In vitro Kulturtechniken für gartenbauliche Kulturen als ... · (Msc projectL. Subh) Solanum...

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InvitroKulturtechniken für gartenbauliche Kulturen als Basis für Vermehrung, Züchtung und Biotechnologie Traud Winkelmann Leibniz Universität Hannover, Institut für Gartenbauliche Kultursysteme, Abteilung Gehölzund Vermehrungsphysiologie TUM Hans Eisenmann Zentrum 18.05.2017

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In‐vitro‐Kulturtechniken für gartenbauliche Kulturen als Basis für Vermehrung, Züchtung und Biotechnologie

Traud Winkelmann

Leibniz Universität Hannover, Institut für Gartenbauliche Kultursysteme, 

Abteilung Gehölz‐ und Vermehrungsphysiologie

TUM Hans Eisenmann Zentrum 18.05.2017 

Page 2: In vitro Kulturtechniken für gartenbauliche Kulturen als ... · (Msc projectL. Subh) Solanum Helleborus 18.05.2017 Traud Winkelmann PhD project Mona Quambusch “All organisms inhabiting

• Einführung in In‐vitro‐Kulturtechniken

• Anwendungsgebiete und wirtschaftliche Bedeutung

• Probleme und Limitierungen

• Somatische Embryogenese bei Cyclamen persicum

• Endophytische Bakterien in der pflanzlichen In‐vitro‐Kultur: Feind oder Freund?

• Zusammenfassung und Ausblick

Inhalte

218.05.2017 Traud Winkelmann

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• Pflanzenzüchtung: genetische Weiterentwicklung von Pflanzen für menschliche Nutzung

– Kreuzungen, Selektion, Mutationszüchtung, Gentechnik, Genome editing

– In‐vitro‐Kulturtechniken unterstützen

• Pflanzenvermehrung: Basis für Pflanzenproduktion, Bereitstellung von gesundem Pflanzenmaterial

– Generative Vermehrung: Samen

– Vegetative Vermehrung:

• Teilung, Stecklinge, Abrisse, Zwiebeln, Knollen…

• Veredlungen

• In vitro‐Vermehrung

In-vitro-Kulturtechniken

318.05.2017 Traud Winkelmann

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Etablierung von Dionaea muscipula

418.05.2017 Traud Winkelmann

1. Explant donor plant

2. Explant type: leaf explant

3. Medium: ½ MS + 4.6 µM kinetin

4. Surface disinfection

Sterilisationsmittel  Konzentration Sterilisationsdauern  

Genotyp ‘Grün‘ 

NaOCl 

1 %  3 min  20 1 %  6 min  20 1 %  10 min  33 6 %  4 min  30 

NaDCC 1 g/l  1 h  27 5 g/l  10 min  51 5 g/l  20 min  53 

Mahnkopp (2013)

pH: ca. 12

pH: ca. 5,8

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518.05.2017 Traud Winkelmann

Mahnkopp (2013)

Etablierung von Dionaea muscipula

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Vermehrung von Dionaea muscipula

618.05.2017 Traud Winkelmann

Mahnkopp (2013)

0

2

4

6

8

10

12

1 2 3 4

Prop

agation rate

Culture passage no.

n = 16 n = 10n = 20n = 6

I = s

a a

b

c

Culture passage: 8 weeks

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Akklimatisierung von Dionaea muscipula

718.05.2017 Traud Winkelmann

Mahnkopp (2013)

01020304050607080

1 2 3 4 5 6 7

Akklimatisierung Weiterkultur

Substrate coverage (%

)

12

Weeks after transferto the greenhouse

I = s

Repetition

n = 97

n = 80

acclimatization acclimatization

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In-vitro-Vermehrungswege

826.04.2016 Traud Winkelmann

George et al. (2008)

90-95 %

8

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Kultursysteme

18.05.2017 Traud Winkelmann

• Kultur auf Festmedium+ Hohe Pflanzenqualität‐ Verfestigungsmittel: teuer‐ Begrenzte Anzahl von Pflanzen/Gefäß, Kulturregal…

10

• Kultur in Flüssigmedium+ Einfache Handhabung+ Schnelles Wachstum und Vermehrung+Möglichkeit des „Upscaling“ und der 

Automatisierung‐ Physiologische Störungen‐ Hohes Kontaminationsrisiko

Foto: S. Richartz

• TIS = Temporäre Immersionssysteme+ Hohe Pflanzenqualität+ Schnelles Wachstum und Vermehrung+Möglichkeit des „Upscaling“ und der 

Automatisierung‐ Hohes Kontaminationsrisiko‐ Technische Ausstattung notwendig

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Kultursysteme - TIS

1018.05.2017 Traud Winkelmann

[email protected]

1

2

3

4

Hass (2016)

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Different plant species tested in the Plantform TIS

1118.05.2017 Traud Winkelmann

Courtesy Margareta Welander

Echinacea Raspberry

RhubarbBirch

Blue‐berry

Foto: Lukas Rollwage

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(Winkelmann et al. 2006, PCTOC 86: 319-327)

4,575

2,5643,441

33,543

3,605

48,901

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

1985 1986 1987 1988 1989 1990 1991 1992 1993 1994 1995 1996 1997 1998 1999 2000 2001 2002 2003 2004

Prod

uctio

n [m

illio

n pl

ants

]

Year

Small fruits

Woody plants

Perennials incl. aquatic plants

Orchids

Other ornamental plants

Total

Kommerzielle In-vitro-Produktion in Deutschland

1218.05.2017 Traud Winkelmann

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• Vermehrung hochpreisiger Pflanzen

• Gewinnung krankheitsfreier Pflanzen durch Meristemkultur

• Unterstützung der Pflanzenzüchtung

– Doppelhaploide

– Regeneration als Basis für Mutationszüchtungund genetische Transformation

– Embryo rescue Techniken nach Artkreuzungen

– Lagerung von genetischen Ressourcen

– Protoplastentechniken

Anwendungsgebiete

1318.05.2017 Traud Winkelmann

meristematic dome

meristem tip

Jansen et al. (1984)

www.hark‐orchideen.de

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• Genotypische Unterschiede

• „Abbau“ von Kulturen

• Hyperhydrizität/Glasigkeit

• Endophyten

• Kontaminationen

• Phenole

• Somaklonale Variation

• Hoher Bedarf an Handarbeit (50‐80 % der Kosten)

18.05.2017 Traud Winkelmann

Probleme und Limitierungen

17

Olmos, et al. (1998), ScientiaHorticulturae 75, 91‐101

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Zygotische Embryogenese

1518.05.2017 Traud Winkelmann

1. Asymmetric division of the zygote

2. Pattern formation in the globular embryo

3. Transition to cotyledonary stage with root and shoot primordia

4. Maturation (storage protein incorporation)

Embr

yoge

nesi

s se

nsu

stric

tu

Lau and Jürgens,MPI Tübingen

Xiang et al. (2011)

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Zygotische versus somatische Embryogenese

1618.05.2017 Traud Winkelmann

Dodeman et al. (1997)

Induction(auxin/stress)Asymmetricdivision

Competent cells + dedifferentiation

Endosperm

Suspensor

Dormancy,timing and extentof storage proteinsynthesis

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Cyclamen (Cyclamen persicum)

1718.05.2017 Traud Winkelmann

• Wichtige blühende Zierpflanze

• Produktion– Deutschland: 25 Mio. Pfl./a– Weltweit: ca. 200 Mio. Pfl./a

• Samenvermehrt• Hohe Saatgutpreise

(0,05‐0,20 € pro Samen)• Interesse an vegetativer 

Vermehrung• In vitro über somatische 

Embryogenese

www.goldsmithseeds.com

www.schoneveld.nl

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Somatische Embryogenese bei Cyclamen persicum

1818.05.2017 Traud Winkelmann

bar = 0.5 cm

Induction of embryogenic cells/cultures

Conversion

Differentiation (A) and germination (B) of somatic embryos 

A B

A

Cell growth(solid or liquid culture)

embryogenic

non ‐embryogenic

Schwenkel and Winkelmann (1998) Plant Tiss. Cult. Biotechnol. 4 (1): 28 ‐ 34

½ MS-medium 2.0 mg/l 2,4-D; 0.8 mg/l 2iP

½ MS-medium 2.0 mg/l 2,4-D; 0.8 mg/l 2iP

hormone-free½ MS-medium

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Anwendungen - Vermehrung

1918.05.2017 Traud Winkelmann

1. Propagation of parental lines of F1 hybrids(numbers needed: ~ 1,000)

2. Propagation of sterile interspecifichybrids (‘Odorella‘)(numbers needed: ~ 500,000)

3. Mass propagation of single elitegenotypes, artificial seed

Winkelmann et al. (2004b) HortScience 39 (5): 1093‐1097

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Anwendungen - Züchtung

2018.05.2017 Traud Winkelmann

1. Long‐term storage of germplasm: 

cryopreservation of embryogenic culturespre‐culture (2‐4 d 0.6 M sucrose)pre‐treatment (1 h 0.6 M sucrose+10 % DMSO

2. Protoplast technology: 

Somatic hybridisation with wild Cyclamen species: embryogenic cultures asstarting material for protoplast isolation

Regeneration protocols available forC. persicumC. coumC. graecumC. alpinum

Winkelmann et al. (2004a) Plant Cell Rep. 23 (1‐2): 1‐8

Foto: V. Mussmann

Winkelmann et al. (2006) PCTOC 86: 337‐347Prange et al. (2010) PCTOC 101:171–182

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Anwendung: Genetische Transformation

2118.05.2017 Traud Winkelmann

• Agrobacterium tumefaciens‐mediatedtransformation of embryogenic callus

• Auxin‐reporter construct DR5::GUS• First transgenic somatic embryos

– Comparison of auxin content and distribution in somatic andzygotic embryos

Samuel Breselge BSc thesis (2013)

Arabidopsis thalianazygotic embryos somatic embryos

Cyclamen persicum somatic embryos

Bassuner et al. (2007)

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Begrenzungen

2218.05.2017 Traud Winkelmann

• Genotypic differences in regenerationability and regeneration efficiency

• Asynchronous formation anddevelopment of somatic embryos

• Malformations/ fused somatic embryos• Precocious germination• Loss of embryogenic competence• Secondary somatic embryos

Insights in physiology ofembryogenesis(transcriptomics/proteomics) needed

Model = zygotic embryo

Photos by S. Ratjens and fromHoenemann et al. (2010)

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Proteomischer Vergleich

2318.05.2017 Traud Winkelmann

1mm

1cm

1cm1mm

Zygotic embryos Somatic embryos

240 embryos in torpedostage (80 mg)

PhD project Christina Rode

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2418.05.2017 Traud Winkelmann

zygotic embryo somatic embryo

>1.5 in SE

>1.5 in ZE1,013 spots in total

137 spots higher abundant in zygotic embryos

109 spots higher abundant in somatic embryos

300 eluted spotssubmitted to MS, 261 with > 1 identifiedprotein (= 87 %)

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Differentiell abundante Proteine

2518.05.2017 Traud Winkelmann

somatic embryo

Rode et al. 2011aPlant Mol Biol 75: 305‐319

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Enolasen

2618.05.2017 Traud Winkelmann

• Functional enzyme for glycolysis/gluconeogenesis and fatty acid biosynthesis• „Small“ Enolases highly abundant in zygotic embryos

(MW 1/2‐1/3 of functional protein)• Novel seed storage proteins?• Recycling of amino acids? Rode et al. 2011a

Plant Mol Biol 75: 305‐319

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Behandlung mit Abscisinsäure (ABA)

2718.05.2017 Traud Winkelmann

Rode et al. (2012) Planta 235: 995‐1011

‐ ABA: proteins of primary metabolism and stress response higherabundant

+ ABA: storage proteins, HSP 70

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Metabolitprofile

2818.05.2017 Traud Winkelmann

In colaboration with K. Niehaus, University Bielefeld; GC‐MS

• Extraction from 10 to 20 mg tissue (80% methanol, ribitol as internal standard)• Metabolites derivatized with 75 µL of methoxylamine hydrochloride in pyridine • GC‐MS analysis: TraceGC gas chromatograph coupled to a PolarisQ ion trap MS • Identification by comparison to standards and the NIST 2005 database • Relative levels of selected metabolites determined by Xcalibur 1.4 software 

Testa Endosperm Zygotic embryo Somatic embryo

Winkelmann et al. 2015Front. Plant Sci. 6:597 

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Metabolitprofile

2918.05.2017 Traud Winkelmann

ZE:  Proline Serine Sucrose

SE:  Asparagine Galactose Myo‐Inositol

Winkelmann et al. 2015Front. Plant Sci. 6:597 

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Forschungsarbeiten

3018.05.2017 Traud Winkelmann

Zygotic embryogenesisSomatic embryogenesis

• Proline?

• Oxygen

• ROS?

• PCD?

• Overexpression/silencing of keygenes

• ROS?

• PCD?

• Metabolites, phytohormones andnutrients

Scheme by S. RatjensPhotos from Hoenemann et al. (2010)

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Blick auf Endophyten

Positive impact on plants in vivo Synthesis of phytohormones Increase of nutrient availability Induced resistance to pathogens

But: Endophytes frequently turn detrimental in in vitro cultures growth inhibition, loss of viability

Phalaenopsis(Msc project L. Subh)

Solanum Helleborus

18.05.2017 Traud Winkelmann

PhD project Mona Quambusch

“All organisms inhabiting plant organs that at some time in their life, can colonize internal plant tissues without causing apparent harm to the host”(Petrini, 1991)

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Fast growing hardwood for the production of high quality furniture.

Breeding goals: straight stem, good wood quality, fast growth.

Single trees with a good habitus were selected and propagated in vitro (trademark: silvaSelect®). 

Genetic diversity in the forest achieved by using a mixture of 18 Prunus avium genotypes.

Genotypes propagated by the IFP (Institut für Pflanzenkultur), cooperation partner of this project.

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Forschungsobjekt: Prunus avium

18.05.2017 Traud Winkelmann

PhD project Mona Quambusch

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Pflanzenmaterial

18.05.2017 Traud Winkelmann

Prunus avium genotype Propagation success in vitro Pictogram

Fama, Achilleus poor −

Asteria, Apollo variable/ fluctuating ±

Neptun, Demeter good +

Losses depending on genotypes:20‐70 % 30‐60 %

PhD project Mona QuambuschRole of endophytic bacteria?

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Identifizierung von Bakterien

Culture‐dependent approach

Culture‐independent approach

DNA extracted from plant material DNA from bacterial isolates

3418.05.2017 Traud Winkelmann

PhD project Mona Quambusch

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DNA extracted from in vitro plant material of propagationphase

Primers used: 799f and 1492r. (Chelius and Triplett, 2001) 

PCR on 16S rDNA

Identifizierung von Bakterien

bacterial amplicon, mitochondrial amplicon* Indicates amplicons used for cloning and ARDRA

±± + +‐‐

18.05.2017 Traud Winkelmann PhD project Mona Quambusch

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Identification of bacteriaAmplified rDNA Restriction Analysis (ARDRA)

Restriction patterns of 95 bacterial 16S rDNA fragments of a plant sample of Neptun (+). 

18.05.2017 Traud Winkelmann PhD project Mona Quambusch

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Identifizierung von BakterienResults of culture‐independent analysis 

Endophytic population of four Prunus avium genopytes

0%

20%

40%

60%

80%

100%

Fama ‐ Achilleus ‐ Neptun + Demeter +Relativ

e prop

ortio

n of clone

s

Prunus genotype

Rhodopseudomonas spp.

other α‐Proteobacteria

Microbacterium spp.

Mycobacterium spp.

uncultured bacterial clone

18.05.2017 Traud Winkelmann

Quambusch et al. (2014) Tree Physiol. 34: 524–533

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Identifizierung von Bakterien

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Growth media: nutrient agar and medium #523 (Viss et al, 1991)  Cultivation at RT for 5 weeks

Isolation of bacterial endophytesPlant material Pure culture

Nep

tun +

Asteria

 ±De

meter +

Gen

otypes no 

bacteria

18.05.2017 Traud Winkelmann PhD project Mona Quambusch

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Identifizierung von Bakterien

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Classification of  bacterial isolates by 16S rDNA sequences

Isolate Isolated from Identified as* Length[bp] % Identity*  # of isolates

F‐I‐3  Fama (‐)  Acinetobacter junii 1441 100 1

301‐3  Fama (‐)  Bacillus sp. 1452 100 1

E 78‐1  Fama (‐)  Kocuria palustris 1398 100 1

E 74‐1  Achilleus (‐)  Pseudomonas  sp. 1441 99 1

A 1‐4  Achilleus (‐) Bacillus sp. 1453 100 29

C 43‐4  Apollo (±)  Variovorax sp. 1440 99 1

210‐1 Asteria (±)  Micrococcus sp. 1402 100 1

N‐I‐1  Neptun (+)  Mycobacterium sp. 705 99 1

N‐I‐2  Neptun (+)  Rhodopseudomonas sp. 1391 99 3

D‐I‐3  Demeter (+)  Bacillus licheniformis 1449 100 1

D‐I‐1  Demeter (+)  Microbacterium testaceum 1398 99 2

18.05.2017 Traud Winkelmann PhD project Mona Quambusch

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Inokulationsexperiment

Effect on rooting three weeks post inoculation

Experimental design Two genotypes: Fama(–) and Achilleus (–)  Inoculation with N‐I‐2 (Rhodopseudomonas) and D‐I‐1 (Microbacterium) 5 min treatment with bacterial suspension in 10mM MgSO4

Evaluation of  rooting after two and three weeks

0

20

40

60

80

100

Fama Ach

Rooting [%

]

Control

N‐I‐2

D‐I‐1

***

0

2

4

6

8

10

12

Fama Ach

Num

ber  of ro

ots

Control

N‐I‐2

D‐I‐1

**

**

*

n = 8 vessels with 5 plants each; asterisks indicate significant differences to control treatment (Dunnett Test) (p ≤ 0.05*, 0.01 ** und 0.001 *** )

18.05.2017 Traud WinkelmannQuambusch et al. (2014) Tree Physiol. 34: 524–533

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Quantifizierung von EndophytenqPCR on 16S rDNA ofMycobacterium spp. with genus specific primers

18.05.2017 Traud Winkelmann Quambusch et al. (2016), PCTOC

Detection sensitivity:  Mycobacterium spp.: 0.1 fg in 10 ng DNA (30 plasmid copies)Microbacterium spp.: 100 fg in 10 ng DNARhodopseudomonas spp: 1 fg in 10 ng DNA

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Offene Fragen

1. Welche Effekte haben Endophyten in vitro (Nährstoffverfügbarkeit,Phytohormone, indirekte Effekte)?

2. Welchen Ursprung haben die Endophyten in In‐vitro‐Kulturen?

3. Welche Faktoren bestimmen die Endophytengemeinschaften in In‐vitro‐Pflanzen und wie lassen sie sich steuern?

18.05.2017 Traud Winkelmann

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• Das enorme Potential pflanzlicher In‐vitro‐Kulturtechniken ist bei weitem nicht ausgeschöpft.

• Abbildung „natürlicher“ Bedingungen könnte helfen, die Limitierungen der somatischen Embryogenese zu überwinden.

• Endophytische Bakterien in pflanzlichen In‐vitro‐Kulturen sollten im Detail untersucht werden auch unter Anwendung neuer Sequenzierungsmethoden, um stabile, dem Vermehrungsziel dienliche bakterielle Gemeinschaften zu erreichen.

• Ein besseres Verständnis der genetischen Basis des Regenerationsvermögens ist notwendig.

• Forschungsbedarf zur Automatisierung

• Revival der Bedeutung von In‐vitro‐Kulturtechniken als Basis für die Anwendung von Genome Editing (CRISPR/Cas9).

Zusammenfassung und Ausblick

4318.05.2017 Traud Winkelmann

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AcknowledgementsMona QuambuschMelanie BartschKristin HallerJane Brümmer

Institut für Pflanzenkultur (IFP)Carolin SchneiderMatthias Döring

University of Oulu, FinnlandAnna Maria Pirttilä

18.05.2017 Traud Winkelmann

Christina RodeMelanie BartschSvenja RatjensJenniffer MwangiSamuel BreselgeCathleen Neitsch

Hans‐Peter Braun (LUH)

Hardy Rolletschek (IPK Gatersleben)Henning Tschiersch (IPK Gatersleben)Karsten Niehaus (Universität Bielefeld)