Induzierbare Enzyme: Genotypische und phänotypische Charakterisierung

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Induzierbare Enzyme: Genotypische und phänotypische Charakterisierung der bgaR-Disruptionsmutante Bacillus megaterium MS970 Prof. Dr. F. Meinhardt B-Kurs Mikrobielle Molekularbiologie Institut für Mikrobiologie WWU Münster - Ergebnisse WS 02/03 -

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Prof. Dr. F. Meinhardt B-Kurs Mikrobielle Molekularbiologie Institut für Mikrobiologie WWU Münster. Induzierbare Enzyme: Genotypische und phänotypische Charakterisierung der bga R-Disruptionsmutante Bacillus megaterium MS970. - Ergebnisse WS 02/03 -. - PowerPoint PPT Presentation

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Induzierbare Enzyme:

Genotypische und phänotypische Charakterisierung der bgaR-Disruptionsmutante Bacillus megaterium MS970

Prof. Dr. F. Meinhardt B-Kurs Mikrobielle Molekularbiologie

Institut für Mikrobiologie WWU Münster

- Ergebnisse WS 02/03 -

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1. und 2. Woche: genotypische Charakterisierung

- Isolation chromosomaler DNA aus B. megaterium DSM319/MS970

- Restriktion mit HincII

- Gelelektrophorese

- Transfer auf Nylonmembran (Southern Blot)

- Nachweis zweier Restriktionsfragmente mit bgaR-Anteilen

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Genetische Organisation der bgaR-Disruptionsmutante MS970 im Vergleich zum Wildtyp DSM319

1.4

1.4

2.6

3.4

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Der Stamm MS970 ist Glucanase-positiv, der Stamm DSM319 negativ

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Gelelektrophoretische Überprüfung der isolierten chromosomalen DNA

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HincII-Restriktion der chromosomalen DNA

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Hybridisierung der chromosomalen DNA mit einem Digoxygenin-markierten EcoRI-Fragment aus pUCXL

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Ergebnis des Southern-Blots

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Quantifizierung der -Galactosidase-Aktivität

O

CH2OH

OH

OH

OH O

NO2

O

CH2OH

OH

OH

OH

OH

+ HO

NO2

ONPG (farblos) Galaktose o-Nitrophenol (gelb)

420

546

ODOD V t

Miller - Units

1000

OD420 Extinktion bei 420 nmOD546 Extinktion der Probe bei 546 nm zum Zeitpunkt der ProbenahmeV Probenvolumen (in ml)t Zeit der Inkubation mit ONPG (in min)

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Ergebnis des -Galactosidase-Enzymtests

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Der bgaM-Promotor ist von CREs (catabolite responsive elements) überlagert

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Das bgaR-Genprodukt ist ein positiver Regulator der -Galactosidase-Expression bei B. megaterium

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Protokollgliederung

1. Zusammenfassung2. Einleitung

- Prinzip Gendisruption- bgaR / Disruptionsvektor pDXyl- Versuchsziel

3. Material und Methoden- Abweichungen vom Skript- Prinzip des Glucanase-Tests erläutern- Prinzip des Southern-Blot / DIG-System erläutern

4. Ergebnisse- Ergebnis des Glucanase-Tests- Ergebnis des Southern-Blot- Ergebnis des Enzymtests

5. Diskussion- Genotypische Charakterisierung erläutern- Welchen Rückschluß auf die Funktion von BgaR erlaubt der Enzymtest ?- Vergleich der Mechanismen zur Katabolitrepression / Substratinduktion bei E. coli / Bacillus, wo positive/negative Kontrolle ?

6. Literatur7. Anhang

- Pipettierschemata- Einzelwerte der photometrischen Messungen