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In vivo Studien zu einer Zell-basierten Therapie für Hirnschäden nach einem Herzstillstand

Kanti Kreuzlingen – Naturwissenschaftswoche 2020

Patricia Meyer12. August 2020

§ Einleitung- Herzstillstand und dadurch versursachte Hirnschäden- Stammzellen und ihr therapeutisches Potential- Forschungsfragen und Hypothese

§ Material und Methoden

§ ResultateI. Charakterisierung des Hirnschadens nach einem HerzstillstandII. Stammzelltransplantation als Therapie für Hirnschäden nach einem

Herzstillstand

§ Diskussion

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Inhalt

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EinleitungHerzstillstand und dadurch verursachte Hirnschäden

Chugh et al., Prog Cardiovasc Dis, 2008 ; Madl and Holzer, Curr Opin Crit Care, 2004; Grubb et al., BMJ, 1996 ; Moulaert et al., Resuscitation, 2009; Sanganalmath et al., Mol Cell Biochem, 2017

§ Ischämischer Hirnschaden- Unterversorgung des Gehirns mit Blut- Energiemangel führt zum Zelltod- Bleibende Gedächtnisstörungen- Aktuell nur sehr limitierte

Behandlungmöglichkeiten

HERZSTILLSTAND

Kein Blutfluss zum Hirn

RAPIDER ABBAU DER GESPEICHERTEN ENERGIE

O2Glukose § Herzstillstand Ursachen

- Erkrankung der Koronararterien- Versch. Herzkrankheiten- Trauma / Überdosis / Ertrinken / Stromschlag

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Humaner Hippocampus

Nagetier Hippocampus

>> speziell anfällig für ischämische Verletzungen

EinleitungCornu Ammonis Segment 1 des Hippocampus (CA1):

Life Science Data Bases; Little 2007; Toda and Gage, Cell Tissue Res, 2018

5

Humaner Hippocampus





6

Humaner Hippocampus





7

Humaner Hippocampus


EinleitungCornu ammonis Segment 1 des Hippocampus (CA1):

Gesund Ischämisch

Gesund Ischämisch


Life Science Data Bases; Little 2007; Schmidt-Kastner, Neuroscience, 2015

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Humaner Hippocampus


EinleitungCornu ammonis Segment 1 des Hippocampus (CA1):

Gesund Ischämisch

Gesund Ischämisch

Ø Verlust der CA1 Zellen führt zu Gedächtnisstörungen Life Science Data Bases; Little 2007; Schmidt-Kastner, Neuroscience, 2015

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EinleitungStammzellen und ihr therapeutisches Potential

Nervenzellen

Leberzellen

Blutzellen

Muskelzellen

Darmzellen

Herzmuskelzellen

https://www.stammzellen.nrw.de (09.08.2020, abgeändert)

https://www.stammzellen.nrw.de/

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Neurone

Astrozten

Oligo-dendrozyten

Microglia

EinleitungStammzellen und ihr therapeutisches Potential

Zell Ersetzung

Kokaia et al., Nat Neurosci, 2012, abgeändert

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Projekt I: Charakterisierung des Hirnschadens nach einem Herzstillstand§ Ist der durch einen Herzstillstand verursachte Schaden im Hippocampus

anhaltend, oder werden die verlorenen Zellen durch neue ersetzt?§ Kann man die Gedächtnisstörungen welche durch den Schaden

verursacht werden mit Verhaltensexperimente nachweisen?

Projekt II: Stammzelltransplantation als Therapie für Hirnschäden nach einem Herzstillstand

§ Was passiert mit den transplantierten Stammzellen?Ø Überleben sie? Sammeln sie sich am Ort des Schadens an? Entwickeln sie

sich zu reifen Nervenzellen?§ Haben die behandelten Tiere verminderte Gedächtnisstörungen?

Forschungsfragen und Hypothese

12

Projekt I: Charakterisierung des Hirnschadens nach einem Herzstillstand§ Ist der durch einen Herzstillstand verursachte Schaden im Hippocampus anhaltend, oder

werden die verlorenen Zellen durch neue ersetzt?§ Kann man die Gedächtnisstörungen welche durch den Schaden verursacht werde mit

Verhaltensexperimente nachweisen?

Projekt II: Stammzelltransplantation als Therapie für Hirnschäden nach einem Herzstillstand

§ Was passiert mit den transplantierten Stammzellen?Ø Überleben sie? Sammeln sie sich am Ort des Schadens an? Entwickeln sie sich zu reifen

Nervenzellen?§ Haben die behandelten Tiere verminderte Gedächtnisstörungen?

Hypothese: Die transplantierten Stammzellen sammeln sich am Ort des Schadens, entwickeln sich zu reifen Nervenzellen und ersetzen die verlorenen Zellen. Bestenfalls ermöglichen sie damit wieder eine ungestörte Funktion des Gedächtnis

Forschungsfragen und Hypothese

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Material und Methoden 1/3

Tiermodell für durch einen Herzstillstand verursachte Hirnschäden

Beatmungsgerät

28°C

Venenkatheter

Blutdruck,Blutgasanalysen

Arterienkatheter

Medikamenten-verabreichung

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Beatmungsgerät

28°C X

Kaliumchloridà Lähmt den Herzmuskel



Einleiten des Herzstillstandes

Blut

druc

k [m

mH

g]

Zeit [Sekunden]

15

Beatmungsgerät

28°C

Adrenalin



Herz-Lungen Wiederbelebung

Blut

druc

k [m

mH

g]

Zeit [Sekunden]

verstecktePlattform

Sichtbare Markierungen

Training Tag 1

TrainingTag 5

TestTage 1,5

??

Tage 2,3,4

16


Morris water maze: Verhaltensexperiment zum Nachweisen von Gedächtnisstörungen bei Ratten

17

Wachstums-faktoren


Entnahme und Vermehrung von Stammzellen aus Rattenembryos

Wachstums-faktoren

Fath, T., et al., Nat Protoc, 2009

ca. 7mm

Lichtmikroskop Fluoreszenzmikroskop

Tag

0Ta

g 2

Tag

5

18


Entnahme und Vermehrung von Stammzellen aus Rattenembryos

Wachstums-faktoren

Wachstums-faktoren

GFP

GFP

GFP: Green Fluorescent Protein, Grün-fluoreszierendes Protein

GFP

§ Ausgeprägter Zelltod in CA1 Segment eine Woche nach Herzstillstand

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A B

DAPI = Zellkerne; FJ = Fluoro-Jade B, sterbende Nervenzellen

Resultate ICharakterisierung des Hirnschadens nach einem Herzstillstand

Kontrolle Herzstillstand

Ktrl. Herzstillst.

20

A B

C D

E

FJ = Fluoro-Jade, sterbende Nervenzellen; NeuN = gesunde Neurvenzellen


Ktrl. Herzstillst.

§ Ausgeprägter Zelltod in CA1 Segment eine Woche nach Herzstillstand

1 Woche 4 Wochen 6 Wochen

HerzstillstandKontrolle

§ Zellverlust in CA1 Segment ist anhaltend


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??

Zeit

im Z

iels

ekto

r[%

]

Test

Tag 1 Tag 5

Test


§ 4 Wochen nach der OP können sich Herzstillstand-Tiere weniger gut an die Position der Plattform erinnern

HerzstillstandKontrolle

§ Transplantierte Zellen überleben mindestens 6 Wochen

§ Erhöhtes Vorfinden von transplantierten Zellen in CA1 Segment nach einem Herzstillstand

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Resultate IIStammzelltransplantation als Therapie für Hirnschäden nach einem Herzstillstand

Wochen nach Herzstillstand4 Wochen

% v

on T

iere

mit

GFP

+ Ze

llen

in C

A1 S

egm

ent

1 Woche 2 Wochen

Herzst. Ktrl Herzst. Ktrl

Tiere ohne GFP+ Zellen in CA1Tiere mit GFP+ Zellen in CA

6 Wochen

DAPI = Zellkerne; GFP = transplantierte Zellen

DAPI = Zellkerne; GFP = transplantierte Zellen; βIII-tubulin, NeuN = Nervenzellen-Marker 23

§ Einen Teil der transplantierteStammzellen entwickelt sich zuNervenzellenDAPI

GFPNeuN GFP NeuN

CA1

Resultate IIStammzelltransplantation als Therapie für Hirnschäden nach einem Herzstillstand

§ Permanenter Verlust der Nervenzellen spezifisch im CA1 Segment des Hippocampus nach einem Herzstillstand

§ Vermindertes Erinnerungsvermögen nach einem HerzstillstandØ Nachweis von zwei der wichtigsten Spätfolgen eines Herzstillstandes

in unserem TiermodellØ Tiermodell ist geeignet um eine neuartige Zell-basierte Therapie zu

testen

§ Transplantierten Zellen überleben mindestens 6 Wochen§ Erhöhtes Vorfinden von transplantierten Zellen am Ort des Schadens

nach einem Herzstillstand§ Transplantierte Zellen haben die Fähigkeit sich zu reifen Nervenzellen zu

entwickelnØ Potential zum ersetzen der verlorenen Zellen vorhanden

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Diskussion

Offene Fragen / Methodenkritik:

§ Längerfristiges Überleben der transplantierten Zellen?

§ Aktivität der transplantierten Zellen? Integrierung ins bestehende neuronale Netzwerk?

§ Funktioneller Beweis fehlt: Auswirkung der Behandlung auf Gedächtnisstörungen?

§ Ist Therapieansatz geeignet für Anwendung beim Menschen?

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Diskussion

Danksagung

Previous membersDr. Michael PernyDr. Stephen JenkinsonMichelle BuriGabi FernandesAlessio Balmelli

Universitätsklinik fürIntensivmedzin, InselspitalProf. Dr. med Stephan JakobPD Dr. med Matthias HänggiProf. Dr. med Jukka Takala

Regenerative Neuroscience ClusterProf. Dr. Hans Ruedi WidmerDr. Stefano di Santo

…ESF TeamDr. med vet Daniela Casoni Kay NettelbeckOlgica Beslac

CAF TeamPD Dr. med vet Alessandra BergadanoAnna Hodel…

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NeuroinfektionslaborProf. Dr. med Stephen Leib Dr. Denis GrandgirardFranziska SimonRobert LukeschDr. Lukas Muri Dr. Silvia ErniMarika LehnerNgoc Dung LeFlorian ZbindenGabriele ChiffiLuca ValenteCarlotta Palaferri

GCB Thesis CommitteePD Dr. Sarah LongnusPD Dr. med Matthias HänggiProf. Dr. Karl-Heinz Krause

Fragen..?

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