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1 Aus dem Institut für Reproduktionsmedizin der Tierärztlichen Hochschule Hannover Interaktion von Spermatozoen und Oviduktepithelzellen in vitro zur Identifizierung des Rezeptorsystems am porcinen Modell Inaugural-Dissertation Zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin (Dr. med. vet.) durch die Tierärztliche Hochschule Hannover Vorgelegt von Katrin Gohr aus Bremen Hannover 2003

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1

Aus dem Institut für Reproduktionsmedizin

der Tierärztlichen Hochschule Hannover

Interaktion von Spermatozoen und Oviduktepithelzellen in vitro

zur Identifizierung des Rezeptorsystems am porcinen Modell

Inaugural-DissertationZur Erlangung des Grades einer Doktorin

der Veterinärmedizin

(Dr. med. vet.)

durch die Tierärztliche Hochschule Hannover

Vorgelegt von

Katrin Gohr

aus Bremen

Hannover 2003

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Wissenschaftliche Betreuung:

Univ.-Prof. Dr. rer. nat. Dr. med. habil. Edda Töpfer-Petersen

1. Gutachterin: Univ.-Prof. Dr. rer. nat. Dr. med. habil. Edda Töpfer-Petersen

2. Gutachter: Prof. Dr. Christiane Kirchhoff

Tag der mündlichen Prüfung: 04.06.2003

Gefördert durch die Deutsche Forschungsgemeinschaft (TO 114/5-3)

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Abkürzungen

4

Inhaltsverzeichnis

Inhaltsverzeichnis............................................................................................. 4

1 Einleitung.................................................................................................. 11

2 Literaturübersicht .................................................................................... 13

2.1 Besamung ........................................................................................................ 13

2.2 Spermatozoon................................................................................................... 14

2.2.1 Morphologie der Samenzelle ..................................................................... 14

2.2.2 Spermienkopf............................................................................................ 15

2.2.3 Spermienschwanz...................................................................................... 15

2.3 Spermatozoenreifung........................................................................................ 16

2.4 Kapazitation ..................................................................................................... 18

2.5 Akrosomreaktion .............................................................................................. 20

2.6 Seminalplasma.................................................................................................. 21

2.7 Spermientransport im weiblichen Genitaltrakt .................................................. 22

2.8 Funktionelles Spermienreservoir....................................................................... 24

2.9 Spermadhäsine.................................................................................................. 26

3 Material und Methoden ........................................................................... 29

3.1 Spermienaufbereitung....................................................................................... 29

3.1.1 Gewinnung der Ejakulate .......................................................................... 29

3.1.2 Konventionelle spermatologische Untersuchung ....................................... 29

3.1.3 Dichtegradientenzentrifugation mit Percoll ............................................. 30

3.1.4 Darstellung der Membranintegrität durch Propidiumjodidfärbung............. 31

3.2 Biochemische Charakterisierung von Proteinen ................................................ 32

3.2.1 Auftrennen des Seminalplasmas mittels analytischer HPLC...................... 32

3.2.2 Herstellung von Spermienextrakten........................................................... 32

3.2.3 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese ..................................................... 33

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Abkürzungen

5

3.2.4 Western Blot Analyse................................................................................ 34

3.2.5 Spezifischer Proteinnachweis durch Immunfärbung .................................. 35

3.2.6 Nachweis von kohlenhydratbindenden Proteinen ...................................... 36

3.2.7 Chemilumineszenzverfahren ..................................................................... 37

3.2.8 Auftrennen des Spermienextraktes mittels analytischer HPLC .................. 38

3.2.9 Massenspektrometrische Analyse .............................................................. 38

3.3 Durchflusszytometrie........................................................................................ 39

3.3.1 Etablierung des Messverfahrens ................................................................ 40

3.3.2 Bestimmung der optimalen Inkubationszeit bei der durchfluss-

zytometrischen Untersuchung der Mannose-Bindungsstrukturen............... 41

3.3.3 Bestimmung der optimalen Zuckerkonzentration bei der durchfluss-

zytometrischen Untersuchung der Mannose-Bindungsstrukturen............... 41

3.3.4 Durchflusszytometrische Untersuchung der Veränderungen in der

Mannose/Galaktose Bindung unter Kapazitationsbedingungen.................. 42

3.4 Fluoreszenzmikroskopie ................................................................................... 44

3.5 Explant-Assay .................................................................................................. 45

3.5.1 Gewinnung der Explante ........................................................................... 45

3.5.2 Koinkubation der Explante mit den Spermatozoen .................................... 47

3.5.3 Videomikrographie der gebundenen Spermien am Explant ....................... 47

3.5.4 Berechnung des Bindungsindexes ............................................................. 48

3.5.5 Kompetitive Hemmungsversuche .............................................................. 49

4 Ergebnisse................................................................................................. 50

4.1 Isolierung der Seminalplasmaproteine .............................................................. 50

4.2 Nachweis von mannosebindenden Proteinen im Seminalplasma....................... 52

4.3 Nachweis von Spermadhäsinen im Spermienextrakt ......................................... 54

4.4 Nachweis von kohlenhydratbindenden Proteinen im Spermienextrakt .............. 55

4.5 Nachweis von AQN-1 im Spermienextrakt ....................................................... 57

4.6 Isolierung der Spermienextraktproteine ............................................................ 58

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Abkürzungen

6

4.7 Nachweis mannosebindender Proteine an ejakulierten, Percoll gewaschenen

Spermien mittels durchflusszytometrischer Analyse ........................................ 60

4.8 Nachweis von mannosebindenden Strukturen auf der Spermienoberfläche ....... 63

4.9 Explant-Assay .................................................................................................. 64

4.9.1 Vergleich von AQN-1 und AWN-2 im Explant-Assay .............................. 65

4.9.2 Vergleich der inhibitorischen Wirkung von 2-Fukosyl-Laktose, ...................

3-Fukosyl-Laktose, Mannopentaose, N-Acetyl-Neuraminyl-Laktose

und β-Laktose im Explant-Assay............................................................... 66

5 Diskussion ................................................................................................. 68

5.1 Die Interaktion zwischen Spermium und Oviduktepithel ist ein

kohlenhydratvermittelter Prozess ..................................................................... 69

5.2 Die Rolle der Spermadhäsine............................................................................ 72

5.3 Nachweis von AQN-1 auf percollgewaschenen Spermien................................. 74

5.4 Kohlenhydratbindungsstellen des Spermatozoens während der Kapazitation .... 75

5.5 Abschlussbetrachtung ....................................................................................... 77

6 Zusammenfassung.................................................................................... 79

7 Summary................................................................................................... 82

8 Literaturverzeichnis ................................................................................. 85

9 Anhang.................................................................................................... 104

9.1 Rezeptverzeichnis............................................................................................104

9.1.1 Spermienextrakte......................................................................................106

9.1.2 Durchflusszytometrie ...............................................................................110

9.1.3 Fluoreszenzmikroskopie...........................................................................110

9.1.4 Explant-Assay ..........................................................................................111

10 Eidesstattliche Erklärung ...................................................................... 113

11 Danksagung ............................................................................................ 115

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Abkürzungen

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Abkürzungen

Abb. Abbildung

AQN porcines Spermadhäsin mit N-Terminus AQN

Aqua dest. Aqua destillata

AU Absorptions Unit

AWN porcines Spermadhäsin mit N-Terminus AWN

BCIP 5-Brom-4-Chlor-3-Indolyl-Phosphat

BI Bindungsindex

BSA Bovine Serum Albumin (Rinderserumalbumin)

bzw. beziehungsweise

°C Grad Celsius

CO2 Kohlenstoffdioxid

Da Dalton

et al. et alii (und andere)

Explant Gewebestück, welches aus dem ursprünglichen Zellverband

entfernt wurde

FITC Fluoreszeinisothiocyanat

HBS Hepes-Buffered-Saline

Hepes N-(2-hydroxyethyl)piperazinN-2-ethan

HPLC High Pressure Liquid Chromatography

kDa Kilodalton

l Liter

LMW Low Molecular Weight

MaldiTof Matrix-assisted Laser-Desorption Ionisation Time-of-Flight

M Molar

Mio. Millionen

mg Milligramm

min Minute

ml Milliliter

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8

mM Millimolar

MS Massenspektrometrie

µg Mikrogramm

µl Mikroliter

µm Mikrometer

NaCl Natriumchlorid

NBT Nitroblau Tetrazoliumsalz

N-Glycan Über eine NH2-Gruppe an Glycoproteine gebundene

Zuckerseitenkette

nm Nanometer

O-Glycan Über eine OH-Gruppe an Glycoproteine gebundene

Zuckerseitenkette

PBS Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (Phosphate-Buffered-

Saline)

pH Negativer dekadischer Logarithmus der

Wasserstoffionenkonzentration

PI Propidiumjodid

PSP Porcine Seminalplasmaproteine

PVDF Polyvinylidene Difluoride

SDS Sodium-Dodecyl-Sulfate

Tab. Tabelle

TBS Trisgepufferte Kochsalzlösung (Tris-Buffered-Saline)

TEMED N,N,N`N`- Tetramethylethylendiamin

TFA Trifluoressigsäure

Tris Tris(hydroxymethyl)-aminomethan

v/v volume/volume (Volumen/Volumen)

w/v weight/volume (Gewicht/Volumen)

x g x-fache der Erdbeschleunigung

z.B. zum Beispiel

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Abkürzungen

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Materialien

Alle verwendeten Chemikalien stammen von Merck, Darmstadt, soweit nicht anders

angegeben ist. Die Rezepturen der verwendeten Pufferlösungen und Reagenzien sind

im Anhang (9) aufgeführt.

Die Begriffe Spermium und Spermatozoon werden synonym verwendet.

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Abkürzungen

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11

1 Einleitung

Die Interaktion zwischen den Gameten ist ein komplexer Vorgang, der in den letzten

Jahren zu einem wichtigen Gegenstand der reproduktionsmedizinischen Forschung

geworden ist. Um eine erfolgreiche Besamung und Zucht sicherzustellen, ist es

unablässig, dass befruchtungskompetente Gameten aufeinander treffen.

Da die Ovulation bei den Haussäugern erst gegen Ende der Brunst erfolgt, muß es

einen Mechanismus geben, der das Zusammentreffen von Spermium und Oozyte

optimiert. Der Eileiter des weiblichen Tieres birgt besondere Eigenschaften zur

Erhaltung der Fortpflanzung. Die meisten Säugetiere haben zu diesem Zweck im

Eileiter ein funktionelles Spermienreservoir ausgebildet, in welchem die Spermien

gelagert werden können. Während der Lagerung werden die Energiereserven der

Spermatozoen geschont und ihre Vitalität erhalten, um die Zeit bis zur Ovulation zu

überbrücken.

Zur Aufrechterhaltung einer vitalen Spermienpopulation dient in erster Linie der

kaudale Isthmus des Oviduktes. Das Spermienreservoir wird durch die Bindung der

Spermien an die zilientragenden Epithelzellen etabliert, gleichzeitig erfolgt durch

diesen Vorgang eine Selektion befruchtungskompetenter Spermien. Nachdem die

Bindung wieder gelöst ist, erreicht das Spermatozoon durch den Vorgang der

Kapazitation mit anschließender Akrosomreaktion seine vollständige

Befruchtungsfähigkeit. Im Verlauf der Kapazitation kommt es zu einer Veränderung

im Spermienmetabolismus, der zu Hyperaktivierung und durch damit verbundenen

größeren Energieverlust auch zu einer geringeren Lebenserwartung führt. Die Aufgabe

des Spermienreservoirs der Säugetiere liegt darin, diese komplizierten Vorgänge zu

modulieren und mit der Ovulation zu synchronisieren.

Durch vorangegangene Studien ist bekannt, dass die initiale Bindung von

Spermatozoen an den Eileiter ein Kohlenhydrat vermittelter Prozess ist, daher

kommen lektinähnliche Substanzen (Spermadhäsine) in Frage, die die Bindung

ermöglichen. Beim Schwein konnte bereits eine große Gruppe von

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Einleitung

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kohlenhydratbindenden Proteinen charakterisiert werden, die als Kandidatenproteine

für die Bindung in Frage kommen.

Die Zellkontakte von Spermien und Epithelzellen können einerseits mit

standardisierten Zellkulturen, andererseits mit Explant-Bindungs-Assays untersucht

werden. Explante sind kleine Teile des Eileiterepithels, die aus dem Ovidukt frisch

geschlachteter Altsauen gewonnen werden. Durch die Art der Zellgewinnung sind die

Untersuchungen mit Hilfe des Explant-Bindungs-Assays sehr gut vergleichbar mit der

in vivo Situation.

Ziel der vorliegenden Arbeit ist es, den Nachweis zu erbringen, ob Spermadhäsine bei

der Etablierung des Spermienreservoirs eine Rolle spielen. Durch Studien von

WAGNER et al. (2002) konnte bereits beim Schwein die Zuckerspezifität des

beteiligten Rezeptorsystems lokalisiert werden. Im Rahmen der vorliegenden

Untersuchungen sollte dieses detailiert charakterisiert werden. Die

kohlenhydratbindenden Strukturen der Spermienrezeptoren werden mit Hilfe von

Spermienextrakten, Durchflusszytometrie, Fluoreszenzmikroskopie sowie mit dem

Explant-Bindungs-Assay untersucht.

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Literaturübersicht

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2 Literaturübersicht

2.1 Besamung

Zur Sicherstellung einer erfolgreichen Zucht ist eine exakte Koordination von

Insemination und Ovulationszeitpunkt notwendig (FLOWERS u. ESBENSHADE

1993). Durch das angewendete Besamungsregime sollte sichergestellt sein, dass vor

der Ovulation eine ausreichende Menge von befruchtungsfähigen Spermatozoen im

Eileiter vorhanden ist (DZUIK u. POLGE 1965). Da Ovulationszeitpunkt und

Östrusdauer beim Schwein variabel sein können, gibt es oft nur retrospektiv

Anhaltspunkte hinsichtlich des Ovulationszeitpunktes. Beim Schwein wird der Beginn

der Rausche durch den Zeitpunkt definiert, an dem der Eberaufsprung durch die Sau

geduldet wird (WILLEMSE u. BOENDER 1967). Die Ovulation erfolgt bei den

meisten Sauen im letzten Drittel der Brunst (WEITZE et al. 1994). Daher sollte die

Östrusdauer einer Sau vor der Besamung bekannt sein, um einen geeigneten

Besamungszeitpunkt zu wählen. Die Ovulationsdauer beträgt 1-6 Stunden (SOEDE u.

KEMP 1993). Durch Ultraschalltechnik konnte bei neueren Untersuchungen der

Ovulationszeitpunkt exakt bestimmt werden und weitere Inseminations-

Ovulationsintervalle ausprobiert werden (WABERSKI et al. 1994; NISSEN et al.

1997). Durch diese Studien war es möglich, die Reproduktionsleistung in Hinsicht auf

den Besamungszeitpunkt zu bewerten. Bei der Durchführung einer Besamung vor der

Ovulation waren zu wenig befruchtungskompetente Spermien am Ort der Befruchtung.

Dies wurde durch eine verminderte Anzahl von akzessorischen Spermien an der Zona

pellucida nachgewiesen (SOEDE et al. 1995). Gleichzeitig war ein Anstieg von

unbefruchteten bzw. mangelhaft befruchteten Sauen zu verzeichnen.

Bei einer postovulatorischen Besamung sind zwar ausreichend befruchtungsfähige

Spermien am Ort der Befruchtung, allerdings sind hier Alterungsprozesse der Oozyten,

die bereits 8-12 Stunden nach der Ovulation beginnen, der Grund für eine reduzierte

Fertilisationsrate (HUNTER 1967, 1994; HUNTER u. DZUIK 1968).

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Literaturübersicht

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Um Schwankungen in der Vorhersage des Ovulationszeitpunktes entgegenzuwirken,

wird die Besamungsfrequenz in praxi erhöht. Durch zweimalige Belegungen konnten

FLOWERS u. ALHUSEN (1992) deutlich bessere Konzeptionsraten und

Wurfgrößenerhöhungen feststellen als bei einmaligen Besamungen.

2.2 Spermatozoon

2.2.1 Morphologie der Samenzelle

Eberspermatozoen entsprechen im wesentlichen den Spermatozoen anderer

Säugetierarten (Abb.1). Die Samenzelle geht als Produkt der Gametogenese des

männlichen Tieres hervor. Das Spermium besteht aus Kopf, Hals und Schwanz, wobei

sich der Spermienschwanz in Mittel-, Haupt- und Endstück gliedert (SETCHEL 1982).

Die Gesamtlänge eines Spermiums liegt zwischen 50 und 70 µm.

Abb. 1: Schematische Darstellung (Querschnitt) der Ebersamenzelle

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Literaturübersicht

1515

2.2.2 Spermienkopf

Der Spermatozoenkopf beinhaltet fast ausschließlich den Zellkern, der aus stark

kondensiertem Chromatin besteht, das die Desoxyribonucleinsäure als Träger der

genetischen Information enthält (MONESI 1976). Der Zellkern ist von der inneren und

äußeren Kernmembran umgeben und ist von ovaler bis rechteckiger, seitlich

abgeflachter Form. Der Kopf eines Eberspermatozoen ist 7-10 µm lang und 4-5 µm

breit (DÖCKE et al. 1982). Ungefähr 2/3 des Kopfes bestehen aus der Kopfkappe,

dem sogenannten Akrosom, das aus den Vesikeln des Golgikomplexes entsteht. Das

Akrosom beinhaltet hydrolytische Enzyme wie Akrosin und Hyaluronidase, die bei der

Interaktion mit der Eizelle freigesetzt werden und dadurch dem Spermium die

Penetration der Oozyte ermöglichen (YANAGIMACHI 1994). Das Halsstück des

Spermiums stellt eine bewegliche Verbindung zwischen Spermienkopf und

Spermienschwanz dar. Als Kontaktstelle gilt die Basalplatte, die zwischen der

Implantationsgrube des Kerns und dem proximalen Zentriol eine Verbindung herstellt.

Dieser als Gelenkkopf bezeichnete Bereich ist eine Prädilektionsstelle für Halsbrüche.

2.2.3 Spermienschwanz

Der Spermienschwanz wird in Mittel-, Haupt- und Endstück unterteilt und entspringt

als Achsenfaden am proximalen Zentriol des Spermienhalses. Der Achsenfaden besitzt

eine für Geißeln typische radialsymetrische Struktur, die aus zwei zentral

angeordneten Mikrotubuli, umgeben von neun Doppelmikrotubuli sowie neun

Außenfibrillen, besteht. Um die Energieversorgung des Spermiums sicherzustellen, ist

das Mittelstück von einer einlagigen, spiralförmig angeordneten Schicht

Mitochondrien umgeben. Den längsten Teil des Spermienschwanzes bildet das

Hauptstück, wobei die Dicke der Außenfibrillen nach distal abnimmt. Dieser Bereich

ist von der sogenannten Ringfaserscheide umgeben, die aus einer Schicht fibrillärer

Proteine besteht. Am Ende der Ringfaserscheide beginnt das Endstück, das weder

Mantelfasern noch eine Faserscheide besitzt und in dessen Verlauf der Achsenfaden

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Literaturübersicht

1616

frei vom Plasmalemm umgeben ist (SETCHEL 1982). Alle Abschnitte eines

Spermatozoons sind von einer Plasmamembran umgeben, deren

Lipidzusammensetzung entsprechend der Funktion der einzelnen Spermatozoenareale

variiert.

2.3 Spermatozoenreifung

Die sich an die Spermatogenese anschließende posttestikuläre Spermienreifung ist für

die Befruchtungsfähigkeit der Samenzellen essentiell. Die posttestikuläre

Spermienreifung vollzieht sich während der Nebenhodenpassage und der Ejakulation.

Die aus dem Keimepithel des Hodens freigesetzten Spermien besitzen noch nicht die

Fähigkeit, sich aktiv fortzubewegen. Sie werden durch Kontraktionen der myoiden

Zellen der Lamina propria der Samenkanälchen zum Rete testis des Hodens

transportiert und gelangen von dort in den Nebenhoden. Der Nebenhoden wird in die

Bereiche Nebenhodenkopf, Nebenhodenkörper und Nebenhodenschwanz gegliedert.

Durch die Passage im Nebenhoden erfahren die Spermien einige physiologische,

morphologische und biochemische Veränderungen, die als Nebenhodenreifung

bezeichnet werden. Verbunden mit diesen Prozessen kommt es im Nebenhodenkörper

zum Erwerb der Motilität, während der Nebenhodenschwanz hauptsächlich als

Spermienspeicher genutzt wird.

Im Verlauf der Nebenhodenpassage kommt es zu einer biochemischen Veränderung an

der Oberfläche der Spermatozoen, die sowohl Kohlenhydrate und Proteine als auch in

die Membran integrierte Lipide betreffen (YANAGIMACHI 1994). Hier finden

Umbauprozesse der Plasmamembran statt, die durch Lokalisationsänderungen von

integralen oder peripheren Membranproteinen gekennzeichnet sind

(HAMMERSTEDT et al. 1982). Des weiteren werden Peptidstrukturen zum Teil

partiell durch den Einbau von epididymalen Proteinen ersetzt (OVERSTREET 1983,

DACHEUX et al. 1989).

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Literaturübersicht

1717

Eine wichtige Rolle spielt das im Nebenhoden synthetisierte Cholesterin für den

Schutz der Spermatozoen vor mechanischer Schädigung. Cholesterin wird vom Epithel

des Nebenhodens sezerniert und in die Plasmamembran des Spermiums eingebaut

(SEKI et al. 1992). Die Negativladung der Spermienoberfläche steigt während des

Reifungsvorganges an; eine Hypothese beschreibt als Ursache die Übertragung von

Sialsäuren auf Glykokonjugate durch Sialyltransferasen, die ebenfalls Bestandteil der

Nebenhodenflüssigkeit sind (TULSANI et al. 1993; FLECHON 1979).

Nach der Passage durch den Nebenhoden besitzen die Spermatozoen die vollständige

Fähigkeit, an die Zona pellucida der Oozyte zu binden und sind in der Lage, sich

gerichtet vorwärts zu bewegen (COOPER 1996, KIRCHHOFF u. IVELL 1995). Die

Dauer der Reifung im Nebenhoden variiert beim Säuger zwischen zwei und elf Tagen

(JOHNSON und VARNER 1988).

Während der Ejakulation kommen die Spermatozoen mit den Sekreten der

akzessorischen Geschlechtsdrüsen in Berührung und verlieren vorübergehend ihre

Befruchtungsfähigkeit wieder. Dieser Vorgang dient dem Schutz des Spermiums vor

Degeneration, aber vor allem soll frühzeitige Kapazitation beziehungsweise das

Eintreten der Akrosomreaktion vermieden werden. Diese Schutzeinrichtung ist

insbesondere während der Ejakulation und der nachfolgenden Wanderung im

weiblichen Genital bis zum eigentlichen Ort der Befruchtung, dem Eileiter, notwendig

(TÖPFER-PETERSEN et al. 1996).

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Literaturübersicht

1818

2.4 Kapazitation

Durch AUSTIN u. CHANG wurde 1952 erstmals die Bedeutung der Kapazitation

beschrieben. Mit Kapazitation ist eine physiologische und biochemische Veränderung

gemeint, die notwendig ist, um die Spermien auf die Befruchtung vorzubereiten bzw.

die Akrosomreaktion einzuleiten. Die Kapazitation kann als progressiver

Destabilisierungsprozess angesehen werden, der für die Akrosomreaktion essentiell ist

(YANAGIMACHI 1994).

Den Spermien sind so genannte Dekapazitationsfaktoren aufgelagert, die eine

vorzeitige Kapazitation verhindern sollen (SHIVAJI et al. 1990, YANAGIMACHI

1994). Die Stabilisierung der Spermatozoenmembran erfolgt über den Einbau von

Cholesterin, über Protein-Proteinwechselwirkungen wird dann eine Schutzschicht um

die empfindliche akrosomale Region des Spermienkopfes gebildet.

Biochemisch gesehen betreffen die Veränderungen während der Kapazitation im

wesentlichen die Membranen der Spermatozoen, sowie die intrazellulären

Ionenkonzentrationen (BEDFORD u. HOSKINS 1990). Durch die Entfernung der

Sialsäuren und der Sulfatreste aus der Plasmamembran durch Hydrolasen des

weiblichen Genitalsekretes nehmen die negativen Oberflächenladungen ab

(LANGLAIS et al. 1981). Aus der Plasmamembran wird zusätzlich Cholesterin

entfernt, das über verschiedene Lipoproteine reguliert wird.

Durch die erhöhte Membrandurchlässigkeit kommt es zu einem zweiphasigen

Calciuminflux. Hierbei ist die erste Phase mit dem Kapazitationsprozess eng

verbunden, während die zweite Phase durch einen massiven Anstieg der Calciumionen

den Beginn der Akrosomreaktion anzeigt (FRASER 1995). Durch die Aktivierung der

Calcium abhängigen Adenylatcyclase steigt der intrazelluläre cAMP-Spiegel,

Proteinkinase A wird aktiviert; die wiederum reguliert die Tyrosinkinaseaktivität

(VISCONTI et al. 1997; VISCONTI u. KOPF 1998). Eine kapazitationsabhängige

Tyrosinphosphorylierung wurde 1996 von TÖPFER-PETERSEN et al. beim Eber und

Bullen beobachtet. Durch den Anstieg des intrazellulären Calciums und cAMP sowie

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Literaturübersicht

1919

durch die Destabilisierung der Spermatozoenmembran kommt es zu einer

Hyperaktivierung der Spermatozoen am Ende des Kapazitationsvorganges.

An welchem Ort im weiblichen Genitaltrakt die Kapazitation beginnt, ist

speziesabhängig. Bei Tierarten mit intrauteriner Ejakulatdeponierung erfolgt die

Kapazitation fast ausschließlich im unteren Isthmusabschnitt des Eileiters

(YANAGIMACHI 1994).

KAWAKAMI et al. (1998) konnten in einer Studie zeigen, dass die Kapazitation bei

Hundespermatozoen durch Eileiterflüssigkeit induzierbar ist. Durch verschiedene

Medien mit Zusätzen wie BSA, Hydrogencarbonat oder Calcium kann in vitro eine

Kapazitation herbeigeführt werden (VISCONTI et al. 1997). HARRISON (1996)

berichtete, dass die Kapazitation ein spezifischer, initiierbarer und kontrollierbarer

Prozeß ist, bei dem Hydrogencarbonat die entscheidende Rolle spielt.

Sind die Spermatozoen kapazitiert, ist ihre Membran instabil und ihre Lebensdauer

verringert (BEDFORD 1970), so dass davon ausgegangen werden kann, dass der

Prozeß der Kapazitation mit der Ovulation synchronisiert sein muß. Durch HUNTER

(1995) wurde beschrieben, dass der Ablauf der vollständigen Kapazitation nicht von

der Verweildauer der Spermien im unteren Isthmusabschnitt abhängt, sondern direkt

mit der Ovulation in Zusammenhang zu bringen ist.

Diese Vorgänge sind in ihrer Gesamtheit notwendig, damit das Spermatozoon später

die Akrosomreaktion durchführen und sich schließlich mit der Eizelle vereinigen kann.

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Literaturübersicht

2020

2.5 Akrosomreaktion

Bei der Akrosomreaktion werden akrosomale Enzyme aktiviert und freigesetzt, die für

die Penetration der Zona pellucida benötigt werden. Bei dieser Reaktion fusioniert die

äußere akrosomale Membran mit der darüber liegenden Plasmamembran; dadurch

werden Kanäle im Akrosom gebildet und lytische Enzyme freigesetzt

(YANAGIMACHI 1994). Durch diese Enzyme kommt es zu einer partiellen

Hydrolyse der Zona pellucida, wodurch die Spermatozoen in der Lage sind, die

extrazelluläre Matrix zu penetrieren. Die Penetration ist die Voraussetzung für die

Fusion mit der Vitellinmembran der Oozyte.

Das zentrale Ereignis der Akrosomreaktion ist die Exozytose des Spermienakrosoms

die durch einen massiven Influx extrazellulärer Calciumionen entsteht (FLORMANN

et al. 1992; FRASER 1993). Dabei haben Untersuchungen von HARRISON et al.

(1993) bei Eberspermatozoen ergeben, dass durch die Anwesenheit von Bicarbonat die

intrazelluläre Calciumaufnahme erleichtert wird. Durch den Anstieg des

intrazellulären Calciumspiegels erhöht sich der pH-Wert intrazellulär, die negative

Ladung an der Spermienoberfläche vermindert sich, und durch diese Komponenten

wird die Plasmamembran der Spermatozoen direkt destabilisiert.

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Literaturübersicht

2121

2.6 Seminalplasma

Direkt nach der Ejakulation verlieren Säugetierspermatozoen die bereits im

Nebenhoden erworbene Fähigkeit, eine Eizelle zu befruchten. Dieses Phänomen ist auf

den Einfluss des Seminalplasmas zurückzuführen. Als Seminalplasma wird das

sekretorische Produkt von Hoden und Nebenhoden sowie der verschiedenen

akzessorischen Organe (Ampulle, Samenblasendrüse, Prostata, Bulbourethraldrüse)

des männlichen Genitaltraktes bezeichnet. Die verschiedenen Drüsen beinhalten

sowohl vom Volumen als auch von der Zusammensetzung unterschiedliche

Komponenten, die jahreszeitlichen und auch individuellen Schwankungen unterliegen.

Die Befruchtungsfähigkeit geht vorübergehend verloren, weil die Inhaltsstoffe des

Seminalplasmas sich während der Ejakulation wie eine Schutzhülle um die

Spermatozoen legen und die Spermien vor Schädigungen, Umwelteinflüssen und

frühzeitiger Kapazitation schützen (SHIVAJI 1990).

Noch vor einigen Jahren waren Wissenschaftler der Meinung, dass diese Schutz- und

Nährfunktion (WILLIAMS-ASHMAN 1988) die einzige Aufgabe des Seminalplasmas

sei. Inzwischen ist die Zusammensetzung des flüssigen, spermienfreien Anteils des

Ejakulates besser untersucht, und es sind diverse neue Erkenntnisse gewonnen worden.

Das Seminalplasma enthält niedermolekulare organische Substanzen wie freie

Aminosäuren, Monosaccharide, Prostaglandine, Polyamine, Lipide, Steroidhormone

und Proteine (MANN und LUTWACK-MANN 1981). Weiterhin sind eine Reihe von

verschiedenen Ionen wie Na+, K+, H+, Mg2+, Cl- und Ca2+ gefunden worden (HAFEZ

1993; FRASER 1995). Der pH-Wert des Seminalplasmas liegt im basischen Bereich

zwischen 7,2 und 7,8, um das saure Milieu im weiblichen Genitale zu neutralisieren,

und bietet eine Spermienschutzfunktion (SETCHELL et al. 1994).

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Literaturübersicht

2222

2.7 Spermientransport im weiblichen Genitaltrakt

Bereits vor dem Zeitpunkt der Ovulation sind am Ort der Befruchtung schon

ausreichend befruchtungskompetente Spermatozoen vorhanden. Dies kennzeichnet

einen erfolgreichen Spermientransport, denn schon vor dem Einsetzen physiologischer

Alterungsprozesse der Oozyte können die Spermatozoen die Eizelle penetrieren und

befruchten. Der Spermientransport ist ein komplexer Vorgang, der durch verschiedene

Faktoren beeinflusst wird. Seminalplasmaanteil, Seminalplasmazusammensetzung,

Paarungsverhalten der Tierart, der weibliche Reproduktionstrakt mit mechanischen

und physikochemischen Barrieren sowie immunogene Anteile des Uterus (HUNTER

1988, 1995) beeinflussen die Spermatozoen auf ihrem Weg zum Eileiter. Bei den

Säugetieren wird zwischen Tieren unterschieden, die das Ejakulat vaginal (Rind,

Ziege, Schaf, Kaninchen, Affe) oder im Uterus (Pferd, Schwein) deponieren. Der

eigentliche Transport zum Ovidukt erfolgt in einer Kombination aus aktivem und

passivem Transport. Durch VIRING u. EINARSSON (1981) wurde erstmals ein

transuteriner Transport von Spermatozoen durch koordinierte

Myometriumskontraktionen beim Schwein beschrieben.

Durch im Uterus vorhandene Hormone wie Östrogene und Progesteron wird die

Motilität des Uterus gesteigert (CLAUS et al. 1989). Auch Östrogene sind im

Seminalplasma enthalten, wodurch eine Synthese und Freisetzung von Prostaglandin F

2 α induziert wird (PAKRASI et al. 1983). Durch die Hormonfreisetzung kommt es zu

einer Frequenzsteigerung der Kontraktionswellen am Uterus (CLAUS u. SCHAMS

1990). Die Tierarten bei denen die Spermatozoen direkt in den Uterus abgesetzt

werden, besitzen als Hauptbarriere die uterotubale Verbindung, die aktiv überwunden

werden muß und der eine gewisse selektive Funktion auf die Gesamtpopulation der

Spermien zukommt (HUNTER 1995).

Je nach Tierart sind die Zeiten unterschiedlich, in denen sich eine Anzahl

befruchtungsfähiger Spermien in der uterotubalen Verbindung und im kaudalen

Isthmus etabliert. Untersuchungen von STEVERINK et al. (1998) ließen die

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Literaturübersicht

2323

Vermutung zu, dass beim Schwein bereits 30 Minuten nach der Insemination eine

ausreichende Anzahl Spermatozoen im Ovidukt vorhanden ist, um eine Fertilisation zu

ermöglichen. Durch Untersuchungen von HUNTER (1981) konnte nachgewiesen

werden, dass beim Schwein innerhalb von 30 Minuten 50 % der Oozyten befruchtet

sind und nach maximal 2 Stunden eine 100%ige Fertilisation gewährleistet ist. Wird

die Besamung oder Bedeckung einer Sau in Ovulationsnähe durchgeführt, ist die

Transportgeschwindigkeit sowie die Anzahl transportierter Spermatozoen erhöht

(HUNTER 1981). Untersuchungen ergaben, dass es bei Pferd und Rind nach der

Bedeckung 4-8 Stunden dauert, bis sich eine ausreichende Anzahl

befruchtungskompetenter Spermatozoen am Befruchtungsort befindet (SCOTT u.

OVERSTREET 1999).

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Literaturübersicht

2424

2.8 Funktionelles Spermienreservoir

Besonders bei Haussäugetieren mit mehrtägiger Östrusdauer ist bei einer frühen

Bedeckung bzw. Besamung in der Brunst eine Art Spermienspeicher im weiblichen

Genitaltrakt erforderlich, in dem die Befruchtungsfähigkeit der Spermatozoen bis zur

Freissetzung der Eizelle bewahrt werden kann.

Der kaudale Isthmus des Eileiters erfüllt die Aufgaben eines funktionellen

Spermienreservoirs sowohl bei Scheidenbesamern, wie Ziege, Schaf und Rind

(Reservoir II) als auch bei Uterusbesamern, wie Pferd und Schwein (Reservoir I).

Das Spermienreservoir besitzt verschiedene wichtige Aufgaben:

1. Selektion intakter, befruchtungsfähiger Spermien

2. Aufrechterhaltung der Lebensfähigkeit der Spermien bis zum Zeitpunkt der

Ovulation

3. Regulation von Hyperaktivierung und Kapazitation

4. Begrenzung der Spermienzahl am Ort der Befruchtung durch gezielte Loslösung

Durch das extrem enge Lumen im Bereich des Eileiteristhmus kommt es zu einer

Auftrennung der Gesamtspermienpopulation. Ein Teil der Spermienpopulation

befindet sich im Lumen des Eileiters, ein anderer Teil bindet an das

Schleimhautepithel (MBURU et al. 1997). Die im Lumen befindlichen Spermien

unterliegen morphologischen Veränderungen im Sinne eines Alterungsprozesses,

während die an die Epithelzellen der Schleimhaut gebundenen Spermien vor einem

Transport durch die Zilien geschützt sind (BLANDAU u. GADDUM-ROSSE 1974).

Die Spermien sind im Eileiter vor Phagozytose, übermäßigem Energieverlust sowie

frühzeitiger Kapazitation geschützt. Die Regulation dieser Vorgänge unterliegt der

zyklusstandabhängig unterschiedlichen Zusammensetzung der luminalen

Eileiterflüssigkeit hinsichtlich des Proteingehaltes, enzymatischer Aktivität,

Elektrolytgehalt und Viskosität.

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Literaturübersicht

2525

Kapazitierte Spermien besitzen eine deutlich reduzierte Fähigkeit mit den

Oviduktepithelzellen eine Bindung einzugehen (FAZELI et al. 1999) sowie deutlich

sichtbare hyperaktive Geißelbewegungen, durch die sie aktiv zum Ort der Befruchtung

(Ampulla) gelangen (SMITH 1998). Durch das funktionelle Spermienreservoir wird

sichergestellt, dass zum Zeitpunkt der Ovulation ausreichend befruchtungskompetente

Spermien zur Befruchtung zur Verfügung stehen, da die Spermatozoen zeitlich

versetzt freigesetzt werden. Somit spielt das Spermienreservoir für eine erfolgreiche

Befruchtung eine bedeutende Rolle (Abb.2).

In der Literatur wird die Beteiligung von Kohlenhydrat-Proteinbindungen bei der

beschriebenen Anheftung der Spermien an das Epithel des Spermienrerservoirs

diskutiert (SMITH u. YANAGIMACHI 1991; SUAREZ et al. 1991; HUNTER 1995

LEFEBRE et al. 1997; GEHLHAAR et al. 2000; WAGNER et al. 2001). Die

Erkennung der spezifischen kohlenhydratbindenden Proteine oder lektinähnlichen

Moleküle der Spermien erfolgt über vom Oviduktepithel exprimierte Oligosaccharide

(SUAREZ 1998; SUAREZ et al. 1998).

Abb. 2: Bindungsmodell des funktionellen Spermienreservoirs; gebundene

Spermatozoen (grau) an Oligosaccharidstrukturen des Oviduktepithels. Nach der

Kapazitation lösen sich die Spermien (weiß) vom Epithel und setzen ihre Migration

fort.

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Literaturübersicht

2626

2.9 Spermadhäsine

Als Spermadhäsine werden Proteinmoleküle mit kleiner molekularer Masse

(12-15 kDa) bezeichnet, die sich im Seminalplasma verschiedener Säugetierspezies

nachweisen lassen.

Tab. 1: Nomenklatur der Spermadhäsine

Tierart Spermadhäsine

Schwein AWN-1, AWN-2

AQN-1, AQN-3

PSP-1, PSP-2

Rind aSFP

Pferd HSP-7

Spermadhäsine sind spermienoberflächenassoziierte Eiweiße, für die Funktionen bei

der Kapazitation sowie bei der Gametenerkennung gezeigt werden konnten

(CALVETE et al. 1996, RODRIGUEZ-MARTINEZ et al. 1998). Die Analyse ihres

Ursprungs, ihrer Lokalisation auf der Oberfläche und ihres

Ligandenbindungsverhaltens sowie ihre quantitative Bestimmung kann wertvolle

Hinweise geben, um die Funktion auf molekularer Ebene zu verstehen und damit auch

reproduktionsmedizinisch effektiver in das Fortpflanzungsgeschehen eingreifen zu

können.

Die Primärstruktur der Spermadhäsine besteht aus 111-133 Aminosäuren mit einer

Sequenzidentität von 40 – 60% und einer homologen Anordnung von zwei

Disulfidbrücken (SANZ et al. 1991, 1992a, 1992b; EINSPANIER et al. 1994). Jeweils

zwei benachbarte Cysteinreste sind über zwei Disulfidbrücken verknüpft. Es konnte

nachgewiesen werden, dass Spermadhäsine von ihrer Struktur zu einer Familie von

ontogenetisch regulierten Proteinen gehören, die durch die sogenannte CUB-Domäne

charakterisiert sind (BORK u. BECKMANN 1993).

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Literaturübersicht

2727

Die Namensgebung erfolgte durch den Vergleich von Proteinsequenzen der

Komplementfaktoren Clr/Cls, des embryonalen Seeigelproteins Uegf sowie des

Knochen-morphogenetischen-Proteins bmpf. Für die CUB-Domäne wurde eine

ähnliche Tertiärstruktur vorgefunden wie im variablen Bereich der Immunglobuline.

Als Erkennungsmerkmal sind neun antiparallele β-Faltblattstränge beschrieben (Bork

u. Beckmann 1993). Durch ROMERO et al. konnte 1997 mittels

Röntgenstrukturanalyse und durch biophysikalische Verfahren erstmals die

dreidimensionale Struktur der CUB-Domäne am Beispiel der Spermadhäsine

aufgeklärt werden. Spermadhäsine enthalten eine einzige CUB-Domäne.

Spermadhäsine sind in der Lage, spezifisch an Kohlenhydrate zu binden, zeigen mit

den bisher bekannten Lektinen aber keinerlei Ähnlichkeit. Aus diesem Grund werden

sie als eine Gruppe neuartiger Lektine angesehen.

Das Spermadhäsin AWN bildet in seinem Syntheseort eine Ausnahme zu den anderen

Spermadhäsinen, denn es wird nicht erst in den akzessorischen Geschlechtsdrüsen

gebildet, sondern bereits in den Tubuli recti und im Rete testis des Hodens

(SINOWATZ et al. 1995; EKHLASI-HUNDRIESER et al. 2002).

Spermadhäsine besitzen verschiedene Möglichkeiten, an biochemischen Prozessen

teilzunehmen. Über die Kohlenhydratbindungsmöglichkeiten hinaus sind

Spermadhäsine in der Lage, Glycoaminoglycane, Phospholipide und

Serinproteinaseinhibitoren zu binden (SANZ et al. 1992a). Durch ihr Bestreben,

sulfatierte Glukosaminoglycane wie Heparin zu binden, können sie als regulative

Kapazitationsfaktoren wirken (CALVETE et al. 1995).

Eine wichtige Rolle spielen die Spermadhäsine bei der Bindung der Gameten, die über

die apikale Region des Spermienkopfes vermittelt wird. Durch indirekte

Immunfluoreszenzmikroskopie zeigten SANZ et al. (1993), dass Spermadhäsine im

akrosomalen Bereich des Spermienkopfes lokalisiert sind und gingen von einer

Beteiligung der Spermadhäsine bei der initialen Bindung der Gameten aus. AWN

wurde durchflusszytometrisch durch PETRUNKINA et al. (2000) an lebenden

Spermatozoen nachgewiesen.

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Literaturübersicht

2828

RODRIGUEZ-MARTINEZ et al. (1998) konnten nachweisen, dass AWN bei an die

Zona pellucida gebundenen Spermatozoen in vivo als Bindungspartner noch zur

Verfügung steht.

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Material und Methoden

2929

3 Material und Methoden

3.1 Spermienaufbereitung

3.1.1 Gewinnung der Ejakulate

Für die Versuche wurden ausschließlich Spermatozoen klinisch gesunder,

institutseigener Eber verwendet. Alle Eber wurden während der

Versuchsdurchführung von November 2001 bis Dezember 2002 regelmäßig abgesamt,

um eine möglichst gleichbleibende Samenqualität zu gewährleisten. Die Tiere wurden

jeweils am Versuchstag mit Hilfe eines Phantoms durch die Handmethode abgesamt.

In einem isolierten Gefäß mit einem innenliegenden Plastikbeutel wurde das Ejakulat

aufgefangen. Durch ein steriles Netz wurde das Bulbourethraldrüsensekret abgetrennt.

Für die Versuche im Explant-Assay wurde die spermienreiche Fraktion des Ejakulates

gesammelt, bei allen anderen Untersuchungen wurde das Gesamtejakulat verwendet.

Es wurden für alle Untersuchungen ausschließlich Spermatozoen eingesetzt, die sich

nach dem konventionellen Verfahren als normosperm erwiesen. Alle verwendeten

Spermatozoen wurden einer Dichtegradientenzentrifugation mit Percoll (Amersham

Biosciences, Uppsala, Schweden) unterzogen.

3.1.2 Konventionelle spermatologische Untersuchung

Mit Hilfe eines Phasenkontrastmikroskopes (Zeiss 1697, Jena) mit Wärmeplatte

wurden die Samenzellen direkt nach der Gewinnung bei 160-facher Vergrößerung

einer Motilitätsschätzung unterzogen. Weiterhin erfolgte eine makroskopische

Beurteilung von Farbe und Beschaffenheit des Ejakulates, die Bestimmung der

Samenzelldichte und Untersuchung der Samenzellmorphologie. Um den Anteil der

morphologisch abweichenden Spermien festzustellen, wurden 200 Spermien unter

dem Phasenkontrastmikroskop mit Ölimmersion bei 1000-facher Vergrößerung

ausgezählt und beurteilt. Aus der spermienreichen Fraktion des Ejakulates wurden

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Material und Methoden

3030

10 µl in ein Eppendorfgefäß (Eppendorf, Sarstedt) zusammen mit temperaturgleicher

Formolcitratlösung pipettiert und vermischt. Von dieser Suspension wurden auf einem

staubfreien Objektträger zwei Tropfen aufgetragen und mit Deckgläsern (18 x 18 mm)

abgedeckt. Diese fixierten Spermien wurden nach KRAUSE (1965) untersucht.

3.1.3 Dichtegradientenzentrifugation mit Percoll

Bei der Dichtegradientenzentrifugation mit Percoll (Amersham Biosciences, Uppsala,

Schweden) wurde eine Trennung vorwärtsbeweglicher Spermien von den übrigen

Bestandteilen des Ejakulates aufgrund des unterschiedlichen spezifischen Gewichtes

und der unterschiedlichen Sedimentationsgeschwindigkeit erreicht (CLAASSENS et

al. 1998, PERTOFT et al. 1977).

Ein Zentrifugenröhrchen aus Glas mit konischem Boden wurde in schräger Position

zunächst mit 2 ml 70 % Percoll -Lösung befüllt und anschließend mit 4 ml 35 %

Percoll -Lösung überschichtet. Dabei sollte darauf geachtet werden, dass die 35 %

Percoll -Lösung beim Pipettieren vorsichtig an der Wand des Röhrchens entlang läuft

und beide Lösungen sich nicht vermischen.

Die Zentrifugation erfolgte bei 20 °C in zwei Schritten:

a.) 10 min bei ca. 300 x g

b.) 20 min bei ca. 800 x g

Nach der Zentrifugation konnte der Überstand mit Hilfe einer Eppendorfpipette

abgehebert werden. Das Spermienpellet am Boden des Glasgefäßes wurde mit 500 µl

HBS-Pufferlösung resuspendiert. Die Ermittlung der Spermiendichte folgte mit einer

Zählkammer nach Thoma. Dazu wurden 10 µl Spermiensuspension in 10 ml einer 10

% Kochsalzlösung gegeben und nach der Durchmischung in eine vorbereitete Thoma-

Zählkammer pipettiert. Nachdem die Spermien sich nach einer Minute Ruhezeit

abgesetzt hatten, konnten sie unter dem Mikroskop bei einer 40 fachen Vergrößerung

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Material und Methoden

3131

ausgezählt werden. Zur Ermittlung der Dichte wurden im oberen und unteren

Zählkreuz jeweils fünf Quadrate ausgezählt und addiert.

ausgezählte SpermienDichte =

ausgezählte Fläche x Kammerhöhe x Verdünnung

Ausgezählte Fläche = 10/25 mm2

Kammerhöhe = 1/10 mm

Verdünnung = 1: 1000

Der durch Einsetzen in die Formel errechnete Faktor beträgt 10.000 und wurde mit den

ausgezählten Spermien multipliziert. Das Resultat ergab die Dichte in Mio

Spermienzellen /ml.

3.1.4 Darstellung der Membranintegrität durch Propidiumjodidfärbung

Propidiumjodid gehört zu den Farbstoffen, die in der Lage sind, eine nicht intakte

Zellmembran zu durchdringen und an die DNA der Zelle zu binden. Das

Absorptionsmaximum liegt bei 536 nm, der maximale Emissionsbereich bei 617 nm.

Hierbei weisen Zellen mit nicht intakter Zellmembran eine rote Fluoreszenz auf. Mit

einer Endkonzentration von 0,5 mg/ml wurde Propidiumjodid in Aqua dest. gelöst und

im Gefrierschrank bei -20 °C lichtgeschützt aufbewahrt (HARRISON u. WICKERS

1990). Die Spermiensupension (970µl) wurde mit 20µl Formolcitrat und 10µl

Propidiumjodid versetzt. Nach 5 Minuten Reaktionszeit unter Lichtabschluss wurden

rote (membrandefekt) und grüne (membranintakt) Spermienzellen ausgezählt. Je 200

Samenzellen wurden unter dem Fluoreszenzmikroskop bei einer Wellenlänge von

536 nm ausgewertet und prozentual angegeben. Durch dieses Verfahren konnte der

Anteil der membrandefekten Spermien objektiv ermittelt werden.

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Material und Methoden

3232

3.2 Biochemische Charakterisierung von Proteinen

3.2.1 Auftrennen des Seminalplasmas mittels analytischer HPLC

Zur Herstellung eines spermienfreien Seminalplasmas wurde das Gesamtejakulat

zentrifugiert und der Überstand abpipettiert. Die Zentrifugation erfolgte bei 160 x g

bei 20 °C für 10 Minuten. Nach einer lichtmikroskopischen Kontrolle auf

Spermienfreiheit wurde das Seminalplasma lyophilisiert und davon 4 mg mit 1 ml

eines 0,0085 %igen Trifuoressigsäure (TFA)-Wassergemisches (Puffer A) verdünnt,

und über eine analytische C18-Säule (ET 250/10, Nucleosil 100-7, Macherey-Nagel,

Düren, Deutschland), die mit einem reverse phase HPLC-System (Beckman mit LKB

2141 Detektor, Pharmacia, Freiburg) verbunden war, aufgetrennt. Die Detektion

erfolgte bei einer Wellenlänge von 220 nm. Die Durchflussrate betrug 2 ml/min, die

Range 2,0 AU. Die Elution erfolgte durch 90 % Acetonitril + 0,085 % TFA in Wasser

(Puffer B) bei einem Gradienten von 25-70 % in 60 Minuten und von 70-90 % in

10 Minuten. Das Chromatogramm wurde bei einem Papiervorschub von 2 mm/min

erstellt. Die Fraktionen wurden aufgefangen und lyophylisiert.

3.2.2 Herstellung von Spermienextrakten

Die Dichte der Spermatozoen wurde auf 107 Spermatozoen/ml HBS-Puffer eingestellt.

Die Extraktion erfolgte durch Extraktionspuffer/1 % Chaps in PBS-Puffer

(AppliChem, Darmstadt). Das vorbereitete Gefäß mit Spermien und Puffern wurde 20

Minuten bei 1000 x g zentrifugiert und der Überstand in ein frisches Gefäß

abpipettiert.

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Material und Methoden

3333

3.2.3 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese

Zu analytischen Zwecken wurde die Elektrophorese in einer Modifikation nach der

von LAEMMLI (1970) beschriebenen Methode durchgeführt. Die verwendeten

18 %igen Polyacrylamidgele wurden selbst hergestellt und mit einem 4,5 % igen

Sammelgel überschichtet. In diesem Sammelgel wurden je nach Versuchsansatz

Kunststoffkämme eingesetzt, durch die eine unterschiedliche Anzahl von

Probentaschen im Gel geformt wurden. Die aufgebrachten Spermienextrakte wurden

von 2 bis 15 µl mit je 2fach konzentriertem Laemmli-Puffer versetzt, 7 Minuten bei

95 °C erhitzt, 1 Minute auf Eis gestellt und 1 Minute bei 13.000 x rpm zentrifugiert. Je

nach Auftragsvolumen der Probe variierten die Taschengrößen des Gels. Zur

Ermittlung der relativen Molekulargewichte wurde routinemäßig ein LMW-Standard

(Low Molecular Weight Proteinstandard, Bio Rad, 161-0304) verwendet.

Die Elektrophorese wurde in einer Elektrophoresekammer (Bio Rad Mini-Protein II,

Bio Rad) durchgeführt. Im oben aufgetragenen Sammelgel erfolgte die Auftrennung

der Proteine mit 100 V, im Trenngel wurde die Stromstärke auf 200 V erhöht. Durch

das Austreten des blauen Farbstoffes am unteren Gelrand wurde das Ende der

Elektrophorese sichtbar. Nach diesem Verfahren konnten die zu analysierenden

Proteine auf Membranen übertragen werden oder mit Coomassie Brilliant Blue R

(Serva, Heidelberg, 35051) angefärbt werden.

Die Gele wurden nach der Elektrophorese für 30 Minuten bei Raumtemperatur mit

Coomassie Brilliant Blue R (Serva, Heidelberg 35051) 0,25 % ige Färbelösung

(40 % Methanol, 10 % Eisessig) angefärbt. Um die überschüssige Hintergrundfarbe zu

entfernen, wurde das Gel in einer Entfärbelösung (20 % Methanol, 10 % Eisessig)

geschwenkt. Die Entfärbelösung wurde bei diesem Vorgang mehrmals gewechselt.

Zwischen mit Wasser befeuchteten Cellophanblättern (Gel Drying Film, Promega,

Madison) wurden die Gele bei Raumtemperatur getrocknet.

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Material und Methoden

3434

3.2.4 Western Blot Analyse

Zu den empfindlichsten Nachweismethoden der Proteine nach elektrophoretischer

Auftrennung gehören immunologische Verfahren. Zu diesem Zweck werden Proteine

aus dem Gel durch ein Blotting-Verfahren auf eine Membran transferiert. Nach der

von TOWBIN et al. (1992) beschriebenen Methode wurde der Elektroblot

durchgeführt. Die 6 x 8 cm große PVDF Membran (Roche, Nr. 1722026) wurde für

eine Minute mit 100 % Methanol durchfeuchtet und danach in Aqua dest. und

Blotting-Puffer äquilibriert. In einem Semi-dry-Apparat (Biometra, Göttingen) mit

Wasserkühlung wurde ein Blotsandwich, bestehend aus drei Lagen Blotpapier

(GB 003, Schleicher & Schuell, Dassel), der Blotmembran, dem Gel und wiederum

drei Lagen Blotpapier, angeordnet. Das Blotpapier wurde vorher in Blottingpuffer

angefeuchtet, dann wurden die Proteine bei 1 mA/cm2 für zwei Stunden bei

Raumtemperatur übertragen.

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Material und Methoden

3535

3.2.5 Spezifischer Proteinnachweis durch Immunfärbung

Die Qualität der Übertragung durch den Blotvorgang wurde durch das Färben der

geblotteten Gele in Coomassie Brilliant Blue und durch eine reversible Färbung der

geblotteten Membran in Ponceau Rot (5 min bei Raumtemperatur) kontrolliert. Bei

erfolgreicher Übertragung wurde die angefärbte Membran mit Aqua dest. entfärbt und

über Nacht bei 4 °C in Blocking Reagenz (Roche, Nr. 1096176) inkubiert, um die

freien Kapazitäten der Membran abzusättigen und unspezifische Bindungen der

verwendeten Antikörper an die Membran zu verhindern. Die darauf folgende

Inkubation mit dem ersten Antikörper wurde für eine Stunde bei Raumtemperatur

durchgeführt. Alle verwendeten Antikörper wurden vor der Inkubation mit Blocking

Reagenz in der optimalen Konzentration verdünnt. Nicht gebundene Antikörper

wurden durch Waschen (3 x 10 min) mit TBS-Puffer von der Membran entfernt. Die

Membran wurde für eine Stunde bei Raumtemperatur mit dem zweiten an Alkalische

Phosphatase gebundenen Antikörper beschickt und danach in TBS/1 % TWEEN und

in Detektionspuffer je 2 x 10 min gewaschen.

Die Farbreaktion erfolgte mit NBT/BCIP Stock Solution (AppliChem, Darmstadt

Nr. 298 83 9) in 100 mM TRIS-HCl bei einem pH-Wert 9,5 in 100mM NaCl. Bei

dieser Färbung dient BCIP als Substrat für die alkalische Phosphatase, das nach der

Dephosphorylierung oxidativ in einen Indigofarbstoff überführt wird. Bei dieser

Reaktion oxidiert NBT ebenfalls zu einem blauen Farbstoff und wirkt somit

farbverstärkend. Die Färbung findet unter Lichtabschluß statt und wird mit Wasser

gestoppt.

Tab. 2: Verwendete Antikörper

Primärantikörper Sekundärantikörper

Anti AQN-1 1:1000

(eigene Herstellung) in Blocking-Reagenz

Anti-Rabbit-AP 1:5000

(Dianova, Hamburg) in Blocking-

Reagenz

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Material und Methoden

3636

3.2.6 Nachweis von kohlenhydratbindenden Proteinen

Bei diesen Versuchen wurde die Membran nach dem Blockieren über Nacht in

Blocking Reagenz Lösung bei 4 °C mit immobilisierten Zuckern (40 µg

α-D-Mannose-Biotin/ml Blocking Reagenz), die kovalent an eine

Polyacrylamidmatrix gebunden sind, inkubiert. Überschüssige Reagenzien wurden

durch 3 x Waschen mit TBS entfernt. Der Nachweis der Bindung der Modellzucker

erfolgt über Streptavidin-Alkalische-Phosphatase. Die überschüssige

Sekundärsubstanz wird durch 2 x 10 Minuten Waschen mit TBS Puffer/1 % Tween

entfernt. Abschließend wird die Membran 2 x 10 Minuten in Detektionspuffer

gewaschen.

Die Membran wurde mit NBT/BCIP Stock Solution (Roche Nr. 1681451) gefärbt und

getrocknet.

Tab. 3: Verwendete Primär-und Sekundärsubstanzen

Primärsubstanz Sekundärsubstanz

α-Mannose-PAA-Biotin

40µg/ml Blocking Reagenz

(Synthesome/ Lectinity, Bad Homburg)

Streptavidin- Alkalische-Phosphatase

1:5000 in TBS-Puffer

(Dianova, Hamburg, 016030084)

α-Galaktose-PAA-Biotin (1-3 Verknüpfung)

20 µg/ml Blocking-Reagenz

(Synthesome/ Lectinity, Bad Homburg)

Streptavidin- Alkalische-Phosphatase

1:5000 in TBS-Puffer

(Dianova, Hamburg, 016030084)

β-Galaktose-PAA-Biotin (1-3 Verknüpfung)

20 µg/ml Blocking-Reagenz

(Synthesome/ Lectinity, Bad Homburg)

Streptavidin- Alkalische-Phosphatase

1:5000 in TBS-Puffer

(Dianova, Hamburg, 016030084)

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Material und Methoden

3737

3.2.7 Chemilumineszenzverfahren

Alternativ wurde bei sehr geringen Proteinmengen das Chemilumineszenzverfahren

eingesetzt, das sich durch eine empfindliche Detektion auszeichnet. Durch variable

Belichtungszeiten sind unterschiedlich intensive Bilder von einer Membran

herstellbar.

Nach der Inkubation mit Primär- und Sekundärantikörper wurden die Membranen in

eine Folie mit 4 ml working solution des Chemilumineszenz-Substrates (Super Signal

West Pico; Pierce über KMF Laborchemie, St. Augustin-Buisdorf) eingeschweißt und

für 60 Sekunden leicht geschwenkt. Die Membran wurde aus der Folie entfernt und in

einer mit einer neuen Folie ausgestatteten Röntgenkassette mit Klebestreifen befestigt.

Ein Röntgenfilm (XAR-5, Kodak GmbH, Stuttgart) wurde in einer Dunkelkammer in

die Röntgenkassette eingelegt und durch das von der Membran ausgehende Lichtsignal

belichtet.

Die Belichtungszeiten variierten zwischen 15 Sekunden und drei Minuten. In einem

Entwicklungsbad (G 150, Agfa Deutschland) wurde der Film für 20-40 Sekunden

geschwenkt, danach in einem mit Aqua dest. gefüllten Stoppbad für einige Sekunden

gewaschen. Die Fixation des Röntgenfilms erfolgte für eine Minute in einem Fixierbad

(G 350, Agfa Deutschland). Nach einer fünfminütigen Wässerung wurde der Film

hängend getrocknet.

Die Membran kann nach einer Behandlung mit 3 M Kaliumthiocyanatlösung (Merck,

Darmstadt) über Nacht („Strippen“) für andere Verfahren eingesetzt werden. Eine

weitere Inkubation mit Primär- und Sekundärsubstanzen ist nach erneutem Blockieren

durchführbar. Zur Überprüfung des erfolgreichen Ablösens der Zuckerstrukturen

wurde nach dem „Strippen“ der Membran eine Leeruntersuchung mit 4 ml working

solution durchgeführt. Auf dem verwendeten Röntgenfilm konnten keinerlei Signale

erkannt werden.

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Material und Methoden

3838

3.2.8 Auftrennen des Spermienextraktes mittels analytischer HPLC

Um eine Auftrennung der im Spermienextrakt enthaltenen Proteine durchführen zu

können, wurde die Probe in einer Verdünnung von 1 : 20 verwendet. Davon wurden

50 µl Probe mit 450µl eines 0,085 %igen Trifluoressigsäure (TFA)-Wassergemisches

(Puffer A) verdünnt und über eine analytische C18 –Säule (ET 250/4, Nucleosil 300-5,

Macherey-Nagel, Düren, Deutschland), die mit einem reverse phase HPLC-System

(Beckman mit LKB 2141 Detektor, Pharmacia, Freiburg) verbunden war, aufgetrennt.

Die Detektion erfolgte bei einer Wellenlänge von 220 nm. Die Durchflußrate betrug

800 µl/min, die Range 1,0 AU. Die Elution wurde mit 90 % Acetonitril +0,085 % TFA

in Wasser (Puffer B) bei einem Gradienten von 5-60 % in 120 Minuten durchgeführt.

Das Chromatogramm wurde bei einem Papiervorschub von 2 mm/min erstellt. Die

Fraktionen wurden aufgefangen und lyophylisiert.

3.2.9 Massenspektrometrische Analyse

Die mittels reverse phase HPLC isolierten Proteine wurden in der

massenspektrometrischen Analyse mit einem matrix-assisted laser

desorption/ionization MALDI-II (Kratos Analytical V 5.2), der mit einem Bruker

REFLEX time-of flight (TOF) ausgestattet war, untersucht. Die Proteinfraktionen

wurden mit α-Cyano-4-hydroxycinnamidsäure in einer Acetonitril/0,1 % TFA-

Mischung (70:30, v/v) auf einen Stahlobjektträger gegeben und nach der Sandwich-

Methode (KUSSMANN et al. 1997) kokristallisiert. Die Profilerstellung fand im

positiven Ionenmodus mit linearer High-Power von 100 - 120 statt. Pro Spektrum

wurden 60 - 80 Laserschüsse abgegeben.

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Material und Methoden

3939

3.3 Durchflusszytometrie

Mit der Durchflusszytometrie können physikalische Eigenschaften von Zellen, wie

Größe, Form und Struktur bestimmt werden. Zusätzlich können Zellfunktionen erfaßt

werden, die mit Hilfe von marker-gekoppelten Fluoreszenzfarbstoffen dargestellt

werden können.

Das verwendete Durchflusszytometer (Galaxy, S 2314, DAKO, Hamburg ) ist mit

einem Argonionenlaser und einer UV-Quecksilberlampe ausgestattet, wobei der Laser

bei einer Wellenlänge von 488 nm detektiert. Zum Gerät gehört eine Computereinheit

mit Software (Mikrosoft Windows 98, FloMax), die eine gezielte Auswertung der

Messungen mit Hilfe der Sechsparameterdarstellung (zwei optische und vier

Fluoreszenzparameter) ermöglicht.

Zur Messung muß eine Einzelzellsuspension vorliegen. Die Probenflüssigkeit wird

durch Überdruck aus dem Probenröhrchen (No./ REF 55484; 3,5 ml; 55 x 12 mm;

Sarstedt, Nürnbrecht) über eine Stahlkapillare in die Quarz-Flowküvette eingeführt.

Um Zellaggregate aufzutrennen, werden die Zellen in der sie umgebenden

Trägerflüssigkeit stark beschleunigt und dadurch hintereinander aufgereiht gemessen.

Jede einzelne Zelle passiert so den fokussierten Laserstrahl. Je nach Zellmorphologie

(Größe und Granularität) entstehen Lichtbeugungen, die als Streulichtsignale von

Lichtdetektoren in bis zu 65.536 Kanälen pro Parameter registriert werden. Das

Vorwärtsstreulicht (FSC = forward scatter) verhält sich proportional zur Größe der

gemessenen Zellen, während das Seitwärtsstreulicht (SSC = side scatter) Rückschlüsse

über die intrazelläre Beschaffenheit (Granularität) sowie über die Oberflächenstruktur

(Komplexität) der Zellen zulässt.

Bei der Verwendung von fluorochrommarkierten Partikeln werden diese durch die

Intensität des einfallenden Lichtes angeregt (Anregungslicht) und emittieren Photonen

einer für jeden Fluorochromfarbstoff typischen Wellenlänge. Die Fluoreszenzsignale

werden von für verschiedene Wellenlängen empfindliche Lichtdetektoren ermittelt.

Für die Grünfluoreszenz (FL-1) ist das verwendete Durchflusszytometer genauso mit

einem Messbereich ausgestattet wie für Messbereiche im Orange- und

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Material und Methoden

4040

Rotfluoreszenzbereich (FL-2, FL-3). Die Intensität der Fluoreszenz wird logarithmisch

verstärkt und auf einer logarithmischen Skala dargestellt.

Durch das Computerprogramm (Mikrosoft Windows 98, FlowMax) wird eine gezielte

Auswertung der Messungen durch eine Zweiparameterdarstellung ermöglicht. In

einem Punktdiagramm (Dot Blot) wird jeweils ein Punkt eingezeichnet, wenn an einer

Intensitätsachse (linear oder logarithmisch), an der beide Parameter gegeneinander

aufgetragen werden, sich die ermittelten Werte der Parameter schneiden. Eine weitere

Möglichkeit der Darstellung ist das Einparameter-Histogramm bei dem vertikal die

Anzahl der Zellen je Kanal aufgetragen werden und horizontal die jeweilige

Messgröße aufgetragen wird.

Eine separate Auswertung verschiedener Zellsubpopulationen aus einem Probenansatz

ist möglich. In einem Dot Blot können bestimmte Meßfenster definiert (gating) und

einzelnd analysiert werden. In den Versuchen sind als Markerfarbstoffe

Propidiumjodid (610 nm Bandpass Filter) und Fluoreszenzisothiozyanat (FITC,

520 nm Bandpass Filter) eingesetzt worden.

3.3.1 Etablierung des Messverfahrens

Um die Kohlenhydratbindungsstellen quantifiziert darzustellen, erfolgte zur

Etablierung des Messsystems zunächst eine Untersuchung mit α-D-Mannose-PAA-

FITC. Zur Wahl der Messeinstellung des Durchflusszytometers wurde zunächst je eine

Messung mit Spermatozoen in HBS-Puffer, denen entweder nur Propidiumjodid-

Lösung oder nur immobilisierte Zucker (FITC-Konjugat) zugesetzt wurden,

durchgeführt. Bei den unter Kapazitationsbedingungen durchgeführten

Untersuchungen erfolgte eine zusätzliche Messung der Spermien mit den zu

untersuchenden Zuckern in Tyrode-Kapazitationsmedium (HARRISON 1993), um das

Gerät für alle nachfolgenden Untersuchungen desselben Tages einzustellen. Während

der gesamten Untersuchungsreihe wurden bei einer Messung jeweils 10.000 Zellen

(400-600 Spermienzellen pro Sekunde) im Trägermedium ausgewertet.

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Material und Methoden

4141

Bei jeder Messung betrug das Probenvolumen 1 ml, in das 5 µl Propidiumjodid-

Stammlösung als Lebend-Tot-Kontrolle sowie BSA (5 µg/ml) zugesetzt wurden, um

unspezifische Bindungen zu verhindern.

3.3.2 Bestimmung der optimalen Inkubationszeit bei der

durchflusszytometrischen Untersuchung der Mannose-Bindungsstrukturen

Um die optimale Inkubationszeit für den Nachweis mannosebindender Strukturen auf

der Spermienoberfläche festzustellen, wurden kinetische Vorversuche zu

verschiedenen Zeitpunkten durchgeführt. In einer Konzentration von 3 µg/ml HBS-

Puffer wurden mit α-D-Mannose-PAA-FITC markierte Spermiensuspensionen jeweils

nach 1, 3, 5, 7 10 und 15 Minuten durchflusszytometrisch untersucht. Für den weiteren

Versuchsablauf wurde nach dieser Untersuchung eine Inkubationszeit von 3 Minuten

festgelegt.

3.3.3 Bestimmung der optimalen Zuckerkonzentration bei der

durchflusszytometrischen Untersuchung der Mannose-Bindungsstrukturen

In diesem Vorversuch wurde die optimale Zuckerkonzentration bei einem

Probenvolumen von 1 ml ermittelt. Jeweils nach einer Zeitspanne von 3 Minuten

wurden verschiedene Konzentrationen von 0,5 µg, 1 µg, 2 µg, 5 µg und 8 µg jeweils

pro Milliliter Probenvolumen durchflusszytometrisch gemessen. Nach der

Untersuchung ergab sich ein Optimum der Fluoreszenz für 2-5 µg des Reagenzes/ml

Probenvolumen. Für die weiteren Versuche wurde eine Zuckerkonzentration von

3 µg/ml Trägermedium festgelegt.

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Material und Methoden

4242

3.3.4 Durchflusszytometrische Untersuchung der Veränderungen in der

Mannose/Galaktose Bindung unter Kapazitationsbedingungen

Nach dem heutigen Wissensstand ergibt sich die Hypothese, dass sich die

Bindungsstellen der Spermatozoen während des Kapazitationsvorganges verändern.

Daher wurden die Spermien in diesem Versuchsabschnitt in ein spezielles

Kapazitationsmedium (Tyrode-Medium) überführt und gemessen.

Die Messungen erfolgten 3, 15 und 30 Minuten nach Überführen der Spermatozoen in

das Tyrode-Medium. Während der Inkubationszeiten wurden die Probenröhrchen in

einem CO2-Brutschrank (Nuaire US Autoflow, Zapf, Langenhagen) bei 39 °C

aufbewahrt. Die durchflusszytometrische Bestimmung der mittleren Fluoreszenz der

Spermienpopulationen erfolgte unverzüglich nach der Entnahme der inkubierten

Spwermiensuspensionen aus dem Brutschrank. Die Inkubation der Spermien wurde

mit α-D-Mannose-PAA-FITC, α-Galaktose-PAA-FITC sowie mit β-Galaktose-PAA-

FITC durchgeführt. Jeder Zucker wurde zu einer Endkonzentration von 3 µg/ml

Tyrode-Medium hinzupipettiert und die mittlere Intensität der Fluoreszenz mit Hilfe

der Flow Max Software ermittelt. Als Negativkontrolle wurde bei α-D-Mannose-

PAA-FITC eine 0,5 M α-Methylmannopyranosid Lösung eingesetzt. Bei den

Galaktosen wurde jeweils eine Kontrolle mit 0,5 M Laktose-Lösung durchgeführt.

Um die proportionale Umverteilung innerhalb der Population lebender Zellen zu

beobachten, wurde eine Einteilung in vier Quadranten vorgenommen (Abb. 3).

Quadrant 1 (Q1) beeinhaltet die toten Zellen mit niedriger Fluoreszenz der

gebundenen Zucker, während Quadrant 2 (Q2) die toten Spermienzellen repräsentiert,

die eine hohe Fluoreszenz aufweisen. Im Quadrant 3 (Q3) werden die lebenden

Spermienzellen mit niedriger Fluoreszenz dargestellt. Die hohe Fluoreszenz lebender

Zellen zeigt Quadrant 4 (Q4). Die Darstellung der Umverteilung konnte mit dem

Einfügen sogenannter „Gatings“ (Messfenster) erreicht werden, wobei die Trennung

der Population mit hoher Zuckerbindungskapazität von der Spermienpopulation mit

niedriger Fluoreszenz der Zucker erfolgte. Vor der Messung wurde die Trennung

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Material und Methoden

4343

durch Gatings vorgenommen, festgelegt und während der gesamten

durchflusszytometrischen Analyse konstant gehalten.

Abb. 3: Darstellung eines Punktdiagrammes (Dot Blot) der durchflusszytometrischen

Analyse

Q1: Tote Zellen mit niedriger Fluoreszenz; Q2: Tote Zellen mit hoher Fluoreszenz

Q3: Lebende Zellen mit niedriger Fluoreszenz; Q4: Lebende Zellen mit hoher

Fluoreszenz

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Material und Methoden

4444

3.4 Fluoreszenzmikroskopie

Durch fluoreszenzmikroskopische Untersuchungen sollten mannosebindende

Strukturen auf der Oberfläche der Spermatozoen sichtbar gemacht werden. Es wurden

wie bei der Durchflusszytometrie Spermatozoen in Tyrode-Medium inkubiert und

jeweils 3, 15 und 30 Minuten nach der Inkubation Spermienausstriche angefertigt, die

eine Stunde luftgetrocknet wurden. Die Fixation erfolgte mit Paraformaldehydlösung.

Um unspezifische Bindungsstellen zu blockieren, wurden die Ausstriche mit

PBS/10 % BSA in einer feuchten Kammer über Nacht bei 4 °C inkubiert. Danach

wurde Mannose-PAA-FITC in 100 µl Portionen auf die Objektträger gegeben. Die

Inkubation mit Mannose-PAA-FITC (20 µg/ml in PBS/1 % BSA) in einer feuchten

Kammer bei 37 °C wurde 60 Minuten durchgeführt. Zum Waschen wurden die

Objektträger 3 x 10 Minuten in PBS geschwenkt. Die Objektträger wurden mit 50 µl

Glycerin-PBS-Gemisch (9:1; Mountingpuffer) beschichtet und mit einem

Deckgläschen versehen. Bis zur Fluoreszenzmikroskopie wurden die Objektträger

unter Lichtabschluss aufbewahrt.

Als Negativkontrolle wurde bei einem Ausstrich vor der Zugabe von Mannose-PAA-

FITC eine Lösung von 0,5 M α-Methylmannopyranosid auf einen Objektträger

gegeben und unter den oben genannten Bedingungen inkubiert.

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Material und Methoden

4545

3.5 Explant-Assay

Für den Versuchsabschnitt wurden die Ejakulate von zwei klinisch gesunden,

institutseigenen Ebern verwendet. Für die Versuche wurde ausschließlich die

spermienreiche Fraktion des Ejakulates eingesetzt.

Am örtlichen Schlachthof wurden am Tag des Versuches zwei Eileiter von

verschiedenen Altsauen gewonnen, die in 4 °C gekühlter PBS-Lösung transportiert

wurden. Die Eileiter von postpuberalen Sauen wurden ausgewählt, da sie

ausgeprägtere Epithelfalten aufweisen und sich dadurch zur Explantgewinnung besser

eignen als solche von Jungsauen. Der Zyklusstand der Tiere konnte für diesen

Versuchsansatz vernachlässigt werden (GEHLHAAR et al. 2000).

3.5.1 Gewinnung der Explante

Die Eileiter wurden im Labor in eine mit frischer, gekühlter PBS-Pufferlösung

vorbereitete Petrischale (Greiner GmbH, Frickenhausen) überführt. Mit Hilfe einer

anatomischen Pinzette (TBH GmbH, Langenhagen) und einer Schere mit zwei spitzen

Schenkeln (Aesculap, TBH GmbH, Langenhagen) wurde das Eileitergekröse

(Mesosalpinx) vom Eileiter (Abb. 4/1) entfernt. Zur weiteren Präparation wurden eine

Mikropinzette (Dumont forceps 45°, Fine Science Tools GmbH, Heidelberg) und eine

Mikroschere mit zwei spitzen Schenkeln und einer Schnittfläche von drei Millimetern

(Mini-Vannas, Fine Science Tools GmbH, Heidelberg) verwendet. Nachdem das

Gekröse nahezu vollständig abpräpariert war, konnte der Eileiter mit der Schere

longitudinal eröffnet werden. In einer mit Parafin gefüllten Petrischale wurde der

Eileiter unter leichtem Zug mit zwei grauen Kanülen (0,7 x 30mm, Luer Lock,

Heiland, Hamburg) fixiert und das Epithel mit PBS-Lösung feuchtgehalten. Aus den

Epithellängsfalten (Abb. 4/2) des kaudalen Isthmus des Oviduktes wurden nun die

Explante (0,5-1mm, Abb. 4/3) unter einem Stereomikroskop (Zeiss 475003, Jena) mit

Hilfe der Mikroinstrumente gewonnen. Für den Versuch wurden nur die Explante

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Material und Methoden

4646

verwendet, die sich bei der anschließenden Prüfung mit Hilfe des Inversmikroskopes

(IM 35, Zeiss, Jena) durch ihre Größe, einen vorhandenen Epithelsaum sowie gute

Zilienbewegung als tauglich erwiesen. Die ausgewählten Explante wurden in kleinen

mit TALP-Medium gefüllten Petrischalen (35 x 10 mm, Greiner GmbH,

Frickenhausen) bis zum Versuchsbeginn im Kühlschrank gelagert.

Abb. 4: Schematische Darstellung der Explantgewinnung:

1 = Querschnitt durch den Eileiter

2 = Längsschnitt durch den Eileiter

3 = Explant (im Verhältnis etwas vergrößert)

1 2 3

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Material und Methoden

4747

3.5.2 Koinkubation der Explante mit den Spermatozoen

In einer kleinen Petrischale wurden zwei Explante in 60 µl TALP-Medium im

Brutschrank (Nuaire US Autoflow, Zapf, Langenhagen) für fünf Minuten bei 39 °C

und fünf Prozent CO2 Begasung äquilibriert. Gleichzeitig wurden auch die in einem

Eppendorfgefäß vorverdünnten Spermatozoen und eine Gewebekulturschale mit vier

Nocken (35 x10 mm, Greiner GmbH, Frickenhausen) in den Brutschrank verbracht.

Zu diesen Explanten wurde nach Ablauf der fünf Minuten die 10 µl

Spermiensuspension (105 Spermien/ml TALP-Medium) hinzugegeben und unter

denselben Bedingungen für weitere fünfzehn Minuten koinkubiert. Die Explante

wurden nun in einer Gewebekulturschale mit Nocken je 2 x in 60 µl TALP-Medium

gewaschen. Ein mit Silikonrahmen (Silicone Stopcock Grease, Dow-Corning, Serva

Feinbiochemica, Heidelberg) versehener Objektträger (IDL, Interessengemeinschaft

der Laborffachhändler, GmbH + Co KG) wurde mit frischem, vorgewärmten TALP-

Medium (60 µl) beschickt und die Explante mit Hilfe der Mikropinzette auf den

gewärmten Objektträger aufgegeben und mit einem Deckglas abgedeckt.

3.5.3 Videomikrographie der gebundenen Spermien am Explant

Mit Hilfe des Inversmikroskopes, welches mit einer Videokamera (Kappa, CF 8/1),

einem Monitor (WV-BM 1400, Panasonic) und einem Videorecorder (SLV-

E 720,VHS, Sony) gekoppelt war, wurde der Versuch dokumentiert. Der Objektträger

wurde auf dem Deckglas liegend auf den Mikroskoptisch verbracht und die Explante

in ihrer Gesamtheit bei einer 50,4 fachen (6,3 x 8) Vergrößerung gefilmt. Zusätzlich

wurden von jedem Explant drei Fragmente (Teilstücke) in der 256 fachen (32 x 8)

Vergrößerung aufgenommen. Durch das Drehen der Mikrometerschraube des

Inversmikroskopes konnten die gebundenen Spermatozoen in allen Ebenen erfaßt und

gezählt werden. Nachdem alle Versuche durchgeführt und aufgezeichnet waren,

erfolgte die Auswertung in der 256 fachen Vergrößerung mit Hilfe einer am Monitor

befestigten Folie, auf der jedes Spermium mit einem Folienstift markiert wurde.

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Material und Methoden

4848

Um die Größe der gefilmten Explante und Fragmente bestimmen zu können, wurde an

jedem Versuchstag eine Skalierung (OT, 0,01mm2, Olympus) in den beschriebenen

Vergrößerungen auf der Videokassette festgehalten. Die Flächenausmessung wurde

mit Hilfe des computergestützten Flächenmeßprogrammes „ AIDA “ (mika medical

GmbH, Bildanalyse Ver. 2.0, Copyright 1992, Rosenheim) durchgeführt. Zu diesem

Zweck wurde der Computer (Dell 450/M, Germany) mit einem Monitor (Trinitron,

Germany) und dem Videorekorder gekoppelt. Die während des Versuches

aufgenommene Skalierung wurde vor Beginn der Berechnungen gespeichert. Durch

Umfahren des Explantes bzw. des Fragmentes (im Standbild) mit der Maus des

Computers konnte die Fläche der Explante und Fragmente errechnet werden.

3.5.4 Berechnung des Bindungsindexes

Durch die gezählten Spermien und die mit dem Flächenmessprogramm gemessene

Größe des Explantes konnte der Bindungsindex mit einem SAS-Computerprogramm

ermittelt werden. Definiert ist der Bindungsindex als die mittlere Anzahl der gezählten

und am Explant gebundenen Spermien pro 0,01 mm2 Explantfläche (PETRUNKINA

et al. 2001)

BIE = (SG1 + SG2 + SG3 ) / (FF1 + FF2 + FF3)

BIE = Bindungsindex der an das Explant gebundenen Spermien

SG1,2,3 = Anzahl der gebundenen Spermien an das Fragment des jeweiligen Explantes

FF1,2,3 = Gemessene Fläche des Fragmentes eines Explantes

BI= (BIE1+ BIE2) / 2

BIE1 + BIE2 sind die Bindungsindices des ersten und zweiten Explantes, die

gleichzeitig im Versuch verwendet wurden.

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Material und Methoden

4949

3.5.5 Kompetitive Hemmungsversuche

Bei diesen Versuchen sollte eine mögliche Beteiligung verschiedener Spermadhäsine

bei der Interaktion der Spermatozoen mit den Oviduktepithelzellen untersucht werden.

Dazu wurden zu den vorinkubierten Explanten und Spermien Spermadhäsine gegeben,

so dass Spermien und Spermadhäsine miteinander um die Strukturen der

Oviduktepithelzellen konkurrieren konnten. Die Versuchsbedingungen entsprechen

denen in 3.5-3.5.4 beschriebenen. Eine signifikant herabgesetzte Anzahl (p < 0,05) der

gebundenen Spermien war ein Hinweis auf die Beteiligung des kompetitiv

eingesetzten Spermadhäsins bei der Spermatozoen-Oviduktepithelzellbindung. Als

Spermadhäsine wurden vergleichsweise AQN-1 und AWN-2 in verschiedenen

Konzentrationen (1,25 µM – 20 µM) eingesetzt.

In einem weiteren Versuch wurden verschiedene Kohlenhydrate eingesetzt und ihre

Rolle als Inhibitionssubstanzen untersucht. Bei einer Konzentration von 3 µM wurden

2-Fukosyl-Laktose, 3-Fukosyl-Laktose, Mannopentaose, N-Acetyl-Neuraminyl-

Laktose und β-Laktose (Sigma, Aldrich) zu den vorinkubierten Explanten gegeben

und in ihrer Fähigkeit, die Spermatozoenbindung an das Eileiterepithel zu

beeinflussen, verglichen.

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Ergebnisse

5050

4 Ergebnisse

Durch die Spermadhäsine wird eine Gruppe von Proteinen repräsentiert, die

oberflächenassoziiert den Spermatozoen aufliegen. Hinsichtlich ihrer physiologischen

Funktion wird den Spermadhäsinen sowohl eine Rolle bei der initialen Bindung der

Spermatozoen an die Zona pellucida der Eizelle als auch bei der Etablierung des

Spermienreservoirs zugedacht. Verschiedene Spermadhäsine aus dem porcinen

Seminalplasma sind proteinbiochemisch charakterisiert, allerdings stehen

Untersuchungen im Spermienreservoir des weiblichen Genitaltraktes zur

Identifizierung des Rezeptorsystems beim Schwein noch aus. Zu diesem Zweck

wurden im Rahmen dieser Arbeit Untersuchungen auf proteinbiochemischer Ebene,

durchflusszytometrische und fluoreszenzmikroskopische Untersuchungen, sowie

kompetitive Hemmversuche im Explant-Assay durchgeführt.

4.1 Isolierung der Seminalplasmaproteine

Das Seminalplasma setzt sich aus den Sekreten von Hoden, Nebenhoden und

akzessorischen Geschlechtsdrüsen zusammen und weist einen hohen Gehalt

unterschiedlicher Proteine auf. Ein Einfluß der Seminalplasmaproteine auf die

Spermienfunktion bei der Spermien-Epithelzell-Interaktion bei der Kapazitation sowie

als Protektor während der Ejakulation und des Transportes im weiblichen Genital wird

diskutiert. Mit einem reverse phase HPLC System konnten 16 Proteinfraktionen aus

dem zellfreien Eberseminalplasmapool isoliert werden. Davon sind sechs Fraktionen

als Spermadhäsine mittels massenspektrometrischer Untersuchung (Malditof, Kratos

Analytical V 5.2) identifiziert worden (Tab. 4). Die Identifizierung erfolgte für die

Spermadhäsine PSP-1, PSP-2, AWN-1, AWN-2, AQN-1 sowie AQN-3. Das

entsprechende Chromatogramm ist in Abbildung 5 dargestellt. Für die weiteren

Untersuchungen wurden die gekennzeichneten Proteinfraktionen aufgefangen,

dialysiert und gefriergetrocknet.

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Ergebnisse

5151

Abb. 5 : Chromatogramm der Spermadhäsine aus porcinem Seminalplasma,

aufgetrennt über ein reverse phase HPLC System; Säule: C18 (ET 250/10,

Nucleosil 100-7), Durchfluss = 2ml/min; Range = 2 AU; Wellenlänge = 220 nm;

Papier 2mm/min; Gradienten von 25-70 % in 60 Minuten und von 70 – 90 %

in 10 Minuten

I = PSP-1, II = AQN-1, III = PSP-2, IV = AQN-3, V = AWN-1, VI = AWN-2

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Ergebnisse

5252

Tab. 4: Massenspektrometrie der Spermadhäsine; Vergleich der gemessenen zur

errechneten relativen Molekülmasse in Dalton (Da).

Spermadhäsin Relative Molekülmasse (Da)

Gemessener Wert Errechneter Wert

PSP-1 12.170,9 12.297,04

AQN-1 11.832,9 11.833,2

PSP-2 12.657,7 12.646,46 (GlcNAc)

AQN-3 12.883,0 12.884,6

AWN-1 14.774,5 14.776,05

AWN-2 15.066,9 14.818,05 (GlcNAc)

4.2 Nachweis von mannosebindenden Proteinen im Seminalplasma

Um festzustellen, ob die im Seminalplasma isolierten Spermadhäsine sich, wie in der

Literatur beschrieben, als mannosebindend herausstellen, wurden Untersuchungen

durchgeführt, bei denen die Kohlenhydratbindungseigenschaften charakterisiert

werden konnten.

Die Fraktionen der Seminalplasmaproteine, die über das reverse phase HPLC System

aufgetrennt und fraktioniert aufgefangen wurden, eigneten sich für die weitere

Proteinuntersuchung in der SDS-Gelelektrophorese. In der SDS-Gelelektrophorese

wurden die isolierten Seminalplasmaproteine PSP-1, PSP-2, AWN-1/2, glykosiliertes

AWN-1/2, AQN-1 sowie AQN-3 aufgetrennt (Abb. 6 A). Die relative Molekülmasse

der isolierten Seminalplasmaproteine lagen im Vergleich zum

Molekulargewichtsstandard im Bereich von 11-15 kDa.

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Ergebnisse

5353

Im Western-Ligand-Blot (Abb. 6 B) sind mannosebindende Fraktionen nachgewiesen

worden. Neben den dominierenden Proteinbanden von PSP-1/2 wurden zusätzliche

Banden im Bereich von 31 kDa dargestellt. In diesem Fall handelt es sich vermutlich

um aggregierte Formen dieses Proteins. Des weiteren ergab die Untersuchung bei

AQN-3 und AWN-1 je eine Bandenbildung mit geringerer Intensität. Mit diesem

Verfahren konnte bei der glykosylierten Form von AWN-1 keine Reaktion mit α-D-

Mannose nachgewiesen werden.

Bei AQN-1 wurden deutliche Signale mit geringfügig größeren relativen

Molekülmassen nachgewiesen. Hierbei handelt es sich höchstwahrscheinlich um

aggregierte Formen von AQN-1.

Abb. 6 : Auftrennung der Seminalplasmaproteine (Spermadhäsine) mittels SDS-

Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese (A) und dazugehöriger Western-Ligand-Blot (B)

mannosebindener Proteine. Der Western-Ligand-Blot wurde auf eine Mannosebindung

getestet.

1 = AQN-3; 2 = AQN-1; 3 = Glykosyliertes AWN1/2; 4 = AWN1/2; 6 = PSP-1/2

In der Spur 5 wurde kein Protein aufgetragen.

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Ergebnisse

5454

4.3 Nachweis von Spermadhäsinen im Spermienextrakt

Da die Spermatozoen vor der Extraktion durch eine Dichtegradientenzentrifugation

vorbehandelt waren, stellte sich am Anfang der Untersuchungen die Frage, ob die

Spermadhäsine nach der Zentrifugation in ausreichender Menge isoliert werden

können. Nach den Versuchen konnte kein negativer Einfluß durch Percoll® in Bezug

auf die Spermadhäsinassoziation sowie in den Bindungseigenschaften der Spermien

festgestellt werden.

Für die Isolierung des Proteins sollte zunächst eine Methode gefunden werden, die es

erlaubte möglichst viel Protein zu extrahieren. Vergleichsweise wurden Extrakte mit

OGP-Extraktionspuffer und mit Extraktionspuffer/1 % Chaps angefertigt. Als

effektivere Auszugsmöglichkeit der Spermadhäsine wurde für die Extraktion in den

folgenden Versuchen Extraktionspuffer/1 % Chaps verwendet. In der Abbildung 7 ist

die Auftrennung der extrahierten Proteine vergleichsweise sowohl mit OGP-

Extraktionspuffer als auch mit Extraktionspuffer/1 % Chaps im SDS-Gel zu sehen.

Abb. 7: Auftrennung der Spermienextraktproteine mittels SDS-Polyacrylamid-Gel-

Elektrophorese (18 %); 1, 2 und 3 = OGP-Extraktion; 4 und 5 = Extraktion durch

Extraktionspuffer/ 1 % Chaps

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Ergebnisse

5555

4.4 Nachweis von kohlenhydratbindenden Proteinen im Spermienextrakt

Da im Vorfeld nicht eindeutig geklärt werden konnte, ob bei Percoll® gewaschenen

Spermien noch mannosebindende Proteine vorhanden sind, wurde zur Klärung dieser

Frage im Dot Blot Verfahren eine Chemilumineszenzanalyse durchgeführt. Zum

Vergleich wurde neben den aufgetragenen Spermienextrakten in verschiedenen

Konzentrationen reverse phase HPLC gereinigtes AQN-1 sowie AQN-3 aufgetragen.

Die PVDF Membran wurde mit α-D-Mannose-Biotin, sowie nach dem Waschen mit

alkalischer Peroxidase/Streptavidin inkubiert.

Bei der Analyse der isolierten Proteine wurden positive Signale im Bereich der

Spermienextrakte (Abb. 8, I A, I B) festgestellt. AQN-3 (Abb. 8, II C) zeigte eine

geringere Bindung von α-D-Mannose-Biotin als AQN-1 (Abb. 8 II A). Dabei wurden

aufgrund der höher eingesetzten Konzentration stärkere Signale bei AQN-1 und AQN-

3 dargestellt als bei den Spermienextrakten (Abb. 8, II A/B/C). Als

Kandidatenproteine kommen zu diesem Zeitpunkt der Untersuchung sowohl AQN-1

als auch AQN-3 in Frage.

Abb. 8 : Nachweis mannosebindender Proteine des Spermienextraktes im Dot Blot

Verfahren

I A = 10 µl (ca. 50 µg) Spermienextrakt; I B = 20 µl (ca. 100 µg) Spermienextrakt;

II A = 20 µl (ca. 15 µg) AQN-1; II B = 30 µl (ca. 20 µg) AQN-1;

II C = 10 µl (ca. 15 µg) AQN-3

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Ergebnisse

5656

Der Extrakt wurde in verschiedenen Konzentrationen im Dot Blot System auf seine

Kohlenhydratbindungseigenschaften untersucht. Die eingesetzten Zucker α-Mannose-

PAA-Biotin, α-Galaktose-PAA-Biotin und β–Galaktose-PAA-Biotin zeigten alle gute

Bindungseigenschaften, wobei die extrahierten Proteine bevorzugt eine Bindung mit

Mannose eingingen. Die Spermienextrakte von percollgewaschenen Spermien wiesen

bereits bei niedrigen Konzentrationen (Abb. 9, 5/6µg) deutliche Signale bei der

Mannosebindung auf. In der Abbildung 9 sind die mit den verschiedenen Zuckern

behandelten PVDF Membranen zu sehen. Es wurde deutlich, dass Mannose gegenüber

a-und ß-Galaktose bevorzugt gebunden wurde.

Abb. 9: Dot Blot Analyse des Spermienextraktes

Die Spermienextrakte wurden in abnehmenden Konzentrationen (1 = ca. 100 µg,

2 = ca. 50 µg; 3 =ca. 25 µg; 4 =ca. 12,5 µg; 5 =ca. 6,2 µg; 6 =ca. 3,1 µg) aufgetragen.

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Ergebnisse

5757

4.5 Nachweis von AQN-1 im Spermienextrakt

Das Spermadhäsin AQN-1 zeigte in der Western Blot Analyse eine sehr hohe Affinität

zu α-D-Mannose. Dieses Ergebnis stützt das Konzept, dass die Bindung porciner

Spermien über die Bindung von assoziierten Spermadhäsinen an mannosehaltige

Oligosaccharide des Epithels vermittelt wird. Da mannosebindende Proteine im

Spermienextrakt durch die Dot Blot Analyse nachgewiesen wurden und AQN-1 sich

bereits durch seine hohe Affinität zu Mannose im Western-Blot zu erkennen gab,

wurde AQN-1 näher untersucht.

Der Spermienextrakt wurde im 18 % SDS-Gel aufgetrennt und anschließend im

Western-Blot analysiert. Unter Verwendung von AQN-1 spezifischen polyklonalen

Antikörpern konnte ein intensives Signal im Bereich von 14 kDa nachgewiesen

werden (Abb.10). Dies bedeutete, dass im Spermienextrakt das Spermadhäsin AQN-1

vorhanden war. Als Positivkontrolle wurde ein HPLC gereinigtes AQN-1 aufgetragen.

AQN-1 konnte im Spermienextrakt charakterisiert werden.

Abb. 10: Nachweis von AQN-1 im Spermienextrakt mittels Western Blot Analyse

A/E = 5 µl (ca. 25 µg) Spermienextrakt =, B = AQN-1 (ca. 20 µg) Positivkontrolle,

C = 10 µl (ca. 50 µg) Spermienextrakt, G = 2 µl (ca. 12 µg) Spermienextrakt;

In den Spuren D/F wurde kein Spermienextrakt aufgetragen.

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Ergebnisse

5858

4.6 Isolierung der Spermienextraktproteine

Da bei vorangegangenen Untersuchungen sowohl AQN-1 als auch AQN-3 eine

Mannosebindung zeigten, wurden zur Absicherung der Ergebnisse der Western Blot-

und Chemilumineszenz Analyse weiterführende Untersuchungen durchgeführt.

Die gewonnenen Spermienextrakte wurden mit der reverse phase HPLC aufgetrennt

und fraktioniert aufgefangen (Abb. 11). Die einzelnen Fraktionen wurden lyophilisiert

und massenspektrometrisch analysiert. Aus der massenspektrometrischen Analyse

ging eindeutig hervor, dass es sich bei den isolierten Fraktionen vorwiegend um die

Spermadhäsine AQN-1 und AQN-3 handelte (Tab.5). Andere Proteine konnten durch

die massenspektrometrische Analyse nicht eindeutig zugeordnet werden.

Abb. 11: Chromatogramm der AQN-1 (1) und AQN-3 (2) Isolierung aus dem

Spermienextrakt über ein reverse phase HPLC System; Säule: C18 (ET 250/4,

Nucleosil 300-5), Durchfluss = 800 µl/min; Range = 1,0 AU; Wellenlänge = 220 nm;

Gradient = 5-60 % in 120 Minuten; Papier: 2 mm/min

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Ergebnisse

5959

Tab. 5 : Massenspektrometrische Analyse der Spermadhäsine AQN-1 und AQN-3;

Vergleich der gemessenen zur errechneten relativen Molekülmasse in Dalton (Da)

Spermadhäsine Relative Molekülmasse (Da)

AQN-1 Gemessener Wert:

11.823,9

Errechneter Wert:

11.833,2

AQN-3 12.844,1 12.884,6

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Ergebnisse

6060

4.7 Nachweis mannosebindender Proteine an ejakulierten, Percoll

gewaschenen Spermien mittels durchflusszytometrischer Analyse

Vor Beginn des Versuches lag die Vermutung nahe, dass sich die zuckerbindenden

Strukturen der Spermien während des Kapazitationsprozesses ändern. Durch die

vorangegangenen Ergebnisse wurde Mannose als der Zucker identifiziert, zu dem das

Spermadhäsin AQN-1 die höchste Bindungsaffinität besitzt. Ob und in welchem

Umfang die Bindungsstellen für Mannose sich bei der Kapazitation verändern, zeigte

dieser Versuchsabschnitt.

Die Kapazitation wurde mit dem Tyrode-Medium im Brutschrank bei 39 °C und

5 % CO2 Begasung induziert. Die durchflusszytometrischen Analysen wurden 3, 15

und 30 Minuten nach der Inkubation durchgeführt.

Während der Kapazitation halbierte sich die Fluoreszenz der mit Mannose markierten

Spermienzellen, wobei ein stetiger Anstieg der Fluoreszenz der mit

β-Galaktose inkubierten Spermien zu verzeichnen war. Die Fluoreszenzkurve der

α-Galaktose (Abb. 12) zeigte eine geringgradige Verminderung der Bindungsstellen

im Laufe der Kapazitation.

Die Abbildung 13 zeigt die Umverteilung von Spermien mit unterschiedlichen

Zuckerbindungsaffinitäten innerhalb der Population lebender Zellen. Die verwendeten

Daten wurden aus einem Quotienten von Quadrant 4 zu Quadrant 3 ermittelt (siehe

Material und Methoden, 3.3.4). Die Vergrößerung dieses Wertes entspricht der

Umverteilung der Zellen aus den Quadranten mit niedriger Fluoreszenz zu hoher

Fluoreszenz. Die Verkleinerung des Quotienten entspricht einer Abwanderung der

Zellen von einem Quadranten mit hoher Fluoreszenz zu niedriger Fluoreszenz. Bei der

Berechnung der proportionalen Verschiebung innerhalb der Population lebender

Zellen inkubiert mit Mannose-PAA-FITC wurde bei einem anfänglichen Mittelwert

der Proportion der lebenden Zellen von 3,8 (nach 3 Minuten) nach 30 Minuten eine

stark verminderte proportionale Verteilung von 1,0 festgestellt. Im Gegensatz dazu hat

sich die Proportion der lebenden Zellen von ß-Galaktose-PAA-FITC inkubierten

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Ergebnisse

6161

Spermien im Laufe der Kapazitation bei einem anfänglichen Wert von 0,04 stark

vergrößert, bereits nach 30 Minuten konnte ein Mittelwert von 3,08 errechnet werden.

Die mit a-Galaktose-PAA-FITC inkubierten Spermienpopulationen zeigten eine

geringgradige Vergrößerung der proportionalen Verteilung der Zellen mit höherer und

niedrigerer Fluoreszenz während des Kapazitationsprozesses (siehe Material und

Methoden, 3.3.4). Diese Ergebnisse zeigen eine signifikante Verschiebung der

Population der mit a-D-Mannose-PAA-FITC gebundenen Spermien in den niedrigen

Signalbereich; im Gegensatz zu einer massiven Verschiebung der ß-Galaktose-PAA-

FITC gebundenen Spermienzellpopulation in den höheren Signalbereich.

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Ergebnisse

6262

Abb. 12: Darstellung der Bindungsintensität von kapazitierten Spermatozoen unter

Einfluß von α-Galaktose-, β-Galaktose- und α-D-Mannose-PAA-FITC

Abb. 13: Proportionale Verteilung von Spermien mit unterschiedlichen

Zuckerbindungsaffinitäten innerhalb der Population lebender Zellen

0

1

2

3

4

5

6

0 5 10 15 20 25 30 35Inkubation, min

Pro

port

ion

alpha-gal beta-gal man

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

0 5 10 15 20 25 30 35Inkubation, min

Inte

nsitä

t

alpha-gal beta-gal man

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Ergebnisse

6363

4.8 Nachweis von mannosebindenden Strukturen auf der

Spermienoberfläche

Durch Fluoreszenzmikroskopie sollten mannosebindende Strukturen auf den

Plasmamembranen der Eberspermien lokalisiert werden. Die Spermien wurden im

Tyrode-Medium inkubiert. Zu verschiedenen Zeitpunkten (3, 15, und 30 Minuten)

nach der Inkubation wurden Spermienausstriche angefertigt, die mit Mannose-PAA-

FITC beschickt wurden. Um eine unspezifische Bindung auszuschließen, wurde die

Rezeptorenbindung spezifisch mit 0,5 M α-Methylmannopyranosid gehemmt. Die

Abbildung 14 zeigt den Nachweis von mannosebindenden Strukturen an ejakulierten,

percollgewaschenen Spermien im Hellfeld (A) und im Fluoreszenzlicht (B). Bei

intakten Spermien ist der mannoseerkennende Bereich im akrosomalen Bereich des

Spermienkopfes lokalisiert. Nach der Kapazitation konnten die fluoreszierenden

Signale im akrosomalen Teil des Spermienkopfes nach 30 Minuten nicht mehr

nachgewiesen werden.

A B

Abb. 14: Fluoreszenzmikroskopischer Nachweis von mannosebindenden Strukturen

auf der Spermienoberfläche:

A: Spermium vor der Kapazitation im Hellfeld; B: Spermium mit mannosebindenden

Strukturen im apikalen Bereich dargestellt im Fluoreszenzlicht.

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Ergebnisse

6464

4.9 Explant-Assay

Um das komplementäre Rezeptorsystem, das für die Etablierung des

Spermienreservoirs beim Schwein verantwortlich ist, untersuchen zu können, wurden

mit Hilfe des Explant-Assays kompetitive Hemmversuchsreihen durchgeführt

(GEHLHAAR et al. 2000). Für die Untersuchungen wurden etwa 1mm große

Gewebestückchen aus den Longitudinalfalten des kaudalen Isthmus des Oviduktes von

frisch geschlachteten Sauen verwendet. Die Bindung von Spermien an das

Oviduktepithel wurde als Bindungsindex (Material und Methoden, 3.5.4) quantifiziert.

Der Bindungsindex stand in einer linearen Beziehung zu der Menge hinzugegebener

Spermatozoen. Damit war die mathematische Grundlage gegeben, um kompetitive

Hemmversuche sowie Rezeptorstudien durchführen zu können.

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Ergebnisse

6565

4.9.1 Vergleich von AQN-1 und AWN-2 im Explant-Assay

Im Explant-Assay wurden die Spermadhäsine AQN-1 und AWN-2 auf ihre

inhibitorischen Fähigkeiten getestet (Abb. 15). Jedes Protein wurde in einer

abfallenden Konzentrationsreihe von 20 µM bis 1,25 µM zu den Explanten gegeben.

Um die inhibitorische Aktivität zu vergleichen, wurde für AQN-1 ein IC50-Wert von

4,6 µM ermittelt. Durch das Spermadhäsin AWN-2 konnte keine spezifische

Hemmung erreicht werden.

Abb. 15: Einsatz von AQN-1 und AWN-2 im Explant-Assay

0

20

40

60

80

100

120

0 5 10 15 20 25

Konzentration (µM)

Bin

dung

sind

ex (S

perm

ien

/ 0.0

1 m

m2 )

AWN-2 AQN-1

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Ergebnisse

6666

4.9.2 Vergleich der inhibitorischen Wirkung von 2-Fukosyl-Laktose, 3-Fukosyl-

Laktose, Mannopentaose, N-Acetyl-Neuraminyl-Laktose und β-Laktose im

Explant-Assay

Um zu überprüfen, ob außer Mannose auch andere Zucker bei der Spermienbindung

eine Rolle spielen, wurden im Explant-Assay Vergleichszucker in bezug auf die

Hemmbarkeit der Spermienbindung eingesetzt. Alle verwendeten Substanzen wurden

bei einer Konzentration von 3 µM gegen eine Kontrolle verwendet. Aus der Abbildung

16 ist ersichtlich, dass gegen die Kontrolle eine hohe signifikante Inhibition von

Mannopentaose ausging (p ≤ 0,0001), die von der Grundstruktur zum

Oligomannosyltyp gehört, hervorging. 2- (p ≤ 0,0003) bzw. 3-Fukosyl-Laktose

(p ≤ 0,0009) wirkten ebenfalls signifikant hemmend auf die Spermienbindung. Eine

nicht signifikante Inhibition zeigten bei dieser Untersuchung β-Laktose und N-Acetyl-

Neuraminyl-Laktose (p ≥ 0,05).

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Ergebnisse

6767

0

10

20

30

40

50

60

70

80

Kontrolle N-Acetyl-Lak. beta-Lak. 3-Fuk.-Lak. 2-Fuk.-Lak. Mannopent.

Mittelwert Standardabw.

Abb. 16 : Einsatz von N-Acetyl-Neuraminyl-Laktose, β-Laktose, 3-Fukosyl-Laktose,

2-Fukosyl-Laktose und Mannopentaose im Explant-Assay, aufgeführt als

Bindungsindices.

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Diskussion

6868

5 Diskussion

Der Schweinebestand in der Bundesrepublik Deutschland betrug im Jahr 2001 rund 26

Mio. Tiere. Von den rund 2,5 Mio. Zuchtsauen wurden im Wirtschaftsjahr 1998/99

etwa 63 % künstlich besamt.

Am Beispiel der Schweiz wird deutlich, dass der Anteil der künstlichen Besamung von

20 % im Jahre 1995 auf 43 % im Jahre 2001 angestiegen ist; dies verdeutlicht, wie

wichtig die Kenntnisse der Befruchtung aus veterinärmedizinischer Sicht sind. Durch

die künstliche Besamung kommt es international zu einem Strukturwandel und zu

einer Professionalisierung in der Schweineproduktion. Durch die Anwendung der

künstlichen Besamung kommen nur Besamungseber zum Einsatz, die bezüglich

Fruchtbarkeit, Mast- und Schlachtleistung und Erbfehlerfrequenzen positiv zum

züchterischen Fortschritt beitragen. Die Wirtschaftlichkeit in der Ferkelerzeugung

wird vor allem durch die Anzahl der je Sau und Jahr abgesetzten und verkauften

Ferkel bestimmt.

Mit Hilfe der künstlichen Besamung ist es möglich, die Schweinezucht ökonomischer

zu gestalten. Da trotz mehrjähriger Erfahrung im Umgang mit der künstlichen

Besamung die Korrelation von Ovulationszeitpunkt und Besamungszeitpunkt

Schwierigkeiten mit sich bringt, ist es notwendig, die Befruchtungsvorgänge weiter zu

erforschen. Durch detailierte Grundlagenkenntnisse des Befruchtungsprozesses wird

die Tierproduktion zukünftig optimiert werden.

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Diskussion

6969

5.1 Die Interaktion zwischen Spermium und Oviduktepithel ist ein

kohlenhydratvermittelter Prozess

Nach der Ejakulation bzw. nach der künstlichen Besamung werden die Spermatozoen

bis zur Ovulation der Eizelle im Isthmus des Oviduktes gespeichert. An diesem

Prozess scheinen beim Schwein kohlenhydratbindende Proteine aus dem männlichen

Genitaltrakt beteiligt zu sein. Diese oberflächenassoziierten Proteine verhalten sich

wie Lektine und binden an Kohlenhydratstrukturen des Oviduktepithels. Sie werden

nach DOSTALOVA et al. (1995) während des Kapazitationsprozesses entfernt; damit

sind die Spermatozoen in der Lage, sich vom Epithel des Oviduktes zu lösen. Nach der

Ablösung bzw. nach der Kapazitation können die Spermien nicht mehr an das

Eileiterepithel binden (FAZELI et al. 1999). Untersuchungen von GEHLHAAR et al.

(2000) ergaben, dass epididymale Spermien eine verminderte Bindungsfähigkeit

gegenüber ejakulierten Spermatozoen besitzen. Daher lag die Schlußfolgerung nahe,

dass während der Ejakulation durch den Kontakt mit dem Seminalplasma aus den

akzessorischen Geschlechtsorganen Substanzen auf die Spermienoberfläche gelangen,

die die Bindung an das Eileiterepithel ermöglichen.

Bei verschiedenen Tierarten konnte gezeigt werden, dass ein

Kohlenhydraterkennungsmechanismus für die Bildung des funktionellen

Spermienreservoirs beim Säuger verantwortlich ist. Grundlegende Arbeiten sind von

IGNOTZ et al. (2001) beim Rind durchgeführt worden, die bei dieser Spezies eine

Beteiligung von Fukose nachweisen konnten. Entsprechende Untersuchungen von

WAGNER et al. (2001) konnten für das Schwein Oligomannosylstrukturen als

dominantes Signal zeigen. Die lektinhistochemischen Studien von WAGNER

et al. (2001) werden als Hinweis gewertet, dass ähnlich wie beim Rind auch beim

Schwein lektinähnliche Proteine für die Spermien-Oviduktbindung verantwortlich

sind.

Durch TÖPFER-PETERSEN et al. (2002) wurde festgestellt, dass Mannosyl-

Oligosaccharide von den Epithelzellen im weiblichen Genitaltrakt exprimiert werden,

die eine hohe Affinität zu spermienassoziierten Lektinen aufweisen. Diese

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Diskussion

7070

Untersuchungen gaben den Anstoß, die Spermadhäsine auf ihre

Mannosebindungsfähigkeit hin zu untersuchen.

Spermadhäsine gehören zu einem neuartigen Typ von Lektinen, deren

Kohlenhydraterkennungsdomäne bisher nicht eindeutig geklärt ist. Die Einteilung der

Lektine erfolgt über ihre Erkennungsdomäne (CRD Carbohydrate Recognition

Domain). Lektine gehören zu den kohlenhydratbindenden Proteinen ohne

enzymatische Aktivität. Erstmalig wurden sie im Pflanzenreich gefunden. In letzter

Zeit wurde zunehmend erkannt, dass sie auch bei biologischen Vorgängen im

Tierreich eine große Rolle spielen (CALVETE et al. 1995).

Die Spermadhäsine assozieren bei der Ejakulation an die Spermatozoenmembran.

Durch die Kohlenhydratbindungseigenschaft nehmen sie eine sehr wichtige Stellung

bei den kohlenhydratvermittelten Interaktionen der Zellen beim Befruchtungsvorgang

ein. Die Oviduktzellbindung und die Interaktion zwischen den Gameten scheint durch

verschiedene Spermadhäsine vermittelt zu sein (GABIUS 1997).

EKHLASI-HUNDRIESER (2000) und VON RAD (2002) konnten bei in vitro

Versuchen beobachten, dass das Spermadhäsin AQN-1 α-D-Mannose erkennt und mit

einer Dissoziationskonstanten im Bereich von 10-7 M bindet.

Die eigenen gelelektrophoretischen Untersuchungen mit anschließender Western-

Ligand-Blot Analyse weisen mannosebindende Proteine im Seminalplasma des Ebers

nach. Das stärkste Signal der untersuchten Spermadhäsine zeigt AQN-1.

IGNOTZ et al. (2001) ist es gelungen, ein analoges Protein (PDC 109) mit einer

Zuckerspezifität für Fukose aus dem Seminalplasma des Bullen zu isolieren. Dieses

Protein zeichnet sich durch eine Homologie zu der heparin- und gelatinbindenden

Domäne des Fibronectin Typ II (FnII) aus. Es wird in der Samenblase sezerniert und

assoziiert während der Ejakulation mit der Spermienoberfläche (TÖPFER-PETERSEN

et al. 1998). MÜLLER et al. (2002) untersuchten die Funktion des PDC 109 als

Hauptkomponente des bovinen Seminalplasmas. PDC 109 spielt bei den

Reifungsprozessen der Spermien, insbesondere bei der Kapazitation, eine Rolle. Es ist

in der Lage, mit seiner heparinbindenden Domäne spezifisch die Lipide

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Diskussion

7171

Phosphatidylcholin und Cholesterol aus der Plasmamembran von Spermien zu

extrahieren. Durch das Herauslösen des Cholesterols aus der Plasmamembran von

Spermienzellen kommt es zur Induktion der Signaltransduktionskaskaden

(ZARINTASH u. CROSS 1996), die zur Hyperaktivierung (CROSS u. RAZY-

FAULKNER 1997) und Akrosomreaktion führen. Die Fn Typ II Domäne des PDC

109 Proteins besteht aus einer zentralen Kerneinheit, die sich aus zwei antiparallelen

„β-sheets“, die nahezu rechtwinklig zueinander stehen, und zwei irregulären „Loop“-

Regionen zusammensetzt. Demgegenüber zeigt die CUB-Domäne der Spermadhäsine

zwei sandwichförmig angeordnete Faltblätter mit jeweils zwei parallelen und vier

antiparallen „β-strands“.

Das Spermadhäsin AQN-1 besitzt als sogenanntes CUB-Protein genau wie die

Proteine vom Fn Typ II sowohl eine Glykan- als auch eine Heparin-Bindungsdomäne.

Durch den Vergleich der Domänenstruktur beider Proteine kann die Hypothese

aufgestellt werden, dass AQN-1 neben der Rolle bei der Interaktion von Kohlenhydrat-

und Protein-Bindung im Spermienreservoir nach erfolgter Ovulation in die Einleitung

des Kapazitationsprozesses involviert sein könnte.

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Diskussion

7272

5.2 Die Rolle der Spermadhäsine

Beim Schwein sind die Hauptkomponenten des Seminalplasmas Proteine, die als

Spermadhäsine bezeichnet werden und sich durch ihre

Kohlenhydratbindungsfähigkeiten auszeichnen. Beim Eber konnten bisher die

Spermadhäsine AQN-1, AQN-3, AWN-1, AWN-2, PSP-1 und PSP-2 isoliert werden.

Den einzelnen Gruppen der Spermadhäsine werden verschiedene Aufgaben

zugeschrieben. Sie sollen akrosomstabilisierend sein und als Dekapazitationsfaktoren

sowie als Zona pellucida-bindende Moleküle fungieren.

Das Spermadhäsin PSP-2 bildet mit bestimmten N-Glycoformen des PSP-1 ein

Heterodimer und stellt die Hauptkomponente im Seminalplasma des Ebers dar. Die

einzelnen PSP-Proteine besitzen die Fähigkeit Heparin zu binden, wobei diese

Fähigkeit als Heterodimer verloren geht (CALVETE et al. 1995a). Untersuchungen

von ASSREUY et al. (2002) haben ergeben, dass PSP-1 und PSP-2

immunmodulatorische Aufgaben besitzen. Bei der Injektion von PSP-1/PSP-2

Heterodimeren in die Peritonäalhöhle von Ratten konnte ein Einstrom von

neutrophilen Granulozyten nachgewiesen werden. PSP-1 könnte nach Aussagen von

ASSREUY et al. (2002) über Protein-Protein-Interaktion bei der Immunmodulation

beteiligt sein. Beim Bindungsverhalten der Spermien im Spermienreservoir spielen

PSP-1 und PSP-2 daher vermutlich keine Rolle.

Das Spermadhäsin AWN bildet in seinem Syntheseort eine Ausnahme zu den anderen

Spermadhäsinen, denn es wird bereits in den Tubuli recti des Rete testis des Hodens

sowie später wieder in der Samenblase gebildet (SINOWATZ et al. 1995). Auf

molekularbiologischer und proteinbiochemischer Ebene wurde AWN von EKHLASI-

HUNDRIESER et al. (2002) zusätzlich im Nebenhodenschwanz und Prostata

nachgewiesen. Während der Nebenhodenpassage assoziiert AWN über seine

Phospholipidbindungsdomäne an die Membran der Spermien. SINOWATZ et al.

(1995) konnten mittels Western Blot Analyse AWN als einziges Spermadhäsin an

epididymalen Spermien nachweisen.

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Diskussion

7373

Von AWN sind bereits zwei Isoformen (AWN-1 und AWN-2) identifiziert worden

(SANZ et al. 1992b). Beide Polypeptidketten sind identisch, AWN-2 besitzt zusätzlich

einen N-terminalen Acetylrest. DOSTALOVA et al. (1995a) erhielten Hinweise auf

eine Beteiligung von AWN bei der Bindung der Spermatozoen an die Eizelle. In

Studien von DOSTALOVA et al. (1995a) konnte eine Bindungsfähigkeit von AWN an

solubilisierte, biotinylierte porcine Zona pellucida festgestellt werden. Die

Oligosaccharidstrukturen der Zona pellucida enthalten Galaktosestrukturen, die von

AWN erkannt werden können. AWN konnte als einziges Spermadhäsin durch eine

elektronenmikroskopische Darstellung nach einer in vivo Insemination identifiziert

werden (RODRIGUEZ-MARTINEZ et al. 1998). AWN weist nach Untersuchungen

von TÖPFER-PETERSEN et al. (1998) eine Hauptbindungsdomäne für Galaktose

sowie eine Unterdomäne für Sialsäure und N- Acetylhexosamin auf.

In der Samenblase sowie in der Prostata des Ebers werden AQN-1 und AQN-3

zusammen mit anderen Spermadhäsinen sezerniert. AQN-1 bildet Aggregate, die

während der Ejakulation als eine Schutzschicht um den akrosomalen Bereich des

Spermienkopfes gelagert und bei der Kapazitation wieder abgelöst werden. Durch die

Anlagerung der Spermadhäsine wird das Spermium vor vorzeitiger Akrosomreaktion

geschützt. AQN-3 bindet nach DOSTALOVA et al. (1995b) direkt an Lipide der

Spermienmembran und wird danach von anderen Spermadhäsinen wie AQN-1

überlagert und spielt daher bei der Bindung im Spermienreservoir keine entscheidene

Rolle.

AQN-1 und AWN-2 schienen als Spermadhäsine in bezug auf die

Kohlenhydratbindungseigenschaften interessant zu sein. Bei der eigenen Western-

Ligand-Blot Analyse zeichnete sich AWN-2 im Vergleich zu AQN-1 allerdings durch

eine geringere Affinität zu Mannose aus. Daher lag die Vermutung nahe, das AWN bei

der Etablierung des Spermienreservoirs nicht beteiligt zu sein scheint. Um diese

Hypothese zu überprüfen, wurden AQN-1 und AWN-2 im Explant-Assay eingesetzt.

Die Ergebnisse des Explant-Assays bestätigen die Vermutung, dass AWN nicht an der

Bildung des Spermienreservoirs beteiligt ist, da sich die Bindung zwischen

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Diskussion

7474

Oviduktepithelzellen und Spermatozoen durch Zugabe von AWN nicht hemmen läßt.

Demgegenüber zeigt AQN-1 eine signifikante inhibitorische Aktivität bei einer IC50

von 4,6 µM. Da epididymale Spermien nach Aussagen von PETRUNKINA et al.

(2001b) nur vermindert in der Lage sind, an das Eileiterepithel zu binden, liegt die

Vermutung nahe, dass AQN-1 der putative Rezeptor ist, der an der Etablierung des

Spermienreservoirs beteiligt ist.

5.3 Nachweis von AQN-1 auf percollgewaschenen Spermien

Bisher wurden wenige Untersuchungen an Spermien nach einer

Dichtegradientenzentrifugation mit Percoll® durchgeführt Untersuchungen an

humanen Spermien von TANPHAICHITR et al. (1988) zeigten, dass in bezug auf die

Fertilisationsrate keinerlei Unterschiede bestehen zwischen percollgewaschenen und

solchen Spermien die im Swim-up Verfahren aufgereinigt wurden. Da unklar war, ob

die Spermadhäsine sich nach dem Percollverfahren noch auf der Spermienoberfläche

befinden wurden Western-Ligand-Blot Analysen durchgeführt.

Der Nachweis von AQN-1 auf percollgewaschenen Spermien konnte durch die eigene

Western-Ligand-Blot Analyse eines Spermienextraktes erbracht werden. In der Dot

Blot Analyse konnte nachgewiesen werden, dass die Spermienextrakte mit α-D-

Mannose, α-Galaktose und β-Galaktose eine Bindung eingehen. Bevorzugt wurde

bereits bei niedrigen Konzentrationen α-D-Mannose gebunden. Im Spermienextrakt

percollgewaschener Spermien sind demnach kohlenhydratbindende Proteine

nachzuweisen, die in der Lage sind, Mannose zu binden. Eine Aufarbeitung mittels

reverse phase HPLC des Spermienextraktes diente zur Isolierung eines Proteins, das

sich nach der massenspektrometrischen Analyse als AQN-1 mit einer relativen

Molekülmasse von 11.823 kDa herausstellte. Diese Untersuchung hat gezeigt, das die

Dichtegradientenzentrifugation mit Percoll eine schonende und effektive

Waschmethode darstellt, die die für die Etablierung des Spermienreservoirs

funktionelle Spermienoberfläche erhält.

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Diskussion

7575

5.4 Kohlenhydratbindungsstellen des Spermatozoens während der

Kapazitation

Um die Spermien nach der Ejakulation in die Lage zu versetzen, die Befruchtung

durchzuführen, sind zahlreiche physiologische und biochemische Veränderungen

essentiell. Die Kapazitation kann nur eingeleitet werden, wenn Proteine des

Seminalplasmas, die den Spermien aufliegen, entfernt oder umgewandelt werden

(YANAGIMACHI 1994). Diese Proteine werden als Dekapazitationsfaktoren

bezeichnet. Nach der Ejakulation ist ein Spermium mit 12 – 60 Millionen Molekülen

Spermadhäsinen AQN-1, AQN-3, PSP-1, AWN-1 und AWN-2 überzogen. Während

der in-vitro Kapazitation reduziert sich die Anzahl der Moleküle auf 5 - 6 Millionen

pro Spermatozoon (DOSTALOVA et al. 1994).

Durch Untersuchungen, bei denen die Kapazitation durch spezielle Medien

herbeigeführt wird, können die durch Umbauprozesse veränderten Protein-

Kohlenhydrat-Bindungsstellen der Spermienmembran deutlich gemacht werden.

Durch lektinhistochemische Studien von WAGNER et al. (2001) lagen Hinweise vor,

dass Glykanstrukturen vom Mannose- und Galaktosetyp sowie

N-Acetylglucosamin - Typ vom gesamten weiblichen Genitaltrakt exprimiert werden.

Der Nachweis verschiedener Zuckerstrukturen führte zu der Überlegung, dass die

Proteinrezeptoren der Spermienoberfläche sich während der Kapazitation verändern.

Da die eigene Dot Blot - Analyse des Spermienextraktes bereits Anhaltspunkte auf die

bevorzugten Zucker lieferte, wurde die durchflusszytometrische Analyse unter

Kapazitationsbedingungen ausschließlich mit α-D-Mannose, α-Galaktose sowie β-

Galaktose durchgeführt. Die Untersuchungen von WAGNER et al. (2001) trugen zur

Auswahl der in der durchflußzytometrischen Untersuchung eingesetzten Zucker bei.

Durch die Ergebnisse des Explant-Assays wurde bestätigt, dass N-Acetylglucosamin

in bezug auf die Spermienbindung im Spermienreservoir vernachlässigt werden

konnte, denn besonders Mannopentaose mit Mannosylrest war in der Lage, die

Spermienbindung an das Epithel kompetitiv zu hemmen.

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Diskussion

7676

Die durchflusszytometrische Analyse während der Kapazitation ergab eine 50 % ige

Verminderung der Fluoreszenz der mit Mannose markierten Spermienzellen im

Zeitraum von 30 Minuten im Vergleich zu unkapazitierten Spermatozoen. Im

Gegensatz dazu vergrößerten sich die Bindungsstellen für β-Galaktose kontinuierlich,

während die Intensitätskurve für α-Galaktose das Maximum nach ca. 15 Minuten

erreichte.

Diese Ergebnisse unterstreichen die Hypothese, dass die Bindung im

Spermienreservoir durch Mannosestrukturen herbeigeführt wird und dass nach der

Ablösung vom Epithel Galaktosestrukturen bei der Interaktion mit der Zona pellucida

der Eizelle eine Rolle spielen. Anhand der eigenen Experimente kann postuliert

werden, dass bei kapazitierten Spermien eine hohe Bindungsfähigkeit für Galaktose

bzw. eine niedrige Bindungsaffinität für Mannose vorliegt.

Mit den fluoreszenzmikroskopischen Versuchen konnten mannosebindende Strukturen

am apikalen Rand ejakulierter, percollgewaschener Spermien durch

Mannose-PAA-FITC nachgewiesen werden. Es konnte gezeigt werden, dass sich die

Fluoreszenz im Laufe der Kapazitation verlor.

Mittels durchflußzytometrischer Untersuchungen an Bullenspermien konnten von

REVAH et al. (2000) kohlenhydratbindende Strukturen auf der apikalen Membran des

Spermiums detektiert werden. Beim Spermienreservoir des Bullen konnte Fukose als

proteinbindende Zuckerstruktur identifiziert werden (IGNOTZ et al. 2001). Eine

intensive Fluoreszenz im Bereich der akrosomalen Region wurde durch REVAH et al.

(2000) ebenfalls beobachtet. IGNOTZ et al. (2001) konnten nachweisen, dass die bei

lebenden, unkapazitierten Spermien vorhandene Fluoreszenz im Bereich des

Akrosoms nach der Kapazitation nicht mehr vorhanden ist.

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Diskussion

7777

5.5 Abschlussbetrachtung

Ohne eine genaue Kenntnis der Bindungspartner, die für die Etablierung des

Spermienreservoirs eine Rolle spielen, kann der Mechanismus der Steuerung der

Modulation der Spermienfunktion nicht bestimmt werden. Um die Spermien-Ovidukt-

Interaktion des Schweines näher zu charakterisieren, wurde diese Arbeit angefertigt.

Aus den vorliegenden Daten ist es möglich, ein Bindungsmodell (Abb. 17) beim

Schwein zu entwickeln.

Im Verlauf der Spermienreifung assoziiert AWN mit der Membran der Spermatozoen.

Zusätzlich bilden weitere Spermadhäsine wie AQN-1 eine Schutzschicht, indem sie

den direkt mit der Membran verbundenen Spermadhäsinen (AWN) aufgelagert

werden. Die akrosomintakten, nicht kapazitierten Spermien binden über AQN-1 an das

Epithel des Eileiters. Um den Ovulationszeitpunkt herum wird durch noch unbekannte

Signale die Kapazitation induziert und AQN-1 Bindungsstellen gehen verloren.

Dadurch wird AWN „demaskiert“ und steht für die Interaktion mit der Zona pellucida

zur Verfügung.

Abb. 17: Modell der Assoziation von AQN-1 auf der Spermienoberfläche (siehe

5.5,Abschlussbetrachtung); nach der Loslösung werden Bindungsstellen für Galaktose

exprimiert (AWN).

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Diskussion

7878

Da die Rolle von AQN-1 bei der Spermien-Ovidukt-Interaktion nur zu einem kleinen

Teil beleuchtet werden konnte, ist es notwendig, die Funktion der Spermadhäsine

weiter zu untersuchen, um das Rezeptorsystem vollständig zu identifizieren. Einige

Forschergruppen (BALL et al. 1997, IGNOTZ et al. 2001, GREEN et al. 2001)

konnten bei verschiedenen Spezies unterschiedliche Kohlenhydrate beschreiben, die

an der Interaktion von Spermatozoen und Epithelzellen des weiblichen Genitaltraktes

beteiligt sind. Durch die Ergebnisse von HESS (1998) und SIMON (2002) sind

tierartübergreifende Bindungen von Spermatozoen an Oviduktzellkulturen des

Schweins erzielt worden. Die Ergebnisse sprechen dafür, dass sich der

Bindungsmechanismus zwischen den einzelnen Spezies in den Grundlagen ähnelt.

Um die Beteiligung von AQN-1 im Kapazitationsprozess näher zu charakterisieren,

sollten in weiteren Untersuchungen Spermienextrakte vor und nach der Kapazitation in

vitro mittels HPLC und anschließender Massenspektrometrie analysiert werden. Sollte

sich die oben beschriebene Hypothese durch diese Untersuchungen bestätigen, könnte

die Funktion von AQN-1 im Explant-Assay unter Kapazitationsbedingungen mit Hilfe

monoklonaler Antikörper (Anti-AQN-1) detailliert charakterisiert werden. Die vom

Ovidukt exprimierten Spermienrezeptoren können mit Hilfe moderner Proteom-

analytik weiter charakterisiert werden, damit beide Seiten des Rezeptorsystems

identifiziert werden können.

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Zusammenfassung

7979

6 Zusammenfassung

Katrin Gohr: Interaktion von Spermatozoen und Oviduktepithelzellen in vitro zur

Identifizierung des Rezeptorsystems am porcinen Modell.

Bei den höheren Säugetieren müssen die Spermatozoen für eine erfolgreiche

Befruchtung umfassende Zell-Zell-Interaktionen im weiblichen Genitaltrakt eingehen.

Die beteiligten molekularen Zielstrukturen, die in diesem komplexen Geschehen als

Ligand bzw. Rezeptor fungieren, sind bisher noch nicht identifiziert und

charakterisiert.

Aus physiologischer Sicht ist bekannt, dass die Spermatozoen an das Oviduktepithel

des kaudalen Isthmus des Eileiters binden und dort das Spermienreservoir bilden, um

bis zum Zeitpunkt der Ovulation ihre Vitalität aufrechtzuerhalten. Gleichzeitig kommt

es durch die Bindung zu einer Selektion intakter, befruchtungsfähiger Spermien und zu

einer Begrenzung der Spermienzahl am Befruchtungsort durch gezielte Loslösung

sowie zu einer Regulation der Hyperaktivierung und Kapazitation.

Unterschiedliche molekulare Strukturen sind an diesen zellulären Wechselwirkungen

beteiligt. So exprimiert das Epithel des weiblichen Genitaltraktes auf der

Zelloberfläche Oligosaccharidstrukturen, während auf der Spermienmembran

kohlenhydratbindende Proteine assoziiert vorliegen.

Am Aufbau der Oligosaccharidstrukturen ist Mannose beteiligt, hinsichtlich des

Rezeptorsystems der Spermatozoen gibt es bisher wenige Hinweise. Im Rahmen der

vorliegenden Arbeit sollte im porcinen Tiermodell daher die physiologische und

funktionelle Bedeutung von Ligand und Rezeptor näher untersucht werden.

Zu diesem Zweck wurden zunächst Seminalplasmaproteine aus porcinen Ejakulaten

isoliert. Nach der SDS-Poylacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) und

anschließendem Western-Ligand-Blot erfolgte die Identifizierung

kohlenhydratbindender Proteine. Um zu klären, ob die identifizierten Proteine nach der

Dichtegradrientenzentrifugation mit Percoll weiterhin auf der Spermienmembran

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Zusammenfassung

8080

assoziiert vorliegen, wurden Spermienextrakte angefertigt. Anschließend erfolgte die

Untersuchung der Spermienextrakte über SDS-PAGE und Western-Ligand-Blot auf

ihre Kohlenhydratbindungsfähigkeit. Zur Identifizierung der kohlenhydratbindenden

Proteine wurden die Spermienextrakte über reverse phase HPLC entwickelt und die

resultierenden Fraktionen der massenspektrosmetrischen Analyse zugeführt. Mit dem

Verfahren der Durchflusszytometrie wurden die kohlenhydratbindenden Eigenschaften

von Spermien-assoziierten Proteinen unter Kapazitationsbedingungen untersucht. Sie

wurden durch fluoreszenzmikroskopische Untersuchungen ergänzt. Mit dem Ziel die

in vivo Bedingungen zu imitieren, wurden kompetitive Hemmversuche mit den

Spermadhäsinen AQN-1 und AWN-2 in Explant-Assays durchgeführt.

Folgende Ergebnisse wurden erzielt.

1. Die Seminalplasmaproteine des Ebers konnten isoliert und mittels

massenspektrometrischer Analyse als Spermadhäsine identifiziert werden.

2. Die Untersuchung des Spermienextraktes resultierte im Nachweis einer

Proteinbande mit 12 kDa. Über Massenspektrometrie wurde das Spermadhäsin

AQN-1 identifiziert.

3. Durchflusszytometrische Messungen unter Kapazitationsbedingungen zeigten in

einem Zeitraum von 30 Minuten einen massiven Verlust der

Mannosebindungsstellen auf den Spermatozoen sowie eine Zunahme der α- und

β-galaktosebindenden Strukturen.

4. In den fluoreszenzmikroskopischen Untersuchungen konnten mannosebindende

Strukturen im apikalen Bereich der Spermienköpfe ejakulierter,

percollgewaschener Spermien lokalisiert werden. Während des

Kapazitationsprozesses verschwanden die Mannosebindungsstellen völlig.

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Zusammenfassung

8181

5. Im Explant-Assay konnte festgestellt werden, dass eine signifikante Hemmung

der Spermienbindung durch AQN-1 an das Oviduktepithel erreicht wird. Die

inhibitorische Aktivität von AQN-1 konnte mit einer IC 50 von 4,6 µM berechnet

werden. Bei der Verwendung verschiedener Modellzucker wurde die

Spermienbindung an das Oviduktepithel ausschließlich durch Mannopentaose

(Mannosylrest) inhibiert.

Die vorliegenden Daten verdeutlichen die besonderen

Kohlenhydratbindungseigenschaften von AQN-1 im weiblichen Genitaltrakt und

stützen die Vorstellung, dass AQN-1 als putativer Rezeptor die Bindung der Spermien

an das Oviduktepithel im Bereich des porcinen Spermienreservoirs vermittelt.

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Summary

8282

7 Summary

Katrin Gohr: Identification of the receptor system involved in the interaction between

spermatozoa and epithelial cells of the porcine oviduct in vitro.

In higher mammals cell-cell-interactions within the female genital tract are of crucial

importance for a successful fertilisation. So far the molecular nature of the

orchestrating ligand and receptor molecules involved in this tightly regulated scheme

are neither identified nor characterised.

In the pig it is well documented that spermatozoa are bound to the epithelial layer of

the caudal isthmus of the oviduct, thus generating a reservoir of sperm cells and in

addition maintaining their vitality until the point of ovulation. Simultaneously, intact

and fertile spermatozoa are selected, a local restriction of the number of spermatozoa

is achieved by the mechanism of controlled release of adhered spermatozoa, and,

finally, the processes of hyperactivation as well as capacitation is initiated.

The surface molecules involved in the cellular interaction and recognition processes

differ with respect to their molecular structures. Whereas mannose residues containing

oligosaccharides are expressed on the surface of the epithelial cells of the female

genital tract, carbohydrate binding proteins are associated with the outer membrane of

spermatozoa. However, data detailing the nature of the receptor molecules attached to

the spermatozoa are rare. It was the aim of the present investigation to characterise

ligand and receptor molecules biochemically and to analyse their physiological and

functional role in the porcine model in greater detail.

Initially, seminal plasma proteins were isolated from porcine ejaculates. Following

size fractionation by electrophoresis in SDS-polyacrylamidgels (SDS-PAGE)

carbohydrate binding proteins were identified by Western blotting. Protein extracts

were obtained from spermatozoa centrifuged in a Percoll density gradient in order to

clarify whether these proteins are associated to the sperm membrane. Subsequently, by

SDS-PAGE and Western-blotting these extracts were tested for their capacity to bind

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Summary

8383

carbohydrates. For further analysis, sperm protein extracts were run by reverse phase

HPLC and the resulting peak fractions exhibiting carbohydrate binding activity were

analysed by mass spectrometry. Flow cytometric techniques were used to measure

alterations of the carbohydrate binding activity of spermatozoa associated proteins

during the process of capacitation. These analyses were supplemented by fluorescence

microscopy. Using explant assays imitating in vivo conditions competitive inhibition

experiments were performed with the spermadhesins AQN-1 and AWN-2.

The following results were obtained:

1. Boar sperm seminal plasma proteins were isolated from ejaculates.

Subsequently, mass spectrometry resulted in the identification of spermadhesins.

2. Analysis of protein extracts isolated from spermatozoa by SDS-PAGE revealed

a protein of 12 kDa. After further analysis by mass spectrometry this protein was

identified as spermadhesin AQN-1.

3. Using the technique of flow cytometry a rapid decline of mannose binding sites

paralleled by an increase of binding sites for α- and β-galactose was observed within a

time period of 30 minutes after initiating the capacitation process of spermatozoa.

4. The data obtained by flow cytometric analysis are consistent with results

generated by fluorescence microscopy. Whereas mannose binding sites were localised

within the apical part of sperm heads of ejaculated and Percoll purified spermatozoa,

these mannose binding sites, however, disappeared completely during the capacitation

process.

5. In explant assays it was demonstrated that spermadhesin AQN-1 is able to

significantly. inhibit the binding of spermatozoa to the epithelial layer of the oviduct

Its inhibitory activity was estimated to be IC50 ~ 4,6 µM. Additionally, among the

various sugar compound tested herein only mannopentaose inhibited the binding of

spermatozoa to the epithelial layer of the oviduct.

These data show in detail the binding properties of spermadhesin AQN-1 for different

carbohydrates within the porcine female genital tract. Further, they strongly suggest

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Summary

8484

that AQN-1 functions as a putative receptor mediating binding of spermatozoa to the

epithelial layer of the oviduct at the site of the sperm reservoir.

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Anhang

104104

9 Anhang

9.1 Rezeptverzeichnis

Percoll® -Lösungen (Sigma-Aldrich, P-1644, Deisenhofen), 35 % und 70 %

Zusammensetzung nach HARRISON et al. (1982)

1.) 10-fach konzentrierte Saline-Hepes-Stammlösung:

1,4 M Natriumchlorid

200 mM Hepes

90 mM Glucose

25 mM Kaliumhydroxid (1M KOH)

Alle Substanzen werden in 70 ml Aqua dest. gelöst und der pH-Wert auf 7,4

eingestellt. Danach wird mit Aqua dest. auf 100 ml Lösung aufgefüllt und der pH-

Wert bei 7,6 festgelegt. Die Stammlösung kann eingefroren gelagert werden.

2.) Lösung M

10,8 g der Saline-Hepes-Stammlösung werden sterilfiltriert und mit Aqua dest. auf

100 ml aufgefüllt. Zu dieser Lösung werden 250 µl Gentamycinsulfat in einer

Konzentration von 20 mg/ml hinzugegeben. Der pH-Wert wird auf 7,4 eingestellt und

die Osmolarität gemessen. Der Messwert wird als m in die Formel [ siehe 5.)]

eingesetzt (mOsm/kg ~ 295).

3.) Percoll®-Lösung in unverdünnter Form

Percoll ® sollte vor dem Messen der Osmolarität Raumtemperatur erreicht haben.

Der Messwert wird als p in die Formel [siehe 5.)] eingesetzt (mOsm/kg ~ 15).

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Anhang

105105

4.) Lösung 1+9

5,4 g der Saline-Hepes-Stammlösung werden sterilfiltriert und mit 50,9 g unverdünnter

Percoll®-Lösung aufgefüllt. Die Osmolarität wird gemessen und der gemessene Wert

als dp in die Formel [siehe 5.)] eingesetzt (mOsm/kg ~ 350).

5.) Rechnung

I.) Oa = 0,1 x (10 m + 9 p)

= ~ 310

II.) R = [Oa - (0,1 x dp)] / (0,9 x dp)

= ~ 0,85

III.) Vp = (10 m - 295) / [R x (295 - p)]

= ~ 11

6.) Herstellung der Percoll®-Gebrauchslösungen

I. 100 %ige Percoll®-Gebrauchslösung:

= (Vp - 9) x 1,13 x 5 g Percoll® +Lsg. 1+9

=(Vp - 9) x 5,65 g Percoll®-Lösung + Lsg. 1 +9

Lösung vorsichtig schwenken

Osmolarität messen; Wert sollte bei~ 295 mOsm/kg liegen.

II. 35 %ige Percoll®-Gebrauchslösung:

•Eine Hälfte der 100 % igen Gebrauchslösung nehmen(= V1)

• Mit Lösung M auf V2 auffüllen

• V2 = V1 x 100 / 35

Lösung vorsichtig schwenken

III. 70 % ige Percoll®-Gebrauchslösung:

• andere Hälfte der 100 % igen Gebrauchslösung nehmen ( = V1 )

•Mit Lösung M auf V3 auffüllen

• V3 = V1 x 100 / 70

Lösung vorsichtig schwenken

Die hergestelltenGebrauchslösungen sind im Kühlschrank ungefähr 14 Tage haltbar.

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Anhang

106106

9.1.1 Spermienextrakte

Extraktionspuffer/1 % Chaps:

10 mM Tris/HCl

10 % Saccharose

1 % SDS

1 mM PMSF

1 mM EDTA

1 % Chaps

OGP-(N-Octyl ß-D Glucopyranoside) Extraktionspuffer:

10 mM Tris/HCl

10 % Saccharose

2 % OGP

1 mM PMSF

1 mM EDTA

pH 7,2

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Anhang

107107

Tab. 6: Polyacrylamidgele

18 % Trenngel:

10 ml

30 % Acrylamidlösung (Roth, Karlsruhe): 6,0 ml

1,5 M Tris/HCl pH 8,8: 2,5 ml

10 % SDS Ultrapure (Roth, Karlsruhe): 100µl

Aqua bidest.: 1,3ml

TEMED (Serva, Heidelberg): 4,0 µl

10 % Ammoniumpersulfat (Serva, Heidelberg) 100µl

4,5 % Sammelgel:

3 ml

30 % Acrylamidlösung (Roth, Karlsruhe): 0,5 ml

1,0 M Tris/HCl pH 6,8: 0,38 ml

10 % SDS Ultrapure (Roth, Karlsruhe): 30 µl

Aqua bidest.: 2,1 ml

TEMED (Serva, Heidelberg): 3,0 µl

10 % Ammoniumpersulfat (Serva, Heidelberg) 30 µl

Elektrodenlauf-Puffer:

25 mM Tris

192 mM Glycin

0,1 % SDS (w/v)

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Anhang

108108

Laemmli-Auftragspuffer (nach LAEMMLI 1970):

50 mM Tris

2 % SDS (w/v)

10 % Glycerin

1 Spatelspitze Bromphenolblau

pH 6,8

Ponceaufärbelösung:

0,5 % Ponceau Rot (Roth, Karlsruhe) in 1 % Essigsäure

Blotting-Puffer:

0,039 M Glycin

0,048 M Tris

0,0375 % SDS (w/v)

20 % Methanol (v/v)

TBS/0,1 % Tween :

50 mM Tris/HCL

150 mM Na Cl

5 mM EDTA

0,025 % Sodiumazid

pH 7,4

Detektionspuffer:

0,1 M Tris

0,1 M Na Cl

pH 9,5

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Anhang

109109

NBT-Lösung (Nitroblautetrazoliumchlorid) :

75 mg/ml NBT (Applichem, Darmstadt) in 70 % Dimethylformamid

BCIP-Lösung (5-Brom-4-Chlor-3-Indolyl Phosphat p-toluidine salt) :

50 mg/ml BCIP (Applichem, Darmstadt) in 100 % DMF

NBT/BCIP Farbreaktionslösung:

50 µl NBT-Lösung

40 µl BCIP-Lösung

20 ml Detektionspuffer

Coomassie Brilliant Blue-Färbung (CBB) :

2g/l Coomassie Blue R 250 (Serva, Heidelberg 35051)

0,5 g/l Coomassie Blue G 250

426 ml/ l Ethanol ( 96 %)

50 ml/ l Methanol

100 ml/ l Eisessig

CBB-Entfärbelösung:

20 % Methanol

10 % Eisessig

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Anhang

110110

9.1.2 Durchflusszytometrie

Tyrode-Medium, mod. (Kapazitationsmedium):

Zusammensetzung nach HARRISON (1993)

96 mM NaCl

3,1 mM KCl

2,0 mM CaCl2

0,4 mM MgSO4 x 6 H2O

0,3 mM Na2PO4

5,0 mM Glucose

21,6 mM Na-Lactat

1,0 mM Na-Pyruvat

15 mM NaHCO3

20 mM Hepes

0,3 % BSA,

0,001 % Phenolrot

pH 7,4

9.1.3 Fluoreszenzmikroskopie

Paraformaldehydlösung:

5 g Paraformaldehyd auf 40 ml H2O (10 % ige Lösung) + 3 Tropfen 0,75 M NaOH zur

Lösung und auf 50 ml mit Aqua dest. Auffüllen.

Fixation mit 2 % Paraformaldehydlösung und 0,2 % Glutaraldehyd.

Stoppen mit 0,1 M Glycin

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Anhang

111111

9.1.4 Explant-Assay

TALP-Medium (Tyrode-Albumin-Laktat-Pyruvat-Medium):

Zusammensetzung nach PARRISH et al. (1988)

Tab. 7: TALP-Medium

Substanz Stammlösung

(100 ml)

Gebrauchslösung (500 ml)

Menge der Stammlösung in ml

Natriumchlorid

NaCl

2,3 M 99 mM

21,7 ml

Kaliumchlorid

KCl

158 mM 3,1 mM

9,8 ml

Natriumhydrogencarbonat

NaHCO3

150 mM 15 mM

50 ml

Hepes 9,2 mM 5 ml

Natriumdihydrogenphosphat

NaH2PO4 x H2O

35 mM 0,35 mM

5 ml

Natriumlaktat 21,6 mM

Kalziumchlorid

CaCl2 x 2H2O

200 mM 2 mM

5 ml

Magnesiumchlorid

MgCl2 x 6H2O

100 mM 1,1 mM

5,5 ml

500 ml TALP-Medium werden auf einen pH-Wert von 7,4 eingestellt, sterilfiltriert

und in 50 ml Portionen bei –20 °C eingefroren. Am Versuchstag werden nach dem

Auftauen zu einer 50 ml Portion TALP-Medium 500 µl Gentamycin (50 mg/ml), 55 µl

Natriumpyruvat (2,2 mg/ml) und 0,3 g Bovines Serum Albumin (Cohn`s Fraktion V)

hinzugegeben. Die Osmolarität der Gebrauchslösung liegt bei 280-320 mOsm/kg.

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Anhang

112112

HBS-Puffer (Hepes-Buffered-Saline):

10 mM Glucose

20 mM Hepes

2,5 mM Kaliumhydroxid (1M KOH)

ph-Wert 7,5

TBS-Puffer (Tris buffered saline):

50 mM Tris

150 mM Natriumchlorid

pH-Wert 7,5

PBS-Puffer (Phosphat buffered saline):

150 mM Natriumchlorid

9,1 mM Natriumdihydrogenphosphat-Dihydrat

2,49 mM Kaliumdihydrogenphosphat

pH-Wert 7,4

Natriumchloridlösung 10 %:

1,7 M Natriumchlorid

1000 ml Aqua dest.

Formolcitrat :

modifiziert nach HANCOCK (1956)

37 %ige Formalinlösung

2,9 %ige Natriumcitratlösung , Mischungsverhältnis 1:24

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Eidesstattliche Erklärung

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10 Eidesstattliche Erklärung

Hiermit erkläre ich, dass ich die Dissertation mit dem Titel:

Interaktion von Spermatozoen und Oviduktepithelzellen in vitro

zur Identifizierung des Rezeptorsystems am porcinen Modell

selbstständig verfasst habe.

Bei der Anfertigung wurden folgende Hilfen Dritter in Anspruch genommen:

1. Am Institut für Reproduktionsmedizin der Tierärztlichen Hochschule Hannover

habe ich die Versuche mit dem im Kapitel Material und Methoden aufgeführten

Hilfen und Hilfsmitteln durchgeführt.

2. Die statistische Auswertung der Ergebnisse wurde nach Beratung mit und unter

Anleitung von Frau Dipl.-Phys. Dr. Anna Petrunkina unter Verwendung des

Statistikprogrammes SAS vorgenommen.

3. Die fachliche Beratung wurde von Frau Prof. Dr. rer. nat. Dr. med. habil. Edda

Töpfer-Petersen und Frau Dr. rer. nat. Mahnaz Ekhlasi-Hundrieser – Institut für

Reproduktionsmedizin der Tierärztlichen Hochschule Hannover übernommen.

Ich habe keine entgeltliche Hilfe von Vermittlungs- bzw. Beratungsdiensten in

Anspruch genommen. Niemand hat von mir unmittelbar oder mittelbar entgeltliche

Leistungen für Arbeiten erhalten, die im Zusammenhang mit dem Inhalt der

vorgelegten Dissertation stehen.

Ich habe die Dissertation an folgenden Institutionen angefertigt:

- Institut für Reproduktionsmedizin der Tierärztlichen Hochschule Hannover

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Eidesstattliche Erklärung

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Die Dissertation wurde bisher nicht für eine Prüfung oder Promotion oder für einen

ähnlichen Zweck zur Beurteilung eingereicht.

Ich versichere, dass ich die vorstehenden Angaben nach bestem Wissen vollständig

und der Wahrheit entsprechend gemacht habe.

Katrin Gohr

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Danksagung

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11 Danksagung

An dieser Stelle möchte ich mich ganz herzlich bei Frau Prof. Dr. Dr. Edda Töpfer-

Petersen für die Überlassung des interessanten Themas, die sehr freundliche

Aufnahme im Institut für Reproduktionsmedizin, die persönliche Betreuung und die

motivierende Unterstützung bei der Anfertigung dieser Arbeit bedanken.

Mein besonderer Dank geht an Frau Dr. Anna M. Petrunkina für ihr Engagement und

ihre tatkräftige Unterstützung bei der statistischen Auswertung der entsprechenden

Versuchsteile.

Mein persönlicher und herzlichster Dank gilt Frau Dr. Mahnaz Ekhlasi-Hundrieser und

Frau Christiane Hettel ohne deren fachliche und persönliche Betreuung ich diese

Arbeit nicht hätte anfertigen können.

Bei allen Mitarbeitern des Institutes für Reproduktionsmedizin besonders bei Frau Dr.

Silja Ebeling, Frau Christine Kochel und Frau Bianca Oldendorf möchte ich mich für

die gute Zusammenarbeit und große Hilfsbereitschaft bei der Durchführung und

Fertigstellung der Arbeit bedanken.

Den Doktoranden des gesamten Instiutes, besonders Dr. Bettina von Rad,

Dr. Frank Magnus, Eyke Jebe, Erik Olaf Piehler und Gabi Volker danke ich für die

tatkräftige Unterstützung und die angenehme Arbeitsatmosphäre. Die mir

entgegengebrachte Freundlichkeit über die reine Zusammenarbeit hinaus und die

unterhaltsamen zusammen verbrachten Stunden werde ich in guter Erinnerung

behalten.

Mein ganz großer Dank gilt meinen Eltern für ihre Anteilnahme und bereitwillige

Unterstützung in jeglicher Form, die es mir ermöglichte, mein Studium und die

Promotion in dieser Form zu absolvieren.

Mein Dank gilt auch meinem Sohn Bastian, der mich während der Fertigstellung

dieser Arbeit oft ins Labor begleitet hat und viel Geduld bewiesen hat.

Schließlich und endlich danke ich der Deutschen Forschungsgemeinschaft für die

Unterstützung des Projektes.