Insertionsmutagenesen zur Markierung von Genen

mit tip und Nachweis der Fusionsproteine in vivo

Den Naturwissenschaftlichen Fakultäten

der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg

zur

Erlangung des Doktorgrades

vorgelegt von

Maximilian Schlicht

aus Kulmbach

Als Dissertation genehmigt von den Naturwissenschaftlichen Fakultäten der

Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg

Tag der mündlichen Prüfung: 25. September 2006

Vorsitzender der Promotionskommission: Prof. Dr. D.-P. Häder

Erstberichterstatter: Prof. Dr. W. Hillen

Zweitberichterstatter: Prof. Dr. M. Hensel

Nicht der Pflicht nur zu genügen, was sie fordert und verlangt,

nicht der Stunde nur zu leben, was sie nimmt und was sie dankt, –

Freunde, einem stolzern Wollen gelte unsres Tages Lauf:

Über Sturm und über Wolken Sonn entgegen trag's uns auf!

Anastasija und meiner Familie gewidmet.

Danksagung

Herrn Professor Dr. Wolfgang Hillen möchte ich an dieser Stelle ganz besonders für die Aufnahme in seine Arbeitsgruppe danken. Die sehr guten Arbeitsbedingungen an seinem Lehrstuhl und seine stete Diskussionsbereitschaft trugen zum Gelingen dieser Arbeit bei. Herrn Professor Dr. Michael Hensel danke ich für die freundliche Übernahme des Zweitgutachtens. Bei allen „rezenten“ und ehemaligen Mitgliedern des Lehrstuhls für Mikrobiologie bedanke ich mich für die stets angenehme Zusammenarbeit. Vorneweg Herrn Dr. Alfons Rösch, der „Mutter der Kompanie“, für fachliche, wie auch private Gespräche. Ebenso sei den Damen der Medienküche, Frau Hildegard Stork und Frau Manuela Hanuschik, gedankt. Für die logistische Unterstützung aus dem Sekretariat gilt mein Dank Frau Heidemarie Prell und Frau Donata Wehr. Nicht vorstellbar wäre ein reibungsloser Ablauf am Lehrstuhl ohne die optimale technische Unterstützung unseres „Alles-möglich-Machers“ Markus Müller. Herrn Priv.-Doz. Dr. Fritz Titgemeyer danke ich für die Zusammenarbeit bei den gemeinsamen Veröffentlichungen der alten „DasR-Streptomyceten-Garde“ und für manches private Wort. Dank gilt auch Dr. Ralph Bertram für die Gespräche zur „Lage der Nation“.

Was wäre aber unser Lehrstuhl ohne das famose Kellerlabor, dem Tummelplatz der „Fast Eukis and Furious Peptides“. Mein Dank gilt hier zuerst unserer „lebenden Pubmed“ Herrn Dr. Christian Berens – herzlichen Dank für die optimale fachliche Unterstützung! Ebenso der ehemaligen Kollegin Dr. Christel Krüger und den Kollegen Dr. Lars Drüppel und besonders natürlich Dr. Marcus Klotzsche, für die Identifikation der spannendsten 16 AS seiner und meiner Promotion. Herzlichen Dank für die stets gute Stimmung an meine Laborkolleginnen Christina Danke, Sabine Fischer und Britta Schmidt, wie auch an das technische Unterstützungsteam in unserem Labor: Kristin Garke, Klaus Pfleiderer und „Seine markgräfliche Durchlaucht“ Andreas Schmidt. Anke Friedlein sei Dank für ihr stetes Engagement und ihre wertvollen Beiträge im Rahmen ihres F2/F3-Praktikums und ihrer Diplomarbeit. Dank auch an Martin Capek und meinen „Schergen“ Fabian Geldmacher für die „erlebnisreiche“ Zeit im Labor.

Natürlich möchte ich mich auch bei meinen alten StudienkollegInnen bedanken, die mit mir die Höhen und Tiefen der Diplomarbeit und Promotion durchlebt haben: Mareen Sprehe, Johannes Bail und natürlich Andreas W. Thomae. Auch der Lausanne-Export der Mikrobiologie sei an dieser Stelle hervorgehoben: m. lb. Fbr. Manfred Beleut.

Besonderer Dank gilt meinem Laborkollegen Janko Daam.

INHALTSVERZEICHNIS

- i -

Inhaltsverzeichnis

1. Zusammenfassung / Summary 1

2. Einleitung 3

2.1 Vom Genom zum Proteom - von der Information zur Funktion 3

2.2 Globale Analysen des Transkriptoms 4

2.3 Globale Analysen des Proteoms 5

2.3.1 Proteomanalysen mittels zweidimensionaler Gelelektrophorese

2.3.2 Proteindetektion durch Translationsfusionen mit Reporterenzymen

2.4 Methoden zur Generierung von Translationsfusionen 8

2.4.1 Gerichtete Mutagenese mittels des „λ Red Systems“

2.4.2 Ungerichtete Mutagenese basierend auf Tn5-Transposons

2.5 Das Tet System und die Einsatzmöglichkeit TetR regulierbarer Reporterkonstrukte 13

2.6 Das Transkription induzierende Peptid Tip als alternativer TetR Induktor 14

2.7 Ziel der Arbeit 16

3. Ergebnisse 17

3.1 Konstruktion von Insertionselementen zur ungerichteten Erzeugung von chromosomal kodierten C-terminalen Tip-Fusionsproteinen 17

3.2 Architektur und Funktionsprinzip eines Suppressor-basierten Insertionselements 19

3.2.1 Überprüfung der TetR Induktionsfähigkeit eines C-terminalen Peptidanhängsels im Kontext eines Insertionselements

3.2.2 Analyse der Suppressions-Effizienz und der Funktionalität des Selektionsmarkers

3.2.3 Aktivitätsanalysen der Suppressionskassette auf temperatursensitiven Plasmiden

3.2.4 Architektur des InsTipSup Elutionsvektors

INHALTSVERZEICHNIS

- ii -

3.2.5 Transposase-vermittelte Integration von InsTipSup in vitro und in vivo

3.3 Architektur und Funktionsprinzip des Insertionselements InsTipα 31

3.3.1 Die in vivo Funktionalität von InsTipα

3.3.2 Transposase-vermittelte Integration von InsTipα in E. coli WH207(λtet50)

3.3.3 Identifikation der Insertionsorte von InsTipα

3.3.4 Nachweis der Expression der InsTip1-markierten Fusionsproteine

3.3.5 Charakterisierung der wuchsdefizienten Insertionsmutante WH851

3.3.6 Detektion quantitativer Expressionsunterschiede mittels InsTip1

3.4 Konstruktion und in vivo Funktionsanalyse von InsTip1-Derivaten 47

3.5 Konstruktion eines Rekombinationselements zur gerichteten Erzeugung von chromosomal kodierten N-terminalen Tip-Fusionsproteinen 51

3.5.1 Architektur und Funktionsprinzip des Rekombinationselements ReTipN

3.5.2 Überprüfung der in vivo Funktionalität einer TipFRT1-Proteinfusion

4. Diskussion 57

4.1 Insertionselemente zur Erzeugung von Translationsfusionen 58

4.2 Vergleich der TetR-Induktion durch Tip- bzw. InsTip1-Fusionen 59

4.3 Insertionsmutagenesen mit InsTipSup und InsTipα 61

4.4 Über die InsTipα-Insertionsmutanten WH851 – WH855 63

4.4.1 Vergleich der genomischen Insertionsorte von InsTipα

4.4.2 Vergleich der Phänotypen von WH851 – WH855 mit dem Referenzstamm

4.4.3 Vergleich der mittels InsTip1-Markierung nachgewiesenen Proteinexpression mit publizierten Daten

4.5 Vergleich der TetR-Induktion durch die InsTip1-Derivate InsTip2 und InsTip3 67

4.6 Fusionsanhängsel zur Proteindetektion: Je kleiner desto feiner? 68

4.7 Das N-terminale Fusionsanhängsel TipFRT1 70

4.8 Ausblick 71

INHALTSVERZEICHNIS

- iii -

5. Materialien, Medien und Methoden 74

5.1 Materialien 74

5.1.1 Chemikalien

5.1.2 Verbrauchsmittel

5.1.3 Geräte

5.1.4 Enzyme, Proteine und Antikörper

5.1.5 Kommerziell erhältliche Reagenziensysteme

5.1.6 Größenmarker für DNA-Fragmente und Proteine

5.1.7 Oligonukleotide

5.1.8 Bakterienstämme und Phagen

5.1.9 Plasmide

5.1.10 Konstruktion der Plasmide

5.2 Medien und Medienzusätze 87

5.2.1 Bakteriennährmedien

5.2.2 Fakultative Medienzusätze

5.3 Lösungen und Puffer 89

5.3.1 Lösungen zur Elution von DNA

5.3.2 Lösung zur DNA-Präzipitation mittels PEG

5.3.3 Puffer und Lösungen für die Gelelektrophorese

5.3.4 Lösungen zur Herstellung eines denaturierenden PAA-Gels (SDS-PAGE)

5.3.5 Lösungen zur Färbung von DNA- und Protein-Gelen

5.3.6 Lösung zur Herstellung nativer PAA-Gele

5.3.7 Puffer für Western Blot-Analysen

5.3.8 Puffer für β-Galaktosidase Aktivitätsmessungen

5.3.9 Puffer für in vitro Transposonmutagenesen

5.4 Methoden 92

5.4.1 Allgemeine Methoden

5.4.2 Herstellung elektrokompetenter Zellen von E. coli

5.4.3 Isolierung der Insertionselemente InsTipSup und InsTipα

5.4.4 Herstellung der Transposomen

5.4.5 Elektroporation von E. coli mit Transposomen

5.4.6 Bestimmung des InsTipα Insertionsortes

INHALTSVERZEICHNIS

- iv -

5.4.7 Das Reportersystem zur Analyse der in vivo TetR Induktionsfähigkeit von Tip-Fusionsproteinen

5.4.8 Quantifizierung der β-Galaktosidase Aktivität in E. coli

5.4.9 Gewinnung von Proteinrohlysaten

5.4.10 Western Blot-Analyse

5.5 Computerprogramme, Datenbanken und Internetdienste 100

5.5.1 Computerprogramme

5.5.2 Datenbanken und Internetdienste

6. Literaturverzeichnis 101

7. Publikationen 116

8. Lebenslauf 117

9. Abkürzungsverzeichnis 118

9.1 Abkürzungen 118

9.2 Einheiten 120

9.3 Vorsätze von Einheiten 120

9.4 Nukleotid-Nomenklatur 121

9.5 Aminosäure-Nomenklatur nach IUPAC-IUB Vereinbarung von 1969 121

ZUSAMMENFASSUNG

- 1 -

1. Zusammenfassung

In der vorliegenden Arbeit wurde eine Methode entwickelt, unter Nutzung eines genetischen Elements in vivo Informationen über das Proteom eines Prokaryoten zu erlangen. Die Strategie basiert auf der Erzeugung chromosomal kodierter Fusionsproteine, die mit der Sequenz des Transkription-induzierenden Hexadecapeptids Tip markiert sind. Durch die TetR-induzierenden Eigenschaften von Tip sollte die Expression der Tip-markierten Fusionsproteine qualitativ und quantitativ durch ein Reportergen in vivo detektiert werden, dessen Expression unter TetR-Kontrolle steht. Hierfür wurden die Insertionselemente InsTipSup und InsTipα entwickelt, die von dem prokaryotischen Transposon Tn5 abgeleitet sind. Sie kodieren für die Sequenz des Peptids Tip und integrieren Transposase-vermittelt Sequenz-unspezifisch in vitro bzw. in vivo in DNA. Durch Insertion dieser Elemente in das richtige Leseraster eines offenen Leserahmes, wird dieser mit der InsTip1-kodierenden Sequenz markiert. Wird dieses Gen exprimiert, entstehen Fusionsproteine, die über ein 30 Aminosäure-langes InsTip1-Anhängsel verfügen. Für die C-terminale Fusion von InsTip1 am Modellprotein TrxA wurde nachgewiesen, dass sie dieselben TetR-induzierenden Eigenschaften aufweist wie Tip. Transposomen aus InsTipα und der hyper- und transaktiven Tn5-Transposase wurden in vitro assembliert und eine Insertionsmutagenese in Escherichia coli durchgeführt, um mittels eines TetR-regulierten Reporters Stämme zu isolieren, die TetR-induzierende InsTip1-Fusionsproteine synthetisieren. Dies erzeugte eine Bibliothek von 6400 KmR InsTipα-Insertionsmutanten, von denen fünf Mutanten bei einem visuellen Auswahlverfahren auf MacCONKEY Bouillon-Agarplatten Derepression des TetR-regulierten lacZ Reportergens aufzeigten. Die Insertion von InsTipα erfolgte in die offenen Leserahmen der nicht-essentiellen Gene atpD, ppiD, yraI bzw. yicO, sowie in den des als essentiell annotierten Gens yfdX. Für alle fünf Stämme konnte die Expression der jeweiligen Fusionsproteine durch β-Galaktosidase Aktivitätsmessungen nachgewiesen werden, wobei erstmals mittels Tip die Synthese von chromosomal kodierten Proteinen in vivo qualitativ und quantitativ detektiert wurde. Die Expressionsanalysen der InsTip1-markierten Proteine in Vollmedium und verschiedenen Minimalmedien zeigten, dass der Proteinnachweis in exponentiell wachsenden und stationären Kulturen erfolgen kann. Die Ergebnisse stimmen mit publizierten Daten überein die auf Transkriptionsfusionen oder Microarray-Analysen basieren und ergänzen darüber hinaus vorhandene Datensätze. Im zweiten Projekt wurde das Rekombinationselement ReTipN aufgebaut, mit dem in einer Diplomarbeit Gene in Salmonella enterica gerichtet an ihrem 5´-Ende mit der Tip-kodierenden Sequenz markiert wurden, um N-terminale TipFRT1-Fusionen zu erzeugen. Für die N-terminale Fusion von TipFRT1 an TrxA wurde in dieser Arbeit nachgewiesen, dass sie ebenso TetR-Induktion vermittelt, wie die N-terminale Fusion Tip-TrxA.

ZUSAMMENFASSUNG

- 2 -

1. Summary

This work established a method to obtain proteomic information from a prokaryote in vivo by using a genetic element. The strategy is based on the construction of chromosomally encoded fusion proteins which are tagged with the sequence of the transcription-inducing hexadecapeptide Tip. Due to the TetR inducing properties of Tip the expression of the Tip-tagged fusion proteins should be qualitatively and quantitatively analysable in vivo with the help of a TetR controlled reporter gene. The insertion elements InsTipSup and InsTipα were constructed. They are derived from the prokaryotic transposon Tn5, encode the sequence of the peptide Tip and can integrate randomly in DNA in vivo and in vitro. If an insertion of these elements occurs in the correct reading frame, the targeted orf is tagged with the InsTip1 encoding sequence. Expression of such a gene generates a fusion protein with a 30 amino acid long tag. This study demonstrated that the C-terminal fusion of InsTip1 with the model protein TrxA mediates the same TetR inducing properties as a fusion with the hexadecapeptide Tip. Transposomes of InsTipα and hyper- and transactive Tn5-transposase were formed in vitro

and an insertion mutagenesis was carried out in Escherichia coli. A library of 6400 InsTipα insertion mutants was obtained by selection for KmR. With the help of a TetR regulated reporter construct, strains should be isolated which expresses TetR-inducing InsTip1 fusion proteins. Visual screening of MacCONKEY Bouillon agar plates detected five mutant strains displaying the expression of InsTip1 tagged proteins by derepressing the TetR regulated reporter gene lacZ. The insertion of InsTipα took place in the open reading frame of the non-essential genes atpD, ppiD, yraI, and yicO as well as in the postulated essential gene yfdX. The expression of the fusion proteins could be demonstrated with β-galactosidase activity measurement for these strains. In doing so, the first Tip-based qualitative and quantitative in vivo detection of protein expression from the endogenous locus could be demonstrated. The expression analysis of the InsTip1 tagged proteins in rich and minimal media demonstrated that the protein detection can occur within exponential and stationary grown cultures. The obtained results were in full agreement with previously published data based on transcriptional fusions or microarray analysis and could extend published protein expression patterns. In the second project, the recombination element ReTipN was constructed. In the context of a diploma thesis ReTipN was used to tag genes of Salmonella enterica side-specifically at their 5´-end with the Tip-encoding sequence, to gain N-terminal TipFRT1 fusions. This work demonstrated for the N-terminal fusion of TipFRT1 to TrxA, that TipFRT1-TrxA can also mediate TetR induction as effectively as the N-terminal fusion Tip-TrxA.

EINLEITUNG

- 3 -

2. Einleitung

2.1 Vom Genom zum Proteom - von der Information zur Funktion

Durch die Veröffentlichung des ersten, vollständig sequenzierten Genoms von Haemophilus

influenzae (Fleischmann et al., 1995) im Jahre 1995 durch Craig Venter´s TIGR (The Institute

for Genomic Research) in Rockville, Maryland, USA, war der Startschuss für die

weitreichenden prokaryotischen und eukaryotischen Genomprojekte der letzten 10 Jahre

gefallen. Neben der Sequenzierung und Kartierung des menschlichen Genoms im so

genannten Human Genome Project (Venter et al., 2001), konnten nach der

Genomsequenzierung des prokaryotischen Organismus H. influenzae bis heute für über 279

weitere bakterielle Genome die komplette DNA-Sequenz ermittelt werden. Im Mittelpunkt

des Interesses standen und stehen dabei vor allem prokaryotische Modellorganismen, wie

Escherichia coli (Blattner et al., 1997) und Bacillus subtilis (Kunst et al., 1997), als auch

pathogene bzw. industriell relevante Bakterienarten wie Mycobacterium tuberculosis,

Salmonella enterica bzw. Streptomyces coelicolor (Cole et al., 1998; McClelland et al., 2001;

Bentley et al., 2002).

Diese durchgeführten Sequenzanalysen von prokaryotischer, wie auch eukaryotischer

genomischer DNA, stellen eine wichtige Basis dar, um einen globalen Überblick über die

gesamte genetische Information eines Organismus und deren genomische Organisation zu

erhalten.

Die abgeschlossene Genomanalyse für den Gram-negativen Modellorganismus E. coli K-12

ergab ein Genom von 4639221 bp, das 4288 kodierende Gene beinhaltet (Blattner et al.,

1997). Richmond et al. konnten in darauf folgenden Studien zeigen, dass in Abhängigkeit der

physiologischen Bedingungen jedoch nur ein Anteil dieser 4288 Gene exprimiert wird und

dass E. coli bei Wachstum auf Vollmedium sogar bis zu 75% seiner Gene nicht transkribiert

(Richmond et al., 1999). Abgeschlossene Genomanalysen vermitteln durch die Identifikation

kodierender DNA-Sequenzen zwar Kenntnis über Proteine, die theoretisch gebildet werden

können, also über das potentielle zelluläre Proteinrepertoire, eröffnen aber keine Einblicke in

die tatsächlich stattfindende Expression der Gene eines Organismus, die zur Erzeugung der

Proteine als Funktionsträger der Zelle führen (Blackstock und Weir, 1999).

Die Proteinbiosynthese der Zellen unterliegt auf Ebene der Transkription von mRNA dem

Einfluss von Regulationsmechanismen, die die Transkription an sich und die

EINLEITUNG

- 4 -

Transkriptniveaus einzelner Gene steuern und so den Organismus durch die Variation des

tatsächlich benötigten Proteoms an Umwelteinflüsse und extrazelluläre Stimuli anpassen.

Gerade aber die Expressionsprofile von Proteinen, die im Gegensatz zur DNA nicht Träger

der Information, sondern der zellulären Funktion sind, stehen in der Post-Genom-Ära im

Mittelpunkt des Interesses, da sie Einblicke in den status quo der Zellen ermöglichen und so

z.B. in der Bekämpfung humanpathogener Organismen neue Wirkbereiche und Zielorte für

Antibiotika erschließen (Blackstock und Weir, 1999).

In den vergangenen drei Jahrzehnten wurden verschiedenste Methoden entwickelt, um auf

mRNA- und Protein-Ebene globale Analysen des Gesamtbestands der mRNA, d.h. des

Transkriptoms bzw. des Proteoms eines Organismus zu ermöglichen. Dies eröffnete Einblicke

in die qualitative und quantitative Komplexität des in vivo vorliegenden Proteinrepertoires

einer Zelle und auf das Expressionsniveau einzelner Proteine.

2.2 Globale Analysen des Transkriptoms

Eine effektive Analyse- und Vergleichsmethode des Transkriptoms für prokaryotische

Organismen stellen DNA- bzw. RNA-Mikroarrays dar, die es erlauben, ein vollständiges Bild

des Expressionsprofils der gesamten mRNA eines Organismus unter verschiedensten

Umweltbedingungen, wie z.B. Stress, Nahrungsangebot oder Zell-Wirt Interaktionen, zu

erhalten (Lucchini et al., 2001; Conway und Schoolnik, 2003; Dharmadi und Gonzalez,

2004). Studien dieser Art konnten zum einen für Gram-negative und Gram-positive

Modellorganismen wie E. coli und B. subtilis durchgeführt werden, als auch für

Humanpathogene wie z.B. Mycobacterium tuberculosis, Haemophilus influenzae und Vibrio

cholerae (Dharmadi und Gonzalez, 2004). Jedoch stehen Mikroarrays bisher nicht für jeden

Organismus zur Verfügung, wodurch die speziesübergreifende Nutzung eingeschränkt ist.

Vergleichende Analysen von mRNA-Niveaus und den dazugehörigen Proteinmengen zeigten

in Hefe, dass bei einer direkten Übertragung der Mikroarray Daten auf das Proteom ein

verzerrtes Bild der intrazellulären Situation entsteht (Gygi et al., 1999; Griffin et al., 2002),

da bei gleichen mRNA-Mengen die Protein-Mengen bis zu 20-fach variieren. Dadurch

reichen Expressionsdaten, die auf mRNA beruhen, für die Interpretation zellulärer Abläufe

und die Gewinnung von Proteom-Informationen nicht aus.

EINLEITUNG

- 5 -

Als Gründe hierfür können zum einen post-transkriptionale Regulationsmechanismen genannt

werden, die die Translationsraten von Proteinen steuern (Harford und Morris, 1997), als auch

die Halbwertszeit der mRNA bzw. Stabilität der Proteine (Bernstein et al., 2002; Tobias et al.,

1991). So konnten Bernstein et al. zeigen, dass 99% von 3835 mRNA Transkripten in E. coli

unterschiedliche Halbwertszeiten zwischen 1 min und 18 min aufweisen (Bernstein et al.,

2002). Carpousis et al. beschreiben sogar mRNA-Halbwertszeiten von unter 30 s für E. coli

(Carpousis et al., 1999), was zu experimentellen Problemen bei der Gewinnung qualitativ

hochwertiger mRNA-Proben für die Erstellung von Mikroarrays führen kann (Lucchini et al.,

2001).

2.3 Globale Analysen des Proteoms

Im Gegensatz zur dargestellten Transkriptomik, die die Quantifizierung der mRNA-

Transkripte umfasst, beinhaltet die so genannte Proteomik (Dove, 1999) qualitative und

quantitative Analysen der Expression und der Expressionsniveaus einzelner Proteine, sowie

deren Mengenänderungen unter verschiedensten Bedingungen (Han und Lee, 2006). Darüber

hinaus erlauben auf Proteomik basierende Studien die Gewinnung von Informationen über

post-translationale Proteinmodifikationen, die auf mRNA-Ebene nicht erhalten werden

können, sowie Informationen über Proteinfunktion, Proteintranslokation und subzelluläre

Proteinlokalisation (Han und Lee, 2006).

2.3.1 Proteomanalysen mittels zweidimensionaler Gelelektrophorese

Die Entwicklung der zweidimensionalen (2D) Gelelektrophorese (O´Farrell, 1975; Klose

1975) eröffnete die Möglichkeit, vergleichende Analysen von präparierten Proteinextrakten

aus eukaryotischen und prokaryotischen Zellen durchzuführen und so direkte Einblicke in

Anwesenheit, Mengenverteilung und Mengenunterschiede einzelner Proteine im zellulären

Proteom zu erhalten. Die Methode erlaubt es, auf einem einzigen Gel mehrere hundert bis

tausend verschiedene Proteinbanden zu detektieren (Gygi et al., 2000a), wodurch es möglich

wurde, globale Proteinexpressionsunterschiede, z.B. zwischen Wildtyp- und Mutanten-

Stämmen durch vergleichende 2D Gelelektrophorese zu analysieren (Tobisch et al., 1999; Küster-Schöck et al., 1999; Leboeuf et al., 2000; Eppler et al., 2002).

EINLEITUNG

- 6 -

In Kombination mit der Proteinidentifikation durch Massenspektroskopie, Edman-Abbau

(Edman, 1970) oder Western-Blot Analysen konnten mit dieser Technik direkt einzelne

Proteine als biochemische Funktionsträger aus einem Proteom quantitativ und qualitativ

analysiert werden.

Jedoch besitzen biochemische Analysen, wie die 2D Gelelektrophorese, methodische Grenzen

in Bezug auf die physikalischen und chemischen Eigenschaften der Proteine. So beeinflussen

Proteinmengen und -modifikationen, Hydrophobizität und extreme isoelektrische Punkte

einzelner Proteine das Laufverhalten der Proteine während der isoelektrischen Fokusierung,

wodurch hauptsächlich höher exprimierte, hydrophile Proteine mit isoelektrischen Punkten

(pI) unter pH 8 detektiert werden (Gygi et al., 2000a; Gygi et al., 2000b; Pederson et al.,

2003). Für Hefe, bei der 80% des vorhergesagten Proteoms niedrig exprimierte Proteine

darstellen, ungefähr 50% der Proteine einen pI über pH 8 aufweisen und 30% zu den

potentiellen Membranproteinen zählen, konnte so gezeigt werden, dass nur etwa ein Drittel

der theoretisch exprimierten Proteine mittels 2D Gelelektrophorese identifiziert und

quantifiziert werden kann (Pederson et al., 2003).

Überdies wird die Protein-Identifikation mittels Massenspektroskopie (MALDI-TOF) oftmals

durch Protein-Modifikationen, wie z.B. N-Acetylierung, Phosphorylierung oder

Glykosylierung (Larsen und Roepstorff, 2000) und geringe Mengen einzelner niedrig

exprimierter Proteine erschwert (Gygi et al., 2000a; Gygi et al., 2000b).

2.3.2 Proteindetektion durch Translationsfusionen mit Reporterenzymen

Neben biochemischen Methoden zur Detektion und Quantifizierung von Proteinen wurden

mehrere Strategien, basierend auf rekombinanter DNA, entwickelt, mittels Reporterenzymen

bzw. Affinitätsanhängseln die Synthese von einzelnen Proteinen in vivo bzw. in vitro zu

detektieren und gegebenenfalls zu quantifizieren (Patton, 2002).

In eukaryotischen und prokaryotischen Applikationen dienen Reporterenzyme wie z.B. die β-

Galaktosidase (LacZ) aus E. coli, das green fluorescent protein (GFP) aus der Qualle

Aequorea victoria (Zimmer, 2002) bzw. dessen Derivate (Margolin, 2000; Matz et al., 2002;

Lippincott-Schwartz und Patterson, 2003) und die Alkalische Phosphatase (PhoA) aus E. coli

als Marker für Translationsfusionen mit Zielproteinen. Diese Markierungs-Techniken werden

im Laboralltag vielfältig eingesetzt, da ein breites Spektrum an eukaryotischen und

prokaryotischen Organismen für diese Methodik zugänglich ist.

EINLEITUNG

- 7 -

Im Vergleich zu klassischen Transkriptionsfusionen, bei denen das zu analysierende Zielgen

gegen ein lacZ- bzw. gfp-Reportergen ersetzt wird, um die Promotoraktivitäten und

Expressionsstärken von Genen in Prokaryoten zu analysieren (Silhavy, 2000; Hautefort et al.,

2003), wird bei einer Translationsfusion das Gen von Interesse mit einem Reportergen am 5´-

oder 3´-Ende markiert. Nach erfolgter Translation wird so ein N- oder C-terminal markiertes

Fusionsprotein generiert (Phillips, 2001; Zimmer, 2002), das in vivo enzymatisch oder

physikalisch detektiert werden kann. Diese Art des Expressionsnachweises vermeidet es, das

Gen von Interesse zu deletieren und erlaubt, dass das zu analysierende Zielprotein als Teil

eines Fusionsproteins gebildet wird. Durch die Vermeidung der Erzeugung von

Deletionsmutanten werden so indirekte Effekte auf die Proteinexpression vermindert.

Translationsfusionen mit LacZ wurden bereits 1980 von Shuman et al. genutzt, um in E. coli

Proteine zu markieren und enzymatisch zu detektieren (Shuman et al., 1980). Mittels

einzelner LacZ-Fusionen konnte in Saccharomyces cerevisiae die Expression einiger tausend

Proteine erfolgreich in vivo analysiert werden (Ross-Macdonald et al., 1999). Fusionsproteine

mit PhoA-Markierungen wurden hingegen für Analysen des Proteinexports über die

cytoplasmatische Membran und den Nachweis von Membranproteinen genutzt, da PhoA erst

im Periplasma der Zellen enzymatisch aktiv ist und detektiert werden kann (Manoil et al.,

1990; Hayes, 2003).

LacZ- bzw. PhoA-Fusionsproteine bieten überdies die Möglichkeit, die Proteinmengen des

Fusionspartners durch die enzymatische Aktivität von LacZ bzw. PhoA direkt zu

quantifizieren (Hayes, 2003).

Proteinfusionen mit N- bzw. C-terminalen GFP-Anhängseln dienen in Eukaryoten und

Prokaryoten neben Analysen der Proteinexpression, der Aufklärung der intrazellulären

Proteinlokalisation in vivo und als visuelle Nachweismethode von zellulärer Proteinbewegung

(Chalfie et al., 1994; Wang und Hazelrigg, 1994; Phillips, 2001; Lippincott-Schwartz und

Patterson, 2003). In S. cerevisiae wurde in einer globalen Studie die Expression von 4156

GFP-Fusionsproteinen von ihrem natürlichen endogenen Lokus im Hefegenom detektiert und

deren Lokalisation in der Zelle analysiert (Huh et al., 2003).

In einer weiteren globalen Studie wurde eine Kollektion an Stämmen von S. cerevisiae

generiert, die C-terminale, mit dem tandem affinity purification tag (TAP) (Puig et al., 2001)

markierte Proteine chromosomal kodieren (Ghaemmaghami et al., 2003). Puig et al. nutzten

die N- bzw. C-terminale TAP-Markierung von Proteinen zur hoch-affinen Aufreinigung

dieser Proteine oder Proteinkomplexe (Puig et al., 2001), wobei Ghaemmaghami et al. in S.

EINLEITUNG

- 8 -

cerevisiae 4251 C-terminale TAP-Fusionsproteine immunologisch detektierten und so deren

Expressionsmengen quantifizierten (Ghaemmaghami et al., 2003).

2.4 Methoden zur Generierung von Translationsfusionen

2.4.1 Gerichtete Mutagenese mittels des „λ Red Systems“

Baudin et al. beschrieben für den eukaryotischen Modellorganismus S. cerevisiae, dass

lineare DNA-Fragmente, wie z.B. PCR-Produkte (Lorenz et al., 1995), die endständig über

mindestens 35 bp zum Genom identische Sequenzen verfügen, durch homologe

Rekombination ins Chromosom von S. cerevisiae integrieren (Baudin et al., 1993). Diese

Fähigkeit wurde für die gerichtete genomische Markierung von Genen mit der kodierenden

Sequenz für GFP- bzw. TAP-Reporterenzyme genutzt. Durch die Erzeugung einer Kollektion

an rekombinanten Stämmen, die Fusionsproteine kodieren, mit Hilfe amplifizierter, linearer

DNA, konnten globale Expressionsstudien in S. cerevisiae durchgeführt werden

(Ghaemmaghami et al., 2003; Huh et al., 2003).

Einige natürlich kompetente Prokaryoten, wie der Gram-positive Modellorganismus B.

subtilis, verfügen ebenso über die Fähigkeit freie DNA ins Cytoplasma aufzunehmen. Für

lineare DNA-Fragmente, die über flankierende Genom-identische Sequenzabschnitte

verfügen, konnte gezeigt werden, dass Zellen damit transformierbar sind, da diese lineare

DNA mittels doppelt-homologer Rekombination ins bakterielle Chromosom integrieren kann

(Niaudet et al., 1985).

Gram-negative Enterobacteriaceae wie z.B. E. coli und S. enterica hingegen können nicht mit

linearen DNA-Fragmenten transformiert werden, da die Exonuklease V des zelleigenen

RecBCD Rekombinationskomplexes diese im Cytoplasma abbaut (Lorenz und Wackernagel,

1994; Court et al., 2002). Für diese Organismen wurden daher alternative Strategien

entwickelt, chromosomale Gen-Modifikationen, -Insertionen und -Deletionen zu generieren

(Hamilton et al., 1989; Metcalf et al., 1996; Link et al., 1997). All diese Methoden stellen

jedoch Plasmid-basierte Systeme dar und sind daher im Laboralltag für globale Mutagenese-

Studien an einem Organismus sehr arbeits- und kostenintensiv.

Murphy entwickelte ein System unter Nutzung von Komponenten des

Rekombinationssystems des Bakteriophagen λ, welches erlaubt, lineare DNA-Fragmente

gezielt mittels homologer Rekombination ins Genom von E. coli zu integrieren (Murphy,

EINLEITUNG

- 9 -

1998). Zur Integration wurden zur Genomsequenz identische Bereiche von 900 bp bis 1200

bp auf den DNA-Fragmenten benötigt. Die Weiterentwicklung dieser Strategie durch

Datsenko und Wanner erlaubte es, lineare PCR-Fragmente, die flankierend über mindestens

36 bp Sequenzidentität zum Genom verfügen, in E. coli chromosomal zu integrieren

(Datsenko und Wanner, 2000). Dieses so genannte „λ Red System“ und darauf basierende

Applikationen konnten bisher erfolgreich in E. coli (Datsenko und Wanner, 2000),

enterohaemorrhagischen (EHEC) und enteropathogenen (EPEC) E. coli Stämmen (Murphy

und Campellone, 2003), S. enterica (Uzzau et al., 2001; Husseiny und Hensel, 2005), Yersinia

pseudotuberculosis (Derbise et al., 2003), sowie Klebsiella aerogenes (Janes et al., 2001)

angewandt werden. Zur Charakterisierung von Genen unbekannter Funktion wurden λ Red

vermittelt gerichtete chromosomale Gen-Deletionen generiert. Darüberhinaus konnten Gene

sequenzspezifisch modifiziert bzw. markiert werden, um Translationsfusionen zu erzeugen

(Uzzau et al., 2001; Court et al., 2002).

Gerichtete Mutagenesestudien in einem prokaryotischen Organismus mittels des „λ Red

Systems“ setzen jedoch voraus, dass die DNA-Sequenz des zu modifizierenden bzw. zu

deletierenden Gens bekannt ist, da die sequenzspezifische Mutagenese durch Integration über

sequenzhomologe DNA-Abschnitte erfolgt. Somit bedarf es genauer Kenntnisse über die

betreffende Gensequenz; im Idealfall ist die Sequenz des kompletten Genoms bekannt.

2.4.2 Ungerichtete Mutagenese basierend auf Tn5-Transposons

Transposons sind mobile genetische Elemente, die von einer genomischen Donor-Stelle an

einen neuen Ort im Genom springen können. Genetische Reorganisation durch

intragenomische Transposition wurde erstmals 1950 von McClintock bei Zea mays

beschrieben (McClintock, 1950), wobei in den darauf folgenden Jahren verschiedenste

transponierbare genetische Elemente auch bei Prokaryoten gefunden wurden. Eine

Transposon-Klasse stellen Elemente dar, die direkt von DNA in DNA transponieren können

und u.a. für Resistenz-vermittelnde Proteine kodieren. Zu dieser Gruppe von Transposons

zählen u. a. die bakteriellen Elemente Tn5 und Tn10.

Durch ihre genetische Mobilität und die Möglichkeit auf Selektion von Integranten wurden

Transposons wie Tn5 (Goryshin und Reznikoff, 1998), aber auch Tn7 (Biery et al., 2000) und

Tc1/mariner (Lampe et al., 1996) in vielen prokaryotischen und eukaryotischen Organismen

für globale Transpositionsmutagenesen genutzt, um z.B. genomische Kartierungen

EINLEITUNG

- 10 -

vorzunehmen und randomisiert Gene durch Transposon-Insertionen zu inaktivieren, um

Bibliotheken von Deletionsmutanten zu generieren. So konnten in Mycoplasma genitalium

mit Hilfe einer globalen in vivo Transposonmutagenese nicht-essentielle Gene identifiziert

werden, um für einen prokaryotischen Organismus ein mögliches Minimalgenom zu

definieren (Hutchison et al., 1999). Darüber hinaus konnten transponierbare Elemente, wie

z.B. Tn5tac1 (Chow und Berg, 1988), Tn5-araPBAD (Serina et al., 2004), InsTetG+ (Bertram et

al., 2005) und InsTetG-1 (Köstner et al., 2006) konstruiert werden, die Elemente des Tn5-

Transposons benutzen. Mit diesen Insertionselementen konnten durch randomisierte

Mutagenesen in das Genom von B. subtilis, S. enterica bzw. E. coli regulierbare Promotoren

wie z.B. Ptac, araPBAD, Pxyl/tet oder PtetA integriert werden, um regulierbare

Transkriptionsfusionen mit Zielgenen zu erzeugen. So wurden essentielle Gene in diesen

Stämmen identifiziert, deren Repression zu einem konditional letalen Phänotyp führt. Ebenso

wurden Transposons auf Basis von Mos1 mariner konzipiert, mit deren Hilfe in vivo und in

vitro Gene des parasitischen Protozoen Leishmania mit einem Reportergen markiert wurden,

um chromosomal kodierte GFP-Fusionsproteine zu erzeugen (Goyard et al., 2001). In S.

cerevisiae wurde mit diesen Transposon-basierten Mutagenesestudien eine Bibliothek an

Stämmen generiert, die chromosomal kodierte LacZ-Fusionsproteine exprimieren (Ross-

Macdonald et al., 1999).

Transposons wie Tn5 oder Tn10 besitzen endständig typischerweise je eine so genannte

invertierte Sequenzwiederholung (IS; insertion sequence) und kodieren in cis das Enzym

Transposase, das den Transpositions-Prozess katalysiert. Zusätzlich beinhalten diese

Transposons Gene, die Resistenz gegenüber Antibiotika wie Kanamycin, Bleomycin und

Streptomycin bzw. Tetrazyklin hervorrufen (Ason und Reznikoff, 2004; Chopra, 1986).

Die auf dem Tn5 Transposon kodierte Transposase vermittelt, durch die Bindung an eine 19

bp lange DNA-Erkennungssequenz an den äußeren Enden der IS50-Elemente, die Exzision

des gesamten Transposons von der Donor-Stelle unter Bildung eines synaptischen Komplexes

und dessen Integration an einer anderen Stelle im Genom. Bei der Integration der

transponierten DNA in Ziel-DNA entsteht beiderseits der Integrationsstelle eine 9 nt lange

einzelsträngige DNA-Sequenz, die vom zelleigenen DNA-Reparatursystem in

doppelsträngige DNA überführt wird (Reznikoff, 2003). Man spricht hierbei vom so

genannten konservativen „Schnitt-und-Klebe“ (cut and paste) Transpositions-Prozess

(Reznikoff et al., 1999; Reznikoff, 2003; Steiniger-White et al., 2004).

EINLEITUNG

- 11 -

Hier ist besonders die Fähigkeit von Tn5-Transposomen für genomweite Anwendungen von

Bedeutung, nahezu sequenzunspezifisch in Ziel-DNA zu inserieren (York et al., 1998;

Goryshin et al., 1998; Hoffman et al., 2000). Dies hat darüber hinaus den Vorteil, dass für

Applikationen mit Transposomen keinerlei Informationen über die Sequenz der Ziel-DNA

vorliegen müssen, was den Einsatz von Tn5 Transposomen bei Organismen ermöglicht, deren

Genome noch nicht sequenziert sind.

Eine Schwierigkeit bei Transpositionsmutagenesen stabile Mutantenstämme zu generieren,

stellt die inhärente Mobilität der Elemente durch die in cis kodierte Transposase auf den

Elementen dar, die für Tn5 eine in vivo Transpositionfrequenz von 10-4 bis 10-5 je Zelle

vermittelt (York et al., 1998; Reznikoff, 2003).

Um diese Instabilität bei in vivo Transpositionen zu vermeiden, wurde für Mutagenesestudien

das Tn5-Transposon gerichtet so modifiziert und minimiert, dass es nicht mehr für die

Transposase kodiert und nur noch über einen Resistenzmarker und die für die

Transpositionsreaktion notwendigen 19 bp langen Bindestellen der Transposase verfügt. Die

Tn5-Transposase wird hingegen in trans auf einem temperatursensitiven Plasmid exprimiert,

das nach erfolgter Transpositionsreaktion eliminiert werden kann.

Eine weitere Strategie für Mutagenesen stellt die in vitro Transposition dar, wobei hier nach

in vitro Integration des Transposons in die Ziel-DNA, diese modifizierte DNA durch

homologe Rekombination, z.B. mittels des „λ Red Systems“, in das Genom des Organismus

eingebaut werden muss (Kang et al., 2004).

Die Arbeitsgruppe um William S. Reznikoff in Madison, Wisconsin, USA konnte ein

hocheffizientes in vivo Insertionssystem für globale Mutagenesestudien etablieren, das die

Vorteile der beiden oben genannten Strategien nutzt. Die Methode basiert auf Elementen des

Tn5 Transposons und erlaubt die Sequenz-unspezifische Integration eines beliebigen DNA-

Fragments in Ziel-DNA. Bei dieser Variante der Transposonmutagenese wird in vitro der

Transposomenkomplex aus inserierbarer DNA und Tn5-Transposase gebildet, anschließend

mittels Elektroporation in die Zielzellen eingebracht, wo die Sequenz-unspezifische

Integration in die Ziel-DNA in vivo erfolgt (Goryshin et al., 2000). Die in vitro Bildung des

Transposomenkomplexes hat den Vorteil, dass das DNA-Element keine Transposase kodieren

muss, wodurch nach erfolgter Integration das DNA-Element stabil im Genom der Zielzelle

verbleibt.

EINLEITUNG

- 12 -

Durch gerichtete Modifizierung der Aminosäuresequenz der Tn5-Transposase wurde eine

hyper- und transaktive Version generiert, die drei Aminosäureaustausche beinhaltet (E54K,

M56A und L372P) und die Transpositionsaktivität um mehrere Zehnerpotenzen steigert

(Goryshin und Reznikoff, 1998; York et al., 1998). Zusätzlich wurden die 19 bp langen,

spezifischen Erkennungs- und Bindesequenzen der Tn5-Transposase für die Bindung der

hyper- und transaktiven Tn5-Transposase optimiert. Die resultierenden Erkennungssequenzen

wurden Mosaik Elemente (ME) genannt (Zhou et al., 1998).

Das zu mobilisierende DNA-Element muss für die in vitro Komplexbildung nur von zwei ME

flankiert sein. Weiterhin kann es einen Resistenzmarker beinhalten, um bei

Mutagenesestudien auf genomische Insertionsmutanten zu selektieren. Grundsätzlich ist

jedoch für die Bildung des synaptischen Komplexes und den Transpositions-Prozess die

zwischen den ME liegende Sequenz nicht von Bedeutung (Abb. 2.1A-B) (Goryshin et al.,

2000).

Abb. 2.1: Schematische Darstellung sowie dreidimensionale Röntgen-Kristallstruktur eines Tn5-Transposoms. (A) Schematische Darstellung. Die ME sind als schwarze Dreiecke dargestellt, die Tn5-Transposase als grauer Kreis. (B) Dreidimensionale Struktur eines Tn5-Transposoms, basierend auf einer Röntgen-Kristallstrukturanalyse (Davies et al., 2000). Die DNA ist in violett dargestellt, die zwei Moleküle Tn5-Transposase sind in gelb und rot abgebildet. Die Abbildung wurde von Epicentre® Biotechnologies, Madison, Wisconsin, USA übernommen.

Mit Hilfe dieser Methode wurden ungerichtete und globale Mutagenesestudien bereits bei 26

verschiedenen Gram-negativen Prokaryoten, wie z.B. E. coli, S. enterica, Proteus vulgaris,

Pseudomonas sp., Rickettsia prowazekii durchgeführt (Hoffman et al., 2000; Goryshin et al.,

2000; Qin et al., 2004; Serina et al., 2004; Winterberg et al., 2005; Köstner et al., 2006), wie

A B ME

SynaptischerKomplex

(Tn5-Transposom)

ME

beliebige DNA-Sequenz

hyper- und transaktive Tn5-

Transposase

19 bp19 bp

EINLEITUNG

- 13 -

auch bei zehn Gram-positiven Arten wie u.a. B. subtilis, Mycobacterium avium und

Corynebacterium diptheriae (Bertram et al., 2005; Laurent et al., 2003; Oram et al., 2002).

Eine vollständige Liste aller mit dieser Methode mutierten Organismen findet sich bei

Epicentre® Biotechnologies, Madison, Wisconsin, USA unter www.epibio.com/transcite.asp.

2.5 Das Tet System und die Einsatzmöglichkeit TetR regulierbarer

Reporterkonstrukte

In dreizehn bisher gefundenen Resistenzdeterminanten aus Gram-negativen und Gram-

positiven Bakterien wird die Transkription von tetA, das das Protein TetA kodiert, durch das

Tet Repressor Protein (TetR) reguliert (Berens und Hillen, 2004; Agerso und Guardabassi,

2005). Die am besten charakterisierte Tc-Resistenzdeterminante, die über einen TetA/TetR

Regulationsmechanismus verfügt, befindet sich auf dem Transposon Tn10.

Das Protein TetA vermittelt Resistenz gegenüber dem Antibiotikum Tetrazyklin (Tc) und

stellt einen in der Zellmembran verankerten Antiporter dar (Yamaguchi, 1992), der die aktive

Ausschleusung von Tc aus dem Cytoplasma vermittelt und dessen Expression einer

stringenten Regulation durch TetR auf DNA-Ebene unterliegt.

Studien zeigten, dass die Expression von TetA in Abwesenheit von Tc streng reprimiert ist, da

eine konstitutive Bildung von TetA zu einem Wachstumsnachteil führt und eine

Überexpression sogar toxisch auf die Zellen wirkt. Eckert und Beck erkannten als Grund

hierfür einen unregulierten Kationentransport durch TetA, der zum Zusammenbruch des

Membranpotentials führt (Eckert und Beck, 1989).

In Gegenwart des Antibiotikums Tc bedarf es der Expression von TetA, damit die

intrazelluläre Konzentration an Tc kein Niveau erreicht, das einen hemmenden Einfluss auf

die Proteinbiosynthese hat.

TetR reguliert auf Grund dieser beiden Grundbedingungen stringent die Expression von TetA.

Einerseits bindet TetR in seiner nativen Form hochspezifisch an seiner DNA-Operatorsequenz

tetO (Berens et al., 1992) und reprimiert effektiv die Expression von TetA, andererseits

besitzt TetR gegenüber dem Effektor Tc eine hohe Affinität, um möglichst sensitiv die

Induktion der TetA Expression zu gewährleisten. Tc vermittelt hierbei eine Konformations-

Änderung von TetR, so dass TetR von tetO dissoziiert und die Expression von TetA

ermöglicht wird (Orth et al., 2000; Lederer et al., 1996).

EINLEITUNG

- 14 -

Auf Grund dieser stringenten Regulationseigenschaften eignen sich die regulatorischen

Elemente des Tetrazyklin-Resistenz-Operons aus Tn10 für heterologe Expressionssysteme

(Hillen und Berens, 1994). Das so genannte Tet System ist das meistgenutzte regulatorische

System zur konditionalen Genexpression in Eukaryoten (Berens und Hillen, 2003). In

Prokaryoten belaufen sich die Einsatzmöglichkeiten von Tet Regulatoren nicht nur auf Gram-

negative Organismen, wie z.B. Enterobacteriaceae, in denen Tetrazyklin-Resistenz-

Determinanten häufig vorkommen (Chopra und Roberts, 2001). Ebenso wurde im Gram-

positiven, GC-reichen Bakterium Corynebacterium glutamicum eine Resistenzdeterminante

dieses Typs gefunden (Tauch et al., 2000). Darüber hinaus wurden in weiteren GC-reichen

Gattungen wie Mykobakterien und Streptomyceten (Ehrt et al., 2005; Rodriguez-Garcia et al.,

2005), sowie auch in GC-armen Arten wie B. subtilis, Staphylococcus aureus und

Streptococcus pneumoniae Tet-regulierte Systeme etabliert (Geissendörfer und Hillen, 1990;

Bateman et al., 2001). So kann bei Prokaryoten auf eine generelle Einsatzmöglichkeit des Tet

Systems geschlossen werden.

Das Tet System wird daher u.a. für die Tetrazyklin gesteuerte Expression von plasmidständig

oder chromosomal kodierten luc-, lacZ- oder gfp- Reporterkonstrukten zur Anwendung

gebracht (Lutz und Bujard, 1997; Scholz et al., 2000).

2.6 Das Transkription induzierende Peptid Tip als alternativer TetR

Induktor

Klotzsche et al. identifizierten in einem in vitro Selektionsansatz in Form eines „Phage

Display“ (Kay et al., 2001) Hexadecapeptide die spezifisch an TetR binden (Klotzsche et al.,

2005). Um zu überprüfen, ob diese Hexadecapeptide auch in vivo die Induktion von TetR

vermitteln, wurden sie C-terminal bzw. N-terminal an das Trägerprotein Thioredoxin A

fusioniert (Klotzsche et al., 2005).

Thioredoxin A (TrxA) aus E. coli ist ein 11 kDa großes und hochlösliches, cytoplasmatisches

Protein, das die Aufrechterhaltung des intrazellulären Redoxniveaus vermittelt. Auf Grund

vorhandener Strukturdaten (Katti et al., 1990) und seiner solvensexponierten C- bzw. N-

Termini wurde TrxA schon in anderen Studien als Trägerprotein für Peptid-Fusionen gewählt

(Park und Raines, 2000; Colas et al., 1996).

Als in vivo Reportersystem zur Analyse der TetR-Induktion durch diese Fusionsproteine,

wurde eine unter TetR-Kontrolle stehende tetA-lacZ-Transkriptionsfusion verwendet (Smith

EINLEITUNG

- 15 -

und Bertrand, 1988), wobei die gemessene Aktivität der β-Galaktosidase als Maß für die

Induktion galt (Klotzsche et al., 2005) (Abb. 2.2C1-C2). Für eines dieser Hexadecapeptide

konnte in vivo gezeigt werden, dass es sowohl als C-, als auch als N-terminale Fusion an

TrxA in vivo TetR der Klasse B induzieren kann (Klotzsche et al., 2005). Dieses Peptid wurde

Tip (transcription inducing peptide) genannt (Abb. 2.2A-B).

Hexadecapeptid Tip

W-T-W-N-A-Y-A-F-A-A-P-S-G-G-G-S

In vitro selektierte M13-Linker- Sequenz Sequenz

Abb. 2.2: Sequenz und Struktur des Hexadecapeptids Tip sowie schematische Darstellung der Transkriptionsinduktion durch ein Tip-Fusionsprotein. (A) Sequenz des Hexadecapeptids Tip. Aminosäuren sind im Ein-Buchstaben-Code angegeben und vom N-Terminus aus aufsteigend nummeriert. Aminosäuren 1 bis 12 stellen die mittels „Phage Display“ in vitro selektierte Sequenz dar, Aminosäuren 13 bis 16 die Linker-Sequenz des M13-Phagen. (B) Struktur des Hexadecapeptids Tip (Y. Muller, Erlangen; nicht veröffentlicht; Auflösung 2,5 Å). Die Aminosäuren sind vom N-Terminus aus aufsteigend nummeriert. (C1 und C2) Schematische Darstellung der Transkriptionsinduktion eines unter TetR-Kontrolle stehenden Reportergens durch das TrxA-Tip Fusionsprotein. Der Eckpfeil stellt den Promotor dar, der weiße Pfeil das Reportergen und der schwarze Pfeil die transkribierte mRNA. Die TetR Operatorsequenz tetO ist als schwarze Box dargestellt. (C1) TetR reprimierter Zustand. (C2) Induzierter Zustand in Gegenwart von TrxA-Tip.

In darauf folgenden Studien konnte die Induzierbarkeit von TetR durch weitere C-terminal

bzw. N-terminal Tip-markierte Proteine aus E. coli (SbmC) und Salmonella enterica (HPr,

TrxA und SspHI) in vivo nachgewiesen werden (Klotzsche, 2005; Capek, 2005; Friedlein,

2006; Gebert, 2006).

A B

1

3

11

8

6

12

2 4

5

7 9

10

1 3 11 8 6 12 2 4 5 7 9 10 13 16 14 15

tetO Reportergen

TetR

tetO Reportergen

TetR

tetO Reportergen

mRNA

TetR

tetO Reportergen

mRNA

TetR

C1 C2

TrxA-Tip

C-Term.

N-Term.

EINLEITUNG

- 16 -

Die Fähigkeit verschiedener C- bzw. N-terminaler Tip-Fusionsproteine TetR Induktion in vivo

zu vermitteln, eröffnet die Möglichkeit, das Hexadecapeptid Tip als universelles

Peptidanhängsel zu nutzen und so mittels eines TetR regulierten Reporterkonstruktes die

Expression eines beliebigen Tip-Fusionsproteins in vivo qualitativ nachzuweisen und zu

quantifizieren.

2.7 Ziel der Arbeit

Ziel dieser vorliegenden Arbeit war die Entwicklung einer Methode, unter Nutzung eines

genetischen Elements Informationen über das Proteom eines Prokaryoten in vivo zu erlangen.

Die Idee beruht auf der Erzeugung von chromosomal kodierten Fusionsproteinen, die mit dem

kurzen Hexadecapeptid Tip markiert sind (Klotzsche et al., 2005). Dies sollte zum einen

mittels eines Insertionselementes erfolgen, das Transposase-vermittelt sequenzunspezifisch in

das Genom von E. coli integriert.

In einem weiteren Projekt sollte ein Rekombinationselement aufgebaut werden, das es erlaubt,

Gene in prokaryotischen Genomen gerichtet am 5´-Ende mit der Tip-kodierenden Sequenz zu

markieren, um N-Terminale Tip-Fusionsproteine zu erzeugen.

Mit Hilfe der TetR induzierenden Eigenschaften von Tip sollte die Expression der Tip-

Fusionsproteine durch ein von TetR reguliertes Reportergen detektiert werden. Dies würde

die Möglichkeit eröffnen, die Proteinexpression qualitativ und quantitativ in vivo zu

analysieren.

ERGEBNISSE

- 17 -

3. Ergebnisse

3.1 Konstruktion von Insertionselementen zur ungerichteten Erzeugung

von chromosomal kodierten C-terminalen Tip-Fusionsproteinen

Mittels ungerichteter Mutagenese eines prokaryotischen Genoms sollte eine Kollektion an

Mutanten-Stämmen erzeugt werden, die C-terminale Tip-Fusionsproteine an ihrem endogenen

Lokus exprimieren. Die Mutanten sollten durch ein Insertionselement generiert werden, das

Transposase-vermittelt ungerichtet ins Genom integriert.

Ungerichtete Mutagenesen unter Nutzung von Insertionslementen, die auf dem Tn5-

Transposon basieren, wurden bereits erfolgreich und effizient bei einer Vielzahl von

Prokaryoten, wie z.B. E. coli, Salmonella enterica, Proteus vulgaris, Pseudomonas sp.,

Rickettsia prowazekii und Bacillus subtilis, durchgeführt (Hoffman et al., 2000; Goryshin et

al., 2000; Qin et al., 2004; Serina et al., 2004; Bertram et al., 2005; Köstner et al., 2006).

Unter Nutzung der hyper- und transaktiven Tn5-Transposase (Goryshin und Reznikoff, 1998)

können bei E. coli hohe Insertionsraten von 8,4 x 106 pro µg eingebrachter DNA erreicht

werden (Hoffman et al., 2000) und die Sequenz-unspezifische Integration in Ziel-DNA

begünstigt ungerichtete Mutagenesestudien (Hoffman et al., 2000).

Für die in vitro Bildung von Tn5-Transposomenkomplexen (Goryshin et al., 2000) und deren

Integration in DNA muss ein Insertionselement von zwei 19 bp langen Mosaik Elementen

flankiert sein, die die spezifischen Erkennungs- und Bindesequenzen der hyper- und

transaktiven Tn5-Transposase darstellen (Zhou et al., 1998; Goryshin et al., 2000; Reznikoff,

2003).

Darüber hinaus muss das Insertionselement zusätzlich über eine Resistenzdeterminante

verfügen, um nach Tn5-Transposase-vermittelter Insertion auf Stämme mit einer Integration

des Elements im Genom selektieren zu können. Hierbei zeigen Gene wie cat oder aphAIII, die

Resistenz gegenüber Chloramphenicol bzw. Kanamycin vermitteln, speziesübergreifende

Anwendbarkeit. Für eine Kanamycin-Resistenzkassette z.B., die das Gen aphAIII beinhaltet,

konnte gezeigt werden, dass sie Resistenz sowohl in Gram-negativen, als auch in Gram-

positiven Bakterien vermittelt (Guérout-Fleury et al., 1995).

Die Integration des Elements ins prokaryotische Genom erfolgt statistisch, z.B. bei E. coli, in

87,8% der Fälle in den offenen Leserahmen eines Gens (orfX) (Blattner et al., 1997). Inseriert

ERGEBNISSE

- 18 -

hierbei, mit einer Wahrscheinlichkeit von 16,6%, das Element zufällig in der richtigen

Orientierung in das richtige Leseraster, entsteht ein durchgehender Leserahmen, der die Tip-

kodierende Sequenz, die auf dem Insertionselement lokalisiert ist, mit dem endogenen

Leserahmen des markierten Gens verbindet. Diese Insertionsmutante exprimiert das Tip-

markierte Fusionsprotein vom natürlichen chromosomalen Lokus.

Abb. 3.1: Schematische Darstellung der Erzeugung markierter Gene durch ungerichtete Integration eines Insertionselements. (A) Genomische Situation vor der Insertion (B) Genomische Situation der Insertionsmutante. Insertionselement: Schwarze Dreiecke stellen die Mosaik Elemente dar, der graue Balken die Tip-kodierende Sequenz, der weiße Balken den Resistenzmarker. Genom: Der Eckpfeil stellt den endogenen Promotor dar, der graue Pfeil das Gen orfX und der schwarze Pfeil den durchgehenden Leserahmen (orf bzw. 3´-markierter orf). Das Protein OrfX und das Tip-Fusionsprotein OrfX-Tip sind schematisch gezeigt.

Um strukturelle Beeinträchtigungen des markierten Proteins durch den Fusionsanteil

möglichst zu minimieren, sollte die Tip-kodierende Sequenz direkt an das 3´-Ende eines ME

kloniert werden, so dass der durchgehende Leserahmen eines markierten Gens über die

Nukleotidsequenz des ME direkt mit der Tip-kodierenden Sequenz verbunden ist. Der offene

Leserahmen endet mit einem Stopcodon am 3´-Ende der Tip-kodierenden Sequenz (Abb. 3.1).

Von diesem allgemeinen Aufbau leiten sich die folgenden zwei Konzepte ab. Zum einen

sollte ein Insertionselement konzipiert werden, das es ermöglicht, Integranten direkt zu

selektieren, die Tip-Fusionsproteine exprimieren. Ein weiteres Insertionselement wurde so

aufgebaut, dass nur auf genomische Integration des Elements selektiert wird. Aus der

Insertionselement

Genom

Wildtyp orfX

OrfX

SS

orf

Resistenzmarker

Integration

Genom

markierter Stamm

3´-markierter orf

orfX

OrfXOrfX

SS

Tip

A

B

ERGEBNISSE

- 19 -

Kollektion an beliebigen Insertionsmutanten sollen anschließend Stämme isoliert werden, bei

denen mit Hilfe eines TetR regulierten Reporterkonstrukts die Gegenwart von Tip-

Fusionsproteinen nachgewiesen werden kann.

3.2 Architektur und Funktionsprinzip eines Suppressor-basierten

Insertionselements

Nach der Transposase-vermittelten, unspezifischen Integration des Insertionselements in das

Genom muss eine Selektion auf Kandidaten gewährleistet werden können, die das

Insertionselement tragen. Zusätzlich war von Interesse, aus der zu erwartenden Anzahl von

Insertionsmutanten (8,4 x 106 Mutanten pro µg eingebrachter DNA; Hoffman et al., 2000)

speziell diejenigen gezielt zu selektieren, bei denen die Insertion in ein Gen erfolgte, das

transkribiert wird und das Tip-Fusionsprotein exprimiert.

Abb. 3.2: Schematische Darstellung des Funktionsprinzips des Suppressor-basierten Insertionselements nach ungerichteter Integration. Insertionselement: Schwarze Dreiecke stellen die Mosaik Elemente dar, der graue Balken die Tip-kodierende Sequenz, der weiße Pfeil das Gen cat. Genom: Der Eckpfeil stellt den endogenen Promotor dar, der graue Pfeil das Gen orfX und der schwarze Pfeil den durchgehenden Leserahmen (3´-markierter orf). (A) Expression des Volllängen-Fusionsproteins OrfX-ME-Tip-Cat in Gegenwart einer Suppressor-tRNA. (B) Expression des C-terminal markierten Fusionsproteins OrfX-ME-Tip in Abwesenheit einer Suppressor-tRNA. Das jeweilige Fusionsprotein und die Suppressor-tRNA sind schematisch dargestellt.

orfX

OrfX

S cat

Cat

sup:tRNA

orfX

OrfXOrfX

S cat

Cat

sup:tRNA

orfX

OrfX

S catorfX

OrfXOrfX

S cat

A

B

OrfX-ME-Tip-Cat

OrfX-ME-Tip

ERGEBNISSE

- 20 -

Um dies zu ermöglichen, beinhaltete das Insertionselement als Selektionsmarker das Gen cat,

welches für die Chloramphenicol-acetyl-transferase (Cat) kodiert. Der offene Leserahmen von

cat schließt direkt über eine Ala-Ser-Gly-kodierende Sequenz an das 3´-Ende der Tip-

kodierenden Sequenz an und wird nur durch ein TAG-Stopcodon vom durchgehenden

Leserahmen der ME-Tip-kodierenden Sequenz getrennt. Das Methionin-Startcodon der

Chloramphenicol-acetyl-transferase wurde gerichtet gegen ein Alanin-Codon ausgetauscht,

um die unabhängige Expression des Resistenzgens auszuschließen (Abb. 3.2).

Erfolgt die Integration des so konzipierten Insertionselements in einen transkribierten offenen

Leserahmen (orfX), steht die Transkription des Resistenzgens (cat) unter Kontrolle des

endogenen Promotors, der die mRNA des Tip-markierten Fusionsproteins exprimiert (Abb.

3.2).

Für die effiziente Translation der Chloramphenicol-acetyl-transferase ist die Anwesenheit

einer Suppressor-tRNA (sup:tRNA) nötig, damit die Synthese des C-terminalen OrfX-Tip-

Fusionsproteins nicht am TAG-Stopcodon der mRNA abbricht, sondern auch die

Chloramphenicol-acetyl-transferase als Untereinheit des Fusionsproteins synthetisiert wird.

Die Nutzung einer Suppressor-tRNA zur Erzeugung eines Fusionsproteins, das die Resistenz

vermittelt, stellt einen elementaren Bestandteil dieser Selektions-Strategie dar. Nach diesem

Verfahren werden nur Mutantenstämme selektiert, die tip-markierte Gene exprimieren und in

Gegenwart einer sup:tRNA die Resistenz-vermittelnde Chloramphenicol-acetyl-transferase

als Untereinheit des Tip-Fusionsproteins synthetisieren (Abb. 3.2A).

Da nach der Selektion der Mutantenstämme die enzymatische Funktion der Chloramphenicol-

acetyl-transferase nicht mehr benötigt wird und ausschließlich die TetR induzierende

Aktivität des Tip-markierten Fusionsproteins erwünscht ist, sollte die Expression der

sup:tRNA auf einem temperatursensitiv replizierenden Plasmid erfolgen, dass nach erfolgter

Selektion eliminiert werden kann (Abb. 3.2B). Diese Suppressionskontrolle zur Generierung

C-terminaler Tip-Fusionsproteine ist entscheidend, da bisher keine Protein-internen, aktiven

Tip-Fusionen gefunden wurden (Klotzsche et al., 2005).

ERGEBNISSE

- 21 -

3.2.1 Überprüfung der TetR Induktionsfähigkeit eines C-terminalen Peptidanhängsels

im Kontext eines Insertionselements

Zuerst musste überprüft werden, ob das Hexadecapeptid Tip als C-terminale Proteinfusion

weiterhin TetR Induktion vermittelt, wenn Tip, nicht wie bei Klotzsche et al. über die Ser-

Gly-Gly-Ala Sequenz an den C-Terminus eines Proteins fusioniert ist, sondern über die von

einem Mosaik Element kodierte Sequenz.

Abb. 3.3: Schematische Karte des Plasmids pWH1384, sowie des Fusionsproteins TrxA-ME-Tip bzw. TrxA-ME-Tip-Cat. Das Gen trxA ist als grauer Pfeil gekennzeichnet, das Mosaik Element als schwarzes Dreieck, die Tip-kodierende Sequenz als graues Rechteck. „S“ kennzeichnet das TAG-Stopcodon. Das schwarze Quadrat stellt die Ala-Ser-Gly-Sequenz dar, der weiße Pfeil das cat Gen. Die weiße Box repräsentiert die Ampicillin-Resistenzkassette (ApR). Der Replikationsursprung (pMB1) ist als graue Box dargestellt. (B1) Fusionsprotein TrxA-ME-Tip. (B2) Fusionsprotein TrxA-ME-Tip-Cat. Aminosäuren sind im Ein-Buchstaben-Code angegeben. Der Aminoterminus ist mit H2N gekennzeichnet, der Carboxyterminus mit COOH. TrxA, Cat und Tip sind schematisch dargestellt.

Für die in vivo Funktionsanalyse wurde die Nukleotidsequenz von pWH2101 gerichtet

modifiziert, so dass die Sequenz zwischen trxA und der Tip-kodierenden Sequenz gegen die

19 bp eines Mosaik Elements ausgetauscht wurde. Nach erfolgter Translation verbindet die

Aminosäuresequenz Ala-Val-Ser-Tyr-Thr-His-Leu anstelle von Ala-Ser-Gly-Gly-Ala TrxA

mit Tip. Der durchgehende Leserahmen endet mit einem TAG-Stopcodon. Das resultierende

Plasmid wurde pWH1384 genannt und exprimiert unter Kontrolle von Ptac das C-terminale

Fusionsprotein TrxA-ME-Tip, das 131 AS umfasst (Abb. 3.3). Zusätzlich wurde das cat Gen,

wie oben beschrieben, stromabwärts des TAG-Stopcodons an das 3´-Ende der TrxA-ME-Tip-

kodierenden Sequenz kloniert. Die Klonierungsstrategie von pWH1384 ist in Kap. 5.1.10

dargestellt.

AVSYTHLTip

COOHH2N TrxATrxA

B1

A

ApR

pMB

1

pWH13845256 bp

trxA

Ptac

S

ApR

pMB

1

pWH13845256 bp

trxA

Ptac

S

B2 AVSYTHL

TipH2N TrxATrxA CatCatXASGA COOH

sup:tRNA

sup:tRNA+-

ERGEBNISSE

- 22 -

Um zu überprüfen, ob das neu konzipierte C-terminale Fusionsprotein TrxA-ME-Tip, wie

TrxA-Tip, TetR induzierende Eigenschaften vermittelt, wurde der Stamm E. coli

WH207(λtet50) mit pWH527 und pWH1384 cotransformiert. pWH527 exprimiert TetR

konstitutiv auf niedrigem Niveau (Klotzsche et al., 2005). Die Analyse der TetR-

Induktionsfähigkeit von TrxA-ME-Tip erfolgte mittels β-Galaktosidase Aktivitätsmessung

(siehe Kap. 5.4.8). Als Kontrollansatz wurde WH207(λtet50) mit dem Plasmid pWH2101

anstelle von pWH1384 transformiert, welches das TetR induzierende C-terminale

Fusionsprotein TrxA-Tip exprimiert (Klotzsche et al., 2005). Als Repressions- bzw.

Aktivitäts-Kontrolle wurde das Plasmid pWH806 mitgeführt, wobei die Induktion von TetR

hier mit 100 nM Tc erfolgte.

Abb. 3.4: Vergleich (A) der Induktion von TetR durch TrxA-Tip und TrxA-Me-Tip und (B) der Expressionsniveaus von TrxA-Tip und TrxA-ME-Tip mittels Western Blot Analyse. (Α) TetR wird von pWH527 exprimiert. TrxA-Tip ist auf pWH2101, TrxA-ME-Tip auf pWH1384 kodiert. Die Induktion von Ptac erfolgte mit 60 µM IPTG (schwarze Balken). pWH806 wurde als Repressions- (linker weißer Balken) und Induktions-Kontrolle (grauer Balken; 100 nM Tc) mitgeführt. Die Messung wurde in E. coli WH207(λtet50) bei 28°C durchgeführt. Die Aktivität der β-Galaktosidase ist in Einheiten nach Miller [MU] (Miller, 1972) angegeben. (B) Das Expressionsniveau von TrxA-Tip bzw. TrxA-ME-Tip wurde mittels eines monoklonalen anti-ThioTM Antikörpers detektiert. Hierfür wurden 10 µg Proteinrohlysat je Spur aufgetragen. Die Rohlysate wurden aus den üTK für die β-Galaktosidase Aktivitätsmessung gewonnen. (-) in Abwesenheit von IPTG, (+) mit 60 µM IPTG. Die jeweilige Peptidlänge ist in [AS] angegeben, das Molekulargewicht in [kDa].

Die durchgeführten β-Galaktosidase Aktivitätsmessungen zeigen, dass bei einer IPTG

Konzentration von 60 µM TrxA-ME-Tip TetR nicht induziert, TrxA-Tip hingegen eine 12,4-

fach höhere β-Galaktosidase Aktivität vermittelt (Abb. 3.4A). Auch bei höheren IPTG

Konzentrationen (125, 250 und 500 µM) konnte keine Induktion von TetR durch

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

pWH2101 pWH1384pWH8060

2000

4000

6000

β-G

al. A

ktiv

ität [

MU

]

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

pWH2101 pWH1384pWH8060

2000

4000

6000

β-G

al. A

ktiv

ität [

MU

]

pWH2101 pWH1384pWH8060

2000

4000

6000

β-G

al. A

ktiv

ität [

MU

]

A B

TrxA-ME-Tip

131 AS; 14,1 kDa

pWH2101 pWH1384

TrxA-Tip

129 AS; 13,7 kDa

- - + +

ERGEBNISSE

- 23 -

TrxA-ME-Tip detektiert werden (Daten nicht gezeigt). Gleichzeitig durchgeführte Western

Blot Analysen (siehe Kap. 5.4.10) mittels eines monoklonalen anti-ThioTM Antikörpers

wiesen, im Vergleich zu TrxA-Tip, deutliche niedrigere Proteinmengen des Fusionsproteins

TrxA-ME-Tip unter einer IPTG Konzentration von 60 µM auf (Abb. 3.4B).

Um einen möglichen sterischen Einfluss der Aminosäuren des translatierten ME auf die TetR

induzierende Eigenschaft von Tip zu minimieren, wurde zwischen das ME und die Tip-

kodierende Sequenz die Nukleotidsequenz für einen sieben Aminosäure langen Linker mit der

Sequenz Ser-Gly-Gly-Ala-Gly-Gly-Ala integriert. Dies sollte den Abstand des

Peptidanhängsels zu den Aminosäuren des ME erhöhen und durch den Anteil kleiner und

flexibler Aminosäuren die mögliche sterische Beeinträchtigung von Tip minimieren (Abb.

3.5B). Das Plasmid wurde pWH1903 genannt und exprimiert unter Kontrolle von Ptac die C-

terminale Proteinfusion TrxA-InsTip1, die 138 AS umfasst. Die weiteren genetischen

Komponenten von pWH1903 entsprechen denen, die auf pWH1384 kodiert sind (Abb. 3.5A).

Die Klonierungsstrategie von pWH1903 ist in Kap. 5.1.10 dargestellt.

Abb. 3.5: Schematische Karte des Plasmids pWH1903 sowie des Fusionsproteins TrxA-InsTip1. (A) Das Gen trxA ist als grauer Pfeil, das ME als schwarzes Dreieck, die Aminosäuresequenz Ser-Gly-Gly-Ala-Gly-Gly-Ala ist als weißer und die Tip-kodierende Sequenz als grauer Balken dargestellt. „S“ kennzeichnet das TAG-Stopcodon. Das schwarze Quadrat stellt die Ala-Ser-Gly-Sequenz dar, der weiße Pfeil das cat Gen. Die weiße Box repräsentiert die Ampicillin-Resistenzkassette (ApR). Der Replikationsursprung (pMB1) ist als graue Box dargestellt. (B1) Fusionsprotein TrxA-InsTip1. (B2) Fusionsprotein TrxA-InsTip1-Cat. Aminosäuren sind im Ein-Buchstaben-Code angegeben. Der Aminoterminus ist mit H2N gekennzeichnet, der Carboxy-terminus mit COOH. TrxA, Cat und Tip sind schematisch dargestellt.

Der Stamm E. coli WH207(λtet50) wurde mit pWH527 und pWH1903 cotransformiert. Die

Analyse der TetR-Induktionsfähigkeit von TrxA-InsTip1 erfolgte mittels β-Galaktosidase

ApR

pMB

1

pWH19035277 bp

trxA

Ptac

S

ApR

pMB

1

pWH19035277 bp

trxA

Ptac

SS

AVSYTHLSGGAGGATip

COOHH2N TrxATrxA

A

B1

B2

sup:tRNAsup:tRNA

+-

AVSYTHLSGGAGGATip

COOHH2N TrxATrxA CatCatXASGA

ERGEBNISSE

- 24 -

Aktivitätsmessung (siehe Kap. 5.4.8). Parallel wurde das Plasmid pWH2101 transformiert,

welches das TetR induzierende C-terminale Fusionsprotein TrxA-Tip kodiert (Klotzsche et

al., 2005). Als Repressions- bzw. Aktivitäts-Kontrolle wurde das Plasmid pWH806

mitgeführt, wobei die Induktion von TetR hier mit 100 nM Tc erfolgte.

Mit IPTG Konzentrationen von 15 bis 500 µM wurde die Expression des jeweiligen

Fusionsproteins induziert. Die Expression von TrxA-Tip bzw. TrxA-InsTip1 in Gegenwart

von 15 µM IPTG führt schon zu einer Induktion von TetR, detektierbar durch die ca. 10-fach

bzw. ca. 7,5-fach erhöhte β-Galaktosidase Aktivität gegenüber dem TetR reprimierten

Zustand (ca. 238 MU). Ab einer Konzentration von 30 µM IPTG erreicht die β-Galaktosidase

Aktivität mit einer 13-fachen Steigerung ein Plateau bei ca. 3000 MU und spiegelt die

maximale TetR Induktion durch das Fusionsprotein TrxA-Tip wider, wohingegen durch

TrxA-InsTip1, kodiert auf pWH1903, die maximale β-Galaktosidase Aktivität erst bei ca. 250

µM IPTG erreicht wird (Abb. 3.6).

TrxA-InsTip1 vermittelt zwar das gleiche maximale TetR-Induktionsniveau wie Tip-TrxA,

allerdings bei deutlich höheren IPTG Konzentrationen.

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

pWH

806

pWH

806

+ 0,

05 µ

g/m

l Tc

pWH

2101

pWH

2101

+ 1

5 µM

IPT

G

pWH

2101

+ 3

0 µM

IPT

G

pWH

2101

+ 6

0 µM

IPT

G

pWH

2101

+ 1

25 µ

M IP

TG

pWH

2101

+ 2

50 µ

M IP

TG

pWH

2101

+ 5

00 µ

M IP

TG

pWH

2101

-ME

-Bs1

-x-C

mA

pWH

2101

-ME

-Bs1

-x-C

mA

+ 15

µM

IPT

G

pWH

2101

-ME

-Bs1

-x-C

mA

+ 30

µM

IPT

G

pWH

2101

-ME

-Bs1

-x-C

mA

+ 60

µM

IPT

G

pWH

2101

-ME

-Bs1

-x-C

mA

+ 12

5 µM

IPT

G

pWH

2101

-ME

-Bs1

-x-C

mA

+ 25

0 µM

IPT

G

pWH

2101

-ME

-Bs1

-x-C

mA

+ 50

0 µM

IPT

G

pWH

2101

-ME

-Bs1

-x-C

mA

sup:

tRN

A-G

ly(a

)pWH2101pWH806 pWH1903

β-G

al. A

ktiv

ität [

MU

]

0

2000

4000

6000

0 15 30 60 125 250 500 0 15 30 60 125 250 500

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

pWH

806

pWH

806

+ 0,

05 µ

g/m

l Tc

pWH

2101

pWH

2101

+ 1

5 µM

IPT

G

pWH

2101

+ 3

0 µM

IPT

G

pWH

2101

+ 6

0 µM

IPT

G

pWH

2101

+ 1

25 µ

M IP

TG

pWH

2101

+ 2

50 µ

M IP

TG

pWH

2101

+ 5

00 µ

M IP

TG

pWH

2101

-ME

-Bs1

-x-C

mA

pWH

2101

-ME

-Bs1

-x-C

mA

+ 15

µM

IPT

G

pWH

2101

-ME

-Bs1

-x-C

mA

+ 30

µM

IPT

G

pWH

2101

-ME

-Bs1

-x-C

mA

+ 60

µM

IPT

G

pWH

2101

-ME

-Bs1

-x-C

mA

+ 12

5 µM

IPT

G

pWH

2101

-ME

-Bs1

-x-C

mA

+ 25

0 µM

IPT

G

pWH

2101

-ME

-Bs1

-x-C

mA

+ 50

0 µM

IPT

G

pWH

2101

-ME

-Bs1

-x-C

mA

sup:

tRN

A-G

ly(a

)pWH2101pWH806 pWH1903

β-G

al. A

ktiv

ität [

MU

]

0

2000

4000

6000

0 15 30 60 125 250 5000 15 30 60 125 250 500 0 15 30 60 125 250 5000 15 30 60 125 250 500

Abb. 3.6: Vergleich der Induktion von TetR durch TrxA-Tip und TrxA-InsTip1.TetR wird von pWH527exprimiert. TrxA-Tip ist auf pWH2101, TrxA-InsTip1 auf pWH1903 kodiert. Die Induktion von Ptac erfolgte mit 15 - 500 µM IPTG (schwarze Balken).pWH806 wurde als Repressions-(linker weißer Balken) und Induktions-Kontrolle (grauer Balken; 100 nM Tc) mitgeführt.Die Messung wurde in E. coliWH207(λtet50) bei 28°C durchgeführt. Die Aktivität der β-Galaktosidase ist in Einheiten nach Miller [MU] (Miller, 1972) angegeben.

ERGEBNISSE

- 25 -

Abb. 3.7: Vergleich der Expressionsniveaus von TrxA-Tip und TrxA-InsTip1 mittels Western Blot Analyse. Das Expressionsniveau von TrxA-Tip bzw. TrxA-InsTip1 wurde mittels eines monoklonalen anti-ThioTM Antikörpers detektiert. Hierfür wurden 10 µg Proteinrohlysat je Spur aufgetragen. Die Rohlysate wurden aus den üTK der β-Galaktosidase Aktivitätsmessung gewonnen. Die jeweilige Peptidlänge ist in [AS] angegeben, das Molekulargewicht in [kDa].

Gleichzeitig durchgeführte Western Blot Analysen (siehe Kap. 5.4.10), bei denen die

Fusionsproteine durch einen monoklonalen anti-ThioTM Antikörper nachgewiesen wurden,

zeigten deutlich geringere Expressionsniveaus von TrxA-InsTip1 gegenüber TrxA-Tip in

Abhängigkeit der jeweiligen Ptac induzierenden IPTG Konzentration (Abb. 3.7).

3.2.2 Analyse der Suppressions-Effizienz und der Funktionalität des

Selektionsmarkers

Anschließend wurde überprüft, ob in Gegenwart einer Suppressor-tRNA das Volllängen-

Fusionsprotein TrxA-InsTip1-Cat translatiert wird und die Chloramphenicol-acetyl-

transferase Resistenz gegenüber Chloramphenicol vermittelt.

Daher wurde in das Plasmid pWH1903 eine Suppressionskassette integriert, die den

konstitutiven, synthetischen Promotor Plpp (Masson und Miller, 1986), das Gen glyU(AS*),

und den Transkriptions-Terminator TrrnC (Young, 1979) beinhaltet. glyU(AS*) kodiert für die

synthetische Suppressor-tRNA sup:tRNAGly deren Funktionalität von Normanly et al. gezeigt

wurde (Normanly et al., 1990) (Abb. 3.8A). Die Klonierungsstrategie von pWH1906 ist in

Kap. 5.1.10 dargestellt.

TrxA-Tip

129 AS; 13,7 kDa

TrxA-InsTip1

138 AS; 14,6 kDa

pWH2101 pWH1903

0 15 60 250 0 15 60 250

IPTG [µM]

ERGEBNISSE

- 26 -

A

B1

B2

WH207(λtet50)[pWH527] wurde mit pWH2101, pWH1903 bzw. pWH1906 transformiert.

Auf selektiven LB-Platten, die neben 60 µM IPTG und 30 µg/ml Kanamycin, steigende

Konzentrationen an Chloramphenicol (1, 3, 10, 30 bzw. 100 µg/ml Cm) enthielten, wurden

die Transformanten vereinzelt.

WH207(λtet50)[pWH527]

ohne IPTG mit 60 µM IPTG

Plasmid

Cm [µg/ml]

1

3

10

30

100

1

3

10

30

100

pWH2101

+

-

-

-

-

+

-

-

-

-

pWH1904 + - - - - ++ + - - -

pWH1906 ++ ++ + + - ++ ++ ++ ++ +

Tab. 3.1: Auflistung der minimal inhibitorischen Konzentrationen (MIK). MIK von Chloramphenicol (Cm) für E. coli WH207(λtet50)[pWH527] ohne IPTG bzw. in Gegenwart von 60 µM IPTG, transformiert mit den Plasmiden pWH2101, pWH1903 bzw. pWH1906. „++“ steht für „Wachstum mit Einzelkoloniebildung“, „+“ für „Wachstum ohne Einzelkolonien“ und „-“ für „kein Wachstum“.

Abb. 3.8: Schematische Karte des Plasmids pWH1906 sowie der theoretisch zu erwartenden Fusionsproteine TrxA-InsTip1 und TrxA-InsTip1-Cat. (A) Die dargestellten genetischen Komponenten entsprechen denen auf pWH1903. Die Stammschleifenstruktur markiert den Transkriptions-terminator TrrnC, der schwarze Pfeil das Gen glyU(AS*), der rechte Eckpfeil den Promotor Plpp (B1) Fusionsprotein TrxA-InsTip1. (B2) Fusionsprotein TrxA-InsTip1-Cat. Amino-säuren sind im Ein-Buchstaben-Code angegeben. Der Amino-terminus ist mit H2N gekennzeichnet, der Carboxy-terminus mit COOH. TrxA, Catund Tip sind schematisch dargestellt.

AVSYTHLSGGAGGATip

COOHH2N TrxATrxA

AVSYTHLSGGAGGATip

COOHH2N TrxATrxA CatCatGASGA

ApRpM

B1

pWH19065621 bp

trxA

Ptac PlppTrrnC

glyU(AS*)S

ApRpM

B1

pWH19065621 bp

trxA

Ptac PlppTrrnC

glyU(AS*)SS

ERGEBNISSE

- 27 -

ohne IPTG 60 µM IPTG

1 2 3 1 2 3

Spur:

ohne IPTG 60 µM IPTG

1 2 3 1 2 3

ohne IPTG 60 µM IPTG

1 2 3 1 2 3

Spur:

Spur: 1: TrxA-Tip

2: TrxA-InsTip1

3: TrxA-InsTip1 bzw. TrxA-InsTip1-Cat

Abb. 3.9: Vergleich der Expressionsniveaus von TrxA-Tip, TrxA-InsTip1 und TrxA-InsTip1-Cat mittels Western Blot Analyse. (A) Vergleich der Expressionsniveaus (B) Nachweis der höhermolekularen Bande bei Inkubation der Proben bei Raumtemperatur (RT), 42°C, 65°C und 100°C für 10 min. Das Expressionsniveau von TrxA-Tip, TrxA-InsTip1 bzw. TrxA-InsTip1-Cat wurde mittels eines monoklonalen anti-ThioTM Antikörpers detektiert. Hierfür wurden 10 µg Proteinrohlysat je Spur aufgetragen. Die Rohlysate wurden aus üTK gewonnen. Die jeweilige Peptidlänge ist in [AS] angegeben, das Molekulargewicht in [kDa].

Der Stamm mit pWH2101 zeigte Wachstum sowohl in Gegenwart, als auch in Abwesenheit

von IPTG nur bis zu einer minimalen inhibitorischen Konzentration (MIK) von 3 µg/ml

Chloramphenicol (Tab. 3.1). Beim Stamm mit pWH1903, der über keine Suppressor-tRNA

verfügt, liegt die MIK in Abwesenheit von IPTG bei 3 µg/ml, in Anwesenheit von 60 µM

IPTG bei 10 µg/ml (Tab. 3.1). Die durchgeführten Western Blot-Analysen zeigen, dass das

TAG-Stopcodon effizient die Bildung des Volllängen-Fusionsproteins TrxA-InsTip1-Cat

unter diesen nicht-supprimierten Bedingungen verhindert, da immunologisch nur das

Fusionsprotein TrxA-InsTip1 (138 AS; 14,6 kDa) nachgewiesen werden kann (Abb. 3.9A).

Ohne Suppressor-tRNA wird eine geringe Menge aktiver Chloramphenicol-acetyl-transferase

als Fusionsproteindomäne translatiert. Sie reicht aus, um die MIK um den Faktor 3 zu

erhöhen, nicht aber um immunologisch nachgewiesen zu werden. WH207(λtet50)[pWH527],

transformiert mit pWH1906, zeigte in Abwesenheit von IPTG Wachstum bis über

Konzentrationen von 30 µg/ml Chloramphenicol, in Gegenwart von 60 µM IPTG bis über

100 µg/ml (Tab. 3.1). Dies zeigt, dass in Gegenwart der konstitutiv exprimierten sup:tRNAGly

die Suppression des TAG-Stopcodons innerhalb des Leserahmens des Volllängen-

RT 42°C 65°C 100°C

60 µM IPTG

pWH1906

RT 42°C 65°C 100°C

60 µM IPTG

pWH1906

TrxA-InsTip1

138 AS; 14,6 kDa

TrxA-InsTip1-Cat

362 AS; 40,5 kDa

A B

ERGEBNISSE

- 28 -

Fusionsproteins TrxA-InsTip1-Cat effizient erfolgt. Dies verdeutlichen auch parallel

durchgeführte Western Blot-Analysen. Unter 60 µM IPTG vermittelt pWH1906 drei

immunologisch nachweisbare Banden, TrxA-InsTip1 (138 AS; 14,6 kDa), TrxA-InsTip1-Cat

(362 AS; 40,5 kDa) und eine höhermolekulare Bande (Abb. 3.9A). Letztere ist wahrscheinlich

auf die Quartiär-Struktur der Chloramphenicol-acetyl-transferase als Homotrimer

zurückzuführen (Maxwell et al., 1999) und verschwindet nach zehnminütiger Inkubation der

Protein-Proben der löslichen Fraktion bei höheren Temperaturen (42°, 65°C und 100°C)

(Abb. 3.9B).

3.2.3 Aktivitätsanalysen der Suppressionskassette auf temperatursensitiven Plasmiden

Die auf pWH1906 kodierte Suppressionskassette wurde in das Plasmid p2650 (Gruffat et al.,

2002) inseriert, das über einen temperatursensitiven Replikationsursprung verfügt (p2650-

sup:tRNAGly). Die Klonierungsstrategie von p2650-sup:tRNAGly ist in Kap. 5.1.10 dargestellt.

Zur Analyse der Aktivität im Kontext von p2572 wurde der E. coli Stamm CSH108 mit

p2650-sup:tRNAGly transformiert. CSH108 besitzt eine chromosomale amber-Mutation an

Position 17 des lacZ Gens und ist daher lacZ - (Miller, 1992). Mittels einer β-Galaktosidase

Aktivitätsmessung konnte gezeigt werden, dass CSH108[p2650-sup:tRNAGly] sup:tRNAGly

exprimiert und eine β-Galaktosidase Aktivität von ca. 1550 MU vermittelt, CSH108[p2650]

hingegen nur 1,4 MU. Ebenso konnte mittels eines optischen Nachweisverfahrens auf LB-

Platten, supplementiert mit 100 µg/ml Ampicillin und 40 µg/ml X-Gal, eine Blaufärbung der

Kolonien von CSH108[p2650-sup:tRNAGly] im Vergleich zu CSH108[p2650] beobachtet

werden, was auf die Spaltung von X-Gal durch eine enzymatisch aktive β-Galaktosidase in

Gegenwart von sup:tRNAGly zurückgeführt wird (Abb. 3.10).

Abb. 3.10: Vereinzelungen von E. coli CSH108[p2650]und CSH108[p2650-sup:tRNAGly] auf LB-Platten. Die Festmedien wurden mit 100 µg/ml Ampicillin und 40 µg/ml X-Gal supplementiert. Die Platten zeigen die Vereinzelungen nach einer Inkubationszeit von 36 h bei 30°C. Im Gegensatz zur Referenz CSH108[p2650] ist bei CSH108[p2650-sup:tRNAGly] eine deutliche Blaufärbung der Kolonien zu erkennen.

p2650 p2650-sup:tRNAGly

E. coli CSH108

ERGEBNISSE

- 29 -

3.2.4 Architektur des InsTipSup Elutionsvektors

Goryshin et al. beschrieben, dass die Bildung von Transposomen mit der hyper- und

transaktiven Tn5-Transposase am effektivsten erfolgt, wenn das jeweilige Insertionselement

als lineares DNA-Fragment vorliegt (Goryshin et al., 2000). Daher wurde die InsTip1-Cat

kodierende Sequenz auf pWH1903, wie in Kap. 5.1.10 beschrieben, durch PCR um das

zweite flankierende ME erweitert und in ein pUC18-Vektorderivat mit modifiziertem pMB1

Replikationsursprung (pMB1*) integriert, der in E. coli eine hohe Kopienzahl des Plasmids

vermittelt (Yanisch-Perron et al., 1985). Das resultierende Insertionselement InsTipSup kann

über zwei flankierende PvuII Schnittstellen als lineares, 793 bp langes DNA-Fragment mit

hoher Ausbeute aus dem Vektor pWH1907 isoliert werden (Abb. 3.11).

Abb. 3.11: Schematische Karte des Plasmids pWH1907. Die zwei PvuII Schnittstellen, die InsTipSup flankieren, sind als gepunktete Pfeile dargestellt. Als weiße Box ist die Ampicillin-Resistenzkassette (ApR) dargestellt. Der Replikationsursprung (pMB1*) ist als graue Box dargestellt.

3.2.5 Transposase-vermittelte Integration von InsTipSup in vitro und in vivo

Das 793 bp große Insertionselement InsTipSup wurde, wie in Kap. 5.4.3 beschrieben, aus dem

Plasmid pWH1907 isoliert und gereinigt. InsTipSup lag anschließend in einer Konzentration

von ca. 25 ng/µl vor und konnte direkt für die Transposonmutagenese eingesetzt werden.

Anschließend wurde überprüft, ob InsTipSup mit der hyper- und transaktiven Tn5-Transposase

in vitro Transposomen, nach dem Protokoll von Epicentre® Biotechnologies, Madison,

Wisconsin, USA (EZ::TNTM Transposase), bildet und die Transposase die Integration von

InsTipSup in vitro in Ziel-DNA vermittelt. Da nicht direkt auf InsTipSup Integration selektiert

werden kann, wurde als Ziel-DNA das Plasmid pML005inv genutzt, das das Gen sacB aus

Bacillus subtilis enthält. sacB kodiert für die Levansucrase, deren Expression in Gegenwart

von 5% (w/v) Saccharose im Medium für E. coli letal ist und somit einen

Gegenselektionsmarker darstellt (Gay et al., 1985; Reyrat et al., 1998). Nach Transformation

ApR

pMB

1

3157 bp

PvuII PvuII

ApR

pMB

1* pWH1907

PvuII PvuII

InsTipα793 bp

InsTipSup

SS

ApR

pMB

1

3157 bp

PvuII PvuII

ApR

pMB

1* pWH1907

PvuII PvuII

InsTipα793 bp

InsTipSupInsTipα793 bp

InsTipSup

SS

ERGEBNISSE

- 30 -

mit dem in vitro Transpositionsansatz können von E. coli nur Kolonien auf Medium mit 5%

(w/v) Saccharose gebildet werden, wenn die Expression einer funktionalen Levansucrase

durch die Integration von InsTipSup in sacB verhindert wird (SucR-Phänotyp) (Steinmetz et al.,

1983). Für InsTipSup konnte durch Insertions-Inaktivierung von sacB gezeigt werden, dass es

in vitro Transposomen bilden kann und die hyper- und transaktive Tn5-Transposase die

Integration von InsTipSup in Ziel-DNA vermittelt (Abb. 3.12).

Abb. 3.12: Schematische Darstellung der bei der in vitro Insertionsmutagenese erhaltenen Insertionsorte von InsTipSup in sacB auf pML005inv. Das sacB Gen ist als schwarzer Pfeil dargestellt, die Genlänge in [bp] ist darunter angegeben. Der jeweilige Insertionsort von InsTipSup in sacB ist als schwarze Linie dargestellt, wobei die sieben Insertionen in der Orientierung des sacB Leserahmens über dem sacB Gen angegeben sind, die Insertionen in entgegengerichteter Orientierung darunter. Ein schwarzer Kreis auf der schwarzen Linie kennzeichnet Insertionsorte in Leseraster -1, ein schwarzes Dreieck Insertionen in Leseraster 0 und ein schwarzes Quadrat Insertionen in Leseraster +1. Das Leseraster +1 stellt das Leseraster dar, das für die Erzeugung eines durchgehenden, instip1-markierten Leserahmens benötigt wird.

Transposomen aus InsTipSup und hyper- und transaktiver Tn5-Transposase wurden wie in

Kap. 5.4.4 beschrieben in vitro hergestellt und elektrokompetente E. coli

WH207(λtet50)[p2650-sup:tRNAGly] mit InsTipSup-Transposomen elektroporiert (126 fmol

InsTipSup; entspricht 65 ng) (siehe Kap. 5.4.5). Danach wurden die Zellen zur Selektion von

InsTipSup Integranten auf MacCONKEY Bouillon-Agarplatten ausgebracht, die mit 10 µg/ml

Chloramphenicol und 30 µg/ml Kanamycin supplementiert waren. Die Konzentration von 10

µg/ml Chloramphenicol lag dabei ca. 3-fach über der minimalen inhibitorischen

Konzentration (MIK) von ca. 3 µg/ml für WH207(λtet50). Nach einer Inkubationszeit von 36

h bzw. 72 h bei 30°C konnten auf den MacCONKEY Bouillon-Agarplatten keine Kolonien

detektiert werden. Dieser Ansatz wurde drei Mal mit gleichem Ergebnis wiederholt.

Dies deutete darauf hin, dass keine der InsTipSup Insertionen in WH207(λtet50)[p2650-

sup:tRNAGly] zu einer InsTipSup Insertionsmutante führte, die in Gegenwart der Suppressor-

tRNA sup:tRNAGly ausreichende Mengen eines InsTip1-Cat-Fusionsproteins exprimiert, um

Resistenz gegenüber 10 µg/ml Chloramphenicol zu gewährleisten.

1419 bp

1292 bp162 bp 586 bp318 bp65 bp 1126 bp

sacB

1375 bp

1419 bp

1292 bp162 bp 586 bp318 bp65 bp 1126 bp

sacB

1375 bp

ERGEBNISSE

- 31 -

3.3 Architektur und Funktionsprinzip des Insertionselements InsTipα

Das Insertionselement InsTipα hat eine Länge von 1816 bp und wird von zwei Mosaik

Elementen (ME) flankiert (Reznikoff, 2003), den 19 bp langen, spezifischen Bindestellen der

hyper- und transaktiven Tn5 Transposase (Goryshin et al., 2000). Das in Abb. 3.13 am linken

Ende liegende ME bildet zusammen mit der stromabwärts liegenden Nukleotidsequenz einen

durchgehenden Leserahmen, der translatiert die sechs Aminosäuren des ME, die sieben

Aminosäure-lange Sequenz Ser-Gly-Gly-Ala-Gly-Gly-Ala und Tip umfasst. Er endet mit

einem TAA-Stopcodon, für das in E. coli gezeigt wurde, dass es, wie im Kontext von

InsTipα, gefolgt am 3´-Ende von dem Nukleotid G, eine in vivo Terminationsaktivität von

über 50% aufweist und so zu den effizientesten Stopcodons zählt (Poole et al., 1995). Für

dieses Teilstück von InsTipα, das das InsTip1-Peptid kodiert, konnte bereits gezeigt werden,

dass es als C-terminale Fusion an TrxA Induktion von TetR vermittelt (Kap. 3.2.2).

Abb. 3.13: Schematische Darstellung des Insertionselements InsTipα. Die flankierenden ME sind als schwarze Dreiecke, die Linker-Sequenz als weißer Balken und die Tip kodierende Sequenz als grauer Balken dargestellt. Der weiße Pfeil zeigt das Gen aphAIII und bildet mit dem als Eckpfeil dargestellten Promotor die KmR Resistenzkassette. Als Stammschleifenstruktur ist der Transkriptionsterminator zu sehen. Die FRT-Elemente sind als schwarze Fünfecke gekennzeichnet. Die Nukleotidsequenz des kodierenden, durchgehenden Leserahmens von InsTipα ist schwarz hinterlegt, die Aminosäuren sind im Ein-Buchstaben-Code über dem jeweiligen Codon-Triplett angegeben. „*“ stellt das Stopcodon „TAA“ dar. Die vier Aminosäuren, die bei Integration in einen offenen Leserahmen potentiell entstehen können, sind in grau aufgelistet.

Weiterhin beinhaltet InsTipα das Resistenzgen aphAIII, welches in der vorliegenden

Kanamycin-Resistenzkassette (KmR), Resistenz sowohl in Gram-negativen als auch in Gram-

positiven Bakterien verleiht (Guérout-Fleury et al., 1995). Zur Unterdrückung polarer Effekte

nach genomischer Integration von InsTipα durch die inserierte Resistenzkassette, wurde

5´ 3´

ERGEBNISSE

- 32 -

stromabwärts von KmR ein bidirektionaler Tn10-Transkriptionsterminator kloniert

(Schollmeier et al., 1985). Um nach erfolgter genomischer Integration von InsTipα

unmarkierte Stämme zu generieren und den Eingriff ins Genom zu minimieren, können

Terminator und KmR über zwei flankierende, 34 bp lange Erkennungsstellen für die Flp-

Rekombinase (FRT) entfernt werden (Senecoff et al., 1985; Cherepanov und Wackernagel,

1995) (Abb. 3.13).

Die Architektur von InsTipα wurde so gewählt, dass, im Gegensatz zum Suppressor-basierten

Insertionselement InsTipSup, nur auf Integration des Elements ins Genom selektiert wird, da

die Kanamycin-Resistenzdeterminante konstitutiv exprimiert wird. Aus der Kollektion an

beliebigen InsTipα Insertionsmutanten sollen anschließend Stämme isoliert werden, bei denen

mit Hilfe eines TetR regulierten LacZ-Reporterkonstrukts die Gegenwart von InsTip1-

Fusionsproteinen auf MacCONKEY Bouillon-Agarplatten visuell nachgewiesen werden

kann.

3.3.1 Die in vivo Funktionalität von InsTipα

Um in vivo die Funktionalität von InsTipα zu überprüfen, nach Integration in den offenen

Leserahmen eines Gens ein TetR induzierendes Fusionsprotein zu generieren und einen

möglichen Einfluß der Expression des gegenläufig angeordneten Resistenzgens aphAIII auf

die Bildung des InsTip1-Fusionsproteins zu detektieren, wurde ein Plasmid kloniert, in dem

InsTipα am 3´-Ende von trxA positioniert wurde. Das Plasmid wurde pWH1909 genannt und

exprimiert unter Kontrolle von Ptac die C-terminale Proteinfusion TrxA-InsTip1, die 138 AS

umfasst (Abb. 3.14). Die Klonierungsstrategie ist in Kap. 5.1.10 dargestellt.

ERGEBNISSE

- 33 -

0

2000

4000

6000

pWH806 pWH2101 pWH1909

0 15 30 60 125 250 500

β-G

al. A

ktiv

ität [

MU

]

0 15 30 60 125 250 500

0

2000

4000

6000

pWH806 pWH2101 pWH1909

0 15 30 60 125 250 5000 15 30 60 125 250 500

β-G

al. A

ktiv

ität [

MU

]

0 15 30 60 125 250 5000 15 30 60 125 250 500

Abb. 3.14: Schematische Karte des Plasmids pWH1909 und des TrxA-InsTip1-Fusionsproteins. (A) Das Gen trxA ist als grauer Pfeil gekennzeichnet, InsTipα schließt sich daran an. Die weiße Box repräsentiert die Ampicillin-Resistenzkassette (ApR). Der Replikationsursprung (pMB1) ist als graue Box dargestellt. Der offene Leserahmen des 3´-markierten Gens trxA ist als dünner schwarzer Pfeil gekennzeichnet. (B) Aufbau von TrxA-InsTip1. Aminosäuren sind im Ein-Buchstaben-Code angegeben. Der Aminoterminus ist mit H2N gekennzeichnet, der Carboxyterminus mit COOH. TrxA und Tip sind schematisch dargestellt.

Der Stamm E. coli WH207(λtet50) wurde mit pWH1911 und pWH1909 cotransformiert.

pWH1911, ein Derivat von pWH527 mit CmR, exprimiert TetR konstitutiv auf niedrigem

Niveau (Klotzsche et al., 2005). Die Analyse der TetR-Induktionsfähigkeit von TrxA-InsTip1

erfolgte mittels β-Galaktosidase Aktivitätsmessung (siehe Kap. 5.4.8). Parallel wurde als

Kontrollansatz WH207(λtet50), anstelle von pWH1909, mit dem Plasmid pWH2101

transformiert, welches das TetR induzierende C-terminale Fusionsprotein TrxA-Tip kodiert

(Klotzsche et al., 2005). Als Repressions- bzw. Aktivitäts-Kontrolle wurde das Plasmid

pWH806 mitgeführt, wobei die Induktion von TetR hier mit 100 nM Tc erfolgte.

ApR

pMB

1

pWH19096319 bp

trxA

Ptac

ApR

pMB

1

pWH19096319 bp

trxA

Ptac

A BAVSYTHLSGGAGGA

TipCOOHH2N TrxA

Abb. 3.15: Vergleich der Induktion von TetR durch Tc, TrxA-Tip und TrxA-InsTip1.TetR wird von pWH1911 exprimiert. TrxA-Tip ist auf pWH2101, TrxA-InsTip1 auf pWH1909 kodiert. Die Induktion von Ptac erfolgte mit 15 - 500 µM IPTG (schwarze Balken). pWH806 wurde als Repressions- (linker weißer Balken) und Induktions-Kontrolle (grauer Balken; 100 nM Tc) mitgeführt. Die Messung wurde in E. coli WH207(λtet50) bei 28°C durchgeführt. Die Aktivität der β-Galaktosidase ist in Einheiten nach Miller [MU](Miller, 1972) angegeben.

ERGEBNISSE

- 34 -

Mit IPTG Konzentrationen von 15 bis 500 µM wurde die Expression des jeweiligen

Fusionsproteins induziert. Die Expression von TrxA-Tip und TrxA-InsTip1 in Gegenwart von

15 µM IPTG führt bereits zu einer Induktion von TetR, detektierbar durch eine 18-fache

Steigerung der β-Galaktosidase Aktivität gegenüber dem TetR reprimierten Zustand. Ab einer

Konzentration von 125 µM IPTG erreicht diese mit einer 28-fachen Steigerung ein Plateau

bei ca. 3800 MU, was die maximale TetR Induktion durch die Fusionsproteine TrxA-Tip und

TrxA-InsTip1 widerspiegelt (Abb. 3.15).

Gleichzeitig durchgeführte Western Blot Analysen (siehe Kap. 5.4.10), bei denen die

Fusionsproteine durch einen monoklonalen anti-ThioTM Antikörper nachgewiesen wurden,

zeigten annähernd gleiche Expressionsniveaus von TrxA-Tip und TrxA-InsTip1 in

Abhängigkeit der jeweiligen Ptac induzierenden IPTG Konzentration (Abb. 3.16). Allerdings

erlaubt die Auflösung des Western Blots keine genauere Aussage über die Korrelation von

Fusionsproteinmenge und Induktion, da der Blot überexponiert ist und bereits in Gegenwart

von 15 µM IPTG die nachgewiesene Proteinmenge von TrxA-Tip ein Maximum erreicht,

TrxA-InsTip1 erst bei 60 µM IPTG.

Abb. 3.16: Vergleich der Expressionsniveaus von TrxA-Tip und TrxA-InsTip1 mittels Western Blot Analyse. Das Expressionsniveau von TrxA-Tip bzw. TrxA-InsTip1 wurde mittels eines monoklonalen anti-ThioTM Antikörpers detektiert. Hierfür wurden 10 µg Proteinrohlysat je Spur aufgetragen. Die Rohlysate wurden aus den üTK der β-Galaktosidase Aktivitätsmessung gewonnen. Die jeweilige Peptidlänge ist in [AS] angegeben, das Molekulargewicht in [kDa].

Das TetR-Induktionsniveau und die Expressionsmenge von TrxA-InsTip1 entsprechen

weitgehend dem von TrxA-Tip. Somit beeinträchtigt im Kontext einer C-terminalen Fusion

an TrxA weder die Länge des Peptid-Anhängsels InsTip1, noch die Aminosäuren des

translatierten Mosaik Elements und des Linkers, die TetR induzierenden Eigenschaften von

TrxA-Tip

129 AS; 13,7 kDa

TrxA-InsTip1

138 AS; 14,6 kDa

0 15 60 250 0 15 60 250

IPTG [µM]

pWH2101 pWH1909

ERGEBNISSE

- 35 -

Tip. Ebenso beeinflusst die Expression des gegenläufig orientierten Resistenzgens nicht die

Bildung des InsTip1-Fusionsproteins.

Um das Insertionselement InsTipα als lineares DNA-Fragment zu erhalten, das über zwei

flankierende PvuII Schnittstellen mit hoher Ausbeute isoliert werden kann, wurde die

Sequenz von InsTipα, wie in Kap. 5.1.10 für das Insertionselement InsTipSup beschrieben, in

ein pUC18-Vektorderivat integriert. Der resultierende Vektor wurde pWH1912 genannt (Abb.

3.17).

Abb. 3.17: Schematische Karte des Plasmids pWH1912. Die zwei PvuII Schnittstellen, die InsTipα flankieren, sind als gepunktete Pfeile dargestellt. Als weiße Box ist die Ampicillin-Resistenzkassette (ApR) dargestellt. Der Replikationsursprung (pMB1*) ist als graue Box dargestellt.

3.3.2 Transposase-vermittelte Integration von InsTipα in E. coli WH207(λtet50)

Das 1816 bp große Insertionselement InsTipα wurde, wie in Kap. 5.4.3 beschrieben, aus dem

Plasmid pWH1912 isoliert und gereinigt. InsTipα lag anschließend in einer Konzentration

von ca. 21 ng/µl vor und konnte direkt für die Transposonmutagenese eingesetzt werden.

Transposomen aus InsTipα und hyper- und transaktiver Tn5-Transposase wurden, wie in

Kap. 5.4.4 beschrieben, hergestellt und 4 x 108 elektrokompetente E. coli

WH207(λtet50)[pWH1911] Zellen wurden mit diesen Transposomen elektroporiert (siehe

Kap. 5.4.5). Die Menge an InsTipα-DNA betrug ca. 16 fmol (20 ng).

Danach wurden die Zellen zur Selektion von InsTipα Integranten auf MacCONKEY

Bouillon-Agarplatten ausgebracht, die mit 25 µg/ml Chloramphenicol und 60 µg/ml

Kanamycin supplementiert waren. Nach einer Inkubationszeit von 36 h bei 37°C wurden auf

den MacCONKEY Bouillon-Agarplatten in einem ersten Experiment insgesamt ca. 5500

Kanamycin-resistente InsTipα Insertionsmutanten gezählt, in einem zweiten ca. 900. Dies

ApR

pMB

1

pWH19124180 bp

PvuII PvuII

InsTipα1816 bp

ApR

pMB

1* pWH19124180 bp

PvuII PvuII

InsTipα1816 bp

ApR

pMB

1

pWH19124180 bp

PvuII PvuII

InsTipα1816 bp

ApR

pMB

1* pWH19124180 bp

PvuII PvuII

InsTipα1816 bp

ERGEBNISSE

- 36 -

entsprach, bei initial ca. 4 x 108 elektroporierten Zellen, einer InsTipα Insertionsrate von ca.

0,014‰, bzw. ca. 0,002‰.

Um in der Bibliothek von 6400 Insertionsmutanten Kandidaten zu finden, die TetR

induzierende InsTip1-Fusionsproteine exprimieren, wurden die Kolonien auf den

MacCONKEY Bouillon-Agar-Platten einem visuellen Auswahlverfahren unterzogen. Die

Enzymaktivität der β-Galaktosidase ist durch einen Farbumschlag des Indikators

Bromkresolpurpur detektierbar. Dies diente hierbei als Nachweis der InsTip1 vermittelten

Induktion von TetR. Aus der ersten Bibliothek von 5500 Insertionsmutanten wurden zwei, aus

der zweiten Bibliothek mit 900 drei gelb gefärbte Kolonien auf diesem Indikatormedium

detektiert, was einer Rate von ca. 0,4‰ bzw. 3,3‰ entspricht. Diese fünf Kandidaten wurden

drei Vereinzelungsrunden unterzogen, wobei die Gelbfärbung bei allen Vereinzelungen stabil

blieb (Abb. 3.18).

Abb. 3.18: Vereinzelungen von WH207(λtet50)[pWH1911] und einer InsTipα-Insertionsmutante auf MacCONKEY Bouillon-Agarplatten. Die Festmedien wurden mit 25 µg/ml Chloramphenicol supplementiert. Die Platten zeigen die Vereinzelungen nach einer Inkubationszeit von 48 h bei 37°C. Im Gegensatz zur Referenz WH207(λtet50)[pWH1911] ist bei dem Insertionskandidaten eine deutliche Gelbfärbung des Indikatormediums zu erkennen.

Bei diesen fünf Insertionskandidaten wurde zuerst analysiert, ob der Indikatorumschlag darauf

zurückzuführen ist, dass die Insertion von InsTipα nicht in das bakterielle Chromosom

erfolgte, sondern in tetR auf pWH1911. Eine Insertions-Inaktivierung von tetR würde zu einer

Derepression der tetA-lacZ-Transkriptionsfusion führen, wodurch β-Galaktosidase exprimiert

würde. Dies wurde für die jeweils isolierten pWH1911-Plasmide der fünf Kandidaten durch

Restriktionsanalyse mit NdeI und NheI überprüft. Die erwarteten Fragmentgrößen von 5208

bp und 2265 bp, die einem unmodifizierten pWH1911 entsprachen, wurden bei allen

isolierten Plasmiden nachgewiesen (Abb. 3.19). Eine Integration von InsTipα in pWH1911

wäre durch eine Größenveränderung des Plasmidfragments um 1816 bp detektierbar.

WH207(λtet50)[pWH1911] InsTipα-Insertionsmutante

ERGEBNISSE

- 37 -

Spur: 1: Standard

2: pWH1911 isoliert aus Kandidat 1; NdeI/NheI

3: pWH1911 isoliert aus Kandidat 2; NdeI/NheI

4: pWH1911 isoliert aus Kandidat 3; NdeI/NheI

5: pWH1911 isoliert aus Kandidat 4; NdeI/NheI

6: pWH1911 isoliert aus Kandidat 5; NdeI/NheI

7: pWH1911 isoliert aus Referenzstamm; NdeI/NheI

Abb. 3.19: Analyse der präparierten pWH1911 Plasmide. pWH1911-Verdau mittels NdeI und NheI. Die erhaltenen Produkte wurden auf einem 1%igen (w/v) Agarosegel analysiert. In Spur 1 ist die peqGOLD DNA-Leiter als Standard zu sehen. Die Größen einiger DNA-Banden sind in [bp] angegeben.

5 4 1 2 7 6 3 Spur:

5208 bp

2265 bp2000 bp 3000 bp

6000 bp

1031 bp

ERGEBNISSE

- 38 -

3.3.3 Identifikation der Insertionsorte von InsTipα

Der genomische Insertionsort von InsTipα wurde durch Sequenzierung in den fünf

Kandidaten identifiziert. Hierzu wurde die jeweilige chromosomale DNA präpariert und mit

den Oligonukleotiden Echo-1 bzw. Echo-2 beidseitig aus InsTipα heraus, der InsTipα-

umgebende Sequenzabschnitt bestimmt (Kap. 5.4.6).

In Abbildung 3.20 sind die jeweiligen Insertionsorte von InsTipα relativ zum betroffenen Gen

des jeweiligen Kandidaten skizziert. Die Kandidaten wurden WH851 bis WH855 genannt.

A B

E

D C

Abb. 3.20: Schematische Darstellung der genomischen Insertion von InsTipα in den jeweiligen Kandidaten.Das jeweilige Gen ist als schwarzer Pfeil mit weißer Beschriftung dargestellt, die Genlänge in [bp] ist darunter angegeben. InsTipα ist schematisch darüber skizziert. Der Integrationsort von InsTipα ist als gepunktete Linie markiert, wobei InsTipα nach dem angegebenen Basenpaar ins Gen inseriert ist. Die Stämme tragen folgende Namen: (A) WH851; (B) WH852; (C) WH853; (D) WH854; (E) WH855.

ERGEBNISSE

- 39 -

Die Transposase-vermittelte Integration von InsTipα ins Genom des E. coli Reporterstammes

WH207(λtet50)[pWH1911] erfolgte in den fünf Insertionsmutanten in die offenen

Leserahmen der Gene atpD, ppiD, yraI, yicO bzw. yfdX.

In Tabelle 3.2 sind zudem Informationen über die markierten Gene, Funktion und

Lokalisation der in Wildtyp-Situation exprimierten Proteine und Bezeichnung der jeweiligen

Fusionsproteine mit der theoretisch zu erwartenden Proteinlänge zusammengefasst. Neben

den vier nicht-essentiellen Genen atpD, ppiD, yraI und yicO konnte mit yfdX ein als essentiell

annotiertes Gen (Gerdes et al., 2003) mit der InsTip1-kodierenden Sequenz markiert werden.

Die Markierung des jeweiligen Proteins mit InsTip1 fand bei allen Fusionen nicht direkt am

C-Terminus statt. Bei den dazugehörigen exprimierten Proteinen handelt es sich sowohl um

cyto- und periplasmatische, als auch um integrale Membranproteine (Riley et al., 2006).

Tabelle 3.2: a: Derivat von WH207(λtet50)[pWH1911]; b: Genlänge in [bp]; c: Essentialität definiert in Gerdes et al. (Gerdes et al., 2003); d: Proteinfunktion und Proteinlokalisation wie in Riley et al. (Riley et al., 2006) annotiert; e: Insertion von InsTipα nach nt; f: Theoretisch zu erwartende Länge des Fusionsproteins in [AS].

YfdX-InsTip1188 AS

YicO-InsTip1313 AS

YraI-InsTip1232 AS

PpiD-InsTip1138 AS

AtpD-InsTip1412 AS

Fusions-Protein f

475periplasmatischunbekanntMW: 22,8 kDa; 211 AS

yfdX636 bp

essentiell

WH855

850integrales Protein der inneren Membran

unbekannt; vorhergesagteXanthin/Uracil PermeaseMW: 46,8 kDa; 444 AS

yicO1335 bp

nicht essentiell

WH854

607periplasmatischunbekannt; gehört zur periplasmatischen Pilus

Chaperon FamilieMW: 25,5 kDa; 231 AS

yraI696 bp

nicht essentiell

WH853

328Membran-verankert;periplasmatisch

Peptidylprolyl-cis-trans-Isomerase D

MW: 68,2 kDa; 623 AS

ppiD1872 bp

nicht essentiell

WH852

1147cytoplasmatischMembran-gebundene ATP Synthase; F1 Domäne;

β-UntereinheitMW: 50,4 kDa; 460 AS

atpD1383 bp

nicht essentiell

WH851

Insertions-Ort e

Subzelluläre Lokalisation d

Proteinfunktion dGen b,cStamm a

YfdX-InsTip1188 AS

YicO-InsTip1313 AS

YraI-InsTip1232 AS

PpiD-InsTip1138 AS

AtpD-InsTip1412 AS

Fusions-Protein f

475periplasmatischunbekanntMW: 22,8 kDa; 211 AS

yfdX636 bp

essentiell

WH855

850integrales Protein der inneren Membran

unbekannt; vorhergesagteXanthin/Uracil PermeaseMW: 46,8 kDa; 444 AS

yicO1335 bp

nicht essentiell

WH854

607periplasmatischunbekannt; gehört zur periplasmatischen Pilus

Chaperon FamilieMW: 25,5 kDa; 231 AS

yraI696 bp

nicht essentiell

WH853

328Membran-verankert;periplasmatisch

Peptidylprolyl-cis-trans-Isomerase D

MW: 68,2 kDa; 623 AS

ppiD1872 bp

nicht essentiell

WH852

1147cytoplasmatischMembran-gebundene ATP Synthase; F1 Domäne;

β-UntereinheitMW: 50,4 kDa; 460 AS

atpD1383 bp

nicht essentiell

WH851

Insertions-Ort e

Subzelluläre Lokalisation d

Proteinfunktion dGen b,cStamm a

ERGEBNISSE

- 40 -

3.3.4 Nachweis der Expression der InsTip1-markierten Fusionsproteine

Zuerst wurde untersucht, ob die Insertion von InsTipα in die jeweiligen Gene (atpD, ppiD,

yraI, yicO bzw. yfdX) das Wuchsverhalten der Stämme WH851 bis WH855 beeinflusst. Daher

wurden Wuchskurven der fünf InsTipα Insertionsmutanten WH851 bis WH855 und des

Referenzstammes WH207(λtet50)[pWH1911] bei 37°C in MacCONKEY Bouillon-Medium

ohne den Indikatorfarbstoff Bromkresolpurpur (MC∆ Medium) bestimmt (Abb. 3.21).

Abb. 3.21: Wuchsverhalten und β-Galaktosidase Aktivität der InsTipα-Insertionsmutanten und des Referenzstamms. Vergleich von WH207(λtet50)[pWH1911] (schwarze Quadrate bzw. schwarze Balken) mit (A) WH851, (B) WH852, (C) WH853, (D) WH854 und (E) WH855 (weiße Quadrate bzw. weiße Balken) in MC∆ Medium bei 37°C. Die oD600 wurde zu den angegebenen Zeitpunkten bestimmt und auf der linken Ordinate in logarithmischer Skalierung aufgetragen. Die gemessenen Werte der β-Galaktosidase Aktivität wurden auf der rechten Ordinate in Einheiten nach Miller [MU] (Miller, 1972) aufgetragen. In allen Stämmen wird TetR von pWH1911 exprimiert.

A B

C D

E

ERGEBNISSE

- 41 -

Hierzu wurden je drei üNK der Stämme WH851 bis WH855 und des Referenzstamms in 10

ml LB Medium bei 37°C angezogen und mit den üNK jeweils 100 ml MC∆ Medium, das mit

25 µg/ml Chloramphenicol versetzt war, auf eine optische Dichte (oD600) von 0,01 angeimpft

und bei 37°C unter ständigem Schütteln inkubiert. Die Analyse des Wuchsverhaltens erfolgte

über einen Zeitraum von 40 h (Abb. 3.21).

Die Wachstumsraten von allen Stämmen waren, mit Ausnahme von WH851, identisch zum

Wuchsverhalten des Referenzstamms WH207(λtet50)[pWH1911]. WH851 zeigte unter den

gegebenen Bedingungen einen deutlichen Wuchsdefekt und erreichte nur eine maximale

oD600 von 0,75 (Abb. 3.21A), die übrigen Stämme hingegen von 5,0 bis 5,5 (Abb. 3.21B-E).

In regelmäßigen Abständen innerhalb der 40 stündigen Inkubation wurden von den Kulturen

der fünf Insertionsmutanten und des Referenzstamms Proben entnommen, um die Aktivität

der β-Galaktosidase während der exponentiellen und stationären Wachstumsphase zu

bestimmen und so die Expression des jeweiligen, chromosomal kodierten Fusionsproteins

(AtpD-InsTip1, PpiD-InsTip1, YraI-InsTip1, YicO-InsTip1 bzw. YfdX-InsTip1) zu

detektieren. Der Referenzstamm WH207(λtet50)[pWH1911] zeigte über den gesamten

Zeitraum des Experiments keine Veränderung der β-Galaktosidase Aktivität. Hier wurden

konstant zwischen 80 bis 150 MU gemessen, was der Hintergrundaktivität der β-

Galaktosidase unter TetR reprimierten Bedingungen entsprach, wenn TetR auf niedrigem

Niveau von pWH1911 exprimiert wird (Abb. 3.21). Bei den Stämmen WH851 bis WH855

wurden während der exponentiellen Wuchsphase (4 – 8 h) ausschließlich Werte im Bereich

der Basalaktivität der β-Galaktosidase des unmarkierten Referenzstamms festgestellt (Abb.

3.21).

Beim Übergang von der exponentiellen Phase in die Stationärphase konnte für die Stämme

WH852 bis WH855, die die Fusionsproteine PpiD-InsTip1, YraI-InsTip1, YicO-InsTip1 bzw.

YfdX-InsTip1 kodieren, ein rapider Anstieg der β-Galaktosidase Aktivität gemessen werden,

wobei innerhalb der Stationärphase (20 - 40 h) ein Plateau erreicht wurde. Mit ungefähr 1100

MU wurde das höchste Induktionsniveau für den Stamm WH852 nachgewiesen, dass auf die

Induktion von TetR durch PpiD-InsTip1 zurückzuführen ist (Abb. 3.21B). Ebenso konnte für

die Expression der Fusionsproteine YraI-InsTip1, YicO-InsTip1 bzw. YfdX-InsTip1, in

WH853, WH854 bzw. WH855, für Zellen der mittleren exponentiellen Wuchsphase (4 h) und

Zellen innerhalb der Stationärphase (20 h) eine ungefähr 5,4- bis 6,3-fache Steigerung der β-

Galaktosidase Aktivität gegenüber dem Referenzstamm errechnet werden (Abb. 3.21C-E). Im

Kontrast dazu wurde für den Stamm WH851, der das Fusionsprotein AtpD-InsTip1 kodiert,

eine deutlich langsamere Zunahme der β-Galaktosidase Aktivität innerhalb der stationären

ERGEBNISSE

- 42 -

Phase detektiert. Hier stieg die β-Galaktosidase Aktivität Wuchsphasen-unabhängig während

des gesamten Experiments stetig an und erreichte innerhalb der 40 Stunden kein Plateau

(Abb. 3.21A). In Tabelle 3.3 sind die Induktionsfaktoren der β-Galaktosidase Aktivität der

Stämme WH851 bis WH855 gegenüber der des Referenzstamms während der exponentiellen

Phase bzw. der Stationärphase aufgelistet.

Induktionsfaktor gegenüber WH207(λtet50)[pWH1911]

exponentielle Phase Stationärphase

Stamm Protein

4 h

8 h

20 h

36 h

40 h

WH851

AtpD-InsTip1

1,6

1,0

2,4

4,5

6,2

WH852 PpiD-InsTip1 1,3 1,5 6,9 7,2 7,8

WH853 YraI-InsTip1 1,3 1,6 6,3 4,8 5,0

WH854 YicO-InsTip1 1,3 1,4 5,4 5,3 5,9

WH855 YfdX-InsTip1 1,3 1,3 5,7 5,7 5,8

Tab. 3.3. Induktionsfaktoren der β-Galaktosidase Aktivität der Stämme WH851 bis WH855 im Vergleich zum Referenzstamm WH207(λtet50)[pWH1911]. Zu den Zeitpunkten 4 h bzw. 8 h (exponentielle Phase) und 20 h, 36 h bzw. 40 h (Stationärphase).

3.3.5 Charakterisierung der wuchsdefizienten Insertionsmutante WH851

Um zu untersuchen, ob die Insertion von InsTipα in atpD zu einem enzymatischen

Funktionsverlust der ATP Synthase und einem atpD „knock-out“ Phänotyp (atpD-) des

Stamms WH851 führt, wurde dessen Wuchsverhalten im Vergleich zum Wildtyp-Stamm

WH207(λtet50)[pWH1911] auf Minimalmedium mit Succinat als einziger Kohlenstoffquelle

untersucht. Lee et al., beschrieben, dass atpD- Stämme nicht die Fähigkeit besitzen Succinat

als alleinige C-Quelle zu verwerten (Lee et al., 1991).

Abb. 3.22: Wachstumsanalyse von WH207(λtet50)[pWH1911] und WH851 auf Minimalmedium mit 30 mM Succinat als Kohlenstoffquelle. (A) WH207(λtet50)[pWH1911] bildet nach einer Inkubationszeit von 72 h bei 37°C Einzelkolonien. (B) WH851 zeigt kein Wachstum.

A B

ERGEBNISSE

- 43 -

WH851 zeigte auf diesem Medium kein Wachstum, wohingegen WH207(λtet50)[pWH1911]

auf Minimal-Festmedium mit Succinat als Kohlenstoffquelle Einzelkolonien bilden und somit

Succinat verwerten konnte (Abb. 3.22). WH851 hat einen Suc- Phänotyp, der auf einen

Funktionsverlust der ATP Synthase durch die InsTipα Insertion in atpD zurückzuführen ist.

Wise bzw. Lee et al. zeigten für Stämme mit Mutationen in der β-Untereinheit der ATP

Synthase, dass diese in Flüssigmedium mit Glukose als limitierender Kohlenstoffquelle einen

Wuchsdefekt aufwiesen (Wise, 1990; Lee et al., 1991).

In M9-Minimalmedium, supplementiert mit 2,5% (v/v) LB und 3 mM Glukose (Lee et al.,

1991) zeigte WH851 während des exponentiellen Wachstums bei 37°C unter ständigem

Schütteln keinerlei Unterschied zum Wildtyp. Beim Übergang von der exponentiellen in die

stationäre Phase stagnierte das Wachstum von WH851 bei einer maximale oD600 von 0,31,

wohingegen WH207(λtet50)[pWH1911] innerhalb der Stationärphase kontinuierlich bis zum

96 h Messpunkt auf eine oD600 von 0,9 wuchs (Abb. 3.23).

Abb. 3.23: Wuchskurven und in vivo Aktivitätsmessungen der β-Galaktosidase von WH851 und WH207(λtet50)[pWH1911]. Vergleich von WH207(λtet50)[pWH1911] (schwarze Quadrate bzw. schwarze Balken) mit WH851 (weiße Quadrate bzw. weiße Balken) in M9-Minimalmedium mit 2,5% (v/v) LB und 3 mM Glc bei 37°C. Die optische Dichte (oD600) wurde bei λ = 600 nm zu den angegebenen Zeitpunkten bestimmt und auf der linken Ordinate in logarithmischer Skalierung aufgetragen. Die Werte der β-Galaktosidase Aktivität wurden auf der rechten Ordinate in Einheiten nach Miller [MU] (Miller, 1972) aufgetragen. Die Proben für die β-Galaktosidase Aktivitätsmessungen waren den Kulturen zu den jeweiligen Zeitpunkten entnommen worden. In beiden Stämmen wird TetR von pWH1911 exprimiert.

Um zu analysieren, ob und zu welchem Zeitpunkt in diesem Medium die Expression des

Fusionsproteins AtpD-InsTip1 nachgewiesen werden kann, wurden zu verschiedenen

Zeitpunkten der Wuchskurve den Kulturen Proben entnommen und Messungen der β-

Galaktosidase Aktivität durchgeführt. Hier zeigte sich, dass WH851 während der

ERGEBNISSE

- 44 -

exponentiellen Wachstumsphase annähernd die gleiche β-Galaktosidase Aktivität vermittelt

wie WH207(λtet50)[pWH1911] und somit während dieser Wachstumsphase die Expression

von AtpD-InsTip1 nicht detektiert werden kann. Im weiteren Verlauf der Wuchskurve kann

für den Wildtyp eine leicht abnehmende β-Galaktosidase Aktivität bestimmt werden. WH851

hingegen zeigt ab dem Wuchsphasenwechsel eine zunehmende β-Galaktosidase Aktivität im

Vergleich zum Wildtyp, 2,6-fach stärker zum Zeitpunkt 20 h bis 3,4-fach stärker nach 96 h,

was auf die Expression und Anwesenheit des Fusionsproteins AtpD-InsTip1 schließen lässt

(Abb. 3.23).

3.3.6 Detektion quantitativer Expressionsunterschiede mittels InsTip1

Dartigalongue und Raina zeigten, dass die Expression von ppiD in E. coli der Regulation des

Zwei-Komponenten-Systems CpxR-CpxA unterliegt, dessen Aktivierung bzw. Repression

seinerseits wiederum durch den Spiegel an Acetyl-Phosphat moduliert wird (Dartigalongue

und Raina, 1998). β-Galaktosidase Aktivitätsmessungen einer ppiD-lacZ Transkriptionsfusion

wiesen nach, dass eine 2,5-fach stärkere Aktivität des endogenen ppiD-Promotors vorliegt,

wenn E. coli in Pyruvat-haltigem Minimalmedium anstelle von Glyzerin-haltigem

Minimalmedium angezogen wurde, da Pyruvat als C-Quelle ein hohes Niveau an

intrazellulärem Acetyl-Phosphat vermittelt (Dartigalongue und Raina, 1998).

Diese Regulation des ppiD-Promotors eröffnete die Möglichkeit, mittels einer Analyse der β-

Galaktosidase Aktivität des Stamms WH852 zu überprüfen, ob die C-Quellen abhängige

Induktion von ppiD auch auf Proteinebene mittels der PpiD-InsTip1 Translationsfusion

nachgewiesen werden kann.

Hierzu wurden der Stamm WH852 und der Referenzstamm WH207(λtet50)[pWH1911] in je

drei 100 ml LB Medium, supplementiert mit 25 µg/ml Chloramphenicol, bei 37°C unter

Schütteln üN angezogen, anschließend die Zellen geerntet, mit M9-Minimalmedium

gewaschen, die Zellsuspension 1:100 in M9-Minimalmedium verdünnt und in je 100 ml M9-

Minimalmedium, supplementiert mit 25 µg/ml Chloramphenicol und 50 mM Glyzerin bzw.

50 mM Pyruvat, überführt. Die Anzucht der Kulturen erfolgte unter ständigem Schütteln bei

37°C über einen Zeitraum von 38 h. Der Verlauf der Wuchskurve ist Abbildung 3.24 zu

entnehmen.

ERGEBNISSE

- 45 -

Abb. 3.24: Wuchskurven von WH852 und WH207(λtet50)[pWH1911] in M9-Minimalmedium mit 50 mM Glyzerin bzw. 50 mM Pyruvat. Vergleich von WH207(λtet50)[pWH1911] (Glyzerin: schwarze Quadrate; Pyruvat: schwarze Dreiecke) mit WH852 (Glyzerin: weiße Quadrate; Pyruvat: weiße Dreiecke) in M9-Minimalmedium mit 50 mM C-Quelle bei 37°C. Die oD600 wurde zu den angegebenen Zeitpunkten bestimmt und in logarithmischer Skalierung aufgetragen.

Der Referenzstamm WH207(λtet50)[pWH1911] und WH852 erreichten in Gegenwart der C-

Quelle Pyruvat eine maximale oD600 von 1,0, in Glyzerin-haltigem Medium hingegen eine

deutlich niedrigere oD600 von 0,55, was auf eine effektivere Nutzung von Pyruvat als C-

Quelle zurückzuführen ist (Abb. 3.24).

In regelmäßigen zeitlichen Abständen innerhalb der exponentiellen Phase (13 – 22 h) der 38

stündigen Inkubation und an einem Messpunkt in der stationären Phase (38 h) wurden von

den Kulturen Proben entnommen und deren β-Galaktosidase Aktivität bestimmt.

Abb. 3.25: β-Galaktosidase Aktivitätsmessung von WH852 und WH207(λtet50)[pWH1911]. Vergleich von WH207(λtet50)[pWH1911] (schwarze Balken) mit WH852 (weiße Balken) in M9-Minimalmedium mit (A) 50 mM Glyzerin bzw. (B) 50 mM Pyruvat bei 37°C. Die gemessenen Werte der β-Galaktosidase Aktivität wurden in Einheiten nach Miller [MU] (Miller, 1972) aufgetragen. Die Proben für die β-Galaktosidase Aktivitätsmessungen wurden den Kulturen zu den jeweiligen Zeitpunkten entnommen. In den Stämmen wird TetR von pWH1911 exprimiert.

A B

ERGEBNISSE

- 46 -

Der Referenzstamm WH207(λtet50)[pWH1911] zeigte sowohl in M9-Minimalmedium mit 50

mM Glyzerin als auch mit 50 mM Pyruvat über den gesamten Zeitraum des Experiments mit

110 bis 210 MU Basalaktivitäten der β-Galaktosidase (Abb. 3.25). WH852 hingegen wies in

beiden Medien, mit maximal ca. 500 MU unter Glyzerin und ca. 1000 MU unter Pyruvat,

deutlich höhere β-Galaktosidase Aktivitäten als die Basalwerte des Referenzstamms auf, was

auf die Induktion von TetR durch exprimiertes PpiD-InsTip1 zurückzuführen ist. Für WH852

kann überdies in Pyruvat-haltigem Medium bei allen Messpunkten eine höhere β-

Galaktosidase Aktivität nachgewiesen werden, als in Gegenwart von Glyzerin (Abb. 3.25),

was auf eine erhöhte Expression von PpiD-InsTip1 unter Pyruvat als C-Quelle schließen lässt.

Beim Erreichen einer oD600 von 0,2 zeigte der Referenzstamm unter Glyzerin ein TetR

reprimiertes Hintergrundniveau der β-Galaktosidase Aktivität von ca. 173 MU und unter

Pyruvat von ca. 114 MU. Der PpiD-InsTip1 exprimierende Stamm WH852 vermittelte in

Anwesenheit von Pyruvat (ca. 343 MU) ein höheres Aktivitätsniveau als unter Glyzerin (ca.

287 MU). Nach Subtraktion der Basalaktivität des Referenzstamms von der Aktivität des

Stamms WH852 für die jeweilige C-Quelle, ergibt sich für die β-Galaktosidase Aktivität des

PpiD-InsTip1 exprimierenden Stamms WH852 in Gegenwart von Pyruvat gegenüber

Glyzerin eine Induktion um den Faktor 2 (Abb. 3.26; Tab. 3.4).

Abb. 3.26: Vergleich der β-Galaktosidase Aktivitäten des Stammes WH852 und des Referenzstamms bei einer oD600 von 0,2 in M9-Minimalmedium mit unterschiedlichen C-Quellen. Die Messung der β-Galaktosidase Aktivität wurde in vivo für die Stämme WH207(λtet50)pWH1911 (schwarze Balken) bzw. WH852 (weiße Balken) durchgeführt, wobei die Proben bei einer oD600 von 0,2 entnommen wurden. Die Anzucht erfolgte hierfür in 100 ml M9-Minimalmedium mit 50 mM Glyzerin bzw. 50 mM Pyruvat als C-Quelle bei 37°C. In beiden Stämmen wird TetR von pWH1911 exprimiert. Die Werte der β-Galaktosidase Aktivität wurden in Einheiten nach Miller [MU] (Miller, 1972) aufgetragen. Die gepunktete Linie spiegelt das Basalniveau der β-Galaktosidase Aktivität des Wildtyps bei einer oD600 von 0,2 wider.

ERGEBNISSE

- 47 -

β-Galaktosidase Aktivität

Stamm C-Quelle

MU

MUbereinigt Faktor

WH207(λtet50)[pWH1911]

Glyzerin

173,3 ± 2,2

WH852 Glyzerin 287,3 ± 11,5 114,0 ± 11,5

WH207(λtet50)[pWH1911] Pyruvat 113,7 ± 1,9

WH852 Pyruvat 342,9 ± 4,6 229,2 ± 4,6

2

Tab. 3.4: Vergleich der β-Galaktosidase Aktivität von WH207(λtet50)[pWH1911] und WH852 in Absolutwerten. Die Werte der β-Galaktosidase Aktivität sind in Einheiten nach Miller [MU] (Miller, 1972) angegeben. Die Differenz der β-Galaktosidase Aktivität zwischen WH852 und WH207(λtet50)[pWH1911] in Gegenwart der jeweiligen C-Quelle ist in [MUbereinigt] angegeben.

3.4 Konstruktion und in vivo Funktionsanalyse von InsTip1-Derivaten

In Arbeiten von Klotzsche und Goeke zur Struktur-Funktionsbeziehung der Tip-TetR-

Interaktion wurde gezeigt, dass eine C-terminale Tip-Fusion an TrxA durch einen

zusätzlichen Methionin-Rest (TrxA-MTip) zwischen der Linker-Sequenz und der ersten

Aminosäure von Tip, TetR effektiver induziert (Klotzsche, persönliche Mitteilung; Goeke,

2006).

Mittels einer Zufalls-Mutagenese wurde an dieser Position die Aminosäure Methionin gegen

alle weiteren natürlichen Aminosäuren ausgetauscht. Durch die Analyse der TetR-

Induktionsfähigkeit der resultierenden C-terminalen TrxA-XTip Varianten wurde ersichtlich,

dass die Insertion der Aminosäuren Methionin bzw. Phenylalanin (TrxA-MTip bzw. TrxA-

FTip) die größte Steigerung der Induktion vermittelt, wenn anstelle des Wildtyp Tet-

Repressors die TetR-Derivate N82A bzw. F86A (Goeke, 2006), kodiert auf den pWH1911-

Derivaten pWH1400 (TetRN82A), pWH1406 (TetRF86A) bzw. pWH1407

(TetRN82A/F86A), genutzt werden.

Um zu überprüfen, ob auch im Kontext der TetR induzierenden Peptidsequenz InsTip1,

kodiert auf InsTipα, die Insertion der Aminosäure Methionin oder Phenylalanin an dieser

Position zu einer Steigerung der induzierenden Eigenschaft führen kann, wurde die Sequenz

des Plasmids pWH1912 gerichtet um das Codon für die jeweilige Aminosäure erweitert. Die

Plasmide wurden pWH1398 bzw. pWH1399 genannt und exprimieren unter Kontrolle von

Ptac die C-terminalen Fusionsproteine TrxA-InsTip2 bzw. TrxA-InsTip3, die 139 AS

ERGEBNISSE

- 48 -

umfassen (Abb. 3.27). Die Klonierungsstrategie für beide Plasmide ist in Kap. 5.1.10

dargestellt.

Abb. 3.27: Schematische Karten der Plasmide pWH1909, pWH1398 und pWH1399, sowie der Fusionsproteine TrxA-InsTip1, TrxA-InsTip2 und TrxA-InsTip3. Das Gen trxA ist als grauer Pfeil gekennzeichnet, das jeweilige Insertionselement (InsTipα, InsTipβ und InsTipγ) schließt sich daran an. Die weiße Box repräsentiert die Ampicillin-Resistenzkassette (ApR). Der Replikationsursprung (pMB1) ist als graue Box dargestellt. Der jeweilige offene Leserahmen des 3´-markierten Gens trxA ist als dünner schwarzer Pfeil gekennzeichnet. Aminosäuren sind im Ein-Buchstaben-Code angegeben. Der Aminoterminus ist mit H2N gekennzeichnet, der Carboxyterminus mit COOH. TrxA und Tip sind schematisch dargestellt. Die Aminosäuren Methionin und Phenylalanin vor Tip sind mit einem Pfeil gekennzeichnet. (A) pWH1909 und TrxA-InsTip1 (B) pWH1398 und TrxA-InsTip2 (C) pWH1399 und TrxA-InsTip3.

Der Stamm E. coli WH207(λtet50) wurde mit dem TetR-Derivat exprimierenden Plasmid und

pWH1909, pWH1398 bzw. pWH1399 cotransformiert. Das jeweilige TetR-Derivat wird

konstitutiv auf niedrigem Niveau exprimiert (Klotzsche et al., 2005). Die Analyse der TetR-

Induktionsfähigkeit von TrxA-InsTip1, TrxA-InsTip2 bzw. TrxA-InsTip3 erfolgte mittels β-

Galaktosidase Aktivitätsmessung (siehe Kap. 5.4.8).

trxA

Ptac

pWH19096319 bp

Ptac

pWH13986322 bp

trxA

Ptac

pWH13996322 bp

trxA

ApR

pMB

1

trxA

Ptac

pWH19096319 bp

Ptac

pWH13986322 bp

trxA

Ptac

pWH13996322 bp

trxA

ApR

pMB

1

AVSYTHLSGGAGGATip

COOHH2N TrxA

AVSYTHLSGGAGGAMTip

COOHH2N TrxA

AVSYTHLSGGAGGAFTip

COOHH2N TrxA

A

B

C

ERGEBNISSE

- 49 -

Abb. 3.28: Vergleich der Induktion von TetR, TetRN82A, TetRF86A und TetRN82A/F86A durch TrxA-InsTip1, TrxA-InsTip2 bzw. TrxA-InsTip3. Die TetR-Derivate werden von pWH1911, pWH1400, pWH1406 bzw. pWH1407 exprimiert. TrxA-InsTip1 ist auf pWH1909, TrxA-InsTip2 auf pWH1398 und TrxA-InsTip3 auf pWH1399 kodiert. Die Induktion von Ptac erfolgte mit 120 µM IPTG (schwarze Balken). Die Messung wurde in E. coli WH207(λtet50) bei 28°C durchgeführt. Die Aktivität der β-Galaktosidase ist in Einheiten nach Miller [MU] (Miller, 1972) angegeben.

Die Expression des jeweiligen Fusionsproteins wurde mit einer IPTG Konzentration von 120

µM induziert, da bereits das Plateau der β-Galaktosidase Aktivität bei dieser IPTG

Konzentration erreicht ist (Klotzsche et al., 2005). Gegenüber Wildtyp TetR zeigten TrxA-

InsTip2 und TrxA-InsTip3 im Vergleich zu TrxA-InsTip1 keine signifikante Veränderung der

β-Galaktosidase Aktivität mit und ohne IPTG (Abb. 3.28). TrxA-InsTip1 vermittelt

gegenüber keinem der TetR-Derivate eine gesteigerte Induktion, wobei gegenüber allen TetR-

Varianten eine maximale β-Galaktosidase Aktivität von ca. 3100 MU erreicht wird. Eine

Ausnahme stellt TetRN82A dar, wo nur ca. 1500 MU erreicht werden. Weiterhin konnte

gezeigt werden, dass TetRN82A/F86A mit Werten von ca. 950 MU, deutlich ineffizienter

reprimieren als die übrigen TetR-Varianten (ca. 170 bis 240 MU), was direkt mit unabhängig

gemessenen Daten korreliert (Klotzsche, persönliche Mitteilung; Goeke, 2006). Die

Methionin-Variante TrxA-InsTip2, als auch die Phenylalanin-Variante TrxA-InsTip3

hingegen zeigen mit maximalen β-Galaktosidase Aktivitäten von ca. 4500 bis 4900 MU

deutlich höhere Induktion gegenüber dem Repressor, als TrxA-InsTip1, wenn anstelle des

0

2000

4000

6000

TrxA-InsTip1 TrxA-InsTip2 TrxA-InsTip3

0

2000

4000

6000

β-G

al. A

ktiv

ität [

MU

]

wt N82A F86A N82A F86A

wt N82A F86A N82A F86A

wt N82A F86A N82A F86A

0

2000

4000

6000

TrxA-InsTip1 TrxA-InsTip2 TrxA-InsTip3

0

2000

4000

6000

β-G

al. A

ktiv

ität [

MU

]

wt N82A F86A N82A F86A

wt N82A F86A N82A F86A

wt N82A F86A N82A F86A

wt N82A F86A N82A F86A

wt N82A F86A N82A F86A

wt N82A F86A N82A F86A

ERGEBNISSE

- 50 -

Wildtyp TetR die Varianten TetRN82A, TetRF86A bzw. TetRN82A/F86A vorliegen (Abb.

3.28).

Um zu ermitteln, welche der Fusionsprotein-Repressor-Kombination die stärkste Induktion

vermittelt, wurden die β-Galaktosidase Aktivitäten ohne IPTG verglichen, da die β-

Galaktosidase Aktivitäten bei 120 µM IPTG bereits ein maximales Plateau erreichen (Abb.

3.28).

Die Aktivität der β-Galaktosidase war ohne IPTG bei TrxA-InsTip2 im Vergleich zu TrxA-

InsTip1 3,3-fach höher, wenn als Repressor TetRN82A vorlag. In Gegenwart der weiteren

TetR-Varianten TetRF86A bzw. TetRN82A/F86A vermittelte TrxA-InsTip2 gegenüber

TrxA-InsTip1, mit 1,4-fach bzw. 1,2-fach eine nur leicht erhöhte β-Galaktosidase Aktivität

(Abb. 3.28).

Die Phenylalanin-Variante TrxA-InsTip3 zeigte ebenso ohne IPTG gegenüber TrxA-InsTip1

in Gegenwart der TetR-Derivate TetRN82A, TetRF86A bzw. TetRN82A/F86A eine 4,2-fach,

14-fach bzw. 4,9-fach erhöhte β-Galaktosidase Aktivität (Abb. 3.28). Die höchste Aktivität

vermittelte somit die InsTip3-Fusion in Kombination mit TetRF86A, die eine 19-fach höhere

β-Galaktosidase Aktivität ohne IPTG vermittelt, als die Kombination von InsTip1-Fusion mit

Wildtyp TetR (Abb. 3.28).

ERGEBNISSE

- 51 -

3.5 Konstruktion eines Rekombinationselements zur gerichteten

Erzeugung von chromosomal kodierten N-terminalen Tip-

Fusionsproteinen

3.5.1 Architektur und Funktionsprinzip des Rekombinationselements ReTipN

Als weiteres Projekt wurde, neben der Transposase-vermittelten, unspezifischen Insertion der

Tip-kodierenden Nukleotidsequenz in das Genom von E. coli, mit Hilfe der dargestellten

Insertionselemente (InsTipα, InsTipβ bzw. InsTipγ), ein System aufgebaut, dass es erlaubt,

gerichtet im prokaryotischen Genom Gene am 5´-Ende mit tip zu markieren, um anschließend

die Expression N-terminaler Tip-Fusionsproteine von ihrem endogenen Locus zu analysieren.

Im Rahmen einer Dissertation wurde ein Rekombinationselement zur gerichteten

Modifikation des 3´-Endes eines Gens konstruiert, so dass C-terminal Tip-markierte

Fusionsproteine von ihrem natürlichen chromosomalen Locus exprimiert werden konnten

(Klotzsche, 2005). Die Integration des Elements erfolgte durch das von Datsenko und Wanner

entwickelte „λ Red System“ (Datsenko und Wanner, 2000).

Um den offenen Leserahmen eines Gens am 5´-Ende gerichtet mit der Tip-kodierenden

Sequenz zu markieren, wurde im Rahmen dieser Arbeit das Rekombinationselement ReTipN

konstruiert. Es erlaubt, auf die genomische Integration von ReTipN zu selektieren und

anschließend mit Hilfe der in trans exprimierten Flp-Rekombinase, die von FRT-Elementen

flankierte Kanamycin-Resistenzkassette (Guérout-Fleury et al., 1995) zu entfernen. ReTipN

wurde so konzipiert, dass die Tip-kodierende Sequenz, das zurückbleibende FRT-Element

und das Zielgen einen durchgehenden Leserahmen bilden, wodurch das 5´-Ende des Zielgens

mit der TipFRT1-kodierenden Sequenz fusioniert wird, ohne den endogenen Promotor des

Zielgens und die 5´-liegenden Elemente, die für die Translation wichtig sind, zu verändern.

In Abb. 3.29 ist der schematische Aufbau des Rekombinationselements ReTipN

wiedergegeben.

ERGEBNISSE

- 52 -

Abb. 3.29: Schematische Darstellung des Rekombinationselements ReTipN. Das Startcodon „ATG“ ist als kleiner weißer Balken und die Tip kodierende Sequenz als grauer Balken dargestellt. Die FRT-Elemente sind als schwarze Fünfecke gekennzeichnet und das Nukleotid „A“ am 3´-Ende von ReTipN, als kleiner schwarzer Balken. Der weiße Pfeil zeigt das Gen aphAIII und bildet mit dem Promotor die Resistenzkassette KmR. Die Nukleotidsequenz des kodierenden offenen Leserahmens von TipFRT1 ist schwarz hinterlegt, die Aminosäuren sind im Ein-Buchstaben-Code über dem jeweiligen Codon-Triplett angegeben.

In einer PCR muss durch zwei Oligonukleotide das zu integrierende DNA-Fragment

amplifiziert werden. Die Oligonukleotide sind so gewählt, dass sie mit 20 nt ihres 3´-Endes an

die Sequenzenden des Rekombinationselements ReTipN binden und an ihrem 5´-Ende

mindestens 36 nt enthalten, die identisch zur Sequenzumgebung am Zielort sind (Datsenko

und Wanner, 2000; Murphy und Campellone, 2003) (Abb. 3.30A).

Nach Elektroporation des Stamms mit dem amplifizierten DNA-Fragment erfolgt die

Integration von ReTipN ins Genom durch homologe Rekombination über die am 5´- und 3´-

Ende liegenden, genom-identischen Sequenzabschnitte. Die nach spezifischer Integration

resultierende genomische Lokalisation des Rekombinationselements am 5´-Sequenzterminus

des Zielgens (orfX) ist in Abbildung 3.30C dargestellt. Nach Flp-Rekombinase vermittelter

Eliminierung der Kanamycin-Resistenzkassette wird der durchgehende Leserahmen der

TipFRT1-kodierenden Sequenz an das Zielgen fusioniert, wodurch so die Expression des

TipFRT1-Fusionsproteins, wie unter Wildtyp-Bedingungen, unter Kontrolle des jeweiligen

endogenen Promotors steht (Abb. 3.30C und D).

5´ 3´

Flp-Rekombinase

ERGEBNISSE

- 53 -

Die Klonierungsstrategie des Rekombinationselements ReTipN ist in Kap. 5.1.10 dargestellt,

das resultierende Plasmid wurde pWH1914 genannt.

A

B

C

D

Abb. 3.30: Schematische Darstellung der sequenzspezifischen Integration des Rekombinationselements ReTipN. Das Startcodon „ATG“ ist als kleiner weißer Balken und die Tip kodierende Sequenz als grauer Balken dargestellt. Der weiße Pfeil zeigt das Gen aphAIII und bildet mit dem Promotor die Resistenzkassette KmR. Die FRT-Seiten sind als schwarze Fünfecke gekennzeichnet und das Nukleotid „A“ am 3´-Ende von ReTipN als kleiner schwarzer Balken. Die Stopcodons in allen drei Leserastern sind als „SSS“ dargestellt. Das Zielgen (orfX) ist als grauer Pfeil wiedergegeben. Der offene Leserahmen des 5´-markierten Gens orfX ist als dünner schwarzer Pfeil gekennzeichnet.

Rekombinationselement ReTipN

Genom

Genom

λ Red

Genom

Flp-Rekombinase

Wildtyp

tipFRT1-markierter Stamm

orf

5´-markierter orf

Integration von ReTipN

Oligonukleotid

PCR

SS

SSS

S

SS

S

orfX

SS

SSS

S

orfX

SS

SorfXS

SSSS

SorfX

orfXorfX

Oligonukleotid

ERGEBNISSE

- 54 -

3.5.2 Überprüfung der in vivo Funktionalität einer TipFRT1-Proteinfusion

Die TipFRT1-kodierende Sequenz wurde auf einem Plasmid so an das 5´-Ende von trxA

kloniert, dass sie einen durchgehenden offenen Leserahmen mit trxA bildet. Das Plasmid

wurde pWH1913 genannt und erlaubt die Analyse der in vivo Funktionalität des N-terminalen

Fusionsproteins TipFRT1-TrxA. Dieses umfasst 137 AS und wird unter Kontrolle von Ptac

exprimiert (Abb. 3.31). Die Klonierungsstrategie ist in Kap. 5.1.10 dargestellt.

Abb. 3.31: Schematische Karte des Plasmids pWH1913 und des TipFRT1-TrxA-Fusionsproteins. (A) Das Startcodon „ATG“ ist als kleiner weißer Balken, die Tip kodierende Sequenz als grauer Balken und die FRT-Seite als schwarzes Fünfeck dargestellt und das Nukleotid „A“ am 3´-Ende von ReTipN als kleiner schwarzer Balken. Das Gen trxA ist als grauer Pfeil gekennzeichnet. Die weiße Box repräsentiert die Ampicillin-Resistenzkassette (ApR). Der Replikationsursprung (pMB1) ist als graue Box dargestellt. Der offene Leserahmen des 5´-markierten Gens trxA ist als dünner schwarzer Pfeil gekennzeichnet. (B) Aufbau von TipFRT1-TrxA. Aminosäuren sind im Ein-Buchstaben-Code angegeben. Der Aminoterminus ist mit H2N gekennzeichnet, der Carboxyterminus mit COOH. TrxA und Tip sind schematisch dargestellt.

Der Stamm E. coli WH207(λtet50) wurde mit pWH527 und pWH1913 cotransformiert.

pWH527 exprimiert TetR konstitutiv auf mittlerem Niveau (Klotzsche et al., 2005). Die

Analyse der TetR-Induktionsfähigkeit von TipFRT1-TrxA erfolgte mittels β-Galaktosidase

Aktivitätsmessung (siehe Kap. 5.4.8). Parallel wurde als Kontrollansatz WH207(λtet50)

anstelle von pWH1913 mit dem Plasmid pWH2201 transformiert, welches das TetR

induzierende N-terminale Fusionsprotein Tip-TrxA exprimiert (Klotzsche et al., 2005).

H2N COOHTrxATip

M RSSYSLESIGTSH2N COOHCOOHTrxATrxATip

M RSSYSLESIGTS

A B

ApR

pMB

1

pWH19134586 bp

trxA

Ptac

ApR

pMB

1

pWH19134586 bp

trxA

Ptac

ERGEBNISSE

- 55 -

Abb. 3.32: Vergleich der Induktion von TetR durch Tip-TrxA und TipFRT1-TrxA. TetR wird von pWH527 exprimiert. Tip-TrxA ist auf pWH2201, TipFRT1-TrxA auf pWH1913 kodiert. Die Induktion von Ptac erfolgte mit 1 - 128 µM IPTG (schwarze Balken). Die Messung wurde in E. coli WH207(λtet50) bei 28°C durchgeführt. Die Aktivität der β-Galaktosidase ist in Einheiten nach Miller [MU] (Miller, 1972) angegeben.

Mit IPTG Konzentrationen von 1 bis 128 µM wurde die Expression des jeweiligen

Fusionsproteins induziert (Abb. 3.32). Die Expression von Tip-TrxA und TipFRT1-TrxA

führt bereits in Gegenwart von 1 µM IPTG zur Induktion von TetR, detektierbar durch eine

26-fache Steigerung der β-Galaktosidase Aktivität durch Tip-TrxA gegenüber dem TetR

reprimierten Zustand (125 MU) und eine 19-fache Steigerung durch TipFRT1-TrxA (Abb.

3.32). Die Induktion der β-Galaktosidase Aktivität kann durch Erhöhung der IPTG-

Konzentration bis 8 µM noch kontinuierlich gesteigert werden. Ab einer Konzentration von 8

µM IPTG erreicht diese mit einer 34-fachen Steigerung ein Plateau bei ca. 4300 MU, was die

maximale TetR Induktion durch die Fusionsproteine Tip-TrxA und TipFRT1-TrxA

widerspiegelt (Abb. 3.32).

Abb. 3.33: Vergleich der Expressionsniveaus von Tip-TrxA und TipFRT1-TrxA mittels Western Blot Analyse. Das Expressionsniveau von Tip-TrxA bzw. TipFRT1-TrxA wurde mittels eines monoklonalen anti-ThioTM Antikörpers detektiert. Hierfür wurden 5 µg Proteinrohlysat je Spur aufgetragen. Die Rohlysate wurden aus den üTK der β-Galaktosidase Aktivitätsmessung gewonnen. Die jeweilige Peptidlänge ist in [AS] angegeben, das Molekulargewicht in [kDa].

pWH2201 pWH19130

1000

2000

3000

4000

5000

6000

0

2000

4000

6000

β-G

al. A

ktiv

ität [

MU

]

0 1 2 4 8 16 32 64 1280 1 2 4 8 16 32 64 128 0 1 2 4 8 16 32 64 1280 1 2 4 8 16 32 64 128

Tip-TrxA

125 AS; 13,4 kDa

TipFRT1-TrxA

137 AS; 14,7 kDa

pWH2201 pWH1913

0 2 8 32 128 0 2 8 32 128

IPTG [µM]

0 2 8 32 128 0 2 8 32 128

IPTG [µM]

ERGEBNISSE

- 56 -

Gleichzeitig durchgeführte Western Blot Analysen (siehe Kap. 5.4.10), bei denen die

Fusionsproteine Tip-TrxA und TipFRT1-TrxA durch einen monoklonalen anti-ThioTM

Antikörper nachgewiesen wurden, zeigten ein niedrigeres Expressionsniveau für TipFRT1-

TrxA im Vergleich zu Tip-TrxA (Abb. 3.33).

Da TipFRT1-TrxA das gleiche maximale TetR-Induktionsniveau wie Tip-TrxA vermittelt,

beeinflussen weder die Länge noch die Sequenz des Peptid-Anhängsels TipFRT1 die

induzierenden Eigenschaften von Tip gegenüber TetR im Kontext einer N-terminalen Fusion

am Modellprotein TrxA.

Im Rahmen einer Diplomarbeit wurde das Rekombinationselement ReTipN zur

chromosomalen Markierung der Gene ptsH und trxA im pathogenen Modellorganismus

Salmonella enterica Serovar Typhimurium genutzt. Die Expression der resultierenden N-

terminal Tip-markierten Fusionsproteine HPr und TrxA konnte, mittels eines TetR regulierten

LacZ-Reporterkonstrukts, in vivo nachgewiesen werden (Friedlein, 2006).

DISKUSSION

- 57 -

4. Diskussion

Die Eigenschaft des Hexadecapeptids Tip als C- oder N-terminale Fusion an Trägerproteine

wie TrxA oder SbmC den Tet Repressor zu induzieren (Klotzsche et al., 2005; Capek, 2005),

eröffnete die Möglichkeit, beliebige Proteine mit Tip am C- oder N-Terminus zu markieren

und die Expression dieser Fusionsproteine durch ein TetR reguliertes Reporterkonstrukt in

vivo zu detektieren.

Im Rahmen dieser Arbeit wurden zum einen zwei DNA-Elemente für ungerichtete,

genomweite Mutagenesestudien konstruiert, die mittels hyper- und transaktiver Tn5-

Transposase mobilisiert werden können. Die InsTipSup bzw. InsTipα genannten

Insertionselemente verwenden Elemente, die von dem prokaryotischen Transposon Tn5

abgeleitet sind und die Sequenz des Transkription-induzierenden Peptids Tip kodieren. Sie

wurden so aufgebaut, dass sie bei Integration in den richtigen Leserahmen eines Gens, dieses

mit der InsTip1-kodierenden Sequenz markieren. Wird das markierte Gen translatiert,

entstehen InsTip1-Fusionsproteine. Mittels eines Tet-regulierten Reporterkonstrukts sollten

nach einer ungerichteten Insertionsmutagenese durch InsTipSup bzw. InsTipα Stämme isoliert

werden, die TetR-induzierende InsTip1-Fusionsproteine synthetisieren. Die Expression dieser

Fusionsproteine kann anschließend qualitativ und quantitativ in vivo analysiert werden.

In den weiteren Abschnitten dieser Arbeit werden die nachfolgenden Gesichtspunkte

vergleichend diskutiert: (A) Die TetR-induzierenden Eigenschaften der Fusionsanhängsel

InsTip1, InsTip2 und InsTip3 im Vergleich zu Tip und Tip-Derivaten. (B) Vergleich der

Insertionselemente InsTipSup und InsTipα, sowie weiterer mobilisierbarer Elemente zur

Erzeugung von Translationsfusionen. (C) Vergleich der Expression von InsTip1-

Fusionsproteinen mit publizierten Daten. (D) Vergleich der Methoden zur Proteindetektion

mittels Proteinanhängseln.

Als zweites Projekt dieser Arbeit wurde das Rekombinationselement ReTipN aufgebaut, dass

es erlaubt, mit Hilfe des von Datsenko und Wanner entwickelten „λ Red Systems“ (Datsenko

und Wanner, 2000) ins prokaryotische Genom gerichtet zu integrieren und Gene am 5´-Ende

mit tip zu markieren, um anschließend die Expression N-terminaler Tip-Fusionsproteine von

ihrem endogenen Locus zu analysieren (Friedlein, 2006). Die TetR-induzierenden

Eigenschaften des neu konstruierten N-terminalen Fusionsanhängsels TipFRT1 sollen hier mit

denen von Tip vergleichend diskutiert werden.

DISKUSSION

- 58 -

4.1 Insertionselemente zur Erzeugung von Translationsfusionen

In der Literatur sind verschiedene Insertionselemente beschrieben worden, die auf dem Tn5-

Transposon basieren und für die ungerichtete Erzeugung von C-terminalen

Translationsfusionen mit verschiedenen Reporterenzymen in Prokaryoten genutzt werden. Die

Fähigkeit von Tn5-Transposomen nahezu sequenzunspezifisch in Ziel-DNA zu inserieren

(York et al., 1998; Goryshin et al., 1998; Hoffman et al., 2000) ist besonders für genomweite

Anwendungen von Bedeutung und erklärt die vielfältige Nutzung von Insertionselementen die

auf Tn5 basieren. Typischerweise verfügen diese Insertionselemente, wie auch InsTipα, aus

Selektionsgründen zusätzlich über Resistenz-vermittelnde Gene gegen Antibiotika wie

Chloramphenicol oder Kanamycin.

Insertionselemente wie z.B. TnphoA (Manoil und Beckwith, 1985) oder TnphoA/in (Manoil

und Bailey, 1997) beinhalten den durchgehenden Leserahmen des Gens phoA. Sie werden

genutzt Translationsfusionen mit der Alkalischen Phosphatase (PhoA) aus E. coli zu

generieren, um exportierte Proteine oder Proteine des Periplasmas zu detektieren, da PhoA

nur außerhalb des Cytoplasma enzymatisch aktiv ist (Manoil et al., 1990). Aufbau und

Funktion von TnlacZ/in (Manoil und Bailey, 1997) entsprechen denen von TnphoA/in, wobei

TnlacZ/in die Nukleotidsequenz des Reporterenzyms β-Galaktosidase trägt, um auch nicht-

exportierte, cytoplasmatische Proteine in vivo detektieren zu können.

Die hier beschriebenen Insertionselemente TnphoA, TnphoA/in bzw. TnlacZ/in kodieren, im

Gegensatz zu InsTipα, in cis die Transposase, die zur Mobilisierung des Elements benötigt

wird (Manoil und Beckwith, 1985; Manoil und Bailey, 1997). Die Mobilisierung des

jeweiligen Insertionselements erfolgt hierbei auch nicht über die von Zhou et al. optimierten,

19 bp langen Mosaik Elemente (ME) (Zhou et al., 1998) als Binde- und Erkennungsstellen

der hyper- und transaktiven Tn5-Transposase (Goryshin und Reznikoff, 1998), sondern über

die flankierenden IS50-Elemente eines Tn5-Transposons.

Ein vom Aufbau und der Mobilisierungsmethode mit InsTipα vergleichbares

Insertionselement stellt EZ::Tn<cre-cat> dar (Briones et al., 2006), dass ebenso von zwei ME

flankiert ist und mittels der von Goryshin et al. etablierten Methode in vitro Transposomen

bildet. EZ::Tn<cre-cat> trägt die Nukleotidsequenz des Gens cre, um C-terminale

Translationsfusionen der Cre-Rekombinase mit Zielproteinen zu erzeugen. Durch in vitro

Transpositionsmutagenesen mit EZ::Tn<cre-cat> wurde das Protein SopE aus S. enterica mit

Cre markiert und die Expression des SopE-Cre Fusionsproteins nachgewiesen (Briones et al.,

2006).

DISKUSSION

- 59 -

4.2 Vergleich der TetR-Induktion durch Tip- bzw. InsTip1-Fusionen

Um eine Kollektion an Stämmen zu erhalten, die Tip-Fusionsproteine von ihrem natürlichen

Lokus im Genom eines Prokaryoten aus exprimieren, sollte die Markierung der Gene mit der

Tip-kodierenden Sequenz durch den Einsatz eines Sequenz-unspezifisch integrierenden

Insertionselements erfolgen (Kap. 3.1).

Initial war hierbei von elementarer Bedeutung, dass bei der Markierung eines Gens mit tip die

Tip-kodierende Sequenz als Teil des Insertionselements ins Genom integriert wird. Da ein

durch die hyper- und transaktive Tn5-Transposase zu mobilisierendes Insertionselement von

Mosaik Elementen flankiert ist, musste zur Generierung eines tip-markierten Gens, dieses mit

der Nukleotidsequenz eines ME und der Tip-kodierenden Sequenz in einem durchgehenden

Leserahmen verbunden werden.

Da in diesem Kontext Tip nicht direkt an den C-Terminus eines Proteins fusioniert werden

konnte, wurde überprüft, ob die sieben Aminosäuren des translatierten ME zwischen dem

Zielprotein und Tip einen Einfluß auf die TetR-induzierenden Eigenschaften des

resultierenden Fusionsproteins haben. Von den drei möglichen Leserastern eines ME wurde

das ausgewählt, das die Aminosäuresequenz Ala-Val-Ser-Tyr-Thr-His-Leu kodiert, da diese

Sequenz hauptsächlich kleinere bzw. hydrophile Aminosäuren beinhaltet, die keine

Sekundärstruktur vermitteln.

Hierbei zeigten β-Galaktosidase Aktivitätsmessungen mittels des in vivo Reportersystems in

E. coli WH207(λtet50)[pWH527], dass es bei direkter Fusion des Trägerproteins TrxA über

die Ala-Val-Ser-Tyr-Thr-His-Leu-Sequenz mit Tip zum vollständigen Verlust der TetR-

induzierenden Eigenschaften des Fusionsanhängsels kommt (Kap. 3.2.1).

Durch die zusätzliche Insertion einer Nukleotidsequenz zwischen ME und tip, wurde der

Leserahmen um die Ser-Gly-Gly-Ala-Gly-Gly-Ala kodierende Sequenzabfolge verlängert.

Der Einschub dieser kleinen und flexiblen Aminosäurereste sollte die Flexibilität des

Peptidanhängsels erhöhen und den sterischen Einfluss der Aminosäuren des ME auf die TetR-

induzierenden Eigenschaften von Tip minimieren (Kap. 3.2.1). β-Galaktosidase

Aktivitätsmessungen zeigten, dass dadurch die TetR-induzierenden Eigenschaften von Tip

wiederhergestellt werden konnten. Das resultierende InsTip1-Peptidanhängsel vermittelt im

Kontext einer C-terminalen Translationsfusion mit dem Trägerprotein TrxA, kodiert auf

pWH1909, die gleiche Induktionseffizienz gegenüber TetR wie das von Klotzsche et al.

konstruierte TrxA-Tip (Klotzsche et al., 2005). Beide Konstrukte werden auf dem gleichen

Plasmidhintergrund exprimiert (Kap. 3.3.1).

DISKUSSION

- 60 -

Erfolgt die Expression desselben Fusionsproteins TrxA-InsTip1 jedoch im Kontext des

Vektors pWH1903, wird im Vergleich zu TrxA-Tip die maximale Induktion erst bei höheren

Synthesemengen von TrxA-InsTip1 erreicht. Western Blot-Analysen wiesen nach, dass auf

pWH1903 Ptac erst bei einer IPTG Konzentration von 250 µM dieselbe Menge an TrxA-

InsTip1 vermittelt, die der Menge an TrxA-Tip in Gegenwart von 15 µM IPTG entspricht

(Kap. 3.2.1).

Um einen möglichen Grund für die unterschiedlichen Expressionsmengen von TrxA-InsTip1

zu ermitteln, müssen vorab für beide Plasmide, pWH1903 und pWH1909, die

Gemeinsamkeiten und Unterschiede herausgearbeitet werden.

Beide Plasmide verfügen über denselben Ptac-Promotor und exprimierten das identische

Fusionsprotein TrxA-InsTip1. Auch die kodierende Nukleotidsequenz ist identisch, was einen

möglichen Einfluss der Codonverteilung auf die Syntheserate der Proteine ausschließt.

Die Konstrukte unterscheiden sich durch das Stopcodon am 3´-Ende der InsTip1-kodierenden

Sequenz. pWH1903 verfügt über ein TAG-Stopcodon (Kap. 3.2.1), pWH1909 hingegen über

ein TAA-Stopcodon (Kap. 3.3). Jedoch wurde für diese Stopcodons in E. coli gezeigt, dass

sie, wie im Kontext von pWH1903 bzw. pWH1909 am 3´-Ende gefolgt von dem Nukleotid G,

eine annähernd gleich effiziente in vivo Terminationsaktivität von über 50% aufweisen und so

zu den effizientesten Stopcodons zählen (Poole et al., 1995). Somit sollte die

Terminationseffizienz am Stopcodon des jeweiligen Konstrukts keinen Einfluss auf die

unterschiedlichen Expressionsmengen von TrxA-InsTip1 haben.

Der detektierte Expressionsunterschied von TrxA-InsTip1 beruht möglicherweise auf der

Länge und Struktur des 3´-Endes der transkribierten mRNA, das nicht translatiert wird. In

pWH1909 endet die Transkription der mRNA des Ptac-Promotors am bidirektionalen Tn10-

Transkriptionsterminator (Schollmeier et al., 1985) ca. 190 nt stromabwärts vom 3´-Ende von

trxA-instip1 (Kap. 3.3.1). Auf pWH1903 jedoch schließt sich an den offenen Leserahmen von

trxA-instip1 nach dem TAG-Stopcodon der offenen Leserahmen des cat Gens an, wodurch

eine weitaus längere mRNA gebildet werden kann, die im Kontext von pWH1903 einen 650

Nukleotid-langen, nicht translatierten Bereich umfassen kann (Kap. 3.2.1).

Einzelsträngige 3´-Enden der naszierenden mRNA werden als Substrate der bakteriellen 3´-

5´-Exonukleasen erkannt und abgebaut, wohingegen doppelsträngige

Stammschleifenstrukturen wie der Tn10-Transkriptionsterminator auf pWH1909 die 3´-Enden

der mRNA-Transkripte vor Abbau durch 3´-exo-RNasen schützen (Rauhut und Klug, 1999;

Carpousis, 2002; Kennell, 2002). Somit könnten die unterschiedlichen Proteinmengen von

TrxA-InsTip1, exprimiert von pWH1903 bzw. von pWH1909 und die daraus resultierende

DISKUSSION

- 61 -

unterschiedliche TetR-Induktion auf die Stabilität der transkribierten mRNA zurückgeführt

werden.

4.3 Insertionsmutagenesen mit InsTipSup und InsTipα

Für die Insertionselemente InsTetG+ und InsTetG-1, die von dem prokaryotischen Transposon

Tn5 abgeleitet sind und ebenso wie InsTipSup und InsTipα über zwei flankierende Mosaik

Elemente verfügen, konnte gezeigt werden, dass sie mit der hyper- und transaktiven Tn5-

Transposase mobilisiert werden können und Sequenz-unspezifisch in DNA integrieren

(Bertram et al., 2005; Köstner et al., 2006).

Bei einer in vitro Insertionsmutagenese von InsTipSup-Transposomen in das Plasmid

pML005inv wurden 16 SucR-Klone erhalten, die eine Integration von InsTipSup in das Gen

sacB auf pML005inv aufwiesen (Kap. 3.2.5). Sieben Insertionen von InsTipSup fanden in der

Orientierung des sacB Leserahmens, neun in der entgegengerichteten Orientierung statt, was

einer Wahrscheinlichkeit von 44% bzw. 56% entsprach und der Zufallswahrscheinlichkeit

von 50% je Insertionsorientierung sehr nahe kommt. Bei den Insertionen von InsTipSup in

sacB zeigte sich, dass bei ca. 43% der Insertionen der +1-Leserahmen getroffen wurde, der für

die Erzeugung eines durchgehenden, tip-markierten Leserahmens benötigt wird (Kap. 3.2.5).

Trotz des geringen Probenumfangs von sieben Insertionen kommt dieses Ergebnis der

statistischen Wahrscheinlichkeit von 33,3% bei einer ungerichteten Insertionsverteilung je

Leserahmen nahe. Die Insertionsstellen in sacB zeigten keine konservierte Sequenzabfolge,

was für eine Sequenz-unspezifische Integration spricht und mit den Daten von Bertram et al.

und Köstner et al. im Einklang steht (Bertram et al., 2005; Köstner et al., 2006).

Diese in vitro Insertionsmutagenese zeigte, dass in vitro InsTipSup-Transposomen gebildet

werden können und InsTipSup Transposase-vermittelt Sequenz-unspezifisch in DNA

integrieren kann (Kap. 3.2.5).

Trotz dieser Tatsache konnten bei vier unabhängigen Elektroporationen von

WH207(λtet50)[p2650-sup:tRNAGly] mit InsTipSup-Transposomen (je 126 fmol InsTipSup;

entspricht jeweils 65 ng), in Gegenwart der Suppressor-tRNA sup:tRNAGly, keine InsTipSup-

Insertionsmutanten generiert werden, die InsTip1-Cat-markierte Fusionsproteine exprimieren,

welche Resistenz gegenüber Chloramphenicol vermitteln. Gründe hierfür könnten sein, dass

(A) bei den Insertionen von InsTipSup kein exprimiertes Gen markiert wurde oder (B) die

Expressionsmenge des Gens nicht ausreicht, um das InsTip1-Cat-Fusionsprotein in

DISKUSSION

- 62 -

entsprechender Menge zu synthetisieren und Resistenz gegenüber 10 µg/ml Cm zu erlangen,

was ca. 3-fach über der minimalen inhibitorischen Konzentration von ca. 3 µg/ml für

WH207(λtet50) lag. Ebenso besteht die Möglichkeit, dass (C) die Suppression des TAG-

Stopcodons durch sup:tRNAGly nicht ausreichend ist, das jeweilige Volllängenprotein

effizient zu bilden. Jedoch konnte durch Western Blot-Analysen gezeigt werden, dass in

Gegenwart einer Plasmid-kodierten sup:tRNAGly, die detektierte Menge an TrxA-InsTip1-Cat

der Menge an TrxA-InsTip1 entsprach, was in diesem Kontext auf eine Suppressionseffizienz

von ca. 50% schließen lässt (Kap. 3.2.3).

Mit dem Insertionselement InsTipα konnten jedoch im Vergleich zu InsTipSup in einer ersten

Insertionsmutagenese ca. 5500 Kanamycin-resistente InsTipα Insertionsmutanten in

WH207(λtet50)[pWH1911] generiert werden, in einer zweiten Insertionsmutagenese ca. 900.

Bei initial ca. 4 x 108 elektroporierten Zellen entspricht dies einer InsTipα Insertionsrate von

ca. 0,014‰, bzw. ca. 0,002‰. Je 20 ng InsTipα-DNA (je ca. 16 fmol) wurden für die

Elektroporation eingesetzt. Die Anzahl der InsTipα Integranten in

WH207(λtet50)[pWH1911] liegt hierbei mit ca. 2,75 x 105 KBE/µg InsTipα-DNA bzw.

4,5 x 104 KBE/µg InsTipα-DNA um eine bzw. zwei Zehnerpotenzen unter den publizierten

Daten für E. coli MG1655 von Goryshin et al. (Goryshin et al., 2000) (Kap. 3.3.2). Dies kann

an der Effizienz der Elektroporation des Stammes WH207(λtet50)[pWH1911] liegen.

Goryshin et al. konnten zeigen, dass die Insertionsraten zwischen verschiedenen E. coli

Stämmen um bis zu zwei Zehnerpotenzen voneinander abweichen können (Goryshin et al.,

2000). Eine Abhängigkeit dieser unterschiedlichen Insertionsraten von der Größe des

Insertionselements (Schmidt, 2005) kann ausgeschlossen werden, da das von Goryshin et al.

genutzte Insertionselement, ebenso wie InsTipα (Kap. 3.3), eine Länge von 1,8 kbp aufweist

(Goryshin et al., 2000).

Aus diesen Bibliotheken wurden durch ein visuelles Auswahlverfahren auf MacCONKEY

Bouillon-Agarplatten zwei bzw. drei Kandidaten isoliert, die erhöhte β-Galaktosidase

Aktivität aufwiesen (WH851-WH855), was auf die Induktion von TetR durch die jeweiligen

exprimierten InsTip1-Fusionsproteine (AtpD-InsTip1, PpiD-InsTip1, YraI-InsTip1, YicO-

InsTip1 bzw. YfdX-InsTip1) zurückzuführen ist (Kap. 3.3.2 und 3.3.3). Dies entspricht einer

Rate von ca. 0,4‰ bzw. 3,3‰ an InsTipα Insertionsmutanten, die auf diesem

Indikatormedium detektierbare InsTip1-Fusionsproteine exprimieren.

DISKUSSION

- 63 -

4.4 Über die InsTipα-Insertionsmutanten WH851 – WH855

4.4.1 Vergleich der genomischen Insertionsorte von InsTipα

Die Tn5-Transposase-vermittelte Integration des Insertionselements InsTipα in das Genom

von E. coli WH207(λtet50)[pWH1911] fand in die offenen Leserahmen der Gene atpD, ppiD,

yraI, yicO bzw. yfdX statt. Gerdes et al. definierten die vier Gene atpD, ppiD, yraI und yicO

als nicht-essentielle Gene, wohingegen das Gen yfdX als essentiell annotiert ist (Gerdes et al.,

2003) (Kap. 3.3.3). InsTipα inserierte hierbei nicht direkt am 3´-Ende des jeweiligen offenen

Leserahmens. Bei atpD und yraI erfolgte die Integration von InsTipα nahe dem 3´-Ende,

wodurch nach ca. 82% bzw. ca. 87% des jeweiligen offenen Leserahmens, das Gen mit

instip1 markiert wurde. Bei yicO und yfdX erfolgte die instip1-Markierung nach ca. 64% bzw.

nach ca. 74% des offenen Leserahmens und bei ppiD sogar nahe dem 5`-Ende nach ca. 17%

des offenen Leserahmens (Kap. 3.3.3). Die daraus resultierenden InsTip1-Fusionsproteine

beinhalten daher nur verkürzte N-terminale Teilfragmente des jeweiligen ursprünglichen

Proteins, was zeigt, dass die InsTipα-Insertion nicht direkt am 3´-Ende eines Gens erfolgen

muss, um ein TetR-induzierendes InsTip1-Fusionsprotein zu generieren, das auf

MacCONKEY Bouillon-Agarplatten visuell detektiert und isoliert werden kann (Kap. 3.3.2

und 3.3.3).

4.4.2 Vergleich der Phänotypen von WH851 – WH855 mit dem Referenzstamm

Die InsTipα-Insertionsmutanten zeigten in MC∆-Medium bei 37°C mit Ausnahme von

WH851, bei dem InsTipα in atpD inserierte, identisches Wuchsverhalten im Vergleich zum

Referenzstamm WH207(λtet50)[pWH1911] (Kap. 3.3.4).

Dieses Ergebnis korreliert mit dem Phänotyp von ppiD Deletionsmutanten, die keinen

Unterschied im Wuchsverhalten zum Referenzstamm aufweisen (Justice et al., 2005). atpD -

Stämme, die über eine funktions-untüchtige ATP Synthase verfügen, zeigen einen

charakteristischen Wuchsdefekt in Minimal-Flüssigmedium mit Glukose als limitierender

Kohlenstoffquelle (Wise, 1990; Lee et al., 1991) und können Succinat als Kohlenstoffquelle

nicht nutzen (Lee et al., 1991). Beide Charakteristika treffen auf WH851 zu (Kap. 3.3.5),

wodurch auf einen funktionalen „knock-out“ von atpD geschlossen werden kann, der zur

Inaktivierung der ATP Synthase führt. Schemidt et al. zeigten überdies durch

DISKUSSION

- 64 -

Komplementationsstudien an der β-Untereinheit der ATP Synthase, dass die C-terminalen

18% von AtpD in E. coli für die Funktionalität entscheidend sind (Schemidt et al., 1996). Die

Insertion von InsTipα in atpD erfolgte nach Nukleotid 1147 des 1383 bp langen Gens,

wodurch die ca. 18% des offenen Leserahmen im 3´-Bereich von atpD deletiert wurden, was

zusätzlich den atpD - Phänotyp des Stamms WH851 erklärt (Kap. 3.3.3).

Die Integration von InsTipα in WH855 in das essentielle Gen yfdX führt zu keinem letalen

Phänotyp. Da das Wuchsverhalten von WH855 dem des Referenzstammes entsprach (Kap.

3.3.3 und 3.3.4), kann daraus geschlossen werden, dass die C-terminalen Aminosäuren ab

Position Gly158 von YfdX, die durch die InsTip1-Markierung nicht mehr translatiert werden,

für das Wachstum unter den analysierten Bedingungen nicht benötigt werden.

4.4.3 Vergleich der mittels InsTip1-Markierung nachgewiesen Proteinexpression mit

publizierten Daten

Bei den jeweils InsTip1-markierten Proteinen AtpD, PpiD, YraI, YicO und YfdX, die die

Stämme WH851 bis WH855 exprimieren, handelt es sich sowohl um cyto- und

periplasmatische Proteine, als auch um Membran-verankerte Proteine der inneren Membran

von E. coli (Riley et al., 2006) (Kap. 3.3.3).

In einer Studie von Karlin et al., konnte durch den Genom-weiten Vergleich der Codon-

Verteilung mit Genen, die für hochexprimierte, ribosomale Proteine kodieren, gezeigt werden,

dass u.a. die markierten Gene atpD und ppiD zu den so genannten hochexprimierten PHX-

Genen (predicted highly expressed genes) in E. coli gehören. In dieser Studie wurden von

3898 analysierten Genen in E. coli 306 als PHX-Gene annotiert, was auf einen Anteil von ca.

8% hochexprimierter Gene im Genom von E. coli schließen lässt (Karlin et al., 2001).

Dass AtpD und PpiD auch hochexprimierte Proteine darstellen, wird dadurch verdeutlicht,

dass diese Proteine bei Analysen der Proteinkomplexe der Zellhülle von E. coli mittels 2D

Gelelektrophorese in großen Mengen nachgewiesen werden konnten (Stenberg et al., 2005).

Überdies zeigten Studien, dass die Membran-gebundene ATP Synthase in E. coli zwischen

1,5% und 2% der Gesamtproteinmenge einer Zelle stellt (von Meyenburg et al., 1984).

Die Messwerte der β-Galaktosidase Aktivität in E. coli WH851 lassen den Schluss zu, dass

AtpD-InsTip1 in der Stationärphase gebildet wird. Die β-Galaktosidase Aktivität erreicht

innerhalb von 40 h kein Aktivitäts-Plateau, sondern steigt langsam an, was auf eine

DISKUSSION

- 65 -

kontinuierliche Bildung von AtpD-InsTip1 hindeutet (Kap. 3.3.4). Da es keine publizierten

Expressionsdaten auf mRNA- oder Protein-Ebene von E. coli Stämmen gibt, die eine

funktional inaktive ATP Synthase besitzen, können die erhaltenen Expressionsdaten von

AtpD-InsTip1 nicht verglichen werden. Es kann lediglich die Aussage getroffen werden, dass

Zellen von WH851 in der Stationärphase verstärkt atpD als Teil des atp-Operons

(atpIBEFHAGDC) (Kasimoglu et al., 1996) exprimieren und die Menge von AtpD-InsTip1

stetig ansteigt (Kap. 3.3.4).

Bisher wurden jedoch keine Daten über den Vergleich der Expression von PpiD in

exponentiell wachsenden Zellen und Zellen der Stationärphase veröffentlicht. Die Messung

der β-Galaktosidase Aktivität in WH852 ergab, dass für Zellen der mittleren exponentiellen

Phase (4 h) in MC∆-Medium bei 37°C nur eine leicht erhöhte β-Galaktosidase Aktivität

gegenüber dem Referenzstamm nachgewiesen werden kann (1,3-fach). In der stationären

Wuchsphase (20 h) hingegen erreicht die β-Galaktosidase Aktivität das ca. 6,9-fache des

Referenzstamms, was auf die deutlich erhöhte Expression von PpiD-InsTip1 in der

Stationärphase zurückgeführt werden kann (Kap. 3.3.4).

Dartigalongue und Raina zeigten für exponentiell wachsende Zellen in Minimalmedium mit

den Kohlenstoffquellen Pyruvat bzw. Glyzerin mit Hilfe einer ppiD-lacZ-

Transkriptionsfusion, dass die Aktivität des endogenen ppiD Promotors in Gegenwart von

Pyruvat um den Faktor 2,5, im Vergleich zu Glyzerin, erhöht ist (Dartigalongue und Raina,

1998). Dieses Resultat wurde, mit Hilfe des Stammes WH852 auf Proteinebene durch eine

vergleichende Analyse der PpiD-InsTip1 vermittelten Induktion des Tet-Repressors unter

denselben experimentellen Bedingungen, bestätigt. Hier zeigte WH852 eine 2-fach erhöhte β-

Galaktosidase Aktivität unter Pyruvat gegenüber Glyzerin (Kap. 3.3.6). Dieses Beispiel

verdeutlicht, dass auch quantitative Expressionsunterschiede von Proteinen nachgewiesen

werden können.

Die Gene yraI, yicO und yfdX kodieren für Proteine unbekannter Funktion. Sequenzvergleiche

ergaben, dass yraI und yfdX Motive enthalten, die für periplasmatische Proteine

charakteristisch sind, wobei YraI zur Familie der Pilus-Chaperone gehört, YfdX jedoch zu

keinem charakterisierten Protein Homologie aufweist (Riley et al., 2006). Bei YicO handelt es

sich möglicherweise um ein integrales Protein der inneren Membran, das die Funktion einer

Permease für Xanthin/Uracil hat (Riley et al., 2006). Für keines dieser Proteine gibt es bisher

Expressionsdaten auf Proteinebene für E. coli. Nur für YfdX konnte mittels einer SDS-PAGE

Analyse gezeigt werden, dass durch Überproduktion des Antwortregulators EvgA in E. coli

DISKUSSION

- 66 -

YfdX verstärkt exprimiert wird und unter diesen Bedingungen in der cytoplasmatischen

Proteinfraktion als hochexprimiertes Protein nachgewiesen werden kann (Nishino und

Yamaguchi, 2001).

Die Aktivitätsmessungen der β-Galaktosidase ergaben für die Stämme WH853, WH854 und

WH855 in MC∆-Medium bei 37°C, dass während der mittleren exponentiellen Phase (4 h) nur

eine leicht erhöhte β-Galaktosidase Aktivität gegenüber dem Referenzstamm nachgewiesen

werden kann (jeweils 1,3-fach). Beim Übergang in die Stationärphase stieg die β-

Galaktosidase Aktivität der drei Stämme an und erreichte zum Zeitpunkt 20 h bei WH853 das

6,3-fache, bei WH854 das 5,4-fache und bei WH855 das 5,7-fache des Referenzstamms. Dies

zeigt, dass mit Hilfe der InsTip1-markierten Proteine YraI-InsTip1, YicO-InsTip1 und YfdX-

InsTip1 eine deutlich erhöhte Expression von yraI, yicO und yfdX in der Stationärphase

gegenüber der exponentiellen Phase nachgewiesen werden kann (Kap. 3.3.4).

Dieses Resultat, dass eine erhöhte Expression des Proteins YraI während der Stationärphase

stattfindet, steht mit bereits publizierten Daten von Haddadin und Harcum in perfekter

Übereinstimmung. Sie konnten mittels einer DNA-Microarray Analyse für das Gen yraI eine

4,1-fache Erhöhung der mRNA-Transkriptmenge beim Übergang von der exponentiellen in

die stationäre Phase für E. coli Zellen nachweisen (Haddadin und Harcum, 2005).

In vorausgegangenen Studien von Baranova und Nikaido wurde durch eine lacZ-

Transkriptionsfusion in E. coli die Expression von yicO in der frühen Stationärphase

analysiert. Hier zeigte sich, dass durch die Überexpression des Zweikomponenten-

Regulationssystems BaeSR, welches die Expression von Resistenz-vermittelnden

Exportproteinen kontrolliert, die Promotoraktivität von yicO induziert ist (Baranova und

Nikaido, 2002). Im Gegensatz hierzu konnte in einer Genom-weiten Expressionsanalyse

mittels DNA-Microarrays für E. coli in der mittleren exponentiellen Wuchsphase keine

BaeSR-vermittelte Induktion von yicO nachgewiesen werden (Nishino et al., 2005). Der

Nachweis der Expression des Fusionsproteins YicO-InsTip1 in WH854 ist in voller

Übereinstimmung mit den oben genannten Publikationen und trägt zur Klärung der

unterschiedlichen Ergebnisse der yicO Expressionsdaten bei.

Selinger et al. verglichen das Transkriptionsprofil von E. coli während dem Wachstum in der

exponentiellen Phase und Stationärphase mittels eines Genom-Arrays, wodurch sie

aufzeigten, dass u.a. die Expression des Gens yfdX während der Stationärphase signifikant

induziert ist (Selinger et al., 2000; zitiert in Masuda und Church, 2002). Diese

Expressionsdaten auf mRNA-Ebene korrelieren mit der Expression der β-Galaktosidase in

DISKUSSION

- 67 -

WH855 in der exponentiellen Phase und der Stationärphase, die durch die Induktion von TetR

durch YfdX-InsTip1 hervorgerufen wird (Kap. 3.3.4).

Die Ergebnisse zeigen, dass mittels eines InsTip1-markierten Proteins dessen Expression in

vivo analysiert werden kann und es möglich ist, quantitative Expressionsunterschiede zu

detektieren. Die gewonnenen Proteinexpressionsdaten korrelieren mit Expressionsanalysen

auf Basis von DNA-Microarrays und Transkriptionsfusionen.

4.5 Vergleich der TetR-Induktion durch die InsTip1-Derivate InsTip2

und InsTip3

Mittels β-Galaktosidase Aktivitätsmessungen in den E. coli Reporterstämmen

WH207(λtet50)[pWH527] und DH5α(λtet50)[pWH527] wurde gezeigt, dass N-terminale

Fusionsproteine (Tip-TrxA bzw. Tip-SbmC) TetR effizienter induzieren als C-terminale

Fusionsproteine (TrxA-Tip bzw. SbmC-Tip) (Klotzsche et al., 2005; Capek, 2005) und das

die Effizienz der TetR-Induktion der N-terminalen Fusionen noch erhöht werden kann, wenn

anstelle des Wildtyp Tet-Repressors die Alanin-Mutante TetRN82A genutzt wird, die

strukturell über eine vergrößerte Effektor-Bindetasche verfügt (Klotzsche, persönliche

Mitteilung).

Dies führte zur Überlegung, dass bei den N-terminalen Tip-Fusionen das Methionin

Startcodon vor der Tip-Sequenz die verbesserte Induktion von TetR vermittelt und so auch bei

C-terminalen Tip-Fusionen die Induktionseffizienz durch ein Methionin vor der Tip-Sequenz

gesteigert werden kann.

Bei den C-terminalen Fusionen zeigte sich, dass der Einschub der Aminosäure Methionin

zwischen die Linker-Sequenz und der ersten Aminosäure von Tip (TrxA-MTip), die Effizienz

der TetR-Induktion um das 10-fache, das 3-fache bzw. das 6-fache steigert, wenn zusätzlich

anstelle des Wildtyp Tet-Repressors die Alanin-Mutanten TetRN82A, TetRF86A bzw.

TetRN82A/F86A genutzt werden, die alle strukturell über eine vergrößerte Effektor-

Bindetasche verfügen (Klotzsche, persönliche Mitteilung; Goeke, 2006). In den folgenden

Studien konnte durch den Austausch der zusätzlich integrierten Aminosäure Methionin gegen

Phenylalanin das TrxA-Tip-Derivat TrxA-FTip konstruiert werden, dass gegenüber

TetRN82A annähernd das selbe Induktionsniveau wie TrxA-MTip vermittelt, aber gegenüber

DISKUSSION

- 68 -

TetRF86A bzw. der Doppelmutante TetRN82A/F86A die Induktion um den Faktor 8,4-fach

bzw. 4,6-fach im Vergleich zu TrxA-MTip nochmals steigert (Goeke, 2006).

Diese Ergebnisse eröffneten die Möglichkeit, durch die Insertion der Aminosäuren Methionin

bzw. Phenylalanin vor Tip auf dem Peptidanhängsel InsTip1, die Effizienz der TetR-

Induktion zu erhöhen. Mittels β-Galaktosidase Aktivitätsmessung in E. coli WH207(λtet50)

konnte gezeigt werden, dass ebenso wie bei TrxA-MTip, TrxA-InsTip2 durch den Einschub

der Aminosäure Methionin vor die erste Aminosäure der Tip-Sequenz, die Effizienz der TetR-

Induktion verstärkt wird, wenn anstelle des Wildtyp Tet-Repressors die Alanin-Mutanten

TetRN82A, TetRF86A bzw. TetRN82A/F86A genutzt werden (Kap. 3.4). Im Vergleich zur

Induktion des Wildtyp TetR durch TrxA-InsTip1, zeigt TrxA-InsTip2 gegenüber TetRN82A

eine um das 3,7-fache Steigerung der Induktion, gegenüber TetRF86A eine 2-fache und

gegenüber TetRN82A/F86A eine 6,4-fache (Kap. 3.4).

Der Austausch des Methionin-Restes vor der Tip-Sequenz gegen einen Phenylalanin-Rest,

erzeugte TrxA-InsTip3, dass gegenüber TetRN82A annähernd dasselbe Induktionsniveau wie

TrxA-InsTip2 vermittelte, aber gegenüber TetRF86A bzw. der Doppelmutante

TetRN82A/F86A die Induktion um den Faktor 9,9-fach bzw. 4,3-fach im Vergleich zu TrxA-

InsTip2 nochmals steigerte (Kap. 3.4).

Diese Ergebnisse korrelieren direkt mit den Analysen der TetR- und TetR-Derivat-Induktion

durch die TrxA-Tip-Derivate TrxA-MTip und TrxA-FTip (Goeke, 2006).

Die Sensitivität der Induktion des Tet-Repressors kann deutlich um den Faktor 19 verbessert

werden, wenn anstelle der Repressor-Induktor-Kombination Wildtyp TetR und InsTip1, die

Kombination TetRF86A und InsTip3 genutzt wird (Kap. 3.4).

4.6 Fusionsanhängsel zur Proteindetektion: Je kleiner desto feiner?

Wie einleitend berichtet wurde, konnten in den vergangenen Jahrzehnten durch Nutzung von

Translationsfusionen mit Reporterenzymen verschiedenste Studien zur Proteinlokalisation

und Proteinmengenquantifizierung in Prokaryoten und Eukaryoten durchgeführt werden.

Trotz der Nutzung dieser Reporterenzyme für Proteinnachweise oder Lokalisationsstudien in

vivo können große Fusionsanhängsel von einigen hundert Aminosäuren wie z.B. GFP, die β-

Galaktosidase oder die Chloramphenicol-acetyl-transferase (Cat) u.a. das

Löslichkeitsverhalten des markierten Proteins, sowohl positiv wie auch negativ beeinflussen

(Lesley et al., 2002) oder durch den sterischen Einfluss des Fusionsanteils in vivo zu

DISKUSSION

- 69 -

fehlerhafter intrazellulärer Lokalisation führen (Phillips, 2001; Huh et al., 2003). So

verlängern Translationsfusionen mit GFP oder β-Galaktosidase als Reporterenzyme das

markierte Zielprotein um 238 Aminosäuren (Gerdes und Kaether, 1996) bzw. um 1023

Aminosäuren (Matthews, 2005). Für höher exprimierte Proteine wurde darüber hinaus

gezeigt, dass Fusionen mit GFP zur Aggregation führen können (Phillips, 2001).

Die β-Galaktosidase bildet in ihrer enzymatisch aktiven Form ein Homotetramer, das ein

Molekulargewicht von 464 kDa aufweist (Matthews, 2005). Die Größe und Tertiärstruktur der

β-Galaktosidase kann so möglicherweise als Fusionspartner eine sterische Behinderung der

Zielproteine hervorrufen bzw. deren Lokalisation behindern oder verfälschen.

Ähnliches gilt für Translationsfusionen mit Cat, die in vivo ein funktional-aktives Homotrimer

mit einem Molekulargewicht von 75 kDa bildet (Leslie, 1990). Zusätzlich wurde für dieses

Reporterenzym nachgewiesen, dass Cat ein hochlösliches Protein darstellt und so das

Löslichkeitsverhalten des Fusionspartners beeinflussen kann (Maxwell et al., 1999). Eine

Studie von Robben et al. zeigt, dass der Cat-Fusionsanteil der markierten Proteine an der

Aminosäuresequenz zwischen Zielprotein und Reporterenzym in vivo proteolytisch

abgespalten werden kann (Robben et al., 1993), was zu Nachweisproblemen führen kann.

Prescott et al. konnten auch für GFP-markierte Fusionsproteine in Hefe zeigen, dass die

jeweilige Aminosäuresequenz, die GFP mit dem markierten Protein verbindet, einen

signifikanten Einfluß auf die Stabilität des Fusionsproteins hat (Prescott et al., 1999). Es

konnte gezeigt werden, dass das Fusionsprotein degradiert wird und der GFP-Fusionsanteil

eigenständig in der Zelle vorliegt oder GFP enzymatisch inaktiv ist und somit das

Fusionsprotein nicht detektiert werden kann. Ebenso wird die Detektion von Proteinen mit

kurzen Halbwertszeiten durch die relativ langsame Proteinfaltung von GFP und GFP-

Varianten beeinflusst (Phillips, 2001; Zimmer, 2002).

In dieser Arbeit konnte eine neue Methode etabliert werden, die Expression eines genomisch

kodierten Proteins in vivo zu verfolgen. Durch die C-terminale Markierung des Proteins mit

InsTip1, kann bei Expression des resultierenden Fusionsproteins ein TetR-reguliertes

Reporterkonstrukt in vivo induziert werden. Dessen enzymatische Aktivität kann quantifiziert

werden und erlaubt direkte Rückschlüsse auf die Expression des Fusionsproteins. Da die

Länge der terminalen Markierung mit 30 Aminosäuren vergleichsweise gering ist (Kap. 3.3),

wird der sterische Einfluss auf das markierte Protein minimiert. Mit einem Molekulargewicht

von 2,9 kDa stellt InsTip1 im Vergleich zu den oben aufgeführten Reporterenzymen für

Proteinexpressionsstudien ein extrem kleines Fusionsanhängsel dar, dass in der Größenordung

DISKUSSION

- 70 -

von Hexahistidin-, c-myc-, FLAG-Anhängseln oder Calmodulin-Bindepeptiden liegt, die in

vielen Applikationen als C- oder N-terminale Fusionspartner zur Aufreinigung von Proteinen

genutzt werden, da sie keine oder nur geringe sterische Einflüsse auf das markierte Protein

haben (Terpe, 2003).

Für TrxA-InsTip1, wie auch für TrxA-Tip, konnte mittels Western Blot-Analysen gezeigt

werden, dass es zu keiner detektierbaren proteolytischen Abspaltung des InsTip1- bzw. Tip-

Fusionsanhängsels vom markierten Protein TrxA kommt (Klotzsche, 2005) (Kap. 3.3.1).

Zusätzlich kann die Entkoppelung der Expression des Tip-markierten Zielproteins von der

Reporterenzymexpression die Möglichkeit eröffnen, mit Hilfe einer möglichst sensitiven

Induktion eines TetR-Derivats durch ein Tip-Derivat, auch niedrig exprimierte Tip-

Fusionsproteine in vivo zu detektieren. Eine Basis hierfür stellt die Sensitivitätsverbesserung

der TetR-Tip-Interaktion um das 19-fache durch die Nutzung von TetRF86A in Kombination

mit dem Fusionsanhängsel InsTip3 dar (Kap. 3.4).

4.7 Das N-terminale Fusionsanhängsel TipFRT1

Im zweiten Projekt dieser Arbeit wurde das Rekombinationselement ReTipN aufgebaut, das es

erlaubt, mit Hilfe des von Datsenko und Wanner entwickelten „λ Red Systems“ (Datsenko

und Wanner, 2000) ReTipN über flankierende, genom-identische Sequenzabschnitte, ins

prokaryotische Genom gerichtet zu integrieren und anschließend den offenen Leserahmen

eines Gens am 5´-Ende mit der Tip-kodierenden Sequenz zu markieren, um die Expression

des jeweiligen N-terminalen Tip-Fusionsproteins vom endogenen Locus zu analysieren.

ReTipN wurde so konzipiert, dass nach erfolgter Rekombination ins Zielgen und Flp-

Rekombinase-vermittelter Eliminierung des Selektionsmarkers die Tip-kodierende Sequenz,

ein FRT-Element und das Zielgen einen durchgehenden Leserahmen bilden, wodurch das 5´-

Ende des Zielgens mit der TipFRT1-kodierenden Sequenz fusioniert wird, ohne den

endogenen Promotor des Zielgens und die 5´-liegende nicht translatierte Region, die für die

Translationsinitiation wichtig sind, zu verändern. In einer Diplomarbeit wurden so mittels

ReTipN die Gene ptsH und trxA im Genom von Salmonella enterica gerichtet am 5´-Ende

markiert (Friedlein, 2006).

Für die N-terminale Fusion des 29 AS-langen TipFRT1-Anhängsels am Modellprotein TrxA

wurde im Rahmen dieser Arbeit nachgewiesen, dass es das gleiche maximale TetR-

Induktionsniveau wie das Hexadecapeptid Tip in diesem Kontext vermittelt. Dadurch wurde

DISKUSSION

- 71 -

gezeigt, dass weder die Länge, noch die Aminosäureabfolge des Peptid-Anhängsels TipFRT1

im Kontext einer N-terminalen Fusion am Modellprotein TrxA die induzierenden

Eigenschaften des Hexadecapeptids Tip gegenüber TetR beeinflussen (Kap. 3.5.2) (Klotzsche

et al., 2005). Western Blot-Analysen zeigten jedoch, dass die von TipFRT1-TrxA detektierte

Proteinmenge unter der jeweiligen Ptac induzierenden IPTG-Konzentration im Vergleich zu

Tip-TrxA geringfügig niedriger ist (Kap. 3.5.2). Dies war ein Hinweis, dass möglicherweise

die Nukleotidsequenz des kodierenden Leserahmens die Translationseffizienz beeinflusst.

Die beiden Konstrukte (pWH1913 bzw. pWH2201), die TipFRT1-TrxA bzw. Tip-TrxA

kodieren, unterscheiden sich nur durch den Einschub von 36 bp zwischen der Tip-

kodierenden Sequenz und dem trxA Gen. 34 bp dieser 36 bp stellen die Nukleotidsequenz des

FRT-Elements dar. Die Effizienz der Translation dieser zusätzlichen Nukleotidsequenz bzw.

deren Codons kann ein Grund für die unterschiedlichen Expressionsmengen sein.

Die zwei darin vorkommenden Triplets „AGA“ und „CTA“ sind als seltene Codons

(Brinkmann et al., 1989; Goldman et al., 1995; Merk, 2001) annotiert. Per Definition gelten

Codons als „selten“, wenn sie mit einer Frequenz von < 1% in den Genen von E. coli

auftreten (Merk, 2001). Für die genannten Codons wurde in E. coli K-12 gezeigt, dass sie nur

mit einer Frequenz von 2,1‰ bzw. 3,9‰ auftreten und somit neben den Stopcodons („TAA“:

2,0‰; „TAG“: 0,2‰; „TGA“: 0,9‰) zu den sieben seltensten Triplets zählen (siehe:

http://www.kazusa.or.jp/codon). Diese beiden Codons in der Nukleotidsequenz von tipFRT1-

trxA treten in der Sequenz von tip-trxA nicht auf und könnten so die Translationseffizienz des

TipFRT1-TrxA Fusionsproteins leicht beeinflussen.

Für die Expression von eukaryotischen Genen in E. coli wurde gezeigt, dass die limitierende

Menge an tRNAArg(AGG/AGA) die Translationseffizienz eines „AGA“ Codons verringern kann

(Brinkmann et al., 1989). Die Daten von Goldman et al. zeigen überdies, dass „CTA“-Codons

ebenso die Proteinsynthese inhibieren können, besonders wenn diese, wie bei tipFRT1-trxA im

5´-Bereich der mRNA liegen (Goldman et al., 1995).

4.8 Ausblick

In der vorliegenden Arbeit wurde E. coli einer Insertionsmutagenese mit dem

Insertionselement InsTipα unterzogen. Durch ein visuelles Auswahlverfahren auf

MacCONKEY Bouillon-Agarplatten konnte aus einer Bibliothek von 6400 InsTipα-

Insertionsmutanten, bei fünf Stämmen phänotypisch eine Derepression des TetR-regulierten

DISKUSSION

- 72 -

LacZ-Reporterkonstrukts nachgewiesen werden, was auf die intrazelluläre Expression von

InsTip1-markierten Fusionsproteinen zurückgeführt wurde. Bei diesen markierten Proteinen

handelte es sich um Proteine, deren Synthese während der Stationärphase nachgewiesen

werden konnte.

Zur Steigerung der Effizienz, Stämme zu generieren, die genomisch kodierte InsTip1-

Fusionsproteine exprimieren, können die genutzten Elemente auf Grund der gewonnenen

Daten in mehrerer Hinsicht modifiziert und verbessert werden. (A) Bei weiteren Insertionsmutagenesen in WH207(λtet50) sollte anstelle der Induktor-

Repressor-Kombination InsTip1 und TetR, die deutlich sensitivere Kombination InsTip3 und

TetRF86A genutzt werden. Diese Sensitivitätssteigerung könnte die Möglichkeit bieten, auch

Tip-Fusionsproteine zu detektieren, deren Synthesemengen deutlich niedriger sind, als die

bisherigen fünf InsTip1-Fusionsproteine, von denen zwei sogar als hochexprimierte Proteine

annotiert sind. Dies könnte die Anzahl an detektierbaren Kandidaten auf Platte, die InsTip3-

markierte Fusionsproteine exprimieren, erhöhen. (B) Das bisher genutzte optische Verfahren auf MacCONKEY Bouillon-Agarplatten zur

Auswahl von InsTipα-Insertionsmutanten, die TetR-induzierende InsTip1-Fusionsproteine

exprimieren, ist unzureichend. Hier ist es auf Grund der geringen Farbveränderungen des

Indikators Bromkresolpurpur nur schwer möglich, den unmarkierten WH207(λtet50) Stamm

von WH207(λtet50) Mutanten visuell zu unterscheiden, die TetR-induzierende InsTip1-

Fusionsproteine exprimieren. Dieses System beschränkt die Detektion auf InsTipα-

Insertionsmutanten, die extrem hohe β-Galaktosidase Aktivität aufzeigen und ist somit für die

Identifikation von Insertionsmutanten limitierend, die niedrig exprimierte InsTip1-

Fusionsproteine synthetisieren. Hier würde sich die Nutzung eines neuen genomischen LacZ-

Reporterkontrukts anstelle des λtet50-basierten Systems anbieten, das eine geringere

Basalaktivität der β-Galaktosidase unter TetR-reprimierten Bedingungen vermittelt und das

Detektionsfenster zwischen reprimiertem und induziertem Zustand vergrößert (Lutz und

Bujard, 1997).

Ein Auswahlverfahren basierend auf dem Indikator X-Gal hat gegenüber MacCONKEY

Bouillon den Vorteil, dass die enzymatische Aktivität der β-Galaktosidase durch X-Gal als

Substratanalogon direkt detektiert werden kann. Bei MacCONKEY Bouillon wird der

Indikatorfarbumschlag durch die Ansäuerung des Mediums hervorgerufen, das auf die

enzymatische Spaltung der Laktose im Medium zurückzuführen ist. Dies hat zur Folge, dass

auf diesem Medium auch diejenigen Kolonien einen Farbumschlag hervorrufen, die keine

DISKUSSION

- 73 -

Tip-Fusionsproteine exprimieren, sondern durch die Insertionsmutagenese eine

physiologische Veränderung des Stoffwechsels zeigen und so den pH-Wert des Mediums z.B.

durch Gärung erniedrigen. (C) Da bisher mit den Stämmen WH851 - WH855 nur InsTipα-Insertionsmutanten detektiert

wurden, die das jeweilige InsTip1-Fusionsprotein in der Stationärphase exprimieren, stellt

sich die Frage, ob das Auswahlverfahren auf Platte an sich geeignet ist Insertionsmutanten zu

detektieren, die InsTip1-markierte Proteine z.B. ausschließlich in der exponentiellen

Wuchsphase exprimieren. Hier würde die Nutzung eines TetR-regulierten GFP-

Reporterkonstrukts zusätzlich zum oder anstelle des bisher verwendeten LacZ-

Reporterkonstrukt die Möglichkeit eröffnen, mittels eines FACS-Sorters einzelne Zellen aus

einer Bakterienkultur wuchsphasenabhängig zu isolieren, die InsTip1-Fusionsproteine z.B.

während der exponentiellen Wuchsphase exprimieren. Dieses Verfahren könnte natürlich für

Kulturen in jeder beliebigen Wuchsphase angewandt werden. (D) Um nach einer Insertion von InsTipα in ein Operon mögliche polare Effekte auf

stromabwärts der Integrationsstelle gelegene Gene zu minimieren, sollte das

Insertionselement InsTipα modifiziert werden. Zum einen könnte ein zusätzlicher,

konstitutiver Promotor innerhalb der von FRT-Elementen flankierten Sequenz die

Transkription stromabwärts gelegener Gene aus dem Element heraus vermitteln. Ebenso wäre

es möglich die Orientierung der Kanamycin-Resistenzkassette auf InsTipα zu verändern, um

wie in Kang et al. beschrieben, die Expression stromabwärts der Integrationsstelle gelegener

Gene unter die konstitutive Promotoraktivität der Resistenzkassette zu stellen (Kang et al.,

2004). (E) Neben der von Goryshin et al. beschriebenen Methode einer in vivo Insertionsmutagenese

(Goryshin et al., 2000) wäre es auch möglich, wie in Kang et al. beschrieben, eine Genbank

eines prokaryotischen Organismus einer systematischen in vitro Insertionsmutagenese (Kang

et al., 2004) mit dem Element InsTipα zu unterziehen. Diese so in vitro mutagenisierten

Gensequenzen könnten im Anschluss daran mittels des „λ Red Systems“ durch homologe

Rekombination in das Zielgenom integriert werden. Ebenso wäre für die notwendige

homologe Rekombination auch eine evtl. vorhandene, natürlichen Kompetenz wie z.B. bei B.

subtilis oder Neisseria sp. möglich. Somit könnten spezifische Gene einer Sequenz-

ungerichteten Mutagenese unterzogen werden, um diese mit der InsTip1-kodierenden

Sequenz zu markieren.

MATERIALIEN, MEDIEN UND METHODEN

- 74 -

5. Materialien, Medien und Methoden

5.1 Materialien

5.1.1 Chemikalien

Chemikalie Bezugsquelle

Acrylamid/Methylenbisacrylamid (19:1) 40% Roth, Karlsruhe, Deutschland

Adenosintriphosphat (ATP) Boehringer, Mannheim, Deutschland

Agar Oxoid, Heidelberg, Deutschland

Agarose Sigma, München, Deutschland

Ammoniumacetat Sigma, München, Deutschland

Ammoniumperoxodisulfat (APS) Sigma, München, Deutschland

Ampicillin (Ap) Sigma, München, Deutschland

Anhydrotetrazyklin (atc) Acros, Belgien

Borsäure Merck, Darmstadt, Deutschland

5-Bromo-4-Chloro-3-indolyl-β-D-Galaktopyranosid (X-Gal) PeqLab, Erlangen, Deutschland

Bromphenolblau Serva, Heidelberg, Deutschland

Calciumchlorid Roth, Karlsruhe, Deutschland

Chloramphenicol (Cm) Roth, Karlsruhe, Deutschland

Chloroform Roth, Karlsruhe, Deutschland

Desoxyribonukleotidtriphosphate (dNTPs) PeqLab, Erlangen, Deutschland

N,N-Dimethylformamid (DMF) Sigma, München, Deutschland

Dimethylsulfoxid (DMSO) Roth, Karlsruhe, Deutschland

Dithiothreitol (DTT) Serva, Heidelberg, Deutschland

Essigsäure Roth, Karlsruhe, Deutschland

Ethanol (EtOH) Roth, Karlsruhe, Deutschland

Ethidiumbromid Roth, Karlsruhe, Deutschland

Ethylendiamintetraacetat (EDTA) Sigma, München, Deutschland

Formamid Sigma, München, Deutschland

Glukose (Glc) Roth, Karlsruhe, Deutschland

Glycin Roth, Karlsruhe, Deutschland

Glyzerin (Gly) Roth, Karlsruhe, Deutschland

Hefeextrakt Oxoid, Heidelberg, Deutschland

I-BlockTM Serva, Heidelberg, Deutschland

Isopropanol Roth, Karlsruhe, Deutschland

Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) PeqLab, Erlangen, Deutschland

Kanamycin (Km) Sigma, Deisenhofen, Deutschland

MATERIALIEN, MEDIEN UND METHODEN

- 75 -

Laktose (Lac) Roth, Karlsruhe, Deutschland

MacCONKEY Bouillon Merck, Darmstadt, Deutschland

Magnesiumchlorid Roth, Karlsruhe, Deutschland

Magnesiumsulfat Roth, Karlsruhe, Deutschland

β-Mercaptoethanol Merck, Darmstadt, Deutschland

Methanol Roth, Karlsruhe, Deutschland

Natriumacetat Merck, Darmstadt, Deutschland

Natriumcarbonat Merck, Darmstadt, Deutschland

Natriumchlorid Merck, Darmstadt, Deutschland

Natriumdodecylsulfat (SDS) Serva, Heidelberg, Deutschland

Natriumhydroxid Roth, Karlsruhe, Deutschland

o-Nitrophenyl-β-galactopyranosid (ONPG) Sigma, München, Deutschland

Ochsengalle, getrocknet Fluka, Schweiz

Polyethylenglycol 6000 (PEG 6000) Roth, Karlsruhe, Deutschland

Pyruvat (Pyr) Sigma, München, Deutschland

Saccharose (Sac) Roth, Karlsruhe, Deutschland

Salzsäure Roth, Karlsruhe, Deutschland

Spermidin Sigma, USA

Stickstoff, flüssig Linde, Höllriegelskreuth, Deutschland

Succinat (Suc) Merck, Darmstadt, Deutschland

N,N,N´,N´-Tetramethylethylendiamin (TEMED) Merck, Darmstadt, Deutschland

Tetrazyklin (Tc) Sigma, Deisenhofen, Deutschland

Thiaminiumdichlorid Merck, Darmstadt, Deutschland

Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan Roth, Karlsruhe, Deutschland

Trypton Oxoid, Heidelberg, Deutschland

Tween-20 Serva, Heidelberg, Deutschland

Xylencyanol Serva, Heidelberg, Deutschland

5.1.2 Verbrauchsmittel

Verbrauchsmittel Bezugsquelle

96-Napf-Platten Greiner, Nürtingen, Deutschland

Elektroporationsküvetten (2 mm) PeqLab, Erlangen, Deutschland

Entwickler und Fixierer für Röntgenfilme Tetenal Photowerk, Norderstedt, Deutschland

Glasgefäße Schott, Mainz, Deutschland

Glaspipetten Brand, Wertheim, Deutschland

Greinerröhrchen (15 und 50 ml) Greiner, Nürtingen, Deutschland

Halbmikroküvetten Greiner, Nürtingen, Deutschland

MATERIALIEN, MEDIEN UND METHODEN

- 76 -

Hydrobond-P PVDF-Membran Amersham Bioscience, U.K.

Kunststoffpipettenspitzen Greiner, Nürtingen, Deutschland

Mikrotiterplatten Greiner, Nürtingen, Deutschland

PCR-Reaktionsgefäße PeqLab, Erlangen, Deutschland

Petrischalen Greiner, Nürtingen, Deutschland

Polyethylenröhrchen Greiner, Nürtingen, Deutschland

Quarzküvetten Hellma, Mühlheim, Deutschland

Reaktionsgefäße (1,5 ml und 2,2 ml) Greiner, Nürtingen, Deutschland

Röntgenfilme X-omat AR Kodak, England

Sterilfilter (0,2 µm Porengröße) Sarstedt, Nümbrecht, Deutschland

Whatman Papier 3 mm Whatman, England

5.1.3 Geräte

Gerät Bezugsquelle

ABI PRISMTM 310 Genetic Analyzer Applied Biosystems, USA

Autoklav Systec 5075 EL Systec GmbH, Wettenberg, Deutschland

Biofuge fresco Heraeus Christ, Osterode, Deutschland

Biofuge pico Heraeus Christ, Osterode, Deutschland

Biofuge primo R Heraeus Christ, Osterode, Deutschland

Bio-Rad Gene Pulser II Bio-Rad, München, Deutschland

Gelelektrophoreseapparaturen M. Müller, FAU Erlangen-Nürnberg, Deutschland

Heizblock Dri Block DB3 Techne, England

Horizontalschüttler New Brunswick, Neu Isenburg, Deutschland

Kulturschüttler Mod G25 New Brunswick, Neu Isenburg, Deutschland

Magnet-Heizrührer JKA Werk, Staufen, Deutschland

Milli-Q© PF Plus Millipore, Eschborn, Deutschland

Mikrowellengerät Micromat AEG, Frankfurt/M., Deutschland

Mini-V 8·10 Blot Module Life Techn., Gibco/BRL, Karlsruhe, Deutschland

pH-Meter 766 Calimatic Knick, Berlin, Deutschland

Schüttelwasserbad innova 3100 New Brunswick, Neu Isenburg, Deutschland

Spannungsgerät Heinzinger, Rosenheim, Deutschland

TECAN SpectraFluor Plus TECAN, Crailsheim, Deutschland

Thermocycler GeneAmp PCR-System 2400 Perkin-Elmer, Weiterstadt, Deutschland

Thermocycler primus 96 PeqLab, Erlangen, Deutschland

Ultraschallgerät Sonoplus HD2070 + Sonde UW2070 BANDELIN electronic, Berlin, Deutschland

Ultraspec 3000 Photometer Pharmacia, Freiburg, Deutschland

UV Schirm 366 nm Vetter, Wiesloch, Deutschland

MATERIALIEN, MEDIEN UND METHODEN

- 77 -

Vakuumzentrifuge (Speed-Vac) Heraeus Christ, Osterode, Deutschland

Videodokumentationssystem PeqLab, Erlangen, Deutschland

Vortexer JKA Werk, Staufen, Deutschland

Waage Sartorius universal Sartorius, Göttingen, Deutschland

Wasserthermostat Braun, Melsungen, Deutschland

5.1.4 Enzyme, Proteine und Antikörper

Enzyme, Proteine und Antikörper Bezugsquelle

anti-ThioTM (monoklonal; Spezifität: TrxA-Fusionen; Cat. No. 46-0436)

Invitrogen, Karlsruhe, Deutschland

anti-mouse-HRP Konjugat (Spezifität: anti-Maus IgG) Sigma, Deisenhofen, Deutschland

Bovines Serum Albumin (BSA) New England Biolabs, Frankfurt/M., Deutschland

hyper- und transaktive Tn5-Transposase Lehrstuhl für Mikrobiologie, FAU Erlangen- Nürnberg, Deutschland

PhusionTM High-Fidelity DNA Polymerase Finnzymes, Finnland

Protease Inhibitoren „Complete“ Roche Diagnostics, Mannheim, Deutschland

Restriktionsendonukleasen New England Biolabs, Frankfurt/M., Deutschland Fermentas Life Science, St. Leon-Rot, Deutschland

Ribonuklease A Sigma, München, Deutschland

Shrimps Alkalische Phosphatase (SAP) Roche, Penzberg, Deutschland

T4 DNA Ligase New England Biolabs, Frankfurt/M., Deutschland

T4 DNA Polymerase New England Biolabs, Frankfurt/M., Deutschland

T4 Polynukleotidkinase (PNK) New England Biolabs, Frankfurt/M., Deutschland

5.1.5 Kommerziell erhältliche Reagenziensysteme

System Bezugsquelle Anwendung

BigDye Terminator v 1.1 Cycle Sequencing RR-100

Applied Biosystems, USA

DNA-Sequenzierung

Bio-Rad Protein Assay Bio-Rad, München, Deutschland Bestimmung von Proteinkonzentrationen

ECL plus Western Blotting Detection System

Amersham Bioscience, U.K. Western Blot Analysen

GFXTM PCR DNA and Gel Band Purification Kit

Amersham Bioscience, U.K. DNA-Reinigung und Elution aus Agarosegelen

Nucleobond AX 100 Macherey-Nagel, Düren, Deutschland Plasmidpräparationen

Nucleobond AX 500 Macherey-Nagel, Düren, Deutschland Plasmidpräparationen

MATERIALIEN, MEDIEN UND METHODEN

- 78 -

Nucleospin Plasmid Macherey-Nagel, Düren, Deutschland Plasmidpräparationen

Nucleospin Extract II Macherey-Nagel, Düren, Deutschland DNA-Reinigung und Elution aus Agarosegelen

PhastGel Blue R Pharmacia, Freiburg, Deutschland Färbung von denat. PAA-Gelen

PuReTaqTM Ready-To-GoTM PCR Beads in a plate

Amersham Bioscience, U.K. PCR

QIAamp DNA Mini Kit Qiagen, Hilden, Deutschland Präparation genomischer DNA

5.1.6 Größenmarker für DNA-Fragmente und Proteine

Größenmarker mit den jeweiligen Bandengrößen in [bp] bzw. [kDa] Bezugsquelle

peqGOLD DNA-Leiter [bp]

10000, 8000, 6000, 5000, 4000, 3500, 3000, 2500, 2000, 1500, 1200, 1031, 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200, 100

PeqLab, Erlangen, Deutschland

„PAA“-DNA-Molekulargewichtsstandard [bp]

859, 446, 444, 436, 413, 365, 256, 179, 139, 84, 69, 43, 12

Lehrstuhl für Mikrobiologie, FAU Erlangen-Nürnberg, Deutschland

MultiMark Multi-Colored Standard [kDa]

185, 98, 52, 31, 19, 17, 11, 6, 3

Invitrogen, Karlsruhe, Deutschland

5.1.7 Oligonukleotide

In der folgenden Tabelle sind alle in der vorliegenden Arbeit genutzten Oligonukleotide

aufgelistet. Sie wurden von der Firma MWG-Biotech AG, Ebersberg, Deutschland bezogen

und in Wasser zu einer Konzentration von 100 pmol/µl gelöst.

Bezeichnung Nukleotidsequenz (5´ nach 3´) Verwendung

Cm_for2

AACTAGCTAGCGGGGCAGAGAAAAAAATCACTGG

Klonierung von pWH1384

Cm_rev CATTGGCTGCAGTTTTAGTCAGTTATTACGCCCCGCCCTGCCACTC

Klonierung von pWH1384

5´trxA-seq1 GCCGACATCATAACGGTTCTGGC Sequenzierung von pWH2101-Derivaten

5´trxA-seq2 CCGTTGCAAAACTGAACATCG Sequenzierung von pWH2101-Derivaten

5´trxA.Rsr AGTGGTGCGGTCCGTGCAAAATGATCG Sequenzierung von pWH2101-Derivaten

MATERIALIEN, MEDIEN UND METHODEN

- 79 -

trxApepBs1_for_for CACACAGCTCTAGCTCGAGAAGCTTAACAA Klonierung von pWH2101-Derivaten und pWH1914

trxApepBs1-1_rev_rev CTACCCGCTAGCCTACGAACCTCCACCACTAGGAGC Klonierung von pWH1384

trxApepBs1_for_rev2 AACCTGGCTGTCTCTTATACACATCTGTGGACTTGG AATGCTTATGC

Klonierung von pWH1384

trxApepBs1_rev_for2 AAGTCCACAGATGTGTATAAGAGACAGCCAGGTTAGCGTCGAGGAAC

Klonierung von pWH1384

Linker-for CTCTTATACACATCTGTCCGGAGGCGCTGGTGGCGC ATGGACTTGGAATG

Klonierung von pWH1903

Linker-rev CATTCCAAGTCCATGCGCCACCAGCGCCTCCGGACA GATGTGTATAAGAG

Klonierung von pWH1903

ME-for CTGTCTCTTATACACATCT Klonierung von pWH1907, pWH1912, pWH1398 und pWH1399

ME-CmA-rev CTGTCTCTTATACACATCTTTTTAGTCAGTTATTAC GCCCC

Klonierung von pWH1907

minus-PvuII-for CAGACCGTTCAACTGGATATTACG Klonierung von pWH1907

minus-PvuII-rev CGTAATATCCAGTTGAACGGTCTG Klonierung von pWH1907

1925gv GGGCGATCGGTGCGGGCC Sequenzierung von pWH1866-Derivaten

1925gh GCAAACCGCCTCTCCCCGC Sequenzierung von pWH1866-Derivaten

DP6 CTCGACATCTTGGTTACCG Sequenzierung von pWH1909

S-FRT-2 AAGTATAGGAACTTCGCTTACGAACCTCCACCACTA GGAGC

Klonierung von pWH1909

S-FRT-3 AGCGAAGTTCCTATACTTTCTAGAGAATAGGAACTTCAAGATCCCCTCACGC

Klonierung von pWH1909

S-FRT-4 GAAGTTCCTATTCTCTAGAAAGTATAGGAACTTCAGAGCAACCCCAGCGAACC

Klonierung von pWH1909

S-FRT-5 ACCATGGCTGCAGCTGTCTCTTATACACATCTGAAGTTCCTATTCTCTAGAAAG

Klonierung von pWH1909 und pWH1398

Echo-1 AAACGCATAAGCATTCCAAGTCCATG Identifikation des InsTipα-Insertionsortes

Echo-2 ATGGTTCGCTGGGGTTGCTCTG Identifikation des InsTipα-Insertionsortes

atpD-test ATGGCTACTGGAAAGATTGTCCAGGTAATCG Verifizierung des InsTipα-Insertionsortes in E. coli WH851

ppiD-test ATGATGGACAGCTTACGCACGGCTGCAAACAG Verifizierung des InsTipα-Insertionsortes in E. coli WH852

MATERIALIEN, MEDIEN UND METHODEN

- 80 -

yraI-test ATGTCAAAACGAACATTCGCGGTGATATTAACC Verifizierung des InsTipα-Insertionsortes in E. coli WH853

yicO-test ATGAATAATGACAATACCGATTACGTGAG Verifizierung des InsTipα-Insertionsortes in E. coli WH854

yfdX-test ATGAAACGTTTAATTATGGCCACGATGG Verifizierung des InsTipα-Insertionsortes in E. coli WH855

Bs1-FRT TACTTTCTAGAGAATAGGAACTTCTTGAACCTCCACCACTAGGAGCAGC

Klonierung von pWH1913

FRT-trxA CCTATTCTCTAGAAAGTATAGGAACTTCAAGCGATAAAATTATTCACCTGACTG

Klonierung von pWH1913

trxA-PstI GGAATGGTGCATGCCTGCAGGTCATTTTGCC Klonierung von pWH1913

FRT-3S-PstI-Seq AACTGTCGTCAGTCAGGCTGCAGCTAGTCACTTATGAAGTTCCTATACTTTCTAGAGAA

Klonierung von pWH1914

Seq-HindIII-KmR GCCTGACTGACGACAGTTTTGACACGGATAAGCTTAGAGCAACCCCAGCGAACCATTTG

Klonierung von pWH1914

KmR-S-M-FRT GAAGTTCCTATACTTTCTAGAGAATAGGAACTTCTCATCTAAAACAATTCATCCAGTAA

Klonierung von pWH1914

Met-Ins-f CGCTGGTGGCGCAATGTGGACTTGGAATGCTTATGC Klonierung von pWH1398

Met-Ins-r GCATAAGCATTCCAAGTCCACATTGCGCCACCAGCG Klonierung von pWH1398

Phe-Ins-f CGCTGGTGGCGCATTTTGGACTTGGAATGCTTATGC Klonierung von pWH1399

Phe-Ins-r GCATAAGCATTCCAAGTCCAAAATGCGCCACCAGCG Klonierung von pWH1399

Auf-3 GCGCTTCATAGAGTAATTCTGTAAAGGTCC Sequenzierung von pWH1866-Derivaten

Auf-5 CTTTCTACGTGTTCCGCTTCCTTTAGCAGC Sequenzierung von pWH1866-Derivaten

5.1.8 Bakterienstämme und Phagen

Stamm bzw. Phage Relevante genetische Marker Referenz

E. coli CSH108

∆(gpt-lac)5; λ-; ara(FG); gyrA-(NalR); argE-(Am); rpoB-(Rifr); thi-1

(Miller, 1992)

E. coli DH5α recA1; endA1; gyrA96; thi; relA1; hsdR17 (rK

-, mK+); supE44; Φ80dlacZ∆Μ15;

∆(lacZYA-argF)U169

(Hanahan, 1983)

E. coli RB791 IN[rrnD-rrnE]1; lacIqL8 (Brent und Ptashne, 1981)

E. coli WH207 galK; rpsL; thi; ∆lacX74; recA13 (Wissmann et al., 1991a)

MATERIALIEN, MEDIEN UND METHODEN

- 81 -

E. coli WH851 WH207(λtet50)[pWH1911]-Derivat; atpD(1147)::InsTipα; CmR; KmR

diese Arbeit; (Schlicht et al., 2006)

E. coli WH852 WH207(λtet50)[pWH1911]-Derivat; ppiD(328)::InsTipα; CmR; KmR

diese Arbeit; (Schlicht et al., 2006)

E. coli WH853 WH207(λtet50)[pWH1911]-Derivat; yraI(607)::InsTipα; CmR; KmR

diese Arbeit; (Schlicht et al., 2006)

E. coli WH854 WH207(λtet50)[pWH1911]-Derivat; yicO(850)::InsTipα; CmR; KmR

diese Arbeit; (Schlicht et al., 2006)

E. coli WH855 WH207(λtet50)[pWH1911]-Derivat; yfdX(475)::InsTipα; CmR; KmR

diese Arbeit; (Schlicht et al., 2006)

λtet50 Tn10 tetA-lacZ Transkriptionsfusion; bet+; gam+; cIII+; cI+; lacZ+

(Smith und Bertrand, 1988)

5.1.9 Plasmide

Plasmid Genetische Marker Referenz

p2650

ts-ori; ApR

(Gruffat et al., 2002)

p2650-sup:tRNAGly ts-ori; ApR ; Plpp ; glyU(AS*); TrrnC diese Arbeit

pBlueskript II SK (+) ApR; lacZ Stratagene

pFT76 CmR; pSU2718-Derivat (Mahr, 2001)

pGFIB-1 Plpp; MCS; TrrnC; ApR (Masson und Miller, 1986)

pGly(AS) pGFIB-1-Derivat; mit Sequenz für synthetische Amber-Suppressor sup:tRNAGly in MCS; glyU(AS*); ApR

(Normanly et al., 1990)

pML005inv KmR; sacB (Niederweis, uv.)

pWH527 pWH510-Derivat; tetR(B); lacIq; TetR(B) wird konstitutiv auf niedrigem Niveau exprimiert; KmR

(Klotzsche et al., 2005)

pWH527(N82A) pWH510-Derivat; tetR(B)N82A; lacIq; TetR(B)N82A wird konstitutiv auf niedrigem Niveau exprimiert; KmR

(Klotzsche et al., 2005)

pWH806 pBR322-Derivat; ApR; ohne tetR Gen; pMB1-ori

(Wissmann et al., 1991b)

pWH1384 pWH2101-Derivat; ApR; Ptac; trxA-ME-tip bzw. trxA-ME-tip-cat

diese Arbeit

pWH1396 pWH1912-Derivat; ApR; KmR; InsTipβ diese Arbeit

pWH1397 pWH1912-Derivat; ApR; KmR; InsTipγ diese Arbeit

pWH1398 pWH1909-Derivat; ApR; KmR; Ptac; trxA-instip2 diese Arbeit

pWH1399 pWH1909-Derivat; ApR; KmR; Ptac; trxA-instip3 diese Arbeit

pWH1400 pWH1911-Derivat; tetR(B)N82A; lacIq TetR(B)N82A wird konstitutiv auf niedrigem Niveau exprimiert; CmR

diese Arbeit

MATERIALIEN, MEDIEN UND METHODEN

- 82 -

pWH1406 pWH1911-Derivat; tetR(B)F86A; lacIq TetR(B)F86A wird konstitutiv auf niedrigem Niveau exprimiert; CmR

(Friedlein, 2006)

pWH1407 pWH1911-Derivat; tetR(B)N82A/F86A; lacIq TetR(B)N82A/F86A wird konstitutiv auf niedrigem Niveau exprimiert; CmR

(Friedlein, 2006)

pWH1411 pACYC177-Derivat; CmR (Baumeister et al., 1992)

pWH1866 pUC18-Derivat; ApR; KmR; InsTetG-1 (Köstner et al., 2006)

pWH1870 pUC18-Derivat; ApR; KmR; InsTetG-3 (Zuch, 2004)

pWH1903 pWH2101-Derivat; ApR; Ptac; trxA-instip1 bzw. trxA-instip1-cat

diese Arbeit

pWH1906 pWH1903-Derivat; ApR; Ptac; trxA-instip1 bzw. trxA-instip1-cat; Plpp; glyU(AS*); TrrnC

diese Arbeit

pWH1907 pWH1866-Derivat; ApR; InsTipSup diese Arbeit

pWH1909 pWH2101-Derivat; ApR; KmR; Ptac; trxA-instip1 diese Arbeit; (Schlicht et al., 2006)

pWH1911 pWH527-Derivat; tetR(B); lacIq; TetR(B) wird konstitutiv auf niedrigem Niveau exprimiert; CmR

diese Arbeit; (Schlicht et al., 2006)

pWH1912 pWH1866-Derivat; ApR; KmR; InsTipα diese Arbeit; (Schlicht et al., 2006)

pWH1913 pWH2201-Derivat; ApR; Expression von TrxA mit N-terminaler TipFRT1-Fusion

diese Arbeit

pWH1914 pWH1866-Derivat; ApR; KmR; ReTipN diese Arbeit

pWH2100 pBR322-Derivat; ApR; Ptac; trxA (Klotzsche et al., 2005)

pWH2101 pWH2100-Derivat; ApR; Ptac; trxA-tip (Klotzsche et al., 2005)

pWH2200 pBR322-Derivat; ApR; Ptac; trxA (Klotzsche et al., 2005)

pWH2201 pWH2200-Derivat; ApR; Ptac; tip-trxA (Klotzsche et al., 2005)

5.1.10 Konstruktion der Plasmide

Alle in dieser Arbeit klonierten Plasmide sind in digitaler Form als Vector NTI Suite 6.0–

Dateien vorhanden. Die jeweils veränderte DNA-Sequenz wurde mittels einer

Sequenzierungsreaktion nach Sanger (Sanger et al., 1977) verifiziert. Für Amplifikationen

mittels PCR wurde, sofern nicht anders angegeben, die PhusionTM High-Fidelity DNA

Polymerase verwendet.

p2650-sup:tRNAGly: Das Plasmid p2650 wurde mit dem Restriktionsenzym HincII verdaut.

Das entstehende, 3042 bp große Fragment wurde eluiert und gereinigt. Anschließend wurde

das Fragment mittels Shrimps Alkalischer Phosphatase dephosphoryliert. pGly(AS) wurde

mittels des Restriktionsenzyms PvuII verdaut, das entstehende 344 bp große Fragment, das

MATERIALIEN, MEDIEN UND METHODEN

- 83 -

die Suppressionskassette kodiert, gereinigt und mit dem Vektorfragment von p2650 ligiert.

Der resultierende Vektor p2650-sup:tRNAGly umfasst 3386 bp.

pWH1384: Unter Verwendung der Oligonukleotide trxApepBs1_for_for und

trxApepBs1_rev_for2 wurde ein 398 bp langes Fragment des Vektors pWH2101 mittels PCR

amplifiziert. In einer zweiten PCR wurde mit Hilfe der Oligonukleotide trxApepBs1_for_rev2

und trxApepBs1-1_rev_rev ein 90 bp Fragment des Vektors pWH2101 amplifiziert.

Anschließend wurde mit einer Überlappungs-PCR, unter Nutzung der Oligonukleotide

trxApepBs1_for_for und trxApepBs1-1_rev_rev, das Volllängenamplifikat mit 454 bp

gebildet, wobei die 398 bp und 90 bp langen Fragmente als Matrize dienten. Das 454 bp

große Fragment wurde mit XhoI und NheI geschnitten. Zusätzlich zu diesem Amplifikat

wurde in einer PCR mit den Oligonukleotiden Cm_for2 und Cm_rev ein 696 bp großes

Fragment von dem Vektor pFT76 amplifiziert. Es kodiert die modifizierte Chloramphenicol-

acetyl-transferase, deren Startcodon für Methionin mittels des Oligonukleotids Cm_for2

gerichtet gegen ein Codon für Alanin ausgetauscht wurde. Das 696 bp große Fragment wurde

NheI und PstI geschnitten. Das XhoI und PstI geschnittene, 4141 bp große Vektorfragment

von pWH2101 wurde gleichzeitig mit den 454 bp und 696 bp großen Fragmenten ligiert und

E. coli RB791 damit transformiert. Der resultierende Vektor pWH1384 umfasst 5256 bp.

pWH1396: Die Klonierungsstrategie von pWH1396 entspricht der von pWH1912, wobei

hier mittels des Oligonukleotides ME-for und der o.g. DNA-Polymerase ein 1819 bp langes

Fragment von pWH1398 amplifiziert wurde, das die Sequenz für InsTipβ beinhaltet. Der

resultierende Vektor pWH1396 umfasst 4183 bp.

pWH1397: Die Klonierungsstrategie von pWH1397 entspricht der von pWH1912, wobei

hier mittels des Oligonukleotides ME-for und der o.g. DNA-Polymerase ein 1819 bp langes

Fragment von pWH1399 mit der Sequenz für InsTipγ amplifiziert wurde. Der resultierende

Vektor pWH1397 umfasst 4183 bp.

pWH1398: Unter Verwendung der Oligonukleotide trxApepBs1_for_for und Met-Ins-r

wurde ein 435 bp langes Fragment des Vektors pWH1909 mittels PCR amplifiziert, welches

die Sequenz für trxA und die ersten 20 nt des 5´-Sequenzbereiches von InsTipα umfasste.

Durch das Oligonukleotid Met-Ins-r wurde hierbei im Amplifikat gezielt das Codon „ATG“

eingefügt, so dass nach erfolgter Translation direkt vor Tip die Aminosäure Methionin tritt.

MATERIALIEN, MEDIEN UND METHODEN

- 84 -

Zusätzlich wurde mittels der o.g. DNA-Polymerase und den Oligonukleotiden S-FRT-5 und

Met-Ins-f aus dem Plasmid pWH1909 ein 1804 bp langes Fragment amplifiziert, wobei Met-

Ins-f ebenso das Codon für die Aminosäure Methionin beinhaltet. In einer darauf folgenden

Überlappungs-PCR wurde, unter Nutzung der Oligonukleotide trxApepBs1_for_for und S-

FRT-5, das Volllängenamplifikat mit 2203 bp gebildet, wobei die 435 bp und 1804 bp langen

Fragmente als Matrize dienten. Das 2203 bp lange Fragment wurde mit XhoI und PstI

geschnitten und mit dem ebenso XhoI und PstI geschnittenen, 4141 bp großen

Vektorfragment von pWH2101 ligiert und E. coli RB791 damit transformiert. Der

resultierende Vektor pWH1398 umfasst 6322 bp.

pWH1399: Die Klonierungsstrategie von pWH1399 entspricht der von pWH1398, wobei

anstelle der Oligonukleotide Met-Ins-f und Met-Ins-r die Oligonukleotide Phe-Ins-f und Phe-

Ins-r genutzt wurden. Durch das Oligonukleotid Phe-Ins-r wurde hierbei im Amplifikat

gezielt das Codon „TTT“ eingefügt, so dass nach erfolgter Translation direkt vor Tip die

Aminosäure Phenylalanin tritt. Der resultierende Vektor pWH1399 umfasst 6322 bp.

pWH1400: Die Klonierungsstrategie von pWH1400 entspricht der von pWH1911, wobei

an die Stelle des Vektors pWH527, der TetR(B) konstitutiv auf niedrigem Niveau exprimiert,

das pWH527-Derivat pWH527(N82A) tritt, welches die Expression von TetR(B)N82A

vermittelt. Der resultierende Vektor pWH1400 umfasst 7473 bp.

pWH1903: Mittels der o.g. DNA-Polymerase und der Oligonukleotide Linker-rev und

trxApepBs1_for_for wurde ein 425 bp langes Fragment amplifiziert, sowie mittels der

Oligonukleotide Linker-for und Cm_rev ein 782 bp langes Fragment. Als Matrize diente in

beiden Fällen pWH1384. In einer darauf folgenden Überlappungs-PCR wurde, unter Nutzung

der Oligonukleotide trxApepBs1_for_for und Cm_rev, das Volllängenamplifikat mit 1157 bp

gebildet, wobei die 425 bp und 782 bp langen Fragmente als Matrize dienten. Das 1157 bp

große Fragment wurde mit XhoI und PstI geschnitten und mit dem ebenso XhoI und PstI

geschnittenen, 4141 bp großen Vektorfragment von pWH2101 ligiert. E. coli RB791 wurde

anschließend mit dem Ligationsansatz transformiert. Der resultierende Vektor pWH1903

umfasst 5277 bp.

pWH1906: Das Plasmid pWH1903 wurde mit dem Restriktionsenzym EheI verdaut und

das so linearisierte, 5277 bp große Plasmid wurde anschließend mittels Shrimps Alkalischer

MATERIALIEN, MEDIEN UND METHODEN

- 85 -

Phosphatase dephosphoryliert. pGly(AS) wurde mittels des Restriktionsenzyms PvuII

verdaut, das entstehende 344 bp große Fragment, das die Suppressionskassette kodiert,

gereinigt und mit dem linearisierten Vektor pWH1903 ligiert. Der resultierende Vektor

pWH1906 umfasst 5621 bp.

pWH1907: Mittels der o.g. DNA-Polymerase und der Oligonukleotide ME-for und minus-

PvuII-rev wurde ein 227 bp langes Fragment amplifiziert, sowie mittels der Oligonukleotide

minus-PvuII-for und ME-CmA-rev ein 590 bp langes Fragment. Als Matrize diente in beiden

Fällen pWH1903. In einer darauf folgenden Überlappungs-PCR wurde, unter Nutzung der

Oligonukleotide ME-for und ME-CmA-rev, das Volllängenamplifikat mit 793 bp gebildet,

das InsTipSup umfasst, wobei die 227 bp und 590 bp langen Fragmente als Matrize dienten.

Durch die Nutzung der Oligonukleotide minus-PvuII-for und minus-PvuII-rev wurde eine

PvuII Schnittstelle innerhalb der InsTipSup Sequenz eliminiert. Zusätzlich wurde das Plasmid

pWH1866 mit PvuII restringiert, wodurch ein 1376 bp und ein 2364 bp langes

Vektorfragment entstanden. Das 2364 bp lange Fragment wurde eluiert und mit Shrimps

Alkalischer Phosphatase dephosporyliert. Das 793 bp lange Amplifikat der PCR wurde durch

die T4 Polynukleotidkinase an den 5´–Enden phosphoryliert und mit dem PvuII geschnittenen

2364 bp Fragment des Vektors pWH1866 ligiert. E. coli RB791 wurde mit dem

Ligationsansatz transformiert. Der resultierende Vektor pWH1907 umfasst 3157 bp.

pWH1909: Durch Nutzung der o.g. DNA-Polymerase und der Oligonukleotide

trxApepBs1_for_for und S-FRT-2 wurde von pWH1903 mittels PCR ein 480 bp langes

Fragment amplifiziert. Weiterhin wurde mittels PCR unter Verwendung der DNA Polymerase

und der Oligonukleotide S-FRT-3 und S-FRT-4 ein 1706 bp großes Fragment amplifiziert,

wobei der Vektor pWH1870 als Matrize diente. In einer darauf folgenden Überlappungs-PCR

wurde, unter Nutzung der Oligonukleotide trxApepBs1_for_for und S-FRT-5, das

Volllängenamplifikat mit 2200 bp gebildet, das das Gen trxA und die InsTipα kodierende

Sequenz umfasst, wobei die 480 bp und 1706 bp langen Fragmente als Matrize dienten. Das

2200 bp große Amplifikat wurde XhoI und PstI geschnitten und mit dem ebenso XhoI und

PstI geschnittenen, 4141 bp großen Vektorfragment von pWH2101 ligiert. E. coli RB791

wurde anschließend mit dem Ligationsansatz transformiert. Der resultierende Vektor

pWH1909 umfasst 6319 bp.

MATERIALIEN, MEDIEN UND METHODEN

- 86 -

pWH1911: pWH1411 wurde mit dem Restriktionsenzym BsrBI verdaut und das 1486 bp

lange Fragment, das die Sequenz für die Chloramphenicol-Resistenzkassette enthielt, wurde

mit SmaI geschnitten und mit den durch Shrimps Alkalische Phosphatase dephosphorylierten

Vektor pWH527 ligiert. Die Insertion der Chloramphenicol-Resistenzkassette in den Vektor

pWH527 erfolgte in das vektoreigene Kanamycin-Resistenzgen, was dadurch inaktiviert

wurde. E. coli RB791 wurde mit dem Ligationsansatz transformiert. Der resultierende Vektor

pWH1911 umfasst 7473 bp.

pWH1912: Mittels des Oligonukleotides ME-for und der o.g. DNA-Polymerase wurde ein

1816 bp langes Fragment des Vektors pWH1909 amplifiziert, welches die Sequenz für

InsTipα umfasste. Zusätzlich wurde das Plasmid pWH1907 mit PvuII restringiert, wodurch

ein 793 bp und ein 2364 bp langes Vektorfragment entstand. Das 2364 bp lange Fragment

wurde eluiert und mit Shrimps Alkalischer Phosphatase dephosporyliert. Das 1816 bp lange

Amplifikat der PCR wurde durch die T4 Polynukleotidkinase an den 5´–Enden phosphoryliert

und mit dem PvuII geschnittenen 2364 bp Fragment des Vektors pWH1907 ligiert. E. coli

RB791 wurde mit dem Ligationsansatz transformiert. Der resultierende Vektor pWH1912

umfasst 4180 bp.

pWH1913: Mit Hilfe der o.g. DNA-Polymerase und der Oligonukleotide

trxApepBs1_for_for und Bs1-FRT wurde ein 122 bp Fragment und mit den Oligonukleotiden

FRT-trxA und trxA-PstI ein 442 bp Fragment amplifiziert. In beiden Fällen diente das

Plasmid pWH2201 als Matrize. In einer nachfolgenden Überlappungs-PCR wurden beide

Fragmente als Matrize genutzt und ein 546 bp langes Fragment mit Hilfe der o.g. DNA-

Polymerase und der Oligonukleotide trxApepBs1_for_for und trxA-PstI gebildet. Nach

Restriktion mit den Enzymen XhoI und PstI wurde das PCR-Fragment mit dem ebenso XhoI

und PstI geschnittenen, 4141 bp großen Vektorfragment des Plasmids pWH2101 ligiert. E.

coli RB791 wurde mit dem Ligationsansatz transformiert. Der resultierende Vektor pWH1913

umfasst 4586 bp.

pWH1914: Durch Nutzung der o.g. DNA-Polymerase und der Oligonukleotide Seq-

HindIII-KmR und KmR-S-M-FRT wurde von pWH1909 mittels PCR ein 1404 bp langes

Fragment amplifiziert. Weiterhin wurde mittels PuReTaqTM Ready-To-GoTM PCR Beads und

der Oligonukleotide trxApepBs1_for_for und FRT-3S-PstI-Seq ein 167 bp langes PCR-

Produkt erzeugt, das am 3´-Ende 18 nt langen identischen Sequenzabschnitt zum 5´-Ende des

MATERIALIEN, MEDIEN UND METHODEN

- 87 -

1404 bp langen Fragments aufwies. Durch eine Überlappungs-PCR mit den Oligonukleotiden

trxApepBs1_for_for und KmR-S-M-FRT wurde in Anwesenheit beider genannten Fragmente

als Matrize ein 1553 bp langes PCR-Produkt erzeugt. Dieses wurde durch die T4-

Polynukleotidkinase an den 5´–Enden phosphoryliert und mit dem PvuII geschnittenen 2364

bp Fragment des Vektors pWH1907 ligiert. E. coli RB791 wurde mit dem Ligationsansatz

transformiert. Der resultierende Vektor pWH1914 umfasst 3917 bp.

5.2 Medien und Medienzusätze

Bakteriennährmedien wurden mit deionisiertem Wasser angesetzt und für 25 min bei 121°C

und 2 bar autoklaviert. Plattenmedien wurden vor dem Autoklavieren zusätzlich mit 15 g/l

Agar versetzt.

5.2.1 Bakteriennährmedien

LB-Medium MC∆-Medium

10 g/l Trypton 20 g/l Pepton aus Casein

5 g/l Hefeextrakt 10 g/l NaCl

10 g/l NaCl 5 g/l Ochsengalle, getrocknet

2x MacCONKEY Bouillon

70 g/l MacCONKEY Bouillon

M9-Minimalmedium 10x M9-Salze

100 ml/l 10x M9-Salze 60 g/l Na2HPO4

1 ml/l 1 M MgSO4 30 g/l KH2PO4

10 mg/l Thiaminiumdichlorid 5 g/l NaCl

10 ml/l 20% (w/v) C-Quelle 10 g/l NH4Cl

pH 7,4

MATERIALIEN, MEDIEN UND METHODEN

- 88 -

SOB-Medium SOC-Medium

10 g/l Trypton 10 ml SOB-Medium

2,5 g/l Hefeextrakt 100 µl 1 M MgCl2

0,85 ml 5 M NaCl 100 µl 1 M MgSO4

1 ml 1 M KCl 200 µl 20% (w/v) Glukose

pH 7,0 pH 7,0

5.2.2 Fakultative Medienzusätze

Fakultative Zusätze wurden bei Flüssigmedien nach Erkalten, bei Plattenmedien nach

Abkühlen auf etwa 50°C zugegeben. Antibiotika wurden in 1000-fach konzentrierter Lösung,

wie in Sambrook und Russell beschrieben, angesetzt und bei -20°C gelagert (Sambrook und

Russell, 2001). Tetrazyklin und Anhydrotetrazyklin wurden in 70% (v/v) Ethanol gelöst und

immer frisch angesetzt. X-Gal wurde als 1000-fach Stammlösung angesetzt und in N,N-

Dimethylformamid gelöst. Zur Induktion der Expression von Tip-Fusionsproteinen unter

Kontrolle des tac-Promotors (Ptac) wurde IPTG als 1000-fach Stammlösung angesetzt, in H2O

gelöst und sterilfiltriert (Sterilfilter mit einer Porengröße von 0,2 µm).

Antibiotika-Stammlösungen

100 mg/ml Ampicillin in H2O

25 mg/ml Chloramphenicol in 70% (v/v) EtOH

30 bzw. 60 mg/ml Kanamycin in H2O

0,2 mg/ml Tetrazyklin in 70% (v/v) EtOH

0,2 mg/ml Anhydrotetrazyklin in 70% (v/v) EtOH

X-Gal-Stammlösung

40 mg/ml X-Gal in DMF

IPTG-Stammlösung

500 mM IPTG in H2O

MATERIALIEN, MEDIEN UND METHODEN

- 89 -

5.3 Lösungen und Puffer

5.3.1 Lösungen zur Elution von DNA

TE-Puffer PAA-Elutionspuffer

10 mM Tris-HCl, pH 8,0 500 mM Ammoniumacetat

0,1 mM EDTA, pH 8,0 10 mM Magnesiumacetat

1 mM EDTA, pH 8,0

0,1% (w/v) SDS

5.3.2 Lösung zur DNA-Präzipitation mittels PEG

PEG-Präzipitationslösung

30% (w/v) PEG 6000

1,5 M NaCl

5.3.3 Puffer und Lösungen zur Gelelektrophorese

10x TBE 50x TAE 10x SDS-PAGE-Puffer

890 mM Tris-Base 242 g Tris-Base 1,92 M Glycin

890 mM Borsäure 57,1 ml Essigsäure 0,5 M Tris-Base

20 mM EDTA 100 ml 0,5 M EDTA, pH 8,0 1% (w/v) SDS

pH 8,3 – 8,5 mit H2O auf 1 l und mit Eisessig auf pH 8,3 eingestellt

pH 8,5 – 8,8

4x DNA-Auftragepuffer 2x Protein-Auftragepuffer

0,1% (w/v) Bromphenolblau 0,2% (w/v) Bromphenolblau

0,1% (w/v) Xylencyanol 5% (w/v) SDS

50% (v/v) Glyzerin 50% (v/v) Glyzerin

5% (v/v) 20x TAE 16% (v/v) β-Mercaptoethanol

200 mM Tris-HCl, pH 7,0

MATERIALIEN, MEDIEN UND METHODEN

- 90 -

5.3.4 Lösungen zur Herstellung eines denaturierenden PAA-Gels (SDS-PAGE)

10%-iges PAA-Trenngel PAA-Sammelgel

3,7 ml

40% Acrylamid/ Methylenbisacrylamid (19/1)

750 µl

40% Acrylamid/ Methylenbisacrylamid (19/1)

1,3 ml 1 M Tris-HCl, pH 8,8 650 µl 1 M Tris-HCl, pH 6,8

1,5 ml 1 M Tris-Borsäure, pH 8,8 5,35 ml H2O

7,4 ml H2O 375 µl 2% (w/v) SDS

800 µl 2% (w/v) SDS 375 µl 10% (w/v) APS

400 µl 10% (w/v) APS 10 µl TEMED

5 µl TEMED

Für höherprozentige PAA-Trenngele wurde der Gehalt an 40% Acrylamid/Methylenbisacrylamid (19/1) im Trenngel entsprechend erhöht.

5.3.5 Lösungen zur Färbung von DNA- und Protein-Gelen

Färbelösung für DNA-Gele Färbelösung für Proteine in denat. PAA-Gelen

0,5 mg/l Ethidiumbromid 0,2% (w/v) PhastGel Blue R

60% (v/v) Methanol

Waschlösung für denat. PAA-Gele Entfärbelösung für denat. PAA-Gele

40% (v/v) Methanol 10% (v/v) Essigsäure

10% (v/v) Essigsäure

5.3.6 Lösung zur Herstellung nativer PAA-Gele

12%-iges PAA-Gel

3 ml

40% Acrylamid/ Methylenbisacrylamid (19/1)

1 ml 10x TBE

1 ml Glyzerin

4,89 ml H2O

100 µl 10% (v/v) APS

10 µl TEMED

MATERIALIEN, MEDIEN UND METHODEN

- 91 -

5.3.7 Puffer für Western Blot-Analysen

ZAP 10x PBS PBS-T

10 mM Tris-HCl, pH 8,0 580 mM Na2HPO4 1x PBS

200 mM NaCl 170 mM NaH2PO4 0,1% (v/v) Tween 20

5 mM DTT 680 mM NaCl

Transferpuffer Blockierlösung

10 mM NaHCO3 0,2% (w/v) I-BlockTM in 1x PBS

3 mM Na2CO3 0,1% (v/v) Tween 20

20% (v/v) Methanol

5.3.8 Puffer für β-Galaktosidase Aktivitätsmessungen

5x LacZ-Puffer Stop-Lösung

300 mM Na2HPO4 · 12 H2O 1 M Na2CO3

200 mM NaH2PO4 · H2O

50 mM KCl

5 mM MgCl2 · 7 H2O

250 mM β-Mercaptoethanol

5.3.9 Puffer für in vitro Transposonmutagenesen

In vitro Reaktionspuffer

0,5 M Tris-Acetat, pH 7,5

1,5 M Kaliumacetat

100 mM Magnesiumacetat

40 mM Spermidin

5x LacZ-Puffer wurde stets kurz vor der Messung frisch mit β-Mercaptoethanol versetzt.

MATERIALIEN, MEDIEN UND METHODEN

- 92 -

5.4 Methoden

Die in dieser Arbeit verwendeten Methoden sind in der folgenden Tabelle aufgelistet. Sofern

Abweichungen von diesen Protokollen vorgenommen wurden, wird dies im entsprechenden

Kapitel angegeben.

5.4.1 Allgemeine Methoden

Methode Referenz

Denaturierende Gelelektrophorese von Proteinen (Laemmli, 1970)

Dephosphorylierung von 5´-Hydroxygruppen mittels SAP Protokoll des Herstellers

Elution von DNA aus Agarosegelen (Sambrook und Russell, 2001)

Elution von DNA aus nativen PAA-Gelen (Maxam und Gilbert, 1980)

Ethidiumbromid-Färbung von DNA (Sambrook und Russell, 2001)

PhastGel Blue R Färbung von Proteinen in denaturierenden PAA-Gelen Protokoll des Herstellers

Gelelektrophorese von DNA (Sambrook und Russell, 2001)

Herstellung CaCl2-kompetenter E. coli Zellen (Sambrook und Russell, 2001)

Ligation von DNA-Fragmenten mittels T4 DNA Ligase (Sambrook und Russell, 2001)

In vitro Transposon-Insertionsreaktion nach EZ::TNTM Transposase, Epicentre

Protokoll des Herstellers

Phosphorylierung von DNA-Enden mittels PNK Protokoll des Herstellers

Photometrische Mengenbestimmung von DNA (Sambrook und Russell, 2001)

Präzipitation von DNA mittels Ethanol (Ausubel et al., 1995)

Präzipitation von DNA mittels PEG (Humphreys et al., 1975)

Polymerase-Kettenreaktion (PCR) (Mullis und Faloona, 1987)

Proteinkonzentrationsbestimmung nach Bradford Protokoll des Herstellers

Präparation von chromosomaler DNA aus E. coli mittels QIAamp DNA Mini Kit

Protokoll des Herstellers

Präparation von Plasmid-DNA aus E. coli mittels Nucleobond AX 100 bzw. Nucleospin Plasmid

Protokoll des Herstellers

Restriktion von DNA mittels Restriktionsendonukleasen Protokoll des Herstellers

Sequenzierung von DNA (Sanger et al., 1977)

Transformation von E. coli (Sambrook und Russell, 2001)

MATERIALIEN, MEDIEN UND METHODEN

- 93 -

5.4.2 Herstellung elektrokompetenter Zellen von E. coli

100 bis 600 ml SOB-Medium wurde 1:100 mit einer E. coli üNK angeimpft und die Kultur

bis zum Erreichen einer optischen Dichte von oD600 ≈ 0,4 bei 37°C geschüttelt. Nach

15-minütiger Inkubation auf Eis wurde die Zellsuspension bei 5000 Upm und 4°C für 10 min

(Heraeus Biofuge primo R) zentrifugiert, um die Zellen zu ernten. Das Zellpellet wurde im

gleichen Volumen in eiskaltem 10%igen (v/v) Glyzerin resuspendiert und die Zellsuspension

erneut unter obigen Bedingungen zentrifugiert. Dieser Schritt wurde viermal wiederholt. Das

Pellet wurde anschließend in einem tausendstel des Originalvolumens in eiskaltem

10%igen (v/v) Glyzerin resuspendiert. Die Zellsuspension wurde zu 40 bzw. 100 µl

aliquotiert und mit flüssigem Stickstoff schockgefroren. Gelagert wurden die

elektrokompetenten Zellen bei -80°C.

5.4.3 Isolierung der Insertionselemente InsTipSup und InsTipα

Das jeweilige Plasmid (pWH1907 bzw. pWH1912), das die Sequenz für InsTipSup bzw.

InsTipα trägt, wurde mittels Nucleobond AX500 aus 500 ml üNK von E. coli RB791 in

einer Menge von ca. 800 µg bei einer Konzentration von ca. 1,6 µg/µl isoliert. Mittels PvuII

wurden ca. 100 µg des jeweiligen Vektors geschnitten und das 793 bp bzw. 1816 bp große

Insertionselement (InsTipSup bzw. InsTipα) durch präparative Gelelektrophorese in einem

1%igen (w/v) Agarosegel und anschließender Elution aus dem Gel mittels des GFXTM PCR

DNA and Gel Band Purification Kit gereinigt. InsTipSup bzw. InsTipα lagen anschließend in

Konzentrationen von ca. 25 ng/µl bzw. ca. 21 ng/µl vor. Beide Elemente konnten direkt für

die Transposonmutagenese eingesetzt werden.

5.4.4 Herstellung der Transposomen

Transposomen aus dem Insertionselement InsTipSup bzw. InsTipα und der hyper- und

transaktiven Tn5-Transposase wurden wie folgt hergestellt (Goryshin et al., 2000): durch

Inkubation von ca. 380 fmol InsTipSup bzw. ca. 166 fmol InsTipα mit dem fünf-fachen

molaren Überschuss an hyper- und transaktiver Tn5-Transposase in 25% (v/v) Glyzerin

(Gesamtvolumen: 25 µl) für 30 min bei 37°C wurden Transposomen gebildet

MATERIALIEN, MEDIEN UND METHODEN

- 94 -

(Bertram et al., 2005). Hierbei ist zu beachten, dass stabile Transposomen für in vivo

Applikationen nur in Abwesenheit von Mg2+ Ionen gebildet werden. Die Transposomen

wurden bei -20°C gelagert.

5.4.5 Elektroporation von E. coli mit Transposomen

1 bis 5 µl der Transposomenlösung, was bis zu ca. 65 ng DNA (InsTipSup bzw. InsTipα)

entspricht, wurden in einer eisgekühlten Elektroporationsküvette (2 mm) vorgelegt und mit 40

bzw. 100 µl Zellsuspension elektrokompetenter E. coli WH207(λtet50)[p2650-sup:tRNAGly]

bzw. WH207(λtet50)[pWH1911] versetzt. Dieser Ansatz wurde bei 2,5 kV, 200 Ω und 25 µF

in einem Bio-Rad Gene Pulser II einer Elektroporation unterzogen (Goryshin et al., 2000).

Danach wurde die Zellsuspension in der Küvette mit 2 ml SOC-Medium (37°C) versetzt, in

ein 2,2 ml Eppendorf-Reaktionsgefäß überführt und für 45 min bei 37°C in einem Wasserbad

inkubiert. Anschließend wurde die Zellsuspension auf MacCONKEY Bouillon-Agarplatten

ausplattiert, die mit den jeweiligen Antibiotika versetzt waren.

5.4.6 Bestimmung des InsTipα Insertionsortes

Chromosomale DNA der E. coli WH207(λtet50)[pWH1911] InsTipα Insertionskandidaten

wurde nach Angabe des QIAamp DNA Mini Kit Protokoll extrahiert. Die erhaltene DNA

(Lösungsvolumen: 600 µl) wurde anschließend für 30 min auf Eiswasser einer PEG-Fällung

unterzogen und in 30 bis 50 µl TE-Puffer resuspendiert. Für die nachfolgende

Sequenzierreaktion nach der Kettenabbruchmethode (Sanger et al., 1977) wurden 12 µl der

präparierten DNA mit 6 µl BigDye Terminator v 1.1 Cycle Sequencing RR-100 Mix und 2

µl des Oligonukleotids Echo-1 bzw. Echo-2 (10 pmol/µl) versetzt. Die Reaktion wurde nach

folgendem Programm durchgeführt:

Schritt Inkubationstemperatur Inkubationsdauer

Initiale DNA-Aufschmelzung 96°C 2 min

DNA-Aufschmelzung 96°C 10 s

Oligonukleotid-Anlagerung 58,5°C 5 s 25 bis 45 Zyklen

Elongation 60°C 4 min

Lagerung 4°C ∞

MATERIALIEN, MEDIEN UND METHODEN

- 95 -

Die Reaktionsprodukte wurden anschließend mit 80 µl H2O und 10 µl 3 M Natriumacetat-

Lösung versetzt, mit 96% (v/v) Ethanol gefällt und anschließend mit 70% (v/v) Ethanol

einmal gewaschen. In einer Vakuumzentrifuge wurden die Reaktionsprodukte getrocknet und

danach in 10 µl Formamid resuspendiert. Diese Lösung wurde mittels eines ABI PRISMTM

310 Genetic Analyzer elektrophoretisch analysiert. Zur Bestimmung der jeweiligen

chromosomalen Insertionsorte von InsTipα wurden die erhaltenen Sequenzierdaten

vergleichenden BLAST-Analysen (blastn) (McGinnis und Madden, 2004) in der Colibri-

Datenbank des Institut Pasteur, Frankreich, oder der NCBI-Datenbank des National Institutes

of Health, USA, unterzogen.

5.4.7 Das Reportersystem zur Analyse der in vivo TetR Induktionsfähigkeit von Tip-

Fusionsproteinen

Das komplette in vivo Reportersystem ist mit allen Komponenten in Abb. 5.1 dargestellt. Der

Tet Repressor ist, je nach experimentellem Ansatz, auf dem TetR-exprimierenden Plasmid

pWH527, pWH1911, pWH1400, pWH1406 bzw. pWH1407 kodiert und wird konstitutiv

exprimiert. TetR bzw. das jeweilige TetR-Derivat (TetRN82A, TetRF86A bzw.

TetRN82A/F86A) bindet an die Tet-Operatorsequenz tetO. Diese befindet sich in E. coli

WH207(λtet50) stromaufwärts des chromosomal integrierten Reportergens lacZ. Der TetR

gebundene Zustand entspricht dem reprimierten Zustand des Systems. LacI wird ebenfalls

konstitutiv exprimiert und verhindert die Transkription des unter Ptac-Kontrolle stehenden

Gens, das das jeweilige Fusionsprotein kodiert. Werden die Zellen in Gegenwart von IPTG

kultiviert, wird LacI induziert und dissoziiert von seiner Bindestelle innerhalb der Ptac-

Promotorsequenz ab, wodurch es zur Expression der Tip-Fusionsproteine kommt. Induziert

das jeweils exprimierte Tip-Fusionsprotein den Tet-Repressor, verlässt dieser tetO und die

Expression der β-Galaktosidase erfolgt. Dies kann qualitativ auf MacCONKEY Bouillon-

Agarplatten beobachtet werden und quantitativ mittels einer β-Galaktosidase

Aktivitätsmessung bestimmt werden.

MATERIALIEN, MEDIEN UND METHODEN

- 96 -

Abb. 5.1: Schematische Darstellung des in vivo Reportersystems in E. coli WH207(λtet50). Das TetR exprimierende Plasmid und das Plasmid, das die jeweiligen Tip-Fusionsproteine exprimiert, sind schematisch dargestellt. Das jeweilige Resistenzgen (ApR bzw. Resistenzkassette) und der Replikationsursprung (pMB1 bzw. p15A) sind angegeben. Gene sind als Pfeile dargestellt (tetR, lacIq, trxA bzw. lacZ). Der Ptac-Promotor ist als Eckpfeil gekennzeichnet und die Tet-Operatorsequenz (tetO) als schwarze Box. (A) In Abwesenheit von IPTG. (B) In Gegenwart von IPTG.

5.4.8 Quantifizierung der β-Galaktosidase Aktivität in E. coli

Um die Induzierbarkeit von TetR, TetRN82A und TetRN82A/F86A durch Tip- und Tip-

Derivat-Fusionsproteine bzw. durch Tetrazyklin und Tetrazyklin-Derivate

(Anhydrotetrazyklin) zu quantifizieren, wurde in vivo die β-Galaktosidase Aktivität des E.

A

B

MATERIALIEN, MEDIEN UND METHODEN

- 97 -

coli Stammes WH207(λtet50) bestimmt, in dem die Bindung von TetR an die tetO-

Operatorsequenz die Expression einer chromosomalen tetA-lacZ-Transkriptionsfusion

reguliert.

Für die Charakterisierung der Aktivität der Tip-Fusionen wurden pWH527, pWH1911,

pWH1400, pWH1406, pWH1407 bzw. pWH1925 verwendet. Die Plasmide pWH527 (TetR),

pWH1911 (TetR), pWH1400 (TetRN82A), pWH1406 (TetRF86A) und pWH1407

(TetRN82A/F86A) vermitteln eine Expression der jeweiligen Tet-Repressoren auf niedrigem

Niveau (Klotzsche et al., 2005).

Das experimentelle Vorgehen zur Quantifizierung der β-Galaktosidase Aktivität in E. coli

wird im Folgenden erläutert: zuerst erfolgte die Doppeltransformation des E. coli Stammes

WH207(λtet50) mit dem jeweiligen TetR-exprimierenden Plasmid und dem Plasmid, welches

das Tip-Fusionsprotein exprimiert. Pro Transformationsansatz wurden drei üNK (4 ml LB)

mit Einzelkolonien angeimpft. Die Wuchstemperatur betrug je nach experimentellem Ansatz

entweder 28°C oder 37°C. Mit 120 µl der üNK wurden anschließend jeweils 10 ml üTK

angeimpft. Drei zusätzliche Ansätze pro Konstrukt-Kombination wurden mit 1 bis 500 µM

IPTG (Induktion der Tip-Fusionsprotein-Expression) versetzt. Die Kulturen wurden bis zu

einer oD600 ≈ 0,4 bei 28°C bzw. 37°C geschüttelt und danach für 30 min bei 4°C inkubiert,

um das Wachstum zu stoppen. Anschließend wurde die Zelldichte bei 600 nm bestimmt. In

Abhängigkeit von der zu erwartenden β-Galaktosidase Aktivität wurden 20 bis 100 µl

Zellsuspension in den Reaktionsansatz pipettiert und im Wasserbad bei 28°C inkubiert. Der

Ansatz hat folgende Zusammensetzung:

Lösung Volumen

LB-Medium 800 µl – x µl

Zellsuspension x µl

5x LacZ-Puffer 200 µl

Chloroform 50 µl

0,1% (w/v) SDS 25 µl

Die Reaktion wurde durch Zugabe von 200 µl ONPG Lösung (4 mg/ml ONPG in 1x LacZ-

Puffer) gestartet. Exprimierte β-Galaktosidase katalysiert die Hydrolyse des farblosen

Substratanalogons ONPG zu Galaktose und gelbem o-Nitrophenol, das photometrisch bei

einer Wellenlänge von 420 nm detektiert werden kann. Die Ansätze wurden solange

inkubiert, bis eine deutliche Gelbfärbung im Vergleich zur mitgeführten Referenz (Ansatz

ohne Zellsuspension) ersichtlich war. Die Reaktion wurde dann durch Zugabe von jeweils

MATERIALIEN, MEDIEN UND METHODEN

- 98 -

500 µl 1 M Na2CO3-Lösung (Stop-Lösung) gestoppt und die Absorption der jeweiligen

Probenansätze im TECAN SpectraFluor Plus bei 420 nm und 550 nm (zur Korrektur von

Effekten durch eventuelle Zelltrümmer sowie nicht-aufgeschlossene Zellen) bestimmt. Nach

Subtraktion des Wertes der Referenz wurde die β-Galaktosidase Aktivität nach folgender

Formel in Einheiten nach Miller [MU] bestimmt (Miller, 1972):

A420 – (1,754 * A550) * 106 [MU] = oD600 * V * t

A420: Absorption von o-Nitrophenol bei einer Wellenlänge von 420 nm

1,754: Korrekturfaktor für E. coli

A550: Absorption/Lichtstreuung durch Zelltrümmer bei einer Wellenlänge von 550 nm

oD600: Optische Zelldichte bei einer Wellenlänge von 600 nm

V: Eingesetztes Volumen der Zellsuspension [µl]

t: Zeit [min]

5.4.9 Gewinnung von Proteinrohlysaten

Zellen von E. coli, aus denen Proteinrohlysate gewonnen werden sollten, wurden in

Flüssigkultur unter den gewünschten experimentellen Bedingungen in einem Volumen von 10

ml angezogen und anschließend pelletiert. Danach wurden die Zellpellets in 300 µl 1x ZAP

resuspendiert. Zusätzlich wurde der Protease Inhibitor „Complete“ zugesetzt. Die Zellen

wurden einer Ultraschallbehandlung (BANDELIN Sonoplus HD2070 und Sonde UW2070)

unterzogen (Leistung: 45%; Intervall: 0,9 s; je Ansatz dreimal für 30 s). Um die lösliche

Fraktion von der nichtlöslichen zu trennen, wurden die Ansätze für 1 h bei 4°C und 13000

Upm (Heraeus Biofuge fresco) zentrifugiert und der Überstand in ein neues 1,5 ml

Eppendorf-Reaktionsgefäß überführt. Die Bestimmung der Proteinkonzentration der löslichen

Fraktion erfolgte nach Bradford mittels Bio-Rad Protein Assay Reagenz.

MATERIALIEN, MEDIEN UND METHODEN

- 99 -

5.4.10 Western Blot-Analyse

Der immunologische Nachweis der Expression der TrxA Fusionsproteine durch anti-ThioTM

Antikörper erfolgte mittels Western Blot. Dazu wurden je nach experimentellem Ansatz 5 -

20 µg Proteinrohlysat auf einem 10% bzw. 12%-igen, denaturierenden PAA-Gel aufgetrennt.

Die Proteingele wurden nach der Elektrophorese 30 min in Transferpuffer inkubiert. Die

PVDF-Membranen wurden, nach kurzem Schwenken in Methanol, für 5 min in

Transferpuffer inkubiert. Der Transfer der Proteine vom Gel auf die Membran erfolgte in

Transferpuffer üN bei 4°C und einer konstanten Stromstärke von 120 mA in einer Mini-V

8·10 Blot Module-Apparatur. Die Entwicklung der Western Blots wurde folgendermaßen

durchgeführt:

Schritt Inkubationsdauer Inkubationslösung

Waschen 3x 5 min PBS-T

Blockieren 90 min Blockierlösung

Waschen 2x 5 min PBS-T/Blockierlösung 1:1

Primärer Antikörper 60 min anti-ThioTM 1:6000 in PBS-T/Blockierlösung 1:1

Waschen 3x 5 min PBS-T/Blockierlösung 1:1

Sekundärer Antikörper 30 min anti-mouse-HRP Konjugat 1:6000 in PBS-T/Blockierlösung 1:1

Waschen 4x 5 min PBS-T/Blockierlösung 1:1

Nach den oben aufgeführten Inkubationsschritten wurde die Membran für 5 min mit Substrat-

Lösung versetzt (ECL plus Western Blotting Detection System Substrat: Lösung A/Lösung B

= 50/1). Die Detektion der Lumineszenz erfolgte mit Hilfe eines Röntgenfilms, der abhängig

von der Signalstärke von wenigen Sekunden bis zu mehreren Minuten aufgelegt wurde.

MATERIALIEN, MEDIEN UND METHODEN

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5.5 Computerprogramme, Datenbanken und Internetdienste

Die für diese Arbeit genutzten Computerprogramme, Datenbanken und Internetdienste sind in

den folgenden zwei Abschnitten tabellarisch aufgeführt.

5.5.1 Computerprogramme

Programm Anwendung

DNASTAR EditSeqTM 4.00

Analyse von DNA- und Protein-Sequenzen

DNASTAR SeqManTM II 4.00 Analyse von Elektropherogrammen

Vector NTI Suite 6.0 Erstellung von Plasmidkarten und Verwaltung einer Plasmid-Datenbank

Adobe® Photoshop® Elements 2.0 Bildbearbeitung

Microsoft® Office Standard Edition 2003 Erstellung von Dokumenten und Durchführung von Tabellenkalkulationen

5.5.2 Datenbanken und Internetdienste

URL Anbieter Anwendung

http://www.kazusa.or.jp/codon

Kazusa DNA Research Institute, Japan

Datenbank zur Codon-Verteilung in bakteriellen Genomen

http://genolist.pasteur.fr/Colibri

Institut Pasteur, Paris, Frankreich

Genom-Datenbank von E. coli

http://bmb.med.miami.edu Department of Biochemistry and Molecular Biology University of Miami, USA

Genom-Datenbank von E. coli

http://www.ncbi.nlm.nih.gov

National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA

Literaturrecherche, BLAST-Analyse, Datenbank

http://ca.expasy.org

Swiss Institute of Bioinformatics, Schweiz

Proteom-Datenbank

http://cgsc.biology.yale.edu/cgsc.html

E. coli Genetic Stock Center, Yale, USA

E. coli-Stammsammlungsdatenbank

LITERATURVERZEICHNIS

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6. Literaturverzeichnis

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PUBLIKATIONEN

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LEBENSLAUF

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8. Lebenslauf

Persönliche Daten: Name: Maximilian Josef Edmund Christian Schlicht Geburtstag: 26. Juni 1978 Geburtsort: Kulmbach Familienstand: ledig, keine Kinder Staatsangehörigkeit: deutsch

Schulausbildung: 09/1984 – 07/1988 Grundschule Wunsiedel

09/1988 – 06/1997 Luisenburg-Gymnasium Wunsiedel

Abschluss: Abitur

Grundwehrdienst: 09/1997 – 06/1998 Sanitätsdienst der Luftwaffe; Otto-Lilienthal-Kaserne Roth

Hochschulausbildung: 11/1998 – 03/2003

05/2003 – 11/2003 Seit 12/2003

Stipendium: 10/2003 - 09/2005

Erlangen, den 26. Juli 2006

Studium der Biologie an der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg Diplomarbeit am Lehrstuhl für Mikrobiologie bei Priv.-Doz. Dr. Fritz Titgemeyer zum Thema: „C-Regulation von Streptomyces coelicolor: Analyse des Proteoms von Mutanten der Regulation des Phosphotransferase Systems“

Abschluss: Diplom-Biologe Univ.

Promotion am Lehrstuhl für Mikrobiologie der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg bei Professor Dr. Wolfgang Hillen

Promotionsstipendium der Stiftung Stipendien-Fonds des Verbandes der Chemischen Industrie e.V.

Wissenschaftlicher Angestellter am Lehrstuhl für Mikrobiologie der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg bei Priv.-Doz. Dr. Fritz Titgemeyer

ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS

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9. Abkürzungsverzeichnis

9.1 Abkürzungen

Abkürzung Fachbegriff

% (v/v)

Volumenprozent

% (w/v) Massenprozent

A420 Absorption von o-Nitrophenol bei einer Wellenlänge von 420 nm

A550 Absorption/Lichtstreuung durch Zelltrümmer bei einer Wellenlänge von 550 nm

Abb. Abbildung

Ac Acetat (CH3-COO-)

ADP Adenosindiphosphat

Ap Ampicillin

APS Ammoniumperoxodisulfat

atc Anhydrotetrazyklin

ATP Adenosintriphosphat

bla Resistenz-vermittelndes Gen gegen Ampicillin; Exprimiertes Protein: β-Lactamase

BSA Rinderserumalbumin

cat Resistenz-vermittelndes Gen gegen Chloramphenicol; Exprimiertes Protein: Chloramphenicol-acetyl-transferase

Cm Chloramphenicol

d- Desoxy-

dd- Didesoxy-

dest. destilliert

DMF N,N-Dimethylformamid

DMSO Dimethylsulfoxid

DNA Desoxyribonukleinsäure (deoxyribonucleic acid)

DNase Desoxyribonuklease

dNTPs Desoxyribonukleosidtriphosphate

DTT Dithiothreitol

E. Escherichia

EDTA Ethylendiamintetraacetat

EthBr Ethidiumbromid

EtOH Ethanol

FRT Erkennungsstelle der Flp-Rekombinase (flp recombinase target site)

Glc Glukose

Gly Glyzerin

IPTG Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid

ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS

- 119 -

Kap. Kapitel

KBE Koloniebildende Einheiten

Km Kanamycin

Lac Laktose

LB Luria-Bertani (Medium)

MC∆ MacCONKEY Bouillon ohne den Indikator Bromkresolpurpur (Medium)

MCS vielfache Klonierungsstelle (multiple cloning site)

MIK minimal inhibitorische Konzentration

Mw Molekulargewicht (molecular weight)

mRNA Messenger-RNA

oDx optische Dichte bei einer Wellenlänge von x [nm]

ONPG o-Nitrophenyl-β-galactopyranosid

ori Replikationsursprung (origin of replication)

P Phosphat

PAA Polyacrylamid

PAGE Polyacrylamid-Gelelektrophorese

PCR Polymerasekettenreaktion (polymerase chain reaction)

PEG Polyethylenglykol

PNK T4 Polynukleotidkinase

Pyr Pyruvat R Resistenz/resistent

RNA Ribonukleinsäure (ribonucleic acid)

RNase A Ribonuklease A

RT Raumtemperatur

Sac Saccharose

SDS Natriumdodecylsulfat (sodium dodecyl sulfate)

sp. Spezies

Suc Succinat

Tab. Tabelle

Tc Tetrazyklin

TEMED N,N-N’,N’-Tetramethylethylendiamin

Tip Transkription induzierendes Peptid (transcription inducing peptide)

Tris Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan

tRNA Transfer-RNA

ts thermosensitiv

üN über Nacht

üNK über Nacht-Kultur

Upm Umdrehungen pro Minute

UV Licht im ultravioletten Spektralbereich

Wt Wildtyp

X-Gal 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-galactopyranosid

ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS

- 120 -

9.2 Einheiten

Abkürzung der Einheit Wissenschaftliche Bezeichnung

°C

Grad Celsius

Å Ångström

AS Aminosäure(n)

bar Bar

bp Basenpaar(e)

d Tag(e) (day)

Da Dalton

g Gramm

h Stunde(n) (hour)

l Liter

m Meter

M molar (mol/l)

min Minute(n)

mol 6,022 x 1023 Teilchen

s Sekunde(n)

U Unit (Einheit der Enzymaktivität)

V Volt

W Watt

9.3 Vorsätze von Einheiten

Abkürzung des Vorsatzes Physik. Vorsatz-Bezeichnung Multiplikations-Faktor

M

Mega

(106)

k Kilo (103)

m Milli (10-3)

µ Mikro (10-6)

n Nano (10-9)

p Piko (10-12)

f Femto (10-15)

ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS

- 121 -

9.4 Nukleotid-Nomenklatur

Abkürzung Freie Base Nukleosid Nukleotid

A

Adenin

Adenosin

Adenosin 5´-monophosphat

C Cytosin Cytidin Cytidin 5´-monophosphat

G Guanin Guanosin Guanosin 5´-monophosphat

T Thymin Thymidin Thymidin 5´-monophosphat

9.5 Aminosäure-Nomenklatur nach IUPAC-IUB Vereinbarung von 1969

Ein-Buchstaben-Code Drei-Buchstaben-Code Aminosäure

A

Ala

Alanin

C Cys Cystein

D Asp Asparaginsäure

E Glu Glutaminsäure

F Phe Phenylalanin

G Gly Glycin

H His Histidin

I Ile Isoleucin

L Leu Leucin

K Lys Lysin

M Met Methionin

N Asn Asparagin

P Pro Prolin

Q Gln Glutamin

R Arg Arginin

S Ser Serin

T Thr Threonin

V Val Valin

Y Tyr Tyrosin

W Trp Tryptophan

Die Abkürzung N steht für A, C, G bzw. T.