INAUGURAL - DISSERTATION -...
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INAUGURAL - DISSERTATION
zur
Erlangung der Doktorwürde
der
Naturwissenschaftlich-Mathematischen Gesamtfakultät
der
Ruprecht - Karls - Universität
Heidelberg
vorgelegt von
Diplom-Chemikerin Barbara-Sylvia Weigand
aus Bad Soden am Taunus
Tag der mündlichen Prüfung: 13.Juli 2006
In vitro Selektion von Ribozymen für eine Aldolreaktion –
Isolierung und Charakterisierung von Nukleinsäuren mit
katalytischen Eigenschaften
Gutachter: Prof. Dr. Andres Jäschke
Prof. Dr. Nils Metzler-Nolte
Die vorliegende Arbeit wurde in der Arbeitsgruppe von Prof. Dr. Andres Jäschke in der
Zeit von November 2000 bis September 2002 am Institut für Biochemie im Fachbereich
Biologie, Chemie, Pharmazie der Freien Universität Berlin, sowie von Oktober 2002 bis
Februar 2006 am Institut für Pharmazie und Molekulare Biotechnologie der Fakultät für
Biowissenschaften der Ruprecht-Karls-Universität Heidelberg angefertigt.
Hiermit erkläre ich eidesstattlich, dass ich die vorliegende Arbeit selbstständig und
unter Verwendung der angegebenen Quellen und Hilfsmittel angefertigt habe, sowie
wörtliche oder inhaltliche Zitate als solche gekennzeichnet habe.
Barbara-Sylvia Weigand
Danksagung
Allen voran möchte ich mich bei meinem Doktorvater Prof. Dr. Andres Jäschke für die
interessante und aufregende Themenstellung, die sehr gute Betreuung, die exzellente
Laboraustattung und die angenehmen Arbeitsbedingungen danken.
Herrn Prof. Dr. Nils Metzler-Nolte danke ich herzlich für die Bereitschaft, diese
Dissertation zu begutachten.
Ebenfalls möchte ich mich bei Herrn Prof. Dr. Volker A. Erdmann und seinen
Mitarbeitern für die ausgezeichnete Arbeitsbedingungen und die angenehme
Arbeitsatmosphäre am Institut für Biochemie der Freien Universität Berlin bedanken.
Mein Dank gilt auch allen aktuellen und ehemaligen Mitgliedern unseres Arbeitskreises
für die kollegiale und produktive Zusammenarbeit und den gemeinsamen Spaß während
der Arbeit, bei diversen Fotoshootings und nach „Feierabend“ in der Bar 1, beim Grillen
und auf dem Weihnachtsmarkt.
Der alten Berliner Truppe danke ich sehr für die schönste Zeit – ich vermisse die
legendären Erdinger Stammtische, durch die ich zum Weizenbiertrinker wurde!
Einen ganz lieben Dank an meinen Leidens- und Selektionsgenossen Dr. Andreas
Zerressen-Harte, das Warten auf den Anstieg war hart!
Ein herzliches Dankeschön an Dr. Sonja Keiper und Dr. Christian Frauendorf für ihr
reges Interesse an meiner Selektion und die vielen fachlichen und effektiven
Diskussionen am Telefon!
Dr. Roberto Fiammengo danke ich, weil er immer ganz pronto auf alles eine Antwort
weiß und sich dafür ausgiebig Zeit nimmt!
Martin Hengesbach danke ich für die vielen Tipps bei der Umsetzung der Graphiken,
Alexander Nierth für das Korrekturlesen und die Hilfe, wenn der PC nicht so wollte,
wie ich es wünschte, und Dr. Richard Wombacher für das Lesen der Einleitung und bei
der Unterstützung, wenn das Formulierungs- black-out zugeschlagen hat.
Mihaela Caprioara, Heiko Rudy und Dr. A. Mokhir danke ich für das geduldige
Massen-Messen und Dr. Franke von der Freien Universität Berlin für die vielen
MALDI-Messungen während unserer Berliner Zeit.
Bei Nancy Bakk, Marina Silbereis und Sandra Suhm möchte ich mich für die Synthesen
des Biotinakzeptors und der NHS-Ester bedanken. Vielen Dank an Dr. Felix Hausch für
die Bereitstellung des Photoamidits. Ute Hertle und Tobias Timmermann danke ich für
die NMR-Messungen
Dr. Andrea Maurer danke ich für die Hilfestellungen bei dem Format und die vielen
Tipps, gerne denke ich an unsere Damenabende in der BAR 1.
Einen ganz großen Dank an Viola Funk für ihre stets aufbauende Worte und die ganze
Organisation und Erledigung der Bürokratie, auch vor dem Umzug nach Heidelberg.
Meiner Physiotherapeutin Pernilla Beck möchte ich sehr danken, dass sie es geschafft
hat, meine Bandscheiben wieder fit zu machen und ich mich wieder vernünftig bewegen
kann!
Ein herzliches Dankeschön geht an Annika-Ricarda Jensen, die das „Lektoriat“
übernommen hat und sich durch die böhmischen Dörfer gekämpft hat.
Ganz besonders bedanken möchte ich mich bei Pernilla Beck, Mihaela Caprioara, Elena
Hartmann, Charlotte Heimerl, Dr. Sonja Keiper, Alexander Lang, Alexandra Ochs,
Thorsten Potthoff und Dr. Louis-Sebastian Sonntag für ihre Freundschaft, die vielen
aufbauenden und motivierenden Worte und die Unterstützung, vor allem in den letzten
zwei Jahren meiner Arbeit.
Mein größter Dank gilt meiner Familie, die mir alles ermöglicht, mich in jeder Situation
unterstützt hat und stets hilfreich zur Seite stand und auf die ich mich in jeder Situation
verlassen kann.
Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung................................................................................................................. 1
1.1 Ribozyme .......................................................................................................... 1 1.2 In vitro Selektion .............................................................................................. 3
1.2.1 Direkte Selektion ...................................................................................... 7 1.2.2 Direkte Selektion mit linkergekoppelten Reaktanden .............................. 8 1.2.3 Direkte Selektion mit spaltbaren Linkern............................................... 10
1.3 Die Aldolreaktion ........................................................................................... 14 1.3.1 Die Aldolreaktion in der organischen Chemie ....................................... 14 1.3.2 Natürliche Aldolasen .............................................................................. 16 1.3.3 Katalytische Antikörper.......................................................................... 17 1.3.4 Ribozyme ................................................................................................ 18
2 Zielsetzung der Arbeit .......................................................................................... 19
3 Methoden ............................................................................................................... 20
3.1 Festphasensynthese......................................................................................... 20 3.1.1 Synthese des DNA-Pools mit randomisiertem Bereich.......................... 20 3.1.2 Synthese des Dinukleotids69, 194, 195......................................................... 21
3.2 Derivatisierung der Reaktanden...................................................................... 23 3.2.1 Aktivierung von 4-Acetylbenzoesäure als NHS-Ester ........................... 23 3.2.2 Kopplung des Dinukleotids an 4-Acetylbenzoesäure-NHS-ester........... 24 3.2.3 Synthese von 4-NHS-carboxybenzaldehyd ............................................ 25 3.2.4 Synthese von 4-Biotin-LC-PEO-carboxybenzaldehyd........................... 26
3.3 Aufreinigung und Nachweis von Nukleinsäuren............................................ 27 3.3.1 Denaturierende Polyacrylamid-Gelelektrophorese................................. 27 3.3.2 Autoradiographie .................................................................................... 28 3.3.3 UV-Shadowing ....................................................................................... 28 3.3.4 Isolierung von Nukleinsäuren aus Polyacrylamidgelen.......................... 29 3.3.5 Agarosegele ............................................................................................ 29 3.3.6 Färbung mit Ethidiumbromid ................................................................. 30 3.3.7 Gelfiltration............................................................................................. 30 3.3.8 Hochdruckflüssigkeitschromatographie (HPLC) ................................... 30 3.3.9 Ethanolfällung......................................................................................... 31 3.3.10 Photometrische Quantifizierung ............................................................. 32 3.3.11 Quantifizierung durch Radioaktivität ..................................................... 32
3.4 Molekularbiologische Methoden .................................................................... 33 3.4.1 T7-Transkription..................................................................................... 33 3.4.2 T4-RNA Ligation.................................................................................... 34 3.4.3 Radioaktive 5’-Markierung durch Phosphorylierung ............................. 36 3.4.4 Reverse Transkription............................................................................. 36 3.4.5 Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ......................................................... 37 3.4.6 Klonierung .............................................................................................. 39 3.4.7 LB-Übernachtkulturen ............................................................................ 40
3.4.8 Glycerinkultur......................................................................................... 40 3.4.9 Plasmidaufreinigung (Miniprep)............................................................. 41 3.4.10 Sequenzierung......................................................................................... 41
3.5 Durchführung der in vitro Selektion............................................................... 41 3.5.1 Selektion I ............................................................................................... 41 3.5.2 Selektion II.............................................................................................. 43
3.6 Reaktionskinetiken................................... Fehler! Textmarke nicht definiert. 3.6.1 Geschwindigkeitskonstanten der immobilisierten RNA......................... 45
3.7 Kinetisches Assay mittels Gelshift ................................................................. 46 3.7.1 Gelshift mit Dinukleotidanalogon ......................................................... 46 3.7.2 Streptavidinshift mit selektierter RNA ................................................... 46
3.8 Kinetisches Assay mittels Immobilisierung ................................................... 47 4 Ergebnisse.............................................................................................................. 48
4.1 Entwicklung der Selektionsstrategie............................................................... 48 4.1.1 Erstellung der Nukleinsäurebibliotheken................................................ 50 4.1.2 Synthese des funktionalisierten Dinukleotids......................................... 52 4.1.3 Derivatisierung des Dinukleotids............................................................ 54 4.1.4 Ligation mit modifizierten Dinukleotid.................................................. 55
4.2 Evaluierung geeigneter Selektionsbedingungen............................................. 56 4.3 In vitro Selektion ............................................................................................ 64
4.3.1 Durchführung der ersten in vitro Selektion ............................................ 64 4.3.2 Durchführung der zweiten in vitro Selektion ......................................... 66
4.4 Klonierung und Sequenzanalyse..................................................................... 70 4.5 Kinetische Charakterisierung der Klone......................................................... 72
5 Diskussion .............................................................................................................. 76
5.1 Die Aldolreaktion ........................................................................................... 77 5.2 Die in vitro Selektion...................................................................................... 78 5.3 Selektierte Ribozyme der Aldolreaktion......................................................... 85 5.4 Vergleich mit einem anderen Ribozym .......................................................... 90
6 Zusammenfassung ................................................................................................ 93
7 Summary................................................................................................................ 94
8 Literaturverzeichnis ............................................................................................. 95
9 Anhang................................................................................................................. 107
9.1 Abkürzungen................................................................................................. 107 9.2 Geräte............................................................................................................ 109 9.3 Enzyme ......................................................................................................... 110 9.4 Sonstige Materialien ..................................................................................... 110 9.5 Puffer ............................................................................................................ 111 9.6 Oligonukleotide ............................................................................................ 112
1 Einleitung
1.1 Ribozyme
Noch in den achtziger Jahren des letzten Jahrhunderts wurden gewöhnlich die Begriffe
Biokatalyse und enzymatische Funktionen mit Proteinen assoziiert. Dies änderte sich
1981, als T. R. Cech die erste RNA mit katalytischer Funktion, ein sogenanntes
Ribozym (aus Ribonukleinsäure und Enzym), entdeckte. In der Gruppe um Cech konnte
gezeigt werden, dass das posttrankriptionale Spleißen des Gruppe-I-Introns aus
Tetrahymena thermophila auf einer Autokatalyse basiert. Hierbei schneidet die RNA
ein Intron aus ihrer Sequenz und ligiert die beiden flankierenden Exons.1, 2 Bald darauf
konnten S. Altman und seine Mitarbeiter nachweisen, dass die RNA-Untereinheit der
bakteriellen Ribonuclease P (RNase P) auch unabhängig von der Proteineinheit
Vorläufersequenzen vom 5’-Ende der prä-tRNA abspalten kann und so reife tRNAs
formt.3, 4 Beide Arbeiten wurden 1989 mit dem Nobelpreis für Chemie ausgezeichnet.5, 6
Die Entdeckungen der ersten beiden natürlichen Ribozyme unterstützten die Hypothese
der sogenannten RNA-Welt.7 Diese besagt, dass vor mehr als vier Milliarden Jahren
RNA gleichzeitig als Informations- und Funktionsträger gedient haben könnte und
keine Proteine existent waren. Später wurde die RNA in ihrer Funktion wahrscheinlich
durch Metallionen, Aminosäuren und andere kleine Moleküle als Cofaktoren
unterstützt. Als die zellulären Metabolismen sich weiter entwickelten, schienen die
Anforderungen an die Biokatalysatoren zu steigen, und die Triebkraft zum Übergang zu
Proteinenzymen war gegeben. Nachkommen dieser postulierten RNA-dominierten Ära
sind in der heutigen Welt in Form von natürlich vorkommenden Ribozymen zu finden
und in Organismen wie Bakterien bis hin zum Menschen präsent. Ebenso weisen noch
heute viele Cofaktoren wie ATP, Coenzym A, FAD und NAD+ Nukleotideinheiten auf,
was als Relikt der RNA-Welt angesehen werden kann.8, 9
1.1 Ribozyme 2 Bis heute sind insgesamt acht Typen natürlicher Ribozyme bekannt: Hammerhead (aus
Pflanzenviroiden)10, 11, Hairpin (aus Tabak-Virus-Ringspot-Satellit)12, Hepatitis Delta
Virus (HDV)13-15, Varkud Satellit Ribozym (aus Neurospora)16, Ribonuklease P3, 4,
Gruppe I-Intron1, 2, Gruppe II-Intron17, 18 und glmS RNA19. Allerdings ist die Katalyse
durch diese natürlichen Ribozyme auf Hydrolyse und Umesterungsreaktionen an
Phosphordiesterbindungen beschränkt.
Einer der wichtigsten Prozesse des Lebens, nämlich die Proteinbiosynthese, scheint ein
Fragment einer RNA-Welt zu sein. Bei der Proteinbiosynthese wird die Information
einer Nukleotidsequenz in die entsprechende Aminosäuresequenz mit einer spezifischen
Funktion durch das Ribosom umgeschrieben. Das Ribosom besteht aus drei, in manchen
Fällen auch vier, RNA-Molekülen mit mehreren Proteinen, wobei keine der
Proteinuntereinheit als Peptidyltransferase identifiziert wurde.20 Mit Hilfe der
Kristallstruktur der großen Untereinheit wurde festgestellt, dass der Schlüsselschritt der
Translation nur durch den Nukleinsäureanteil des Ribosoms ohne direkter Beteiligung
eines Proteins aus der Nachbarschaft am katalytischen Zentrums katalysiert wird.21, 22
Das Ribosom kann somit ebenfalls als Ribozym gelten.23
Der Entdeckung, dass sich die Funktion von Nukleinsäuren nicht nur auf das Tragen der
Erbinformation durch DNA und deren Übersetzung in Aminosäuren durch RNA
beschränkt, schließt sich die Frage an, ob RNA es vermag, über das Repertoire der
natürlichen Ribozyme hinaus weitere Reaktionen zu katalysieren.
Im Gegensatz zu Proteinen, denen 20 verschiedene Aminosäuren als Baustein zur
Verfügung stehen, kann RNA nur auf vier Bausteine, die Nukleoside Adenosin, Cytidin,
Guanosin und Uridin, zurückgreifen. Zwar steht dadurch der RNA eine geringere
Variation in der Primärstruktur verglichen mit Proteinen zur Verfügung, jedoch vermag
sie ebenso wie diese aufgrund der Ausbildung von Wasserstoffbrücken, Sekundär- und
höher geordnete Tertiärstrukturen zu formen.24-26
Sekundärstrukturen in Nukleinsäuren basieren auf intramolekular Basenpaarung durch
Wasserstoffbrücken nach dem Modell von Watson und Crick.27 Hierbei treten
doppelsträngige Bereiche (Helices) auf, die durch Haarnadelschlaufen (hairpins), innere
Schlaufen (loops), Ausstülpungen (bulges), Verbindungsstellen (junctions) und
Pseudoknoten (pseudoknots) unterbrochen sein können. Diese Sekundärstruktur-
1.2 In vitro Selektion 3 elemente können auch intermolekular untereinander wechselwirken und somit
komplexere dreidimensionale Strukturen formen. Dabei spielt nicht nur die klassische
Watson-Crick-Basenpaarung eine Rolle, sondern es treten auch andere
Wasserstoffbrückenwechselwirkungen, wie umgekehrte (reversed) Watson-Crick-,
Hoogsteen-, umgekehrte (reversed) Hoogsteen- und Wobble-Basenpaarung, auf.26, 28
Mit dieser Fähigkeit, eine große Vielfalt an Tertiärstrukturen zu formen, ist RNA wie
Proteine in der Lage, Bindungstaschen und katalytische Zentren zu bilden. Aufgrund
der vorherrschenden Wechselwirkungen können potentielle Substrate in Richtung
benachbarter katalytischer Gruppen optimal orientiert und Übergangszustände während
einer stattfindenden Reaktion stabilisiert werden.29 Dies ist die Grundlage für
Interaktionen mit anderen Molekülen 30 und die Katalyse von chemischen Reaktionen.
1.2 In vitro Selektion
Zur Erweiterung des Spektrums an chemischen Reaktionen, die durch RNA katalysiert
werden können, bietet sich die Anwendung des Prinzips der kombinatorischen Chemie
zur Erzeugung von RNA-Bibliotheken an. Denn – im Gegensatz zu den Proteinen –
trägt jedes Nukleinsäuremolekül seinen Bauplan und seine Funktion in sich und ist mit
molekularbiologischen Methoden, wie Transkription, Ligation, reverser Transkription
und Polymerasekettenreakton (PCR), kompatibel. Somit sind Nukleinsäuren ideale
Kandidaten, um durch künstliche Evolution RNA-Moleküle mit neuen Eigenschaften zu
generieren. Im Gegensatz dazu ist die de novo Entwicklung von Proteinen mit
gewünschten Enzymeigenschaften bis heute noch nicht möglich. Hierzu sind die
Kenntnisse über das Zusammenwirken des atomaren Aufbaus, der dreidimensionalen
Architektur und den resultierenden Katalyseeigenschaften nicht hinreichend.
Erste Ansätze einer gerichteten Evolution von Nukleinsäuren wurde zu Beginn der
1990er Jahre in den Gruppen um L. Gold31, G. F. Joyce32 und J. W. Szostak33 parallel
und unabhängig voneinander durchgeführt und dienten zunächst der Generierung von
Nukleinsäuren mit spezifischen Bindungseigenschaften an ein Zielmolekül. Diese
1.2 In vitro Selektion 4 Nukleinsäuren mit spezifischen Bindungseigenschaften werden Aptamere (lat. aptus =
passend) genannt.
Am Anfang einer in vitro Selektion oder der sogenannten SELEX (systematic evolution
of ligands by exponential enrichment)31 steht eine DNA-Bibliothek, die als Pool
bezeichnet wird. Diese kann entweder aus einer bereits bekannten Nukleinsäuresequenz
bestehen, die teilweise zufällig verändert wurde, oder komplett randomisiert sein.
Theoretisch sind bei der Erzeugung eines randomisierten Pools 4N (4 steht für die vier
verschiedenen Nukleotide, N für die Anzahl der randomisierten Positionen)
verschiedene Sequenzen möglich, für einen Pool z. B. mit 140 randomisierten
Positionen entspräche das einer Diversität von 4140 = 1.94 · 1084. Durch die
automatisierte DNA-Synthese sind routinemäßig 1013 - 1016 verschiedene
Oligonukleotide synthetisierbar, was allerdings nur einen kleinen Teil des theoretisch
möglichen Sequenzraums ausmacht.34 Durch enzymatische Ligation von kleineren
Oligonukleotidbibliotheken können auch größere randomisierte Bereiche erzeugt
werden, allerdings ist dann nur ein sehr kleiner Bruchteil des theoretisch möglichen
Sequenzraumes zugänglich und somit die Komplexität eingeschränkter.35
Der randomisierte Bereich wird an beiden Enden von konstanten Bindungsstellen
flankiert, welche die Hybridisierung der Primer für die reverse Transkription der
selektierten RNA in DNA und deren anschließenden Amplifizierung durch PCR
gewährleisten. Durch Verwendung eines Primers, der den Promotorbereich für die
Erkennung durch die T7-RNA-Polymerase trägt, kann der amplifizierte DNA-Pool
anschließend wieder in RNA transkribiert werden (Abb. 1-1).36
Abb. 1-1: Schematische Darstellung des DNA-Pools (oben) und des resultierenden RNA-Pools (unten) mit 70 randomisierten Nukleotiden N
1.2 In vitro Selektion 5 Die eigentliche Selektion besteht aus dem Separieren der RNA-Moleküle mit den
gewünschten Eigenschaften von denen, die diese Eigenschaften nicht aufweisen. Dieses
Abtrennen wird häufig mit Hilfe von Affinitätschromatographie erreicht. Soll
beispielsweise RNA mit einer spezifischen Bindungseigenschaft, analog zu den
Ursprungsexperimenten31-33, selektiert werden, wird das Zielmolekül an eine feste
Matrix gebunden. Die RNA-Bibliothek wird mit dieser Matrix inkubiert und
anschließend die nicht-bindenden RNAs durch Waschen der Matrix abgetrennt. So
verbleiben die RNA-Moleküle, welche das Zielmolekül binden, auf der Matrix und
können dann durch reverse Transkription in DNA umgeschrieben und sofort durch PCR
amplifiziert werden. Durch die nachfolgende Transkription erhält man wieder RNA und
Abb. 1-2: Schema der in vitro Selektion von Aptameren
ein neuer Selektionszyklus kann durchlaufen werden (Abb. 1-2). Die Anzahl der
Zyklen, die durchgeführt werden müssen, um eine Dominanz der Spezies mit den
1.2 In vitro Selektion 6 gewünschten Eigenschaften zu erhalten, sind von dem Zielmolekül, dem Grad der
Randomisierung und der Stringenz abhängig, typischerweise reichen 3 - 15 Durchläufe.
Nach erfolgter Selektion kann der Pool durch Klonieren und Sequenzieren
charakterisiert werden.37
Durch den Ansatz der SELEX-Strategie konnte eine große Palette an Aptameren,
inklusive DNA-Aptameren, selektiert werden. Die Aptamere weisen Affiniäten zu den
unterschiedlichsten Molekülen wie Aminosäuren, Antibiotika, Farbstoffen, Peptiden
und sogar Proteinen auf. Die regelmäßig aktualisierte Aptamer-Datenbank der
Arbeitsgruppe um A.D. Ellington (http://aptamer.icmb.utexas.edu) bietet diesbezüglich
eine detaillierte Übersicht.38
Die gerichtete Selektion von Nukleinsäuren stellt keinen linearen Prozess aus Synthese,
Prüfen/Screenen und Auflösen der Struktur-Funktions-Beziehung wie bei anderen
Stoffklassen dar und hat somit den Vorteil, dass mehrere Selektions- und
Amplifizierungsschritte hintereinander durchgeführt werden können.39 Dadurch kommt
sie einer natürlichen Selektion nach Darwin sehr nahe.40 Ein weiterer Vorteil von
Nukleinsäuren ist, dass während der Selektion der Sequenzraum der angereicherten
Bibliothek durch enzymatisch eingeführte Mutationen im Amplifizierschritt erweitert
werden kann.41-43 Auf diese Art und Weise können auch während der Selektion die
gewünschten Bindungs- oder Katalyseeigenschaften evolutionär verstärkt werden.
Durch den Ansatz der in vitro Selektion von Aptameren wurde die Grundlage zur
Entwicklung von Nukleinsäuren mit gewünschten katalytischen Eigenschaften
(Ribozymen) gegeben.
Per Definition beschleunigt ein Katalysator eine Reaktion, ohne dabei selbst umgesetzt
oder irreversibel verändert zu werden. Die grundlegenden Eigenschaften eines „echten“
Katalysators sind das vorübergehende Binden der Reaktanden und die Stabilisierung
des Übergangszustandes, wodurch die Aktivierungsenergie herabgesetzt und so die
Reaktion beschleunigt wird. Die theoretische Grundlage einer molekularen Erkennung
wurde schon Anfang des 20. Jahrhunderts postuliert44, 45 und führte zu der Suche nach
Molekülen, die Übergangsanaloga (transition state analog, TSA) binden können. Dies
zog zunächst die Entwicklung von katalytischen Antikörpern nach sich und wurde dann
1.2 In vitro Selektion 7 auch auf Nukleinsäuren übertragen. Dabei wurde zuerst der in Frage kommende TSA
synthetisiert, in vitro die affine RNA dagegen selektiert und schließlich auf katalytische
Eigenschaften überprüft. Diese Herangehensweise lieferte allerdings nur einige
Aptamere, die die Isomerisierung eines Biphenyls46, eine Porphyrinmetallierung47 und
die Hydrolyse eines Cholesterolesters48 katalysieren. Andere Versuche hingegen blieben
auf der Stufe der affinen Bindung stehen.49 Zum einen gestaltet sich die Synthese eines
geeigneten Analogons, welches dem tatsächlichen Übergangszustand strukturell sehr
nahe kommt, sehr schwer. Zum anderen erfolgt die Selektion nicht nach katalytischer
Aktivität, sondern nach Bindungseigenschaft.
1.2.1 Direkte Selektion Nukleinsäuren, die bessere Beschleunigungsraten aufweisen und komplexere
Reaktionen katalysieren, wurden durch die direkte Selektion erhalten 35. Bei dieser
Strategie der in vitro Selektion steht nicht die Bindungsfähigkeit der Nukleinsäure,
sondern nur die gewünschte Katalyseeigenschaft im Vordergrund. Die zu selektierende
Nukleinsäure muss gleichzeitig in einer intramolekularen Reaktion Katalysator- und
Substrateigenschaften aufweisen, wobei sie allerdings eine permanente Veränderung
erfährt. Zwar ist dadurch die klassische Katalysatordefinition nicht mehr erfüllt, aber die
katalytisch aktive Nukleinsäure unterscheidet sich von den unaktiven und kann isoliert
werden. Durch den Einsatz eines Reaktanden X konnte das Reaktionsspektrum über
Hydrolyse50, 51 oder Ligation35, 51-56 auf Alkylierungen57, Amidbindungsspaltung58, 59,
Aminoacylierung60, Aminoacyltransfer61 und Phosphorylierung62 hinaus erweitert
werden. Trägt der Reaktand X noch zusätzlich eine Ankergruppe (z.B. Biotin), erhält
die katalytisch aktive Nukleinsäure diese und ist über Affinitätschromatographie (für
Biotin gewöhnlich eine Streptavidinfestphase) von unaktiven einfach abtrennbar
(Abb. 1-3).
1.2 In vitro Selektion 8
Abb. 1-3: Direkte Selektion von selbstmodifizierenden RNA-Molekülen
Durch die direkte Selektion können allerdings nur Ribozyme für
Selbstmodifizierungsreaktionen generiert werden. Dies bedeutet, dass die Nukleinsäure
nicht nur ein guter Katalysator, sondern gleichzeitig auch ein passendes Substrat sein
muss. Vermeintliche Katalysatoren, die allerdings schlechte Substrateigenschaften
haben, können sich bei dieser Art Selektion daher nicht durchsetzen. Auch wenn es
gelungen ist, durch rationales Design ein selbstmodifizierdes Ribozym in Substrat- und
Enzymteil zu zerlegen,62 ist die direkte Selektion generell nicht auf bimolekulare
Reaktionen anwendbar.
1.2.2 Direkte Selektion mit linkergekoppelten Reaktanden Durch das Prinzip der direkten Selektion mit linkergekoppelten Reaktanden63 ist die
Möglichkeit gegeben, Ribozyme für die Reaktion zwischen zwei kleinen Molekülen X
und Y zu selektieren. Der Ansatz basiert zunächst auf einer intramolekularen Katalyse,
bei der der Reaktand Y über einen langen, flexiblen Linker durch Transkription64, 65
oder Ligation66, 67 zu Beginn jedes Zyklus’ am 5’- bzw. 3’- Ende des RNA-Pools
eingeführt wird. Der Linker gewährleistet, dass sich der Reaktand Y frei zu jeder Stelle
an der RNA und somit zu potentiellen katalytischen Taschen bewegen kann. Trägt auch
hier wieder der Reaktand X eine Ankergruppe, erwerben all die RNA-Moleküle, die die
1.2 In vitro Selektion 9 Reaktion zwischen X und Y katalysieren, diese Ankergruppe und können einfach
isoliert werden (Abb. 1-4).
Abb. 1-4: Direkte Selektion mit linkergekoppelten Reaktanden.
Diese Strategie kommt der eigentlichen Definition eines Katalysators näher, da die
RNA nun selbst nicht mehr als Substrat fungiert und durch den Linker räumlich von der
Substratdomäne entfernt ist. Außerdem muss nun die RNA auch keine geeigneten
Substrateigenschaften mehr aufweisen, es steht nur ihre Katalyseeigenschaft im
Vordergrund. Durch den flexiblen Linker bleibt die katalysierende RNA jedoch mit
dem Substrat verbunden und kann so selektiert werden.
Die Anforderungen an den Linker sind, dass er sich gegenüber der zu katalysierenden
Reaktion chemisch inert verhält, keine komplexen Strukturen ausbildet und somit nicht
die Tertiärstruktur der RNA beeinflusst. Zudem muss er eine gute Löslichkeit im
wässrigen Medium aufweisen und sehr flexibel sein, damit die RNA sich möglichst
ungehindert und frei zu den Reaktanden positionieren kann. Als Linker hat sich
Polyethylenglycol (PEG) bewährt, das über zahlreiche Polymerisationsgrade verfügt, so
dass sich fast alle gewünschten Linkerlägen einstellen lassen.
1.2 In vitro Selektion 10 1.2.3 Direkte Selektion mit spaltbaren Linkern Die Reaktivität des Reaktanden X gegenüber den funktionellen Gruppen der RNA, aber
ebenso gegenüber Y, hat einen nicht zu vernachlässigenden Einfluss auf den Ausgang
der Selektion, denn durch die direkte Selektion werden alle katalysierenden RNA-
Spezies isoliert. Das bedeutet, liegt ein reaktiver Reaktand X vor, kann dieser nicht nur
regiospezifisch mit dem gewünschten, an die RNA gekoppelten Reaktanden Y
reagieren, sondern ebenfalls an anderen Stellen innerhalb der RNA. Somit wäre die
Selektion nicht mehr spezifisch für eine bestimmte Reaktion. Es kann davon
ausgegangen werden, dass der Ausgangspool schon von vornherein Spezies beinhaltet,
die Nebenreaktionen katalysieren, und während der Selektion mit angereichert werden.
So kann es passieren, dass die isolierten RNA-Moleküle nicht die gewünschte
Katalyseeigenschaft aufweisen.52, 57, 60, 68
Die Methode des linkergekoppelten Reaktanden Y bietet eine Möglichkeit,
unspezifische Nebenreaktionen zu unterdrücken, wenn mit der Konjugation des Linkers
gleichzeitig eine selektive Spaltstelle zwischen dem Reaktanden Y und der RNA
eingeführt wird.69-72 Dann können nämlich nach der Immobilisierung nur die RNA-
Moleküle gezielt freigesetzt weredn, die am vorgesehenen Reaktanden Y die Reaktion
erfahren haben. Die Nebenreaktion favorisierenden RNA-Sequenzen verbleiben auf der
Festphase und werden dem restlichen Selektionszyklus entzogen. Somit kann die
Selektion auch regiospezifisch durchgeführt werden (Abb. 1-5).
1.2 In vitro Selektion 11
Abb. 1-5: Schema der direkten Selektion mit spezifisch spaltbarem Linker
Neben der Vielzahl an Ribozymen wurden eine Reihe Deoxyribozyme selektiert.
Allerdings beschränkt sich die Katalyseaktivität hier auf RNA-Spaltung, RNA- und
DNA-Ligation sowie Modifikationen von Nukleinsäuren (Übersicht bei
Literaturstelle73). Das eingeschränkte Reaktionsspektrum und die Tatsache, dass bisher
noch kein natürliches DNA-Enzym gefunden wurde, lässt sich auf das Fehlen der 2’-
Hydroxylgruppe an der Ribose zurückführen. Infolgedessen vermag DNA Substrate
nicht so leicht zu koordinieren und keine höher geordneten und komplexe
Tertiärstrukturen wie RNA auszubilden.74
Mit der in vitro Selektion steht somit eine Methode zur Verfügung, mit der RNA als
Katalysator für Reaktionen in der organischen Chemie maßgeschneidert werden kann.
Die folgende Tabelle (Tabelle 1-1) verschafft einen Überblick über das
Reaktionsspektrum, das durch selektierte, künstliche Ribozyme katalysiert wird.
1.2 In vitro Selektion 12 Abgesehen von Peptidbindungsknüpfung, Phosphatesterbindungsknüpfung und
-spaltung sind für die genannten Reaktionstypen bis heute keine natürlichen Ribozyme
bekannt.
Reaktionstyp Reaktionsgleichung
C-C-Bindungsknüpfung
Aldolreaktion72
R1
O
RNH
O
O OOHR1
NH
O
R
Diels-Alder Reaktion75-77
+
Biphenylisomerisierung46 O
O O
O
C-N-Bindungsknüpfung
Amidbindungsbildung78-81 NH2
R1O R2
O
+NH
R2
O
RR OHR+
N-glycosidische Bindungbildung82, 83 O
OHOH
HH
HH
O
OHOH
HH
H
PP
PP
PP+
R1
N
R2
R1
HN
R2
N-Alkylierung57 R N
R2
O
Hal+R2
O
N+
R
R1 R1
+ Hal-
DNA-Depurinierung*84 O
HH
HH
P
P
O
HH
H
P
P
OHH2O
R1
N
R2
R1
HN
R2
C-S-Bindungsknüpfung
S-Michael Reaktion70 NH
O
R
O
NHR1 HS R2 NH
O
R
OH
NHR1
SR2
+
S-Acylierung85 SH +
R1O R2
O
RS R2
O
OHR1R
S-Alkylierung86 P S-
R1
O
Hal+R1
O
O
O-
OR
+ Hal-P SO
O-
OR
1.2 In vitro Selektion 13 C-O-Bindungsknüpfung
Umesterung60, 61, 68, 87-89 OH +
R1O R2
O
R1 = kleines Oligomer, AMP
RO R2
O
+R R1 OH
Carbonatesterhydrolyse48 R1O OR2
O
R1 OH R2 OH CO2H2O
+ +
P-O-Bindungsknüpfung
Phosphoanhydridbildung* 90 P PP P R2 P P R2
P PR1 R1
Phosphorylierung62 R OH R P+ NTP + NDP
RNA-Ligation51, 55, 56, 91-93 R OH P R1 R R1P+
RNA/DNA-Spaltung 94*, 51, 95, (96-
98)*, 99# OHR PR1R R1P +
C-Metallbindungsknüpfung
Porphyrinmetallierung47, 100*, 101*
N
NH N
HN
Me2+
R2
R2
R1R1
Me
N
N N
N
R2
R2
R1R1
Redoxreaktion
Oxidation und Reduktion102, 103 R H
O
OHR
Tabelle 1-1: Beispiele der durch Ribozyme katalysierten Reaktionen. R steht generell für einen Nukleinsäurerest. Reste, die keinen Nukleinsäureanteil aufweisen, sind mit R1 oder R2
bezeichnet. Hal steht für Halogen, P für eine Phosphatgruppe, NDP für Nukleosiddiphosphat, NTP für Nukleosidtriphosphat. * markiert DNA-Enzyme, # RNA-DNA-Enzyme
Auch hinsichtlich des Potentials für die Weiterentwicklung der selektierten Aptamere
und Ribozyme zu Wirkstoffen und Therapeutika in der modernen Medizin ist die in
vitro Selektion vielversprechend (Übersicht hierzu bei Literaturstellen104, 105 für
Aptamere und für Ribozyme bei Literaturstellen106, 107). Durch den Einsatz von
modifizierten Nukleotiden108, 109 oder den nicht-natürlichen L-Nukleotiden110, 111 kann
die notwendige Stabilität im Serum und gegenüber Nukleasen erhöht werden.
1.3 Die Aldolreaktion 14 1.3 Die Aldolreaktion
1.3.1 Die Aldolreaktion in der organischen Chemie Die Aldolreaktion112, 113 gehört zu den am häufigsten angewandten Reaktionen in der
organischen Chemie und stellt eine der vielfältigsten Methoden zur Knüpfung von
Kohlenstoff-Kohlenstoff-Bindungen dar. Bei der Aldolreaktion wird das α-
Kohlenstoffatom eines enolisierbaren Aldehyds oder Ketons 1 an die Carbonylfunktion
eines weiteren Aldehyds oder Ketons 2 unter Basen- oder Säurekatalyse addiert
(Aldoladdition). Das resultierende Produkt stellt eine β-Hydroxycarbonylverbindung 3
dar, die auch Aldol bzw. Ketol genannt wird. Weist die resultierende
β-Hydroxycarbonylverbindung noch mindestens ein α-ständiges Wasserstoffatom auf,
so findet darauf meistens eine Eliminierung von Wasser statt, die ein α, β-ungesättigtes
Aldehyd oder Keton 4 liefert. Die Dehydratisierung verläuft meistens schon als
Gleichgewichtsreaktion während der Addition. Durch Behandlung mit Säure kann das
Gleichgewicht thermisch auf die Seite des Produktes verschoben werden.
Wird die Dehydratisierung nicht unterbunden, wird die gesamte Reaktion als
Aldolkondensation bezeichnet (Abb. 1-6).
R2
OO OH
R2R1
O
R1
- H2O
O
R2R1
1
2
3 4
O
R1
_
O
R1
Enolation
Abb. 1-6: Aldoladdition und –kondensation
Bei der gekreuzten Aldolreaktion (Claisen-Schmidt-Reaktion) werden zwei
verschiedene Carbonylverbindungen eingesetzt. Allerdings ist die Richtung bei einem
klassischen Reaktionsverlauf schwierig zu kontrollieren, denn es treten
Nebenreaktionen durch Kondensation zu Olefinen oder Polymeren auf. Außerdem kann
aufgrund der Reversibilität das Gleichgewicht der Addition nicht auf die Seite des
energetisch ungünstigeren Aldols verschoben werden und es treten regioisomere
Enolate auf, die zu einer Mischung verschiedener Aldole führen. Bei der
1.3 Die Aldolreaktion 15 anschließenden Dehydratisierung kann eine Michael-Addition als störende
Nebenreaktion auftreten. Die regiospezifische Reaktion wurde im Laufe der Jahre durch
die Entwicklung geeigneter Methoden möglich, wobei die Mukaiyama-Aldolreaktion114-
116 den wichtigsten Entwicklungsschritt darstellt (Abb. 1-7).
OSiMe3 1. TiCl4
2. H2O
O
R
OH
R
O
Abb. 1-7: Mukaiyama- Aldolreaktion Ein wesentliches Problem der Aldolreaktion, vor allem bei der Synthese von
Naturstoffen, stellt aber die Kontrolle der Stereochemie dar.117-119 Im Reaktionsverlauf
können zwei neue Chiralitätszentren entstehen und zwei diastereomere
Enantiomerenpaare werden erhalten (Abb. 1-8).
O OH
R3R1
O OH
R3R1
O OH
R3R1
O OH
R3R1
R2 R2R2 R2
Abb. 1-8: Diastereomere Enantiomerenpaare einer Aldolreaktion ohne Kontrolle der Stereochemie Eine Kontrolle der relativen und absoluten Konfiguration eines neugebildeten
Stereozentrums kann durch Verwendung von chiralen Ausgangsverbindungen oder
chiralen Auxiliaren, wie z.B. an dem Enolatdonor gebundene Oxazolidinone 120-126oder
Sultam 127-130, erzielt werden. Nachteil bei der Verwendung von Auxiliaren sind die
nötigen zusätzlichen Syntheseschritte zu deren Einführen und anschließenden
Abspalten. Im Laufe der Jahre wurde darüber hinaus eine Reihe anderer Methoden
entwickelt, die sowohl hohe Wirksamkeit als auch hohe Selektivität aufweisen. Dabei
kann man eine Unterscheidung machen, ob der Aldoldonor, also die Enolat bildende
Komponente, der -akzeptor oder beide durch den Katalysator aktiviert werden.
So basiert die katalysatorvermittelte Aktivierung des Aldoldonors auf
metallorganischen Reagenzien, wie Rhodium- oder Palladiumkomplexen,
Phosphoramid-Lewis-Basen oder verschiedenartigen Borverbindungen.
1.3 Die Aldolreaktion 16 Der Aldolakzeptor lässt sich durch Koordination einer chiralen Lewis-Säure wie
Titan(IV)-, Zinn(II)-, Kupfer(II)-Komplexe, Borkomplexe, aber auch Gold(I)- oder
Silber(I)-komplexe aktivieren, wobei vorher der Aldoldonor in eine reaktive Spezies
wie Silylenolether, Methylenolether oder Ketensilylacetale überführt werden muss.
Die Aktivierung beider Komponenten kann durch die Kombination einer Lewis-Säure
und einer Brønsted-Base in einem Hetero-Dimetallkomplex als Katalysator erfolgen.
Diese Art Katalysator wird auch als Chemzym (chemisches Enzym) bezeichnet, da sie
dasselbe Prinzip wie natürliche Enzyme aufweist. Der Vorteil bei der Anwendung
dieser Katalysatorart ist, dass der Aldolakzeptor zuvor nicht modifiziert werden muss.
(generelle Übersicht hierzu bei Literaturstellen 131-133).
Seit einigen Jahren zeigt sich, dass Prolin ein sehr guter, selektiv arbeitender
Katalysator für die Aldolreaktion ist.134-161 Der Vorteil von Prolin liegt darin, dass es
selber chiral, leicht zugänglich und günstig ist, die Substrate nicht zuvor modifiziert
werden müssen und dass keine inerten Reaktionsbedingungen nötig sind.
1.3.2 Natürliche Aldolasen Aldolreaktionen sind an vielen wichtigen metabolischen Umwandlungen beteiligt und
werden durch Aldolasen katalysiert. Bei den Aldolasen handelt es sich um eine
spezifische Gruppe von Lyasen, die die stereoselektive Addition eines Ketondonors an
einen Aldehydakzeptor katalysieren. Bis heute sind über 30 natürliche Aldolasen
bekannt. Zwei Aldolaseklassen wurden aufgrund ihrer Mechanismen identifiziert und
unterteilt.162 Die Aldolasen der Klasse I kommen bei Tieren und höheren Pflanzen vor
und weisen in ihrem aktiven Zentrum ein Lysin auf, das mit Hilfe seiner
ε-Aminogruppe ein Iminiumion (Schiff’sche Base) mit dem Donor bildet und es so für
den Angriff des Aldolakzeptors aktiviert (Abb. 1-9).163
1.3 Die Aldolreaktion 17
Abb. 1-9: Mechanismus der Klasse-I-Aldolasen (Lys = Lysin, Enz = Enzym, B = Base)
Bei den Klasse-II-Aldolasen handelt es sich um Metalloenzyme, die mit Hilfe eines
Zinkatoms im aktiven Zentrum wahrscheinlich den Donor aktivieren.164, 165. Sie sind in
Pilzen, Algen und einigen Bakterien zu finden.
Vermehrt gewinnt der Einsatz von Aldolasen in der organischen Synthese an
Bedeutung. Ihr Vorteil liegt darin, dass sie hoch selektiv arbeiten, milde
Reaktionsbedingungen wie Raumtemperatur und wässriges Medium bei neutralem pH-
Wert benötigen und oft zu Reaktionen mit verschiedenen Enzymen kompatibel sind. So
kann weitgehendst auf Verwendung von Schutzgruppen verzichtet und mehrere Enzyme
können in mehrstufigen Eintopfreaktionssequenzen verwendet werden (Übersicht
beiLiteraturstellen 132, 166).
1.3.3 Katalytische Antikörper Durch das geeignete Design eines Haptens (Abb. 1-10)167, 168 und die anschließende
Immunisierung eines Tieres konnten zwei katalytische Antikörper, 38C2 (Aldrich
Katalog-Nr. 47995-0 und 48157-2) und 33F12, mit Klasse-I-Aldolase-Eigenschaft
generiert werden.
R
O O LysH2N
R
O HNLys Ab
Ab
R
O NLys AbH
Abb. 1-10: Strategie mit einem β-Diketon als Hapten zur Generierung eines katalytischen Antikörpers mit Klasse-I-Aldolaseaktivität (Lys = Lysin, Ab = Antikörper), wobei das β-Diketon als chemische Falle für eine Lysineinheit des Antikörpers diente
O
LysH2N
HNLys Enz
Enz
HO
HB
-H2OH
BHNLys Enz
HN O
R
Lys Enz
BH
NH
R
OHLysEnz
+H2OO
R
OHNH
HB
O
R
OHLysEnz
H
LysH2N Enz+
1.3 Die Aldolreaktion 18 Die Antikörper weisen die Effizienz der natürlichen Aldolasen auf und katalysieren
Aldolreaktionen mit einem breiteren Substratspektrum unter hoher Stereo-
selektivität169-172, wodurch sie auch in Naturstoffsynthesen 173-176 einsetzbar werden.
Darüber hinaus vermögen die Antikörper auch Robinson-Anellierung
(aufeinanderfolgende Michael- und Aldolreaktion)177-179, Retromichaelreaktion,
Retroaldolreaktion zur kinetischen Racematspaltung 172, 174, 176, 180-183 oder Prodrug-
Aktivierung 184, 185 zu katalysieren. Die Antikörper konnten auch in Richtung
veränderter Substratspezifität und verbesserten Umsatz entwickelt werden.186-189
1.3.4 Ribozyme Trotz der großen Vielfalt an Ribozymen gibt es noch eine Reihe an wichtigen
Reaktionen, für die bisher keine Ribozyme entdeckt wurden. Somit war es eine
Herausforderung, ein Ribozym zu generieren, das Aldolreaktionen katalysiert.
Das Auffinden eines Aldolribozyms wäre nicht nur hinsichtlich der organischen
Synthese, sondern auch bezüglich vieler metabolischen Reaktionen, wie das Bilden von
Ribose aus einen einfachen Aldehyd190, interessant. Hierdurch würde auch die
Hypothese einer RNA-Welt weiter untermauert werden.
Famulok und seine Mitarbeiter berichteten vor kurzem von der Selektion eines
Ribozyms, das eine Aldolreaktion zwischen einem RNA-gekoppelten Keton und einem
biotinylierten Aldehyd in Gegenwart von Zinkionen unterstützt.72
2 Zielsetzung der Arbeit
Wie in der Einleitung beschrieben, ist es möglich, mit einer geeigneten
Selektionsstrategie katalytisch aktive RNA zu erzeugen. Durch geeignete
Selektionsstrategien kann somit das katalytische Potential von Nukleinsäuren über das
der natürlichen Ribozyme hinaus erweitert werden.
Das Ziel der vorliegenden Arbeit ist es, ein Ribozym durch in vitro Selektion zu
generieren, das die Aldolreaktion zwischen einem Acetophenon- und einem
Benzaldehydderivat katalysiert. Hierbei soll die Methode der direkten Selektion mit
photospaltbaren linkergekoppelten Reaktanden angewendet werden. Mittels dieser
Selektionsstrategie wird eine bimolekulare Reaktion wie die Aldolreaktion zugänglich.
Ferner soll diese Strategie eine regiospezifische Reaktion gewährleisten, denn ein
Substrat der Reaktion wird über den Linker an die RNA-Bibliothek gekoppelt.
Zu diesem Zweck ist es notwendig, die Selektionsstrategie an das Reaktandensystem
anzupassen. Dies beinhaltet die Modifizierung des Reaktanden mit dem photospaltbaren
Linker, dessen Ligation an die RNA-Bibliothek, das Auffinden geeigneter Bedingung
der Reaktion und die Überprüfung der Kompatibilität mit der Selektion. Anhand der
Simulation einer Selektion soll das überprüft werden.
Nach erfolgter Selektion sollen die angereicherten katalytisch aktiven RNA-Moleküle
kloniert und sequenziert werden. Im Anschluss wird eine Primär- und
Sekundärstrukturanalyse erfolgen. Desweiteren soll eine Analytikmethode für die
spätere kinetische Charakterisierung einzelner Sequenzen etabliert werden.
3 Methoden
3.1 Festphasensynthese
Die automatisierte Festphasensynthese der verwendeten Nukleinsäuren wurde mit Hilfe
des DNA-Synthezisers Expetide 8909 von Applied Biosystems nach dem
Phosphoramiditverfahren191 durchgeführt. Hierzu wurden die Standard-
synthesechemikalien von der Firma Proligo und das Acetonitril mit einem Wassergehalt
≤ 10 ppm von Roth bezogen. Es wurden Phosphoramidite mit den
Standardschutzgruppen192, 193 (Cruachem/Transgenomic) verwendet und als 0.1 M
Lösung in Acetonitril eingesetzt, als Aktivator diente 0.2 M Benzylthiotetrazol (BTT) in
Acetonitril.
3.1.1 Synthese des DNA-Pools mit randomisiertem Bereich
Zur Synthese des 159 Nukleotide langen DNA-Pools wurde ein CPG-Säulenmaterial
(controlled pore glass) mit einer relativ großen Porengröße von 2000 Ả (dC-CPG von
Glen Research) eingesetzt. Die Synthese wurde formal in drei Teilen durchgeführt: Es
wurde mit einem 1 µmol Maßstab im DNA-Modus für den 3’-Bereich begonnen,
wohingegen die Synthesen des randomisierten und 5’-Bereiches jeweils im 0.2 µmol
Maßstab fortgesetzt wurden. Da die Phosphoramidite der einzelnen Basen
unterschiedliche Kopplungseffizienzen aufweisen, wurde für die Synthese des
randomisierten Bereichs ein Gemisch der Amidite dA:dC:dG:dT im Verhältnis 3:3:2:2
eingesetzt. Die Standardprotokolle des Herstellers wurden dahingehend optimiert, dass
3.1 Festphasensynthese 21 die Pulsanzahl der Waschschritte und die Menge des Oxidationsreagenz’ im
Oxidationsschritt jeweils verdoppelt wurden. Die finale DMT-Schutzgruppen nach der
Synthese des 3’- und des randomisierten Bereiches wurden nicht abgespalten, außerdem
wurde auf den Cappingschritt nach den Kopplungen im randomisierten Bereich
verzichtet.
Die Abspaltung des Oligonukleotides vom Trägermaterial und die Basenentschützung
erfolgte mit 1 ml 33 %-iger NH3-Lösung unter Schütteln bei 55 °C über Nacht. Der
Überstand wurde abgenommen und das CPG noch dreimal mit je 200 µl Wasser
gewaschen. Die Lösungen wurden vereinigt und im Vakuum bis zur Trockene
eingeengt. Das erhaltene DNA-Pellet wurde zweimal erneut in Wasser gelöst und
wieder eingeengt. Die DNA wurde dann auf einem denaturierenden 6 % PAGE
aufgereinigt. Die Detektion erfolgte durch UV-Shadowing, wobei die Hauptbande
ausgeschnitten, eluiert, gefällt und später durch Gelfiltration entsalzt wurde. Die
Quantifizierung der DNA-Menge erfolgte photometrisch.
3.1.2 Synthese des Dinukleotids69, 194, 195
ON
O
OH
H2N O
O
O
PHO
O
OP O
O
O
O
P O
OH
OO
OO
OO
OPHO
O
O
P
O OH
O
NH2
N
N
PHO
OH
O
O
O
OH
O
NH2
N
N
HO
O
O
O
OPO
OH
OO
OO
O
OP O
OH
OO
OO
O
O
OH
OO
OO
OO
OP O
OH
OO
OO
O
1 Die Synthese des Dinukleotids mit dem photospaltbaren Linker 1 fand im DNA 1 µmol
Maßstab statt. Hierbei diente das 3’-Aminomodifier-C6-CPG mit einer Porengröße von
3.1 Festphasensynthese 22 500 Ả (ChemGenes) als Trägermaterial. Die benötigten Amidite DMT-
Hexaethylenglycol-CED-phosphoramidit (pHeg) (ChemGenes), Bis-(cyanoethyl)-N,N-
diisopropylphosphoramidit (Phosphat) (ChemGenes) und (1-o-Nitrophenyl-1-O-(2-
cyanoethyl-N,N-diisopropylphosphor-amidyl)-3-O-DMTr-1,3-propan-diol) (Foto) (zur
Verfügung gestellt von F. Hausch194, 196) kamen als 0.1 M Lösung in Acetonitril zum
Einsatz. Für die Synthese wurde das Standardsyntheseprotokoll des Herstellers
modifiziert: doppelte Pulsanzahl der Waschschritte, doppelte Menge an
Oxidationsreagenz, Kopplungzeiten des HEG-Amidits und Foto-Amidits je 90 s, rC-
Amidit 720 s und Phosphat-Amidit dreimal je 90 s. Nach der letzten Kopplung wurde
auf die Abspaltung der finalen DMT-Schutzgruppe verzichtet, da das Phosphat-Amidit
keines besitzt.
Zur Abspaltung des Dinukleotids vom Träger und gleichzeitiger Basenentschützung
wurde das CPG in ein Reaktionsgefäß mit Schraubdeckel überführt und in 40 %-iger
Methylaminlösung 10 min bei 65 °C geschüttelt. Danach wurde der Überstand
abgenommen, das CPG dreimal mit je 1 ml einer Lösung aus Ethanol, Acetonitril und
Wasser im Verhältnis 3:1:1 gewaschen und schließlich die vereinigten Überstände im
Vakuum vollständig eingeengt. Die Desilylierung der 2’-Hydroxylgruppe erfolgte mit
250 µl einer frisch hergestellten Lösung aus 150 µl NMP, 75 µl TEA und 100 µl
TEA⋅3HF (65 °C für 1.5 h unter Schütteln). Die abgekühlte Lösung wurde dann mit
250 µl TEAAc-Lösung (2 M, pH 8) versetzt und über eine äquilibrierte NAP-Säule
(2 M TEAAc, pH 8) entsalzt. Das Rohprodukt wurde anschließend eingeengt und durch
RP-HPLC (Gradient A) aufgereinigt. Die Detektion erfolgte über UV-Absorption bei
260 nm. Die Peaks wurden fraktioniert, vollständig eingedampft, mit MALDI-TOF
Massenspektroskopie charakterisiert und photometrisch quantifiziert.
MS (MALDI, m/z): [M+H]+ = 2821.89 (berechnet: 2821.16), [(pCC-Heg3-X)+H]+ =
1903.22 (berechnet: 1903.40), [(pCC-Heg3)+H]+ = 1743.34 (berechnet: 1742.24),
[(Heg2-NH2)+H]+ = 917.33 (berechnet: 918.76)
3.2 Derivatisierung der Reaktanden 23
3.2 Derivatisierung der Reaktanden Alle Reagenzien wurden in höchster Reinheit von Acros, Fluka, Pierce und Sigma-
Aldrich erworben und direkt ohne weitere Aufreinigung verwendet. Wasserfreies DMF
wurde von Fluka bezogen und über Molekularsieb aufbewahrt.
Dünnschichtchromatographie wurde unter Verwendung von Kieselgelplatten der Firma
Macherey-Nagel (Polygram® Sil G/UV254 40 x 80 mm) durchgeführt. Für die
Flashchromatographie wurde Kieselgel (Korngröße 40 µm) von J. T. Baker verwendet. 1H-NMR Spektren wurden mit dem Spektrometer der Firma Bruker AM-360
(360 MHz) aufgenommen und mit TMS als internen Standard kalibriert. Die
chemischen Verschiebungen (δ) sind in ppm angegeben. Zur Beschreibung der Signale
wurden die Abkürzungen wie folgt verwendet: s = singlett, d = duplett, t = triplett,
q = quartett, quin = quintett, sext = sextett, m = multiplett. MALDI-Massenspektren
wurden auf einem Bruker Biflex III aufgenommen. Die Zusammensetzungen
charakteristischer Massenfragmente sind in eckigen Klammern angegeben.
3.2.1 Aktivierung von 4-Acetylbenzoesäure als NHS-Ester
O
O ON
O
O
2
In einem ausgeheizten Schlenkkolben wurden 142 mg 4-Acetylbenzoesäure
(0.85 mmol, 1 eq) im Argongegenstrom gefüllt und unter Rühren in 1 ml abs. DMF
gelöst. Danach wurden 97.5 mg N-Hydroxysuccinimid (0.85 mmol, 1 eq)
hinzugegeben. Nach vollständigem Lösen erfolgte die Zugabe von 194 mg DCC
3.2 Derivatisierung der Reaktanden 24 (0.94 mmol, 1.1 eq). Nach wenigen Minuten Rühren bei RT fiel ein Niederschlag aus.
Nach 3 h wurde der Niederschlag durch Filtration abgetrennt, das Filtrat im Vakuum
eingeengt und durch Flashchromatographie aufgereinigt (Eluent: Hexan: EE = 2:1,
Detektion DC: UV-Löschung). Das Produkt 2 konnte mit einer Ausbeute von 98.6 %
(219 mg, 0.84 mmol) als farbloser Feststoff erhalten werden.
1H-NMR (360 MHz, CDCl3): δ = 8.24 -8.18 (m, 2H), 8.09 -8.03 (m, 2H), 2.91 (s, 4H),
2.65 (s, 3H)
3.2.2 Kopplung des Dinukleotids an 4-Acetylbenzoesäure-NHS-ester
ON
O
OH
HN O
O
O
PHO
O
OP O
O
O
O
P O
OH
OO
OO
OO
OPHO
O
O
P
O OH
O
NH2
N
N
PHO
OH
O
O
O
OH
O
NH2
N
N
HO
O
O
O
OPO
OH
OO
OO
O
OP O
OH
OO
OO
O
O
OH
OO
OO
OO
OP O
OH
OO
OO
O
O
O
3 In einem Reaktionsgefäß wurden 94 nmol 1 (cend: 217 µM) in 215 µl KH2PO4-Puffer,
pH 8 gelöst. Zu der Lösung wurden 5.4 µmol 4-Acetylbenzoesäure-NHS-ester 2
(cend: 25 mM), der in DMSO gelöst war, hinzugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde
über Nacht bei 37 °C geschüttelt. Die Isolierung des Produkts 3 erfolgte mittels RP-
HPLC (Gradient A). Die Peaks wurden fraktioniert, vollständig eingedampft, mit
3.2 Derivatisierung der Reaktanden 25 MALDI-TOF charakterisiert und photometrisch quantifiziert. Die Ausbeuten betrugen
bis zu 58.8 %).
MS (MALDI, m/z): [M+H]+ = 2967.28 (berechnet: 2967.30), [(pCC-Heg3-X) +H]+ =
1903.33 (berechnet: 1903.40), [(pCC-Heg3-X-O) +H]+ = 1888,12 (berechnet: 1887.40)
3.2.3 Synthese von 4-NHS-carboxybenzaldehyd
O
O ON
O
O
4
In einem ausgeheizten Schlenkkolben wurden 250 mg 4-Carboxybenzaldehyd
(1.65 mmol, 1 eq) im Argongegenstrom gefüllt und unter Rühren in 5 ml abs. DMF
gelöst. Danach wurden 200 mg N-Hydroxysuccinimid (1.75 mmol, 1.06 eq)
hinzugegeben. Nach vollständigem Lösen erfolgte die Zugabe von 378 mg DCC (1.83
mmol, 1.11 eq). Nach wenigen Minuten erfolgte eine Trübung der Lösung und es
wurden weitere 3 h gerührt. Der Niederschlag wurde durch Filtration abgetrennt, das
Filtrat im Vakuum eingeengt und durch Flashchromatographie aufgereinigt
(Eluent: Hexan: EE = 1:1, Detektion DC: UV-Löschung). Das Produkt 4 konnte als
farbloser Feststoff zu 69 % (408 mg, 1.14 mmol) erhalten werden.
1H-NMR (360 MHz, CDCl3): δ = 10.1 (s, 1H), 8.28-8.16 (m, 2H), 7.96-7.84 (m, 2H),
2.84 (s, 4H)
3.2 Derivatisierung der Reaktanden 26
3.2.4 Synthese von 4-Biotin-LC-PEO-carboxybenzaldehyd
HN NH
SNH
OO
H H
O
O
ONH
O
O
5
In einem trockenen Kolben, der zuvor mit Argon gespült wurde, wurden 200 mg Biotin-
LC-PEO (478 µmol, 1 eq) in 10 ml trockenem DMF gelöst und sofort mit 365 mg 4-
Carboxybenzaldehyd-NHS-ester 4 (1.48 mmol, 3.1 eq) umgesetzt. Nach einigen
Minuten bildete sich ein Niederschlag. Zu Vervollständigung der Reaktion wurde über
Nacht gerührt. Danach wurde das DMF im Vakuum entfernt und das Rohprodukt
säulenchromatographisch (Eluent: EE: MeOH = 3:1, Detektion DC: Cer(IV), UV-
Löschung) aufgereinigt. Nach Einengen im Vakuum wurde das Produkt 5 in CH2Cl2
gelöst und zur Abtrennung des Kieselgels durch Watte filtriert. Nach Einengen und
Trocknen im Vakuum konnte 4-Biotin-LC-PEO-carboxybenzaldehyd 5 als farbloses Öl
(164 mg, 297 µmol, 62 %) erhalten werden.
MS (MALDI, m/z): [M+H]+ = 551.41 (berechnet: 550.67), [M+Na]+ = 573.41
(berechnet: 573.66), [M+K]+ = 589.39 (berechnet: 589.77)
1H-NMR (360 MHz, CD3OD): δ = 10.05 (s, 1H), 7.80-7.84 (m, 2H), 7.54-7.57 (m, 2H),
4.58 (m, 2H), 4.53-4.47 (m, 2H), 4.29 (m, 2H), 3.62-3.67 (m, 12H), 3.48-3.59 (m, 1H),
2.88-2.93 (m, 1H), 2.66-2.70 (m, 1H), 2.15-2.21 (m, 2 H), 1.61-1.64 (m, 4H), 1.41-1.43
(m, 2H)
3.3 Aufreinigung und Nachweis von Nukleinsäuren 27
3.3 Aufreinigung und Nachweis von Nukleinsäuren
3.3.1 Denaturierende Polyacrylamid-Gelelektrophorese Das Prinzip der Elektrophorese beruht darauf, dass sich ein geladenes Molekül in einem
elektrischen Feld bewegt. Dabei ist die Geschwindigkeit des Moleküls proportional zu
seiner Gesamtladungsdichte, Größe und Form, die elektrophoretische Mobilität
umgekehrt proportional zu der molaren Masse. Da Nukleinsäuren Moleküle einer relativ
homogenen Zusammensetzung mit konstanter Form und Ladungsdichte sind, können
sie durch Elektrophorese getrennt werden. Dies geschieht in einer gelartigen Matrix.
Durch Verwendung von Gelmatrices werden Konvektionsströme, die durch kleine
Temperaturgradienten verursacht werden, verhindert und eine effektive Auflösung ist
gegeben. Zudem lässt sich durch die Wahl der Porengröße des Gels ein weiterer
Trenneffekt nach Größe der wandernden Moleküle erzielen. Jene, die kleiner als die
Poren sind, wandern sehr schnell und legen so in einer bestimmten Zeit eine größere
Strecke zurück. Solche, die deutlich größer sind als die Poren, sind praktisch
unbeweglich. Dazwischen gibt es jede Abstufung. Zur elektrophoretischen Trennung
werden häufig Polyacrylamidgele eingesetzt, die sogenannte Polyacrylamid-
gelelektrophorese (PAGE), da sie chemisch inert sind und sich leicht durch
Polymerisation aus dem Monomer Acrylamid herstellen lassen. Ferner lässt sich die
Porengröße durch unterschiedliche Konzentrationen an Acrylamid und dem
Quervernetzer Methylenbisacrylamid einstellen. Durch Zusatz von denaturierenden
Agenzien und der damit verbundenen Zerstörung von Sekundär- und Tertiärstruktur läßt
sich die Gelelektrophorese auch zur Trennung vornehmlich nach der Kettenlänge der
Nukleinsäuren einsetzen. Für die Trennung insbesondere größerer Nukleinsäuren wird
als Gelmatrix bevorzugt Agarose eingesetzt, da sie ein gröberes Maschenwerk bildet.
Das Monomer Acrylamid wurde zusammen mit dem quervernetzenden Reagenz N, N’-
Methylenbisacrylamid durch Zusatz des Radikalstarters Ammoniumperoxodisulfat
(APS) und dem Stabilisator N,N,N’,N’-Tetramethylethylendiamin (TEMED) zur
Polymerisation gebracht. Zur Denaturierung enthielt die Mischung 8.3 M Harnstoff.
3.3 Aufreinigung und Nachweis von Nukleinsäuren 28 Für die Auftrennung von Nukleinsäuren unterschiedlicher Länge wurden
Polyacrylamidgele in verschiedenen Konzentrationen verwendet. Hierfür wurde das
Rotiphorese DNA Sequenziersystem von Roth verwendet und nach Herstellerangaben
vermischt.
Die Polymerisation des Gels wurde durch Zugabe von 400 µl APS (10 % w/v) und
40 µl TEMED gestartet. Die Lösung wurde luftblasenfrei zwischen zwei Glasplatten
gegossen, die zuvor durch Spacer an drei Seiten abgedichtet wurden. Nach Einsetzen
des Kammes für die Taschen zur Probenauftragung wurde das Gel nach der
Polymerisationszeit in einer vertikalen Gelapparatur in 1 x TBE-Puffer ohne Probe
laufen gelassen.
Die Proben wurden mit dem halben Volumen Gelladepuffer versetzt und direkt auf das
Gel aufgetragen.
3.3.2 Autoradiographie Die Autographie stellt die empfindlichste Nachweismethode von radioaktiv markierten
Nukleinsäuren dar. Hierzu wurden die Gele mit 32P-markierter RNA von einer
Glasplatte gelöst, mit Folie eingeschlagen und in einer Röntgenkassette mit einem
Röntgenfilm exponiert und anschließend entwickelt. Die Expositionszeit richtete sich
dabei nach der Intensität der Strahlung.
Wahlweise wurden die Gele auch mit einem Phosphorimager ausgewertet.
3.3.3 UV-Shadowing Aufgrund ihrer inhärenten UV-Absorption lassen sich Nukleinsäuren ohne jegliche
Anfärbung sichtbar machen. Hierzu wurde das PAGE auf eine in Folie eingeschlagene
Kieselgelplatte 60 F254 mit Fluoreszenzfarbstoff von Merck gelegt und von oben mit
Licht der Wellenlänge 254 nm bestrahlt. Die Oligonukleotide waren durch
Fluoreszenzlöschung zu erkennen. Aufgrund der sehr geringen Empfindlichkeit dieser
3.3 Aufreinigung und Nachweis von Nukleinsäuren 29 Methode wurde sie nur bei präparativen Gelen angewendet. Die entsprechenden Banden
wurden direkt unter der UV-Lampe ausgeschnitten, wobei die Bestrahlung so kurz wie
möglich gehalten wurde, um photoinduzierte Schäden in den Nukleinsäuren zu
vermeiden.
3.3.4 Isolierung von Nukleinsäuren aus Polyacrylamidgelen Die durch denaturierende PAGE gereinigten Nukleinsäuren wurden aus dem Gel mit
einem Skalpell ausgeschnitten, in etwa 2 x 2 mm große Stückchen zerteilt und mit
0.3 M Natriumacetatlösung pH 5.5 (für anschließende Ethanolfällung) für 1 h bei 80 °C
oder über Nacht bei 37 °C geschüttelt. Die Elutionslösung wurde vorsichtig mit einer
Pipette abgenommen und über einen Mikrozentrifugenfilter (∅ 0.45 µm) filtriert, um
evtl. mitgeschleppte Gelstücke abzutrennen.
3.3.5 Agarosegele Nach jeder Selektionsrunde wurden für die Analyse der DNA-Produkte aus der PCR
2 %-ige (w/v) Agarosegele verwendet. Hierzu wurde 1 g Agarose in 50 ml 0.5 x TBE
gegeben, in einer Haushaltsmikrowelle zum Sieden gebracht und durch Umschwenken
gelöst. Nach Abkühlung auf etwa 40 °C wurden 2 µl Ethidiumbromid (1 %-ige Lösung
in Wasser) zur flüssigen Agarose gegeben und in eine horizontalen Gelapparatur mit
Kamm gegossen. Nach dem Erkalten und Erstarren des Gels wurden die Proben in
nativem Probenpuffer (30% Glycerin, 0.5x TBE) mit je 0.03 % der Farbstoffe
Bromphenolblau und Xylencyanol aufgetragen. In einer Nachbarspur wurde eine DNA-
Leiter als Längenmarker aufgetragen.
3.3 Aufreinigung und Nachweis von Nukleinsäuren 30 3.3.6 Färbung mit Ethidiumbromid Ethidiumbromid ist ein heterocylischer, aromatischer Fluoreszenzfarbstoff, der durch
Interkalation an Nukleinsäuren binden kann. Hierbei wird die Fluoreszens im UV-
Bereich im Vergleich zum freien Farbstoff intensiviert. Doppelsträngige DNA erzeugt
dabei eine stärkere Fluoreszens als einzelsträngige DNA oder RNA. Ab einer gewissen
Mindestmenge an Nukleinsäure (> 0.01 OD260) ist diese Methode zum schnellen
Nachweis gut geeignet und wurde bei den analytischen Agarosegelen eingesetzt. Hierzu
wurde Ethidiumbromid direkt zu den Agaroselösungen gegeben. Auf einem
Transilluminator mit Licht der Wellenlänge 306 nm konnten die Nukleinsäurebanden
durch orange Fluoreszenz sichtbar gemacht werden.
3.3.7 Gelfiltration Mit Hilfe der Gelfiltration können aus Nukleinsäurelösungen Salze abgetrennt werden.
Es beruht auf dem Prinzip der Permeations-Chromatographie, bei dem ein Gel mit einer
bestimmten Porengröße verwendet wird. Ab einer gewissen Größe sind Moleküle nicht
mehr in der Lage, in diese Poren einzudringen und werden zuerst eluiert. Kleinere
Moleküle permeieren die stationäre Phase und werden deshalb entsprechend retardiert.
Es kamen vorgepackte Chromatographiesäulen mit Sephadex G25-Material (NAP) der
Firma Amersham zum Einsatz und wurden nach den Angaben des Herstellers
verwendet.
3.3.8 Hochdruckflüssigkeitschromatographie (HPLC) Die Reinigung des Dinukleotids 1 und des Derivats 3 erfolgte über HPLC. Bei der
HPLC handelt es sich um eine Säulenchromatographie, die durch Verwendung von sehr
feinkörnigem Trägermaterial (5 - 10 µm) als stationäre Phase eine sehr geringe
Trennstufenhöhe und damit verbunden eine große Trennleistung erreicht. Zur
3.3 Aufreinigung und Nachweis von Nukleinsäuren 31 Auftrennung von Nukleinsäuren wird eine unpolare Umkehrphase (reversed phase, RP)
als stationäre Phase eingesetzt, bei der die polaren Silanolgruppen von Kieselgel mit
Alkylsilanen modifiziert sind. Hier kam eine C18-Säule mit 18 Kohlenstoffatomen in der
Alkylkette (Luna 80 C18, 5 µm, 250 x 4.6 mm, Phenomenex) zum Einsatz. Als mobile
Phase wurde ein binäres Gradientensystem aus 0.1 M TEAAc, pH 7.0 und 0.1 M
TEAAc, pH 7.0 in 80 % Acetonitril verwendet. Die chromatographische Trennung
wurde mit einer Flussgeschwindigkeit von 1 ml/min und einer Säulentemperatur von
45 °C durchgeführt. Die Detektion erfolgte durch UV-Absorption bei 254 und 260 nm.
Es wurde die 1100 Serie von Agilent und die Software ChemStation verwendet.
Gradient A
t [min] 0 5 18 21 25 28
0.1 M TEAAc, 80 % MeCN, pH 7.0 [%] 1 20 22.6 100 100 1
Um während der Selektion den Überschuß an biotinylierten Aldolakzeptor 5 zu
entfernen, wurde die zuvor gefällte RNA durch eine Gelfiltrationsäule (Tosohaas
TSKgel G300 SWXL-400, 5 µm, 300 x 7.8 mm) an der HPLC aufgereinigt. Es wurde
isokratisch mit 0.2 M NaOAc mit 1 % MeOH, pH 6.0 bei einem Fluß von 0.6 ml/min
eluiert. Die Säulentemperatur betrug hier 25 °C.
3.3.9 Ethanolfällung Die am häufigsten angewendete Methode, um Nukleinsäuren zu konzentrieren und
dabei niedermolekulare Bestandteile größtenteils abzutrennen, war die Ethanolfällung.
Zunächst wurde die Lösung mit 3 M NaOAc pH 5.5 auf 0.3 M eingestellt. Die Lösung
wurde dann mit dem 2-fachen Volumen an Ethanol (- 80 °C) gemischt und sofort für
mindestens 25 min bei 9000 x g und 0 °C zentrifugiert. Schwer zu präzipitierende
Proben wurden zuvor über Nacht bei -20 °C gefällt. Das erhaltene Pellet wurde vom
Überstand befreit, einmal mit 80 % kaltem Ethanol gewaschen und anschließend 2 min
zentrifugiert. Das Pellet wurde vom Überstand getrennt und im Vakuum getrocknet.
3.3 Aufreinigung und Nachweis von Nukleinsäuren 32 3.3.10 Photometrische Quantifizierung Nukleinsäuren lassen sich aufgrund der starken Absorption ihrer Nukleobasen
photometrisch detektieren und quantifizieren. Die Extinktionsmaxima und
-koeffizienten der einzelnen Basen liegen im UV-Bereich, sind aber unterschiedlich und
werden von der spezifischen Sequenz leicht beeinflusst. Deshalb wird die
Quantifizierung bei 260 nm durchgeführt und über die Näherungsformel
Basen der Anzahl100GesamtOD
=[nmol] Stoffmenge 260 ⋅
kann die Stoffmenge der Nukleinsäure bestimmt werden. Hierbei ist die optische Dichte
OD260 die Menge, die in 1 ml Wasser gelöst, bei 260 nm in einer Küvette mit 1 cm
Schichtdicke einen Absorptionswert von 1 erzeugt.
Die Konzentrationen der Dinukleotidanaloga wurden unter Anwendung des Lambert-
Beer’schen Gesetzes
dc =E ⋅⋅ε
bestimmt. E bezeichnet die Extinktion, ε den molaren Extinktionskoeffizienten in
M-1cm-1, c die Konzentration in mol/l und d die Schichtdicke der Küvette in cm. Der
Extinktionskoeffizient des Dinukleotids bei 260 nm berechnete sich additiv aus dem der
beiden Cytidinen (ε260 = 6541 M-1cm-1) ohne Berücksichtigung anderer im Dinukleotid
enthaltener chromophorer Gruppen.
3.3.11 Quantifizierung durch Radioaktivität Eine sehr empfindliche Methode zur Detektion von Nukleinsäuren ist das Markieren mit 32P durch molekularbiologische Methoden. Die Quantifizierung von radioaktiv
markierten Proben erfolgte mittels eines Szintillationszählers. Hierbei wurde die Probe
3.4 Molekularbiologische Methoden 33 mit einem Aliquot als Referenz direkt vermessen. Die Berechnung der Stoffmenge
erfolgte wie bei der T7-Transkription in Kapitel 3.4.1 beschrieben.
Um die Selektionsausbeute der jeweiligen Runden zu bestimmen, wurde das Verhältnis
der Radioaktivitätsmenge in cpm vor und nach der Immobilisierung bestimmt.
3.4 Molekularbiologische Methoden
3.4.1 T7-Transkription
In vitro lässt sich eine gegebene DNA-Sequenz mittels der DNA-abhängigen RNA-
Polymerase des Bakteriophagen T7 in die komplementäre RNA umschreiben.
Vorrausetzung hierfür ist ein 17 Basenpaar langer doppelsträngiger Erkennungsbereich
am 3’-Ende (T7-Promotor) des DNA-Templats. Dieser Promotorbereich ermöglicht die
Anlagerung der RNA-Polymerase, wird aber nicht im Verlauf der Transkription in RNA
umgeschrieben und muß daher bei der PCR wieder in die DNA eingeführt werden. Der
Einbau der Nukleobasen erfolgt in Form von Nukleosidtriphosphaten (NTPs). Durch
Einsetzen von α-32P-markiertem NTP lässt sich die herzustellende RNA radioaktiv
markieren. Die RNA-Synthese beginnt immer mit einem Guanosin, wobei sich die
Ausbeute der Transkription deutlich erhöht, wenn die RNA mit zwei oder mehreren
Guanosinen beginnt.36, 197
Als DNA-Templat während der in vitro Selektion diente dsDNA, die aus der PCR der
vorangegangenen Selektionsrunde stammte.
Zur radioaktiven Markierung wurde α-32P-CTP verwendet. Die Inkubation eines
Transkriptionsansatzes erfolgte mindestens drei Stunden oder über Nacht bei 37 °C.
3.4 Molekularbiologische Methoden 34 Ein Standardansatz setzt sich wie folgt zusammen:
Endkonzentration Reagenz
10x Transkriptionspuffer
10 mM DTT
0.4 mg/ml BSA
4 mM NTP
0.34 µM DNA-Templat
0.4 - 1.7 µCi/µl α-32P-CTP
0.4 u/µl T7 RNA-Polymerase
Zur späteren Quantifizierung der Transkription wurde ein 1 µl Aliquot dem
Transkriptionsansatz entnommen. Zur Isolierung der RNA wurde der
Transkriptionsansatz entweder auf ein denaturierendes 12 % PAGE gegeben, durch
Autoradiographie detektiert, aus dem Gel ausgeschnitten, eluiert und durch
Ethanolfällung entsalzt oder mittels des RNA/DNA Mini Kits von Qiagen® nach
Herstellerangaben aufgereinigt. Die erhaltene RNA und das Aliquot wurden im
Szintillationszähler vermessen. Für die Quantifizierung der RNA dienten folgende
Gleichungen:
[cpm] oaktivitätGesamtradi eeingesetzt [cpm]RNA der ität Radioaktiv = CTP-P32- des Einbaurate α
Transkript im Cytidineder Anzahll][ CTPVolumen [mM]CTPion KonzentratEinbaurate =[nmol] Stoffmenge-RNA μ⋅⋅
3.4.2 T4-RNA Ligation
Das Enzym T4-RNA-Ligase verestert die 3’-Hydroxylgruppe einer RNA mit der 5’-
Phosphatgruppe eines weiteren RNA-Moleküls in Gegenwart von ATP. Sollen längere
Oligonukleotide miteinander ligiert werden, müssen das 3’- und 5’- Ende räumlich
durch eine komplementäre, hybridisierte Matrize zusammengeführt werden.198, 199
3.4 Molekularbiologische Methoden 35 Da die T4-RNA-Ligase eine hohe Toleranz gegenüber Modifikationen in der zu
ligierenden RNA aufweist,67 konnte die Einführung des linkergekoppelten Aldoldonors
3 in den RNA-Pool durch die T4-RNA-Ligase erfolgen. Durch zuvorige Hybridisierung
eines Primers B-4, der zum 3’- Ende des RNA-Pools komplementär ist, konnte die
Ligationseffizienz erhöht werden. Die Inkubation erfolgte 4.5 Stunden bei 18 °C unter
Schütteln.
Standardansatz:
Hybridisierung
5 µM RNA
10 µM Primer B-4
10 min bei 90 °C, dann 10 min auf Eis
Ligation
10 x Ligationspuffer
0.02 mg/ml BSA
0.2 mM ATP
10 % (v/v) DMSO
38 µM Dinukleotid 3
2-4 u/µl T4-RNA-Ligase
4.5 h bei 18 °C
Der Ligationsansatz wurde nach der Inkubationszeit gefällt und durch Aufreinigung auf
einem 12 % PAGE konnte die RNA vom RNA-Konjugat getrennt werden. Nach
dreimaliger Elution der Gelstücke und anschließender Ethanolfällung lag das Konjugat
als Pellet vor.
3.4 Molekularbiologische Methoden 36
3.4.3 Radioaktive 5’-Markierung durch Phosphorylierung
Die Hydroxlygruppe des 5’-Ende eines Oligonukleotids lässt sich mit dem Enzym
Polynukleotid-Kinase (PNK) des T4-Phagens phosphorylieren, wobei das γ-Phosphat
eines ATP übertragen wird. Verwendet man bei der Kinasierung γ-32P-ATP wird somit
eine 5’-terminale radioaktive Markierung des Oligonukleotides ermöglicht.
Zur radioaktiven Markierung des Dinukleotids 1 und seines Derivats 3 musste das 5’-
Ende zuvor durch das Enzym Shrimp Alkalische Phosphatase (SAP) dephosphoryliert
werden.
Dephosphorylierung
10 x SAP-Puffer
0.5 µM Dinukleotid 1 bzw. 3
0.1 u/µl SAP
1 h bei 37 °C, Inaktivierung der SAP 10 min bei 80 °C, dann 10 min auf Eis
Kinasierung
10 x PNK-Puffer A
0.4 - 1.7 µCi/µl γ-32P-ATP
0.5 u/µl T4-PNK
1 h bei 37 °C
Anschließend wurde der Ansatz durch ein 22.5% denaturierendes PAGE aufgereinigt,
das Dinukleotid mit Wasser eluiert und durch Gelfiltration entsalzt.
3.4.4 Reverse Transkription
Um nach einer Selektionsrunde die selektierte RNA durch PCR amplifizieren zu
können, musste sie zunächst in cDNA umgeschrieben werden. Dies erfolgte durch eine
RNA-abhängige DNA-Polymerase (reverse Transkriptase), die einen gegebenen DNA-
3.4 Molekularbiologische Methoden 37 Primer verlängert. Hierzu muß der Primer an das 3’-Ende der RNA hybridisieren und
wird dann komplementär zum RNA-Templat durch das Enzym vervollständigt. In der
Selektion wurde die SuperScript II RNase H- reverse Transkriptase (Invitrogen)
eingesetzt, die eine RNase H-Deletion aufweist.
Als RNA-Matritze diente die selektierte RNA, die entweder noch über Biotin an
Streptavidin-Agarose gebunden war oder frei in Lösung vorlag. In alle Ansätze wurde
BSA zugegeben, was eine mögliche Adsorption der reversen Transkriptase an der
Festphase unterbinden sollte.
Standardansatz:
Hybridisierung
RNA
6.67 µM Primer B
10 min bei 85 °C, dann 4 min 0 °C
Reverse Transkription
5x 1st strand buffer
0.5 mg/ml BSA
4.17 mM DTT
0.5 mM dNTP
2 min bei 55 °C
3.33 u/µl Superscript
1h bei 55 °C
3.4.5 Polymerase-Kettenreaktion (PCR)
Die PCR (polymerase chain reaction) ist eine Methode, bei der selbst ein einzelnes
DNA-Molekül exponentiell vervielfältigt werden kann. Voraussetzung hierzu ist der
Einsatz kurzer, 20 -30 langer Oligonucleotide (Primer), die komplementär zum 3’- und
5’-Ende der zu amplifizierenden DNA sind.200
3.4 Molekularbiologische Methoden 38 Die PCR ist ein iterativer Prozeß und lässt sich in drei Abschnitte unterteilen. Zuerst
wird die doppelsträngig vorliegende DNA durch kurzes Erhitzen auf 93 -100 °C
aufgeschmolzen. Durch schnelles Abkühlen auf die Hybridisierungstemperatur (37 -
65 °C) und einen großen Primerüberschuß wird die Rückbildung des vorher
vorliegenden DNA-Doppelstranges unterbunden und die Anlagerung der Primer kann
erfolgen. Im Anschluß wird dann die DNA-Synthese durch eine DNA-abhängige,
themostabile DNA-Polymerase ausgehend von den angelagerten Primern durchgeführt.
Hierbei fügt die Polymerase Desoxynukleosidtriphosphate (dNTPs) an das
3’-Primerende an, so dass eine komplementäre Kopie des Templats entsteht. Für die
hier verwendete Taq-Polymerase, die aus dem thermostabilen Bakterium Thermus
aquaticus isoliert wird, wurde eine Elongationstemperatur von 72 °C verwendet.
Für die PCR-Amplifikation der selektierten RNA wurde der gesamte Ansatz der
reversen Transkription verwendet. Die durchgeführte PCR wurde mittels 2 %-igem
Agarosegel analysiert.
Standardansatz: Temperaturbedingungen:
PCR 94 °C 3:00 min Denaturierung vor 1. Zyklus
RT-Ansatz
4 µM Primer A 94 °C 1:00 min Denaturierung
10x-PCR-Puffer 50 °C 1:30 min Hybridisierung
4 mM MgCl2 72 °C 2:30 min Elongation
0.25 mM dNTP 13 - 16 Cyclen
0.05 u/µl Taq-Polymerase 72 °C 10:00 min finale Elongation
Um eine DNA-Ausgangsbibliothek für die in vitro Selektion herzustellen, wurde der am
Synthesizer hergestellte DNA-Pool durch eine präparative PCR amplifiziert.
Idealerweise sollten hierbei von möglichst allen Sequenzen einige Kopien erhalten
werden. Außerdem wurde durch den Primerüberhang am 3’-Ende (Primer A) der T7-
Promotorbereich eingefügt. Damit eine möglichst vollständige Polymerisation aller
vorliegenden Matrizen gewährleistet war, wurden die Matrizenkonzentration erhöht,
und die Hybridisierungs- und Extensionszeiten verlängert.
3.4 Molekularbiologische Methoden 39
Temperaturbedingungen:
präp. PCR 94 °C 3:00 min Denaturierung vor 1. Zyklus
65 µM ssDNA
5 µM Primer A 94 °C 2:00 min Denaturierung
7.5 µM Primer B 50 °C 6:00 min Hybridisierung
10x-PCR-Puffer 72 °C 10:00 min Elongation
4 mM MgCl2
0.2 mM dNTP 8 Cyclen
0.02 u/µl Taq-Polymerase
3.4.6 Klonierung Die nach der 13. bzw. 14. Selektionsrunde der zweiten Selektion erhaltenen
katalytischen RNA-Moleküle wurden revers transkribiert und mittels PCR amplifiziert.
Dabei wurde durch Inkubation für weitere 10 Minuten bei 72 °C nach der PCR erreicht,
dass die PCR-Produkte durch die Taq-Polymerase 3’-terminal adenyliert wurden. Diese
DNA-Moleküle wurden dann mit dem PCR Cloningplus Kit der Firma Qiagen® in einen
Plasmidvektor (pDrive Cloning Vector) kloniert. Dabei wurde nach den Vorschriften
des Herstellers gearbeitet. Das Klonierungskit beinhaltet einen linearisierten Vektor
(pDrive Cloning Vector), der einen einzelnen 3’-überhängenden Uridin-Rest besitzt und
dadurch die Ligation des 3’-adenylierten PCR-Produktes ermöglicht. Die Ligation
wurde für eine Stunde bei 4 °C durchgeführt. Der Vektor wurde danach in die
mitgelieferten kompetenten Zellen transformiert. Diese E. coli-Zellen
(Qiagen EZ Competent Cells) wurden entsprechend den Herstellerangaben auf LB-
Platten (Luria-Bertani-Medium) ausgestrichen und über Nacht bei 37 °C inkubiert. Die
LB-Platten enthielten Ampicillin als Selektionsmarker und wurden zuvor mit X-gal
(5-Brom-4-chlor-3-indoyl-β,D-galactopyranosid) und IPTG (Isopropylthio-β,D-
galactopyranosid) behandelt. Diejenigen Zellen, in die erfolgreich ein Plasmid
transformiert wurde, konnten durch die Plasmid-vermittelte Antibiotika-Resistenz auf
dem Medium wachsen. Die Stelle im Plasmid, in welche die DNA kloniert wurde,
3.4 Molekularbiologische Methoden 40 befindet sich mitten im Plasmid-Gen für das α-Peptid der β-Galactosidase. Diese
β-Galactosidase spaltet mit Hilfe von IPTG X-gal in einen blauen Farbstoff. Die nicht-
rekombinanten Klone mit noch intaktem Gen sind so durch ihre Blaufärbung zu
erkennen, Klone mit insertierter DNA, und somit defektem Gen, sollten weiße Kolonien
bilden.
Die von den LB-Platten isolierten Klone wurden durch PCRs amplifiziert und parallel
in LB-Übernachtkulturen vervielfältigt. Die PCRs wurden mit zwei verschiedenen
Primerkombinationen (Primer A und B der PCR und die Standardprimer M13rev und
M13for(-21) für das Sequenzieren) durchgeführt, um zu überprüfen, ob die Klone das
Insert trugen.
3.4.7 LB-Übernachtkulturen
Um die DNA-Plasmide in vivo für die anschließende Sequenzierung zu amplifizieren,
wurden LB-Übernachtkulturen angelegt. Hierzu wurden die Klone in 5 ml LB-Medium,
das ebenfalls Ampicillin als Selektionsmarker enthielt, geimpft und unter Schütteln bei
37 °C über Nacht kultiviert. Nach der Inkubation wurden die Kulturen bei 4000 rpm
zentrifugiert, der Überstand verworfen und das erhaltene Pellet der Plasmidaufreinigung
unterworfen.
3.4.8 Glycerinkultur
Zum Aufbewahren von Bakterienkolonien über einen längeren Zeitraum eignen sich
Glycerinkulturen, die bei -80 °C ohne Verlust der Vitalität gelagert werden können.
Hierfür wurden 700 µl der LB-Übernachtkultur mit 300 µl Glycerin vermischt und
sofort eingefroren.
3.5 Durchführung der in vitro Selektion 41 3.4.9 Plasmidaufreinigung (Miniprep)
Aus einer 5 ml Übernachtkultur wurden mit Hilfe des QIAprep® Spin Miniprep Kit der
Firma Qiagen nach Anleitung des Herstellers Minipräparationen durchgeführt, wobei
sich Erträge von 1.9 - 7.5 µg reiner Plasmid-DNA ergaben. Zur Elution der DNA
wurden 50 µl 10 mM TrisCl, pH 8.5 bzw. Millipore-Wasser verwendet. Die
Quantifizierung der Plasmid-DNA erfolgte photometrisch.
3.4.10 Sequenzierung
Die Sequenzierung der aus der Minipräparation erhaltenen Plasmide wurde durch die
Firma Seqlab, Göttingen, durchgeführt. Hierzu wurden 600 - 700 ng Plasmid und 20
pmol Primer M13rev in 7 µl Tris-Puffer (10 mM Tris.Cl, pH 8.5) gelöst.
Die Auswertung der Sequenzdaten wurden mit dem Program Chromas Version 2.3
durchgeführt. Zum Auffinden von Sequenzhomologien wurde das Programpaket
Multialign201 verwendet.
3.5 Durchführung der in vitro Selektion
3.5.1 Selektion I
Für den Start der ersten Selektion wurden zwei Komplexitäten des Ausgangspools mit
2.18 · 1014 verschiedenen Sequenzen über Nacht transkribiert, wobei die
Endkonzentration des DNA-Templates 0.34 µM betrug. Die Aufreinigung des
Transkripts erfolgte durch das Qiagen RNA/DNA Midi Kit®. Nach der Fällung lagen
31.6 nmol RNA vor, was ca. 87 Kopien pro Spezies entsprach.
Die Ligation wurde wie beschrieben (Kapitel 3.4.2) durchgeführt und über ein
6 % PAGE aufgereinigt. Es wurden zwei Banden erhalten, ausgeschnitten, eluiert und
gefällt. Die nicht-ligierte RNA wurde nochmals der Ligation mit allen Schritten
3.5 Durchführung der in vitro Selektion 42 unterzogen. Es konnten 2.9 nmol RNA-Konjugat L1, was ca. 8 Kopien der
Ausgangsbibliothek entsprach, erhalten werden.
Für die Durchführung der Reaktion wurde das gesamte RNA-Ligat L1 zunächst in
Selektionspuffer und Wasser gelöst, für 5 min auf 85 °C erhitzt und zum Renaturieren
für 30 min bei RT abgekühlt. Danach wurden die Cofaktoren (Endkonzentrationen s.
Tabelle 3-1) hinzugegeben und mit der Zugabe von 50 mM des biotinylierten
Aldolakzeptors 5 die Reaktion gestartet. Die Reaktion wurde für 24 h bei 25 °C
geschüttelt. Die Endkonzentration des RNA-Ligats L1 betrug 1 µM.
NaCl 200 mMKCL 100 mMCaCl2, Mg Cl2 je 5 mMZnCl2 500 µMAlCl3, CoCl2, CuCl2, MnCl2 je 5 µML-Lysin 500 µMH-His-Lys-OH 5 µM
Tabelle 3-1: Endkonzentrationen aller Cofaktoren
Um den Überschuß an Aldolakzeptor 5 abzutrennen, wurde zunächst der gesamte
Reaktionsansatz ethanolgefällt, das erhaltene Pellet in Wasser gelöst und durch
Gelfiltration gereinigt. Fraktionen mit RNA wurden nochmals ethanolgefällt und das
resultierende Pellet in 400 µl Immobilisationspuffer resuspendiert.
Für die Immobilisierung wurden 200 µl einer Suspension von Streptavidin-Agarose auf
einen Mikrozentrifugenfilter gegeben, die Lösung bei 2000 rpm abzentrifugiert und
verworfen. Der gesamte Filter wurde zu Absättigung von unspezifischen
Bindungsstellen zweimal mit je 350 µl tRNA-haltigem (2 mg/ml)
Immobilisationspuffer für 10 min unter Schütteln inkubiert. Anschließend wurde die
Festphase noch zweimal mit je 350 µl Immobilisationspuffer gewaschen. Danach wurde
die RNA-Lösung auf die im Spinfilter befindlichen Agarosepartikel gegeben, durch
mehrmaliges Aufziehen der Pipette mit dieser vermischt und für 1 h bei 25 °C unter
Schütteln inkubiert.
Nach der Immobilisierungszeit wurde die überstehende Lösung durch Zentrifugation
abgetrennt. Die nicht-bindenden RNAs wurden durch 20 Waschungen der Festphase mit
3.5 Durchführung der in vitro Selektion 43 je 400 µl denaturierenden Waschpuffer und abschließend fünfmal mit dem gleichen
Volumen an Wasser abgetrennt.
Für die Abspaltung der RNA von der Festphase wurde die Streptavidin-Agarose in
350 µl Wasser suspendiert und zweimal je 30 s mit einem Laser (355 nm, 10 Hz,
5 mJ/Puls, 7 ns/Puls) bestrahlt, wobei die Festphase unmittelbar vor jeder Bestrahlung
aufgeschlämmt wurde. Danach wurde die Festphase zentrifugiert, zweimal mit je 350 µl
Wasser gewaschen, die erhaltenen Filtrate vereinigt und eingeengt. Abschließend wurde
die im Filtrat erhaltenen RNA durch RT-PCR amplifiziert.
Für die Transkription der zweiten Runde dienten 1/10 der aus der PCR resultierenden,
ethanolgefällten dsDNA als Templat, ab Runde drei wurde direkt 1/10 des PCR-
Ansatzes als Templat in der Transkription eingesetzt. Die Ligationen der weiteren
Runden wurden mit 1.7 – 2.3 nmol Transkript durchgeführt, wobei 400 pmol -1.1 nmol
RNA-Konjugat L1 erhalten wurden. Nach 12 Runden wurde die erste Selektion
beendet.
3.5.2 Selektion II
Die zweite Selektion wurde mit einem Anfangspool mit ca. 1.49 · 1015 verschiedenen
Sequenzen gestartet, wobei in der ersten Runde ca. 51 Kopien durch die Transkription
erhalten wurden. Die Aufreinigung des Transkripts erfolgte durch 12 % PAGE. Nach
dreimaligen Eluieren und Fällen wurde die gesamte RNA ligiert, wodurch 10.2 nmol
RNA-Konjugat L2 erhalten werden konnte. Die Reaktion wurde analog zu der ersten
Selektion durchgeführt, allerdings mit 500 µM L-Prolin als zusätzlichen Cofaktor. Die
Reaktionszeit betrug 4 h.
Nach der Reaktion wurde wie in der ersten Selektion (Kapitel 3.5.1) verfahren. Um
einen RNA-Verlust bei den Fällungen nach der Reaktion und der Gelfiltration zu
minimieren, wurden zusätzlich alle verwendeten Reaktionsgefäße vor Benutzung mit
einem entsprechenden tRNA-haltigen Puffer (2 mg/ml) gespült.
3.5 Durchführung der in vitro Selektion 44 Bis einschließlich der 3. Selektionsrunde wurde auf die Laserspaltung verzichtet und die
RNA direkt von der Festphase amplifiziert. Hierfür wurde die Streptavidin-Agarose in
ein Reaktionsgefäß überführt, der Spinfilter zweimal mit je 100 µl Wasser nachgespült,
die Lösung mit der Festphase vereinigt und schließlich zentrifugiert. Der Überstand
wurde dann vorsichtig abgetrennt und mit den abgesetzten Partikeln die RT-PCR
durchgeführt. In der 4. Runde wurde das umgesetzte RNA-Konjugat L2a auf zwei
Festphasen aufgeteilt, um parallel zu der direkten Selektion eine mit UV-Spaltung des
RNA-Ligats L2a von der Streptavidin-Agarose nach der Immobilisierung auszuführen.
Die Spaltung mit Hilfe des Lasers wurde wie in der ersten Selektion (Kapitel 3.5.1)
beschrieben durchgeführt.
In der 7. Runde erfolgte in dem direkten Selektionspfad eine Gegenselektion gegen
Streptavidin- und Agarosebinder. Das RNA-Ligat L2 wurde hierfür 4 h unter den
genannten Reaktionsbedingungen allerdings ohne den Biotinakzeptor 5 umgesetzt.
Nach der Reaktion wurde die RNA L2 durch Ethanol gefällt, das erhaltene Pellet in
Immobilisierungspuffer gelöst, auf die vorbehandelte Streptavidin-Agarose gegeben
und für 1 h bei 25 °C unter Schütteln immobilisiert. Danach wurde die RNA-Lösung
abzentrifugiert und aus dem Filtrat das RNA-Konjugat L2 gefällt. Mit diesem RNA-
Konjugat L2 wurde dann die Reaktion mit Biotinakzeptor 5 duchgeführt und die
restlichen Selektionsschritte wie zuvor beschrieben durchlaufen.
In der 9. Runde wurde eine weitere Gegenselektion durchgeführt, diesmal gegen
Nebenreaktionen an der RNA. Das Transkript wurde direkt, ohne zuvor ligiert zu
werden unter den genannten Reaktionsbedingungen in Gegenwart von dem
biotinylierten Aldolakzeptor 5 für 4 h umgesetzt, danach gefällt und im Anschluß daran
die Immobilisierung durchgeführt. Die nicht-immobilisierte RNA wurde gefällt und die
Selektion entsprechend der Bedingungen für die erste Selektion (Kapitel 3.5.1) ab der
Ligation weitergeführt.
In der 10. Runde wurde der direkte Selektionspfad in zwei verschiedene Richtungen
entwickelt, wobei die Vorgehensweise wie bei Einführung der parallel laufenden
Selektion mit Laserspaltung war. Zum einen wurden die Reaktionszeiten sukzessiv
verkürzt (10. Runde: 1 h, 11. Runde: 10 min, 12. - 14. Runde: 1 min), zum anderen die
Konzentrationen an biotinylierten Aldolakzeptor 5 (11. Runde: 10 mM, 12. und 13.
3.6 Reaktionskinetiken 45 Runde: 4.7 mM) verringert. Nach insgesamt 13 bzw. 14 Selektionsrunden wurden die
angereicherten Pools kloniert und sequenziert.
3.6 Reaktionskinetiken
3.6.1 Geschwindigkeitskonstanten der immobilisierten RNA
In jeder Selektionsrunde wurde aus dem Prozentsatz der immobilisierten RNA
(RNAimmo) die scheinbare (apparent) Reaktionsgeschwindigkeitskonstante kapp 2.
Ordnung für die selektierte RNA nach folgender Gleichung berechnet:
0t
t0
00
app
]Akzeptor[]Ligat[]Akzeptor[]Ligat[
ln)]Ligat[]Akzeptor([t
1k
⋅⋅
−⋅=
⋅
wobei [Akzeptor]0 und [Ligat]0 für die Ausgangskonzentrationen des biotinylierten
Aldolakzeptors 5 und des RNA-Ligats L2 stehen. Die entsprechenden Konzentrationen
zur Zeit t wurden wie folgt bestimmt:
0
immot
]Ligat[100RNA100
]Ligat[⋅
−=
[Akzeptor]t = [Akzeptor]0 – [Ligat]0 + [Ligat]t
3.7 Kinetisches Assay mittels Gelshift 46
3.7 Kinetisches Assay mittels Gelshift
3.7.1 Gelshift mit Dinukleotidanalogon 3
Für die Ermittlung der Hintergrundreaktion wurden 1µM Aldoldonor modifiziertes,
radioaktiv markiertes Dinukleotid 3 („DN-Aldol“) bei 25 °C im Selektionspuffer mit je
50 mM L-Lysin und L-Prolin gelöst. Die Reaktion wurde durch die Zugabe von 50 mM
Biotinakzeptor 5 gestartet. Nach entsprechenden Zeitabständen wurden 15 µl Aliquots
aus dem Ansatz genommen, mit demselben Volumen an PAGE-Ladepuffer versetzt und
bei -80 °C gelagert. Durch Gelshift auf einem 22.5 % denaturierenden PAGE wurden
die Proben analysiert und mit dem Phosphorimager quantifiziert.
3.7.2 Streptavidinshift mit selektierter RNA
Die Kinetiken der intramolekularen Reaktion zwischen dem an das entsprechende,
radioaktiv markierte Klontranskript gebundenen DN-Aldol 3 und dem Biotinakzeptor 5
wurden auf einem kombinierten 4 % und 12 % Page analysiert. Hierzu wurde die
Reaktion wie in der zweiten Selektion (Kapitel 3.5.2) mit 4.7 mM Biotinakzeptor 5
beschrieben durchgeführt. In bestimmten Zeitabständen wurden 10 µl Aliquots
entnommen, mit 10 µl Stoppuffer versetzt und bei -80 °C gelagert. Anschließend
wurden alle Proben parallel ethanolgefällt, die Pellets in je 10 µl Immobilisationspuffer
gelöst, mit 10 µl Streptavidinlösung (1 mg/ml) versetzt und für 30 min bei 25 °C
inkubiert. Da Streptavidin Biotin in einem stabilen Komplex bindet, ist ein Shift
zwischen dem RNA-gebundenen Aldolprodukt und der nicht-reagierten RNA zu
beobachten. Der Umsatz der Reaktion ließ sich mit dem Phosphorimager bestimmen.
3.8 Kinetisches Assay mittels Immobilisierung 47 3.8 Kinetisches Assay mittels Immobilisierung
Eine weitere Möglichkeit, die Kinetik der intramolekularen Reaktion zu verfolgen, ist
analog zu der Selektion (Kapitel 3.5) die Immobilisierung auf Streptavidin-Agarose und
anschließendes Waschen unter denaturierenden Bedingungen. Für die kinetischen
Experimente wurde die Reaktion einschließlich der Ethanolfällung wie in Kapitel 3.7.2
beschrieben durchgeführt. Die erhaltenen Pellets wurden je in 50 µl
Immobilisationspuffer gelöst und auf vorbehandelte Streptavidin-Agarose in einem
Spinfilter gegeben. Hierzu wurden 50 µl der Streptavidin-Agarose-Suspension wie in
der Selektion mit tRNA behandelt. Die Immobilisierung erfolgte für 30 min bei 25 °C
unter Schütteln. Danach wurde die Festphase gemäß des Selektionsprotokolls
gewaschen. Die Quantifizierung erfolgte durch Auszählen der auf der Festphase
verbliebenen Radioaktivität im Szintillationszähler.
4 Ergebnisse
4.1 Entwicklung der Selektionsstrategie
Die Aldolreaktion ist sowohl in der organischen Chemie als auch in vielen biologisch
wichtigen Stoffwechselwegen, wie z.B. im Zuckermetabolismus, der Glykolyse oder
dem Calvin-Zyklus, eine sehr bedeutende Reaktion. Trotzdem wurde bisher kein
natürliches Ribozym für diese Reaktion entdeckt. Mit dem Prinzip der direkten in vitro
Selektion mit linkergekoppelten Reaktanden sollte es möglich sein, ein Ribozym zur
Katalyse einer Aldolreaktion zu entwickeln.
Zum Erreichen dieses Ziels wurden die verwendeten Aldolkomponenten durch
organische Synthese den Ansprüchen der Selektionsstrategie angepaßt, die verwendeten
Oligonukleotide durch Festphasensynthese hergestellt und bei der Durchführung der
Selektion kamen verschiedene molekularbiologische Techniken zum Einsatz.
Desweiteren wurden unterschiedliche analytische Methoden wie HPLC, UV-
Spektroskopie, MALDI-TOF und NMR-Spektroskopie angewendet.
Das Prinzip der direkten in vitro Selektion zur Generierung von katalytisch aktiver
RNA ist auf die Selbstmodifikation von RNA beschränkt. Die Strategie, einen
Reaktanden kovalent durch einen langen, flexiblen Linker an die RNA zu binden,
ermöglicht, die in vitro Selektion auch auf bimolekulare Reaktionen auszudehnen. Wird
zudem eine spaltbare Einheit in den Linker eingebaut, kann die Reaktion zusätzlich
regiospezifisch erfolgen und Nebenreaktionen, die an der RNA selbst stattfinden,
zurückgedrängt werden. Somit kann die RNA als echter Katalysator agieren.
In der vorliegenden Arbeit sollte für die bimolekulare Aldolreaktion (Abb. 4-1)
zwischen einem Acetophenonderivat 6 und einem modifizierten Benzaldehyd 7 ein
Ribozym in einer in vitro Selektion mit photospaltbaren linkergekoppelten Reaktanden
generiert werden.
4.1 Entwicklung der Selektionsstrategie 49
Abb. 4-1: Der in vitro Selektion zugrunde liegende Aldolreaktion zwischen Acetophenon 6 und Benzaldehyd 7
Um die Selektion durchführen zu können, mussten die Mitglieder der kombinatorischen
RNA-Bibliothek über einen spaltbaren Linker mit einem Aldolreaktanden kovalent
verbunden werden. Hierzu wurde ein Dinukleotidanalogon 1 an seinem 3’-Ende mit
dem Acetophenon 6 als Aldoldonor modifiziert und enzymatisch durch T4-RNA Ligase
an das 3’-Ende der RNA-Sequenzen gekoppelt. Die Spezies des RNA-Pools konnten
dann die Reaktion mit dem biotinylierten Aldolakzeptor Benzaldehyd 7 eingehen. Im
Anschluß an die Reaktion konnten RNA-Moleküle, die erfolgreich die Reaktion
ausführten, durch Streptavidin-Agarose-Affinitätschromatographie isoliert werden, da
sie durch die Reaktion mit dem Benzaldehyd auch das Biotin erwarben. Dabei sollten
RNA-Moleküle, die das Biotin durch die Additions- oder Kondensationsreaktion
erwarben, gleichermaßen immobilisiert werden.
Die im Linker enthaltene photospaltbare Einheit gewährleistete eine weitere Selektion.
Hierdurch können Spezies, die abseits vom vorgegebenen Reaktionszentrum am 3’-
Ende der RNA-Moleküle unspezifisch reagiert haben sollten, abgetrennt werden.
O
O R2
O
O R1
+
O
R1
O
OH
R2
O
RNA
O
R1
O R2
O
RNA
7 6 8
9
4.1 Entwicklung der Selektionsstrategie 50
Abb. 4-2: Strategie der in vitro Selektion mit photospaltbarem Linker zur Generierung eines Aldol-Ribozyms (abgebildet ist nur das Additionsprodukt)
4.1.1 Erstellung der Nukleinsäurebibliotheken
Ausgangspunkt der ersten durchgeführten in vitro Selektion war eine kombinatorische
Bibliothek aus ssDNA mit 159 Nukleotiden, die mittels Festphasensynthese hergestellt
wurde (Abb. 4-3). Der Pool wurde derart konstruiert, dass eine randomisierte Region
von 120 Basen durch zwei konstante Bereiche am 3’- und 5’-Ende flankiert war. Bei
den konstanten Enden handelt es sich um Primerbindungsstellen, die für die
4.1 Entwicklung der Selektionsstrategie 51 Amplifizierung durch RT-PCR am Ende des Selektionszyklus notwendig sind. Während
der RT hybridisiert Primer B an das 20 Nukleotide lange 5’-Ende der RNA und erzeugt
cDNA, die dann durch Zugabe des Primers A in der darauf folgenden PCR amplifiziert
wird. Dabei hybridisiert Primer A an das 19 Nukleotide lange 3’-Ende und führt durch
einen Primerüberhang den notwendigen 17 Nukleotide langen T7-Promotorbereich ein.
Abb. 4-3: Konstruktion der DNA- und RNA-Bibliotheken. Aus dem synthetisierten ssDNA-Pool mit 120 randomisierten Nukleotiden N120 (violett) wurde in einer präparativen PCR unter Einsatz von Primer A (blau) und B (grün) der dsDNA-Pool erzeugt. Dabei wurde der Pool um die T7-Promotorregion (rot) erweitert. Der erhaltene, amplifizierte Pool diente als Templat für das Generieren des RNA-Pools durch eine präparative T7-Transkription am Beginn der Selektion
Für die Synthese des randomisierten Bereichs wurde ein Gemisch der Amidite
dA:dC:dG:dT im Verhältnis 3:3:2:2 eingesetzt. Dieses nicht-äquimolare Verhältnis
wurde zum Ausgleich der unterschiedlichen Kopplungseffizienzen der einzelnen
Phosphoramidite eingesetzt, um die Wahrscheinlichkeit eines gleichverteilten Einbaus
der einzelnen Basen zu gewährleisten. Die Synthese der Bibliothek wurde formal in drei
Teilen durchgeführt. Es wurde mit einem 1 µmol Maßstab für den 3’-Bereich begonnen,
die Synthesen des randomisierten und 5’-Bereiches wurden jeweils im 0.2 µmol
Maßstab fortgesetzt.
Da es bei der chemischen Festphasensynthese von insbesondere längeren DNA-
Sequenzen (über 100 Nukleotide) verstärkt zu Kettenabbrüchen kommt, wurde auf den
Cappingschritt nach den Kopplungen im randomisierten Bereich verzichtet. Der
Cappingschritt soll das Verlängern von nicht-umgesetzten Oligonukleotid aus einem
vorhergehenden Synthesezyklus verhindern. Wird nun das Capping während der
4.1 Entwicklung der Selektionsstrategie 52 Synthese ausgelassen, fallen am Ende auch verkürzte DNA-Sequenzen an, was aber im
Prinzip für den Einsatz in einer in vitro Selektion nicht von Nachteil ist.
Nach der erfolgten Synthese, Entschützung und Gelaufreinigung der ssDNA wurde
überprüft, wieviel DNA sich in einer PCR vollständig amplifizieren ließ, denn nur
Sequenzen, die keine Depurination aufweisen, sind durch die DNA-abhängige
Polymerase amplifizierbar. Es wurden zwei verschiedene Elongationsexperimente
durchgeführt. Zum einen der Einbau von radioaktiven dCTP in einem einzelnen PCR-
Zyklus und zum anderen eine Primer-Extension des 5’-terminal radioaktiv markierten
Primers B35. Der synthetisierte Pool enthielt 2.18 · 1014 verschiedene DNA-Sequenzen,
die durch PCR amplifizierbar waren.
Bevor der DNA-Pool in der Selektion eingesetzt werden konnte, war es nötig, aus den
einzelsträngigen DNA-Sequenzen doppelsträngige zu erzeugen, und eine ausreichende
Anzahl an Kopien der einzelnen Spezien zu erzeugen. Dies wurde durch eine
präparativen PCR erreicht.
Für die zweite Selektion wurde ein DNA-Pool durch die Firma NOXXON synthetisiert.
Dieser Pool wies einen randomisierten Bereich von 70 Nukleotiden auf, die terminalen
Primerbindungstellen waren dieselben wie zuvor. Im Gegensatz zu dem 159 Nukleotide
langen Pool wurde die Synthese mit Capping durchgeführt, um eine definierte
Sequenzlänge zu erhalten. Die Komplexität wurde ebenfalls durch Primer-Extension
und dCTP-Einbau bestimmt, sie betrug 1.49 · 1015. Die Erzeugung von Kopien des
Pools erfolgte durch präparative PCR.
4.1.2 Synthese des funktionalisierten Dinukleotids
Die kovalente Bindung des Aldoldonors Acetophenon 6 an die Mitglieder der
kombinatorischen RNA-Bibliothek wurde durch das universell modifizierbare
Dinukleotid 169, 195, das auch schon in einigen direkten Selektionen mit
linkergekoppelten Reaktanden eingesetzt wurde194, 202, 203, bewerkstelligt.
4.1 Entwicklung der Selektionsstrategie 53 Das Dinukleotid 1 (Abb. 4-4) erfüllt alle Anforderungen, die an die Selektionsstrategie
gestellt wurden. Es trennt den Aldoldonor 6 räumlich von der RNA durch fünf flexible,
chemisch inerte Hexaethylenglycoleinheiten (HEG) und ermöglicht dabei eine freie
Positionierung des Reaktanden zu den potentiellen katalytischen Zentren der RNA. Es
ist zudem mit einer enzymatischen Einführung in den RNA-Pool durch T4-RNA Ligase
kompatibel. Dies wird durch die zwei Cytidine mit einer 5’-terminalen Phosphatgruppe
(pCC) ermöglicht, die zur Substraterkennung für das Enzym dienen und die Ligation an
das 3’-Ende der RNA erlauben.67 Der durch UV-Licht der Wellenlänge 355 nm
spaltbare o-Nitrobenzyl-Ester (X) 196 innerhalb der Hexaethylenglycoleinheiten
ermöglicht die selektive Trennung der RNA von dem Reaktionsprodukt und ggf. von
Nebenprodukten. Die 3’-terminale primäre aliphatische Aminogruppe macht das
einfache Modifizieren mit dem als NHS-Ester aktivierten Reaktanden 2 möglich.
Abb. 4-4: Aufbau des photospaltbaren Dinukleotidanalogons 1
Die Synthese des modifizierbaren Dinukleotids 1 ließ sich zudem einfach durch
Verwendung von handelsüblichen Monomeren am DNA-Synthesizer nach dem
Phosphoramiditverfahren ausführen. Lediglich das Amidit des Photobausteins musste
durch organische Synthese hergestellt werden und wurde von Dr. F. Hausch zur
Verfügung gestellt.
4.1 Entwicklung der Selektionsstrategie 54 4.1.3 Derivatisierung des Dinukleotids
Die primäre Aminogruppe am 3’-Ende des Dinukleotids 1 läßt sich durch aktivierte
Ester selektiv acylieren (Abb. 4-5). Um den Aldoldonor Acetophenon 6 an das
Dinukleotidanalogon 1 zu koppeln, wurde dieser in Form seiner Carbonsäure in den N-
Hydroxysuccinimidester 2 überführt und bei einem pH-Wert von 8 mit dem Dinukleotid
1 umgesetzt. Die Einhaltung und Pufferung des pH-Wertes war entscheidend, da
entweder der NHS-Ester bei höherem pH-Wert hydrolysiert oder das primäre Amin bei
Werten unter 8 protoniert wird und somit nicht mehr reagieren kann.
O
O O N
O
O
pCC-Heg3-X-Heg2-NH2 + O
O
pCC-Heg3-X-Heg2-NH
Abb. 4-5: Synthese des an das Dinukleotid-gebundenen Aldoldonors 3 aus dem Dinukleotid 1 und der als NHS-Ester aktivierten 4-Acetylbenzoesäure 2
Nach der Isolierung des Produktes 3 durch RP-HPLC konnten bis zu 58.8% erhalten
werden. Die Charakterisierung erfolgte durch MALDI-TOF, wobei die für das
Dinukleotid typischen Fragmente auftraten. Der Molekülmassepeak des Dinukleotid-
Aldoldonors 3 als Kation ist bei m/z = 2967.28 g/mol (berechnet: [M+H]+ = 2967.30)
zu erkennen. Ein schweres Fragment ist bei m/z = 1903.33 g/mol (berechnet m/z [(pCC-
Heg3-X) +H]+ = 1903.40) zu finden und wird von einer Masse mit m/z = 1888.12 g/mol
begleitet, die wahrscheinlich durch Sauerstoffabstraktion an der o-Nitrobenzyleinheit
hervorgerufen wird (berechnet m/z = 1887.40).
1 2 3
4.1 Entwicklung der Selektionsstrategie 55
4.1.4 Ligation mit modifizierten Dinukleotid
Damit das Aldoldonor-modifizierte Dinukleotid 3 in der Selektion eingesetzt werden
konnte, musste zunächst überprüft werden, ob dieses sich an die beiden RNA-
Bibliotheken durch T4-RNA-Ligase ligieren ließ. Hierzu wurden die in verschiedenen
Doktorarbeiten194, 202, 203 verwendeten Protokolle an das vorliegende System angepaßt
und optimiert. Es zeigte sich, dass sowohl der 159 als auch der 109 Nukleotide lange
Pool mit einem 7.6-fachen Überschuss an Dinukleotid-Aldoldonor 3 in Gegenwart von
10 % DMSO ligierbar war. Durch die Verwendung eines zweifachen
Primerüberschusses (Primer B-4), der zum 3’-Ende der RNA komplemetär ist, konnte
die Ausbeute des Ligationproduktes auf über 70 % gesteigert werden.
Abb. 4-6: Ligation des Dinukleotid-Aldoldonors 3 an den Pool mit 159 Nukleotide (Spur 2, 6 % denaturierendes PAGE) und mit 109 Nukleotide (Spur 3). Es ist ein deutlicher Mobilitätsunterschied zwischen dem Pool und dem Ligationsprodukt erkennbar. Als Referenz diente jeweils der nicht-ligierte Pool (Spur 1 bzw. 4).
Die Reaktionszeit für die Ligation wurde auf 4.5 h bei 18 °C begrenzt, um einer
Degradation des RNA-Pools und somit den Verlust potentieller Ribozyme vorzubeugen.
Die Ligationsprodukte wiesen einen ausreichend großen Unterschied in der
elektrophoretischen Mobilität gegenüber der nicht-ligierten RNA auf und konnten somit
durch PAGE abgetrennt werden (Abb. 4-6).
4.2 Evaluierung geeigneter Selektionsbedingungen 56 4.2 Evaluierung geeigneter Selektionsbedingungen
Vor der eigentlichen Durchführung der in vitro Selektion mussten inzelne Schritte des
Selektionszyklus’ untersucht, auf ihre Funktion geprüft und hinsichtlich der
Bedingungen optimiert werden.
Zur Überprüfung, ob die Aldolreaktion zwischen den der Selektion zugrunde liegenden
4-Acetylbenzoesäure 6 und 4-Carboxybenzaldehyd 7 in wässriger Lösung möglich ist,
wurden zunächst Modellreaktionen mit Analoga der beiden Substrate durchgeführt.
Die Aldoladdition wurde mit Acetophenon 10 und p-Nitrobenzaldehyd 11 in
Anwesenheit einer Lewissäure und -base in schwach basischer wässriger Lösung
ausgeführt (Abb. 4-7).204 Unter den angegebenen Bedingungen wurde ausschließlich
das Additionsprodukt 12 gebildet und konnte durch 1H-NMR bestätigt werden.
O
NO2
O
+
O OH
NO2
ZnNO3.6H20,
Me2NEtOH
40°C, H20, pH 9.5
Abb. 4-7: Aldolreaktion zwischen Acetophenon 10 und p-Nitrobenzaldehyd 11
Die Aldolkondensation wurde mit den Methylestern von 4-Acetylbenzoesäure 13 und 4-
Carboxybenzaldehyd 14 unter Basenkatalyse in Methanol durchgeführt (Abb. 4-8). Das
Kondensationsprodukt 15 konnte eindeutig durch 1H-NMR und MALDI-TOF
identifiziert werden.
12 10 11
4.2 Evaluierung geeigneter Selektionsbedingungen 57
Abb. 4-8: Aldolkondensation der Methylester von 4-Acetylbenzoesäure 13 und 4-Carboxybenzaldehyd 14
Aufgrund der erfolgreichen Durchführung der beiden Reaktionen unter organisch-
chemischen Bedingungen sollte die Aldolreaktion zwischen 4-Acetylbenzoesäure 6 und
4-Carboxybenzaldehyd 7 unter Selektionsbedingungen ebenfalls möglich sein.
Hierzu mussten zuerst geeignete Reaktionsbedingungen etabliert werden, bei denen ein
geringer, aber detektierbarer Umsatz zwischen dem mit dem Aldoldonor modifizierten
Dinukleotidanalogon 3 (DN-Aldol) und dem biotinylierten Aldolakzeptor 5
(Biotinakzeptor) erfolgt. Diese Hintergrundreaktion sollte es prinzipiell in der in vitro
Selektion ermöglichen, auch schwach aktive Spezies zu isolieren. Die Analyse der
Reaktion mit dem am 5’-Ende radioaktiv markierten DN-Aldol 3 war durch Gelshift-
Assays möglich. Die Reaktionen wurden in einem Tris-Puffer, der Natrium- und
Kaliumionen enthielt, bei pH 7.4 ausgeführt.
Zur Ermittlung eines geeigneten Überschusses an Biotinakzeptor 5 wurde DN-Aldol 3
mit verschiedenen Biotinakzeptorüberschüssen umgesetzt (Abb. 4-9). Nach einer langen
Reaktionszeit von 48 Stunden trat bei 2000- und 20000-fachen Überschuss (gegenüber
DN-Aldol) in schwachen Spuren eine neue Bande mit geringerer elektrophoretischer
Mobilität auf, die bei einem 200000-fachen Überschuss intensiver wurde.
15 13 14
O
COOMe
O
+
O
10% KOH, MeOH, RT
COOMe
MeOOC COOMe
4.2 Evaluierung geeigneter Selektionsbedingungen 58
Abb. 4-9: Reaktion des DN-Aldols 3 mit verschiedenen Überschüssen an Biotinakzeptor 5 (1 µM DN-Aldol 3, Reaktionszeit: 48 h, 22.5 % denaturierendes PAGE, Vgl.: DN-Aldols 3)
Da die in vitro Selektion auch ein Generieren von Aldolase-artigen Ribozymen
ermöglichen sollte, wurde untersucht, ob Zinkionen und L-Lysin die Aldolreaktion
beeinflussen (Abb. 4-10). Bei der zweiten Selektion sollte auch L-Prolin, das in vielen
Aldolreaktion als Katalysator diente (s. Kapitel 1.3), zusätzlich als Cofaktor eingesetzt
werden. Es konnte gezeigt werden, dass in Anwesenheit der drei Cofaktoren weiterhin
die retardierte Bande auftritt. Allerdings durfte die Zinkionenkonzentration nicht zu
hoch sein, da sonst neben der retardierten Bande ein Schmier auftrat, der vermutlich
durch Komplexbildung mit dem DN-Aldol stammte.
Nachdem die Bedingungen für die Selektion (vgl. Kapitel 3.5) durch die
Voruntersuchungen festgesetzt wurden, wurde die zeitabhängige Umsetzung des DN-
Aldols 3 mit dem Biotinakzeptor 5 untersucht (Abb. 4-11). Dies diente dazu, für den
Anfang der Selektion eine geeignete Reaktionsdauer zu ermitteln. Es ergab sich hieraus
für die Hintergrundreaktion eine Anfangsgeschwindigkeit von
vini = 2.7 · 10-13 ± 2.1 · 10-16 Ms-1 für die Aldolreaktion in Gegenwart von L-Lysin und L-
Prolin.
4.2 Evaluierung geeigneter Selektionsbedingungen 59
Abb. 4-10: Einfluss von Cofaktoren auf die Reaktion zwischen DN-Aldol 3 und Biotinakzeptor 5 (1 µM DN-Aldol 3, 50 mM Biotinakzeptor 5, 24 h Reaktionszeit, 22.5 % denaturierendes PAGE). Alle drei Cofaktoren begünstigen die Biotinylierung des DN-Aldols 3 (Vgl.: DN-Aldols 3). Eine Zn2+-Konzentration von 20 mM verursacht Komplexbildung des DN-Aldols 3
Abb. 4-11: Zeitabhängiger Umsetzung von 1 µM DN-Aldols 3 mit 50 mM Biotinakzeptor 5 in Gegenwart von je 50 mM L-Lysin und L-Prolin. a) 22.5 % denaturierende PAGE (Vgl.: DN-Aldols 3) b) graphische Darstellung. Die Anfangsgeschwindigkeit vini = 2.7 · 10-13 ± 2.1 · 10-16 Ms-1 wurde aus der Steigung ermittelt
4.2 Evaluierung geeigneter Selektionsbedingungen 60 Um sicherzustellen, dass die Reaktion ausschließlich an dem Acetyl des DN-Aldols 3
stattfindet und nicht an den Cytidinen, wurde das nicht-modifizierte Dinukleotid 1 unter
den festgesetzten Bedingungen für mindestens 24 Stunden mit dem Biotinakzeptor 5
inkubiert (Abb. 4-12). Es konnte gezeigt werden, dass der Biotinakzeptor 5 selektiv an
der Acetyleinheit des DN-Aldols 3 reagiert. Mit dem unmodifizierten Dinukleotid 1, das
eine primäre Aminogruppe trägt, konnte keine weitere, retardierte Bande erhalten
werden.
Abb. 4-12: Reaktion von DN-Aldol 3 bzw. Dinukleotid 1 mit Biotinakzeptor 5 (1 µM DN-Aldol 3 bzw. Dinukleotid 1, 50 mM Biotinakzeptor 5, 50 mM L-Lysin, 24 h Reaktionszeit, 22.5 % denaturierendes PAGE). Die Biotinylierung findet ausschließlich an der Acetyleinheit des DN-Aldols 3 statt (roter Kreis)
Ein weiterer Nachweis, dass die Aldolreaktion erfolgte, lieferten Gelshift-Assays mit
Neutravidin. Hierzu wurde an eine 25 Nukleotide lange RNA das DN-Aldol 3 ligiert
und mit dem Biotinakzeptor 5 zur Reaktion gebracht. Durch PAGE konnte das Produkt
von dem RNA-Ligat L2 abgetrennt werden (Abb. 4-13a) und wurde nach der Isolierung
aus dem Gel mit dem Biotin-bindenden Protein Neutravidin inkubiert (Abb. 4-13b). Da
Neutravidin vier Biotinmoleküle binden kann, sind maximal, abhängig vom
Bindungsgrad, vier dicht beieinander liegende Banden auf einem PAGE zu erwarten.
Nach Auftrennung durch PAGE konnte eine stark retardierte Doppelbande in
Taschennähe detektiert werden, die offensichtlich von dem gebildeten Neutravidin-
Biotin-Produkt-Komplex stammte. Zur Kontrolle, dass der Shift nur mit dem Produkt
zustande kam, wurde das Ligat ebenfalls mit Neutravidin inkubiert. Hier konnte keine
neue Bande beobachtet werden.
4.2 Evaluierung geeigneter Selektionsbedingungen 61
Abb. 4-13: a) Biotinylierung des 25-mer-DN-Aldol-Ligats durch den Biotinakzeptor 5 (Spur 1), als Vergleich dienen das 25-mer-DN-Aldol-Ligat (Spur 2) und das 25-mer (Spur 3, Doppelbanden: 25-mer und 25+1-mer). Die Banden aus Spur 1 und 2 wurden isoliert und mit Neutravidin umgesetzt. b) Neutravidin verursacht einen deutlichen Shift mir dem biotinylierten 25-mer-DN-Aldol-Ligat (Spur 1a, roter Kreis), mit dem 25-mer-DN-Aldol-Ligat ist kein Shift zu beobachten (Spur 2a). Spur 1: biotinyliertes 25-mer-DN-Aldol-Ligat, 2: 25-mer-DN-Aldol-Ligat, 3: 25-mer (18 % denaturierendes PAGE)
Die Selektionsstrategie sieht die gezielte Spaltung des Linkers vor. Die Spaltung soll die
Abtrennung von Spezies, die abseits vom vorgegeben Reaktionszentrum am 3’-Ende
der RNA-Moleküle unspezifisch reagiert haben, ermöglichen. Deshalb musste
untersucht werden, ob das Dinukleotidanalogon an der photochemisch aktiven Einheit
im Linker durch Bestrahlung gespalten werden kann. Hierzu wurde der DN-Aldoldonor
3 mit dem Biotinakzeptor 5 umgesetzt, das Produkt isoliert und mit UV-Licht bei
355 nm bestrahlt. Es zeigte sich, dass eine Bestrahlung von 15 s bei 10 Hz und 80 %
Energie ausreicht, um die photolabile Einheit im Dinukleotidanalogon 3 zu spalten
(Abb. 4-14).
4.2 Evaluierung geeigneter Selektionsbedingungen 62
Abb. 4-14: Photospaltung des biotinylierten DN-Aldols bei 355 nm. 15 s bei 10 Hz und 80 % Energie ist ausreichend, um eine vollständige Spaltung der photolabilen Einheit im Dinukleotid zu erreichen (rechte Spur; 22.5 % denaturierendes PAGE)
Die Selektion sollte in Gegenwart verschiedener Metallsalze, die als potentielle
Cofaktoren dienen könnten, und hohen Konzentrationen an L-Lysin und
Biotinakzeptor 5 ausgeführt werden. Deshalb musste überprüft werden, ob durch den
Zusatz der Cofaktoren die RNA verstärkt degradiert wird bzw. in irgendeiner Weise mit
den Zusätzen wechselwirkt. Zur Überprüfung wurde eine 25 Nukleotide lange RNA mit
den Metallsalzen, L-Lysin und dem Biotinakzeptor 5 für mindestens 20 h inkubiert
(Abb. 4-15). Es zeigte sich, dass weder Biotinakzeptor 5 noch L-Lysin bzw.
Biotinakzeptor 5 in Gegenwart der Metallsalze mit der RNA wechselwirken. Die
Degradierung der RNA wurde durch die Metallsalze, nicht aber durch den
Biotinakzeptor 5 oder L-Lysin, leicht verstärkt und war schon nach zwei Stunden
Inkubationszeit erkennbar.
Nach den erfolgten Voruntersuchungen schlossen sich Selektionstestrunden mit dem
Pool an. Hierbei wurden alle Schritte des Selektionszyklus’ hintereinander ausgeführt.
Dies diente zum einen der Überprüfung, ob die einzelnen Schritte des Selektionszyklus’
miteinander kompatibel sind, und zum anderen der Praktikabilität der
Selektionsstrategie. Nach dem Durchlaufen der Testrunde konnte die im Rahmen der
zuvor durchgeführten Kinetiken erwartete RNA-Menge auf Streptavidin-Agarose
immobilisiert werden. Die RNA ließ sich durch UV-Bestrahlung von der Festphase
spalten und durch RT-PCR amplifizieren. Ebenso war es möglich, die immobilisierte
RNA direkt von der Festphase zu amplifizieren. Zur Kontrolle, ob die Amplifizierung
4.2 Evaluierung geeigneter Selektionsbedingungen 63 von sehr geringen RNA-Mengen möglich ist, wurde die RNA aus der letzten Waschung
amplifiziert (Abb. 4-16). Desweiteren konnte gezeigt werden, dass das Ausführen
mehrerer Runden hintereinander möglich ist, was hinsichtlich der Selektion wichtig
war.
Abb. 4-15: Inkubation eines 25-mers mit a) 1000-fachen Überschuß Biotinakzeptor 5 in Gegenwart von Metallsalzen (Endkonzentrationen s. Tabelle 3-1) für 2:30 und 24 h (Doppelbanden: 25-mer und 25+1-mer) und b) je 50000-fachen Überschuß L-Lysin (Spur 1) und Biotinakzeptor 5 (Spur 2) ohne Metallsalze (18 % denaturierendes PAGE, Vgl.: 25-mer)
Abb. 4-16: Erfolgreiche Amplifizierung des 159-nt RNA-Pools durch RT-PCR nach einer Testrunde (2 % Agarosegel). Spur 1: 100 bp DNA-Leiter, 2: dsDNA der letzten Waschfraktion, 3: dsDNA der immobilisierten RNA, 4: dsDNA der durch UV-Bestrahlung von der Festphase gespaltenen RNA. Als Vergleich wurden jeweils ein Aliquot vor der PCR entnommen und aufgetragen (entsprechende Spuren mit a)
4.3 In vitro Selektion 64 4.3 In vitro Selektion
4.3.1 Durchführung der ersten in vitro Selektion
Die Ausgangs-RNA-Bibliothek der ersten in vitro Selektion enthielt ca. 2.18 · 1014
verschiedene, 159 Nukleotide lange Sequenzen. Nach der Ligation des Pools mit dem
Dinukleotid-Aldoldonor 3 lagen ca. 8 Kopien (2.9 nmol) pro Sequenz als Ligat vor.
Dieses RNA-Ligat L1 wurde im Selektionspuffer gelöst, bei 85 °C denaturiert und
durch langsames Abkühlen auf Raumtemperatur renaturiert. Danach wurden alle
potentiellen Cofaktoren, die Metallionen, das Dipeptid und L-Lysin, zu der RNA-
Lösung gegeben. Die Endkonzentrationen der Metallsalze, ausgenommen ZnCl2, und
des Dipeptids richteten sich nach der Dissertation von B. Seelig77. Die Zugabe von
L-Lysin und Zinkionen basiert darauf, dass natürliche Aldolase diese als Cofaktoren für
die Katalyse benutzen (vgl. Kapitel 1.3.2). Durch ihre Anwesenheit in der Selektion
sollte die Möglichkeit gegeben werden, auch Aldolase-ähnliche Ribozyme zu
generieren. Die Endkonzentrationen von L-Lysin und Zink(II) wurden durch die
Vorstudien ermittelt. Die Aldolreaktion wurde in der ersten Selektion mit einem
50000-fachen Überschuss an biotinylierten Aldolakzeptor 5 für 24 Stunden
durchgeführt, die Endkonzentration des RNA-Ligats L1 betrug immer 1 µM.
Vor der Immobilisierung auf Streptavidin-Agarose musste der große
Biotinakzeptorüberschuß abgetrennt werden, dies geschah durch Fällen und
Gelfiltration. Die Streptavidin-Agarose wurde vor der Immobilisierung mit tRNA
behandelt, um eventuell vorhandene unspezifische Bindungsstellen für RNA
abzusättigen. Nach der Immobilisierung der umgesetzten RNA-Konjugate L1a wurden
die nicht-bindenden RNA-Moleküle zuerst durch Zentrifugation und anschließend
durch ausgiebiges Waschen der Festphase unter denaturierenden Bedingungen
abgetrennt. Die immobilisierten RNA-Konjugate L1a wurden mit UV-Licht bestrahlt,
um die RNA-Moleküle, die spezifisch an dem Aldoldonor reagiert haben, durch
photolytische Spaltung des Linkers selektiv freizusetzen. RNA-Sequenzen, die durch
die Reaktion an einer anderen Stelle als dem Aldoldonor biotinyliert wurden oder an
Streptavidin gebunden haben, verblieben auf der Streptavidinfestphase.
4.3 In vitro Selektion 65 Die durch die Photospaltung erhaltene RNA wurde durch reverse Transkription in
cDNA umgeschrieben. Um zu gewährleisten, dass stabilere RNA-Strukturen für die
reverse Transkriptase zugänglich wurden, wurde die reverse Transkription bei leicht
denaturierenden 55 °C durchgeführt. Nach der Amplifikation durch PCR lag ein
angereicherter DNA-Pool vor, der als Templat für die nächste Runde diente. Es wurden
insgesamt 12 Runden unter konstanten Bedingungen durchgeführt.
In der graphischen Darstellung des Selektionsverlaufs mit Photospaltung (Abb. 4-17) ist
ein Anstieg der Selektionsrate der immobilisierten RNA-Konjungate vor Durchführung
der Photospaltung in der jeweiligen Runde zu erkennen. Dieser Trend ließ sich jedoch
nicht nach der anschließenden durchgeführten Photospaltung und der dadurch
erhaltenen von der Festphase gespalteten RNA beobachten. Hier stieg die relative
Menge der von der Festphase gespalteten RNA geringfügig in der 11. Runde an, brach
dann aber in der darauf folgenden Runde wieder ein.
Die Rate der gespalteten und demzufolge über den konjugierten Aldoldonor
biotinylierten RNA lag während der gesamten Selektion deutlich unter der in den
Vorversuchen bestimmten Hintergrundrate von 0.5 %. Da letztendlich keine
signifikante Anreicherung erzielt werden konnte, wurde die Selektion nach der 12.
Runde eingestellt.
4.3 In vitro Selektion 66
Abb. 4-17: Rundenergebnisse der ersten Selektion. Relative Menge in Prozent an selektierter RNA bezogen auf die zur Immobilisierung eingesetzten RNA-Konjugate L1 und L1a. Die blauen Balken zeigen die Entwicklung der gesamten immobilisierten RNA-Konjugate L1a nach denaturierender Waschung, rote Balken die Menge an durch UV-Spaltung freigesetzte RNA
4.3.2 Durchführung der zweiten in vitro Selektion
Für die zweite Selektion wurde ein weiterer DNA-Pool mit einer Komplexität von ca.
1.49 · 1015 verschiedenen Sequenzen eingesetzt. Dieser Pool wies im Vergleich zu dem
der ersten Selektion 70 Nukleotide im randomisierten Bereich auf. Für die präparative
Transkription wurden zwei Komplexitäten des DNA-Pools als Templat eingesetzt und
ca. 51 Kopien (126 nmol) konnten erhalten wurden. Durch die Verwendung eines Kits
zur Aufreinigung und Isolation des Transkripts konnte auf die zeitaufwendige
Gelreinigung verzichtet werden.
Die präparative Ligation wurde mit 52 nmol Transkript durchgeführt und nach
Aufreinigung standen 10.2 nmol (ca. 4 Kopien) RNA-Ligat L2 für die Selektion zur
Verfügung. Prinzipiell wurde genauso wie in der ersten Selektion verfahren, zusätzlich
wurden L-Prolin als zusätzlicher Cofaktoren bei der Reaktion eingesetzt und die
Reaktionszeit auf vier Stunden reduziert. Außerdem wurden bei den Fällungen nach der
Reaktion und der Gelfiltration alle verwendeten Reaktionsgefäße vor Benutzung mit
einem entsprechenden tRNA-haltigen Puffer (2 mg/ml) gespült. Die tRNA sollte
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1
1,1
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12Selektionsrunde
sele
ktie
rte R
NA
[%]
immobilisierte RNAgespaltene RNA
4.3 In vitro Selektion 67 unspezifische Bindungsstellen absättigen und so den Verlust von RNA-Molekülen und
somit potentiellen Katalysatoren minimieren.
Desweiteren wurde, um einen Verlust aktiver Spezies in den Anfangszyklen durch
nicht-optimale Photospaltung zu verlieren, bis einschließlich der 3. Runde auf die
Spaltung von der Festphase verzichtet und die RNA direkt amplifiziert. In der 4. Runde
wurde das umgesetzte RNA-Ligat L2 auf zwei Festphasen immobilisiert. So ließ sich
parallel zu der direkten Selektion eine mit UV-Spaltung des umgesetzten RNA-Ligats
L2 von der Streptavidin-Agarose nach der Immobilisierung ausführen.
In der 7. Runde des direkten Selektionspfads erfolgte eine Gegenselektion, um die
unerwünschte Anreicherung von Agarose- oder Streptavidin-bindenden RNA-
Sequenzen zu unterbinden. In der 8. Runde war ein signifikanter Anstieg von 10.2 %
bei der direkten Selektion zu beobachten, der sich reproduzieren ließ. Auch die
Wiederholung der Runde, ausgehend von der 7. Runde, unter verkürzter Reaktionszeit
(20 min statt 4 h) wies einen leichten Anstieg gegenüber der 7. Runde auf.
In der 9. Runde schloss sich eine weitere Gegenselektion an. Diese Gegenselektion
diente zu Erfassung von RNA, die durch die Reaktion mit dem biotinylierten
Aldolakzeptor 5 an anderen Stellen als dem Aldoldonor reagiert haben. Bei der
Gegenselektion verblieben 2.0 % der RNA auf der Festphase, die demzufolge an einer
anderen Stelle durch die Reaktion mit dem Biotinakzeptor 5 biotinyliert worden sein
mußten. Die Wiederholung dieser Runde mit RNA, die nicht mit dem Aldoldonor 3
ligiert wurde, ergab 1.1 % immobilisierte RNA. Nach der Gegenselektion in dieser
Runde konnte 5.4 % RNA-Ligat L2a immobilisiert werden.
Ab der 10. Runde wurde der direkte Selektionspfad unter zwei verschiedenen
Selektionsdrücken entwickelt. Zum einen wurden die Reaktionszeiten (ausgehend von
4 h) von 1 h zu 1 min sukzessiv verkürzt, zum anderen die Konzentrationen (beginnend
bei 50 mM) des biotinylierten Aldolakzeptor 5 von 10 mM zu 4.7 mM schrittweise
gesenkt. Durch die stringenter werdenden Bedingungen nahmen die
Immobilisierungsraten von Runde zu Runde ab. Letztendlich wurden die angereicherten
Pools nach 14 bzw.13 Runden zur Charakterisierung durch Klonieren vereinzelt und
sequenziert. Die scheinbaren Geschwindigkeitskonstanten 2. Ordnung wurden aus dem
Anteil der immobilisierten RNA-Ligate L2a in jeder Runde berechnet. Bis zu dem
Anstieg in der 8. Runde stieg die Reaktionsbeschleunigung kontinuerlich auf das
4.3 In vitro Selektion 68 17-fache. Die am Ende der Selektion erreichte Reaktionsbeschleunigung für den
angereicherten Pool, der hinsichtlich der Reaktionszeit stringenter behandelt wurde,
ergab das 596-fache gegenüber dem Ausgangspool. Der Pool aus dem Selektionspfad,
in dem die Konzentration verringert wurde, wies eine 61-fache Beschleunigung
gegenüber dem Anfang auf. Der gesamte Verlauf der direkten Selektion und die
ermittelten scheinbaren Geschwindigkeitskonstanten sind in Abb. 4-18 dargestellt.
Abb. 4-18: Verlauf der direkten Selektion. Anreicherung der biotinylierten RNA in jeder Runde (Balkendiagramm) und die dazu gehörenden scheinbaren Geschwindigkeitskonstanten (kleiner Graph). In Runde 7 und 9 Gegenselektionen gegen Streptavidin-und Agarosebindern bzw. Nebenreaktionen. Bis zur 10. Runde handelt es sich um dieselbe Selektion (hellblaue Balken), in Runde 11 wurde sie geteilt und unter unterschiedlichen Selektionsdrücken entwickelt. Die Biotinakzeptorkonzentrationen und Reaktionszeiten sind für jeden Zyklus angegeben
4.3 In vitro Selektion 69 Der Verlauf des Selektionszweigs, in dem nach der Immobilisierung die RNA durch
UV-Bestrahlung ab der 4. Runde von der Festphase gespalten wurde, ist in Abb. 4-19
graphisch dargestellt. Insgesamt zeichnet sich bei dieser parallel geführten Selektion
unter gleichbleibenden Reaktionsbedingungen kein kontinuierlicher Anstieg der
selektierten RNA ab. In der 8. Runde war die Menge an abgespaltener RNA so gering,
dass sie durch den Szintillationszähler nicht erfasst werden konnte. Die Selektion wurde
bis zu der 9. Runde weitergeführt.
Abb. 4-19: Rundenergebnisse der zweiten Selektion mit UV-Spaltung. Relative Menge in Prozent an selektierter RNA bezogen auf die zur Immobilisierung eingesetzten RNA-Konjugate L2 und L2a. Die blauen Balken zeigen die Entwicklung der selektierten RNA mit direkter Amplifizierung, rote Balken die Menge der ab der 4. Runde durch UV-Spaltug freigesetzten RNA. In Runde 8 konnte keine RNA nach der Photospaltung detektiert werden
n. d
.0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
1 2 3 4 5 6 7 8 9Selektionsrunde
gesp
alte
ne R
NA
[%]
direkte SelektionSelektion mit UV-Spaltung
4.4 Klonierung und Sequenzanalyse 70
4.4 Klonierung und Sequenzanalyse
Nach der 13. bzw. 14. Runde der direkten Selektionen wurden beide angereicherten
Pools in cDNA durch reverse Transkription umgeschrieben, durch PCR amplifiziert und
anschließend mit Hilfe eines Kits kloniert. Da das sogenannte Blue/white screening bei
kurzen, insertierten DNA-Sequenz nicht zuverlässig funktioniert, wurden sowohl blaue
als auch weiße Klone von der LB-Nährplatte isoliert. Insgesamt fielen pro
Selektionspfad 96 Klone an. Mittels PCR mit zwei Primersystemen, die für die
Selektion verwendeten Primer A und B und die Sequenzierstandardprimer M13rev und
M13for(-21), wurde überprüft, welche Klone ein Insert aufwiesen. Es trugen 116 Klone
die insertierte DNA.
Um für die Sequenzierung Plasmid-DNA zu erhalten, wurden LB-Übernachtmedien mit
den Klonen beimpft und bei 37 °C angezogen. Die durch DNA-Minipräparation
aufgereinigte Plasmid-DNA wurde durch die Firma SeqLab sequenziert.
Nach Auswertung der Sequenzen wurden 85 Primärstrukturen erhalten, die mit Hilfe
des Clustalw Cluster Alignment-Algorithmus im Multalin-Programmpaket201 auf
Homologien verglichen wurden. Hierbei ließen sich 31 verschiedene Sequenzen in 12
Familien (Abb. 4-20) einordnen und 41 unabhängige Einzelnsequenzen identifizieren.
Dubletten wurden beim Homologievergleich aussortiert. Die meisten Klone trugen im
randomisierten Bereich wie im Anfangspool 70 Nukleotide, einige Klone erfuhren aber
auch eine Verkürzung (62, 65, 68, 69 Basen) oder Verlängerung (71, 72, 75 Nukleotide)
der randomisierten Positionen.
Die Familien weisen zwei bis vier Mitglieder auf, wobei in den beiden größten Familien
(Familie 5 und 7) Mitglieder auftreten, die aus beiden Selektionszweigen stammten. Es
sind auch Familien zu beobachten, deren Klone ihren Ursprung in nur einem
Selektionspfad haben. Dabei sind Familien, die aus der Selektion unter verkürzten
Reaktionszeiten generiert wurden, häufiger vertreten.
Innerhalb der Familien zeigen die Sequenzen vereinzelte Punktmutationen an bis zu vier
Basen auf und in drei Familien sind Deletionen von zwei bis drei Basen zu beobachten.
Interessanterweise erscheinen die Deletionen immer nur in einem einzigen Mitglied
einer Familie. Die geringe Anzahl an Punktmutationen und Deletionen lassen vermuten,
4.4 Klonierung und Sequenzanalyse 71 dass die Mitglieder einer Familie von derselben Vorläufersequenz abstammen und im
Laufe der Selektion die Mutationen erfuhren. Auffällig ist, dass bei einigen Familien die
Punktmutationen nur unter Purin- oder Pyrimidinbasen (Transitionen) erfolgte. Familien
2 und 4 weisen ausschließlich je eine Mutation in einer Purinbase auf, Familie 11 und
13 drei bzw. eine Mutation der Pyrimidinbase. Das Vergleichen der Familien
untereinander und mit den Einzelsequenzen zeigte keine generellen konservierten
Regionen, aber verschiedene kleine auftretenden Sequenzeinheiten. Auffallend sind die
ausgedehnten Purinbereiche, die in allen Klonen auftreten.
5'-GGA GCT CAG CCT TCA CTG C- N70-GGC ACC ACG GTC GGA TCC AC-3'
Familie Sequenz im randomisierten Bereich #2 (2) CACGCATTGATTCCATCATGCGAAACGGTAGGAXGTTGAGGAGGATAATGGATCTCCACGGCCTTGGTAT
#3 (2) AGGGCGAGAAGTGGATCAAACGAGCACGACATTACGTGTGTAGTAAGTACGATTAAAAAAAAGTTTTCGTTCTG
#4 (2) AAAXGTTGGGTGGAATATAGCGGATCGAGGCACCTTTCTGGTTTCCTTGAGACATGTGGATACGAGCGAC
#5 (4) GGTCGTTTAGATACAAAGGTTGATAAGAAGGATCYGACTTGCTTCACGTGAACACCAGCGCGTTACGCTA
#6 (3) AAGACGGGAGGGCGAGAAGATCAGACATACGAGCACGTAGCGCCGTTTGTGTCCTGAAACXGGGTCTTAAY
#7 (4) AGCGGGAGCCAATCTTCGGTTTXTGCTTCCGTGCCAACGGTAGGCGAGAAGGATCCACATACGAGCACGGCC
#8 (2) GGATCTACGCTATGCCACCCATAGTTTTATTTGCAGCGTTTGGCAGAGAGGATATAGGATCGTGACTCCAC
#9 (2) ATTACCGGCATCAACTCCGTTTGTTTGTYTCGCAGGTTCGGTTGAGGAGGATAGGGATCTCCACGGCCGC
#10 (3) AAGAGGGYGAGATTAAGCTTCACTGATYGTGGTTACCTCGATGYAAATTTTTCCTCGTAGCATCGTATCG
#11 (2) TGAACACAGTGTGTACTTAAGCYCTACGGAGGYGTAYTGGATCACGCCGAACTCCCTTGGAGTCACGGTG
#12 (2) CGTCTCGCGGTGGTGTGATAACGTAGCGGCAGGAGGAATTXATCTTGCAAAGATGTATGCTGTGGAGCGACT
#13 (3) TCAACCGAGCTACGGCTGATAGGACATTGGATCTCCACGGCCCGGTAGCCTCATCCACCACTAYGTAAC
Abb. 4-20: Primärstrukturen der selektierten Klone. Es sind nur die Sequenzen im randomisierten Bereich aufgelistet, die konstanten Primerbereiche sind oben angegeben. Jede Familie wird durch einen Prototypen dargestellt, die Zahl in Klammern gibt die Mitgliederanzahl an. Grüne Farbe der Familiennummerierung bedeutet, dass diese Familie ausschließlich aus dem Selektionspfad mit stringenter werdender Reaktionszeit stammt, blaue Farbe stringenter werdende Bedingung hinsichtlich des Biotinakzeptors 5. Punktmutationen sind durch rote Buchstaben gekennzeichnet, wobei X für Mutationen einer Purin- und Y für Pyrmidinbasen stehen. Magentafarbene Kästchen stellen die Basendeletionen dar
Durch die Vorhersage der Sekundärstruktur mit der Software mfold205 ließ sich, wie
schon aus den Primärstrukturen zu erwarten war, kein dominates Motiv in den Klonen
erkennen. Die Klone mit gleichen Sequenzeinheiten zeigten auch in der
4.5 Kinetische Charakterisierung der Klone 72 Sekundärstruktur Ähnlichkeiten in diesen Bereichen, es handelte sich ausschließlich um
Regionen mit Watson-Crick-Basenpaarung.
4.5 Kinetische Charakterisierung der Klone
Die Familien sollten hinsichtlich ihrer Aktivität verglichen und die aktivsten Klone
genauer untersucht werden. Zu diesem Zwecke wurde überprüft, ob aus den Plasmiden
der einzelnen Mitglieder die individuellen RNA-Spezies durch T7-Transkription
zugänglich waren. Hierfür wurden die Plasmide zunächst mit den in der Selektion
verwendeten Primern A und B in einer PCR amplifiziert und dann die erhaltene dsDNA
als Templat in der Transkription eingesetzt. Alle 31 Klone ließen sich transkribieren.
Die gewählten Substrate der Aldolreaktion sind aromatische Systeme. Diese erfahren
bei stattfindender Reaktion keine signifikante Änderung ihrer UV-spektroskopischen
Eigenschaften, womit sich diese Eigenschaften nicht zur Differenzierung zwischen
Substrate und Produkt oder zur Verfolgung des Reaktionsablaufes eignen. Es mussten
deshalb analytische Methoden gefunden werden, die es ermöglichten, die katalytische
Aktivität der Klone hinsichtlich der Aldolreaktion zu charakterisieren. Prinzipiell ist es
möglich, nach der stattgefundenen Reaktion das RNA-Ligat L2 und das am RNA-Ligat
gebildete Produkt L2a aufgrund der unterschiedlichen Größe und damit verbundenen
elektrophoretischen Migrationseigenschaft auf einem Gel durch Gelshift zu analysieren.
Da der Massenunterschied des Produkts zu dem RNA-Ligat L2 im Verhältnis gering ist,
war kein großer Shift zu erwarten. Deshalb sollte der Shift zu einem Supershift verstärkt
werden, indem die Biotinylierung des RNA-Ligats L2 nach der Reaktion durch die
Umsetzung mit Streptavidin ausgenutzt wurde. Die mit Streptavidin gebildeten
Konjugate laufen in einem Gel langsamer als freie RNA. Streptavidin verfügt über vier
Bindungsstellen für Biotin, wonach bis zu vier Streptavidin-RNA-Komplexe mit
unterschiedlichen Migrationseigenschaften gebildet werden können.206, 207
Nach 4 h Reaktionszeit wurden die Aliquots zur Abtrennung des
Biotinakzeptorüberschusses gefällt, um sicher gehen zu können, dass die anschließende
4.5 Kinetische Charakterisierung der Klone 73 Komplexbildung mit dem Streptavidin quantitativ erfolgte. Die Analyse der Gele zeigte,
dass die Klone wie erwartet die Aldolreaktion unterstützten und das gebildete Produkt
durch Streptavidin abgefangen werden kann. Für alle Klone konnten retardierte Banden
beobachtet werden, die durch die Komplexbildung mit dem Streptavidin zustande
kamen. Allerdings schien die Komplexbildung mit dem Streptavidin nicht quantitativ zu
verlaufen, da bei dem Versuch, die Gelshifts zu reproduzieren, stark voneinander
abweichende Werte erhalten wurden.
Eine weitere Möglichkeit der kinetischen Analyse der Klone ist, analog zu der
Selektion, die Immobilisierung des umgesetzen RNA-Ligats L2 und anschließendes
Waschen der Festphase unter denaturierenden Bedingungen. Hierfür wurden die
Aliquots vor der Immobilisierung gefällt, um den Biotinakzeptorüberschuss
abzutrennen und so zu gewährleisten, dass das RNA-Produkt-Konjugat L2a quantitativ
von der Streptavidin-Agarose gebunden würde. Die Quantifizierung des gebildeten
Produkts L2a erfolgte durch Bildung der Verhältnisses der immobilisierten RNA zu der
gesamten RNA-Menge. Im Gegensatz zu den Gelshiftassays lieferte dieses Verfahren
reproduzierbare Ergebnisse. Die Klone der Familien 2 und 6 zeigten nach 4 h
Reaktionszeit den größten Umsatz, er lag zwischen 12.3 und 16.3 %. Zur Kontrolle
wurden die Transkripte von drei verschiedenen Klonen (BSW328A1, BSW328A7,
BSW332F), die nicht mit dem DN-Aldol 3 ligiert waren, unter denselben Bedingungen
mit dem Biotinakzeptor 5 inkubiert, immobilisiert und die Festphasen gewaschen. Hier
wurden nach 4 h Reaktionszeit nur 0.07 % – 0.17 % immobilisiert.
Die aktivsten Klone sollten nun kinetisch genauer betrachtet werden. Hierzu wurden
1 µM RNA-Ligat L2 des entsprechenden Klons mit 4.7 mM biotinylierten
Aldolakzeptor 5 inkubiert und zur Ermittlung der zeitabhängigen Umsatzänderung zu
bestimmten Zeiten Aliquots aus dem Reaktionsansatz entnommen und immobilisiert.
Die Zunahme des gebildeten Aldolproduktes ist in Abb. 4-21 dargestellt. Alle Klone der
4.5 Kinetische Charakterisierung der Klone 74
Abb. 4-21: Kinetiken für die Klonfamilien 2 (a) und 6 (b). kapp ist die scheinbare Geschwindigkeitskonstante und wurde mittels der Gleichung in Kapitel 3.6.1 ermittelt
beiden untersuchten Familien zeigen eine Sättigungskinetik. Bei der stattfindenden
Reaktion, die eine Selbstmodifikation der RNA darstellt und somit nur ein einfacher
Umsatz (single turnover) pro RNA-Molekül möglich ist, nähert sich der Umatz mit
zunehmender Reaktionszeit einem Sättingungswert. Die Anfangsgeschwindigkeiten vini
für die Klone wurden aus der Produktzunahme über die ersten 5 % des Umsatzes durch
lineare Regression bestimmt und sind in Tabelle 4-1 dargestellt.
4.5 Kinetische Charakterisierung der Klone 75
Familie Klon vini [Ms-1]
2 BSW332C6 8.3 · 10-12 ± 1.0 · 10-13
BSW332F4 1.2 · 10-11 ± 7.4 · 10-13
6 BSW328A7 6.9 · 10-12 ± 2.8 · 10-15
BSW332A11 1.5 · 10-11 ± 2.2 · 10-15
Hintergrundreaktion 2.7 · 10-13 ± 2.1 · 10-16
Tabelle 4-1: Anfangsgeschwindigkeiten der untersuchten Klone
Die Transkripte der Klone beschleunigen die Aldolreaktion zwischen dem 330- und
500-fachen gegenüber der Hintergrundreaktion, die mit dem Dinuklotidaldoldonor 3
gemessen wurde. Innerhalb der Familie 2 ist der Unterschied der
Anfangsgeschwindigkeiten nicht groß. In Familie 6 ist der Beschleunigungsfaktor des
Klons BSW332A11 doppelt so hoch wie der des Mitglieds BSW328A7. Diese beiden
Klone unterscheiden sich durch zwei Punktmutationen: einer Transition und einer
Transversion zwischen Adenosin und Cytidin.
Die ermittelten scheinbaren Geschwindigkeitskonstanen 2. Ordnung der Klone liegen in
derselben Größenordnung wie die, die für die angereichten Pools ermittelt wurden
(Abb. 4-21c).
Zwei verschieden lange RNA-Bibliotheken wurden der in vitro Selektion unterzogen.
Die erste Selektion, bei der der Pool 120 Nukleotide im randomisierten Bereich aufwies
und die Photospaltung als zweites Selektionskriterium von der ersten Runde an
durchgeführt wurde, erzielte keine Anreicherung an aktiven Spezies. In der zweiten
Selektion mit einem Pool, der nur 70 randomisierte Positionen besaß, wurde die
Photospaltung erst ab der 4. Runde eingesetzt und parallel zur Selektion mit direkten
Amplifizierung durchgeführt. Es konnte in dem direkten Selektionsweg eine
Anreicherung in der 8. Runde erzielt werden. Ein Teil der isolierten Sequenzen wurden
kinetisch genauer untersucht.
5 Diskussion
Die Entdeckung, dass RNA katalytische Eigenschaften besitzt, löste die Suche nach
Ribozymen natürlichen Ursprungs aus. Bald wurde auch die Herausforderung
angetreten, geeignete Techniken zu finden, um RNA, die verschiedene chemische
Reaktionen katalysieren können, zu generieren.
Das Generieren neuer Ribozyme ist nicht nur hinsichtlich der medizinischen Forschung
und der damit verbundenen Entwicklung neuer Therapeutika auf RNA-Basis
interessant106, 107, 208-211, sondern auch hinsichtlich der Hypothese einer RNA-Welt, in
der Metabolismus und Replikation einfacher Organismen durch RNA-Enzyme
ausgeführt und kontrolliert wurden.8, 212 Das Auffinden weiterer Ribozyme würde die
Hypothese der RNA-Welt weiter untermauern.
Enzyme auf Proteinbasis weisen ein großes Spektrum an biologischen Aktivitäten, die
sich im Laufe der natürlichen Evolution über einen sehr langen Zeitraum entwickelt und
optimiert haben, auf. Die de novo und evolutionäre Entwicklung von Nukleinsäuren
sind technisch wenig aufweniger als das gezielte Designen künstlicher Enzyme. Da
Proteine sich nicht enzymatisch kopieren und amplifizieren lassen, muss für die in vitro
Selektion eines Peptids oder Proteins mit gewünschter Eigenschaft der Genotyp und der
Phänotyp in aufwendigen Prozessen miteinander verknüpft werden.213-216 Dagegen
ermöglicht das inhärente Tragen des Geno- und Phänotypes in einem
Nukleinsäuremolekül die technisch leicht zugängliche Entwicklung von Nukleinsäuren
mit neuen Eigenschaften durch die Methode der direkten in vitro Selektion.
Anfangs gingen aus den Selektionsexperimenten Ribozyme hervor, die ihre
Selbstmodifikationen katalysierten, da ein Reaktionspartner stets die RNA selbst war.
Durch die Erweiterung der Methode auf Reaktanden, die nicht auf Nukleinsäuren
basieren, konnte das Spektrum der RNA-gestützen Katalyse ausgedehnt werden. Das
Verwenden von linkergekoppelten Reaktanden in der direkten Selektion führte
schließlich zur Generierung von Ribozymen, die bimolekulare Reaktionen katalysieren
können. Durch den Ansatz der direkten Selektion mit linkergekoppelten Reaktanden
sollten Ribozyme zugänglich sein, die auch in einer intermolekularen Weise unter
5.1 Die Aldolreaktion 77 mehrfachem Umsatz katalytisch aktiv sind. Weist der Linker, der einen Reaktanden mit
der RNA verbindet, eine ausreichende Länge auf, wird die Situation der Reaktanden in
freier Lösung simuliert und eine intermolekulare Katalyse sollte begünstigt sein.
In der vorliegenden Arbeit sollte das katalytische Spektrum von RNA erweitert werden,
indem die Selektionstrategie mit linkergekoppelten Reaktanden entsprechend
modifiziert und angepasst wurde. Die adaptierte Methode sollte auf die Kohlenstoff-
Kohlenstoff-Bindungsknüpfung durch eine Aldolreaktion angwendet werden, dabei
wurden zwei verschiedene RNA-Bibliotheken der Selektionsmethode unterworfen. Es
gelang, in einem der beiden Pools eine Anreicherung an aktiven Spezies zu erhalten,
und die isolierten Spezies genauer zu untersuchen.
5.1 Die Aldolreaktion
Die Wahl der Substrate der Aldolreaktion fiel aus mehreren Gründen auf Acetophenon
6 und Benzaldehyd 7. Die Edukte, 4-Acetylbenzoesäure und 4-Carboxybenzaldehyd,
sind kommerziell erhältlich und eignen sich durch die Carboxylfunktion ausgezeichnet
zur Modifizierung. Um die Substrate mit der Selektionsstrategie kompatibel zu machen,
konnten sie als NHS-Ester aktiviert werden und an das primäre Amin des
Dinukleotids 1 bzw. Biotinderivats gekoppelt werden. Da es sich bei beiden Substraten
um aromatische Verbindungen handelt, ist die Möglichkeit des Stackings mit
Basenpaaren der RNA gegeben. Hierdurch könnte eine optimale Positionierung und
Stabilisierung der Substrate während der Reaktion erfolgen. Die Untersuchung, ob
aliphatische Verbindungen als Substrate von den isolierten Sequenzen akzeptiert
würden, könnte ein Hinweis auf Interaktionen durch Stacking sein.
Zudem ist die Frage offen, ob die aus der Selektion erhaltenen Sequenzen die
Aldoladdition oder die Kondensation katalysieren. Das aus einer Kondensation
resultierende konjugierte π-System könnte dabei energetisch bevorzugt werden.
RNA besitzt die Fähigkeit, kleine Moleküle wie beispielsweise Glycin217 zu binden.
Somit wäre es denkbar, dass Ribozymen generiert werden können, die Aminosäuren als
Cofaktoren benutzen. Neben mono- und divalenten Metallionen wurden der Reaktion in
5.2 Die in vitro Selektion 78 der Selektion zusätzlich L-Prolin, L-Lysin und das Dipeptid H-His-Lys-OH zugesetzt.
Von Prolin ist bekannt, dass es stereospezifisch Aldolreaktionen über einen
Enaminintermediat katalysiert140, 218 und, was hinsichtlich der Selektion wichtig ist,
auch in wässrigem Medium wirksam ist.149, 151, 219 Die Zugabe von L-Lysin und
Zinkionen in höherer Konzentration im Vergleich zu den anderen Metallionen sollte die
Möglichkeit eröffnen, Aldolase-ähnliche Ribozyme zu generieren. Aldolasen der
Klasse I unterstützen die stereoselektive Deprotonierung des Aldoldonors, indem sie mit
einer Lysineinheit kovalent eine Schiff’sche Base bilden. Die Bildung der Schiff’schen
Base könnte auch mit Nukleobasen erfolgen, allerdings lässt die geringe Nukleophilie
der exocyclischen Amniogruppen dies nicht erwarten.
In Aldolasen der Klasse II sitzen die Zinkionen im aktiven Zentrum und polarisieren das
Keton im Aldoldonor, um die Deprotonierung der α-aciden Position zu vereinfachen,
und stabilisieren darüber hinaus den Übergangszustand.
Bei der Aldolreaktion entsteht ein neues stereogenes Zentrum, somit schließt sich die
Frage an, welches Stereoisomer durch die isolierten Klone bevorzugt gebildet wird.
5.2 Die in vitro Selektion
Prinzipiell gibt es zwei verschiedene Möglichkeiten, den RNA-Pool mit einem
Reaktanden zu koppeln. Zum einen ermöglicht der Einbau eines Initiatornukleotids am
5’-Terminus durch die T7-Polymerase während der Transkription die
Funktionalisierung der Bibliothek, zum anderen steht die Ligation eines kurzen
Oligonukleotidderivats am 3’-Ende der RNA durch die T4-RNA-Ligase zur Verfügung.
In dieser Arbeit war die Ligation eines modifizierten Dinukleotids 3 der Transkription
mit einem Initiatornukleotids vorzuziehen, denn die Synthese des Aldoldonor-
modifizierten Linkers gestaltete sich schnell und einfach. Die T4-RNA-Ligase benötigt
lediglich als Erkennungsnukleotid ein phosphoryliertes Cytidin und ist gegenüber
Modifikationen im 3’-Bereich sehr tolerant.220 Das Dinukleotid mit integriertem
photospaltbaren Linker wurde durch Kopplung der entsprechenden Monomere an einer
aminomodifizierten Festphase erhalten. Das resultierende Dinukleotid 1 konnte
5.2 Die in vitro Selektion 79 anschließend postsynthetisch einfach mit dem Aldoldonor funktionalisiert werden. So
konnte auf eine aufwendige, mehrstufige Synthese eines entsprechend modifizierten
Initiatornukleotids verzichtet werden. Die posttranskriptionale Ligation an den RNA-
Pool erfordert nur einen geringen Überschuss im mikromolaren Bereich des
Aldoldonordinukleotids 3, wogegen die 5’-Funktionalisierung durch ein
Initiatornukleotid in millimolaren Mengen erfolgt.
Bei der Ligation des Dinukleotidderivats 3 an den RNA-Pool konnte davon
ausgegangen werden, dass ausschließlich das gewünschte lineare RNA-Konjugat L1
bzw. L2 gebildet wurde. Eine Zirkularisierung oder Oligomerisierung der RNA konnte
ausgeschlossen werden, da die RNA am 5’-Terminus bedingt durch die Transkription
ein Triphosphat trägt und das 3’-Ende des Dinukleotids 3 durch den Aldoldonor
blockiert ist. Außerdem waren auf den Gelen zur Aufreinigung des Ligationsprodukts
ausschließlich zwei Banden zu sehen, die von der nicht umgesetzten RNA und dem
RNA-Konjugat L1 bzw. L2 stammten.
Die in dem Linker enthaltene photospaltbare o-Nitrobenzyl-Einheit sollte als ein
weiteres Selektionskriterium neben der Immobilisierung der aktiven RNA-Spezies
während der Selektion dienen. Durch die gezielte Spaltung der immobilisierten RNA
durch UV-Licht sollte nur die RNA freigesetzt werden, die die Aldolreaktion am
vorgesehenen Substrat und nicht an internen Stellen der RNA katalysiert haben.
Die Bedingungen, unter denen die Reaktion während der Selektionen durchgeführt
werden sollten, wurden durch die Umsetzung des DN-Aldoldonors 3 mit dem
biotinylierten Aldolakzeptor 5 etabliert und auf den mit dem DN-Aldol 3
funktionalisierten RNA-Pool für die in vitro Selektion übertragen.
Bei der ersten durchgeführten Selektion wurde eine RNA-Bibliothek verwendet, die
einen randomisierten Bereich von 120 Basen aufwies. Die photoinduzierte Spaltung der
immobilisierten RNA von der Streptavidin-Agarose-Festphase wurde von der ersten
Runde an durchgeführt. Der prozentuale Anteil der so selektierten RNA nach einer
Reaktionszeit von 24 h blieb während der gesamten Selektion (Abb. 4-17) stets unter
dem Wert von 0.6 %, der aus der Hintergrundreaktion mit dem freien DN-Aldol 3
ermittelt wurde. Der direkte Vergleich mit der Hintergrundrate sollte möglich sein, da
bei den Voruntersuchungen zu der Selektion gezeigt werden konnte, dass die
5.2 Die in vitro Selektion 80 Aldolreaktion ausschließlich am Aldoldonor 3 stattfand und nicht an einer anderen
Position des DN-Aldoldonors 3 (Abb. 4-12).
Zwar erreicht der Wert in der 11. Runde mit 0.2 % ein Maximum, aber von einem
Anstieg kann in dieser Größenordnung nicht gesprochen werden. Handelte es sich um
eine schwache Anreicherung an aktiven RNA-Spezies, müssten in einer nachfolgenden
Runde unter gleichbleibenden Reaktionsbedingungen ein ähnlicher oder gar höherer
Wert erreicht werden.
Betrachtet man hingegen die Immobilisierungsraten der RNA vor der UV-Spaltung, so
fällt auf, dass ab der 7. Runde der Wert über dem des Hintergrunds liegt. Allerdings ist
auch hier keine signifikante Erhöhung der Rate an immobilisierten RNA zu erkennen,
da die Werte alternierend von Runde zu Runde geringfügig steigen und fallen. Die
Selektion wurde aufgrund eines ausbleibenden Anstiegs der Rate nach der 12. Runde
eingestellt.
Über die Gründe für einen negativen Ausgang einer Selektion kann nur spekuliert
werden, denn es sind zu viele Faktoren und Parameter beteiligt, deren Gesamtheit,
Zusammenspiel und gegenseitige Einflüsse nicht ergründbar sind. Zudem stellt jeder
Schritt der Selektion selbst eine Selektion dar, in dem Sequenzen bevorzugt werden und
andere aus dem Selektionszyklus fallen.
Es kann vermutet werden, dass bei der durchgeführten Selektion die Komplexität des
Ausgangspools zu klein war und während der präparativen Ligation in der ersten Runde
wichtige Motive nicht ligiert wurden. Das Verwenden eines Pools mit einer größeren
Komplexität und ein nochmaliges Ligieren der RNA, die bei der präparativen Ligation
nicht ligiert wurde, sollten diesen Problemen entgegenwirken. Ein anderer Grund für die
ausgebliebene Anreicherung könnte gewesen sein, dass durch das Einsetzen des zweiten
Selektionskriterium, die Abspaltung der immobilisierten RNA von der Festphase, von
der ersten Runde an Spezies, die potentielle Katalysatoren gewesen wären, nicht
selektiert wurden und auf der Festphase verblieben. In zwei verschiedenen in vitro
Selektionen konnte gezeigt werden, dass ein Photospaltungsschritt für die Selektion
aktiver RNA nicht essentiell war.70, 72 Deshalb sollte für eine neue Selektion in den
ersten drei Runden auf die Photospaltung verzichtet und danach parallel eine Selektion
mit direkter Amplifikation nach der Immobilisierung durchgeführt werden.
5.2 Die in vitro Selektion 81 Der zweiten Selektion wurde ein anderer Ausgangspool zugrunde gelegt. Es handelte
sich um einen Pool, der im Vergleich zu dem vorhergehenden nur 70 randomisierte
Positionen, jedoch eine größere Komplexität aufwies. Generell kann nicht vorhergesagt
werden, welche Poollänge die optimale für eine in vitro Selektion ist. Mit zunehmender
Länge des randomisierten Bereichs steigt zwar die Zahl der möglichen Sequenzen
expotentiell an, ab einer Anzahl von 25 randomisierten Positionen ist der theoretisch
mögliche Sequenzraum synthetisch aber nicht mehr realisierbar. Ein kürzerer Pool kann
folglich eine höhere Komplexität erreichen und damit erhöht sich die
Wahrscheinlichkeit, ein Ribozym zu finden. Dagegen sollten längere Bibliotheken
theoretisch gegenüber kürzeren überlegen sein, weil sie ein größeres Potential haben,
komplexere Sekundär- und Tertiärstrukturen und damit potentielle katalytische Zentren
auszubilden. Dies wäre besonders bei komplexeren katalytischen Fragestellungen
wichtig. Allerdings können sich auch randomisierte Regionen, die nicht für die
katalytische Funktion des Ribozyms essentiell sind, störend durch z.B. konkurrierende
Faltungsmöglichkeiten auf das katalytische Zentrum auswirken.221 Zudem besitzen
längere randomisierte Bereiche den Nachteil, schwerer replizierbar zu sein, da sie unter
Umständen stabile intramolekulare Strukturen ausbilden, die nicht oder nur schwer
durch die Polymerasen überwunden werden können. Da sich der Selektionszyklus aus
vielen enzymatischen Einzelschritten, wie Transkription, reverse Transkription und
PCR, zusammensetzt, ist dieses Problem nicht zu vernachlässigen. So kann es sein, dass
nicht alle Sequenzen, und somit vermeintlich aktive Spezies, mit gleicher Effektivität
durch die eingesetzten Polymerasen transkribiert und amplifiziert werden und eine
Anreicherung von den Polymerasen bevorzugter, nicht zwangsläufig aktiver Sequenzen
zur Folge hat.222 Die Benachteiligung längerer Sequenzen gegenüber den kürzeren bei
der Replikation kann auch bei dem Selektionsexperiment mit einem gemischten Pool
aus verschieden langen Sequenzen bestanden haben.223 Der Pool wies 30, 60, 100 und
140 randomisierte Stellen auf, aber nur die Sequenzen mit 30 und 60 randomisierten
Nukleotiden brachten aktive Spezies hervor. Dieses Ergebnis hatte die Annahme zur
Folge, dass ein Pool mit 60 randomisierten Stellen optimal für eine Selektion sei.
Theoretisch sollten aktive Motive kürzerer Sequenzen auch unter den Sequenzen mit
längeren randomisierten Bereichen zu finden sein. Zu diesem Ergebnis kam die
Reselektion eines Aptamers aus verschiedenen Pools mit 16 – 90 randomisierten
5.2 Die in vitro Selektion 82 Positionen.224 Gleichzeitig zeigte sich aber auch, dass es hierfür eine optimale Poollänge
gab. Die Pools mit 50 und 70 Nukleotiden im randomisierte Bereich ermöglichten ein
Wiederfinden eines bestimmten Motivs. Die kürzesten und längsten Sequenzen
bereiteten bei der Reselektion Probleme. Dagegen wurde aus einer RNA-Bibliothek mit
220 randomisierten Nukleotiden eine RNA-Ligase isoliert,35 deren katalytisches
Zentrum später auf 93 Nukleotide verkürzt werden konnte.91 Dabei bleibt die Frage
offen, ob dieses Motiv wirklich das minimale Motiv ist, da es viele Möglichkeiten gibt,
durch Basendeletionen eine RNA zu rekonstruieren. Ebenso wird nie geklärt werden
können, ob dieses Motiv auch aus einem kleineren Pool hervorgegangen wäre.
Für die zweite Selektion wurde die Reaktionszeit von 24 h auf 4 h verkürzt. Die im
Vergleich zur ersten Selektion verkürzte Reaktionszeit sollte eine Degradation der RNA
in Gegenwart der zugesetzten Cofaktoren abschwächen. Es ist denkbar, dass bei der
ersten Selektion potentielle Katalysatoren durch die Degradation aus dem
Selektionszyklus ausschieden.
Außerdem wurde, um die Wahrscheinlichkeit einer Anreicherung von aktiven RNA-
Motiven zu erhöhen, die Selektion auf zwei Arten durchgeführt. Es erfolgte direkt nach
der Immobilisierung die Amplifikation der selektierten RNA und parallel dazu erst nach
der photolytischen Abspaltung von der Festphase.
In dem Selektionspfad, der das zusätzliche Selektionskriterium der photolytischen
Abspaltung von der Festphase hatte, konnte keine Anreicherung erzielt werden
(Abb. 4-19). Er wurde nach der 9. Runde eingestellt. Überraschenderweise erfolgte hier
vor der Photospaltung eine Erhöhung der Immobilisierungsrate bis zu 5.6 % in der
9. Runde, dennoch ließ sich nur ein geringer Anteil RNA von der Festphase spalten und
selektieren (Abb. 5-1). Diese Beobachtung wurde auch schon in einer Selektion auf eine
1,3-dipolaren Cycloaddition gemacht.225 Offensichtlich verhinderte das zweite
Selektionskriterium zwar erfolgreich die Anreicherung von Spezies, die
Nebenreaktionen bevorzugten. Denn durch die Spaltung von der Festphase werden
intern modifizierte RNA-Sequenzen nicht freigesetzt und konnten nicht in weitere
Runden verschleppt werden. Aber auch die Isolierung von RNA, die ausschließlich die
Aldolreaktion katalysieren, scheint durch die Photospaltung verhindert worden zu sein.
Andernfalls hätte die Immobiliserungsrate vor der Photospaltung in einer Runde
5.2 Die in vitro Selektion 83 einbrechen müssen und nach der Photospaltung hätte keine RNA amplifizierbar sein
können. In der 8. Runde wurde RNA nach der Photospaltung isoliert, allerdings war der
Anteil an Radioaktivität sehr gering, so dass sich der Fehler des Szintillationszählers
hier stärker bemerkbar machte.
Abb. 5-1: Selektionszweig mit Spaltung der immobilisierten RNA durch UV-Licht. Dargestellt sind die relativen Mengen an selektierter RNA bezogen auf die zur Immobilisierung eingesetzen RNA-Konjugate L1 und L1a vor (schattierte Balken) und nach der photolytischen Spaltung (rote Balken). Die nach der 8. Runde durch UV-Spaltung erhaltene RNA-Menge konnte nicht detektiert werden
Um nachzuprüfen, ob eine Anreicherung Aldol-katalysierender RNA vor der
Photospaltung erfolgte, könnten die Sequenzen des Pools nach der 9. Runde durch
Klonierung vereinzelt werden und dann in einem Aktivitätstest überprüft werden.
Die direkte Selektion dagegen zeigte eine klare Entwicklung in Hinblick einer
Anreicherung (Abb. 4-18). Da bei diesem Selektionspfad auf das weitere
Selektionskriterium der photolytischen Spaltung der selektierten RNA von der
Festphase verzichtet wurde, musste die ungewollte Anreicherung von Agarose- oder
Streptavidin-bindenden RNA-Sequenzen und Nebenreaktion katalysierende Spezies
unterdrückt werden. Dies konnte durch entsprechende Gegenselektionen erreicht
werden. Die erste Gegenselektion wurde in der 7. Runde gegen die Agarose- und
Streptavidinbinder durchgeführt. In der darauf folgenden 8. Runde erfolgte der
reproduzierbare, signifikante Anstieg der Rate immobilisierter RNA. Eigentlich würde
n. d
.
0
1
2
3
4
5
6
4 5 6 7 8 9Selektionsrunde
sele
ktie
rte R
NA
[%]
immobilisierte RNA vor UV-Spaltung
nach UV-Spaltung
5.2 Die in vitro Selektion 84 man nach einer Gegenselektion einen Einbruch der Rate erwarten. Betrachtet man die
vorhergehende 6. Runde, ist hier eine Tendenz zum Anstieg zu beobachten und ein
leichter Einbruch erfolgt in der 7. Runde mit der Gegenselektion. Somit liegt die
Annahme nahe, dass in den Runden zuvor hauptsächlich Spezies mit den gewünschten
Eigenschaften, nämlich eine Aldolreaktion zu katalysieren, angereichert wurden.
Andernfalls wäre es zu dem erwarteten Einbruch gekommen und bis zum Anstieg
hätten mehr Runden erfolgen müssen. Auch die Wiederholung der 8. Runde mit nur
20 min Reaktionszeit zeigt, dass es sich um einen Anstieg handelte und aktive
Sequenzen vorhanden sein mussten. Es konnten 0.6 % RNA unter den stringenteren
Reaktionsbedingungen selektiert werden, was im Vergleich zu der 7. Runde mit
Gegenselektion ebenfalls einen leichten Anstieg bedeutete.
Bei der weiteren Gegenselektion in der 9. Runde verblieben nur 2 % der RNA auf der
Festphase. Diese Gegenselektion diente dazu, RNA-Sequenzen zu erfassen, die durch
die Reaktion mit dem biotinylierten Aldolakzeptor 5 an anderen Stellen als dem
Aldoldonor reagiert haben. Hätte eine Anreicherung an Spezies stattgefunden, die
Nebenreaktionen favorisieren, wäre der Anteil an auf der Festphase verbliebenen RNA
höher gewesen. Nach dieser Gegenselektion war durch die Durchführung der
Aldolreaktion ein Anstieg der Immobilisierungsrate auf 5.4 % zu beobachten. Dies
deutet darauf hin, dass sich nur Spezies im angereicherten Pool befanden, die die
Aldolreaktion am vorgesehenen Aldoldonor und nicht an Nukleobasen katalysierten.
Die direkte Selektion wurde nach der Gegenselektion gegen Nebenreaktionen in der
9. Runde unter zwei verschiedenen Selektionsdrücken weiterentwickelt. Zum einen
wurde die Reaktionszeit sukzessiv von 4 h auf 1 min verkürzt, zum anderen die
Konzentration des Biotinakzeptors 5 von 50 mM auf 4.7 mM verringert. Diese
Entwicklung unter verschiedenen Bedingungen sollte dazu dienen, die
Sequenzdiversität zu verringern226 und Spezies zu generieren, die die Aldolreaktion
effizient beschleunigen.
5.3 Selektierte Ribozyme der Aldolreaktion 85
5.3 Selektierte Ribozyme der Aldolreaktion
Die selektierten Spezies zeigten eine große Sequenzvielfalt, wobei 12 Familien mit
unterschiedlichen Primärstrukturen im randomisierten Bereich und 41 unabhängige
Einzelsequenzen gefunden wurden (Abb. 4-20). Aufgrund der großen Diversität der
erhaltenen Klone war ein Auffinden von generellen Strukturmotiven oder ein rationales
Verkürzen der isolierten Sequenzen auf ein minimales Motiv durch Vergleich von
Sequenzabschnitten oder Sekundärstrukturvorhersagen nicht möglich. Um die aktiven
Klone zu verkürzen, müssten Studien durchgeführt werden, bei denen schrittweise eine
Sequenz durch die Verwendung veränderter Primer in einer PCR verkürzt und die
resultierenden Sequenzen auf ihre Aktivität überprüft werden. Einen wichtigen
Anhaltspunkt in Hinblick auf Verkürzungsstudien einzelner Klone liefern die
Basendeletionen, die in drei Familien bei je nur einem Mitglied zu beobachten sind. Es
liegt nahe, dass die fehlenden Basen nicht essentiell für die Katalyseaktiviät sind.
Auffallend bei der Sequenzanalyse waren die oft auftretenden, ausgedehnten
Purinbereiche. Diese Purinbereiche könnten eine wichtige Rolle bei der Katalyse der
Aldolreaktion spielen. Es wäre denkbar, dass diese Abschnitte der Sequenzen durch die
tertiäre Struktur dem Aldoldonor am 3’-Ende ausreichend nahe kommen und diesen
durch Ausbildung einer Schiff’schen Base unter Beteiligung der exocyclische
Aminogruppe aktivieren. Solch ein denkbarer Mechanismus wäre analog zu den
Aldolasen der Klasse I, die in Kapitel 1.3.2 bereits erwähnt wurden.
Dies ließe sich überprüfen, indem eine vermeintliche Schiff’sche Base durch Borhydrid
abgefangen oder durch Cyanid inhibiert würde und keine Aldolreaktion resultierte. Mit
dieser chemischen Falle und Inhibition durch Cyanid konnten Perrin und seine
Mitarbeiter zeigen, dass ein DNA-Enzym bei der stattfindenden Katalyse ein
Intermediat, in der eine kovalente Schiff’sche Base gebildet wird, durchläuft.227 Das
untersuchte DNA-Enzym war mit primären Aminen und Imidazolen modifiziert und
hydrolysierte unabhängig von Metallionen Phosphordiesterbindungen in RNA. Es ist
bisher ungeklärt, ob die modifizierten Basen direkt in der Katalyse involviert sind.
Vorstellbar wäre, dass sie die Bildung einer katalytischen Tasche unterstützen, aber
5.3 Selektierte Ribozyme der Aldolreaktion 86 dabei die katalytische Aktivität der exocyclischen Aminogruppen an unmodifizierten
Basen durch neu auftretende Wechselwirkungen stören. Die Autoren kamen zu dem
Schluss, dass DNA-Enzyme generell fähig sein sollten, eine Aldolkondensation zu
katalysieren. Diese Ergebnisse und Überlegungen sollten prinzipiell auf RNA
übertragbar sein, denn RNA weist im Gegensatz zu DNA eine größere Vielfalt an
Sekundär- und Tertiärstruktur auf und das Spektrum an Reaktionen, das durch
Ribozyme katalysiert wird, ist vielfältiger als das von DNA-Enzymen.
Die einzelnen Mitglieder einer Familie unterscheiden sich nur in Punktmutationen an
bis zu vier Basen. Auffällig ist, dass bei einigen Familien nur Transitionen (Familien 2
und 4: Purin, Familie 11 und 13: Pyrimidin) erfolgten, bei den restlichen Familien
ausschließlich Transversionen (Abb. 4-20). Ob die Transversion innerhalb einer Familie
eine Auswirkung auf die Aktivität hat, müsste genauer untersucht werden. Hinweis auf
einen Einfluss der Aktivität könnte sein, dass innerhalb der Familie 2 die relativen
Geschwindigkeitskonstanten dicht beieinander liegen (Abb. 4-21). Beide
Familienmitglieder weisen eine Punktmutation zwischen Purinbasen auf. Dagegen ist in
Familie 6 der Beschleunigungsfaktor des Klons BSW332A11 doppelt so hoch wie der
des Mitglieds BSW328A7. Diese beiden Klone unterscheiden sich durch drei
Punktmutationen: zwei Transitionen und eine Transversion (Adenosin/Cytidin). Stellte
sich zudem heraus, dass diese Familie kein Lysin als Cofaktor benötigt, könnte noch
zusätzlich untersucht werden, ob trotzdem eine Schiff’sche Base als Intermediat
gebildet wird. Cytidin verfügt wie die Purinbasen über eine exocyclische Aminogruppe
und wäre somit ebenfalls fähig, eine Schiff’sche Base auszubilden. Allerdings lässt die
schwache Nukleophilie der exocyclischen Aminogruppen in RNA-Basen dies nicht
erwarten.
Die große Diversität der isolierten Sequenzen, vor allem die Anzahl an
Einzelsequenzen, spricht dafür, dass trotz der stringenten Selektionsführung in beiden
Selektionszweigen die angereicherten Pools noch relativ komplex waren. Es liegt auch
nahe, dass wesentlich mehr aktive Spezies in den angereicherten Pools vorlagen, was
sich durch eine weitere Klonierung und Sequenzierung klären ließe.
5.3 Selektierte Ribozyme der Aldolreaktion 87 Die Zusammensetzungen der Familien deuten ebenfalls auf eine große Diversität der
angereicherten Bibliotheken hin. Denn hier treten überwiegend Familien auf, in denen
die Klone aus beiden Pfaden stammten. Es ist jedoch auch denkbar, dass gerade diese
Familien mit ihren Mitgliedern die effizientesten sind, weil sie unter beiden
Selektionsdrücken überlebten. Hierbei wäre es zudem interessant zu untersuchen, ob
sich die unterschiedlichen Selektionsdrücke auf die Aktivität und Abhängigkeit von
Cofaktoren der einzelnen Mitglieder auswirken.
Desweiteren sind auch Familien zu beobachten, deren Klone ihren Ursprung in nur
einem der Selektionszweige haben. Dabei sind Familien, die aus der Selektion unter
verkürzten Reaktionszeiten generiert wurden, häufiger vertreten. Diese Begebenheit
lässt vermuten, dass diese Familien von unterschiedlichen Cofaktoren abhängig sein
könnten. Würde sich dies bewahrheiten, wäre ein Vergleich hinsichtlich Aktivität und
Abhängigkeit von Cofaktoren mit den Familien, deren Klone aus beiden
Selektionspfaden stammen, sehr interessant.
Bei der Berechnung der möglichen energetisch günstigsten Sekundärstrukturen wurden
für die Sequenzen einer Familie weitgehend dieselben Strukturvorschläge erhalten
(Abb. 5-2). Die gute Übereinstimmung der Sekundärstrukturen innerhalb einer Familie
lässt erwarten, dass die Sequenzen in einer Familie dieselbe Aktivität besitzen. Würde
sich das bestätigen, wären dies erste Anhaltspunkte für die Verkürzung der Sequenzen.
Die Selektion sollte es ermöglichen, Ribozyme zu generieren, die den beiden
natürlichen Aldolaseklassen ähnlich agieren. Deshalb wird es außerordentlich
interessant sein, zu überprüfen, ob die Aktivität der Klone von zumindest einem der
Cofaktoren L-Lysin, L-Prolin oder Zn2+-Ionen abhängt. Da bisher noch nichts darüber
bekannt ist, hätte ein Vergleich mit Aptameren für diese Cofaktoren Indizien dafür
liefern können. Leider sind aber bisher für keiner dieser Komponenten Aptamere
bekannt. Famulok unternahm erfolglos den Versuch, aus einem gedopten Pool einen
L-Lysin-Binder zu isolieren. 228 Als Grundlage für den gedopten Pool nahm er eine
RNA-Bibliothek, aus der er zuvor ein L-Citrullin-Aptamer generierte. Desweiteren ist
ein HIV-1 Tat Protein-bindendes Aptamer bekannt, das für seine Bindungseigenschaft
Zn2+ benötigt.229 Allerdings ist dabei noch nicht geklärt, wie die Zinkionen bei der
Bindung des Tat-Proteins agieren. Ebenso scheinen Lysin-Einheiten eine Rolle bei der
Bindung eines DNA-Aptamers an menschliches α-Thrombin zu spielen.230, 231
5.3 Selektierte Ribozyme der Aldolreaktion 88
Abb. 5-2: Sekundärstrukturenvorschläge für die untersuchten Klone. Abgebildet sind die energetisch günstigsten der Berechnung durch die Software mfold205. Ausgefüllte Kreise stehen für Watson-Crick-Basenpaarung. Die Punktmutationen innerhalb einer Familie sind durch einen roten Kreis gekennzeichnet. Für Familie 2 wird für beide Klone dieselbe Sekundärstruktur vorgeschlagen, bei Familie 3 liegt der Unterschied in der Größe des Loops zwischen den Nukleotiden 74 und 80
5.3 Selektierte Ribozyme der Aldolreaktion 89 Vergleich man die beiden untersuchten Familien, so scheint es nicht entscheidend in
Hinblick auf die Aktivität zu sein, aus welchem Selektionszweig ein Klon stammt.
Denn der aktivste Klon BSW332A11 (kapp = 5.3 · 10-5 M-1s-1) unter den untersuchten
wurde unter stringenteren Bedingungen bezogen auf die Konzentration des
Aldolakzeptors 5 generiert. Er beschleunigt die Reaktion um das 500-fache gegenüber
der Hintergrundreaktion. Hingegen stammte der am wenig aktivste Klon BSW328A7
(kapp = 2.4 · 10-5 M-1s-1) aus demselben Selektionspfad. Betrachtet man die scheinbaren
Geschwindigkeitkonstanten der letzten Runden der Selektion, würde man erwarten, dass
die Selektionsführung mit den stringenter werdenden Reaktionszeiten die aktiveren
Klone generiert haben sollten. Möglicherweise bestätigt sich dies, wenn mehr
Sequenzen aus diesem Selektionszweig untersucht werden.
Im Vergleich zu der katalytischen Effizienz der Aldolase-Antikörpern167, die je nach
Substraten zwischen kcat/Km = 0.16 und 13.9 M-1s-1 und für Retroaldolreaktionen232
sogar bei 2.3 · 103 M-1s-1 liegen kann, oder zu natürlichen Aldolasen, z.B. dem zentralen
Enzym der Glykolyse und gut charakterisierten Fructose-1,6-biphosphat Aldolase233
4.9 · 104 M-1s-1, sind die scheinbaren Geschwindigkeitskonstanten der untersuchten
Klone sehr niedrig. Die Evolution und Optimierung der natürlichen Enzyme hat über
Millionen von Jahren stattgefunden, dagegen hat die Optimierung und anschließende
Durchführung der in vitro Selektion mit der Isolierung der RNA nur wenige Monate
gedauert. Ein Vorteil der in vitro Selektion gegenüber der Generierung der Antikörper
ist, dass viele Cofaktoren angeboten werden können, welche nicht zwingend kovalent
an die Nukleinsäure gebunden sein müssen. Zur Generierung von Antikörpern muß das
TSA so konzipiert werden, dass es bei der Immunisierung die Produktion von
katalytischen Antikörpern hervorruft. Sollen wie im Falle der Aldolase-Antikörper
bestimmte funktionelle Gruppen der Aminosäuren bei der Antikörperproduktion
intergriert werden, muß in den TSA eine chemische Falle eingebaut werden (vgl.
Kapitel 1.3.3). War die Generierung von Antikörpern erfolgreich, ist nicht sicher
gestellt, dass diese auch katalytische Eigenschaften besitzen.
Da nicht alle isolierten Sequenzen im Rahmen dieser Arbeit kinetisch untersucht
wurden, ist nicht auszuschließen, dass auch aktivere Spezies bei der Selektion generiert
wurden. Überdies könnte die in vitro Selektion entweder nach dem erfolgten Anstieg
unter stringenteren Bedingungen wiederholt werden oder noch weitergeführt werden.
5.4 Vergleich mit einem anderen Ribozym 90 Somit wäre es möglich, das Potential aktiver Spezies noch auszureizen und schnellere
Klone zu generieren.
5.4 Vergleich mit einem anderen Ribozym
Kürzlich berichteten Famulok und seine Mitarbeiter über die Selektion eines Ribozyms,
das eine Aldolreaktion katalysiert.72 Die Selektion ging von einem längeren Pool aus, in
dem ein 14 Basen langer konstanter Bereich von zwei randomisierten Bereichen mit 70
und 72 Nukleotiden flankiert wurde. Das als Aldoldonor fungierende, aliphatische
Keton wurde während der Transkription mit dem entsprechenden Initiatornukleotid in
die insgesamt 194 Nukleotide lange RNA-Bibliothek eingeführt. Das Initiatornukleotid
wies einen ähnlichen Aufbau wie das in der vorliegenden Arbeit verwendete
Dinukleotid auf. Es besaß einen flexiblen, aber kürzeren Spacer aus drei
Ethylenglykoleinheiten und trug ebenfalls die photospaltbare o-Nitrobenzyleinheit. Die
Photospaltstelle sollte wie in dieser Arbeit als zweites Selektionskriterium dienen, um
Sequenzen, die die gewünschte Reaktion austrugen, von denjenigen zu trennen, die
Nebenreaktionen favorisierten. Im Gegensatz zu dieser Arbeit wurde ein aliphatischer
Aldoldonor verwendet und an das 5’-Ende des RNA-Pools gekoppelt. Ob es prinzipiell
entscheidend für den Ausgang einer Selektion ist, wenn das Substrat am 3’- oder 5’-
Ende sitzt, kann nicht gesagt werden.
Ebenso kann nicht geprüft werden, ob der Aufbau des Pools entscheidend dafür war,
dass aus der Selektion nur eine Klonfamilie hervorging. Die einzelnen Sequenzen
unterscheiden sich in Punktmutationen, die hauptsächlich in dem zweiten
randomisierten Abschnitt der RNA zu finden sind. Theoretisch sind längere
Bibliotheken gegenüber kürzern überlegen, weil sie komplexere Sekundär- und
Tertiärstrukturen ausbilden können (vgl. Kapitel 5.2). Vielleicht brachte der von
Famulok verwendete, lange Pool sehr komplexe Strukturen hervor, dass deshalb die
Verkürzung des aktivsten Klons um nur 20 Nukleotide am 3’-Terminus ohne Verlust
seiner Aktivität möglich war. Er weist eine 4300-fache Reaktionsbeschleunigung
gegenüber der Hintergrundreaktion auf. Aufgrund der Daten, die durch enzymatisches
Probing des nicht verkürzten Klons erhalten wurden, wurde eine Sekundärstruktur
5.4 Vergleich mit einem anderen Ribozym 91 postuliert. Sie weist ein einzelsträngiges zentrales Sequenzmotiv auf, das sich in viele
doppelsträngige Bereiche mit Hairpin und Bulges verzweigt.
Ein anderer Grund, dass der angereicherte Pool nur eine Sequenzfamilie hervorbrachte,
kann Degradation potentiell aktiver Sequenzen sein. Denn die Reaktionszeit am Anfang
der Selektion betrug 24 h und wurde erst nach der Anreicherung auf 5 h verkürzt. Somit
ist es denkbar, dass nur komplexere Strukturen in der Selektion überlebten. In der in
dieser Arbeit beschriebenen Selektion war die Reaktionszeit anfangs nur 4 h, um
eventuell auftretende Degradation der RNA zu vermindern, und wurde dann
schrittweise auf 1 min verkürzt. Aber auch die Stringenz der Selektion könnte
entscheidend für die Diversität des angereicherten Pools sein. Famulok und seine
Mitarbeiter variierten nur die Reaktionszeit der Aldolreaktion, nicht aber die
Konzentration des biotinylierten Akzeptors, der derselbe war wie in der vorliegenden
Arbeit.
Famulok verfolgte wie die im Rahmen dieser Arbeit durchgeführte Selektion die direkte
Amplifikation nach der Immobilisierung und die Strategie der photolytischen
Abspaltung der selektierten RNA von der Festphase. Offensichtlich ist das zweite
Selektionskriterium für die Anreicherung aktiver Spezies nicht zwingend notwendig,
denn in beiden Selektionszweigen erfolgte die Anreicherung in derselben Runde und
letztendlich wurden dieselben Sequenzen erhalten.
Ein entscheidender Unterschied der Selektion, die in dieser Arbeit beschrieben wird, zu
der von Famulok und seinen Mitarbeitern ist, dass nicht nur die üblichen mono- und
divalenten Metallionen zugesetzt wurden, sondern auch L-Lysin, L-Prolin und
Zinkionen in einer höheren Konzentration. Somit war die Möglichkeit gegeben, sowohl
Aldolase Klasse I- als auch Klasse II-ähnliche Ribozyme zu generieren. Famulok bot
nur Zinkionen in höherer Konzentration an und isolierte ein Ribozym, das nur in
Gegenwart von Zinkionen aktiv ist. Welche Rolle das Zink bei der Katalyseaktivität des
Ribozyms spielt, ist bisher unbekannt.
Die Katalyse der intermolekularen Reaktion wurde mit einer zweisträngigen Variante
des beschriebenen Ribozyms untersucht. Hierzu wurde der Klon um sechs Basen am
5’-Ende verkürzt und ein Hexamer, das den ersten sechs Basen des 5’-Ende des Klons
enspricht, gebildet. Das Hexamer wurde am 5’-Ende mit dem Aldoldonor modifiziert
und der Reaktion mit dem biotinylierten Aldolakzeptor unter single turnover
5.4 Vergleich mit einem anderen Ribozym 92 Bedingungen unterworfen. Die Katalyse der freien Reaktanden durch das Ribozym war
nicht möglich, ebenso konnte kein multiple turnover mit dem zweisträngigen System
erhalten werden.
Die im Rahmen dieser Arbeit isolierten Sequenzen müssen noch in einem trans-Assay
auf ihre intermolekulare Katalyseaktivität überprüft werden. Hierbei ist es von Vorteil,
dass der Dinukleotid-Aldoldonor 3 verwendet werden kann und die Bedingungen einer
intermolekularen Katalyse eher gegeben sind als bei Famuloks Ribozym. Hier war
nämlich das Aldoldonor-tragende Hexamer zuvor Teil des Ribozyms und scheint in
Interaktionen im Ribozym beteiligt zu sein.
6 Zusammenfassung
Durch die in vitro Selektion konnte im Laufe der letzten 20 Jahre eine Reihe an künstlichen RNA-Enzymen (Ribozyme) entwickelt werden. Die Fähigkeit der Ribozyme, eine große Bandbreite an organischen Reaktionen zu katalysieren, unterstützt die Hypothese der RNA-Welt, der zufolge in einer früheren Welt metabolische Umwandlungen durch RNA-Moleküle bewerkstelligt wurden. Die Bindungsausbildung zwischen zwei Kohlenstoffatomen dürfte in solch einer Welt auch bereits eine erhebliche Rolle gespielt haben. In der Natur werden Kohlenstoff-Kohlenstoff-Bindungen überwiegend durch Aldolreaktionen gebildet, wobei Aldolasen die Reaktion in einem Enaminmechanismus (Klasse I) oder mit Hilfe von Zinkionen (Klasse II) katalysieren. Diese Arbeit beschreibt die Etablierung einer Selektionsstrategie zur Generierung von Ribozymen, die eine Aldolreaktion ähnlich den Aldolasen katalysieren sollen. Für die direkte in vitro Selektion mit photospaltbaren linkerkoppelten Reaktanden wurden zwei verschieden lange RNA-Bibliotheken verwendet. Die Einführung des Aldoldonors an den 3’-Terminus der kombinatorischen Bibliotheken erfolgte über einen flexiblen Dinukleotidlinker durch enzymatische Ligation. Nach stattgefundener Reaktion mit dem biotinylierten Aldolakzeptor konnten aktive RNA-Moleküle durch Affinitätschromatographie von nicht-umgesetzten Sequenzen abgetrennt und durch die im Linker enthaltene photospaltbare o-Nitrophenyleinheit selektiv freigesetzt werden. Die Photospaltstelle im Linker sollte hierbei die Regioselektivität der Aldolreaktion und eine ungewollte Anreicherung an Spezies, die Nebenreaktionen bevorzugen, gewährleisten. In dem kürzeren Pool, der einen randomisierten Bereich von 70 Nukleotiden aufwies, wurde eine Anreicherung an Spezies beobachtet und nach 13 bzw. 14 Runden kloniert und sequenziert. Es wurden insgesamt 85 Sequenzen isoliert, die in 12 Familien mit insgesamt 34 Mitgliedern eingeteilt werden konnten. Sekundärstrukturanalyse und -vergleiche wurden durchgeführt. Zur kinetischen Charakterisierung der isolierten Sequenzen wurden verschiedene Ansätze ausgetestet. Die genauer charakterisierten Spezies beschleunigen die Reaktion zwischen dem 230- und 500-fachen und weisen eine scheinbare Geschwindigkeitskonstante zwischen 2.4 · 10-5 und 5.3 · 10-5 M-1s-1auf. Durch die erfolgreiche Selektion von Sequenzen, die eine Aldolreaktion beschleunigen, konnte das Reaktionsspektrum, das durch RNA katalysiert wird, ausgebaut und die Hypothese der präbiotischen RNA-Welt weiter untermauert werden.
7 Summary
During the past 20 years several artifical RNA-enzymes (ribozymes) have been developed by in vitro selection. The ability of ribozymes to catalyse a broad spectrum of organic reactions supports the hypothesis of the RNA world in which metabolic transformations were carried out by RNA molecules. The bond formation between two carbon atoms could have played a role in the RNA world as well. In nature carbon-carbon bonds are mainly formed by the aldol reaction catalysed by aldolases either via an enamine mechanism (class I) or by zinc iones (class II). This work describes the establishment of a selection strategy for generation of ribozymes which should catalyse the aldol reaction in a manner similar to aldolases. Two RNA libraries with different lengths were subjected to the direct in vitro selection with photo-cleavable linker-coupled reactant. The aldol donor was attached via a flexible dinucleotide linker to the 3’-terminus of the combinatorial library by using enzymatic ligation. By reaction with the biotinylated aldol acceptor active RNA molecules could be separated from unreacted sequences by affinity chromatography and were selectively released by cleaving the photo-sensible o-nitrophenyl moiety contained in the linker. The photo-cleavage step should control the regioselectivity of the aldol reaction and prevent the undesired enrichment of species which favour side reactions. An enrichment of active species were obtained in the shorter pool with 70 randomised nucleotides and after 13 and 14 rounds the enriched pools were cloned and sequenced. In total 85 sequences were obtained, 31 of which could be classified into 12 families. In addition the analysis and comparison of the secondary structures were achieved. For kinetic characterisation of the isolated sequences different approaches were tested. Two species characterised in more details accelerate the reaction about 230- and 500-fold, respectively, and the apparent rate constants are 2.4 · 10-5 and 5.3 · 10-5 M-1s-1, respectively. By this successful selection the spectrum of reactions catalysed by RNA could be expanded and it supports the hypothesis of a prebiotic RNA world.
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9 Anhang
9.1 Abkürzungen ε molarer Extinktionskoeffizient
A Adenosin
abs. absolut
ATP Adenosintriphosphat
APS Ammoniumperoxodisulfat
BSA Rinderserumalbumin
BTT Benzylthiotetrazol
c Konzentration
C Cytidin
cDNA komplementäre DNA
cend Endkonzentration
Ci Curie, 1Ci = 37 MBq
cm Zentimeter
CPG controlled pore glass
cpm Zählimpulse pro Minute
CTP Cytidintriphosphat
d Schichtdicke (der Küvette)
dA Desoxyadenin
dC Desoxycytidin
DC Dünnschichtchromatographie
DCC Dicyclohexylcarbodiimid
dCTP Desoxycytidintriphosphat
dG Desoxyguanosin
DMSO Dimethylsulfoxid
DMT 4,4‘-Dimethoxytrityl
DN Dinukleotid
DNA Desoxyribonukleinsäure
dT Desoxythymidin
DMF Dimethylformamid
dNTP Desoxyribonukleosidtriphosphat
dsDNA doppelsträngige DNA
DTT Dithiothreitol
E Extinktion
E. coli Escherichia coli
EDTA Ethylendiamintetraacetat
EE Essigester
eq Äquivalent
g Gramm
G Guanin
glmS Glucosamin-6-Phosphat-Synthase
GTP Guanosintriphosphat
h Stunde
HEPES N-2-Hydroxyethylpiperazin-N’-2-ethansulfonsäure
HPLC Hochdruckflüssigkeitschromatographie
Hz Hertz
IPTG Isopropylthio-β,D-galactopyranosid
kapp scheinbare Geschwindigkeitskonstante
l Liter
LB Luria-Bertani
m Meter
M mol/l, molar
MALDI-TOF matrix assisted laser desorption/ionization-time of flight
MeCN Acetonitril
MeOH Methanol
min Minute
mJ Millijoule
NaOAc Natriumacetatlösung
NHS N-Hydroxysuccinimid
nm Nanometer
NMP N-Methylpyrrolidinon
NMR Kernmagnetische Resonanzspektroskopie
ns Nanosekunde
NTP Nucleosidtriphosphat
OD260 optische Dichte bei λ = 260 nm
PAGE Polyacrylamid-Gelelektrophorese
PCR Polymerase-Kettenreaktion
PEG Polyethylenglycol
PNK Polynukleotid-Kinase
RNA Ribonukleinsäure
RNase Ribonuklease
RP-HPLC reversed-phase HPLC
rpm rounds per minute
RT Raumtemperatur
RT Reverse Transkription
s Sekunde
SAP Shrimp Alkalische Phosphatase
SELEX systematic evolution of ligands by exponential enrichment
ssDNA/RNA einzelsträngige DNA/RNA
t Zeit
T Thymidin
Taq Thermophilus aquaticus
TBE Tris Borat EDTA-(Puffer)
TCA Trichloressigsäure
TEA Triethylamin
TEAAc Triethylammoniumacetat
TEA⋅3HF Triethylamin⋅Trihydrofluorid
TEMED N,N,N‘,N‘-Tetramethylendiamin
Tris Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan
t-RNA Transfer-RNA
TSA transition state analog
U Units, Uridin
UTP Uridintriphosphat
UV ultraviolett
vini Anfangsgeschwindigkeit
v/v Volumen pro Volumen
w/v Gewicht pro Volumen
X-gal 5-Brom-4-chlor-3-indoyl-β,D-galactopyranosid
9.2 Geräte Autoklav Sterico AG
Elektrophoresekammern Bio-Rad, MINI SUB™ DNA CELL
Eigenbau für PAGE
Expositionskassetten Kodak X-Omatic
Geldokumentationsanlage BioRad
HPLC-Anlage Agilent Technologies, Serie 1100
HPLC-Säulen:
- Luna 80 C18 , 5 µm, 250 x 4.6 mm
Phenomenex
- TSKgel G3000 SWXL, 5mm, 300 x 7.8mm Tosohaas
MALDI-Massenspektrometer Bruker Reflex
Mikrozentrifugenfilter
- ∅ 0.45 µm
Pall, Schleicher & Schuell , BioRad
NMR-Spektrometer Bruker A250, Bruker AMX500
PCR-Geräte MJ Research PTC 100
pH-Meter Knick, Calimatic 761
Phosphorimager Storm 840, Molecular Dynamics
Pipetten Gilson, Pipetman P2, P20, P200, P1000
Reaktionsgefäße, silikonisiert Biozym
Reinstwasseranlage Milli-Q, Millipore
Röntgenfilme Fuji, Medical X-ray Film RXOG (Safety)
Röntgenfilmkassetten Kodak, X-OMATIC
Spannungsgeber Pharmacia, ECPS 3000/150 und 500/400
Syntheziser Applied Biosystems EXPEDITE 8909
Szintillationszähler Beckman LS 6500
Thermoschüttler Eppendorf, Thermomixer 5436
UV-Laser (355 nm) MiniQ, Spectron Laser
UV-Küvetten Quarzglas SUPRASIL, HELLMA
UV-Spektrometer Shimadzu, UV-160A
UV-Transilluminator CAMAC Reprostar II
Vakuumzentrifuge Savant, Speed Vac Concentrator
Waagen Mettler AE 163 und AC 88; Sartorius
Zentrifugen Heraeus Christ, Biofuge 13R, A
Du Pont, Sorvall RC28S
Sigma 112
9.3 Enzyme Shrimp alkalische Phosphatase USB SuperScript™ II RNase H- RT Invitrogen
Taq-Polymerase Rapidozym
T4-RNA-Ligase MBI Fermentas
T4-Polynukleotidkinase MBI Fermentas
T7-RNA-Polymerase MBI Fermentas
9.4 Sonstige Materialien 100 bp DNA-Leiter MBI Fermentas Kieselgel (0.063-0.200 mm) J.T. Baker Mikrospinzentrifungenfilter, 0.45 µm, CA Centrex, Roth NAP5-Säulen Amersham RNA/DNA Kit Qiagen
9.5 Puffer 5x-First Strand Buffer (RT)
250 mM Tris-HCl pH 8.3 375 mM KCl 15 mM MgCl2
HPLC-Puffer
0.1 M TEAAc pH 7.0
Immobilisierungspuffer
1 M NaCl 10 mM HEPES pH 7.2 5 mM EDTA mit HCl eingestellt
HPLC-Puffer
0.1 M TEAAc pH 7.0 80 % Acetonitril
10x Kinase-Puffer
500 mM Tris-HCl, pH 7.6 100 mM MgCl2 50 mM DTT 1 mM Spermidin 1 mM EDTA
5x Selektionspuffer
150 mM Tris-HCl pH 7.4 1 M NaCl 500 mM KCl
LB-Medium
20 g LB-Broth ad 1 l Wasser, autoklavieren, bei 4 °C lagern, vor Benutzung: 100 µg/ml Ampicillin
Stoppuffer
8 M Harnstoff 50 mM EDTA, pH 7.2
LB-Agarplatten
17.5 g LB-Agar (Lennox-Agar) ad 500 ml Wasser, autoklavieren, bei ca. 55 °C: 100 µg/ml Ampicillin 50 µM IPTG 80 µg/ml X-gal - in sterile Petrischalen gießen, bei 4 °C lagern
10x Taq-Puffer
200 mM Tris-HCl pH 8.4 500 mM KCl
Ligase-Puffer (10x)
500 mM HEPES-NaOH pH 8.3 100 mM MgCl2 1 mM ATP
TBE-Puffer
89 mM Tris-HCl, pH 7.5 89 mM Borsäure 2 mM EDTA
Probenpuffer, nativ (Agarosegel)
0.25 % Xylencyanol FF 0.25 % Bromphenolblau 30 % Glycerol
10x Transkriptionspuffer
800 mM HEPES, pH 7.5 220 mM MgCl2 10 mM Spermidin
PAGE-Ladepuffer (denaturierend)
90 % Formamid 10 % 1x TBE je eine Spatepspitze Xylencyanol und Bromphenolblau
Wasch-Puffer
8 M Harnstoff 0.1 M Tris-HCl pH 7.4
9.6 Oligonukleotide Alle Sequenzen sind in 5’→ 3’-Richtung angegeben. Entweder wurden sie durch
Festphasensynthese selber hergestellt, von den Firmen NOXXON, Berlin, oder IBA,
Göttingen, bezogen.
RNA 159-mer Pool:
GG AGC TCA GCC TTC ACT GC—N120—GGC ACC ACG GTC GGA TCC AC
RNA 109-mer Pool (NOXXON):
GGA GCT CAG CCT TCA CTG C- N70-GGC ACC ACG GTC GGA TCC AC
RNA 25-mer:
GGA GCU CAG CCU UCA CUG CUC CAC C
DNA Primer A (IBA):
TCT AAT ACG ACT CAC TAT AGG AGC TCA GCC TTC ACT GC
DNA Primer B (IBA):
GTG GAT CCG ACC GTG GTG CC
DNA Primer B-4 (IBA):
AT CCG ACC GTG G TG CC
DNA Primer M13rev (IBA):
CAG GAA ACA GCT ATG ACC
DNA Primer M13for (-21) (IBA):
TGT AAA ACG ACG GCC AGT
