Phase

Totvolumina im Chromatographie-System

van Deemter-Gleichung:

h = A +Bu

C u_

uh =

+

= Flussgeschwindigkeittheoretische Bodenhöhe

A( )Bu_( )

C u( )

Eddy-Diffusion

longitudinale Diffusion

Zeit

Start

Säule

Massentransfer zwischen stationärer und mobiler Phase

- Diffusionskoeffizient des Analytenin der stationären Phase

- Diffusionskoeffizient des Analytenin der mobilen Phase

- Dicke der stationären Phase

- Flussrate

- Verteilungskoeffizient

- Partikelgröße

Verteilungsgeschwindigkeit variiert mit:

Verteilung zwischen stationärer undmobiler Phase benötigt eine gewisse Zeit

mobile Phase

stationäre Phase

Bandbreite

Bandbreite nach einiger Zeit

langsameAquilibrierung

Fluss-Richtung

Faktoren, die zur Peakverbreiterung führen

Eddy-Diffusion

longitudinale Diffusion

Massentransport zwischenmobiler und stationärer Phase

Totvolumina im Chromatographie-System

van Deemter-Gleichung:

h = A +Bu

C u_

uh =

+

= Flussgeschwindigkeittheoretische Bodenhöhe

A( )Bu_( )

C u( )

HPLC

Hochdruckgradientensystem (pro Fließmittel eine Pumpe)

Niederdruckgradientensystem

(High Pressure Liquid Chromatography,)Hochleistungsflüssigkeitschromatographie

Isokratische Elution, Gradientenelution

isokratisch:

Die Zusammensetzung des Fließmittelsbleibt während der Trennung konstant

Die Zusammensetzung des Fließmittelsändert sich während der Trennung hinzu höherer Elutionskraft

Gradient:

A BC

D

A B C D

A B C D

Zeit

Abs

orpt

ion

Abs

orpt

ion

Abs

orpt

ion

Zeit

Fließmittel 2(höhere Elutionskraft)

Fließmittel 1

V

V

V

V

V

V

V

V

Funktionsweise eines Injektionsventils

Load InjectVentilstellung:

Proben-schleife

von derPumpe

zur Säule

zum Abfall-Behälter

von derPumpe

zur Säule

von der Injektions-spritze

Abs

orpt

ion

[220

nm]

Retentionszeit [min]

0.05

0.01

20 40 600

Sta

rt

Trennung tryptischer Peptide von Ferritin durchReversed-Phase-Chromatographie