INNO-LiPA HLA-DPB Amplification · Beabsichtigter Verwendungszweck . . . . . . . . . . . . . . . ....

25016 v22004-03-09In

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200

4

INNO-LiPA HLA-DPB Amplification

Distributed by: INNOGENETICS GmbHLembecker Straβe 1946359 Heiden (Westfalen)Germany

+49 2867 99 07 0

INNOGENETICS s.a.r.l.8, Rue du Maréchal de Lattre-de-Tassigny59800 LilleFrance

+33 149 93 26 18 INNOGENETICS S.r.lVia del Mare 3600040 Pomezia (Roma)Italy

+39 0691 180375

INNOGENETICS N.V.Technologiepark 69052 GhentBelgium

+32 9 329 1329

INNOGENETICS Diagnostica yTerapeutica (IDT) S.A.Calle Botánica 14608908 Hospitalet de Llobregat (Barcelona)Spain

+34 93 600 8000

Manufactured by:INNOGENETICS N.V.Technologiepark 69052 GhentBelgium

Table of contents

English Symbols used . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .4Intended use . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .5Test Principle . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .5Reagents . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .6

Description, preparation for use and recommended storageconditions . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .6

Materials required but not provided . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .7Safety and environment . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .7Specimen, preparation and storage . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .7

DNA extraction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .7Remarks and precautions . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .8Test procedure . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .8Results . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .10

Visualization . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .10Validation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .10

Limitations of the procedure . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .10Test performance . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .11

FrançaisSymboles utilisés . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .11But du test . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .12Principe du test . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .12Réactifs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .12

Description, préparation et conditions de conservation . . . . .12Matériel nécessaire non fourni . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .13Consignes de sécurité . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .14Echantillons: recueil, préparation et conservation . . . . . . . . . . . . . .14

Extraction ADN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .14Remarques et précautions . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .14Procédures . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .15Résultats . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .17

Visualisation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .17Validation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .17

Limites du test . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .17Performances . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .17

DeutschVerwendete Symbole . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .18

INNOGENETICS®*

2 * INNOGENETICS® is a Registered Trademark of Innogenetics N.V.

Beabsichtigter Verwendungszweck . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .18Funktionsweise des Tests . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .19Gelieferte Materialien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .19

Beschreibung, Vorbereitung, Lagerung und Haltbarkeit . . . . .19Zusätzlich benötigte Materialien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .20Sicherheitshinweise und Entsorgung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .21Herstellung und Aufbewahrung der Proben . . . . . . . . . . . . . . . . . . .21

DNA-Extraktion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .21Sicherheitshinweise und Vorsichtsmaßnahmen . . . . . . . . . . . . . . . .21Arbeitsablauf . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .22Ergebnisse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .24

Visualisierung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .24Validierung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .24

Einschränkungen des Verfahrens . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .24Leistungsfähigkeit des Tests . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .25

ItalianoSimboli utilizzati . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .25Uso previsto . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .26Principio del test . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .26Reagenti . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .26

Descrizione, preparazione per l'uso e condizioni diconservazione raccomandate . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .26

Materiali richiesti ma non forniti . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .27Sicurezza e ambiente . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .28Campioni, preparazione e conservazione . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .28

Estrazione del DNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .28Note e precauzioni . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .28Procedura del test . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .29Risultati . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .31

Visualizzazione . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .31Validazione . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .31

Limiti della procedura . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .31Performance del test . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .32

EspañolSímbolos utilizados . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .32Uso al que está destinado . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .33Principios del ensayo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .33Reactivos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .33


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Descripción, preparación para el uso y condiciones dealmacenamiento recomendadas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .33

Materiales necesarios pero no suministrados . . . . . . . . . . . . . . . . . .34Seguridad y medio ambiente . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .35Recogida, preparación y almacenamiento de muestras . . . . . . . . . .35

Extracción de ADN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .35Observaciones y precauciones . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .36Procedimiento del ensayo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .36Resultados . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .38

Visualización . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .38Validación . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .38

Limitaciones del procedimiento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .39Eficacia del ensayo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .39

PortuguêsSímbolos usados . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .39Indicações de uso . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .40Princípio do teste . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .40Reagentes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .41

Descrição, preparação para utilização e condições deconservação recomendadas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .41

Materiais necessários mas não fornecidos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .42Segurança e meio ambiente . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .42Colheita, preparação e conservação das amostras . . . . . . . . . . . . . .42

Extracção de ADN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .42Observações e precauções . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .43Procedimento do teste . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .43Resultados . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .45

Visualização . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .45Validação . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .46

Limites do procedimento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .46Performance do teste . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .46

English

Symbols used

Amplification kit

Manufactured by

INNOGENETICS®

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In vitro diagnostic medical device

Lot number

Catalogue number

Use by

Consult instructions for use

Temperature limits

Amplification Buffer

Primer Mix

MgCl2 Solution

Intended use

The INNO-LiPA HLA-DPB Amplification kit, for in vitro use, is intendedfor the nucleic acid amplification of the second exon of the humanleukocyte antigen (HLA) DPB1 locus. The reaction is performed bymeans of the polymerase chain reaction (PCR)*.

Test Principle

The DNA sample to be amplified by PCR is introduced into a reagentmixture containing a buffer with an excess of deoxynucleoside 5'- triphosphates (dNTPs), biotinylated primers, and thermostable DNApolymerase. The primers amplify the target sequence of DNA indicated inthe 'Intended use' statement.

By heating, the two strands of the DNA helix are separated (denaturation) inorder to expose the target sequences to the primers. Upon cooling to aspecific temperature, these primers will bind to complementary regions ofsequences that flank the target sequence (annealing). At another specifictemperature, the thermostable DNA polymerase will utilize the excess


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dNTPs to extend the annealed primers along the target template (extension).This way, two exact biotinylated copies of the target sequence areproduced after one cycle. After multiple cycles, a large number ofbiotinylated copies of the target sequence is obtained.

* The use of this product is covered by a license of F. Hoffmann - La Roche Ltd and Roche Molecular Systems, Inc.

Reagents

Description, preparation for use and recommended storage conditions

- The reagents should be stored isolated from any source ofcontaminating DNA, especially amplified DNA products.

- The reagents for amplification processes should be handled in aroom free from amplified DNA. Autoclaved tubes and pipette tips(preferably cotton-plugged) should be used.

- If kept at -25/-15°C and stored in the original vials, the reagents arestable until the expiry date of the kit. However, it is recommended toaliquot reagents after first use and then store at -25/-15°C.

- Do not use the reagents beyond the expiry date of the kit.- Alterations in physical appearance of the kit reagents may indicate

instability or deterioration.

Reagents supplied:

Component Quantity Ref. DescriptionAmplification Buffer 1 x 0.3 ml 56982 Containing all, dNTPs and 0.05%

NaN3 as preservative. Allow tothaw completely before use.

Primer Mix 1 x 0.3 ml 57029 Containing biotinylated primers, and0.05% NaN3 as preservative. Allowto thaw completely before use.

MgCl2 solution 1 x 0.3 ml 55701 Containing 0.05% NaN3 aspreservative Allow to thawcompletely and bring to 20 - 25°Cbefore use in order to dissolve theMgCl2 entirely.

INNOGENETICS®

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Materials required but not provided

- Materials for DNA extraction.- Disposable gloves.- Disposable sterile pipette tips (preferably cotton-plugged).- Sterile microtubes.- Microtube racks.- Microtube centrifuge.- DNA thermal cycler and equipment.- Pipettes adjustable to deliver 1 - 20 µl, 20 - 200 µl, and 200 - 1000 µl.- Autoclaved distilled water.- Mineral oil (if required).- Thermostable DNA Polymerase (Taq DNA polymerase is recommended)

Safety and environment

- Please refer to manufacturer's safety data sheet and productlabeling for information on potentially hazardous components.

- Specimens should always be handled as potentially infectious.- Use of protective equipment is necessary: gloves and safety

spectacles when manipulating dangerous or infectious agents.- Waste should be handled according to the institution's waste disposal

guidelines. Also observe all federal, state, and local environmentregulations.

Specimen, preparation and storage

NOTE:- Reagents are not supplied.

DNA extraction

Commonly used salting-out DNA extraction methods or methods based onspin columns can be used to prepare genomic DNA starting from acid-citrate-dextrose (ACD)- or ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)-anticoagulated whole blood samples.

Store the DNA samples at -25/-15°C.

The extracted DNA should have a concentration ≥≥ 0.02 µg/µl. The purity (A260nm/A280nm) should be ≥≥ 1.5.


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Remarks and precautions

- In order to avoid DNA contamination, a maximum physicalseparation between pre- and post-amplification steps isrecommended: separate rooms, separate pipettes and other labmaterial, separate lab coats and gloves (and their stock) are minimumprecautions for good laboratory practice. The reagents should beisolated from any source of contaminating DNA, especiallyamplified DNA products. Also avoid microbial contamination of reagents.

- Avoid any return from the post-amplification room to the pre-amplification room.

- All pipette tips and tubes used for the amplification process shouldbe autoclaved. Pipette tips with cotton plugs are recommended. Use a new sterile pipette tip for each aliquoted specimen.

- After thawing, vortex Amplification Buffer, Primer Mix, and MgCl2solution and spin down all reagents.

- Do not mix reagents between kits, unless the components haveidentical lot numbers.

- Avoid microbial contamination of reagents.

Test procedure

NOTE:- This protocol for the amplification of exon 2 of the HLA-DPB1

alleles was designed for optimal amplification using GeneAmp™PCR tubes (0.5 ml) and PE-480 (Perkin Elmer) thermal cyclers; orMicroAmp® PCR tubes (0.2 ml) and PE-2400 or PE-9600 (PerkinElmer) thermal cyclers, and using AmpliTaq DNA polymerase(Perkin Elmer Cetus). This protocol can be used for most commercial types of thermalcyclers, but may require some modifications indicated by themanufacturer of the cycler.

- Prior to use, determine whether the protocol is compatible with thethermal cycler in use at your laboratory. Ensure that the thermalcycler is calibrated prior to use.

- Take the necessary precautions to avoid non-specific amplificationand primer-dimer formation, which may impair the results:• Perform the pipetting steps on ice and without delay.• Preheat (96°C ± 0.75°C) the heating block of the thermal cycler

before inserting the samples, and immediately start the cyclingprocess.

INNOGENETICS®

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1. Dilute each genomic DNA to a concentration between 0.02 and 0.1 µg/µl in TE buffer.

2. Determine the number of vial to be prepared (N) as:N= number of DNA samples +1 (negative control, no DNA) + 1Using a cotton-plugged pipette tip prepare a mastermix in anautoclaved 1.5 ml tube:

(N x 14.8 µl) Autoclaved distilled water.+ (N x 10 µl) Amplification Buffer (natural-capped).+ (N x 10 µl) DPB Primer Mix (yellow-capped).+ (N x 10 µl) MgCl2 (violet-capped).+ (N x 0.2 µl) Taq Polymerase of 5 U/µl (N x 1 U).

The total volume of this amplification mix is now (N x 45 µl).Vortex briefly and aliquot 45µl of this mastermix into (N - 1)autoclaved amplification tubes.NOTE:• Each component must be added and supplied in the right amount.

Too much or too little sample or reagent might result inaspecific amplification or even in no amplification at all.

3. Add 2 drops (~40 µl) of mineral oil into each tube if required (e.g. when using the PE-480).Pipette 5 µl (0.1 to 0.5 µg) of the genomic DNA preparation (throughthe mineral oil if required).Add 5 µl of distilled water (no DNA) to the negative control tube.REMARK:• Do not vortex or mix.• Check that the amplification mixture is at the bottom of the tube.

4. Place the samples into the preheated and calibrated thermal block (seeinstructions indicated by the manufacturer of the thermal cycler).Start the amplification program designed for the INNO-LiPA HLA-DPB Amplification.


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DPB1 amplification profile:

5. After the amplification process, use the samples immediately with theINNO-LiPA HLA-DPB test strips or store the samples at -15/-25°C.NOTE:• Do not store the amplified DNA products together with unused

amplification reagents.

Results

Visualization

The presence of the amplified product can be checked on a 2% agarose gel.Load 10 µl of the amplified product per slot. The amplicon should appearas a single band with a length of 280 bp.

Validation

- Include at least one negative and one positive control each time anamplification is performed. As with any new laboratory procedure,the inclusion of additional positive and negative controls should beconsidered until a high degree of confidence is reached in the abilityto correctly perform the test procedure. If the inclusion of anadditional positive control is desirable, use a known positive sample.

- If a positive band is obtained in the gel for the negative control, the entirerun should be discarded and the complete procedure should be repeated.

Limitations of the procedure

- Use of this product should be limited only to personnel well trainedin the techniques of amplification.

- Polymerase inhibition (e.g. by heparin, hemoglobin) might be thereason for complete failure of the assay!

Cycler type PE-480 PE-2400PE-9600

Step Temp Time Time1. denature 96°C 5 min 5 min2. denature 96°C 20 sec 15 sec repeat cycle 3. anneal primers 55°C 20 sec 20 sec step 2 to 4, 4. extend primers 72°C 30 sec 20 sec 30 times5. elongate 72°C 10 min 10 min

INNOGENETICS®

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- Powder from disposable gloves and sodium hypochlorite have aninhibiting effect on amplification.

- Repeated freezing/thawing of the DNA samples might result in lessefficient amplification.

- Good laboratory practice and careful performance of the procedurespreviously specified allow specific amplification.

Test performance

INNO-LiPA HLA-DPB was evaluated in 23 tissue typing laboratoriesworldwide, within the scope of the 12th International HistocompabilityWorkshop, France 1996.No INNO-LiPA HLA-DPB specific amplification failures have been reported.

Français

Symboles utilisés

Trousse d'amplification

Fabriqué par

Produit pour diagnostic in vitro

Numéro du lot

Référence catalogue

Utiliser avant

Instructions d'emploi

Température de stockage

Tampon Amplification


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Solution Primers

Solution MgCl2But du test

Le kit INNO-LiPA HLA-DPB Amplification, à usage in vitro, est destinéà l'amplification des acides nucléiques de l'exon 2 du locus HLA-DPB1(human leukocyte antigen). La réaction est réalisée par des réactions enchaîne de polymérisation (PCR)* .

Principe du test

L'ADN de l'échantillon à amplifier par PCR est introduit dans un milieuréactionnel contenant en excès des désoxynucléosides 5'-triphosphates(dNTPs), des primers biotinylés et de l'ADN polymérase thermostable. Les primers amplifient la séquence cible d'ADN indiquée dans « but du test ».

Par chauffage, les deux brins de l'hélice ADN se séparent (dénaturation)ouvrant les séquences cibles aux primers. En abaissant la température àune température spécifique, les primers vont se fixer aux régions deséquences complémentaires encadrant la séquence cible (annealing). A une autre température spécifique, l'ADN polymérase va utiliser lesdNTPs en excès pour faire une élongation des primers fixés le long du brind'ADN cible (extension). Ainsi, deux copies biotinylées de la séquenced'ADN cible sont produites après un cycle. En multipliant les cycles, unnombre important de copies biotinylées de la séquence cible sont obtenues.

* L'utilisation de ce produit est couverte par une licence de F. Hoffmann - La Roche Ltd et Roche Molecular Systems, Inc.

Réactifs

Description, préparation et conditions de conservation

- Les réactifs doivent être stockés isolés de toute source d'ADNcontaminant, spécialement des produits ADN amplifiés.

- Les réactifs pour amplification doivent être manipulés dans une piècedépourvue d'ADN amplifié. Des tubes et embouts de pipettes (avecfiltre coton) autoclavés doivent être employés.

INNOGENETICS®

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- Maintenus entre -15/-25°C, dans le flacon d'origine, les réactifs sontstables jusqu'à la date de péremption du kit. Après la premièreutilisation, il est recommandé d'aliquoter les réactifs et de lesconserver entre -15/-25°C.

- Ne pas utiliser les réactifs au-delà de la date de péremption du kit.- L'altération de l'apparence physique des réactifs peut indiquer une

instabilité ou une détérioration.

Composant Quantité Ref. DescriptionTampon Amplification 1 x 0.3 ml 56982 Contient tous les dNTPs et 0.05%

NaN3 comme conservateur.Laisser décongeler avant emploi.

Solution Primers 1 x 0.3 ml 57029 Contient les primers biotinylés, et

0.05% NaN3 comme conservateur.Laisser parfaitement décongeler.

Solution MgCl2 1 x 0.03 ml 55701 Contient 0.05% NaN3 comme

conservateur. Laisser parfaitementdécongeler et maintenir à 20 - 25°C avant emploi pourpermettre la complète dissolutiondu MgCl2.

Matériel nécessaire non fourni

- Matériels pour extraction ADN.- Gants jetables.- Embouts de pipette stériles jetables (de préférence, avec filtre coton).- Microtubes stériles.- Portoirs pour microtubes.- Centrifugeuse pour microtubes.- Thermocycleur et équipement.- Pipettes ajustables pour les volumes 1 - 20 µl, 20 - 200 µl, 200 - 1000 µl.- Eau distillée autoclavée.- Huile minérale (si besoin).- ADN Polymérase thermostable (Taq Polymérase recommandée).


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Consignes de sécurité

- Se référer aux fiches de sécurité du fabricant et à l'étiquetage duproduit pour toute information sur les risques potentiels descomposants.

- Les échantillons doivent toujours être manipulés commepotentiellement infectieux.

- Utiliser un équipement de protection: gants et écrans de protectionlors de la manipulation d'agents dangereux ou infectieux.

- Les déchets devront être éliminés selon les directives en vigueur etles règlements pour la préservation de l'environnement.

Echantillons: recueil, préparation et conservation

NOTE: - Les réactifs ne sont pas fournis.

Extraction ADN

Les méthodes d'extraction ADN communément utilisées, précipitation ousur colonne, peuvent être utilisées pour préparer l'ADN génomique à partird'échantillons de sang total recueilli sur ACD (acide -citrate-dextrose) ouEDTA (acide ethylenediaminetetraacétique).

Conserver les extraits ADN entre -15/-25°C.

Les extraits ADN doivent avoir une concentration ≥≥ 0.02 µg/µl. La pureté (A260nm/A280nm) devra être ≥≥ 1.5.

Remarques et précautions

- Pour éviter toute contamination ADN, une séparation physiquemaximale est recommandée entre les étapes de pré- et post-amplification: pièces séparées, pipettes et matériel de laboratoiredistincts, gants et blouses (et leur stock) séparés sont des précautionsminimum pour une bonne pratique de laboratoire. Les réactifsdoivent être isolés de toute source de contamination ADN, plusparticulièrement de produits amplifiés. Eviter aussi lescontaminations microbiennes des réactifs.

- Eviter de retourner en zone pré-amplification après un passage enpost-amplification.

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- Les tubes et les embouts de pipette doivent être autoclavés. Des embouts avec filtre coton sont recommandés. Utiliser un nouvelembout stérile à chaque aliquote d'échantillon.

- Après décongélation, homogénéiser au vortex le tamponAmplification, la solution Primers et la solution MgCl2, puiscentrifuger brièvement tous les réactifs.

- Ne pas mélanger les réactifs entre kits, sauf si les composantscomportent le même numéro de lot.

- Eviter toute contamination microbienne des réactifs.

Procédures

NOTE : - Ce protocole pour amplification de l'exon 2 des allèles HLA-DPB1 a

été préparé pour une amplification optimale en utilisant les tubesPCR GeneAmp™ (0.5 ml) et le thermocycleur PE-480 (PerkinElmer) ou les tubes PCR MicroAmp™ (0.2 ml) et les thermocycleursPE-2400, PE-9600 ou PE-9700 (Perkin Elmer) et AmpliTaq DNApolymérase (Perkin Elmer Cetus).D'autres thermocycleurs peuvent être employés mais peuventnécessiter des modifications selon les indications du fabricant.

- Avant utilisation, déterminer si le protocole est compatible avec lethermocycleur du laboratoire. S'assurer que le thermocycleur estcorrectement calibré.

- Pendre les précautions nécessaires pour éviter toute amplificationnon-spécifique et la formation de primer-dimers qui peuvent affecterles résultats:• Réaliser les étapes de pipetage en maintenant les tubes dans de

la glace, et sans interruption.• Préchauffer le bloc chauffant du thermocycleur (96°C ± 0.75°C)

avant d'insérer les tubes et démarrer immédiatement leprogramme d'amplification.

1. Diluer chaque extrait ADN à une concentration entre 0.02 et 0.1µg/µlen tampon TE.

2. Déterminer le nombre de tubes (N) nécessairesN = Nombre d'échantillons + 1 Contrôle négatif (sans ADN) + 1.Avec des embouts stériles munis de filtre coton, préparer unmastermix dans un tube (1.5 ml) autoclavé:


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(N x 14.8 µl) Eau distillée autoclavée.+ (N x 10 µl) Tampon Amplification (bouchon incolore).+ (N x 10 µl) Solution Primers HLA-DPB1 (bouchon jaune).+ (N x 10 µl) Solution MgCl2 (bouchon violet).+ (N x 0.2 µl) Taq Polymerase à 5U/µl (N x 1 U).

Le volume total du Mastermix est de N x 45 µl. Vortexer brièvementet aliquoter 45 µl de ce mastermix dans N-1 tubes autoclavés pouramplification. NOTE: • Chaque composant doit être ajouté et présent à la bonne

concentration. Trop ou pas assez d'échantillon ou de réactifspeut conduire à une amplification aspécifique ou même à uneabsence d'amplification.

3. Si nécessaire, ajouter 2 gouttes (~40 µl) d'huile minérale dans chaquetube (e. g. PE-480).Introduire 5 µl (0.1 à 0.5 µg) d'ADN génomique extrait (à traversl'huile minérale si présente) et 5 µl d'eau distillée dans le tubeContrôle Négatif (sans ADN).NOTE: • Ne pas mélanger.• Vérifier que le mélange réactionnel est au fond du tube.

4. Placer immédiatement les tubes dans le bloc préchauffé et calibré duthermocycleur (voir les instructions fournies par le fabricant duthermocycleur). Démarrer le programme d'amplification INNO-LiPAHLA-DPB Amplification.Programme d'amplification INNO-LiPA HLA-DPB

5. Après l'amplification, procéder immédiatement au test INNO-LiPAHLA-DPB ou conserver les échantillons entre -15/-25°C.

Thermocycleurs PE-480 PE-2400PE-9600

Etape TempératureTemps Temps1. Dénaturation 96°C 5 min. 5 min.2. Dénaturation 96°C 20 sec. 15 sec. Répéter cycle 3. Annealing 55°C 20 sec. 20 sec. < 2+3+4 >4. Extension 72°C 30 sec. 20 sec. 30 fois5. Elongation 72°C 10 min. 10 min.

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NOTE :• Ne pas conserver les produits amplifiés avec des réactifs pour

amplification non utilisés.

Résultats

Visualisation

La présence des amplicons peut être vérifiée en gel d'agarose 2%.Déposer 10µl de chaque produit amplifié dans un puits sur le gel.L'amplicon apparaîtra sous la forme d'une bande unique de 280 pb.

Validation

- Inclure au moins un contrôle négatif et un contrôle positif danschaque série d'amplification. Comme pour toute nouvelle procédure,l'inclusion de contrôles négatifs et positifs supplémentaires peut êtreenvisagée jusqu'à maîtrise parfaite du test avec un niveau deconfiance élevé. Si l'inclusion d'un contrôle positif est envisagée,utiliser un échantillon positif connu.

- Si une bande positive est obtenue sur le gel pour le contrôle négatif,la série entière doit être invalidée et une procédure complète doit êtrerecommencée.

Limites du test

- L'utilisation de ce test doit être restreinte au personnel ayant reçu uneformation pour les techniques d'amplification génomique.

- Une inhibition de la polymérase (e. g. héparine, hémoglobine) peutconduire à un échec complet d'amplification.

- Le talc des gants jetables et l'hypochlorite de sodium ont un effetinhibiteur sur l'amplification.

- Les cycles répétés de congélation/décongélation des extraits ADNpeuvent affecter le rendement d'amplification.

- Les bonnes pratiques de laboratoire et le respect des précautions demanipulation spécifiées assurent une amplification spécifique.

Performances

Les performances du test INNO-LiPA HLA-DPB ont été évaluées dans 23 laboratoires d'histocompatibilité dans le monde sur la base de la 12èmeWorkshop Internationale d'Histocompatibilité (France 1996).Aucun échec d'amplification spécifique DPB1 n’a été rapporté.


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Deutsch

Verwendete Symbole

Amplifikationskit

Hersteller

Hilfsmittel für die medizinische In vitroDiagnostik

Chargennummer

Katalognummer

Durchführung durch

Siehe Bedienungsanleitung

Temperaturlimits

Amplifikationspuffer

Primerlösung

MgCl2-Lösung

Beabsichtigter Verwendungszweck

Der INNO-LiPA HLA-DPB Amplifikationskit ist ausschließlich für die in-vitro-Verwendung bestimmt. Er dient der Amplifikation der DNA deszweiten Exons des humanen Leukozytenantigen (HLA)- DPB1 Locus.Die Reaktion wird mit Hilfe der Polymerasekettenreaktion (PCR)*durchgeführt.

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Funktionsweise des Tests

Die DNA-Probe, die mittels PCR* amplifiziert werden soll, wird in eineReaktionsmischung gegeben, die alle für die Amplifikation benötigtenVerbindungen, darunter einen Überschuss an Desoxynukleosid-5'-Triphosphaten (dNTPs), biotinylierte Primer und hitzestabile DNA-Polymerase enthält. Die Primer amplifizieren die DNA-Zielsequenz, dieim Kapitel „Beabsichtigter Verwendungszweck" angegeben ist.

Durch Erhitzen werden beide Stränge der DNA-Doppelhelix voneinandergetrennt (Denaturierung), sodass die Zielsequenzen für die Primer freiliegen.Die Primer haben eine Sequenz, die der Region, die die Zielsequenzflankieren, komplementär ist. Bei Abkühlung auf eine bestimmteTemperatur binden diese Primer an komplementäre Regionen, die dieZielsequenz flankieren (Annealing). Bei einer anderen bestimmtenTemperatur verlängert die thermostabile DNA-Polymerase mit Hilfe derdNTPs die gebundenen Primer längs der Zielsequenz (Verlängern). Auf diese Weise entstehen nach einem Zyklus aus Denaturieren,Annealing und Verlängern zwei exakte biotinylierte Kopien derZielsequenz. Dieser Zyklus wird wiederholt, bis sich eine für dieTestdurchführung ausreichende Zahl biotinylierter Kopien der Zielsequenzgebildet hat.

* Die Verwendung dieses Produkts wird durch eine Lizenz von F. Hoffmann- La Roche Ltd und Roche Molecular Systems, Inc. abgedeckt.

Gelieferte Materialien

Beschreibung, Vorbereitung, Lagerung und Haltbarkeit

- Alle Reagenzien sind bei Aufbewahrung in den Originalgefäßen bei -15/-25°C bis zum angegebenen Verfallsdatum stabil. Um Kontaminationund Zersetzung zu vermeiden, wird empfohlen, alle Reagenzien nachdem ersten Gebrauch zu aliquotieren und bei -15/-25°C einzufrieren.

- Verwenden Sie den Kit nicht nach Überschreitung des Verfallsdatums.- Der Kit muss so aufbewahrt werden, dass er auf keinen Fall mit

anderer DNA, vor allem mit amplifizierter DNA, kontaminiertwerden kann.

- Alle Änderungen im physischen Erscheinungsbild der Kit-Reagenzienkönnen auf Instabilität oder Zersetzung hinweisen.


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- Die Reagenzien für die Amplifikation müssen in einem Raumhergestellt werden, in dem kein amplifizierte DNA vorhanden ist.Reaktionsröhrchen und Pipettenspitzen (möglichst mit Wattestopfen)müssen autoklaviert sein.

Gelieferte Materialien:

Bestandteil Menge Katalog- Beschreibungnummer

Amplifikations-puffer 1 x 0,3 ml 56982 Enthält alle dNTPs und 0,05%

Natriumazid alsKonservierungsmittel. VorVerwendung vollständig auftauen.

Primerlösung 1 x 0,3 ml 57029 Enthält biotinylierte Primer und0,05% Natriumazid alsKonservierungsmittel. VorVerwendung vollständig auftauen.

MgCl2-Lösung 1 x 0,3 ml 55701 Enthält 0,05% Natriumazid alsKonservierungsmittel. VorVerwendung vollständig auftauenund auf 20 - 25°C erwärmen, bisdas MgCl2 vollständig gelöst ist.

Zusätzlich benötigte Materialien

- Materialien für die DNA-Extraktion.- Einmalhandschuhe.- Sterile Einmalpipettenspitzen (möglichst mit Wattestopfen).- Sterile Mikrogefäße.- Racks für Mikrogefäße.- Mikrozentrifuge.- DNA-Thermocycler und Zubehör.- Pipetten mit variablem Volumen: 1 - 20 µl, 20 - 200 µl und 200 - 1000 µl.- Autoklaviertes destilliertes Wasser.- Gegebenenfalls Mineralöl.- Hitzestabile DNA-Polymerase (möglichst Taq-DNA-Polymerase).

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Sicherheitshinweise und Entsorgung

- Bitte beachten Sie die Sicherheitsdatenblätter des Herstellers unddie Produktkennzeichnung bezüglich gefährlicher Substanzen.

- Behandeln Sie alle Proben als potenziell infektiös.- Verwenden Sie Schutzkleidung, wenn notwendig: bei der Arbeit mit

infektiösen oder gefährlichen Substanzen Schutzbrille undHandschuhe tragen.

- Bei Beseitigung der Chemikalien sind neben hausinternenVorschriften die entsprechenden Gesetze bzw. Verordnungen der EG-Mitgliedsländer, der Bundesrepublik Deutschland und derBundesländer zu beachten.

Herstellung und Aufbewahrung der Proben

WICHTIG:- Die hierfür benötigten Reagenzien sind nicht im Lieferumfang des

Kits enthalten.

DNA-Extraktion

Zur Herstellung genomischer DNA können Blutproben verwendet werden, dieACD (=Acid-Citrat-Dextrose) oder EDTA (Ethylendiamintetraessigsäure) alsGerinnungshemmer enthalten. Zur Isolation können die bekannen Methoden(DANN-Fällung durch Aussalzen oder Säulenextratktion) verwendet werden.

DNA-Proben bei -15/-25°C aufbewahren.

Die extrahierte DNA muss in einer Konzentration von ≥≥ 0,02 µg/µlvorliegen. Die Reinheit (A260nm/A280nm) muss ≥≥ 1,5 sein.

Sicherheitshinweise und Vorsichtsmaßnahmen

- Zur Vermeidung von Kontamination müssen die Arbeitsschritte vorund nach der Amplifikation räumlich voneinander getrennt werden.Zur Einhaltung der Guten Laborpraxis (GLP) wird dringend dieVerwendung getrennter Gefäße, Pipetten etc. und auch das Tragengetrennter Laborkittel und -handschuhe empfohlen. Der Kit muss soaufbewahrt werden, dass er auf keinen Fall mit anderer DNA, vorallem mit amplifizierter DNA, kontaminiert werden kann. Die Reagenzien dürfen nicht mikrobiell kontaminiert sein.

- Vermeiden Sie, zwischen den beiden Arbeitsplätzen hin- und herzugehen.


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- Alle für die Amplifikation verwendeten Reaktionsröhrchen undPipettenspitzen (möglichst mit Wattestopfen) müssen autoklaviertsein. Verwenden Sie Einmalprodukte, und verwerfen Sie diese nacheinmaligem Gebrauch.

- Mischen Sie Amplifikationslösung und Primerlösung und MgCl2-Lösung nach dem Tauen kurz auf einem Vortex-Mischer durch.Zentrifugieren Sie alle Reagenzien kurz, vor allem LiPA-Taq.

- Mischen Sie keine Reagenzien unterschiedlicher Kits, es sei denn,sie haben identischen Chargennummern.

- Die Reagenzien dürfen nicht mikrobiell kontaminiert sein

Arbeitsablauf

WICHTIG:- Das hier beschriebene Amplifikationsprotokoll für die Amplifikation

von Exon 2 der HLA-DPB1-Allele ist optimiert für das Arbeiten mitGeneAmp™ PCR-Gefäßen (0,5 ml) und einem Thermocycler PE-480 (Perkin Elmer) oder MicroAmp® PCR-Röhrchen (0,2 ml) undeinem Thermocycler PE-2400 oder PE-9600 (Perkin Elmer) unterVerwendung von AmpliTaq DNA-Polymerase (Perkin Elmer Cetus).Das Arbeitsprotokoll ist für die meisten handelsüblichenThermocycler geeignet, muss aber unter Umständen für denjeweiligen Gerätetyp modifiziert werden.

- Vor der Testdurchführung muss überprüft werden, inwieweit dasArbeitsprotokoll für den von Ihnen verwendeten Thermocycler geeignetist. Vor Verwendung muss der Thermocycler kalibriert werden.

- Treffen Sie die folgenden erforderlichen Vorsichtsmaßnahmen, umunspezifische Amplifikation und die Bildung von Primer-Dimeren zuverhindern, weil dadurch die Qualität der Versuchsergebnissebeeinträchtigt werden könnte:• Alle im folgenden beschriebenen Pipettierschritte müssen

unverzüglich und im Eisbad durchgeführt werden.• Vor Einsetzen der Proben den Thermocycler auf 96 ± 0,75°C

erhitzen und sofort mit der ersten Amplifikationsrunde beginnen.

1. Genomische DNA mit TE-Puffer auf Konzentration zwischen 0,02und 0,1 µg/µl verdünnen.

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2. Anzahl der benötigten Gefäße (N) bestimmen:N = Anzahl DNA-Proben + 1 (Negativkontrolle ohne DNA) + 1. Mit Hilfe einer Pipette mit Baumwollstopfen wird in einemautoklavierten 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen eine Gesamtlösung(Mastermix) hergestellt:

(N x 14,8 µl) autoklaviertes destilliertes Wasser.+ (N x 10 µl) Amplifikationspuffer (naturfarbene Kappe).+ (N x 10 µl) DPB1-Primerlösung (gelbe Kappe).+ (N x 10 µl) MgCl2 (violette Kappe).+ (N x 0,2 µl) Taq-Polymerase, 5 U/µl (N x 1 U).

Das Gesamtvolumen beträgt nun (N x 45 µl). Kurz auf Vortex-Mischer durchmischen und 45-µl-Aliquots der Gesamtlösung in (N - 1) autoklavierte Amplifikationsgefäße einpipettieren.WICHTIG:• Alle Komponenten müssen in den richtigen Mengen und

Volumina zugegeben werden. Die Zugabe von zuwenig Probeoder Reagenz kann zu nicht spezifischen Ergebnissen oder zuüberhaupt keiner Amplifikation führen.

3. Gegebenenfalls (z.B. bei Versuchsdurchführung mit PE-480) 2 Tropfen (~ 40 µl) Mineralöl in jedes Röhrchen geben. 5 µl (0,1 bis 0,5 µg) der genomischen DNA zugeben (gegebenenfallsdurch die Mineralölschicht hindurch). In das Röhrchen für die Negativkontrolle (ohne DNA) 5 µldestilliertes Wasser geben.WICHTIG:• Nicht schütteln (Vortex) oder mischen.• Sicherstellen, dass die Amplifikationsmischung sich auf dem

Röhrchenboden befindet!4. Proben in beheizten und kalibrierten Thermoblock stellen und

Hinweise des Geräteherstellers beachten. Das spezifischeAmplifikationsprogramm für die HLA-DPB-Amplifikation starten.


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DPB1-Amplifikationsprofil:

5. Sofort nach der Amplifikation die Proben auf die INNO-LiPA HLA-DPB-Teststreifen auftragen oder bei -15/-25°C einfrieren.WICHTIG:• Amplifizierte DNA-Produkte getrennt von nicht verwendeten

Amplifikationsreagenzien aufbewahren.

Ergebnisse

Visualisierung

Die Präsenz von Amplikons kann durch Trennung in einem 2%-igenAgarosegel geprüft werden. Jede Bahn wird mit 10 µlAmplifikationsprodukt beladen. Das Amplikon migriert als einzelneBande mit einer Größe von 280 bp.

Validierung

- Bei jeder Amplifikationsserie müssen mindestens je eine Positiv- undeine Negativkontrolle mitgeführt werden. Wie bei jedem neuenLaborverfahren müssen so lange Positiv- und Negativkontrollenmitgeführt werden, bis die Erfahrung zeigt, dass deren Durchführungzu zuverlässigen Ergebnissen führt. Auf Wunsch kann auchzusätzlich eine bekannt positive Probe mitgeführt werden.

- Tritt bei der Negativkontrolle im Gel eine positive Bande auf, mussdie gesamte Serie verworfen werden, und der gesamte Ablauf musswiederholt werden.

Einschränkungen des Verfahrens

- Der Test darf nur von Laborpersonal ausgeführt werden, das dieTechnik der DNA-Amplifikation bereits beherrscht.

Thermocycler PE-480 PE-2400PE-9600

Schritt Temperatur Zeit Zeit1. Denaturieren 96°C 5 min 5 min2. Denaturieren 96°C 20 sec 15 sec Schritte 2 bis 43. Annealing der 55°C 20 sec 20 sec 30-mal

Primer wiederholen4. Primer verlängern 72°C 30 sec 20 sec5. Verlängern 72°C 10 min 10 min

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- Der Test kann vollständig zu negativen Ergebnissen führen, wenn diePolymerase z.B. durch Heparin oder Hämoglobin inhibiert wurde.

- Pulver von Einmalhandschuhen und Natriumhypochlorit inhibierendie Amplifikation.

- Wiederholtes Einfrieren und Auftauen der DNA-Proben kann dieEffizienz der DNA-Amplifikation beeinträchtigen.

- Die Einhaltung der Guten Laborpraxis (GLP) und sorgfältigeDurchführung aller Arbeitsschritte werden dringend empfohlen, umspezifische Amplifikationsergebnisse zu erzielen.

Leistungsfähigkeit des Tests

Der INNO-LiPA HLA-DPB Test wurde nach den Kriterien des 2thInternational Histocompability Workshop, Frankreich, 1996, in 23 Gewebetypisierungslabors weltweit evaluiert.Bei der Evaluierung wurden alle Proben erfolgreich amplifiziert.

Italiano

Simboli utilizzati

Kit de amplificación

Prodotto da

Dispositivo medico - diagnostico in vitro

Numero di lotto

Codice

Uso

Consultare le istruzioni per l'uso

Limiti di temperatura


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Amplification Buffer

Primer Mix

MgCl2 Solution

Uso previsto

Il kit (per uso diagnostico in vitro) INNO-LiPA HLA-DPB è statoprogettato per l'amplificazione del secondo esone del locus DPB1dell'antigene leucocitario umano (HLA). La reazione è condotta permezzo della reazione polimerasica a catena (PCR)*.

Principio del test

Il campione di DNA da amplificare mediante PCR viene aggiunto ad unamiscela di reagenti contenente un eccesso di deossinucleosidi 5' trifosfati(dNTP), primers biotinilati e DNA polimerasi termostabile. I primersamplificheranno la sequenza di DNA target indicata nel paragrafo 'Uso previsto'.

Mediante riscaldamento, le due catene dell'elica di DNA vengono separate(denaturazione) in modo da esporre le sequenze target ai primers.Raffreddando ad una specifica temperatura, questi primers si legherannoalle regioni complementari di sequenza che fiancheggiano la sequenzatarget (appaiamento). Ad un'altra specifica temperatura, la DNA polimerasitermostabile, utilizzando i dNTP, estenderà i primers appaiati lungo iltemplato target (estensione). In tal modo vengono prodotte dopo un ciclodue copie identiche biotinilate della sequenza target. Dopo cicli multipli, siottiene un gran numero di copie biotinilate della sequenza target.

* L'utilizzo di questo prodotto è coperto da licenza di F. Hoffmann - La Roche Ltd e Roche Molecular Systems, Inc.

Reagenti

Descrizione, preparazione per l'uso e condizioni di conservazioneraccomandate

- I reagenti dovrebbero essere conservati lontano da sorgenti di DNAcontaminante, specialmente da prodotti di DNA amplificato.

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- I reagenti per il processo di amplificazione devono essere maneggiati inuna stanza priva di materiale di DNA amplificato. Devono essere usateprovette e puntali per pipette (preferibilmente con filtro) autoclavati.

- Se mantenuti a -15/-25°C e conservati nei flaconi originali, i reagentisono stabili fino alla data di scadenza del kit. Tuttavia si raccomandadi aliquotare i reagenti (eccetto la LiPA Taq) dopo il primo utilizzo epoi di conservarli a -15/-25°C.

- Non utilizzare i reagenti dopo la data di scadenza del kit.- Alterazioni nell'aspetto fisico dei reagenti del kit possono indicare

instabilità o deterioramento.

Reagenti forniti:

Componente Quantità Rif. DescrizioneAmplification Buffer 1 x 0.3 ml 56982 Contiene tutti i dNTPs e 0.05%

NaN3 come conservante. Lasciarescongelare completamente primadell'uso.

Primer Mix 1 x 0.3 ml 57029 Contiene primers biotinilati e0.05% NaN3 come conservante.Lasciare scongelarecompletamente prima dell'uso.

MgCl2 solution 1 x 0.3 ml 55701 Contiene 0.05% NaN3 comeconservante. Lasciare scongelarecompletamente per discioglierel'MgCl2 e lasciar stabilizzare a 20 - 25°C.

Materiali richiesti ma non forniti

- Materiali per l'estrazione del DNA.- Guanti monouso.- Puntali sterili monouso (preferibilmente con filtro).- Provette sterili.- Porta provette.- Microcentrifuga.- Thermal cycler e accessori.- Pipette regolabili per volumi da 1 - 20 µl, da 20 - 200 µl,

e da 200 - 1000 µl.


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- Acqua distillata autoclavata.- Olio minerale (se richiesto).- DNA Polimerasi termostabile (è raccomandata la Taq DNA polimerasi).

Sicurezza e ambiente

- Si prega di fare riferimento alla scheda di sicurezza delproduttore e alle etichette del prodotto per informazioni relativeai componenti potenzialmente pericolosi.

- I campioni devono essere sempre maneggiati come potenzialmenteinfettivi.

- É necessario l'uso di dispositivi di protezione: guanti e occhiali disicurezza quando si manipolano agenti pericolosi o infettivi.

- I rifiuti devono essere smaltiti secondo le linee guida disposte dalleistituzioni. Osservare anche tutte le disposizioni nazionali e locali.

Campioni, preparazione e conservazione

NOTA:- I reagenti non sono forniti.

Estrazione del DNA

Per preparare DNA genomico partendo da campioni di sangue intero conacido-citrato-destrosio (ACD) o acido etilendiamminotetracetico (EDTA)come anticoagulante, possono essere utilizzati i comuni metodi di estrazionedel DNA, salting-out o i metodi basati sull'estrazione da colonnine.

Conservare i campioni di DNA a -15/-25°C.

Il DNA estratto dovrebbe avere una concentrazione ≥≥ 0.02 µg/µl. La purezza (A260nm/A280nm) dovrebbe essere ≥≥ 1.5.

Note e precauzioni

- Per evitare contaminazioni da DNA, si raccomanda la massimaseparazione fisica fra i passaggi di pre- e post-amplificazione: stanzeseparate, pipette e altro materiale di laboratorio dedicati, camici e guantiseparati (e loro scorte) sono le minime precauzioni per una buona praticadi laboratorio. I reagenti devono essere isolati da qualsiasi sorgente diDNA contaminante, specialmente dai prodotti di DNA amplificati.Evitare anche la contaminazione microbica dei reagenti.

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- Evitare qualsiasi rientro dalla stanza di post-amplificazione allastanza di pre-amplificazione.

- Tutti i puntali e le provette utilizzati devono essere autoclavati. Sonoconsigliati puntali con filtro. Utilizzare un nuovo puntale sterile perogni campione aliquotato.

- Dopo lo scongelamento, vortexare l'Amplification Buffer, la PrimerMix e l'MgCl2, e centrifugare brevemente tutti i reagenti.

- Non miscelare i reagenti tra kit diversi, a meno che i componenti nonabbiano lotto identico.

- Evitare la contaminazione microbica dei reagenti.

Procedura del test

NOTA:- Questo protocollo per l'amplificazione dell'esone 2 degli alleli

HLA-DPB1 è stato disegnato per una ottimale amplificazione usandoprovette GeneAmp™ PCR (0.5 ml) e thermal cyclers PE-480 (Perkin Elmer), o provette MicroAmp® PCR (0.2 ml) e thermal cyclers PE-2400, PE-9600 (Perkin Elmer), e usando l'AmpliTaq DNAPolimerasi (Perkin Elmer Cetus). Questo protocollo può essere usato anche per la maggior parte deithermal cyclers commerciali, ma può richiedere alcune modificheindicate dal produttore dello strumento.

- Prima dell'uso determinare se il protocollo è compatibile con ilthermal cycler in uso nel vostro laboratorio. Prima dell'uso,assicurarsi che il thermal cycler sia calibrato.

- Adottare le necessarie precauzioni per evitare amplificazioni nonspecifiche e la formazione di dimeri dei primers, che possonoinficiare il risultato:• Eseguire i passaggi di pipettamento in ghiaccio e senza ritardi.• Preriscaldare (a 96°C ± 0.75°C) il blocco riscaldante del

thermal cycler prima di inserire i campioni e far partireimmediatamente il programma di amplificazione.

1. Diluire ciascun DNA genomico a una concentrazione compresa tra0.02 e 0.1 µg/µl in tampone TE.

2. Determinare il numero di provette da preparare (N):N = numero di campioni di DNA + 1 (controllo negativo; no DNA) + 1.Usando puntali con filtro preparare la miscela di amplificazione inuna provetta autoclavata da 1.5 ml:


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(N x 14.8 µl) Acqua distillata autoclavata.+ (N x 10 µl) Amplification Buffer (tappo trasparente).+ (N x 10 µl) DPB1 Primer Mix (tappo giallo).+ (N x 10 µl) MgCl2 (tappo viola).+ (N x 0.2 µl) Taq Polimerasi di 5 U/µl (N x 1 U).

Il volume totale di questa miscela di amplificazione è ora (N x 45 µl).Vortexare brevemente e aliquotare 45 µl di questa miscela in (N-1)provette di amplificazione autoclavate.NOTA:• Ciascun componente deve essere aggiunto e dosato nella giusta

quantità. Troppo o troppo poco campione o reagente può portarea risultati di amplificazione aspecifici o anche a nessunaamplificazione.

3. Aggiungere, se necessario (ad es. quando si usa PE-480) 2 gocce diolio minerale (~40 µl) in ogni provetta.Pipettare 5 µl (da 0.1 a 0.5 µg) di DNA genomico estratto (al di làdell'olio minerale, se presente).Aggiungere 5 µl di acqua distillata (no DNA) alla provetta delcontrollo negativo.NOTA:• Non vortexare o miscelare• Controllare che la miscela di amplificazione sia sul fondo della

provetta!4. Posizionare i campioni nel blocco del thermal cycler preriscaldato e

calibrato (vedere le istruzioni indicate dal produttore del thermalcycler). Far partire il programma di amplificazione designato perINNO-LiPA HLA-DPB Amplification.Profilo di amplificazione di DPB1:Thermal Cycler PE-480 PE-2400

PE-9600Step Temp Tempo Tempo1. Denaturazione 96°C 5 min 5 min2. Denaturazione 96°C 20 sec 15 sec Ripetere gli 3. Appaiamento 55°C 20 sec 20 sec step da 2 a 4, 4. Estensione 72°C 30 sec 20 sec per 30 volte5. Estensione 72°C 10 min 10 min

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5. Dopo il processo di amplificazione, utilizzare immediatamente icampioni con le strisce del test INNO-LiPA HLA-DPB o conservarei campioni a -15/-25°C.NOTA:• Non conservare i prodotti di DNA amplificato insieme ai

reagenti di amplificazione non ancora utilizzati.

Risultati

Visualizzazione

La presenza dei prodotti amplificati può essere controllata su gel di agarosioal 2%. Caricare 10 µl di prodotto amplificato per pozzetto. L'ampliconedovrebbe apparire come singola banda con una lunghezza di 280 bp.

Validazione

- Includere almeno un controllo positivo e uno negativo ogni volta cheviene eseguita un'amplificazione. Come per ogni nuova procedura dilaboratorio, dovrebbe essere preso in considerazione l'inserimento diun controllo positivo e negativo aggiuntivi fino al raggiungimento diun alto grado di confidenza nell'esecuzione del test. Se si desideraincludere un controllo positivo aggiuntivo, utilizzare un campionepositivo conosciuto.

- Se si ottiene sul gel una banda positiva per il controllo negativo, l'interaseduta deve essere scartata e deve essere ripetuta la procedura completa.

Limiti della procedura

- L'uso di questo prodotto dovrebbe essere limitato solo al personaleaddestrato alle tecniche di amplificazione.

- L'inibizione della Polimerasi (ad es.: mediante eparina, emoglobina)può essere la causa di un completo fallimento del test!

- Il talco dei guanti monouso e l'ipoclorito di sodio hanno effetti diinibizione sull'amplificazione.

- Ripetuti congelamenti/scongelamenti dei campioni di DNA possonocausare amplificazioni meno efficienti.

- Le buone pratiche di laboratorio e un'accurata esecuzione delleprocedure precedentemente specificate permetterannoun'amplificazione specifica.


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Performance del test

L'INNO-LiPA HLA-DPB è stato valutato in 23 laboratori di tipizzazionetissutale sparsi in tutto il mondo, all'interno dello scopo del 12thWorkshop Internazionale di Istocompatibilità, Francia 1996.Nessun fallimento specifico di amplificazione di INNO-LiPA HLA-DPB èstato riportato.

Español

Símbolos utilizados

Kit di amplificazione

Fabricado por

Producto sanitario para diagnóstico in vitro

Número de lote

Número de catálogo

Para ser usado por

Consulte las instrucciones de uso

Limitaciones de temperatura

Tampón de amplificación

Solución de primers

Solución de magnesio

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Uso al que está destinado

El kit INNO-LiPA HLA-DPB Amplification, de uso in vitro, está diseñadopara la amplificación de los ácidos nucleicos del segundo exón del locusDPB1 del antígeno leucocitario humano (HLA). La reacción se lleva acabo mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR)*.

Principios del ensayo

La muestra de ADN a amplificar mediante la PCR se introduce en unamezcla de reactivos que contiene un tampón con un exceso dedesoxinucleósido 5'-trifosfatos (dNTPs), "primers" (oligonucleótidoscebadores) biotinilados, y ADN polimerasa termoestable. Los primersamplifican los exones 2 y 3 del locus C del HLA y por esa razón sedenominan "primers HLA-C".

Las dos cadenas de la hélice de ADN se separan (desnaturalización) porcalentamiento, exponiendo las secuencias diana a los primers. Tras enfriarla mezcla a una temperatura concreta, estos primers se ligan a regionescomplementarias de secuencias que flanquean a la secuencia diana(anillamiento). A otra temperatura concreta, la ADN polimerasatermoestable utiliza el exceso de dNTPs, extendiendo los primersanillados a lo largo del ADN molde diana (extensión). De esta forma, trasun ciclo se obtienen dos copias exactas, biotiniladas, de la secuenciadiana. Tras múltiples ciclos se obtiene un número mayor de copiasbiotiniladas de la secuencia diana.

* La utilización de este producto está cubierta por una licencia F. Hoffmann - La Roche Ltd y Roche Molecular Systems, Inc.

Reactivos

Descripción, preparación para el uso y condiciones de almacenamientorecomendadas

- Los reactivos deben almacenarse completamente aislados decualquier fuente de ADN contaminante, especialmente productos deADN amplificado.

- Los reactivos para las reacciones de amplificación deben seralmacenados en una habitación libre de ADN amplificado.Preferiblemente se deben usar puntas con filtro y tubos autoclavados.


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- Si se mantienen a una temperatura de -15/-25°C en sus botellasoriginales, los reactivos son estables hasta la fecha de caducidadindicada. No obstante, se recomienda alicuotar los reactivos tras elprimer uso, y luego almacenarlos a una temperatura de -15/-25°C.

- No utilice los reactivos más allá de su fecha de caducidad.- Las alteraciones de la apariencia física del kit de reactivos pueden

ser signos de inestabilidad o deterioro.

Reactivos suministrados:

Component Quantity Ref. DescriptionTampón de amplificación 1 x 0.3 ml 56982 Contiene todos los dNTPs y NaN3

al 0,05% como conservante. Dejar que se descongeletotalmente antes de su uso.

Solución de primers 1 x 0.3 ml 57029 Contiene los primers biotinados y

NaN3 al 0,05% como conservante.Dejar que se descongeletotalmente antes de su uso.

Solución de MgCl2 1 x 0.3 ml 55701 Contiene NaN3 al 0,05% como

conservante. Dejar que sedescongele totalmente y llevarlo a20 - 25ºC para permitir ladisolución total del MgCl2.

Materiales necesarios pero no suministrados

- Materiales para la extracción de ADN.- Guantes desechables.- Puntas de pipeta estériles desechables (preferiblemente taponadas

con algodón).- Microtubos esterilizados.- Racks de microtubos.- Centrifugadora de microtubos.- Ciclador térmico de ADN y equipo.- Pipetas ajustables para pipetear de 1 - 20 µl, de 20 - 200 µl,

y de 200 - 1000 µl.- Aceite mineral, silicona (en caso necesario).- Agua destilada esterilizada en autoclave.

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- ADN polimerasa termoestable (se recomienda la Taq DNApolimerasa).

Seguridad y medio ambiente

- Por favor, consulte la hoja de datos sobre seguridad delfabricante y el etiquetado del producto para obtener informaciónacerca de componentes potencialmente peligrosos.

- Las muestras deben manipularse siempre como productospotencialmente peligrosos.

- Es imprescindible el uso de equipo protector personal: guantes ygafas de seguridad cuando manipule agentes peligrosos oinfecciosos.

- Deseche los residuos de acuerdo con las normas de manejo deresiduos de su institución. Asimismo, cumpla con todas las normasmedioambientales nacionales, autonómicas y locales.

Recogida, preparación y almacenamiento de muestras

NOTA:- Los reactivos no se suministran.

Extracción de ADN

Para preparar ADN genómico a partir de muestras de sangre enteratratadas con los anticoagulantes ácido-citrato-dextrosa (ACD) o ácidoetilendiaminotetraacético (EDTA) pueden utilizarse los métodos comunesde extracción del ADN por desalación o métodos basados enminicolumnas de centrifugación.

Almacene las muestras de ADN a una temperatura de -15/-25ºC.

El ADN extraído debería tener una concentración ≥≥ 0,02 µg/µl. La pureza (A260nm/A280nm) debería ser ≥≥ 1,5.


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Observaciones y precauciones

- A fin de evitar la contaminación del ADN, se recomienda utilizar unamáxima separación física entre los pasos de pre y posamplificación:salas separadas, pipetas (y demás material de laboratorio) separadas,trajes y guantes de laboratorio (y sus recambios) separados, son lasprecauciones mínimas para las buenas prácticas de laboratorio. Los reactivos deben aislarse de cualquier fuente de ADNcontaminante, especialmente productos de ADN amplificado. Evitetambién la contaminación microbiana de los reactivos.

- Una vez en la sala de posamplificación evite volver a la sala depreamplificación.

- Todas las puntas de pipeta y tubos utilizados para el proceso deamplificación deben haberse esterilizado en autoclave antes de suuso. Se recomienda utilizar puntas de pipeta taponadas con algodón.Utilice una punta nueva por cada alícuota de muestra que pipetee.

- Tras la descongelación, vortee la solución de amplificación, lasolución de primers y la solución de MgCl2 y centrifuguebrevemente todos los reactivos.

- No mezcle reactivos de distintos kits excepto si los componentestienen el mismo número de lote.

- Evite la contaminación microbiana de los reactivos.

Procedimiento del ensayo

NOTA:- Este protocolo para la amplificación del exón 2 de los alelos HLA-

DPB1 está diseñado para proporcionar una amplificación óptimautilizando tubos GeneAmp™ (de 0,5 ml) para PCR y cicladorestérmicos PE-480 (Perkin Elmer Cetus), o tubos MicroAmp(r) (de 0,2 ml)para PCR y cicladores térmicos PE-2400 y PE-9600 (Perkin ElmerCetus) y AmpliTaq DNA polymerase (Perkin Elmer Cetus).Este protocolo puede utilizarse con la mayoría de cicladores térmicoscomerciales, aunque es posible que deba modificarse en función delas indicaciones del fabricante del termociclador.

- Antes de utilizarlo, determine si el protocolo es compatible con elciclador térmico que utilice en su laboratorio. Asegúrese que elciclador térmico este calibrado antes de utilizarlo.

- Tome las precauciones necesarias para evitar la amplificación noespecífica y la formación de dímeros de primers, ya que, de locontrario, los resultados se verían comprometidos:• Lleve a cabo los pasos de pipeteado en hielo y sin demora.

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• Precaliente (a 96°C ± 0.75ºC) el bloque de calentamiento delciclador térmico antes de colocar las muestras e inicie deinmediato el proceso.

1. Diluya cada ADN genómico a una concentración comprendida entre0.02 y 0.1 µg/µl en tampón TE.

2. Determine el número de viales que se deben preparar (N) utilizandola siguiente fórmula:N = número de muestras de ADN + 1 (control negativo; sin ADN) + 1. Utilizando puntas taponadas con algodón, prepare la mezcla maestraen un tubo de 1,5 ml esterilizado en autoclave:

(N x 14.8 µl) agua destilada autoclavada.+ (N x 10 µl) Tampón de amplificación (tapón color natural).+ (N x 10 µl) Solución de primers DPB1 (tapón amarillo).+ (N x 10 µl) Solución de MgCl2 (tapón violeta).+ (N x 0.2 µl) Taq Polimerasa de 5U/µl (N x 1 U).

El volumen total de esta mezcla de amplificación es ahora igual a (N x 45 µl). Procese brevemente en vórtex y pipetee 45 µl de esta mezclamaestra en (N-1) tubos de amplificación esterilizados en autoclave.NOTA:• Cada componente se debe añadir en la cantidad adecuada. Si no

se pone la cantidad justa (por exceso o por defecto) de reactivosy de muestra pueden producirse amplificaciones inespecíficas opuede que no haya amplificación.

3. Añada 2 gotas (~40 µl) de aceite mineral en cada tubo si es necesario(por ejemplo, si utiliza PE-480).Pipetee 5 µl (0.1 a 0.5 µg) del preparado de ADN genómico (si esnecesario, a través del aceite mineral). Añada 5 µl de agua destilada (sin ADN) al tubo de control negativo.NOTA:• No lo vortee ni lo mezcle.• Compruebe que la mezcla de amplificación esté en el fondo del tubo.

4. Inserte las muestras en el bloque térmico precalentado y calibrado(consulte las instrucciones del fabricante del ciclador térmico). Inicie el programa de amplificación diseñado para la amplificaciónINNO-LiPA HLA-DPB.


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Perfil de la amplificación DPB1:

5. Concluido el proceso de amplificación, utilice las muestras deinmediato con tiras INNO-LiPA HLA-DPB o almacénelas a unatemperatura de -15/-25°C.NOTA: • No almacene los productos de ADN amplificado junto a los

reactivos de amplificación que no se hayan utilizado.

Resultados

Visualización

La presencia de amplicones puede comprobarse en gel de agarosa al 2%.Cargue 10 µl del producto amplificado por ranura. El productoamplificado debe aparecer como una única banda de 280 pb.

Validación

- Incluya al menos un control negativo y uno positivo cada vez querealice una amplificación. Como con cualquier nuevo procedimientode laboratorio, deberían incluirse controles positivos y negativosadicionales hasta que el procedimiento de ensayo se consigadesarrollar correctamente con un elevado grado de confianza. En caso de que sea aconsejable incluir un control positivo adicional,utilice una muestra positiva conocida.

- Si se obtiene una banda positiva correspondiente al control negativoen el gel, debe desecharse la totalidad de la prueba y repetirse todo elprocedimiento.

Termociclador PE-480 PE-2400PE-9600

Paso Temp Time Time1. Desnaturalización 96°C 5 min 5 min2. Desnaturalización 96°C 20 sec 15 sec Repetir los 3. Anillamiento 55°C 20 sec 20 sec ciclos 2 a 4,

primers 30 veces 4. Extensión primers 72°C 30 sec 20 sec5. Elongación 72°C 10 min 10 min

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Limitaciones del procedimiento

- Este producto sólo debe ser utilizado por personal especializado entécnicas de amplificación.

- La inhibición de la polimerasa (por ejemplo, por la heparina o por lahemoglobina) puede anular el ensayo.

- Asimismo, el polvillo de los guantes desechables y el hipocloritosódico tienen un efecto inhibidor sobre la amplificación.

- Una congelación/descongelación repetida de las muestras de ADNpuede ocasionar una amplificación menos eficiente.

- La amplificación específica se asegura mediante las buenas prácticasde laboratorio y una cuidadosa ejecución de los procedimientos quese han descrito.

Eficacia del ensayo

El INNO-LiPA HLA-DBB ha sido evaluado en 23 laboratorios de tipajede tejido de todo el mundo, dentro del alcance del 12th InternationalHistocompatibility Workshop, France 1996.No se informó de ningún fallo en las amplificaciones específicas con elINNO-LiPA HLA-DPB.

Português

Símbolos usados

Kit de amplificação

Fabricado por

Dispositivo médico de diagnóstico In vitro

Número de lote

Número de catálogo

Usar até


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Consultar instruções de utilização

Limites de temperatura

Tampão de amplificação

Mix de primers

Solução de MgCl2Indicações de uso

O kit INNO-LiPA HLA-DPB Amplification, para uso in vitro, foiconcebido para a amplificação dos ácidos nucleicos do segundo exão dolocus DPB1 do antigénio leucocitário humano (HLA). A reacção ocorrepor intermédio de uma reacção de polimerização em cadeia (PCR)*.

Princípio do teste

A amostra de ADN a ser amplificada por PCR é introduzida numa misturade reagentes contendo um tampão com um excesso de desoxinucleosido5'- trifosfatos (dNTPs), primers biotinilados e ADN polymerasetermoestável. Os primers amplificam a sequência alvo de ADN indicadanas "Indicações de Uso".

Por aquecimento, as duas cadeias de hélice do ADN são separadas(desnaturação) de modo a expor as sequências alvo aos primers. Após oarrefecimento da mistura, a uma determinada temperatura, estes primersligam-se a regiões complementares de sequências que flanqueiam asequência alvo (emparelhamento). A uma outra temperatura específica, aADN polymerase termoestável utiliza os dNTPs em excesso para estenderos primers emparelhados ao longo do modelo alvo (extensão). Destemodo, após um ciclo, são produzidas duas cópias exactas, biotiniladas, dasequência alvo. Após múltiplos ciclos, obtém-se um elevado número decópias biotiniladas da sequência alvo.

* A utilização deste produto depende de licença de F. Hoffmann - La Roche Ltd e Roche Molecular Systems, Inc.

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Reagentes

Descrição, preparação para utilização e condições de conservaçãorecomendadas

- Os reagentes devem ser armazenados completamente isolados dequalquer fonte de contaminação de ADN, especialmente de produtosde ADN amplificado.

- Os reagentes para procedimentos de amplificação devem ser manuseadosnuma sala livre de ADN amplificado. Devem ser usados tubos e pontasde pipeta autoclavados (preferencialmente com filtro de algodão).

- Desde que conservados de -25/-15°C e guardados nos frascosoriginais, os reagentes mantêm-se estáveis até à data de validadeindicada no kit. No entanto, recomenda-se aliquotar os reagentesapós a primeira utilização e então conservá-los de -25/-15°C.

- Não utilizar reagentes para além da data de validade indicada no kit.- Alterações na aparência física dos reagentes do kit podem indicar

instabilidade ou deterioração.

Reagentes fornecidos:

Componente Quantidade Refª. DescriçãoTampão de amplificação 1 x 0.3 ml 56982 Contém todos os dNTPs e 0.05%

NaN3 como conservante. Permitirdescongelação completa antes deutilizar.

Mix de primers 1 x 0.3 ml 57029 Contém primers biotinilados e0.05% NaN3 como conservante.Permitir a descongelaçãocompleta antes de utilizar.

Solução de MgCl2 1 x 0.3 ml 55701 Contém 0.05% NaN3 como

conservante. Permitir adescongelação completa e levar a20 - 25°C antes de utilizar, de modoa dissolver completamente MgCl2.


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Materiais necessários mas não fornecidos

- Materiais para extracção de ADN.- Luvas descartáveis.- Pontas de pipeta esterilizadas, descartáveis (preferencialmente com

filtro de algodão).- Microtubos esterilizados.- Suportes de microtubos.- Centrífuga de microtubos.- Termociclador de ADN e acessórios.- Pipetas ajustáveis para dispensar de 1 - 20 µl, 20 - 200 µl,

e 200 - 1000 µl.- Água destilada autoclavada.- Óleo mineral (se necessário).- AND polymerase termoestável (recomenda-se o uso de Taq DNA

polymerase).

Segurança e meio ambiente

- Consultar as instruções de segurança do fabricante e a rotulagemdo produto com informações sobre componentes potencialmenteperigosos.

- As amostras devem sempre ser manuseadas como potencialmenteperigosas.

- É necessário o uso de equipamento de protecção pessoal: Luvas eóculos de segurança, quando manusear agentes perigosos ouinfecciosos.

- Os resíduos devem ser manipulados de acordo com as regras dainstituição relativas ao tratamento de resíduos. Respeitar tambémtodos os regulamentos oficiais, locais e ambientais.

Colheita, preparação e conservação das amostras

NOTA:- Os reagentes para a preparação das amostras não são fornecidos com o kit.

Extracção de ADN

Para preparar o ADN genómico, a partir de amostras de sangue total,tratadas com anticoagulantes ácido-citrato-dextrose (ACD) ou ácidoetilenodiaminatetraacético (EDTA), podem utilizar-se os métodos comunsde extracção do ADN por salting-out ou os métodos baseados em colunas.

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Conservar as amostras de ADN a uma temperatura de -25/-15°C.

O ADN extraído deve ter uma concentração ≥≥ 0.02 µg/µl. A pureza(A260nm/A280nm) deve ser ≥≥ 1.5.

Observações e precauções

- A fim de evitar a contaminação do ADN, recomenda-se uma máximaseparação física entre os passos de pré e pós amplificação: salasseparadas, pipetas e outro material de laboratório separados, batas eluvas de laboratório (e o seu stock) separados, são precauçõesmínimas para uma boa prática laboratorial. Os reagentes devem estarisolados de qualquer fonte de contaminação de ADN, especialmenteprodutos de ADN amplificados.

- Uma vez na sala de pós-amplificação, evitar regressar à sala de pré-amplificação.

- Todas as pontas de pipeta e todos os tubos usados para o processo deamplificação devem ser previamente esterilizados em autoclave.Recomenda-se o uso de pontas de pipeta com filtros de algodão. Usar uma nova ponta de pipeta esterilizada para cada alíquota daamostra.

- Depois de descongelar, agitar no vortex o Tampão de Amplificação, aMix de Primers e a solução de MgCl2 e centrifugar (short spin) todosos reagentes.

- Não misturar reagentes de kits diferentes, a não ser que oscomponentes tenham números de lote idênticos.

- Evitar a contaminação microbiana dos reagentes.

Procedimento do teste

NOTA:- Este protocolo para a amplificação do exão 2 dos alelos HLA-DPB1

foi concebido para uma amplificação óptima utilizando tubos dePCR GeneAmp™ (0.5 ml) e termocicladores PE-480 (Perkin Elmer);ou tubos de PCR MicroAmp® (0.2 ml) e termocicladores PE-2400ou PE-9600 (Perkin Elmer), e usando polymerase AmpliTaq DNA(Perkin Elmer Cetus). Este protocolo pode utilizar-se com a maioria dos modelos determocicladores comerciais, mas pode necessitar de algumas alteraçõesde acordo com as indicações do fabricante do termociclador.


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- Antes de utilizar, determinar se o protocolo do teste é compatívelcom o termociclador utilizado no seu laboratório. Assegurar-se deque o termociclador foi calibrado antes de usar.

- Tomar as precauções necessárias para evitar amplificação nãoespecífica e formação de dímeros de primers, situações que podemcomprometer os resultados:• Realizar os passos de pipetagem no gelo e sem demora.• Pré-aquecer (96°C ± 0.75°C) o bloco de aquecimento do

termociclador antes de colocar as amostras e iniciarimediatamente o processo de ciclagem.

1. Diluir cada ADN genómico a uma concentração entre 0.02 e 0.1 µg/µl em tampão TE.

2. Determinar o número de frascos a serem preparados (N), utilizando aseguinte fórmula:N= número de amostras de ADN + 1 (controlo negativo, sem ADN) + 1.Utilizando pontas de pipeta com filtro de algodão, preparar umamastermix num tubo de 1,5 ml esterilizado em autoclave:

(N x 14.8 µl) Água destilada esterilizada em autoclave.+ (N x 10 µl) Tampão de amplificação (tampa de cor natural).+ (N x 10 µl) DPB1 Mix de primers (tampa amarela).+ (N x 10 µl) MgCl2 (tampa violeta).+ (N x 0.2 µl) Taq polymerase a 5 U/µl (N x 1 U).

O volume total desta mistura de amplificação é agora (N x 45 µl).Agitar no Vortex brevemente e pipetar 45µl desta mastermix para (N - 1) tubos de amplificação esterilizados em autoclave.NOTA:• Cada componente deve ser adicionado e fornecido na quantidade

exacta. Uma quantidade demasiado grande ou demasiado pequenada amostra ou de reagentes pode resultar numa amplificaçãoinespecífica ou mesmo numa não amplificação.

3. Juntar 2 gotas (~40 µl) de óleo mineral em cada tubo, se necessário(por ex. Quando se utilizar o PE-480).Pipetar 5 µl (0.1 a 0.5 µg) da preparação de ADN genómico (atravésdo óleo mineral, se necessário).Juntar 5 µl de água destilada (sem ADN) ao tubo de controlo negativo.

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OBSERVAÇÃO:• Não agitar (Vortex) ou misturar.• Verificar que a mistura de amplificação se encontra no fundo do

tubo.4. Colocar as amostras no bloco térmico pré-aquecido e calibrado do

termociclador (ver as instruções do fabricante do termociclador).Iniciar o programa de amplificação concebido para a amplificaçãocom INNO-LiPA HLA-DPB Amplification.

5. Concluído o processo de amplificação, utilizar de imediato as amostrascom as tiras de teste INNO-LiPA HLA-DPB ou conservá-las a umatemperatura de -15/-25°C.NOTA:• Não conservar produtos de ADN amplificado juntamente com

reagentes de amplificação não utilizados.

Resultados

Visualização

A presença de produtos amplificados pode ser verificada num gel deagarose a 2%. Colocar 10 µl do produto amplificado por ranhura. O produto da amplificação deve aparecer como uma banda única comuma dimensão de 280 pb.

Tipo de Termociclador PE-480 PE-2400PE-9600

Passo Tempª Tempo Tempo1. Desnaturação 96°C 5 min 5 min2. Desnaturação 96°C 20 seg 15 seg Repetir os 3. Emparelhamento 55°C 20 seg 20 seg passos 2 a 4, 4. Extensão 72°C 30 seg 20 sec 30 vezes5. Elongação final 72°C 10 min 10 min


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Validação

- Incluir, pelo menos, um controlo negativo e um positivo de cada vezque se realiza uma amplificação. Tal como em qualquer novoprocedimento laboratorial, deve ser tomada em consideração ainclusão de controlos adicionais positivo e negativo, até que se atinjaum alto grau de confiança na capacidade de realizar correctamente oprocedimento de teste. Se for desejável a inclusão de um controlopositivo adicional, utilizar uma amostra positiva conhecida.

- Se se obtiver uma banda positiva no gel para um controlo negativo,deve ser desprezada toda a série de testes e o procedimento deve serrepetido por completo.

Limites do procedimento

- A utilização deste produto deve ser limitada a pessoal bem treinadoem técnicas de amplificação.

- A inibição da polymerase (por ex. por heparina, hemoglobina) podeser razão para uma falha completa do ensaio!

- O pó das luvas descartáveis e o hipoclorito de sódio têm um efeitoinibidor na amplificação.

- A congelação/descongelação repetida das amostras de ADN poderesultar numa amplificação menos eficiente.

- A amplificação específica assegura-se mediante as boas práticas delaboratório e uma cuidadosa execução dos procedimentos descritos.

Performance do teste

O INNO-LiPA HLA-DPB foi avaliado mundialmente em 23 laboratóriosde tipagem de tecidos, dentro do âmbito do 12th InternationalHistocompability Workshop, França 1996.Não foram referidas falhas específicas de amplificação do INNO-LiPAHLA-DPB.

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INNO-LiPA HLA-DPB Amplification · Beabsichtigter Verwendungszweck . . . . . . . . . . . . . . . ....

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