Intrazelluläres Überleben von Staphylococcus aureus in ... · puerperalis. Neben den...

Aus dem Friedrich-Loeffler-Institut für Medizinische Mikrobiologie

(Direktor: Univ. - Prof. Dr. med. Ivo Steinmetz)

der Universitätsmedizin der Ernst-Moritz-Arndt-Universität Greifswald

Intrazelluläres Überleben von Staphylococcus aureus in Makrophagen

Inaugural – Dissertation

zur Erlangung des akademischen Grades

Doktor der Medizin (Dr. med.)

der Universitätsmedizin

der Ernst-Moritz-Arndt-Universität

Greifswald

2016

vorgelegt von

Cäcilia Renner

geb. am 24.11.1982

in Dresden

Dekan: Prof. Dr. rer. nat. Max P. Baur

1. Gutachter: Prof. Dr. I. Steinmetz

2. Gutachter: Prof. Dr. J. Buer

Ort der Disputation: Greifswald

Tag der Disputation: 7. Juni 2017

Gewidmet

meinen Eltern und Geschwistern

I

Inhaltsverzeichnis

INHALTSVERZEICHNIS………………………………………………………………………………………....I

ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS…………………………………………………………………………………. IV

1 EINLEITUNG ........................................................................................................................ 1

1.1 Staphylokokken ........................................................................................................... 1

1.1.1 Allgemeines und klinische Bedeutung.......................................................................... 1

1.1.2 Virulenzfaktoren von Staphylokokken .......................................................................... 3

1.2 Makrophagen ............................................................................................................... 6

1.2.1 Die Rolle von Makrophagen bei der Abwehr bakterieller Erreger .................................... 6

1.2.2 Oxidative Effektormechanismen von Makrophagen....................................................... 7

1.3 Intrazelluläres Überleben von Staphylokokken ............................................................ 8

1.3.1 Staphylokokken in nicht-professionell phagozytierenden Zellen ..................................... 9

1.3.2 Staphylokokken und Makrophagen.............................................................................10

1.4 Zielstellung der Arbeit ................................................................................................13

2 MATERIAL UND METHODEN ..............................................................................................14

2.1 Material .......................................................................................................................14

2.1.1 Geräte .....................................................................................................................14

2.1.2 Gebrauchsmaterialien ...............................................................................................14

2.1.3 Substanzen ..............................................................................................................15

2.1.4 Lösungen, Puffer und Medien ....................................................................................16

2.1.5 Zellkulturmedien .......................................................................................................16

2.1.6 Bakterienkultur .........................................................................................................17

2.1.7 Software ..................................................................................................................17

2.2 Bakterien ....................................................................................................................17

2.2.1 Bakterienstämme......................................................................................................17

2.2.2 Anlegen der Bakterienstocks .....................................................................................18

2.2.3 Anlage von Bakterienkulturen und Bestimmung der Keimzahl.......................................18

2.3 Makrophagen ..............................................................................................................18

2.3.1 RAW-Makrophagen ..................................................................................................19

2.3.2 Murine Knochenmarkmakrophagen ............................................................................20

II

2.4 Staphylococcus aureus - Infektionsversuche mit murinen Makrophagen: Bakterizidie-

und Phagozytoseassays .................................................................................................22

2.4.1 Makrophagen-Bakterizidie-Assay mit S. aureus ...........................................................22

2.4.2 Makrophagen-Bakterizidie-Assay mit S. epidermidis und S. carnosus ...........................23

2.4.3 Makrophagen-Bakterizidie-Assay mit S. aureus unter IFN-Stimulation .........................23

2.4.4 Makrophagen-Bakterizidie-Assay mit S. aureus unter NO-Inhibition mit Aminoguanidin ..24

2.4.5 Makrophagen-Phagozytose-Assay mit S. aureus unter Fibronektin-freien Bedingungen..24

2.5 NO-Assay ...................................................................................................................24

2.6 Statistik ......................................................................................................................25

3 ERGEBNISSE......................................................................................................................26

3.1 Die Charakterisierung der Phagozytose von Staphylokokken durch murine Makrophagen

...................................................................................................................................26

3.1.1 Die Phagozytose von S. aureus durch murine Makrophagen ........................................26

3.1.2 Der Einfluss von IFN-γ auf die Phagozytose von S. aureus ..........................................28

3.1.3 Die Phagozytose von Koagulase-negativen Staphylokokken ........................................29

3.1.4 Die Rolle von Fibronektin-bindendem Protein A bei der Phagozytose – Untersuchungen an S. carnosus .........................................................................................................30

3.1.5 Die Rolle von Fibronektin bei der Phagozytose von S. aureus Newman.........................32

3.2 Die Charakterisierung des intrazellulären Überlebens von Staphylokokken in murinen

Makrophagen ..................................................................................................................33

3.2.1 Intrazelluläres Überleben von S. aureus Newman in RAW-Makrophagen ......................33

3.2.2 S. aureus Newman in primären Knochenmarkmakrophagen von BALB/c- und C57BL/6-Mäusen ...................................................................................................................35

3.2.3 Vergleich des intrazellulären Überlebens von S. aureus Newman und S. aureus RN 6390 . ...............................................................................................................................37

3.2.4 Vergleich des intrazellulären Überlebens von S. aureus Newman und S. epidermidis ATCC 12228 ............................................................................................................39

3.3 Makrophagen-vermittelte Effektormechanismen bei S. aureus-Infektionen .................41

3.3.1 Die Rolle von Stickoxid (NO)......................................................................................41

3.3.2 Die Rolle von reaktiven Sauerstoffradikalen am Beispiel von C57Bl/6 gp91 phox-/- - Makrophagen ...........................................................................................................46

3.4 Der Einfluss der globalen regulatorischen Systeme accessory-gene-regulator (agr) und

staphylococcal-accessory-element (sae) von S.aureus ...................................................47

3.4.1 Die Rolle von agr für die Interaktion von S. aureus RN 6390 mit Makrophagen ..............48

3.4.2 Die Rolle von sae für die Interaktion von S. aureus Newman mit Makrophagen ..............51

III

4 DISKUSSION.......................................................................................................................55

4.1 Phagozytose und intrazelluläres Überleben von Staphylokokken in Makrophagen .....55

4.1.1 Die bakterielle Regulation der Phagozytose in Makrophagen........................................55

4.1.2 Die bakterielle Regulation des intrazellulären Überlebens in Makrophagen ....................57

4.2 Die Bedeutung von FnBPA und Fn für die Internalisierung von S. aureus...................60

4.3 Die Rolle von iNOS und NADPH-Oxidase in der Abwehr von intrazellulärem S. aureus..

...................................................................................................................................63

4.4 S. aureus - ein fakultativ intrazelluläres Bakterium? ...................................................65

5 ZUSAMMENFASSUNG ........................................................................................................68

6 LITERATURVERZEICHNIS ..................................................................................................70

7 PUBLIKATION.....................................................................................................................92

8 DANKSAGUNG ...................................................................................................................93

IV

Abkürzungsverzeichnis

Abb. Abbildung

AG Aminoguanidin agr Accessory gene regulator AHT Anhydrotetracyclin

ATCC The American Type Culture Collection AtlE Staphylococcus epidermidis Major Autolysin BMM Bone marrow derived macrophages

BSA Bovines Serum-Albumin CFU Colony Forming Unit DMEM Dulbecco´s Modified Eagle Medium

Eap Extracellular Adherence Protein FAK Focal Adhesion Kinase Fc Functional chain

Fg Fibrinogen Fn Fibronektin

FnbP Fibronektin-bindendes Protein Genta Gentamycin GFP Green fluorescent protein

GM-CSF Granulozyten-Makrophagen- Kolonie-stimulierender Faktor

h Stunden

HEK Human Embryonic Kidney Cells hla alpha-Hämolysin hMDM Human Monocyte derived Macrophages

HWI Harnwegsinfektion IFN-γ Interferon-gamma

iNOS Inducible Nitrit Oxide Synthase JNK c-Jun-N-terminale Kinase KNS Koagulase-negative Staphylokokken

Lyso Lysostaphin ml Milliliter µg Mikrogramm

µl Microliter MOI Multiplicity of Infection (Infektionsverhältnis) MRSA Methicillin-resistente S. aureus-Stämme

MSCRAMM Microbial Surface Components Recognizing Adhesive Matrix Molecules

NADPH Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate

NK-Zellen Natürliche-Killer-Zellen NO Stickoxid

OD Optische Dichte PBS Phosphatpuffer PFA Paraformaldehyd

p.i. post infectionem PMN Polymorphnuclear Leucocytes PRR Pattern Recognition Receptor

PTK Protein Tyrosin Kinase ROS Reactive Oxygen Species

V

rpm rounds per minute

RPMI Roswell Park Memorial Institute RT Raumtemperatur

s Sekunden sae S. aureus exoprotein expression sar Staphylococcal accessory regulator

sigB alternative Faktor Sigma B SSSS Staphylococcal Scaled Skin Syndrome S. aureus Staphylococcus aureus

t Zeit TCS Two Component Systems TLR Toll-Like-Receptor

TSB Tryptone Soya Broth u.a. unter anderem usw. und so weiter

WT Wildtyp

1

1 EINLEITUNG

1.1 Staphylokokken

1.1.1 Allgemeines und klinische Bedeutung

Die zur Familie der Micrococcaceae zählenden Staphylokokken sind unbewegliche Gram-positive,

Katalase-positive, fakultativ anaerobe Kokken. Ihre Größe beträgt etwa 1 m und sie ordnen sich meist

in Haufen oder in einer Traube (griech. staphylos) an.

Die für die Humanmedizin wichtigste Spezies ist Staphylococcus aureus. Er gehört weltweit zu

den häufigsten Pathogenen, die sowohl innerhalb als auch außerhalb des Krankenhauses Infektionen

hervorrufen können. S. aureus besiedelt bei etwa 20 % der Bevölkerung asymptomatisch Haut- oder

Schleimhäute mit der Nasenschleimhaut als Hauptreservoir (Eiff et al. 2001a; Bera et al. 2006). Die meist

harmlose Kolonisation bildet einen Risikofaktor für eine invasive lokale oder disseminierte S. aureus-

Infektion, die im Extremfall lebensbedrohlich sein kann (Wertheim, Heiman F L et al. 2005; van Belkum

et al. 2009).

Wichtige weitere Gruppe neben S. aureus sind die Koagulase-negativen Staphylokokken (KNS),

die auch in dieser Arbeit betrachtet werden sollen. KNS besitzen im Gegensatz zu S. aureus keine

Plasmakoagulase. Sie besiedeln als natürliche Kommensalen die gesamte Haut und Schleimhaut des

Menschen und sind klassische opportunistische Pathogene. KNS verfügen über ein geringeres Potential

an Pathogenität als S. aureus, wurden jedoch in den letzten Jahrzehnten als wichtige Erreger

nosokomialer Infektionen erkannt. Bisher wurden 32 unterschiedliche Spezies beschrieben, von denen

einige in mikrobiologischen Laboren zu den am häufigsten isolierten Erreger gehören (Eiff et al. 2002; Eiff

et al. 2001b; Keim et al. 2011). Der bedeutendste Vertreter, der 70-80% der KNS-Infektionen ausmacht,

ist Staphylococcus epidermidis (Schoenfelder et al. 2010; Ziebuhr et al. 2006).

1.1.1.1 Klinische Bedeutung von S. aureus

Erster Schritt der S. aureus - Infektion sind meist kleine Haut, - oder Schleimhautläsionen. Diese können

in eine lokale, mit Eiterbildung einhergehende Haut.- oder Weichteilinfektion übergehen, wie z. B.

Wundinfektion, Abszess, Furunkel, Karbunkel. S. aureus kann aber jedes Gewebe infizieren, wenn er in

tiefere Schichten gelangt, oder Zugang zur Blutzirkulation gewinnt (Krishna und Miller 2012). Das

Krankheitsspektrum reicht daher von lokalen bis zu systemischen lebensbedrohlichen Infektionen. Dazu

zählen typischerweise Pneumonie und Sepsis, Osteomyelitis, Spondylodiszitis, Endokarditis. So

verursacht S. aureus neben E. coli zu gleichen Teilen etwa ein Drittel aller Sepsen bei hospitalisierten

EINLEITUNG 2

Patienten (Foster 2005, 2009; Foster et al. 2014). Weiterhin ist S. aureus Erreger spezifischer

Infektionskrankheiten, wie der Impetigo contagiosa, Rhinosinusitis, Otitis media, sowie der Mastitis

puerperalis. Neben den aufgeführten invasiven Infektionen bilden Toxikosen eine weitere Gruppe

S. aureus-verursachter Erkrankungen. Dazu werden das Toxische-Schock-Syndrom (Toxin-1),

Staphylococcal Scaled Skin Syndrome SSSS (Exfoliatintoxin) und Lebensmittelvergiftungen

(Enterotoxine) gezählt, die durch die lokale oder systemische Wirkung der spezifischen Toxine ausgelöst

werden.

1.1.1.2 Klinische Bedeutung von Koagulase-negative Staphylokokken

Koagulase-negative Staphylokokken stellen aufgrund ihrer Fähigkeit der Biofilmbildung die häufigste

Ursache Fremdkörper-assoziierter Infektionen dar (Otto 2012). Durch die Bindung von bakteriellen

Oberflächenproteinen an extrazelluläre Matrixproteine, die die körperfremden Materialien überziehen,

können diese Biofilme entstehen und Gelenkprothesen, Katheter und Gefäßprothesen überziehen.

Bakterien, die in diesem Biofilm leben, sind vor Antibiotika gut geschützt und können daher schlecht

eliminiert werden. (Longauerova 2006; da Silva Domingues, Joana F et al. 2013). Oft ist ausschließlich

nur durch eine weitere chirurgische Intervention eine erfolgreiche Behandlung zu erzielen (Khalil et al.

2007). Biofilme bilden außerdem Foci für systemische S. epidermidis-Infektionen, bevorzugt bei

immunsupprimierten Patienten. Zu den verursachten Krankheitsbildern zählen in diesem Zusammenhang

die Osteomyelitis des Prothesen-umgebenden Knochens, Bakteriämie, Sepsis, sowie Endophtalmitis und

Endokarditis, insbesondere bei künstlichen Herzklappen (Gotz 2002; Rogers et al. 2009; Otto 2014).

1.1.1.3 Therapie von Staphylokokken-Infektionen

Die Behandlung S. aureus-vermittelter Infektionen erfolgt durch penicillinasefeste Penicilline

(Flucloxacillin), da 70-80 % der Stämme Penicillinase bilden. Allerdings nimmt die Resistenzentwicklung

durch Mutation und eine hohe genetische Flexibiltät des Erregers zu und erschwert daher zunehmend

die Behandlung sowohl von S. aureus-Infektionen, als auch KNS-Infektionen (Casey et al. 2007).

Besonders im stationären Bereich stellen Methicillin-resistente Stämme (MRSA, MRSE) mit Resistenz

gegenüber Penicillinase ein ernstzunehmendes Problem dar und machen S. aureus zu einem der

häufigsten Erreger nosokomialer Infektionen. Dies gilt zunehmend auch für S. epidermidis, der sich bei

verstärktem Einsatz von körperfremder Materialien, oder auch immunsupprimierenden Medikamenten zu

einem Haupterreger nosokomialer Infektionen entwickelt hat (Casey et al. 2007; Martins und Cunha,

Maria de Lourdes R S 2007).

EINLEITUNG 3

Die wichtigste Maßnahme zur Vermeidung S. aureus-bedingter Infektionskrankheiten im

Krankenhaus ist neben der Händedesinfektion die Sanierung von Keimträgern durch intranasale

Antibiotikagabe (Wertheim, Heiman F L et al. 2005). Weiterer wichtiger Bestandteil der Prophylaxe ist die

genauere Kenntnis wirtsspezifischer Faktoren, die den Menschen für eine solche Infektion empfänglich

machen und folglich vermieden, oder behandelt werden können (van Belkum et al. 2009).

1.1.2 Virulenzfaktoren von Staphylokokken

1.1.2.1 Virulenzfaktoren von S. aureus

S. aureus verfügt über ein weites Spektrum zahlreich beschriebener Virulenzfaktoren, die seine

Pathogenität ausmachen. Man unterscheidet dabei einerseits zellwandassoziierte Proteine, die an das

Bakterium gebunden sind von solchen Proteinen, die sezerniert werden (sog. Exoproteine, Exoenzyme

und Toxine) (Foster 2005; Asad und Opal 2008; Zecconi und Scali 2013).

Zu den zellwandassoziierten Komponenten zählt die Gruppe der MSCRAMM´s (microbial surface

components recognizing adhesive matrix proteins). Diese umfasst eine Reihe Zellwand -assoziierter

Proteine, z. B. FnbP A und B, Clumpingfactor A und B, das Extrazelluläre Adherence Protein (Eap),

Protein A, oder Kollagenbindendes Protein, die bestimmte extrazelluläre Matrixproteine wie Fibronektin,

Fibrinogen, Kollagen usw. erkennen und an sie binden. S. aureus wird dadurch die Fähigkeit der

Adhärenz an wirtseigene Strukturen vermittelt (Speziale et al. 2009; Foster et al. 2014).

Zu den andererseits von S. aureus sezernierten Proteinen gehören u. a. Koagulase,

Staphylokinase, Katalase sowie verschiedene Leukozidine. Wichtig sind die bereits erwähnten

Hämolysine (α, β, γ, δ), die über die Eigenschaft verfügen Membranen zu lysieren. Außerdem produziert

er Enzyme, wie die Hyaluronidase, Proteasen und Lipasen, die Wirtsstrukturen abbauen können.

S. aureus sezerniert auch eine Reihe von Toxinen (Superantigenen), wie das Toxische-Schock-Syndrom-

Toxin, Exfoliatintoxine und die Enterotoxine (Lowy 1998; Foster 2005; Zecconi und Scali 2013).

Mit Ausnahme der spezifischen Krankheitsbilder, die durch die Wirkung einzelner Toxine

verursacht werden, entstehen S. aureus-Infektionen immer durch ein abgestimmtes Zusammenspiel

verschiedener Virulenzfaktoren (Fournier und Philpott 2005).

1.1.2.2 Virulenzfaktoren von Koagulase-negativen Staphylokokken

Bei vergleichenden Genomanalysen zwischen S. aureus und S. epidermidis stellte sich heraus, dass

Gene von zahlreichen Exotoxinen, die von S. aureus exprimiert werden, bei S. epidermidis fehlen. Dies

mag dafür sprechen, dass S. aureus ein größeres Spektrum an Virulenzfaktoren zur Verfügung steht und

somit aggressivere Möglichkeiten bestehen, der Wirtsabwehr entgegenzuwirken (Gill et al. 2005). Die

EINLEITUNG 4

Mechanismen, über die S. epidermidis verfügt, um im Wirt zu überleben und eine Infektion zu etablieren

sind demgegenüber generell passiver. Die Pathogenität besteht im Wesentlichen in der Fähigkeit der

Biofilm-Bildung (Gotz 2002; Eiff et al. 2002; Mack et al. 2007; Zecconi und Scali 2013; Foster 2005).

Dazu wurden S. epidermidis surface (Ses)-Proteine (u.a. Aap, Bhp, SdrF and SdrG) beschrieben,

die strukturelle Ähnlichkeit mit den bekannten zellwandassoziierten Proteinen von S. aureus aufweisen.

Diese binden Wirtsfaktoren wie Kollagen und Fibronektin und vermitteln somit die Adhärenz an die

Fremdkörper-Oberflächen (Bowden et al. 2005; Arrecubieta et al. 2007). Es wurde darüber hinaus

beschrieben, dass S. epidermidis, ebenso wie S. aureus, FNBP A und B auf seiner Oberfläche exprimiert

und auch im gleichen Maß Fibronektin binden kann (Shinji et al. 1998).

In jüngster Zeit wurden Phenol soluble Modulins (PSM´s) als eine Familie zytolytischer

inflammatorischer Toxine beschrieben, die im Falle von KNS eine entscheidende Rolle in der

Biofilmbildung spielen (Otto 2014, 2012; Peschel und Otto 2013). Es handelt sich um Proteine, die auch

bei S. aureus vorkommen, aber dort mit höheren Expressionsraten und erhöhter zytolytischer Aktivität

(Cheung, Gordon Y C et al. 2010; Otto 2012).

1.1.2.3 Regulation von Virulenzfaktoren

Die Etablierung einer Infektion im Organismus setzt eine koordinierte, auf die Umgebung abgestimmte

Regulation der vielfältigen Virulenzfaktoren voraus. Die Expression von Virulenzfaktoren in S. aureus und

folglich die Synthese von entweder sezernierten oder Zellwand-ständigen Proteinen, wird durch ein

komplexes Zusammenspiel globaler Genregulatoren vermittelt, die so aufeinander abgestimmt werden,

dass sie der Infektionsausbreitung optimal dienen. (Garzoni et al. 2007; Jenkins et al. 2015). Dazu

gehören die Zweikomponentensysteme (TCS) agr, sae, srr, arl und die DNA-bindende SarA-Protein-

Familie, sowie der alternative Faktor sigB (Cheung et al. 2004; Yarwood und Schlievert 2003; Mitchell et

al. 2008).

TCS´s sind so genannte quorum sensing Systeme. Sie ermöglichen dem Erreger eine spezifisch

veränderte Genexpression in Reaktion auf die bestehenden Umweltparameter und folglich eine

kontrollierte Produktion von Proteinen für ein optimales Überleben (Asad und Opal 2008; Cheung et al.

2004; Bronner et al. 2004). Virulenzfaktoren werden somit nur nach Bedarf, vor allem in Abhängigkeit von

der Zelldichte, in bestimmten Phasen des Wachstums gebildet. Die meisten der Zellwand -assoziierten

Proteine werden in der exponentiellen Phase, die sezernierten Proteine vermehrt in der stationären

Wachstumsphase gebildet. Dies vermittelt den Bakterien im Verlauf der Infektion zunächst die Fähigkeit

der Adhärenz an das Wirtszellgewebe und danach die Möglichkeit der Invasion und des intrazellulären

EINLEITUNG 5

Überlebens. Zwei der wichtigsten Regulatorsysteme in der Pathogenese von S. aureus-Infektionen, agr

und sae, sollen im Folgenden genauer vorgestellt werden.

Der globale Regulator agr wird beim Übergang von der exponentiellen in die stationäre

Wachstumsphase der Bakterien durch quorum sensing der Populationsdichte aktiviert. Daraufhin wird die

Synthese Zellwand-assoziierter Proteine (z. B. FnBA, Protein A), wie sie zu Beginn einer S. aureus-

Infektion bevorzugt exprimiert werden, inhibiert und die Produktion von sezernierten Proteine n (z. B. α-

Hämolysin) aktiviert (Novick 2003; Wolz et al. 2000). In-vitro-Studien mit S. aureus zeigten, dass agr-

Mutanten verglichen mit dem Wildtyp in größerem Maß von nicht-professionell phagozytierenden Zellen

internalisiert werden (Wesson et al. 1998). Darüber hinaus wurde auch gesehen, dass die verschiedenen

intrazellulären Wege des Bakteriums, der Wirtsabwehr standzuhalten, mit Defekt im agr-locus nicht mehr

möglich sind. Dazu gehören die Fähigkeit zum Verlassen des Phagosoms und der Übertritt ins Zytosol,

die Unterbindung der phagolysosomalen Verschmelzung, die Apoptoseinduktion der Wirtszelle, oder die

Umgehung der Autophagie (Schnaith et al. 2007; Haslinger-Loffler et al. 2005; Menzies und Kourteva

2000). Entscheidend dabei ist die fehlende Expression von α-Hämolysin in den agr-defizienten Stämmen

(Jarry et al. 2008; Abel et al. 2011; Bantel et al. 2001; Mestre et al. 2010). Aber auch δ- und β-Hämolysin

spielen für die genannten Vorgänge eine Rolle (Giese et al. 2011a). In-vivo zeigten agr-Mutanten eine

attenuierte Virulenz und Zytotoxizität im Vergleich zum Wildtyp (Xiong et al. 2006).

Das Zweikomponentensystem sae ist ein agr-unabhängig arbeitendes regulatorisches System.

Es induziert in der postexponentiellen Wachstumsphase die Synthese von u.a. alpha-Hämolysin (α-

Toxin), beta-Hämolysin, Koagulase, Protein A, Eap und FnBPA und inhibiert dagegen die Transkription

von Kapselpolysaccharid (cap). Wie agr in Reaktion auf die Populationsdichte der Bakterien wirkt,

reguliert sae in Abhängigkeit von bestimmten Stimuli der Umgebung, wie hohe Salzkonzentrationen,

niedriger pH, Glucose, oder Antibiotika in subinhibitorischen Konzentrationen (Rogasch et al. 2006;

Geiger et al. 2008; Harraghy et al. 2005). S. aureus-Stämme mit Mutationen des sae-locus führten in

Endothelzellen in-vitro zu reduzierten Invasionsraten von S. aureus, was auf die verminderte Expression

von fnbA zurückgeführt wurde (Steinhuber et al. 2003). In in-vivo-Modellen von Sepsis bzw. Peritonitis

zeigten sae-Mutanten eine deutlich attenuierte Virulenz im Gesamtorganismus (Watkins et al. 2011;

Voyich et al. 2009).

Die Regulatoren sae und agr wirken also in der Kontrolle einiger Gene entgegengesetzt, so bei

der Expression von FnBP´s (fnbp), Kollagen (coa) und Kapselpolysaccharid (cap), zeigen aber

andererseits gleichsinnige Effekte bei der Expression von α-Toxin (hla), oder Eap (eap), das von beiden

aktiviert wird (Steinhuber et al. 2003; Xiong et al. 2006; Goerke et al. 2001; Harraghy et al. 2005).

EINLEITUNG 6

1.2 Makrophagen

1.2.1 Die Rolle von Makrophagen bei der Abwehr bakterieller Erreger

Makrophagen sind neben den neutrophilen Granulozyten wichtige Zellen der angeborenen Abwehr. Ihre

zentrale Funktion ist die Erkennung von Erregern, deren Phagozytose und Elimination. Es sind langlebige

Zellen, die sich in allen Geweben des Körpers befinden, besonders aber in für Infektionen empfänglichen

Stellen wie Lunge und Darm. Die im Blut zirkulierenden Monozyten sind ihre Vorläuferzellen.

Makrophagen sind als ortsständige Zellen in der Regel die ersten Immunzellen, mit denen bakterielle

Erreger in Kontakt treten. Die im Gegensatz dazu kurzlebigen, nicht im gesunden Gewebe

vorkommenden Neutrophilen werden dann durch sie angelockt (Alberts 2011).

Die Erregererkennung ist der erste Schritt der Wirtsabwehr. Makrophagen erkennen bakterielle

Erreger dabei anhand konservierter mikrobieller Strukturen, wie beispielsweise Lipopolysaccharide und

Flagellin (Pathogen Associate Molecular Patterns, PAMP´s). Als Erkennungsrezeptoren dienen neben

verschiedenen anderen vor allem die so genannten Toll-Like-Receptors (TLR´s), besonders TLR-2. Durch

die Rezeptorbindung wird der Makrophage aktiviert und es erfolgt über die Induktion von intrazellulären

Signalkaskaden die Produktion inflammatorischer Zytokine und Chemokine . Makrophagen bilden dabei

die Hauptquelle für die Produktion der wichtigsten inflammatorischen Parameter wie TNF-α, Il-6 und Il-β,

wie sie für die Abwehr einer Infektion entscheidend sind, als auch an der Entstehung des septischen

Schocks beteiligt sind. Kommt es nämlich zu einer massiven inflammatorischen Antwort, hat das eine

systemische Zytokinwirkung und damit ein septisches Geschehen zur Folge. Grundlage dafür bildet im

Wesentlichen die durch den proinflammatorischen Zytokinüberschuss ausgelöste endotheliale

Überaktivierung und damit mikrovaskuläre Dysfunktion, die letztlich in ein Multiorganversagen mündet

(Fournier und Philpott 2005; Fournier 2012; Sagy et al. 2013).

Die Phagozytose ist ein Prozess, der zur Aufnahme des Erregers ins Phagosom führt, einem neu

gebildeten Organell im Zytoplasma. Die graduelle Veränderung des Phagosoms hin zum Phagolysosom

wird als Phagosomenreifung bezeichnet. Dazu gehören die Ansäuerung des Phagosomeninneren, sowie

die Bildung reaktiver oxidativer Radikale, die durch die Aktivierung des NADPH-Oxidase-Komplexes

entstehen. Zusätzlich entstehen reaktive Stickoxidverbindungen, gebildet durch die Stickoxid-Synthetase

(iNOS). Es handelt sich um zwei essentielle Enzymkomplexe an der Phagosomenwand. Im letzten Schritt

erfolgt die Verschmelzung des Phagosoms mit dem Lysosom, das Lysozyme, Hydrolasen und Defensine

enthält, die den aufgenommenen Mikroorganismus verdauen und abbauen können. In der Regel

überleben Makrophagen die Phagozytose und die Wirkung der von ihnen produzierten reaktiven

bakteriziden Verbindungen. Neutrophile Granulozyten hingegen sterben nach der Phagozytose ab und

EINLEITUNG 7

werden dann wiederum durch Makrophagen abgebaut (Alberts 2011; Rigby und DeLeo 2012; DeLeo et

al. 2009).

Einige bakterielle Erreger haben gelernt, intrazellulär in Makrophagen zu überleben und zu

replizieren. Dazu gehören u.a. Mycobakterium tuberculosis, Salmonella enteritidis, Listeria

monocytogenes, Legionella pneumophila und Burkholderia pseudomallei . Von diesen ist bekannt, dass

sie sich intrazellulär in Makrophagen vermehren können, statt abgebaut zu werden, und dass sie somit

Infektionen aufrecht erhalten (Amer und Swanson 2002 ; Yamamoto 2006). Mycobakterium tuberculosis

und Legionella spp. beispielsweise können die Reifung des Phagosomens verhindern, indem sie die

phagolysosomale Fusion unterbinden. Sie persistieren dann in den frühen Reifungsstadien des s ie

umschließenden Phagosoms, das noch nicht viele bakterizide Komponenten enthält (Rohde et al. 2007;

Xu und Luo 2013). Andere Erreger wie Listeria spp. und B. pseudomallei zerstören das Phagosom in

einem frühen Reifungsstadium und gelangen dabei ins Zytosol (Dewamitta et al. 2010; Gan 2005; Lazar

Adler, Natalie R et al. 2009).

1.2.2 Oxidative Effektormechanismen von Makrophagen

Stickoxid (NO) stellt eine zentrale Komponente für die bakterizide Aktivität von Makrophagen dar,

insbesondere gegenüber intrazellulären Erregern (Fang und Vazquez-Torres 2002; Nathan und Hibbs, J

B Jr 1991; Vazquez-Torres et al. 2008; Nathan und Shiloh 2000; Chakravortty und Hensel 2003). NO und

NO-Derivate werden zusammenfassend als Reactive Nitrogen Intermediates (RNI) bezeichnet und sind

Produkte der Stickoxid-Synthase (NOS). Bisher konnte die Existenz von drei Isoformen dieses Enzyms

nachgewiesen werden, die nach dem Ort ihres jeweiligen Vorkommens als eNOS (in Endothelzellen) und

nNOS (in Neuronen) bezeichnet werden. (Hibbs, John B Jr 2002) Die dritte Form des Enzyms ist die

induzierbare Stickoxid-Synthase iNOS, die vor allem in Makrophagen vorkommt (Nathan 1997;

MacMicking et al. 1997). In ruhenden Makrophagen wird iNOS kaum exprimiert. Erst die Aktivierung von

Makrophagen durch Zytokine, insbesondere IFN-γ, TNF-alpha, Il-1β, oder die Erkennung und Bindung

von Mikroorganismen führt zur Transkription des iNOS Gens (Liew 1994; Kang et al. 2011; Kim et al.

2015).

Die Sauerstoffradikale demgegenüber, gebildet von der NADPH-Oxidase, werden auch unter

dem Begriff Reactive Oxygen Intermediates (ROI) zusammengefasst. Allgemein können diese von allen

aeroben Zellen gebildet werden, doch sind die Phagozyten von Säugern auf eine besonders hohe

Produktion von ROI spezialisiert. Dabei besitzen neutrophile Granulozyten die höchste Kapazität zur

Bildung und Freisetzung von ROI (Nathan und Shiloh 2000). Gendefekte in den verschiedenen

zytosolischen, oder membrangebundenen Untereinheiten des NADPH-Oxidase-Komplexes führen zum

EINLEITUNG 8

Funktionsverlust des Enzyms. Eine bekannte Erkrankungsform diesbezüglich ist die Chronische

Granulomatose, eine Immunschwächeerkrankung mit fehlender Bildung von ROS, die folglich mit ernsten

und rekurrenten Infektionen durch z.B. S. aureus, Aspergillus fumigatus und Salmonella spp. einhergeht

(Vignais 2002).

Neben der bakteriziden Funktion in Phagozyten verfügen ROI und RNI über zusätzliche

regulatorische Funktionen im Immunsystem mit Wirkung über die Zelle hinaus. Dies betrifft die Induktion

von Signalwegen, die Anlockung von Neutrophilen, oder die Aktivierung der Zytokinproduktion (Guzik et

al. 2003; Bogdan et al. 2000a).

1.3 Intrazelluläres Überleben von Staphylokokken

Wenn auch lange als klassischer extrazellulärer Erreger beschrieben (Finlay und Cossart 1997), besteht

inzwischen kein Zweifel daran, dass sich S. aureus auch intrazellulär aufhalten kann. Zahlreiche in-vitro-

Modelle der letzten zwei Jahrzehnte mit nicht-professionell phagozytierenden Zellen, wie Endothelzellen,

Epithelzellen, Enterozyten, Keratinozyten, Osteoblasten (Edwards et al. 2010; Sinha und Fraunholz 2010;

Sinha und Herrmann 2005; Sinha et al. 2000; Kahl et al. 2000; Garzoni und Kelley 2009; Hess et al. 2003;

Edwards et al. 2011; Ellington et al. 2003; Fraunholz und Sinha 2012) zeigten, dass S. aureus in Zellen

eindringen und dort für längere Zeit persistieren kann. Selbst in professionell phagozytierenden Zellen

wie Makrophagen und Neutrophilen wurde in den letzten Jahren beschrieben, dass S. aureus die

Phagozytose überleben und intrazellulär verbleiben kann (Voyich et al. 2005; Gresham et al. 2000; Kubica

et al. 2008; Olivier et al. 2009; Hamza und Li 2014).

Darüberhinaus unterstützen zahlreiche in-vivo-Untersuchungen die Annahme, dass

intrazellulärer S. aureus tatsächlich eine wichtige Rolle in der Pathogenese von S. aureus-Infektionen

spielt. Studien zu chronischer Mastitis (Hebert et al. 2000; Brouillette et al. 2003), Rhinosinusitis (Plouin-

Gaudon et al. 2006; Clement et al. 2005) und Osteomyelitis (Hamza et al. 2013), die häufig chronische,

rekurrente und therapierefraktäre Verläufe zeigen, weisen auf den Zusammenhang von intrazellulärem

S.aureus und der Entstehung einer Infektion des Organismus hin. Gresham et al. beispielsweise

infizierten gesunde Maus-Organismen mit Neutrophilen, die aus erkranktem Gewebe isoliert wurden und

in denen intrazellulärer S. aureus nachweisbar war, wodurch eine Infektion der gesunden Organismen

erzeugt werden konnte (Gresham et al. 2000). S. aureus wurde intrazellulär in Osteoblasten aus

Knochenmaterial von chirurgischen Patienten mit chronischer, therapieresistenter Osteomyelitis

nachgewiesen (Bosse et al. 2005), und es konnte entsprechend am in-vitro-Modell gezeigt werden, dass

infizierte Osteoblasten intrazellulären S. aureus freigeben können und dies zu einer Reinfektionen von

neuen Osteoblasten führt (Ellington et al. 2003). In einer jüngeren in-vivo-Studie konnte am Tiermodell

EINLEITUNG 9

gezeigt werden, dass intrazellulärer S. aureus schwere Knocheninfektionen verursacht, nachdem

S. aureus-infizierte Osteoblasten zu offen frakturiertem Knochen gegeben wurden (Hamza et al. 2013).

Auch S. epidermidis besitzt die Fähigkeit der Internalisierung in eukaryonte nicht-professionell

phagozytierende Zellen, wie an Osteoblasten nachgewiesen werden konnte (Valour et al. 2013; Khalil et

al. 2007). Auch hier ergeben sich Zusammenhänge zwischen intrazellulärem Vorkomen und der

Pathogenese von Erkrankungen, zum Beispiel im Hinblick auf prothesennahe Knocheninfektionen in der

Endoprothetik, oder Biomaterial-assoziierte Infektionen (Broekhuizen, Corine A N et al. 2008;

Broekhuizen, C A N et al. 2010; Valour et al. 2013).

1.3.1 Staphylokokken in nicht-professionell phagozytierenden Zellen

1.3.1.1 Phagozytose

Von zentraler Bedeutung für die Internalisation von S. aureus in nicht-professionell phagozytierende

Zellen sind die Fibronektin-bindenden Proteine (FnBP) auf der Bakterienoberfläche, das extrazelluläre

Matrixprotein Fibronektin, sowie der Wirtszellrezeptor α5β1-Integrin (Sinha et al. 1999; Fowler et al. 2000;

Menzies 2003; Dziewanowska et al. 1999; Hauck und Ohlsen 2006; Hoffmann et al. 2011; Hauck et al.

2012; Ridley et al. 2012). Fibronektin vermittelt dabei die Bindung der FnBP´s an den Integrinrezeptor.

Über weitere Integrin-vermittelte intrazelluläre Signalwege kommt es dann, einem Phagozyten-ähnlichen

Zipper-Mechanismus entsprechend, zur aktiven Internalisation des Erregers durch die Wirtszelle (Agerer

et al. 2003; Sinha et al. 2000; Edwards et al. 2011; Hauck und Ohlsen 2006; Schroder et al. 2006; Agerer

et al. 2005).

Experimente mit einem weiteren typischen zellwandständigen Protein von S. aureus, Clumping

Faktor A, ergaben zwar die Adhärenz an die Wirtszelle, im Gegensatz zu FnBP aber nicht die

Internalisation. Der Integrin-vermittelte aktive Aufnahmeprozess blieb aus (Sinha et al. 2000).

Andererseits konnte eine Internalisierung auch nach Ausschaltung der fnbp-Gene nachgewiesen werden,

so dass vermutlich noch weitere bakterielle Adhäsine die Phagozytose induzieren können (Brouillette et

al. 2003). Bedeutsam wird dies bei dem auch in dieser Arbeit verwendeten S. aureus Stamm Newman,

dessen fnbp-Gene aufgrund struktureller Veränderungen funktionslos sind (Grundmeier et al. 2004). Das

Extrazelluläre Adhärenz Protein (Eap) spielt bei S. aureus Newman eine zentrale Rolle und kompensiert

die Fibronektin-bindende Kapazität, als auch seine Internalisierungsrate (Hussain et al. 2002; Haggar et

al. 2003; Harraghy et al. 2003; Bur et al. 2013b). Der genaue Zell-Rezeptor dafür ist bisher nicht

identifiziert (Alva-Murillo et al. 2014).

Dazu kommen Untersuchungen der jüngsten Zeit, wo das S. aureus Autolysin (Atl), eine

Hydrolase, als ein weiteres Invasin identifiziert wurde. Das Heat-shock-Protein Hsc70 dient dabei als

EINLEITUNG 10

Wirtszellrezeptor, wobei die Bindung mit Atl direkt und ohne Brückenmolekül erfolgt (Hirschhausen et al.

2010). Im Fall von S. epidermidis scheint diese Form der Internalisierung sogar essentie ll zu sein

(Hirschhausen et al. 2010).

1.3.1.2 Intrazelluläres Überleben

S. aureus verfügt je nach Stamm und auch je nach Wirtszelltyp über verschiedenste Strategien, um im

intrazellulären Milieu zu überleben und den Abwehrmechanismen des Wirtszellorganismus zu

entkommen (Sinha und Fraunholz 2010). Grundlegend hierfür ist die Fähigkeit des Bakteriums zur

Anpassung der Genexpression an die intrazelluläre Umgebung (Garzoni et al. 2007). Die Produktion

verschiedener Toxine, wie beispielsweise α-Toxin, ermöglicht S. aureus das Verlassen des

Phagolysosoms und den Übergang ins Zytosol (Jarry et al. 2008; Shompole et al. 2003; Giese et al.

2011b; Sinha und Fraunholz 2010). Es wird weiterhin beschrieben, dass nach Übergang ins Zytosol

S. aureus die Apoptose der Wirtszelle induzieren kann (Bayles et al. 1998; Haslinger-Loffler et al. 2006;

Menzies und Kourteva 2000). Auch die Fähigkeit, die Autophagie für sich zu nutzen, wurde beschrieben

(Schnaith et al. 2007; Pareja, Maria Eugenia Mansilla und Colombo 2013). Ein erwähnenswerter Aspekt

in diesem Zusammenhang ist auch die Bildung von Small Colony Variants (SCV´s). Es handelt sich dabei

um weniger virulente Mutanten, die metabolisch inaktiv über lange Zeiträume intrazellulär verbleiben

können (Garzoni und Kelley 2011; Tuchscherr et al. 2010; Eiff et al. 2006).

Untersuchungen an verschiedenen klinischen S. aureus-Stämmen brachten hervor, dass kurz

nach der Aufnahme in Keratinozyten und Fibroblasten die Mehrheit der Stämme im Phagolysosom

erfolgreich abgetötet wird. Nur wenigen besonders zytotoxischen Stämmen war es vorbehalten, das

Phagolysosom zu verlassen und der Wirtsabwehr zu entgehen. Die gleichen Stämme führten in in-vivo-

Experimenten auch zu deutlich erhöhter Mortalität. (Krut et al. 2003).

Ein Beispiel für das verlängerte intrazelluläre Überleben von S. aureus aufgrund eines Defekts

auf Seiten der Wirtszelle ist die Cystische Fibrose. Im in-vitro-Modell wurde nachgewiesen, dass in CF-

Bronchialepithelzellen S. aureus das Phagosom schneller verlässt als in gesunden Zellen und er den

Abwehrmechanismen der Wirtszelle somit entgeht (Jarry und Cheung 2006; Jarry et al. 2008).

1.3.2 Staphylokokken und Makrophagen

1.3.2.1 Phagozytose von Staphylokokken in Makrophagen

Wie oben dargestellt, kann S. aureus in nicht-professionell phagozytierende Zellen aufgenommen werden

und dort überleben. Zunehmend gibt es auch Hinweise für die Aufnahme und intrazelluläres Überleben

in professionellen Phagozyten, den neutrophilen Granulozyten (Gresham et al. 2000; Voyich et al. 2005)

EINLEITUNG 11

und Makrophagen (Martinez-Pulgarin et al. 2009; Kubica et al. 2008; Das und Bishayi 2009, 2010; Hamza

und Li 2014; Das und Bishayi 2010; Dey und Bishayi 2015).

Ein spezieller Aufnahmemechanismus von S. aureus in Makrophagen ist nicht bekannt. Vielmehr

gibt es aufgrund der Fülle von Rezeptoren auf der Makrophagenoberfläche verschiedene Ansätze, die

Aufnahme von S. aureus in Makrophagen zu erklären. Neben den bekannten Rezeptoren für Komplement

und Fcγ im Rahmen der opsoninabhängigen Phagozytose sind zahlreiche spezifische Rezeptoren

bekannt, die Mikroorganismen direkt erkennen und binden. Dazu zählen die Scavenger Rezeptoren, mit

den Vertretern SRA und CD36 als am meisten untersuchte Rezeptoren im Zusammenhang mit der

S. aureus-spezifischen Abwehr (Stuart et al. 2005; Thomas et al. 2000; Leelahavanichkul et al. 2012).

Die speziellen Liganden auf bakterieller Seite bzw. die konkreten Signalwege, die intrazellulär nach der

Bindung ausgelöst werden, sind nicht einheitlich beschrieben bzw. stammspezifisch sehr unterschiedlich

(DeLoid et al. 2009) (Blanchet et al. 2014). Beide Rezeptoren spielen auch in-vivo eine bedeutsame Rolle

in der Abwehr von S. aureus-Infektionen (Stuart et al. 2005; Thomas et al. 2000; Blanchet et al. 2014),

vermutlich bedingt durch eine erhöhte Phagozytoseleistung des Makrophagen (Thomas et al. 2000).

Zu erwähnen sind ebenso die Rezeptoren der TLR-Familie, mit TLR2 als bedeutendstem

Vertreter für S. aureus-Infektionen. Diese sind entscheidend für die Aktivierung von Signalkaskasen und

die Regulation der Zytokinproduktion, sind selbst aber keine eigentlichen Phagozytoserezeptoren

(Watanabe et al. 2007; Yimin et al. 2013; Fournier 2012; Bishayi et al. 2014).

Zur Bedeutung von FnBP und dem α5β1-Integrin-Rezeptor, wie sie für die Internalisation von

S. aureus in nicht-professionell phagozytierende Zellen vielfach beschrieben ist (Sinha et al. 1999; Alva-

Murillo et al. 2014), gibt es auch bezüglich der Aufnahme in Makrophagen einige Angaben. Wang et al.

konnten beispielsweise zeigen, dass unter den vielen bekannten Makrophagen-Rezeptoren das α5β1-

Integrin für die Phagozytose von S. aureus eine bedeutende Rolle spielt (Wang et al. 2008). Weiterhin

wurde nachgewiesen, dass die FnBP-vermittelte Fibronektinbindung von S. aureus die Phagozytoserate

in Makrophagen eindeutig steigert (Shinji et al. 1998). Interessanterweise wurde in diesem

Zusammenhang beobachtet, dass der KNS-Stamm S. saprophyticus nicht stärker aufgenommen wird,

obwohl er ebenso FnBP´s auf seiner Oberfläche trägt und auch in gleichem Maß an Fn bindet. Ähnliches

wurde auch für die Internalisation des KNS-Vertreters S. epidermidis in nicht-professionell

phagozytierende Zellen beschrieben (Sinha et al. 1999; Agerer et al. 2005). Die Fn-FNBP-Bindung allein

bewirkt keine Phagozytose in Makrophagen. Es wird daher angenommen, dass u.a. die strukturellen

Unterschiede der Fn-FnBP-Bindung im Fall von S. aureus im Gegensatz zu KNS-Stämmem die

Aktivierung des Wirtszellrezeptors α5β1-Integrin auslösen und damit die Internalisierung bewirken (Shinji

et al. 2003; Wang et al. 2008; Shinji et al. 2011).

EINLEITUNG 12

1.3.2.2 Intrazelluläres Überleben von Staphylokokken in Makrophagen

Makrophagen sind die ersten Zellen der angeborenen Abwehr, die durch die Phagozytose bakterielle

Erreger eliminieren und eine Infektion verhindern. Es ist bekannt, dass S. aureus der Makrophagen-

vermittelten Abwehr widersteht, indem er intrazellulär persistieren kann (Kubica et al. 2008; Hamza und

Li 2014; Dey und Bishayi 2015). Auch für Neutrophile wurde dies beschrieben (Gresham et al. 2000;

Voyich et al. 2005; Voyich et al. 2009). Die Mechanismen, durch die er dem intrazellulären Abbau

entgehen kann, sind bisher unvollständig beschrieben. Eine Grundlage ist u.a. eine Veränderung der

Genexpression, um sich an das intrazelluläre Milieu anzupassen und dieses sogar zu nutzen. Diese

Anpassung erfolgt durch die globalen Genregulatoren, vor allem agr und sigB (Kubica et al. 2008). Wie

bereits für nicht-professionell phagozytierende Zellen beschrieben (Jarry et al. 2008), spielt für das

Überleben von S. aureus in Makrophagen das agr-regulierte zytolytische α-Toxin eine essentielle Rolle,

sowie weiterhin die Protease Aureolysin (Kubica et al. 2008), und die antioxidativen Moleküle Katalase

und Superoxiddismutase (SOD) (Das et al. 2008; Das und Bishayi 2009, 2010).

Für Neutrophile wurde beschrieben, dass S. aureus die Phagozytose überlebt und recht schnell

eine Lyse der Wirtszelle hervorruft (Voyich et al. 2005; Lundqvist-Gustafsson et al. 2001), was mit einer

erhöhten Virulenz des Erregers in-vivo korreliert (Voyich et al. 2009). Ähnliches konnte auch bereits in

nicht-professionell phagozytierenden Zellen beobachtet werden (Bayles et al. 1998; Menzies und

Kourteva 1998; Haslinger-Loffler et al. 2006). In Makrophagen überlebt S. aureus hingegen über mehrere

Tage und bewirkt dabei keinen Zelltod (Kubica et al. 2008). Weiterführende Untersuchungen konnten

zeigen, dass durch Phagozytose von S. aureus in Makrophagen sogar antiapoptotische, sowie

zytoprotektive Wege induziert werden (Koziel et al. 2009) und dies wiederum am in-vivo- Modell mit einer

erhöhten Virulenz und Infektionsausbreitung einhergeht (Koziel et al. 2013).

Die Fähigkeit des intrazellulären Überlebens in Makrophagen wurde nicht nur für S. aureus,

sondern auch für Koagulase-negative Staphylokokken nachgewiesen (da Silva Domingues, Joana F et

al. 2013; Boelens et al. 2000). Die klinische Bedeutung fremdkörperassoziierter Infektionen ist erheblich

und gekennzeichnet durch Chronifizierung, Rekurrenz und Therapieresistenz. S. epidermidis konnte ohne

Zeichen des Abbaus in Makrophagen im Fremdkörper-umgebenden Gewebe nachgewiesen werden. Die

intrazelluläre Persistenz von S.epidermidis wurde somit als entscheidend in der Pathogenese von

Fremdkörperinfektionen gesehen (Boelens et al. 2000)

ZIELSTELLUNG 13

1.4 Zielstellung der Arbeit

Es ist bekannt, dass S. aureus die Aufnahme in nicht-professionell phagozytierende Zellen induzieren

kann und dort intrazellulär persistiert. Auch für das intrazelluläre Überleben in Neutrophilen und

Makrophagen als Zellen der angeborenen Immunität gibt es zunehmend Hinweise .

Im Rahmen dieser Arbeit sollte die Erreger-Wirt-Interaktion von S. aureus mit Makrophagen näher

charakterisiert werden. Zu diesem Zweck wurde ein in-vitro-Infektionsmodell mit einer murinen

Makrophagen-Zelllinie, sowie mit primären murinen Knochenmarkmakrophagen etabliert.

Im ersten Teil der Arbeit sollte die Phagozytose und das intrazelluläre Überleben verschiedener

S. aureus-Stämme, sowie Koagulase-negativer Staphylokokken untersucht und verglichen werden. In

diesem Zusammenhang wurde auch der Einfluss von sowohl Fibronektin-bindendem Protein A, als auch

Fibronektin selbst für die Internalisierung von S. aureus untersucht.

Im zweiten Teil der Arbeit sollten bakterizide oxidative Effektormechanismen des Makrophagen

und deren Einflüsse auf die S. aureus-Infektion untersucht werden. Dazu erfolgten Experimente mit

Knochenmarkmakrophagen von Mäusen mit Defekten im iNOS Gen bzw. der gp91 Untereinheit der

NADPH-Oxidase.

Im abschließenden Teil der Arbeit sollte die Bedeutung von zwei bakteriellen Regulatorgenen von

S. aureus im Hinblick auf Phagozytose und intrazelluläres Überleben in Makrophagen betrachtet werden.

Dazu wurden S. aureus-Stämme mit Mutationen in den globalen regulatorischen Systemen agr bzw. sae

für die Infektion in murinen Makrophagen eingesetzt.

14

2 MATERIAL UND METHODEN

2.1 Material

2.1.1 Geräte

Bezeichnung Hersteller

CO2-Brutschrank CB Binder

CO2-Brutschrank S2-Labor Nuaire Zapf Instrumente

ELISA-Reader Multiskan ex Thermo

Inverses Mikroskop Axiovert 40 CF Zeiss

Laser Scanning Mikrosokop Zeiss

Mausschrank Uni Protect Ehret

Photometer Genesys 10UV Thermo

Sicherheitswerkbänke HeraSafe HS 12/2 und K15 Heraeus

Sicherheitswerkbank S2 (Lamina-Flow-Einheit

mit Produktschutz) Clean Air Typ MSC-BSS 4/2

Thermo-Schüttelinkubator KS-15 control Edmund Bühler Labortechnik

Tiefkühlschrank -70°C HFU 686 Basic Heraeus

Tischzentrifuge 5417R Eppendorf

Zentrifuge Multifuge 1L-R Heraeus

Zentrifuge GS15R Beckmann

2.1.2 Gebrauchsmaterialien


Einmalpipetten Sarstedt

Einmalskalpell Dahlhausen

Falcontubes (50 ml) Becton Dickinson

Glas Cover Slips 12mm Glaswarenfabrik Karl Hecht

Kanülen Dispomed

Küvetten Brand

Objektträger Langenbrinck

Petrischalen Sarstedt

Pipettenspitzen Sarstedt

MATERIAL UND METHODEN 15

Reagiergefäße Sarstedt

Röhrchen (15 ml) Sarstedt

Spritzen Becton Dickinson

Zellkulturflaschen (250 ml) Greiner bio one

Zellkulturplatten Greiner bio one

Zellschaber TPP

2.1.3 Substanzen


Chloramphenicol Roth

Gentamicin Sigma

Anhydrotetracyclin (AHT) Fischer scientific / Acros

BSA AppliChem

Lysostaphin Sigma

Ethanol Roth

Methanol J. T. Baker

Glycerin Merck

Mercaptoethanol Sigma

Kaliumchlorid Merck

Kaliumdihydrogenphosphat Merck

Caseinhydrolysat Roth

Salzsäure Merck

Natriumdihydrogenphosphat Merck

Natriumhydrogenphosphat J. T. Baker

Natriumnitrit Sigma

N (1-Naphtyl) Ethylendiamin Sigma

Sulfanilsäure Sigma

Natriumchlorid Roth

Kalziumchlorid Sigma

Magnesiumchlorid Sigma

Tween 20 Merck

Ammoniumchlorid AppliChem

Colombia Agar mit 5% Schafsblut Becton Dickinson

Müller-Hinton II Agar-Platten Becton Dickinson


Müller-Hinton, Pulver Oxoid

Tergitol Fluka

Sevofluran Abbott

2.1.4 Lösungen, Puffer und Medien

Bezeichnung Hersteller/Zusammensetzung

Ammoniumchloridlösung 50mM in NH4Cl

in PBS2+

BSA 10 % in PBS

Natriumnitrit 1 M in Aqua bidest

N (1-Naphtyl) Ethylendiamin 1% in Methanol

Phosphate Buffered Saline (PBS) 0,2 M NaCl

2,5 mM KCl 8 mM Na2PO4 1,5 mM KH2PO4

pH 7,4 PBS2+ 1 mM MgCl,

0,1 mM CaCl2 in PBS pH 7,4

Paraformaldehyd (PFA) 4,95 g Na2HPO4 x 2H2O 0,66 g NAH2PO4 x H 2O

26,31 g NaCl Sulfanilsäure 1 % in HCL (4N)

Tergitol 1 % in PBS mit 0,5 % BSA

2.1.5 Zellkulturmedien


Dulbecco´s Modified Eagle Medium (DMEM) Biochrom

GM-CSF PAN Biotech

IFN-γ Roche

Panexin (+/-Fibronektin) PAN

PBS-Puffer Sigma

RPMI 1640 Biochrom

Trypanblau (0,4 %) Sigma


Trypsin-EDTA PAA

2.1.6 Bakterienkultur

Bezeichnung Hersteller/Zusammensetzung

B2 10g Caseinhydrolysat 25g Hefeextrakt 25g NaCl

1,0g K2HPO4

Glucose 0,5 %

Tryptone-Soya-Broth Oxoid

2.1.7 Software

Microsoft Word 8.1

Microsoft Excel 8.1

Ascent Software Version 2.6

GraphPad Prism 4.1

2.2 Bakterien

2.2.1 Bakterienstämme

Bakterienspezies Stammbezeichnung Genotyp Plasmid Resistenzen Herkunft

S. aureus Newman WT AG Hecker,

Engelmann,

Greifswald

Newman saer- saer-

RN 6390 WT

RN 6911 agr- agr-

ATCC 25923 WT

ATCC 12600 WT

ATCC 29213 WT

S. epidermidis ATCC 12228 WT

S. carnosus TM 300 WT AG Fraunholz,

Greifswald TM 300 (GFP) GFP

TM 300 (GFP, FnBA) GFP,FnBA


2.2.2 Anlegen der Bakterienstocks

Zum Anlegen eines Stocks der in dieser Arbeit verwendeten Staphylokokken-Stämme ohne Plasmide

wurde der Keim am Vortag auf Blutplatte angeimpft, über Nacht bei 37°C bebrütet und eine der Kolonien

am Folgetag von der Platte geerntet und in LB-Medium gebracht. Die Anzucht erfolgte im

Schüttelinkubator bei 37°C und 140 rpm über Nacht. Die Kultur wurde dann mit Glycerin zu einer 30%igen

Lösung versetzt, in 0,5 ml Reagiergefäßen zu je 30 l aliquotiert und bei –70°C eingefroren.

Für S. carnosus erfolgte die Anlage eines Stocks durch Anzucht einer Kolonie von Blutplatte in

B2-Medium über Nacht im Schüttelinkubator. Die Bakterienkultur wurde dann bei 4°C und 9000rpm

abzentrifugiert und das Pellet in 1ml Einfriermedium aufgenommen: 800µl B2 + 200µl Glycerin zu einer

20%igen Lösung. Es wurden 20 µl-Aliquots hergestellt und vor der Lagerung bei -70°C in Stickstoff

schockgefroren.

2.2.3 Anlage von Bakterienkulturen und Bestimmung der Keimzahl

Für alle in-vitro-Infektionsversuche mit S. aureus sowie S. epidermidis und S. carnosus wurden am Vortag

der Infektion 5-10 l eines aufgetauten Aliquots aus dem angelegten Stock in 15-20 ml TSB-Medium,

S carnosus in B2-Medium gegeben und für 16-20 h bei 37°C im Schüttelinkubator bei 140rpm bis zu einer

OD540 von 1,4 kultiviert. Diese Bakterienkultur wurde mit PBS verdünnt auf eine OD540 von 0,4 und je

nach gewünschter MOI im entsprechenden Zellkulturmedium eingestellt. Anhand von vorab

durchgeführten Probemessungen mittels Lebendkeimzahlbestimmungen auf Blutagarplatten wurde von

einer Bakteriendichte von 3,5x108 CFU/ml ausgegangen. Die Dosiskontrolle erfolgte durch CFU-

Bestimmung der Verdünnungsreihe des Infektionsmediums.

2.3 Makrophagen

Die Zellkultivierung erfolgte mit dem Serum-freien Zellkultursystem Panexin BMM®. Dieses wurde

etabliert, um bei der Kultivierung von BMM und folglich in der Charakterisierung von murinen

Makrophagen standardisierte und reproduzierbare Bedingungen zu schaffen (Eske et al. 2009). Mit

diesem standardisierten Medium können Schwankungen in der Konzentration von Serumproteinen

ausgeschlossen und bei der Interpretation von Ergebnissen vernachlässigt werden. Des Weiteren können

im Rahmen der Infektionsversuche bestimmte Faktoren, wie z. B. Fn, kontrolliert eingesetzt werden, um

ihre genaue Funktion zu charakterisieren. Hierzu wurde Panexin BMM® nicht nur für die Zellkultivierung


von primären Knochenmarkmakrophagen verwendet, sondern auch für die Kultivierung von RAW-

Makrophagen und als Medium für alle mit dieser Fragestellung durchgeführten Experimente.

2.3.1 RAW-Makrophagen

Bei RAW-Makrophagen handelt es sich um eine adhärente murine Makrophagen-Zelllinie, die uns

freundlicherweise von der Arbeitsgruppe von Prof. R. Walther (Institut für Biochemie und

Molekularbiologie, Universität Greifswald) zur Verfügung gestellt wurde. Die Zellkultur erfolgte bei 37°C

und 5% CO2 in DMEM + 4% Panexin BMM® in 250 ml-Zellkulturflaschen zu jeweils 20ml Medium.

Für die Erhaltung der Zellen wurden diese alle 3 bis 4 Tage im alten Medium mittels Zellschaber abgelöst.

Ein bis zwei Milliliter der abgelösten Zellsuspension wurden dann in eine neue Kulturflasche mit frischem

Medium gegeben.

2.3.1.1 Einfrieren und Auftauen von Zellen

Die Zellen einer dicht bewachsenen 250 ml-Zellkulturflasche wurden abgelöst und in ein 50 ml-Röhrchen

überführt, welches bei 150g 10 min abzentrifugiert wurde. Nach Dekantieren des Überstandes wurden

die Zellen in Einfriermedium aufgenommen, das sich aus dem für die Zelllinie entsprechenden

Kulturmedium unter Zusatz von 10% DMSO zusammensetzte. Anschließend wurden die Zellen zunächst

bei -70°C gelagert und nach einigen Tagen in den Stickstofftank überführt. Zum Auftauen wurden die

Zellen im Einfrierröhrchen einige Minuten im Wasserbad bei 37°C inkubiert und anschließend in eine 250

ml-Zellkulturflasche mit 20 ml Medium überführt.

2.3.1.2 Ernten und Aussäen von Zellen

Für die Infektionsversuche wurden die Zellen am Vortag geerntet und auf Zellkulturplatten ausgesät. Dazu

wurden die Zellen zweimal mit je 3 ml PBS gewaschen. Anschließend wurden die Zellen wieder mit 5 ml

frischem Zellkulturmedium versetzt. Mittels Zellschaber wurden die Zellen vom Boden der Kulturflasche

abgelöst, resuspendiert und in ein 50 ml-Röhrchen überführt. Nach nochmaligem Resuspendieren wurde

aus dieser geernteten Zellsuspension die Zellzahl mittels Neubauer-Zählkammer ermittelt:

Dazu wurde ein Aliquot (mindestens 10µl) der Zellsuspension entnommen, mit Trypanblau im Verhältnis

1:2 verdünnt und auf eine Neubauer Zählkammer pipe ttiert. Nach dem Auszählen der Zellen unter dem

Mikroskop, konnte die Zellkonzentration der Suspension nach folgender Formel berechnet werden und

durch Zugabe von Medium eine Suspension mit der gewünschten Zellzahl hergestellt werden:


Die Färbung mit Trypanblau dient zur Identifizierung von vitalen Zellen, so dass nur diese bei der

Zellzählung berücksichtigt werden. Die Zellen wurden in der gewünschten Dichte im Medium eingestellt

und mit 400µl pro Well auf 48 Well-Zellkulturplatten zu 1x105 Zellen pro Well ausgesät. Bis zum

Experiment wurden die vorbereiteten Platten über Nacht bei 37°C und unter 5%CO2 im Brutschrank

inkubiert.

2.3.2 Murine Knochenmarkmakrophagen

2.3.2.1 Maus-Inzuchtstämme

BALB/cAn

C57Bl/6N

Diese Mausstämme wurden von Charles River (Niederlassung Sulzfeld) bezogen und bis zum Versuch

in Makrokolonkäfigen mit bis zu 10 Mäusen gehalten. Sie wurden mit Haltungsfutter für Versuchstiere und

Wasser ad libitum versorgt.

C57BL/6J

iNOS-/- (auf C57Bl/6J Hintergrund)

gp91phox-/- (auf C57Bl/6J Hintergrund)

Zuchtpärchen dieser Mausstämme wurden von The Jackson Laboratory (USA, Maine) bezogen und im

Institut für Versuchstierkunde der Universität gezüchtet.

2.3.2.2 Präparation und Kultivierung von Stammzellen aus murinem Knochenmark

Murine Knochenmarkmakrophagen wurden aus weiblichen, 10-20 Wochen alten Mäusen gewonnen (Az:

LALLF M-V/TSD/7221.3-2.3-029/05). Die Tötung der Tiere erfolgte durch zervikale Dislokation nach

Sedierung mit Sevofluran.

Vor der Präparation wurde die Maus auf einer Unterlage mit Hilfe von Kanülen fixiert und mit

Alkohol desinfiziert. Das Fell wurde im Bauchbereich geöffnet und von den unteren Gliedmaßen entfernt.

104 Zellzahl x Verdünnungsfaktor Zellzahl x = ml Zahl der Großquadrate


Es erfolgte nun die Präparation von Femur und Tibia zunächst durch Durchtrennung am Kniegelenk. Die

freigelegten Knochen wurden durch Abschaben unter Verwendung eines Skalpells von Weichteilgewebe

befreit und für mindestens 5 Minuten in eine mit Alkohol gefüllte 10 mm- Petrischale gelegt, danach zum

Spülen in eine weitere Petrischale mit sterilem PBS. Mithilfe eines neuen Skalpells erfolgte die Eröffnung

der Röhrenknochen an beiden Enden innerhalb einer leeren Petrischale und die Spülung des

Markraumes mit einer PBS-gefüllten 5ml-Spritze mit 0,4x12mm-Kanüle. Die Zellsuspensionen aller 4

Knochen wurden in einem 50 ml-Falcon-Röhrchen gesammelt und gut resuspendiert, um die

gewonnenen Zellen zu vereinzeln. Anschließend wurde die Suspension bei 1100 U/Min und 4°C für 10

Min abzentrifugiert. Der Überstand wurde daraufhin vollständig dekantiert und die Zellen in RPMI-Medium

mit Zusatz von 5% Panexin und 50 M Mercaptoethanol resuspendiert. Zur Differenzierung der

Knochenmark-Stammzellen wurde dem Medium des Weiteren Makrophagen-Wachstumsfaktor rmGM-

CSF in einer Konzentration von 2 ng/ml zugesetzt. Die Zellen wurden dann mit jeweils 20 ml in mehrere

250 ml-Zellkulturflaschen ausgesät und bei 37°C und 5% CO2 für 9-11 Tage bebrütet, um sie dann für

Experimente einzusetzen. Am 5. und 7. Tag nach Beginn der Kultivierung wurden die Zellen gefüttert.

Dazu wurden etwa 15 ml des verbrauchten Mediums abgenommen und durch frisches Medium unter

Zugabe von GM-CSF 2 ng/ml ersetzt.

2.3.2.3 Ernten und Aussäen der primären Makrophagen

Am Vortag des Infektionsversuches wurden die primären Makrophagen nach 9-11 Tagen Kultivierung

geerntet. Dazu wurde das alte Medium abgenommen, Reste des Mediums und nicht-adhärente Zellen

mit 3 ml PBS pro Flasche zweimal gewaschen. Im Anschluss wurden die Zellen mit 1,5 ml Trypsin

vollständig benetzt und die Flüssigkeit bis auf wenige Tropfen wieder abgenommen. Nach 10 Min

Inkubation bei 37°C im Brutschrank wurden pro Flasche 5 ml frisches Medium auf die Zellen gegeben,

und diese nochmals mit einem Zellschaber vom Boden abgekratzt, da die Adhärenz der

Knochenmakrophagen auch nach Trypsinbehandlung sehr stark ist. Das Medium mit den abgelösten

Zellen wurde in einem 50ml-Röhrchen aufgenommen. Zum Nachspülen wurde nochmals etwa 5 ml

frisches Medium in jede Kulturflasche gegeben, resuspendiert, wieder abpipettiert und zur Zellsuspension

dazugegeben. Die Zellen wurden dann bei 1100 U/min und 4°C für 10 min abzentrifugiert. Der Überstand

wurde verworfen und die Zellen wiederum in 10 ml PBS gewaschen, um Trypsinrückstände zu entfernen,

da das verwendete Serum-freie Medium Trypsin nicht inhibieren kann. Dann erfolgte die Aufnahme des

Zellpellets in etwa 2-3ml Medium und die Bestimmung der Zellzahl mithilfe der Neubauer Zählkammer

(2.3.1.3). Die Zellsuspension wurde danach in der entsprechenden Menge GM-CSF-haltigen Mediums

eingestellt. Nun erfolgte die Aussaat der Zellen auf 48 Well-Zellkulturplatten mit 400l pro Well in einer


Dichte von 1x105 Zellen pro Well und die Inkubation über Nacht bei 37°C und 5% CO2 im Brutschrank

bis zur Adhärenz.

2.4 Staphylococcus aureus - Infektionsversuche mit murinen Makrophagen:

Bakterizidie- und Phagozytoseassays

Für die experimentelle Untersuchung der Interaktion von S. aureus mit Makrophagen wurde ein

Infektionsmodell in-vitro etabliert. Murine Makrophagen der Zelllinie RAW bzw. primäre Zellen, gewonnen

aus murinem Knochenmark von C57Bl/6- und BALB/c-Makrophagen, wurden dafür mit Staphylokokken

infiziert, wie im Folgenden beschrieben. Um die Interaktion von Seiten der Wirtszelle, als auch von

bakterieller Seite zu charakterisieren, konnte der Bakterizidie-Assay entsprechend modifiziert werden.

Um die Phagozytose von Bakterien in Makrophagen zu untersuchen, wurde lediglich nur der Zeitpunkt

Null untersucht (sog. „Phagozytose-Assay“).

2.4.1 Makrophagen-Bakterizidie-Assay mit S. aureus

Für den Bakterizidie-Assay wurde das Kulturmedium aus den 48 Well Platten abgenommen und die

Zellen zweimal mit etwa 300µl PBS gewaschen, bevor das vorbereitete Infektionsmedium auf die Zellen

gebracht wurde. Die MOI wurde zwischen etwa 200-500 CFU pro Zelle angesetzt (Beschreibung der

Einstellung des Bakterienmediums unter 2.2.3). Nach 1 h Infektionszeit wurden die Wells erneut zweimal

mit PBS gewaschen und so die nicht-adhärenten, nicht-phagozytierten Bakterien entfernt. Nun erfolgte

die kontinuierliche Inkubation mit Zellkulturmedium unte r Zugabe von Gentamycin in einer Konzentration

von 50 µg/ml, um extrazelluläre Bakterien abzutöten und Reinfektionen der Zellen zu vermeiden.

Gentamycin verbleibt bei der eingesetzten Konzentration extrazellulär und durchdringt nicht die

Zellmembran. Vorab durchgeführte Experimente mit unterschiedlichen Konzentrationen von Gentamycin

im Zellkulturmedium zeigten bei einem Gehalt von 50 µg/ml eine Abnahme der extrazellulären Keimzahl

auf etwa 1 bis 3 % der intrazellulären Keimzahl. Die Abnahme der extrazellulären Keime war auch bei

intrazellulärer Proliferation zu beobachten, so dass von ausreichender Wirksamkeit des eingesetzten

Antibiotikums ausgegangen werden konnte (Daten nicht gezeigt). Weitere Vorexperimente mit dem

zusätzlich eingesetzten Enzym Lysostaphin (20 µg/ml) für 30 Minuten nach der Infektion hatten zum Ziel,

speziell extrazelluläre adhärente Bakterien abzulösen und zu eliminieren und daraufhin die intrazellulären

Keimzahlen zu ermitteln. Diese ergaben rund 5 fach geringere Werte im Vergleich zu Kontrollen nur mit

Gentamycin (Daten nicht gezeigt). Die Experimente dieser Arbeit wurden jedoch stets nur unter Gabe von

Gentamycin (50 µg/ml) durchgeführt.


Für die Bestimmung der intrazellulären Bakterienzahl zum Zeitpunkt Null (Phagozytosewert)

wurden die Zellen vor der Lyse für 30 Min mit Medium unter Zusatz von Gentamycin inkubiert. Weitere

Bestimmungen der intrazellulären Keimzahl schlossen sich in den darauffolgenden Tagen nach der

Phagozytose an, wie jeweils den einzelnen Experimenten zu entnehmen ist. Das Antibiotika-haltige

Medium wurde nach 2, spätestens 3 Tagen erneuert, um extrazelluläre Bakterien aus dem Überstand zu

eliminieren.

Zur Erfassung der extrazellulären Bakterienzahlen zu den jeweiligen Zeitpunkten wurde der

Zellüberstand vollständig in 1,5 ml-Gefäße überführt und 100 l davon unverdünnt auf Müller-Hinton-

Agarplatten zur Extrazellulärwertbestimmung ausgestrichen. Für die intrazelluläre Keimzahlbestimmung

wurden die Wells anschließend mit 300 l PBS zweimal gewaschen und jeweils 150 l Tergitol (1%) zur

Zelllyse zugefügt. Nach 10 Min Inkubation bei 37°C im Brutschrank wurden die Zellen vom Boden der

Wells mit einer Pipette kräftig abgekratzt, die Zellsuspension gut resuspendiert, abgenommen und in 1,5

ml-Gefäße pipettiert. 100 l davon wurden in einer Verdünnungsreihe bis zu 10000fach verdünnt und in

Doppelwerten auf Müller-Hinton-Agarplatten ausgestrichen. Nach 48 Stunden konnten die Kolonien

ausgezählt und die Keimzahlen nach folgenden Formeln bestimmt werden:

Mittelwert und Standardabweichung wurden jeweils aus Keimzahlbestimmungen von 3 Wells berechnet.

2.4.2 Makrophagen-Bakterizidie-Assay mit S. epidermidis und S. carnosus

Die Durchführung des Bakterizidie-Assays mit den Koagulase-negativen Stämmen S. epidermidis ATCC

12228, sowie S. carnosus TM 300 erfolgte wie unter 2.4.1 beschrieben. Abweichungen in der

Bakterienkultur sind aus den im Kapitel 2.2 (Bakterien) aufgeführten Erläuterungen ersichtlich.

2.4.3 Makrophagen-Bakterizidie-Assay mit S. aureus unter IFN-Stimulation

Zur Stimulation der Makrophagen wurden diese am Vortag des Experiments mit IFNγ versetzt und dann

in Zellkulturplatten ausgesät und über Nacht inkubiert. IFNγ (Roche) wurde dabei in einer Konzentration

Intrazelluläre Keimzahl / Well = CFU x Verdünnung x 1,5

Extrazelluläre Keimzahl / Well = CFU x Verdünnung x 4


von 100-300 U/ml eingesetzt. Unter Infektion erfolgte kein Zusatz von IFNγ. Weitere Vorgehensweise wie

unter 2.6.1 beschrieben.

2.4.4 Makrophagen-Bakterizidie-Assay mit S. aureus unter NO-Inhibition mit

Aminoguanidin

Aminoguanidin-hemisulfat wurde als 100 mM Stocklösung in H2O angesetzt. Dem Zellkulturmedium

wurde bei Aussaat der Zellen 2 mM Aminoguanidin zugesetzt. Weiterhin wurde es in dieser Konzentration

wiederum dem Infektionsmedium und dem Antibiotikamedium zugesetzt.

2.4.5 Makrophagen-Phagozytose-Assay mit S. aureus unter Fibronektin-freien

Bedingungen

Makrophagen wurden in Zellkulturmedium mit Fn-freiem Panexin über Nacht kultiviert. Im weiteren

Versuchsverlauf wurden sie stets unter diesen Bedingungen inkubiert. Der normale Gehalt an Fn in

Panexin beträgt 2 mg/l, so dass die Konzentration in DMEM mit 4 % Panexin 80 µg/l beträgt.

2.5 NO-Assay

Die Makrophagen werden wie in dem oben beschriebenen in-vitro-Infektionsversuchen geerntet und in

Zellkulturplatten (48-Well) mit 400µl pro Well ausgesät und über Nacht inkubiert. Je nach Versuchsziel

wurden die Zellen dabei mit IFNγ und/oder Aminoguanidin versetzt.

Die Infektion verlief wie unter 2.4.1 beschrieben. Nach der Infektion und zweimaligem Waschen mit 300µl

PBS pro Well wurden die Zellen mit nur 200µl Medium (DMEM +4% Panexin) unter Hinzugabe von 20µg

Gentamycin pro ml versetzt. Aus diesem Zellkulturüberstand wurden dann die Proben für den NO-Assay

entnommen. Auch bei Verwendung von primären Knochenmarkmakrophagen erfolgte nach der Infektion

die Kultivierung in DMEM, da RPMI bereits geringe Mengen an Nitrit enthält.

50µl Proben wurden zu verschiedenen Zeitpunkten doppelt aus jedem Well entnommen und auf einer

96-Well-Platte aufgetragen. Bei längeren Infektionsverläufen wurden die gewonnenen Überstände bis zur

Messung bei -70°C gelagert. 3 Tage Beobachtungszeitraum konnten dabei nicht überschritten werden,

da nach diesem Zeitraum die Vitalität der Zellen durch Verbrauch des Mediums nicht mehr gewährleistet

war.

Die Messung des Nitritgehaltes im Zellkulturüberstand wurde dann wie folgt durchgeführt:


Pro Well wurden erst 50µl Sulfanilsäure und danach 10 µl Salzsäure 37% zugegeben und die Platte

bedeckt bei 37°C und 5% CO2 im Brutschrank in Dunkelheit inkubiert. Anschließend erfolgte die Zugabe

von 50µl pro Well Naphtyl-Ethylendiamin und die Messung des Nitritgehaltes der Proben bei 540nm im

ELISA Reader.

Als Standard diente dabei Natriumnitrit (1mM), welches 1:2 in Medium aufgenommen wurde und in einer

Verdünnungsreihe ebenfalls in Doppelwerten auf die entsprechende Platte pipettiert wurde

2.6 Statistik

Die statistische Auswertung erfolgte im Graphikprogramm GraphPad Prism 4 mit dem Student-T-Test.

Die errechneten p-Werte als Ausdruck der Signifikanz wurden innerhalb der im Ergebnisteil abgebildeten

Graphen in drei Größenordnungen angegeben:

p ≤0,05-0,01 *; p <0,01-0,001 **; p <0,001 ***

26

3 ERGEBNISSE

3.1 Die Charakterisierung der Phagozytose von Staphylokokken durch murine

Makrophagen

3.1.1 Die Phagozytose von S. aureus durch murine Makrophagen

Mit dem Ziel dieser Arbeit, die Interaktion von Staphylococcus aureus und Makrophagen im in-vitro-

Infektionsmodell zu charakterisieren, sollte als erstes die Phagozytose mithilfe eines Phagozytose-

Assays beschrieben werden. Dazu wurden RAW-Makrophagen und primäre Knochenmarkmakrophagen

von C57BL/6- und BALB/c-Mäusen eingesetzt. Es sollten dabei Unterschiede in der

Phagozytosekapazität zwischen den Makrophagen der genetisch unterschiedlichen Mausstämme, sowie

im Vergleich zu einer murinen Makrophagen-Zelllinie untersucht werden. Die Infektion der Zellen erfolgte

in erster Linie mit S. aureus Newman. Bei S. aureus Newman handelt es sich um einen sequenzierten

Referenzstamm, der sehr häufig für genetische, funktionelle und in-vivo-Studien eingesetzt wird.

Daneben wurde auch S. aureus RN 6390, ein Derivat von dem S. aureus-Stamm 8325-4 verwendet,

sowie die S. aureus-Referenzstämme ATCC 25923, 12600 und 29213.

A B

New

man

WT

RN 6

390

WT

ATC

C 2

5923

ATC

C 1

2600

ATC

C 2

9213

102

103

104

105

106

***

Intr

azellu

läre

Keim

zah

l p

ro W

ell

New

man

RN 6

390

103

104

105

106

**

Intr

azellu

läre

Keim

zah

l p

ro W

ell

Abb. 1

Vergleich der Phagozytoserate muriner Makrophagen nach Infektion mit verschiedenen S. aureus-Stämmen. (A) RAW-

Makrophagen nach Infektion mit Newman (MOI 400:1), RN 6390 (MOI 400:1), ATCC 25923 (MOI 660:1), ATCC 12600 (MOI 560:1), sowie ATCC 29213 (MOI 480:1) und (B) primäre C57BL/6-Knochenmarkmakrophagen nach Infektion mit Newman und RN 6390 (beide MOI 220:1). Gezeigt ist das Ergebnis eines repräsentativen Versuchs aus (A) zwei bzw. (B) drei unabhängig

durchgeführten Experimenten mit Mittelwert und Standardabweichung aus Dreifachbestimmungen.

ERGEBNISSE 27

Zunächst wurde die Aufnahme von verschiedenen S. aureus-Stämmen in RAW-Makrophagen untersucht.

Abbildung 1 zeigt, dass zwischen S. aureus Newman und den hier eingesetzten ATCC-Stämmen keine

nennenswerten Unterschiede in der Phagozytose festgestellt werden konnten. Einen hochsignifikanten

Unterschied gab es jedoch beim Vergleich der Internalisierung von Newman und RN 6390 in RAW-

Makrophagen. Dieser zeigte sich auch in primären C57BL/6-Makrophagen (Abb. 1B).

Zahlreich durchgeführte Phagozytose-Assays mit S. aureus Newman (Daten nicht gezeigt) bei

ähnlicher Infektionsdosis (etwa MOI 300:1) zeigten, dass durchschnittlich 100.000 Keime pro Well von

den Zellen phagozytiert wurden (Daten nicht gezeigt). Dies zeigt, dass bei 100.000 ausgesäten Zellen

pro Well mit einem durchschnittlichen Verhältnis von einem Bakterium pro infizierter Wirtszelle zu rechnen

war. Trotz gleicher MOI, gleicher Wirtszellart und standardisiertem Versuchsverlauf unterlag die ermittelte

intrazelluläre CFU in den Experimenten z. T. erheblichen Schwankungen, was mit unterschiedlichen

Wachstumsphasen der Bakterien in der Kultur und folglich veränderter Expression von

Oberflächenproteinen von S. aureus zusammenhängen könnte (Schwankungen zwischen 70.000 bis

300.000 Bakterien pro Well).

Die Zahl intrazellulär detektierter Bakterien bei primären C57BL/6 Makrophagen in Abbildung 1B

verglichen mit den RAW-Makrophagen in Abbildung 1A bei Infektion mit S. aureus Newman, als auch mit

RN 6390 zeigte sich etwa um den Faktor drei erhöht. Eine Ursache mag hier vornehmlich in der Art des

Wirtszellsystems liegen, denn bei primären Makrophagen wurden verglichen mit RAW-Makrophagen

generell, unabhängig vom eingesetzten Bakterienstamm, etwa dreifach höhere intrazelluläre Keimzahlen

ermittelt. Versuche mit BALB/c-Makrophagen zeigten nach Infektion mit Newman (Daten nicht gezeigt)

darüber hinaus in zwei von drei Fällen eine signifikant höhere Phagozytoserate gegenüber C57BL/6-

Makrophagen. In einem Experiment wurde S. aureus Newman hingegen von C57BL/6-Makrophagen

besser phagozytiert, so dass ein reproduzierbarer, signifikanter Unterschied in der Aufnahmekapazität

von BALB/c- und C57BL/6-Makrophagen nicht besteht.

ERGEBNISSE 28

Eine weitere Fragestellung betraf die Abhängigkeit der Phagozytoserate von der Infektionsdosis,

woraufhin Makrophagen mit S. aureus in unterschiedlichen Konzentrationen infiziert und dann die

intrazelluläre Bakterienzahl ermittelt wurde.

MOI

5:1

MOI 1

00:1

MOI

1000

:1

MOI

5000

:1

103

104

105

106

Intr

azellu

läre

Keim

zah

l p

ro W

ell

Abb. 2

Vergleich der Phagozytoserate bei verschiedenen Infektionsdosen. RAW-Makrophagen nach Infektion mit S. aureus Newman. Gezeigt ist das Ergebnis eines einmalig durchgeführten Experiments mit Mittelwert und Standardabweichung aus Dreifachbestimmungen.

Abbildung 2 zeigte, dass trotz oben beschriebener Schwankungen der intrazellulären Keimzahl nach der

Phagozytose bei ähnlichen Konzentrationen von S. aureus eine direkte Proportionalität von MOI und

Phagozytoserate der Makrophagen ermittelt werden konnte. Auch in primären Makrophagen von BALB/c-

Mäusen (Daten nicht gezeigt) konnte ein entsprechender Zusammenhang festgestellt werden.

3.1.2 Der Einfluss von IFN-γ auf die Phagozytose von S. aureus

Im Rahmen der Makrophagen-vermittelten Wirtsabwehr spielt IFN-γ eine wichtige Rolle, vor allem für die

intrazelluläre Eliminierung von Erregern. IFN-γ wird unter anderem von NK-Zellen nach Stimulation durch

IL-12 und IL-18 sezerniert und dient der Aktivierung von Immunzellen, besonders der Stimulation von

Makrophagen. Daher sollte hier untersucht werden, ob sich die Aktivierung von Makrophagen durch IFN-γ

auf deren Phagozytoserate von S. aureus Newman auswirkt. In den folgenden Versuchen wurden die

Zellen beim Aussäen mit IFN-γ stimuliert und bis zur Infektion am nächsten Tag inkubiert. Zunächst wurde

der Effekt der Stimulation an RAW-Makrophagen und anschließend an primären Makrophagen

untersucht.

ERGEBNISSE 29

A B

RAW

+IF

N

RAW

-IFN

0

250000

500000

*

h post infectionem

Intr

azellu

läre

Keim

zah

l p

ro W

ell

BALB

/c +

IFN

IFN

-

BALB

/c

0

250000

500000

Intr

azellu

läre

Keim

zah

l p

ro W

ell

Abb. 3

Vergleich der Phagozytoserate mit und ohne IFN-γ-Stimulation. (A) RAW-Makrophagen (MOI 250:1) und (B) primäre BALB/c-Knochenmarkmakrophagen (MOI 580:1) nach Infektion mit S. aureus Newman. Gezeigt ist das Ergebnis eines repräsentativen Versuchs aus (A) 13 bzw. (B) vier unabhängig durchgeführten Experimenten mit Mittelwert und

Standardabweichung aus Dreifachbestimmungen.

Abb. 3 zeigt, dass die IFN-γ-Stimulation der Makrophagen eine erhöhte Phagozytosekapazität zur Folge

hat. In RAW-Makrophagen (A) konnte eine um 3-4 fach erhöhte intrazelluläre Keimzahl in IFN-γ-

stimulierten verglichen mit unstimulierten Zellen detektiert werden. Die Zunahme der Zahl phagozytierter

Bakterien in stimulierten Zellen war dabei in der Mehrheit der Fälle signifikant. Auch in BALB/c-

Makrophagen wurde durch die IFN-γ-Stimulation eine erhöhte Phagozytoserate beobachtet (B), sowie

auch in S. aureus Newman-infizierten C57BL/6-Makrophagen (Daten nicht gezeigt).

3.1.3 Die Phagozytose von Koagulase-negativen Staphylokokken

Um das Infektionsmodell von S. aureus und Makrophagen auf bakterieller Seite näher zu charakterisieren

sollten nun ergänzende Versuche zur Phagozytose mit dem weniger pathogenen Koagulase-negativen

Erreger S. epidermidis ATCC 12228 erfolgen und mit S. aureus Newman verglichen werden.

Dazu wurde der Phagozytose-Assay in RAW-Makrophagen, wie oben beschrieben, durchgeführt.

ERGEBNISSE 30

A B

New

man

S. e

pider

mid

is

0

100000

200000 *

Intr

azellu

läre

Keim

zah

l p

ro W

ell

S. epid

erm

idis

+IF

N

S. epid

erm

idis

-IF

N

0

250000

500000

Intr

azellu

läre

Keim

zah

l p

ro W

ell

Abb. 4

Vergleich der Phagozytoserate von S. aureus und S. epidermidis. (A) RAW-Makrophagen nach Infektion mit Newman (MOI 730:1) und S. epidermidis ATCC 12228 (MOI 400:1) und (B) RAW-Makrophagen mit und ohne IFN-γ-Stimulation nach

Infektion mit S. epidermidis ATCC 12228 (MOI 360:1). Gezeigt ist das Ergebnis eines repräsentativen Versuchs aus (A) drei bzw. (B) vier unabhängig durchgeführten Experimenten mit Mittelwert und Standardabweichung aus Dreifachbestimmungen.

Wie in Abbildung 4 (A) zu sehen ist, wurde in RAW-Makrophagen nach einstündiger Infektion mit

S. epidermidis ATCC 12228 eine etwa um den Faktor drei höhere Zahl intrazellulärer Erreger im Vergleich

zu Newman detektiert. Die Infektion mit diesem S. epidermidis–Stamm, als dem bedeutendsten Vertreter

der Koagulase-negativen Staphylokokken, zeigte auch in weiteren Experimenten eine signifikant höhere

Zahl internalisierter Keime.

Die vorherigen Experimente (Abb. 3) haben gezeigt, dass die Vorstimulation der Zellen mit IFN-γ

zu einer Erhöhung der Phagozytoserate von S. aureus in Makrophagen führt. Nach Infektion von IFN-γ-

stimulierten RAW-Makrophagen mit S. epidermidis konnte ein ähnlicher Effekt festgestellt werden (B).

Die intrazelluläre Keimzahl in stimulierten Zellen lag knapp um den Faktor drei höher verglichen mit Zellen,

die nicht mit IFN-γ behandelt wurden. Ein signifikanter Unterschied konnte jedoch nicht nachgewiesen

werden.

3.1.4 Die Rolle von Fibronektin-bindendem Protein A bei der Phagozytose –

Untersuchungen an S. carnosus

Die Fibronektin-bindenden Proteine (FnBPA, FnBPB) sind essentiell für die Adhäsion, sowie die

Internalisation von S. aureus in verschiedene nicht-professionell phagozytierende Zellen. FnBPA, ein

ERGEBNISSE 31

Adhäsin/Invasin der Bakterienoberfläche, bindet dabei über das Brückenmolekül Fibronektin (Fn) an den

Wirtsrezeptor Integrin α5β1, wodurch die Aufnahme induziert wird.

In den vorherigen Experimenten wurde gezeigt, dass verschiedene S. aureus-Stämme, sowie

S. epidermidis von murinen Makrophagen internalisiert werden. Welche Rolle dabei FnBPA spielt sollte

anhand des nicht-invasiven grampositiven Bakteriums S. carnosus untersucht werden, dem die

bekannten S. aureus-Oberflächenproteine fehlen. In folgenden Infektionsexperimenten wurden daher

RAW-Makrophagen mit dem Plasmidstamm S. carnosus TM 300 (FnBPA, GFP), der das FnbPA von

S. aureus heterolog auf seiner Oberfläche exprimiert, infiziert. Als Kontrollstamm diente S. carnosus TM

300 (GFP).

TM 3

00 (G

FP)

TM 3

00 (G

FP, F

nBA)

0

100000

200000

300000

400000 ***

Intr

azellu

läre

Keim

zah

l p

ro W

ell

Abb. 5

Vergleich der Phagozytoserate von S. carnosus-Stämmen. RAW-Makrophagen nach Infektion mit S. carnosus TM 300 (GFP-Plasmid) (MOI 200:1) und S. carnosus TM 300 (GFP und FnBA-Plasmid) (MOI 280:1). Gezeigt ist das Ergebnis eines

repräsentativen Versuchs aus insgesamt drei unabhängig durchgeführten Experimenten mit Mittelwert und Standardabweichung aus Dreifachbestimmungen.

Die Untersuchung der Phagozytose von S. carnosus (FnBPA) im Phagozytose-Assay ergab einen

hochsignifikanten Unterschied in der intrazellulären Keimzahl im Vergleich zum Wildtypstamm TM 300

(Abb. 5). Die Expression von FnBPA in S. carnosus TM 300 vermittelte diesem wenig invasiven Bakterium

eine 6-7 fach verbesserte Aufnahme durch RAW-Makrophagen. Die Phagozytoserate konnte durch

Expression von FnBPA also um mehr als 85 % gesteigert werden.

ERGEBNISSE 32

3.1.5 Die Rolle von Fibronektin bei der Phagozytose von S. aureus Newman

Es wurde in Abbildung 5 gezeigt, dass FnBPA für die Internalisierung von Staphylokokken durch

Makrophagen entscheidend ist. Die Bindung von FnBPA des Erregers erfolgt dabei nicht direkt an die

Wirtszelle, sondern wird über Fibronektin vermittelt.

In folgenden Versuchen sollte nun herausgefunden werden, ob lösliches Fibronektin im

Zellkulturmedium notwendig ist, um die Internalisierung von S. aureus zu vermitteln. RAW-Makrophagen

wurden dazu in Fn-freiem Zellkulturmedium kultiviert und inkubiert. Die normale Fn-Konzentration des

dazu eingesetzten Serumersatzstoffes Panexin BMM® beträgt 80 μg/l. Neben S. aureus Newman erfolgte

auch eine Infektion mit dem bereits beschriebenen S. carnosus TM 300 (FnBPA) und seinem

Wildtypstamm.

A B

TM 3

00 (G

FP)

TM 3

00 (G

FP) -

Fn

TM 3

00 (G

FP, F

nBA)

TM 3

00 (G

FP. F

nBA) -

Fn

New

man

New

man

-Fn

0

200000

400000

600000**

**

Intr

aze

llu

läre

Ke

imza

hl

pro

We

ll

New

man

New

man

-Fn

0

25000

50000

**

Intr

aze

llu

läre

Ke

imza

hl

pro

We

ll

Abb. 6

Vergleich der Phagozytoserate von RAW -Makrophagen in Abhängigkeit vom Fn-Gehalt des Zellkulturmediums. (A) RAW-Makrophagen nach Infektion mit S. carnosus TM 300 (GFP-Plasmid) (MOI 130:1) bzw. S. carnosus TM 300 (GFP und

FNBA-Plasmid) (MOI 160:1) und Newman (MOI 300:1) und (B) gleiches Experiment, nur Newman abgebildet. Gezeigt ist das Ergebnis eines repräsentativen Versuchs aus zwei unabhängig durchgeführten Experimenten mit Mittelwert und Standardabweichung aus Dreifachbestimmungen.

In Abbildung 6A wurde nochmals verdeutlicht, dass das FnBPA-Gen in S. carnosus TM 300 eine

hochsignifikante Erhöhung der Phagozytoserate in RAW-Makrophagen bewirkte (schwarze Balken).

Verglichen mit Abbildung 5 lag die intrazellulär detektierte Keimzahl von S. carnosus TM 300 (FnBPA)

hier sogar um den Faktor 8 höher verglichen mit dem Kontrollstamm S. carnosus TM 300 (GFP).

ERGEBNISSE 33

Kultivierte man RAW-Makrophagen nun in Fn-freiem Medium wurde die Phagozytoserate nach Infektion

mit S. carnosus TM 300 (FnBPA) signifikant um Faktor 3-4 reduziert (A). Sie lag interessanterweise

dennoch immer noch deutlich höher im Vergleich zum Kontrollstamm S. carnosus TM 300 (GFP), auch

ohne Fibronektin im Medium (Abb. 6A).

Auch bei S. aureus Newman konnte ein signifikanter Fn-abhängiger Unterschied in der

Internalisierungsrate festgestellt werden, wie Abbildung 6 (B) des gleichen Experiments zeigte. Die Zahl

internalisierter Bakterien lag bei Fibronektin-haltigem Medium vergleichsweise bereits sehr niedrig (A),

und dennoch wurde sie in RAW-Makrophagen aus Fn-freiem Medium nochmals etwa 8 fach reduziert (B).

3.2 Die Charakterisierung des intrazellulären Überlebens von Staphylokokken in

murinen Makrophagen

Nachdem im ersten Abschnitt die Aufnahme von Staphylokokken durch murine Makrophagen

beschrieben wurde, stellte sich nun die Frage, ob die phagozytierten Erreger durch die bakteriziden

Mechanismen der Wirtszelle eliminiert werden, oder ob Staphylokokken in Makrophagen intrazellulär

persistieren, oder sogar replizieren können. In folgendem Abschnitt sollte daher das intrazelluläre

Überleben von S. aureus, sowie S. epidermidis in murinen Makrophagen beobachtet und charakterisiert

werden. Hierzu wurde der bereits etablierte Phagozytose-Assay zeitlich erweitert und das intrazelluläre

Überleben über einen Zeitraum bis zu 120 h nach der Infektion beobachtet. Zur Vermeidung von

Reinfektionen erfolgte die Zugabe von Gentamycin zum Medium, wie es bekanntermaßen erfolgreich zur

Eradikation extrazellulärer Bakterien eingesetzt wird (Hamza et al. 2013). Als Wirtszellen dienten neben

der Makrophagen-Zellinie RAW wiederum primäre Knochenmarkmakrophagen von C57BL/6- und

BALB/c-Mäusen.

3.2.1 Intrazelluläres Überleben von S. aureus Newman in RAW-Makrophagen

Als erstes wurde das intrazelluläre Überleben von S. aureus Newman in RAW-Makrophagen

charakterisiert. Dabei sollte auch der Effekt von IFN-γ auf die Elimination von intrazellulärem S. aureus

untersucht werden.

ERGEBNISSE 34

0 24 48 72 96 120

100

101

102

103

104

105

106

h post infectionem

Intr

azellu

läre

Keim

zah

l p

ro W

ell

Abb. 7

Intrazelluläres Überleben von S. aureus Newman in unstimulierten RAW-Makrophagen (MOI 1000:1). Gezeigt ist das

Ergebnis eines repräsentativen Versuchs aus sieben unabhängig durchgeführten Experimenten mit Mittelwert und Standardabweichung aus Dreifachbestimmungen.

In Abbildung 7 ist gezeigt, dass S. aureus Newman in RAW-Makrophagen über einen Zeitraum von 120 h

persistieren kann. In den ersten 6 h nach Aufnahme in die Zellen kann S. aureus Newman intrazellulär

sogar replizieren. Die intrazelluläre Keimzahl erhöhte sich dabei um Faktor 4. Danach erfolgte ein

kontinuierlicher Abfall der Bakterienzahl bis auf Werte unter 100 Keimen pro Well nach 120 h (oder mehr,

je nach anfänglicher Phagozytoserate). In keinem der durchgeführten Experimente konnten RAW-

Makrophagen nach 120 h S. aureus Newman komplett eliminieren. Die Abtötung extrazellulärer Bakterien

wurde durch die zu den jeweiligen Zeitpunkten stets durchgeführte CFU-Bestimmung der extrazellulären

Keimzahl überprüft. Diese ergab jeweils Werte um Null, so dass Reinfektionen ausgeschlossen werden

konnten (Daten nicht gezeigt).

ERGEBNISSE 35

0 24 48 72 96 120

102

103

104

105

106 +IFN

-IFN

h post infectionem

Intr

az

ell

ulä

re K

eim

za

hl

pro

We

ll

Abb. 8

Vergleich des intrazellulären Überlebens mit und ohne IFN-γ-Stimulation. RAW-Makrophagen nach Infektion mit S. aureus Newman (MOI 175:1). Gezeigt ist das Ergebnis eines repräsentativen Versuchs aus zehn unabhängig durchgeführten Experimenten mit Mittelwert und Standardabweichung aus Dreifachbestimmungen.

In den vorherigen Experimenten wurde gezeigt, dass IFN-γ-stimulierte Makrophagen über eine erhöhte

Phagozytoseleistung für S. aureus Newman verfügen. Dieses Phänomen bestätigte sich auch im

Bakterizidieassay, sichtbar an den 0 h-Werten (Abb. 8). Die intrazellulären Keimzahlen stimulierter und

unstimulierter Zellen näherten sich dann ab 24 h nach der Infektion an und verliefen auf weitgehend

gleichem Niveau. Dies zeigt, dass IFN-γ zwar die Phagozytoserate erhöht, daneben aber keinen Effekt

auf die Elimination von intrazellulärem S. aureus Newman zeigte.

3.2.2 S. aureus Newman in primären Knochenmarkmakrophagen von BALB/c-

und C57BL/6-Mäusen

In den vorherigen Versuchen stellte sich heraus, dass S. aureus Newman in RAW-Makrophagen bis zu

120 h persistieren kann. Weiterhin zeigte sich, dass IFN-γ-stimulierte Makrophagen intrazellulären

S. aureus Newman nicht besser eliminieren konnten als unstimulierte Makrophagen. In folgenden

Experimenten sollte das intrazelluläre Überleben von S. aureus Newman in primären

Knochenmarkmakrophagen von BALB/c- und C57BL/6-Mäusen entsprechend untersucht werden.

Es ist bekannt, dass zwischen beiden Mausstämmen Unterschiede in der Empfänglichkeit

gegenüber einer Infektion mit S. aureus Newman bestehen. BALB/c-Mäuse haben sich dabei als weniger

resistent gegenüber einer Infektion mit S. aureus erwiesen (Köhler et al. 2011). Des Weiteren wurde in

den vorherigen Versuchen gesehen, dass es keinen signifikanten Unterschied in der Phagozytoserate

ERGEBNISSE 36

zwischen den Knochenmarkmakrophagen beider Mausstämme gibt (Kap. 3.1). Hieraus ergab sich die

Frage, ob BALB/c- und C57BL/6-Makrophagen hingegen nach der Phagozytose auf verschiedene Weise

auf den intrazellulären Erreger reagieren und sich Unterschiede in der Eliminationsleistung ergeben. Für

die Versuche wurden die Zellen am Vortag der Infektion mit IFN-γ stimuliert, um eine Aktivierung zu

induzieren und eine mögliche Auswirkung von IFN-γ auf die Kontrolle der S. aureus-Infektion

festzustellen.

A B

0 24 48 72

101

102

103

104

105

106

BL/6J -IFN

BALB/c -IFN

h post infectionem

Intr

azellu

läre

Keim

zah

l p

ro W

ell

0 24 48 72

101

102

103

104

105

106

BL/6J +IFN

BALB/c +IFN

h post infectionem

Intr

azellu

läre

Keim

zah

l p

ro W

ell

Abb. 9

Vergleich des intrazellulären Überlebens von S. aureus Newman in BALB/c- und C57BL/6-Knochenmarkmakrophagen

(MOI 580:1). (A) ohne IFN-γ-Stimulation und (B) mit IFN-γ-Stimulation. Gezeigt ist das Ergebnis eines repräsentativen Versuchs aus (A) 2 bzw. (B) 3 unabhängig durchgeführten Experimenten mit Mittelwert und Standardabweichung aus Dreifachbestimmungen.

Beim Vergleich von BALB/c- und C57BL/6-Makrophagen (Abb. 9) ohne IFN-γ-Stimulation zeigte sich kein

wesentlicher Unterschied in der Kinetik des intrazellulären Überlebens von S. aureus Newman. Der

Verlauf der intrazellulären Keimzahl im Beobachtungszeitraum von 72 h zeigte nur eine geri nge,

statistisch nicht signifikante Abweichung. In der Zusammenschau aller Versuche lässt sich kein

Unterschied in der Elimination von intrazellulärem S. aureus Newman feststellen.

Auch unter IFN-γ-Stimulation (Abb. 9B) zeigte sich ein nahezu identischer Kurvenverlauf der

intrazellulären Keimzahlen von S. aureus Newman in BALB/c- und C57BL/6-Makrophagen.

ERGEBNISSE 37

0 24 48 72 96 120

101

102

103

104

105

106

+IFN

-IFN

h post infectionem

Intr

azellu

läre

Keim

zah

l p

ro W

ell

Abb. 10

Vergleich des intrazellulären Überlebens mit und ohne IFN-γ-Stimulation. C57BL/6-Knochenmarkmakrophagen nach Infektion mit S. aureus Newman (MOI 314:1). Gezeigt ist das Ergebnis eines repräsentativen Versuchs aus drei unabhängig durchgeführten Experimenten mit Mittelwert und Standardabweichung aus Dreifachbestimmungen.

In Abbildung 10 ist gezeigt, dass die intrazellulären Keimzahlen von unstimulierten und IFN-γ-stimulierten

C57BL/6-Makrophagen keine nennenswerten Abweichungen zeigten. Sie verliefen mit einem

kontinuierlichen Abfall bis zum Ende der untersuchten Zeitpunkte 120 h nach der Infektion. Nach 120 h

waren noch durchschnittlich 1000 Keime pro Well detektierbar. Wie für RAW-Makrophagen im Kap. 3.2.1

bereits nachgewiesen werden konnte bestätigt sich hiermit auch bei primären C57BL/6-Makrophagen,

dass kein Einfluss von IFN-γ auf die Kontrolle von intrazellulärem S. aureus Newman besteht.

3.2.3 Vergleich des intrazellulären Überlebens von S. aureus Newman und

S. aureus RN 6390

Im Rahmen der Versuche zur Phagozytose von S. aureus durch Makrophagen wurde neben Stamm

Newman auch der S. aureus-Stamm RN 6390 eingesetzt. Dabei zeigte sich, dass RN 6390 signifikant

geringer durch RAW-Makrophagen phagozytiert wurde als S. aureus Newman (siehe 3.1.1). Im

Folgenden sollte nun geklärt werden, ob sich neben den Unterschieden in der Phagozytoserate auch

Unterschiede im intrazellulären Verhalten zeigen ließen. Dazu wurde der Bakterizidie-Assay mit S. aureus

RN 6390 im Vergleich zu S. aureus Newman in RAW-Makrophagen, als auch in primären C57BL/6-

Makrophagen durchgeführt.

ERGEBNISSE 38

0 24 48 72 96 120

101

102

103

104

105

106 RN 6390

New man

h post infectionem

Intr

azellu

läre

Keim

zah

l p

ro W

ell

Abb. 11

Vergleich des intrazellulären Überlebens von S. aureus Newman und RN 6390. RAW-Makrophagen (ohne IFN-γ-Stimulation) nach Infektion mit S. aureus Newman (MOI 300:1) und RN 6390 (MOI 520:1). Gezeigt ist das Ergebnis eines repräsentativen Versuchs aus drei unabhängig durchgeführten Experimenten mit Mittelwert und Standardabweichung aus

Dreifachbestimmungen.

Nach Infektion von RAW-Makrophagen mit den beiden S. aureus-Stämmen zeigte sich, dass – wie zu

erwarten - RN 6390 in geringerem Maß als Newman internalisiert wurde (Abb. 11). Im weiteren Verlauf

kam es bei RN 6390 im Unterschied zu Newman zu einem Anstieg der intrazellulären Keimzahl um den

Faktor 4 bis 24 h nach der Infektion und danach zu einem kontinuierlichen Rückgang der Bakterienzahl

bis 120 h. Die Proliferation der intrazellulären Erreger im Fall vom Stamm RN 6390 zeigte sich auch in

Reproduktionen des Experiments und war vereinzelt sogar bis 48 Stunden nach der Infektion zu

beobachten. Über den gesamten Beobachtungszeitraum des Experiments betrachtet erfolgte dann eine

Annäherung der intrazellulären Keimzahlen beider Erreger (Abb. 11).

Nach Vorbehandlung der RAW-Makrophagen mit IFN-γ konnte eine ähnliche Kinetik des

intrazellulären Überlebens beider S. aureus-Stämme beobachtet werden. Der Anstieg der intrazellulären

Keimzahl in der frühen Infektionsphase bei dem S. aureus-Stamm RN 6390 wurde unter IFN-γ-Stimulation

nicht in jedem Versuch gesehen (Daten nicht gezeigt).

ERGEBNISSE 39

0 24 48 72

101

102

103

104

105

106 New man +IFN

RN 6390 +IFN

h post infectionem

Intr

azellu

läre

Keim

zah

l p

ro W

ell

Abb. 12

Vergleich des intrazellulären Überlebens von S. aureus Newman (MOI 230:1) und RN 6390 (MOI 180:1). C57BL/6-Makrophagen mit IFN-γ-Stimulation nach Infektion mit S. aureus. Gezeigt ist das Ergebnis eines repräsentativen Versuchs aus drei unabhängig durchgeführten Experimenten mit Mittelwert und Standardabweichung aus Dreifachbestimmungen.

In Abbildung 12 bestätigte sich auch in primären C57BL/6-Makrophagen die signifikant geringere

Internalisierungsrate von S. aureus RN 6390 gegenüber S. aureus Newman. Im folgenden Verlauf

nahmen die intrazellulären Keimzahlen bis 72 h nach der Infektion in nahezu id entischer Kinetik ab. Der

deutliche Unterschied der Internalisierungsrate beider Stämme bewirkte, dass sich die intrazellulären

Keimzahlen bis zum Ende des beobachteten Zeitraums entsprechend signifikant voneinander

unterschieden.

IFN-γ hatte dabei keinerlei Einfluss auf Unterschiede im Verlauf der intrazellulären Keimzahlen

von S. aureus Newman und RN 6390, wie der Vergleich von IFN-γ-stimulierten mit unstimulierten

primären C57BL/6-Makrophagen erbrachte (Daten nicht gezeigt).

3.2.4 Vergleich des intrazellulären Überlebens von S. aureus Newman und

S. epidermidis ATCC 12228

In Abschnitt 3.1.2 wurde gezeigt, dass der Koagulase-negative Staphylokokkus-Stamm S. epidermidis

ATCC 12228 von RAW-Makrophagen signifikant besser phagozytiert wird als S. aureus Newman. Hier

stellte sich nun die Frage, ob der weniger pathogene Keim ähnlich wie S. aureus intrazellulär in

Makrophagen zu persistieren vermag. In folgenden Experimenten wurden daher RAW-Makrophagen mit

S. epidermidis ATCC 12228 und S. aureus Newman infiziert und das intrazelluläre Überleben in

unstimulierten als auch IFN-γ stimulierten Makrophagen untersucht.

ERGEBNISSE 40

A B

0 24 48 72 96 120

100

101

102

103

104

105

106

New man

S. epidermidis

h post infectionem

Intr

azellu

läre

Keim

zah

l p

ro W

ell

0 24 48 72 96 120

100

101

102

103

104

105

106 New man +IFN

S. epidermidis +IFN

h post infectionem

Intr

azellu

läre

Keim

zah

l p

ro W

ell

Abb. 13

Vergleich des intrazellulären Überlebens von S. aureus Newman (MOI 360:1) und S. epidermidis ATCC 12228 (MOI 175:1). RAW-Makrophagen (A) ohne IFN-γ-Stimulation und (B) mit IFN-γ-Stimulation. Gezeigt ist das Ergebnis eines

repräsentativen Versuchs aus drei unabhängig durchgeführten Experimenten mit Mittelwert und Standardabweichung aus Dreifachbestimmungen.

Im Vergleich zu S. aureus Newman war die Aufnahme von S. epidermidis ATCC 12228 in RAW-

Makrophagen wie erwartet signifikant, also etwa 4 fach höher (Abb. 13). IFN-γ hatte dabei keinen Einfluss

auf die Unterschiede in der Phagozytose zwischen S. aureus Newman und S. epidermidis ATCC 12228.

Die Phagozytoserate selbst war unter dem Einfluss von IFN-γ jedoch – wie bereits für S. aureus in

Abschnitt 3.1.1 beschrieben – bei beiden Erregern etwa um den Faktor zwei erhöht. In Abbildung 13

zeigte sich weiterhin, dass S. epidermidis bis zu einem Zeitraum von 72 h nach der Infektion in

Makrophagen persistieren kann. Bis zu diesem Zeitpunkt kam es zu keiner erheblichen Abweichung der

intrazellulären Keimzahl im Vergleich zu S. aureus Newman. 96 h nach Infektion konnten in

S. epidermidis-infizierten RAW-Makrophagen jedoch keine vitalen Keime mehr nachgewiesen werden.

Die Kinetik des intrazellulären Überlebens von S. epidermidis ATCC 12228 zeigte ab diesem Zeitpunkt

daher einen eindeutigen Unterschied im Vergleich zu S. aureus Newman. S. aureus Newman persistierte

bis 120 h nach der Infektion in RAW-Makrophagen. Die verbleibende Zahl intrazellulärer Erreger betrug

ca. 500 Keime pro Well in unstimulierten Makrophagen und einem annähernd doppelt so hohen Wert in

Makrophagen nach IFN-γ-Stimulation, korrelierend mit der erhöhten Phagozytoserate in diesen Zellen.

Ein eindeutiger Einfluss von IFN-γ auf die intrazelluläre Kinetik im Vergleich beider Erreger konnte nicht

gesehen werden.

ERGEBNISSE 41

3.3 Makrophagen-vermittelte Effektormechanismen bei S. aureus-Infektionen

Zu den wichtigsten Effektormechanismen von Makrophagen zur Elimination intrazellulärer Pathogene

zählt die Bildung von bakteriziden oxidativen Komponenten wie beispielsweise NO, gebildet durch die

induzierbare NO-Synthase (iNOS) und von ROI, gebildet durch die NADPH-Oxidase. In den folgenden

Experimenten sollte gezeigt werden, inwieweit S. aureus die NO-Produktion des Makrophagen

beeinflusst bzw. welche Rolle die iNOS- und NADPH-Aktivitäten bei der Elimination des Erregers spielen.

3.3.1 Die Rolle von Stickoxid (NO)

Als erstes wurde die Bedeutung von NO im Rahmen des intrazellulären Überlebens von S. aureus

untersucht. Dazu wurden Makrophagen mit S. aureus Newman infiziert und anschließend die NO-

Produktion anhand der Nitritkonzentration im Zellkulturüberstand bestimmt. Weiterhin wurde untersucht,

wie sich die Inhibition von NO auf das intrazelluläre Überleben von S. aureus auswirkt. Dies erfolgte durch

biochemische Hemmung von NO durch Aminoguanidin, sowie durch Infektion von C57BL/6 iNOS-/--

Knochenmarkmakrophagen.

3.3.1.1 NO-Produktion von S. aureus Newman-infizierten Makrophagen

RAW-Makrophagen und primäre C57BL/6-Knochenmarkmakrophagen wurden mit S. aureus Newman

infiziert und die NO-Produktion der Makrophagen über einen Infektionszeitraum von drei Tagen erfasst.

In den Versuchen wurden die Makrophagen vor dem Aussäen mit IFN-γ stimuliert (300U/ml), das zur

Induktion von iNOS entscheidend beiträgt (Shibata et al. 2011).

A B

24 48 72

0

20

40

60

80

RAW +Infektion

RAW

n.d.

**

**

h post infectionem

Nit

rite

(µM

)

24 48 72

0

20

40

60

80

RAW +Infektion +IFN

RAW +IFN

h post infectionem

Nit

rite

(µM

)

ERGEBNISSE 42

C

24 48 72

0

10

20

30

40

50

60 -IFN

+IFN

h post infectionem

Nit

rite

(µM

)

Abb. 15

Einfluss von S. aureus auf die NO-Freisetzung in muriner Makrophagen-Zelllinie. RAW-Makrophagen nach Infektion mit Newman (A) ohne IFN-γ-Stimulation und (B) mit IFN-γ-Stimulation im Vergleich zu uninfizierten Zellen, sowie (C) Vergleich der IFN- γ –Wirkung von infizierten RAW-Makrophagen (MOI 580:1). Gezeigt ist das Ergebnis eines repräsentativen Versuchs

aus drei unabhängig durchgeführten Experimenten mit Mittelwert und Standardabweichung aus Dreifachbestimmungen. n.d.= nicht detektierbar

Wie in Abbildung 15 (A) ersichtlich, führte die Infektion mit S. aureus Newman in RAW-Makrophagen zu

einer deutlich signifikanten Zunahme der NO Produktion ab 48 h nach Infektionsbeginn. Der zu messende

NO-Gehalt bei nicht-infizierten Kontrollzellen war zu allen Zeitpunkten vernachlässigbar gering.

Die Abbildung 15 (B) zeigt (dasselbe Experiment wie A), dass bereits die IFN-γ-Stimulation zu einer

deutlichen NO-Produktion der RAW-Makrophagen mit ansteigender Kinetik führte. Bereits nach 24 h war

die Nitritkonzentration im Zellkulturüberstand deutlich erhöht, wobei zwischen infizierten und uninfizierten

Makrophagen kein signifikanter Unterschied bestand. Im weiteren Messverlauf nahm die NO-Produktion

der infizierten Zellen weiter zu, ein signifikanter Unterschied ergab sich jedoch zu keinem Zeitpunkt zu

den uninfizierten Makrophagen. Abbildung 15 C verdeutlicht nochmals, dass der Nitritgehalt nach

S. aureus-Infektion bei IFN-γ-stimulierten Zellen leicht höhere Werte verglichen mit unstimulierten Zellen

erreicht. Eine Stunde nach Infektion (= Null-Stundenwert) konnte keinerlei NO mit dem eingesetzten

Assay detektiert werden und die Werte wurden daher nicht abgebildet.

ERGEBNISSE 43

A B

24 48 72

0

50

100

150

200

250

C57BL/6J +Infektion

C57BL/6J

n.d.

**

*

h post infectionem

Nit

rit

(mM

)

24 48 72

0

50

100

150

200

250

C57BL/6J +Infektion +IFN

C57BL/6J +IFN

*

*

*

h post infectionem

Nit

rit

(mM

)

Abb. 16

Einfluss von S. aureus auf die NO-Freisetzung in primären Makrophagen. C57BL/6-Knochenmarkmakrophagen nach Infektion mit Newman (A) ohne IFN-γ-Stimulation und (B) mit IFN-γ-Stimulation im Vergleich zu uninfizierten Zellen (MOI 415:1). Gezeigt ist das Ergebnis eines repräsentativen Versuchs aus vier unabhängig durchgeführten Experimenten mit

Mittelwert und Standardabweichung aus Dreifachbestimmungen. n.d.=nicht detektierbar

Abbildung 16 A zeigt den NO-Assay nun mit primären C57BL/6-Makrophagen nach S. aureus Newman-

Infektion. Im Vergleich zu RAW-Makrophagen ergab sich eine ähnliche Kinetik der NO-Produktion über

den beobachteten Zeitraum. S. aureus steigert die NO-Produktion der Makrophagen signifikant. Die

gemessenen NO-Konzentrationen der Kontrollzellen liegen hier ebenfalls im Bereich um Null.

In der Abbildung 16 B ist dasselbe Experiment mit IFN-γ-stimulierten C57BL/6-Makrophagen zu sehen.

Es zeigt sich ein erheblicher Nitritkonzentrationsanstieg auf Werte um 100 µM bereits nach 24 h. Zu den

späteren Messpunkten verdoppeln sich die produzierten NO-Mengen sogar. Zu den uninfizierten, IFN-γ-

stimulierten Kontrollzellen ergab sich dadurch ein signifikanter Unterschied.

3.3.1.2 Intrazelluläres Überleben in NO-inhibierten RAW-Makrophagen

Nachdem gezeigt werden konnte, dass eine Infektion mit S. aureus zu einer Induktion von NO in

Makrophagen führt, stellte sich nun die Frage, ob NO zur Elimination des Erregers in diesen Zellen

beiträgt. Im Folgenden sollte daher das intrazelluläre Überleben in Abwesenheit von NO untersucht

werden. Dazu wurde die Bildung von NO in Makrophagen durch Aminoguanidin, einem kompetitiven

Inhibitor von iNOS, gehemmt und daraufhin das intrazelluläre Verhalten von S. aureus über einen

längeren Infektionszeitraum beobachtet. Aminoguanidin-vorbehandelte RAW-Makrophagen wurden zu

diesem Zweck mit S. aureus Newman infiziert und die intrazelluläre Keimzahl zu verschiedenen

ERGEBNISSE 44

Zeitpunkten bis 120 h nach Infektion ermittelt. Keimzahlbestimmungen aus infizierten Zellen ohne

Aminoguanidin-Behandlung dienten als Kontrolle.

Um zunächst die Wirksamkeit von Aminoguanidin im Hinblick auf die NO-Inhibition zu demonstrieren,

wurden RAW-Makrophagen beim Aussäen mit Aminoguanidin (2mM) vorbehandelt, sowie mit IFN-γ

stimuliert. Am nächsten Tag wurden sie für eine Stunde mit S. aureus Newman inkubiert und beim

anschließenden Mediumwechsel nochmals mit gleicher Konzentration AG versetzt. Im

Zellkulturüberstand erfolgte dann die Bestimmung des Nitritgehalts.

A B

24 48 72

0

10

20

30

40

50

60 -IFN

+IFN

h post infectionem

Nit

rite

(µM

)

24 48 72

0

10

20

30

40

50

60

-IFN

+IFN

h post infectionem

Nit

rite

(µM

)

Abb. 17

Einfluss von S. aureus auf die NO-Freisetzung in Makrophagen nach Aminoguanidin-Behandlung. RAW-Makrophagen

mit und ohne IFN-γ-Stimulation nach Infektion mit Newman (A) ohne und (B) mit AG-Behandlung (MOI 500:1). Gezeigt ist das Ergebnis eines repräsentativen Versuchs aus sieben unabhängig durchgeführten Experimenten mit Mittelwert und Standardabweichung aus Dreifachbestimmungen.

Wie aus Abbildung 17 (B) ersichtlich wird, konnte Aminoguanidin die NO-Produktion von RAW-

Makrophagen deutlich reduzieren. Nach Infektion mit S. aureus blieb die erfasste Nitritkonzentration im

Überstand dieser Zellen bei Werten deutlich unter 10 µM und zeigte keinen nennenswerten Unterschied

mehr zwischen unstimulierten und IFN-γ-stimulierten Makrophagen.

ERGEBNISSE 45

A B

0 24 48 72 96 120

102

103

104

105

106

+AG

-AG

h post infectionem

Intr

azellu

läre

Keim

zah

l p

ro W

ell

0 24 48 72 96 120

102

103

104

105

106 +AG +IFN

-AG +IFN

h post infectionem

Intr

azellu

läre

Keim

zah

l p

ro W

ell

Abb. 18

Vergleich des intrazellulären Überlebens von S. aureus in Makrophagen unter Einfluss von Aminoguanidin. RAW-Makrophagen nach Infektion mit Newman (A) ohne und (B) mit IFN-γ-Stimulation (MOI 300:1). Gezeigt ist das Ergebnis eines repräsentativen Versuchs aus vier unabhängig durchgeführten Experimenten mit Mittelwert und Standardabweichung aus


Im Folgenden wurden dann Aminoguanidin-behandelte RAW-Makrophagen eingesetzt, um den

intrazellulären Verlauf von S. aureus Newman unter NO-Inhibition zu untersuchen. Die Ergebnisse

konnten zeigen, dass die iNOS-Hemmung durch Aminoguanidin keinen Unterschied im Überleben von

S. aureus Newman in RAW-Makrophagen im Vergleich zu den unbehandelten Zellen erkennen lässt

(Abb. 18A). Die Phagozytoserate wurde durch Aminoguanidin ebenfalls kaum beeinflusst. In beiden

Kurven zeigte sich dann ein langsamer Abfall der Bakterienzahl bis zu dem beobachteten Zeitraum von

120 h nach Infektion. Auch nach IFN-γ-Stimulation der Zellen war kein Unterschied in der bakteriziden

Aktivität der NO-inhibierten Makrophagen gegenüber internalisiertem S. aureus erkennbar (Abb. 18B).

3.3.1.3 Intrazelluläres Überleben in C57BL/6 iNOS-/--Makrophagen

Da trotz Hemmung von iNOS mit Aminoguanidin noch die Möglichkeit einer Restaktivität des Enzyms

besteht, welche möglicherweise noch für eine effektive intrazelluläre Abwehr einer S. aureus-Infektion

ausreicht, sollten neben der biochemischen Inhibition von iNOS auch Knochenmarkmakrophagen von

Mäusen mit einem genetischen Defekt im iNOS-Gen (C57BL/6 iNOS-/- Mäuse) in die Untersuchung mit

einbezogen werden. Hierfür wurde der Bakterizidie-Assay mit C57BL/6 iNOS-/--

Knochenmarkmakrophagen im Vergleich zu Makrophagen aus C57BL/6 WT-Mäusen nach Stimulation

mit IFN-γ (300U/ml) durchgeführt.

ERGEBNISSE 46

0 24 48 72 96

102

103

104

105

106

WT iNOS

-/-

h post infectionem

Intr

azellu

läre

Keim

zah

l p

ro W

ell

Abb. 19

Vergleich des intrazellulären Überlebens von S. aureus Newman in C57BL/6-WT- und C57BL/6 iNOS-/-- Knochenmarkmakrophagen unter IFN-γ-Stimulation (MOI 230:1). Gezeigt ist das Ergebnis eines repräsentativen Versuchs aus drei unabhängig durchgeführten Experimenten mit Mittelwert und Standardabweichung aus Dreifachbestimmungen.

Wie aus Abb. 19 hervorgeht, konnte kein eindeutiger Unterschied im Verlauf der intrazellulären

Keimzahlen über den beobachteten Zeitraum von 96 h festgestellt werden. Die Abwesenheit von iNOS in

Makrophagen führte nicht zu einer Verschlechterung der bakteriziden Leistung gegenüber dem

aufgenommenen Erreger.

3.3.2 Die Rolle von reaktiven Sauerstoffradikalen am Beispiel von

C57Bl/6 gp91 phox-/- - Makrophagen

Neben der Bildung von NO ist die Bildung und Freisetzung von ROI durch die NADPH-Oxidase ein

weiterer wichtiger Mechanismus zur Elimination intrazellulärer Erreger in Makrophagen. Nachdem

festgestellt werden konnte, dass der iNOS-Oxidase keine relevante Bedeutung in der Makrophagen-

vermittelten Abwehr von intrazellulärem S. aureus zukommt, sollte in folgenden Experimenten untersucht

werden, welche Rolle die NADPH-Oxidase-Aktivität bei der Kontrolle von S. aureus-Infektionen spielt.

Untersuchungen dazu erfolgten an Knochenmarkmakrophagen von gp91 phox- Knock-out Mäusen auf

dem genetischen Hintergrund von C57BL/6-Mäusen. Bei gp91 phox handelt es sich um eine katalytische

Untereinheit des NADPH-Oxidase-Komplexes, welcher in der Phagosomenmembran lokalisiert ist und

für die Bildung von Superoxid und seinen Derivaten verantwortlich ist. Durch den genetischen Defekt im

gp91 phox -Gen fehlt den Tieren demnach die Fähigkeit zur Produktion und Freisetzung von NADPH-

Oxidase-abhängigen ROI. In den folgenden Versuchen wurden gp91 phox-/--Knochenmarkmakrophagen

und C57BL/6-WT-Makrophagen mit und ohne Stimulation durch IFN-γ (300U/ml) mit S. aureus Newman

ERGEBNISSE 47

infiziert und der Verlauf des intrazellulären Überlebens mittels Keimzahlbestimmungen zu verschiedenen

Zeitpunkten nach der Infektion ermittelt.

A B

0 24 48 72 96 120

102

103

104

105

106

WT

gp91

phox-/-

h post infectionem

Intr

azellu

läre

Keim

zah

l p

ro W

ell

0 24 48 72 96 120

102

103

104

105

106

WT

gp91

phox-/-

h post infectionem

Intr

azellu

läre

Keim

zah

l p

ro W

ell

Abb. 20

Vergleich des intrazellulären Überlebens von S. aureus Newman in C57BL/6-WT- und C57BL/6 gp91 phox-/--Knochenmarkmakrophagen (MOI 230:1). (A) ohne IFN-γ-Stimulation und (B) mit IFN-γ-Stimulation. Gezeigt ist

das Ergebnis eines repräsentativen Versuchs aus drei unabhängig durchgeführten Experimenten mit Mittelwert und Standardabweichung aus Dreifachbestimmungen.

Wie in Abbildung 20 zu sehen ist, besteht zwischen C57BL/6-WT- und gp91 phox-/- -

Knochenmarkmakrophagen kein Unterschied bezüglich der Phagozytose, sowie der intrazellulären

Überlebenskinetik von S. aureus Newman über 120h. Im Verlauf der Infektion deutete sich zwar bei IFN-γ-

stimulierten Zellen bis 72 Stunden eine geringgradig verbesserte Abtötung durch C57BL/6-WT-

Makrophagen an, im weiteren Verlauf der intrazellulären Kinetik bestätigt sich dies aber nicht (Abb. 20B).

Nach 120 h liegen die ermittelten intrazellulären Keimzahlen auf gleicher Höhe. Entsprechende

Ergebnisse wurden auch bei nicht IFN-γ-stimulierten Zellen erzielt (Abb. 20A).

3.4 Der Einfluss der globalen regulatorischen Systeme accessory-gene-regulator

(agr) und staphylococcal-accessory-element (sae) von S.aureus

Bei der genetischen Regulation der S. aureus-Virulenzfaktoren spielen unter anderem die globalen

Genregulatoren agr und sae eine wichtige Rolle. Bei agr und sae handelt es sich um so genannte

Zweikomponentensysteme (TCS). Diese sorgen für eine koordinierte Regulation der Expression sowohl

von Oberflächenproteinen, als auch von sezernierten Proteinen. Dadurch wird S. aureus zum einen die

ERGEBNISSE 48

Adhäsion und Internalisierung ermöglicht, zum anderen werden zytotoxische Eigenschaften bereitgestellt,

um den bakteriziden Mechanismen der Zelle zu entgehen. In diesem Kapitel sollte daher die Bedeutung

der globalen Regulatoren agr und sae für Phagozytose und intrazelluläres Überleben von S. aureus in

Makrophagen untersucht werden. Dies erfolgte unter Einbeziehung zweier Mutanten mit funktionell

inaktivem agr- bzw. sae-Regulator: S. aureus Newman (sae) und S. aureus RN 6911 (agr).

3.4.1 Die Rolle von agr für die Interaktion von S. aureus RN 6390 mit

Makrophagen

Das Zweikomponentensystem agr reguliert viele wichtige Virulenzfaktoren von S. aureus. Es wird in der

späten Wachstumsphase der Bakterien induziert und führt zu einer Produktion sezernierter Proteine, wie

z. B. Hämolysine. Auf der anderen Seite bewirkt es eine verminderte Synthese Zellwand-assoziierter

Moleküle, z. B. FnBP. In Experimenten mit Makrophagen, die mit der agr-Mutante von S. aureus RN 6390

infiziert wurden, sollte die Frage geklärt werden, inwieweit dieser Regulator die Internalisierung und das

intrazelluläre Verhalten von S. aureus in Makrophagen beeinflusst.

3.4.1.1 Einfluss des agr-Regulators auf die Phagozytose

Um die Bedeutung von agr auf Eindringungsvermögen von S. aureus zu untersuchen, wurden die

Phagozytoseraten von RAW-Makrophagen nach Infektion mit S. aureus RN 6911agr - und dem WT-

Stamm RN 6390 verglichen. Der Phagozytose-Assay wurde mit unstimulierten und IFN-γ-stimulierten

Zellen durchgeführt.

ERGEBNISSE 49

RN 6

390

-IFN

-IF

N-

agr

IFN

+

RN 6

390

+IF

N

-

agr

102

103

104

105

**

**

h post infectionem

Intr

azellu

läre

Keim

zah

l p

ro W

ell

Abb. 21

Einfluss des agr-Regulators auf die Phagozytose von S. aureus. Unstimulierte und IFN-γ-stimulierte RAW-Makrophagen nach Infektion mit RN 6390 WT und RN 6911 agr- (MOI 300:1). Gezeigt ist das Ergebnis eines repräsentativen Versuchs aus drei (-IFN-γ) bzw. zwei (+IFN-γ) unabhängig durchgeführten Experimenten mit Mittelwert und Standardabweichung aus Dreifachbestimmungen.

Die Ergebnisse des Phagozytose-Assays, wie in Abbildung 21 dargestellt, zeigen eindeutig, dass die Zahl

intrazellulärer Bakterien nach S. aureus RN 6911agr - -Infektion signifikant höher lag als beim WT-Stamm

RN 6390. Die Anzahl der intrazellulären Bakterien in unstimulierten Makrophagen war nach Infektion mit

der agr-Mutante dabei etwa 13 fach höher als nach Infektion mit WT-Bakterien. In IFN-γ-stimulierten

Makrophagen lag die Aufnahme von S. aureus RN 6911agr – immer noch um das 4-fache, also signifikant

über den WT-Erregern, auch wenn diese unter dem Einfluss von IFN-γ selbst signifikant gesteigert in

Makrophagen aufgenommen wurden (Abb. 21).

3.4.1.2 Intrazelluläres Überleben bei funktionell inaktivem agr-System

Im nächsten Schritt sollte geklärt werden, ob die untersuchte agr-Mutante auch über die Fähigkeit des

intrazellulären Überlebens verfügt. Dazu wurde die Zahl intrazellulärer lebender Keime in RAW-

Makrophagen über einen Zeitraum von 72 bzw. 96 h nach der Infektion im Vergleich zum WT-Stamm

ermittelt.

ERGEBNISSE 50

A B

0 24 48 72 96

101

102

103

104

105

106

RN 6390 -IFN

agr-6911 -IFN

h post infectionem

Intr

azellu

läre

Kein

zah

l p

ro W

ell

0 24 48 72

101

102

103

104

105

106

RN 6390 +IFN

agr-6911 +IFNg

h post infectionem

Intr

azellu

läre

Kem

nzah

l p

ro W

ell

Abb. 22

Einfluss des agr-Regulators auf das intrazelluläre Überleben von S. aureus. RAW-Makrophagen nach Infektion mit RN

6390 WT (MOI 170:1) und RN 6911 agr- (MOI 260:1) (A) ohne IFN-γ-Stimulation und (B) mit IFN-γ-Stimulation. Gezeigt ist das Ergebnis eines repräsentativen Versuchs aus jeweils zwei unabhängig durchgeführten Experimenten mit Mittelwert und Standardabweichung aus Dreifachbestimmungen.

Verglichen mit dem WT-Stamm wird S. aureus RN 6911agr - von RAW-Makrophagen signifikant stärker

phagozytiert, wie im bereits durchgeführten Phagozytose-Assay gezeigt wurde (Abb. 22A, B). Dies gilt

gleichermaßen für unstimulierte und IFN-γ-stimulierte Zellen.

Der Verlauf des intrazellulären Überlebens der agr-Mutante war gekennzeichnet durch einen

Rückgang der Bakterienzahl innerhalb 6 h nach der Infektion, die im Gegensatz zu einer Replikation der

entsprechenden WT Bakterien stand. Diese Replikation war in unstimulierten, als auch in IFN-γ-

stimulierten Makrophagen bis 48 h nach Infektion zu beobachten. Trotz unterschiedlicher Aufnahmeraten

und unterschiedlichem Replikationsverhalten glichen sich die intrazellulären Keimzahlen von S. aureus

RN 6911agr - und dem WT-Stamm zum Ende des beobachteten Zeitraums an und es gab keinen

Unterschied in der intrazellulären Keimlast. Sowohl nach 72 h (B), als auch nach 96 h (A) waren noch

vitale Keime erfassbar.

Wesentliche Unterschiede in der Keimelimination zwischen unstimulierten und IFN-γ-stimulierten

Makrophagen wurden vergleichbar der Ergebnisse in vorherigen Kapiteln auch hier nicht deutlich. Die

hier sichtbare schnellere Elimination bei IFN-γ-stimulierten Makrophagen (B) ließ sich nicht reproduzieren.

ERGEBNISSE 51

Abb. 23

Einfluss des agr-Regulators auf das intrazelluläre Überleben von S. aureus und Vergleich mit Stamm Newman. RAW-Makrophagen nach Infektion mit RN 6390 WT und RN 6911 agr- , sowie Newman (MOI 500:1). Gezeigt ist das Ergebnis eines repräsentativen Versuchs aus drei unabhängig durchgeführten Experimenten mit Mittelwert und Standardabweichung aus


In der Abbildung 23 wird zusätzlich zu RN 6390 und seiner agr-Mutante 6911 der Stamm Newman

vergleichend eingesetzt. Es wird nochmals deutlich, dass S. aureus RN 6390 eine frühe intrazelluläre

Proliferation zeigt, die hier bis 24 h post infectionem sichtbar wird. Auch Stamm Newman proliferiert bis

6 h, wobei die Reproduzierbarkeit nicht durchgängig vorhanden ist wie bei RN 6390. Im Gegensatz dazu

zeigt sich bei der agr-Mutante 6911 wiederholt der Rückgang der intrazellulären Keimzahl in den ersten

6 h. Auffallend bei diesem Experiment sind die Phagozytoseraten der Stämme. Bei der agr-Mutante wird

eine höhere Internalisierung erreicht als bei beim WT-Stamm RN 6390, sowie auch bei Stamm Newman.

Die geringe Internalisierungsrate von WT Stamm RN 6390 zeigte sich eindeutig abhängig vom funktionell

aktiven agr-Regulator.

3.4.2 Die Rolle von sae für die Interaktion von S. aureus Newman mit

Makrophagen

Der globale Regulator sae, bestehend aus den regulativen Genen saeR und saeS, ist ein

Zweikomponentensystem, das bespielsweise die Transkription und Expression von FnBPA (fnbA), oder

alpha-Toxin (hla) aktiviert. Da FnBP´s als essentiell für die Aufnahme von S. aureus in nicht-professionell

phagozytierende Zellen erkannt wurden, war von hohem Interesse, welchen Effekt das sae-

Regulatorsystem auf die Fähigkeit hat, in Makrophagen einzudringen. Auch der Einfluss von sae auf das

intrazelluläre Überleben sollte geklärt werden. In den folgenden Versuchen wurden dazu RAW-

Makrophagen, sowie primäre C57BL/6-und BALB/c-Knochenmarkmakrophagen mit der Mutante

SAM 21 28.08.07Killing-Assay S. aureus 2 Wildtyp-Stämme und eine Agr-Mutante

mit RAW-M über 72h

MOI 500:1

Mediumwechsel nach 48h

0 25 50 75103

104

105

106

RN 6390 WT

RN 6911 Mutante

Newman WT

h post infection

intr

azell

ulä

re K

eim

zah

l

cfu

/Well

(400µ

l)

ERGEBNISSE 52

S. aureus Newman sae- infiziert. Die Versuche erfolgten mit und ohne IFN-γ-Stimulation der

Makrophagen.

3.4.2.1 Einfluss des sae-Regulators auf die Phagozytose

A B

New

man

-IFN

-IF

N-

sae

New

man

+IF

N

+IF

N-

sae

0

100000

200000

**

*

h post infectionem

Intr

azellu

läre

Keim

zah

l p

ro W

ell

New

man

-IFN

-IFN

-

sae

New

man

+IF

N

+IF

N-

sae

0

200000

400000

600000

800000

**

**

h post infectionem

Intr

azellu

läre

Keim

zah

l p

ro W

ell

Abb. 24

Einfluss des sae-Regulators auf die Phagozytose von S. aureus. (A) RAW-Makrophagen und (B) C57BL/6-Makrophagen mit und ohne IFN-γ-Stimulation nach Infektion mit Newman WT und Newman sae- (MOI zwischen 400:1 und 500:1). Gezeigt

ist das Ergebnis eines repräsentativen Versuchs aus jeweils zwei unabhängig durchgeführten Experimenten mit Mittelwert und Standardabweichung aus Dreifachbestimmungen.

Bei der Infektion von RAW-Makrophagen, als auch primären C57BL/6 Makrophagen mit S. aureus

Newman sae- zeigte sich, dass die Phagozytoserate der Bakterien in Abwesenheit von sae signifikant

reduziert war (Abb. 24A, B). Die intrazelluläre Keimzahl erreichte bei unstimulierten RAW-Makrophagen

nach Infektion mit S. aureus Newman sae- etwa um den Faktor 2,5 niedrigere Werte, in IFN-γ-stimulierten

RAW-Makrophagen hingegen lag sie sogar um den Faktor 3,3 niedriger gegenüber dem WT-Bakterium

(Abb. 24A). In primären Makrophagen wurde S. aureus Newman sae- von unstimulierten, als auch IFN-γ-

stimulierten C57BL/6-Makrophagen ungefähr um den Faktor 7 bis 8 geringer phagozytiert als der WT-

Stamm Newman (Abb. 24B). Der Einfluss von IFN-γ auf die Steigerung der Phagozytoserate von

S. aureus Newman sae- zeigte sich in beiden Zellarten gering (Abb. 24A, B).

ERGEBNISSE 53

3.4.2.2 Intrazelluläres Überleben bei funktionell inaktivem sae-System

Da in den vorangegangenen Versuchen ein eindeutiger Einfluss des sae-Regulators auf die

Internalisierung von S. aureus in Makrophagen nachgewiesen werden konnte, sollte im Anschluss seine

Wirkung auf das intrazelluläre Überleben untersucht werden. Dazu wurde die Zahl intrazellulärer vitaler

Keime von S. aureus Newman sae- in RAW-Makrophagen, sowie BALB/c-Makrophagen bis zu 72 h nach

der Infektion im Vergleich zum WT-Stamm erfasst.

A B

0 24 48 72 96

102

103

104

105

106

sae-in RAW

New man in RAW

h post infectionem

Intr

azellu

läre

Keim

zah

l p

ro W

ell

0 24 48 72

102

103

104

105

106

New man +IFNsae

-+IFN

h post infectionem

Intr

azellu

läre

Keim

zah

l p

ro W

ell

Abb. 25

Einfluss des sae-Regulators auf das intrazelluläre Überleben von S. aureus in RAW-Makrophagen. RAW-Makrophagen nach Infektion mit Newman WT (MOI 790:1 A und 280:1 B) und Newman sae- (MOI 540:1 A und 270:1 B). (A) ohne IFN-γ-

Stimulation und (B) mit IFN-γ-Stimulation. Gezeigt ist das Ergebnis eines repräsentativen Versuchs aus jeweils zwei unabhängig durchgeführten Experimenten mit Mittelwert und Standardabweichung aus Dreifachbestimmungen.

Wie im vorangegangenen Versuch gezeigt, wurde auch in diesem Experiment S. aureus Newman sae-

geringer in die Zellen aufgenommen (Abb. 25). Im Bakterizidie-Assay mit RAW-Makrophagen wurde nun

deutlich, dass die intrazellulären Keimzahlen bei S. aureus Newman sae- im Verhältnis zum WT-Stamm

keinen wesentlich veränderten Verlauf darstellten (A und B). Durch den Unterschied in der Ausgangszahl

der Keime zeigten sich die Überlebenskurven annähernd parallel. Bis auf den bekannten steigernden

Effekt der IFN-γ-Stimulation auf die Phagozytoserate, blieb der Einfluss von IFN- γ auf den Verlauf der

intrazellulären Keimzahlen im Vergleich von sae-Mutante und WT-Bakterium unbedeutend. In IFN-γ-

stimulierten, als auch in unstimulierten Makrophagen wurde bis zu einem Zeitraum von 96 h nach der

Infektion S. aureus Newman sae- etwa in vergleichbarem Ausmaß wie der WT eliminiert (A und B).

ERGEBNISSE 54

A B

0 24 48

103

104

105

106 New man in BALB/csae

-in BALB/c

h post infectionem

Intr

azellu

läre

Keim

zah

l p

ro W

ell

0 24 48

103

104

105

106 New man +IFN

sae-+IFN

h post infectionem

Intr

azellu

läre

Keim

zah

l p

ro W

ell

Abb. 26

Einfluss des sae-Regulators auf das intrazelluläre Überleben von S. aureus in primären Makrophagen. BALB/c-

Knochenmarkmakrophagen nach Infektion mit Newman WT und Newman sae- (MOI zwischen 260:1 und 300:1) (A) ohne IFN-γ-Stimulation und (B) mit IFN-γ-Stimulation. Gezeigt ist das Ergebnis eines einmalig durchgeführten Versuchs mit Mittelwert und Standardabweichung aus Dreifachbestimmungen.

In primären Makrophagen von BALB/c-Mäusen lag nach Infektion mit S. aureus Newman sae- die Zahl

internalisierter Bakterien in unstimulierten Zellen um den Faktor 1,6 und in IFN-γ-stimulierten Zellen um

den Faktor 3,6 geringer im Gegensatz zum Newman WT-Stamm (Abb. 26). Der Verlauf der intrazellulären

Keimzahlen von S. aureus Newman sae- im Verhältnis zum WT-Stamm zeigte sich auch in primären

Makrophagen ohne wesentlichen Unterschied: Im beobachteten Zeitraum von 48 h unterschied sich der

Kurvenverlauf der intrazellulär erfassbaren Bakterienzahl nicht vom WT-Stamm. Die Vorstimulation der

primären Makrophagen mit IFN-γ spielte keine Rolle für die Erregerelimination. Durch die initial geringere

Aufnahme von S. aureus Newman sae- blieben die Keimzahlen in Bezug zum WT-Stamm jedoch im

Verlauf jederzeit geringer (B).

55

4 DISKUSSION

4.1 Phagozytose und intrazelluläres Überleben von Staphylokokken in

Makrophagen

4.1.1 Die bakterielle Regulation der Phagozytose in Makrophagen

Die Stammabhängigkeit der Phagozytose von S. aureus

Es gibt zahlreiche Studien, die die Internalisation von S. aureus in nicht-professionell phagozytierende

Zellen charakterisieren. Dort werden auch die stammabhängigen Unterschiede in der Invasivität

beschrieben (Sinha et al. 1999). In der vorliegenden Arbeit wurden nun ähnliche Beobachtungen für die

S. aureus-Makrophagen-Interaktion gemacht. Die S. aureus–Referenzstämme Newman und RN 6390

zeigten im Vergleich zu den S. aureus ATCC-Stämmen 25923, 12600 und 29213 deutlich geringere

Phagozytoseraten. Dies ist übereinstimmend mit den Untersuchungen an sämtlichen nicht-professionell

phagozytierenden Zellen, bei denen im Vergleich von verschiedenen S. aureus-Stämmen die

Laborstämme Newman und RN 6390 generell geringere Internalisierungsraten zeigten (Sinha et al. 1999;

Steinhuber et al. 2003).

Die Phagozytose von S. epidermidis

Die im Vergleich zu anderen Stämmen geringere Internalisierungsrate von S. aureus Newman zeigte sich

nicht allein gegenüber den S. aureus-ATCC-Stämmen, sondern sogar gegenüber S. epidermidis, obwohl

es sich um einen KNS-Vertreter handelt. Dies bestätigt nicht nur die geringe Internalisierungsrate von

Stamm Newman, sondern weist darüberhinaus auf das pathogene Potenzial des hier verwendeten

S. epidermidis-Stamms ATCC 12228 hin. Aus anderen Arbeiten ist bekannt, dass S. epidermidis

stammabhängig von Osteoblasten internalisiert werden kann (Khalil et al. 2007; Valour et al. 2013).

Außerdem konnte gezeigt werden, dass S. epidermidis über ein von S. aureus unabhängiges Fibronektin-

bindendes Protein, EmbP, verfügt (Williams et al. 2002).

Die Rolle von FnBP´s für die Phagozytose von S. aureus

Es konnte in vorliegender Arbeit gezeigt werden, dass die reduzierte Expression der FnbP´s im Fall von

den S. aureus-Stämmen Newman bzw. RN 6390 sich in der Internalisierungsrate in Makrophagen

erheblich abbildete. Für S. aureus Newman gilt dabei, dass seine geringe Internalisierungsrate durch eine

Mutation von fnbpA und fnbpB entsteht, die den Funktionsverlust beider Gene bewirkt, wie in nicht-

professionell phagozytierenden Zellen gezeigt werden konnte (Grundmeier et al. 2004).

Interessanterweise konnte in vorliegender Arbeit festgestellt werden, dass der Stamm RN 6390 noch

DISKUSSION 56

deutlich geringer in Makrophagen aufgenommen wurde als der Stamm Newman. Dies deutet zum einen

daraufhin, dass S. aureus Newman den Funktionsverlust seiner FnBP´s durch andere Invasine

kompensieren kann. In diesem Zusammenhang ist erwähnenswert, dass das extrazelluläre Adhärenz -

Protein Eap für die Invasivität von Stamm Newman eine erhebliche Rolle spielt (Haggar et al. 2003). Es

ist außerdem bekannt, dass S. aureus Newman im Vergleich zu anderen Stämmen Eap deutlich stärker

exprimiert (Harraghy et al. 2005).

Zum anderen liegt die Ursache der geringen Aufnahme von S. aureus RN 6390 in Zellen

bekanntermaßen in einem regulatorischen und damit komplexeren Defekt als im Fall von Newman. Dies

gilt neben RN 6390 für alle Derivate von S. aureus 8325-4 (Sinha et al. 1999). Dieser Defekt führt in der

Folge u.a. zu einer verringerten Expression von FnbP´s (Vaudaux et al. 2002; Saravia-Otten et al. 1997;

Herbert et al. 2010) und somit zur verringerten Aufnahme in nicht-professionell phagozytierende Zellen

(Sinha et al. 2000). Es handelt sich um einen Defekt im rsbU-Gen (Giachino et al. 2001; Kullik et al. 1998).

rsbU ist eine Phosphatase, die für die Aktivierung von SigB notwendig ist, von welchem wiederum bekannt

ist, dass es agr negativ reguliert (Giachino et al. 2001). Aufgrund des rsbU-Defektes bleibt die Aktivierung

des SigB-Regulators und folglich die von SigB regulierte Unterdrückung der agr-Expression aus (Bischoff

et al. 2001; Pane-Farre et al. 2009; Horsburgh et al. 2002). In einer kürzlich durchgeführten Studie mit

S. aureus und Makrophagen (Olivier et al. 2009) bestätigte sich dies und ist daher übereinstimmend mit

den geringen Internalisierungsraten von RN 6390 in dieser Arbeit. Im Vergleich zu S. aureus 8325-4

wurde bei Olivier et al. der Stamm mit wieder hergestelltem rsbU-Gen, genannt SH1000, (Horsburgh et

al. 2002) deutlich besser in die Makrophagen-Zelllinie THP-1 aufgenommen (Olivier et al. 2009).

Weiterführend konnte in Experimenten mit der agr-Mutante S. aureus RN 6911 in dieser Arbeit die

Phagozytoserate sogar deutlich über die von Stamm Newman gesteigert werden.

Die Rolle der globalen Regulatoren agr und sae für die Phagozytose von S. aureus

Es wurde bereits in früheren Studien nachgewiesen, dass FnBP´s als auch die Fibronektinbindung selbst

negativ agr-reguliert sind (Wolz et al. 2000; Saravia-Otten et al. 1997), wodurch S. aureus agr-Mutanten

besser in nicht-professionell phagozytierende Zellen eindringen konnten (Wesson et al. 1998). Dies

konnte in dieser Arbeit nun auch für Makrophagen bestätigt werden. Höchstwahrscheinlich ist durch den

Gendefekt neben den FnBP´s die Produktion noch weiterer Proteine beeinflusst, die für die Bindung an

Wirtsfaktoren eine Rolle spielen (Blevins et al. 2002). Zusätzlich ist bekannt, dass durch die fehlende

sigB-Aktivität im Fall von S. aureus RN 6390 nicht nur agr überexprimert, sondern auch der sar-Regulator

geringer exprimiert wird (Gertz et al. 2000; Gertz et al. 1999). Dieser ist im Gegensatz zu agr an der

Expression der FnbP´s beteiligt (Wolz et al. 2000).

Demgegenüber resultierte die Infektion der Makrophagen mit der Mutante S. aureus

Newman sae- in Experimenten dieser Arbeit in deutlich verringerten intrazellulären Keimzahlen, wie

DISKUSSION 57

entsprechend an Endothelzellen und Epithelzellen bereits gezeigt wurde (Steinhuber et al. 2003; Liang et

al. 2006). Es zeigte sich hier der entgegengesetzte Effekt im Verg leich zur Infektion mit der agr-Mutante.

Der sae-abhängigen Phagozytose von S. aureus mag zugrunde liegen, dass der Regulator sae neben

anderen Oberflächenproteinen die Transkription von fnbp aktiviert, und dass agr bekanntermaßen

entgegengesetzt wirkt (Steinhuber et al. 2003; Rogasch et al. 2006; Wolz et al. 2000). Das besonders für

die Invasivität von Stamm Newman entscheidende Eap ist sogar essentiell durch sae reguliert, was mit

den hier gemachten Beobachtungen korreliert (Harraghy et al. 2005). Nach unserem Wissensstand der

gängigen Literatur ist dies die erste Darstellung zum Einfluss von sae und agr für die Aufnahme von

S. aureus in Makrophagen.

4.1.2 Die bakterielle Regulation des intrazellulären Überlebens in Makrophagen

Die fehlende Stammabhängigkeit des intrazellulären Überlebens in murinen Makrophagen

Während sich in vorliegender Arbeit die Phagozytose von S. aureus in Makrophagen deutlich abhängig

vom jeweils eingesetzten Stamm zeigte, konnte diese Beobachtung beim intrazellulären Überleben nicht

gemacht werden. Vielmehr wurde deutlich, dass alle hier eingesetzten S. aureus-Stämme einen

vergleichbaren Verlauf der Überlebenskurve über 5 Tage zeigten, bei dem die intrazelluläre Keimzahl

stetig abnahm. Zwei weitere Studien, die sich mit diesem relativ langen Beobachtungszeitraum von

intrazellulärem S. aureus beschäftigten, konnte ähnliche Überlebenskurven in einer Ratten-

Alveolarmakrophagen-Zellinie (Hamza et al. 2013; Hamza und Li 2014), sowie in humanen Monocyt-

derived-Macrophages (hMDM) beobachten (Kubica et al. 2008). Anders als hier konnte bei Kubica et al.

der Stamm S. aureus 8325-4 (RN 6390 als Derivat) nicht intrazellulär überleben. Dies wurde auf den

rsbU-Defekt zurückgeführt, wie in Experimenten mit dem Stamm SH1000 mit wiederhergestelltem rsbU–

Gen bewiesen werden konnte. Korrelierende Effekte konnten bei Olivier et al. auch an THP1-

Makrophagen gesehen werden, wo sich rsbU als essentiell für das intrazelluläre Überleben erwies (Olivier

et al. 2009). In den hier durchgeführten Experimenten konnte dies nicht bestätigt werden, da der Stamm

RN 6390 mindestens 5 Tage intrazellulär überlebte. Die Diskrepanzen zwischen den Daten dieser Arbeit

und den von Kubica et al. bzw. Olivier et al. gemachten Beobachtungen könnten u.a. darin begründet

sein, dass in beiden Studien humane Makrophagen-Zelllinien (hMDM, THP-1) eingesetzt wurden und

diese sich von der hier eingesetzten murinen Makrophagen-Zelllinie RAW unterscheiden. Es handelt sich

bei hMDM-, sowie THP-1- Zellen nicht um inflammatorische Makrophagen, sondern um Zellen

monozytären Ursprungs. Es bestehen Unterschiede im Differenzierungsgrad und somit eine geringere

Phagozytoseleistung und eine veränderte Zytokinfreisetzung der Zellen im Vergleich zur murinen

Makrophagen-Zelllinie, wie kürzlich untersucht worden ist (da Silva Domingues, Joana F et al. 2013;

DISKUSSION 58

Kubica et al. 2008). Dies macht deutlich, dass die verschiedenen Infektionssysteme nur bedingt

vergleichbar sind, und lässt die hier gewonnenen Ergebnisse an der murinen Makrophagen-Zelllinie

aussagekräftiger erscheinen. Zusätzlich konnten die Ergebnisse durch Untersuchungen mit primären

Knochenmarkmakrophagen von C57BL/6- und BALB/c-Mäusen bestätigt werden. Diese weisen im

Vergleich zur murinen Zelllinie deutlich höhere Expressionsraten sämtlicher Proteine und Zytokine auf

(Chamberlain et al. 2009) und erbringen daher nochmals aussagekräftigere Ergebnisse. Nach unserem

Wissensstand der verfügbaren Literatur sind dies die ersten Ergebnisse zur Kinetik des intrazellulären

Überlebens von S. aureus in primären murinen Knochenmarkmakrophagen.

Intrazelluläres Überleben in genetisch unterschiedlichen primären Makrophagen

In anderen Infektionsmodellen, wie beispielsweise mit dem intrazellulären gramnegativen Stäbchen

B. pseudomallei, lassen die derzeitigen Ergebnisse vermuten, dass die genetisch bedingte

unterschiedliche bakterizide Aktivität von Makrophagen aus BALB/c- und C57BL/6-Mäusen zu der

unterschiedlichen Empfänglichkeit dieser Mausstämme gegenüber dem Erreger beitragen (Breitbach et

al. 2006; Depke et al. 2014; Eske et al. 2009). Ergebnisse unserer Arbeitsgruppe konnten zeigen, dass

auch gegenüber einer Infektion mit S. aureus Unterschiede in der Empfänglichkeit bestehen. Dabei

zeigten sich BALB/c-Mäuse empfänglicher gegenüber einer pulmonalen Infektion mit S. aureus als

C57BL/6-Mäuse (Köhler et al. 2011). Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zeigten jedoch, dass keine

Unterschiede in der Eliminationsfähigkeit von primären Knochenmarkmakrophagen von C57BL/6- und

BALB/c-Mäusen gegenüber intrazellulärem S. aureus bestehen. Dies deutet daraufhin, dass die

unterschiedliche Empfänglichkeit beider Mausstämme gegenüber einer S. aureus-Infektion vermutlich

nicht auf Unterschieden im intrazellulären Überleben von S. aureus in Makrophagen beruht (Depke et al.

2014). Die Beobachtungen weisen vielmehr daraufhin, dass Makrophagen nicht entscheidend für die

Elimination von S. aureus, jedoch für eine generelle Entzündungsreaktion sind (Fournier 2012; Alberts

2011), wie die entsprechenden in-vivo-Untersuchungen unserer Arbeitsgruppe zeigten (Köhler et al.

2011).

Die Rolle von agr und sae für die Kinetik des intrazellulären Überlebens von S. aureus

Während in der schon erwähnten Arbeit von Kubica et al. lediglich alle 24 h die intrazelluläre Keimzahl

bestimmt wurde, konnte in der vorliegenden Studie durch Messung der Keimzahl bereits 6 h nach der

Infektion der Verlauf der intrazellulären Keimzahl differenzierter charakterisiert werden. Trotz des

kontinuierlichen Rückgangs der intrazellulären Keimzahl im Verlauf über 5 Tage war eine kurzzeitige

Proliferation von intrazellulären S. aureus-Stämmen in den ersten 6 h nach der Phagozytose feststellbar,

die besonders bei dem Stamm RN 6390 konsequent auffällig war. Dieses Phänomen wurde bereits früher

mit RN 6390 in Epithelzellen beschrieben (Wesson et al. 1998). Außerdem konnte in den Experimenten

DISKUSSION 59

vorliegender Studie hin und wieder auch eine Proliferation bis zu 24, oder 48 h nach der Phagozytose

dieses Stamms beobachtet werden. Ursächlich dafür ist wiederum die fehlende sigB-Aktivität in RN 6390.

So produziert RN 6390 im Vergleich zum Stamm Newman größere Mengen an hla, sowie weiterer

Exoproteine, die aus der Über-Regulation von agr resultieren (Kullik et al. 1998; Horsburgh et al. 2002)

und entscheidend für das intrazelluläre Überleben sind (Kubica et al. 2008; Jarry et al. 2008; Shompole

et al. 2003; Sinha und Fraunholz 2010; Fraunholz und Sinha 2012). Bei den Experimenten mit der agr-

Mutante RN 6911 in dieser Arbeit konnte dies bewiesen werden, da die beschriebene frühe Proliferation

dann ausblieb. Das weitere intrazelluläre Überleben war im Vergleich zum Wildtyp ansonsten unverändert

über 5 Tage möglich. Demgegenüber stehen die Ergebnisse der Arbeit von Kubica et al. Sie wiesen nach,

dass das intrazelluläre Überleben von S. aureus in Makrophagen eindeutig agr-abhängig ist. Agr-

Mutanten wurden dort innerhalb von 2 Tagen eliminiert. In vorliegender Arbeit stellte sich agr hingegen

nicht als essentiell für das Überleben von S. aureus in Makrophagen dar. Entsprechend seiner

regulatorischen Funktion verhinderte das Fehlen von agr hier nur die frühe Proliferation intrazellulärer

Keime und führte weiterhin zu erhöhten Phagozytoseraten. Ein möglicher Erklärungsansatz für die

Unterschiede zu den Ergebnissen von Kubica et al. ist die dort eingesetzte Newman agr-Mutante im

Gegensatz zur hier verwendeten agr-Mutante RN 6911. Über die stammbedingten Unterschiede

zwischen S. aureus Newman und RN 6390, insbesondere dem rsbU-Defekt bei S. aureus RN 6390 mit

konsekutiver agr-Überregulation, wurde bereits diskutiert. Eine mögliche Bestätigung findet dieser

Erklärungsansatz durch entsprechende Experimente mit RN 6911 agr- in Epithelzellen, in denen sich das

intrazelluläre Verhalten ähnlich zeigte wie hier in Makrophagen (Wesson et al. 1998). Die Vergleichbarkeit

von Experimenten mit den Referenzstämmen Newman und RN 6390 ist aufgrund ihrer bekannten

regulatorischen Unterschiede begrenzt, wie aus der Literatur bereits hervorgeht (Blevins et al. 2002;

Mainiero et al. 2010; Horsburgh et al. 2002). Untersuchungen mit vielen verschiedenen S. aureus-

Stämmen müssten folgen, um repräsentative und klinisch relevante Ergebnisse zu erhalten.

Der zusätzlich in dieser Arbeit untersuchte sae-Regulator zeigte neben der deutlich positiv

regulierten Phagozytoserate auf den weiteren intrazellulären Verlauf keinen Einfluss, wie Experimente

mit Newman sae- ergaben. Trotz der in dieser Arbeit für Mutantenversuche unterschiedlich eingesetzten

Stämme ergibt sich das Bild, dass das intrazelluläre Überleben von S. aureus in Makrophagen wenig

störanfällig ist und, wie die Ergebnisse vermuten lassen, durch die Beteiligung vieler verschiedener

regulatorischer Einflüsse stabil gehalten wird. Keine der insgesamt in dieser Dissertation durchgeführten

Untersuchungen an murinen Makrophagen zeigte eine frühzeitige Elimination von intrazellulärem

S. aureus.

DISKUSSION 60

Intrazelluläres Überleben von S. epidermidis

Die bei S. aureus gemachten Beobachtungen zeigten sich, mit einigen Abweichungen, auch bei dem hier

verwendeten KNS-Vertreter S. epidermidis ATCC 12228. Dieser weniger virulente Erreger im Vergleich

zur S. aureus zeigte auch zu frühen Zeitpunkten nach der Internalisierung keine Proliferation. Weiterhin

unterschied sich der Verlauf des Überlebens des in dieser Studie eingesetzten S. epidermidis-Stammes

mit dem aller eingesetzten S. aureus-Stämme, da nach 3 Tagen keine intrazellulären Keime mehr

nachgewiesen werden konnten. S. epidermidis ATCC 12228 konnte allerdings für mindestens 48 h in

Makrophagen persistieren und wurde nicht sofort eliminiert. Eine frühere Arbeit mit in-vivo-Experimenten

zu Biomaterial-assoziierten Infektionen konnte S. epidermidis bis zu 60 Tage in Makrophagen in der

Umgebung infizierter Katheter nachweisen (Boelens et al. 2000). Diese lange intrazelluläre Persistenz

erklärte sich aus der lokal reduzierten Abwehrlage des Wirts im Biomaterial-umgebenden Gewebe und

ist eine mögliche Ursache für die gefürchteten therapieresistenten Fremdkö rperinfektionen durch

S. epidermidis. Ein Widerspruch zu der kürzeren Überlebensdauer von S. epidermidis gegenüber

S. aureus in dieser Arbeit ergibt sich damit nicht, da die in-vivo Situation bei Boelens et al. andere

Rahmenbedingungen schafft und das Fremdkörpermaterial eine veränderte Zytokinfreisetzung hervorruft.

Der hier gebrachte Nachweis, dass S. epidermidis in Makrophagen internalisiert und nicht sofort abgebaut

wird, spricht für sein pathogenes Potenzial. Es ist beispielsweise bekannt, dass S. epidermidis über

zytolytische Toxine verfügt, die ihn vor der Abwehr in Neutrophilen schützen können (Cheung, Gordon Y

C et al. 2010; Otto 2012). Eine ähnliche aggressive Expression der Toxine wie bei S. aureus konnte nicht

gesehen werden. Dies würde nicht der kommensalen Art der Interaktion von KNS-Stämmen mit ihrem

Wirt entsprechen, was sich in dieser Arbeit durch die kürzere intrazelluläre Persistenz von S. epidermidis

gegenüber S. aureus verdeutlichen ließ. Einschränkend muss jedoch hinzugefügt werden, dass im

Rahmen dieser Arbeit nur ein S. epidermidis-Stamm untersucht wurde. Weitere Studien mit weiteren

KNS-Stämmen sind nötig, um das intrazelluläre Überleben dieser Erreger in Makrophagen genauer zu

charakterisieren.

4.2 Die Bedeutung von FnBPA und Fn für die Internalisierung von S. aureus

Fnbp erhöht die Internalisierung von S. aureus durch Makrophagen

FnBP´s sind essentiell für die Internalisation von S. aureus in nicht-professionell phagozytierende Zellen.

Über das Brückenmolekül Fibronektin, einem extrazellulären Matrixprotein, stellen sie die Verbindung

zum α5β1-Integrinrezeptor der Wirtszellmembran her und vermitteln damit die Internalisierung (Sinha et

al. 1999; Sinha und Fraunholz 2010; Hauck und Ohlsen 2006; Dziewanowska et al. 1999; Alva-Murillo et

al. 2014). Dem sonst nicht-invasiven KNS-Stamm S. carnosus konnte durch die Expression von

DISKUSSION 61

S. aureus-FnBP´s die volle Invasivität, sowie die Fibronektin-Bindungskapazität übertragen werden

(Sinha et al. 1999; Sinha et al. 2000). S. carnosus fehlen sämtliche bekannte S. aureus-

Oberflächenproteine und er kann kein Fibronektin binden (Sinha et al. 1999).

In vorliegender Arbeit wurde nun gezeigt, dass FnBPA auch für die Aufnahme von S. aureus in

Makrophagen eine Rolle spielt, wie in Experimenten mit FnBPA-exprimierendem S. carnosus gezeigt

werden konnte. Die Internalisierung war dabei abhängig von Fibronektin. Shinji et al. konnten bereits

früher zeigen, dass Fibronektin-gebundener S. aureus deutlich besser durch Makrophagen

aufgenommen wird (Shinji et al. 1998). Später fanden die Autoren heraus, dass diese Aufnahme durch

FnBP´s vermittelt wird (Shinji et al. 2011). Aber auch ohne Fibronektin zeigte sich in unserer Arbeit die

Internalisierung von S. carnosus (FNBPA) im Vergleich zum Wildtyp S. carnosus erstaunlicherweise

deutlich erhöht. In diesem Zusammenhang ist erwähnenswert, dass neben der Fähigkeit der Fibronektin-

Bindung FnBP´s zusätzlich über die Möglichkeit der Fibrinogen-Bindung verfügen, wodurch es vermutlich

auch zu einer Internalisierung kommen kann (Wann et al. 2000). Interessanterweise konnte von Shinji et

al. im in-vivo-Modell gezeigt werden, dass das Vorhandensein von FnBP´s schwere septische Verläufe

und eine erhöhte Mortalität des Gesamtorganismus zur Folge hat. Auch andere Autoren zeigten an in-

vivo-Modellen, dass FnBP´s als Virulenzfaktoren von S. aureus eine Rolle spielen und mit der Entstehung

von systemischen inflammatorischen Reaktionen in Verbindung gebracht werden können (Palmqvist et

al. 2005; Brouillette et al. 2003; Edwards et al. 2010; Jenkins et al. 2015). In diesem Zusammenhang

konnte nachgewiesen werden, dass S. aureus-FnBP´s nicht nur zu gesteigerten Internalisierungsraten

führten, sondern auch eine Entzündungsreaktion im Makrophagen induzierten, was an der deutlich

gesteigerten Produktion proinflammatorischer Zytokine wie TNF-alpha und IL-6 erkennbar war (Shinji et

al. 2011). In nicht-professionell phagozytierenden Zellen wurde die FnBPA-abhängige Internalisation von

S. aureus als mögliche Strategie des Bakteriums gedeutet, der immunologischen Abwehr zu entgehen

und vor der Phagozytose und Abwehr durch Makrophagen und Neutrophile geschützt zu sein (Fraunholz

und Sinha 2012). Im Widerspruch dazu wird in dieser Arbeit deutlich, dass S. aureus auch Makrophagen

auf diese Weise internalisieren kann und er intrazellulär für mehrere Tage überlebt, statt eliminert zu

werden.

Ähnlich wie für nicht-professionell phagozytierende Zellen mehrfach nachgewiesen wurde (Sinha

et al. 1999; Sinha und Fraunholz 2010; Hauck und Ohlsen 2006; Dziewanowska et al. 1999) ist bei

Aufnahme von S. aureus in Makrophagen der α5β1-Integrinrezeptor auf der Wirtszellmembran

entscheidend (Wang et al. 2008; Shinji et al. 2003). Es wird angenommen, dass die Integrin-Aktivierung

durch die FnBP-Bindung erfolgt und es über die damit einhergehenden Zytoskelett-Veränderungen zur

Aufnahme von S. aureus in Makrophagen kommt (Shinji et al. 2003; Shinji et al. 2007). Die α5β1-Integrin-

Aktivierung durch FnBP´s führt konkret auch zu der beschriebenen Induktion einer inflammatorischen

DISKUSSION 62

Antwort im Makrophagen (Shinji et al. 2011). Dies deutet daraufhin, dass auch in einem professionell-

phagozytierenden Wirtszellsystem die Phagozytose durch bakterielle Mechanismen beeinflusst werden

kann, und dass es sich bei der FnBP-Fn-induzierten Internalisation von S. aureus in Makrophagen um

ein pathogenes Potenzial des Erregers handelt. Nicht zuletzt bestätigen dies die Experimente mit agr-

und sae-Mutanten dieser Studie, die den Einfluss bakterieller Komponenten auf das intrazelluläre

Überleben und die Phagozytose von S. aureus in Makrophagen eindeutig zeigten.

S.epidermidis wird FnbP-unabhängig internalisiert

Interessanterweise konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass auch S. epidermidis und der

apathogene Wildtyp-Stamm S. carnosus in Makrophagen aufgenommen werden. Für S. epidermidis

wurde bereits nachgewiesen, dass die Aufnahme in Osteoblasten unabhängig von FnBP´s, sowie

unabhängig vom α5β1-Integrin ist (Khalil et al. 2007). Shinji et al zeigten in Experimenten mit primären

Makrophagen, dass der KNS-Stamm S. saprophyticus und andere klinische KNS-Stämme Fibronektin in

gleichem Maß wie S. aureus binden konnten, diese Fn-Bindung im Gegensatz zu S. aureus allerdings

keine Steigerung der Phagozytoserate bewirkte (Shinji et al. 1998). Ursächlich dafür wurden die fehlende

Integrinrezeptor-Aktivierung und die folglich ausbleibenden Cytoskelettveränderungen bei den KNS-

Stämmen gesehen, die demgegenüber bei S. aureus stattfanden und die Phagozytose in Makrophagen

bewirkten (Shinji et al. 2003). Darüberhinaus wurde herausgefunden, dass für S. epidermidis das

Autolysin atlE für die Vermittlung der Internalisierung in nicht-professionell phagozytierende Zellen eine

essentielle Rolle spielt. Als Wirtszellrezeptor konnte das heat shock cognate protein Hsc70 identifiziert

werden (Hirschhausen et al. 2010)

Spezialfall S. aureus Newman: Internalisierung Fn-abhängig, aber FnbP-unabhängig

Die Ergebnisse vorliegender Arbeit konnten nachweisen, dass die Aufnahme von S. aureus Newman in

Makrophagen eindeutig Fibronektin-abhängig ist. Überraschender Weise ergab sich weiterhin, dass

Newman etwa in gleichem Maß wie S. carnosus Wildtyp in murine Makrophagen aufgenommen wurde.

Die Phagozytose von S. carnosus TM 300 zeigte sich im Gegensatz zu S. aureus Newman jedoch nicht

Fn-abhängig, womit frühere Untersuchungen bestätigt werden, dass S. carnosus keine

Fibronektinbindung eingehen kann, da ihm entsprechende Oberflächenproteine fehlen (Sinha et al.

2000). Dass S. carnosus dennoch internalisiert wird hängt möglicherweise damit zusammen, dass es sich

bei Makrophagen um ein professionell phagozytierendes Wirtszellsystem handelt. Dieses verfügt über

eine Vielzahl an Erkennungsrezeptoren ohne Notwendigkeit für opsonierende Proteine, oder bestimmte

bakterielle Bindungseigenschaften (Palecanda und Kobzik 2001; Taylor et al. 2005; Pluddemann et al.

2009), so dass sich auch der apathogene KNS-Stamm S. carnosus intrazellulär nachweisen ließ.

DISKUSSION 63

Die niedrigen Internalisierungsraten von S. aureus Newman ergeben sich hingegen, wie oben

erwähnt, durch die Mutation in den fnbp-Genen (Grundmeier et al. 2004). Überträgt man FnBP´s

(Newman) dem Stamm S. carnosus wird diesem weder die Fn-Bindungsfähigkeit, noch die Invasivität

vermittelt (Grundmeier et al. 2004). Ähnliches zeigte sich auch hier an Makrophagen. Die

Phagozytoserate wird durch Versuche mit S. carnosus (FnBPA) erheblich gesteigert, bleibt im Fall von

S. aureus Newman durch den Funktionsverlust der FnBP´s gering. Die Internalisierung erfolgt bei

Newman, als auch bei S. carnosus (FnBPA) trotzdem deutlich Fn-abhängig. Das bei Stamm Newman

stark exprimierte Eap, das neben anderen Liganden auch Fibronektin bindet, spielt eine bedeutende Rolle

in der FnbP-unabhängigen Internalisierung von S. aureus Newman (Bur et al. 2013a; Haggar et al. 2003;

Hussain et al. 2002; Fraunholz und Sinha 2012).

4.3 Die Rolle von iNOS und NADPH-Oxidase in der Abwehr von intrazellulärem

S. aureus

Reaktive Sauerstoffradikale (ROS), sowie NO und seine Derivate (RNI) sind wichtige toxische Moleküle

in der Makrophagen-Abwehr gegenüber intrazellulären Erregern (Chakravortty und Hensel 2003; Nathan

und Shiloh 2000). Der Bildung von NO wird dabei ein wichtiger Teil der Abwehrmechanismen von

Makrophagen zuteil.

Um die Bedeutung von NO in der Abwehr von intrazellulärem S. aureus zu bestimmen konnte

zunächst gezeigt werden, dass S. aureus die NO-Produktion in Makrophagen induziert. Bereits aus

früheren Untersuchungen ist bekannt, dass S. aureus die iNOS-Expression und NO-Produktion auslöst

(Cunha et al. 1993a; Cunha et al. 1993b; Kuo et al. 2003; Watanabe et al. 2007; Sasaki et al. 1998; Kim

et al. 2015). Die hier vorliegenden Ergebnisse brachten hervor, dass d ie Stimulation der NO-Produktion

in Makrophagen nach S. aureus-Infektion deutlich stärker ausfällt als durch eine Vorbehandlung mit IFN-γ

erreicht werden kann, obwohl IFN-γ das Schlüsselmolekül für die iNOS-Induktion in Makrophagen ist

(Shibata et al. 2011; Bogdan et al. 2000b). Überraschenderweise zeigten in dieser Arbeit Experimente

mit Aminoguanidin, einem biochemischen Inhibitor der iNOS-Expression, dass die Eliminationsfähigkeit

der Makrophagen nach S. aureus-Infektion unabhängig von iNOS blieb. In weiterführenden Experimenten

mit Makrophagen von Mäusen mit genetischem Defekt im iNOS-Gen bestätigte sich dieses Ergebnis. Im

Vergleich von C57BL/6 WT-Makrophagen und C57BL/6 iNOS-/--Makrophagen ergaben sich keine

Unterschiede in den Überlebensraten von intrazellulärem S. aureus Newman.

In entsprechenden in-vivo-Experimenten unserer Arbeitsgruppe mit C57BL/6 iNOS-/--Mäusen

ergab sich, dass die iNOS-Oxidase auch für die Abwehr einer pulmonalen S. aureus-Infektion keine Rolle

DISKUSSION 64

spielt (Köhler et al. 2011). Demgegenüber zeigte sich die NADPH-Oxidase als essentiell für das

Überleben der Tiere, wie sich an den deutlich verringerten Überlebensraten von C57BL/6 gp91phox-/--

Mäusen nach pulmonaler Infektion mit S. aureus nachweisen ließ (Köhler et al. 2011). Die Ergebnisse

vorliegender Arbeit legten überraschender Weise an C57BL/6 gp91phox-/--Makrophagen dar, dass sich

die Überlebensraten von intrazellulärem S. aureus im Vergleich zu Wildtyp-Makrophagen nicht

unterschieden. Nach unserem Kenntnisstand sind dies die ersten Ergebnisse zur Interaktion von

S. aureus mit primären Knochenmarkmakrophagen von Mäusen mit Defekten im iNOS-Gen bzw. der gp91

Untereinheit der NADPH-Oxidase.

Es ist anzunehmen, dass die Bedeutung der am in-vivo- Modell beobachteten essentiellen Rolle

von NADPH in der Abwehr einer S. aureus–Infektion nicht Makrophagen zukommt. Ähnlich wurde dies

von Blos et al. in der Kontrolle einer Leishmania-Infektion beobachtet. Es zeigte sich, dass die NADPH-

Oxidase von existenzieller Bedeutung für das Überleben des Gesamtorganismus ist, die

Eliminationsfähigkeit von gp91phox-/--Makrophagen im Vergleich zu WT-Makrophagen sich dabei aber

nicht unterschied (Blos et al. 2003). Ferner wurde an verschiedenen anderen Infektionsmodellen

beschrieben, dass neutrophile Granulozyten für die Kontrolle einer S. aureus-Infektion entscheidend sind

(Robertson et al. 2008; Rigby und DeLeo 2012; Kockritz-Blickwede et al. 2008). Diesen Beobachtungen

entsprechend wurde herausgefunden, dass für die Elimination von S. aureus in Neutrophilen die NADPH-

Oxidase-Funktion eine entscheidende Rolle spielt (Ellson et al. 2006; Schwartz et al. 2009).

In Ergebnissen unserer Arbeitsgruppe konnte bestätigt werden, dass Makrophagen im

Gegensatz zu Neutrophilen für die Abwehr einer pulmonalen S. aureus-Infektion keine Rolle spielen, und

dass die Depletion von Makrophagen sogar zu verlängerten Überlebensraten der Mäuse führte (Köhler

et al. 2011). Dies könnte damit zusammenhängen, dass Makrophagen die Hauptproduzenten

proinflammatorischer Zytokine sind (Fournier und Philpott 2005; Kerdudou et al. 2006; Fournier 2012)

und eine übermäßige Zytokinproduktion auch zu erhöhter Gewebeschädigung und folglich erhöhter

Mortalität führt. Weiterhin ist in diesem Zusammenhang erwähnenswert, dass die FnBP-vermittelte

Internalisierung von S. aureus in Makrophagen nicht nur die Phagozytoserate steigert, wie die

vorliegenden Ergebnisse zeigen konnten, sondern zusätzlich e ine starke proinflammatorische

Zytokinbildung induziert (Shinji et al. 2011). Dies zeigte sich an weniger schweren Krankheitsverläufen

und erhöhten Überlebensraten im murinen Modell nach Infektion mit fnbp-Mutanten (Shinji et al. 2011).

Eine der möglichen Ursachen des fehlenden Einflusses der iNOS- bzw. NADPH-Effektormoleküle

des Makrophagen gegenüber intrazellulärem S. aureus mag die Fähigkeit sein, durch die Vielfalt

bakterieller Enzyme wie beispielsweise Katalase, Superoxid-Dismutase, L-Laktatdehydrogenase, oder

Staphyloxanthin, die oxidative und nitrosative Wirkung der iNOS- und NADPH-Produkte zu neutralisieren

(Gaupp et al. 2012; Richardson et al. 2008; Clauditz et al. 2006). Dies wurde kürzlich für die S. aureus-

DISKUSSION 65

Makrophagen-Interaktion untersucht und zeigte sich entscheidend für die fehlende Erregerelimination der

Makrophagen und das intrazelluläre Überleben von S. aureus (Das et al. 2008; Das und Bishayi 2010,

2009; Bishayi et al. 2014; Gaupp et al. 2012; Olivier et al. 2009; Richardson et al. 2008).

4.4 S. aureus - ein fakultativ intrazelluläres Bakterium?

Die häufigsten und klassischen Manifestationen von S. aureus-Infektionen, wie Haut.- und

Weichteilinfektionen, Abszess, Impetigo, Sepsis, Pneumonie usw. werden durch extrazelluläre Bakterien

verursacht. In der Untersuchung von Gewebeproben findet man S. aureus dabei in extrazellulären

Räumen (Finlay und Cossart 1997; Lowy 2000). Dennoch lassen chronische und rekurrente

Krankheitsverläufe vermuten, dass S. aureus auch als intrazelluläres Bakterium pathogenetisch

bedeutsam ist. Dies zeigt sich an häufig endovaskulären Infektionen, an hohen Metastasierungsraten von

Infektionen, an hohen Rückfallraten trotz antibiotischer Therapie, oder dass eine antibiotische Therapie

wirkungslos bleibt, wie bei langwierigen Osteomyelitiden.

Diese klinischen Beobachtungen werden durch die zahlreichen in-vitro-Untersuchungen

bestätigt, die S. aureus intrazellulär in sämtlichen Wirtszellen nachweisen konnten. Dies wurde als

Fähigkeit gedeutet, einerseits der konventionellen antibiotischen Therapie, aber andererseits auch der

Abwehr durch professionell phagozytierende Zellen zu entgehen (Fraunholz und Sinha 2012; Garzoni

und Kelley 2009). Wie in vorliegender Arbeit nachgewiesen werden konnte, kann S. aureus jedoch auch

professionell phagozytierende Zellen internalisieren und über längere Zeiträume überleben, so dass er

als fakultativ intrazelluläres Bakterium bezeichnet werden könnte. Bei B. pseudomallei, M. tuberkulosis,

Legionella pneumopila, oder Listeria monocytogenes handelt es sich um typische Beispiele fakultativ

intrazellulärer Bakterien (Molmeret et al. 2004; Seveau et al. 2007; Xu und Luo 2013; Rohde et al. 2007;

Gan 2005). Diese zeichnen sich dadurch aus, dass sie intrazellulär replizieren können und über längere

Zeiträume intrazellulär verbleiben, insbesondere in Makrophagen. Der intrazelluläre Aufenthalt ist dabei

Teil ihres pathogenen Zyklus und die Grundlage für die spezifischen Krankheitsbilder, die diese Erreger

hervorrufen.

Davon unterscheidet sich S. aureus, wie in vorliegender Arbeit gezeigt werden konnte. Allenfalls,

wenn überhaupt, war eine kurzzeitige initiale Replikation mit Übergang in eine langsame, aber

konsequente Reduktion der intrazellulären Keimzahlen über etwa 5 Tage zu beobachten. Des Weiteren

fehlt ein definitiver Nachweis, dass intrazellulärer S. aureus tatsächlich pathogenetische Grundlage einer

bestimmten Krankheit ist, auch wenn in-vivo-Studien zu chronischer Mastitis, Rhinosinusitis, septischer

Arthritis und Osteomyelitis den Verdacht nahe legen (Clement et al. 2005; Hebert et al. 2000; Hamza et

al. 2013; Mal et al. 2013; Bosse et al. 2005; Gresham et al. 2000).

DISKUSSION 66

S. aureus stellt damit, unserer Meinung nach und bezogen auf den derzeitigen Wissensstand,

kein typisches fakultativ intrazelluläres Bakterium dar. Dennoch ist der hier gebrachte Nachweis der

intrazellulären Persistenz von S. aureus in Makrophagen möglicherweise eine der Ursachen für schwer

zu therapierende bzw. chronisch-rekurrente Krankheitsverläufe.

Es ist denkbar, dass S. aureus durch den vorübergehenden intrazellulären Aufenthalt im

Makrophagen an andere Stellen des Organismus gelangt, wodurch es zur Disseminierung der Infektion

kommt. Vermutlich verlässt er die Zellen dann wieder und vermehrt sich. Kubica et al. formulierten bereits

diese Vermutung. Sie beobachteten in ihrer Studie eine ähnliche intrazelluläre Überlebenskurve, wie sie

hier gesehen werden konnte. Nach etwa 5 Tagen verließ S. aureus die Makrophagen und proliferierte

massiv extrazellulär (Kubica et al. 2008). Aufgrund des hier eingesetzten Antibiotika-haltigen Mediums im

Vergleich zur Arbeit von Kubica et al. konnte dies in vorliegenden Ergebnissen nicht beobachtet werden.

Es weist aber darauf hin, dass S. aureus die Makrophagen tatsächlich als kurzfristiges

Überlebensreservoir zu nutzen vermag, um dann die Zelle wieder zu verlassen und e xtrazellulär zu

proliferieren.

In diesen Zusammenhang ist erwähnenswert, dass intrazellulärem S. aureus eine zytoprotektive

Wirkung auf Makrophagen zugeschrieben werden konnte (Kubica et al. 2008), die im Gegensatz zu

apoptotischen Effekten in anderen Zellen steht (Hess et al. 2003; Menzies und Kourteva 1998; Haslinger-

Loffler et al. 2006; Baran et al. 2001). Ähnlich wird es bekanntermaßen von obligat- bzw. fakultativ

intrazellulären Erregern zur Erhaltung ihrer intrazellulären Nische angewandt (Fischer et al. 2001; Hacker

et al. 2006; Abu-Zant et al. 2005). S. aureus induziert nach der Phagozytose die Expression

antiapoptotischer Faktoren des Makrophagen und verlängert so dessen Lebenszyklus. Die Induktion der

Veränderung der Genexpression der Wirtszelle erinnert dabei an fakultativ- und obligat intrazelluläre

Bakterien (Koziel et al. 2009; Kubica et al. 2008; Koziel et al. 2013; Garzoni et al. 2007). In vorliegender

Dissertation zeigten sich entsprechende Ergebnisse. Durch Messung der Zytotoxizität (Daten nicht

gezeigt), sowie lichtmikroskopische Beurteilung der Morphologie und Adhärenz der Zellen war erkennbar,

dass die infizierten Makrophagen über den beobachteten Zeitraum von 5 Tagen größtenteils vital blieben.

Ein weiterer Erklärungsansatz im Hinblick auf die beobachteten Überlebenskurven von S. aureus

in Makrophagen ist, dass er nach etwa 5 Tagen der Wirtsabwehr erliegt und sich bis dahin das

Gleichgewicht zwischen bakteriziden Mechanismen des Makrophagen und der daran angepassten

Expression von bakteriellen Virulenzfaktoren über eine kurze Zeit hält.

In jedem Fall kann die Fähigkeit, zumindest über einen gewissen Zeitraum intrazellulär in

Makrophagen persistieren zu können, als pathogenes Potenzial von S. aureus gesehen werden. Diese

Eigenschaft, die bei S. epidermidis in dieser Arbeit nicht in gleichem Maße beobachtet werden konnte,

DISKUSSION 67

könnte auch mitbestimmend sein für den Unterschied in der Pathogenität zwischen S. aureus und

Koagulase-negativen Staphylokokken.

68

5 ZUSAMMENFASSUNG

Im Rahmen vorliegender Dissertation wurde das intrazelluläre Überleben von S. aureus in Makrophagen

charakterisiert. Dabei lag ein Schwerpunkt auf der Verwendung von primären murinen Knochenmark-

makrophagen, deren Interaktion mit S. aureus bisher wenig beschrieben ist. Die Internalisierung und

Persistenz von S. aureus in primären Makrophagen könnte dabei als Pathogenitätsmechanismus für die

therapieresistenten und persistierenden, sowie rekurrenten Infektionen relevant sein, die der Erreger

neben den klassischen Manifestationen einer S. aureus-Infektion hervorruft. In diesem Zusammenhang

sollte auch diskutiert werden, ob es sich bei S. aureus um ein typisches fakultativ intrazelluläres Bakterium

handelt.

Zunächst wurde anhand eines in-vitro-Infektionsmodells gezeigt, dass verschiedene S. aureus–

Stämme in einer murinen Makrophagen-Zelllinie, sowie in primären murinen Knochenmark-Makrophagen

mindestens 5 Tage unter langsamer Reduktion der anfänglichen Keimzahl überleben können. Der als

Kontrollstamm eingesetzte KNS-Vertreter S. epidermidis ATCC 12228 konnte etwa 3 Tage intrazellulär

nachgewiesen werden.

Die gleichen S. aureus-Stämme wurden bezüglich ihrer Internalisierungsrate untersucht. Dabei

zeigte sich, dass die S. aureus-Stämme Newman und RN 6390 im Vergleich zu den S. aureus ATCC-

Stämmen 25923, 12600 und 29213 deutlich geringer internalisiert wurden. Sogar S. epidermidis ATCC

12228 wies ihnen gegenüber eine höhere Phagozytoserate auf. Dies verdeutlicht die Begrenzbarkeit von

Studien, in denen unterschiedliche S. aureus-Stämme untersucht werden. Die geringen

Internalisierungsraten von Newman und RN 6390 lassen sich dabei aus ihren bekannten regulatorischen

bzw. funktionellen Gendefekten erklären.

Im Rahmen dieser Arbeit wurde darüber hinaus ein Infektionsmodell entwickelt, in dem

Makrophagen von BALB/c- und C57BL/6-Mäusen vergleichend bezüglich Phagozytose und

intrazellulärem Überleben von S. aureus untersucht wurden. Anders als uns von in-vivo-

Infektionsmodellen mit S. aureus bekannt ist, zeigten sich in-vitro keine Unterschiede in der

Eliminationsfähigkeit von primären Knochenmarkmakrophagen von C57BL/6- und BALB/c-Mäusen

gegenüber intrazellulärem S. aureus. Die genetisch bedingte unterschiedliche Empfänglichkeit der

verschiedenen Mausstämme gegenüber einer S. aureus-Infektion beruht wahrscheinlich nicht auf den

unterschiedlichen bakteriziden Mechanismen der Makrophagen.

Es erfolgten weiterhin Experimente mit primären Knochenmarkmakrophagen von Mäusen mit

Defekten im iNOS Gen bzw. der gp91 Untereinheit der NADPH-Oxidase, um die Makrophagen-

spezifischen Abwehrmechanismen gegenüber einer S. aureus-Infektion genauer zu charakterisieren.

ZUSAMMENFASSUNG 69

Dabei konnte kein Effekt von bakteriziden oxidativen, oder nitrosativen Effektormechanismen des

Makrophagen auf die Phagozytose, oder das intrazelluläre Überleben von S. aureus festgestellt werden,

obwohl S. aureus die NO-Produktion in Makrophagen induzierte.

Zur Untersuchung der bakteriellen Regulation in der Interaktion mit Makrophagen wurden

schließlich S. aureus-Stämme mit Mutationen in den globalen regulatorischen Systemen agr bzw. sae

eingesetzt. Agr und sae sind essentielle Regulatoren der S. aureus-Pathogenitätsfaktoren. In

vorliegenden Ergebnissen zeigte sich deren Einfluss vor allem bezüglich der Phagozytoserate. Das

intrazelluläre Überleben hingegen wurde nur unwesentlich beeinflusst. Während sae sich als

entscheidend für die Internalisierung erwies, zeigte agr einen gegensätzlichen Effekt. Agr zeigte sich

hingegen verantwortlich für die initiale, kurzzeitige Proliferation von S. aureus in Makrophagen. Weiterhin

stellten sich das S. aureus-Oberflächenprotein FnBPA, als auch das extrazelluläre Matrixprotein

Fibronektin für die Internalisierung in primäre Makrophagen als essentiell heraus. Diese Ergebnisse

zeigten, dass die intrazelluläre Aufnahme von S. aureus in Makrophagen durch verschiedene bakterielle

Komponenten stark beeinflusst wird.

70

6 LITERATURVERZEICHNIS

1. Abel, Jens; Goldmann, Oliver; Ziegler, Christina; Holtje, Claudia; Smeltzer, Mark S.; Cheung,

Ambrose L. et al. (2011): Staphylococcus aureus evades the extracellular antimicrobial activity

of mast cells by promoting its own uptake. In: J Innate Immun 3 (5), S. 495–507. DOI:

10.1159/000327714.

2. Abu-Zant, Alaeddin; Santic, Marina; Molmeret, Maelle; Jones, Snake; Helbig, Jurgen; Abu

Kwaik, Yousef (2005): Incomplete activation of macrophage apoptosis during intracellular

replication of Legionella pneumophila. In: Infect Immun 73 (9), S. 5339–5349. DOI:

10.1128/IAI.73.9.5339-5349.2005.

3. Agerer, Franziska; Lux, Sigrid; Michel, Antje; Rohde, Manfred; Ohlsen, Knut; Hauck, Christof R.

(2005): Cellular invasion by Staphylococcus aureus reveals a functional link between focal

adhesion kinase and cortactin in integrin-mediated internalisation. In: J Cell Sci 118 (Pt 10), S.

2189–2200. DOI: 10.1242/jcs.02328.

4. Agerer, Franziska; Michel, Antje; Ohlsen, Knut; Hauck, Christof R. (2003): Integrin-mediated

invasion of Staphylococcus aureus into human cells requires Src family protein-tyrosine kinases.

In: J Biol Chem 278 (43), S. 42524–42531. DOI: 10.1074/jbc.M302096200.

5. Alberts, Bruce (2011): Molekularbiologie der Zelle. 5., vollst. überarb. Aufl. Weinheim: Wiley -

VCH.

6. Alva-Murillo, Nayeli; López-Meza, Joel Edmundo; Ochoa-Zarzosa, Alejandra (2014):

Nonprofessional phagocytic cell receptors involved in Staphylococcus aureus internalization. In:

BioMed research international 2014, S. 538546. DOI: 10.1155/2014/538546.

7. Amer, Amal O.; Swanson, Michele S. (2002): A phagosome of one's own: a microbial guide to

life in the macrophage. In: Curr Opin Microbiol 5 (1), S. 56–61.

8. Arrecubieta, Carlos; Lee, Mei-Ho; Macey, Alistair; Foster, Timothy J.; Lowy, Franklin D. (2007):

SdrF, a Staphylococcus epidermidis surface protein, binds type I collagen. In: J Biol Chem 282

(26), S. 18767–18776. DOI: 10.1074/jbc.M610940200.

9. Asad, Shadaba; Opal, Steven M. (2008): Bench-to-bedside review: Quorum sensing and the

role of cell-to-cell communication during invasive bacterial infection. In: Crit Care 12 (6), S. 236.

DOI: 10.1186/cc7101.

LITERATURVERZEICHNIS 71

10. Bantel, H.; Sinha, B.; Domschke, W.; Peters, G.; Schulze -Osthoff, K.; Janicke, R. U. (2001):

alpha-Toxin is a mediator of Staphylococcus aureus-induced cell death and activates caspases

via the intrinsic death pathway independently of death receptor signaling. In: J Cell Biol 155 (4),

S. 637–648. DOI: 10.1083/jcb.200105081.

11. Baran, J.; Weglarczyk, K.; Mysiak, M.; Guzik, K.; Ernst, M.; Flad, H. D.; Pryjma, J. (2001): Fas

(CD95)-Fas ligand interactions are responsible for monocyte apoptosis occurring as a result of

phagocytosis and killing of Staphylococcus aureus. In: Infect Immun 69 (3), S. 1287–1297. DOI:

10.1128/IAI.69.3.1287-1297.2001.

12. Bayles, K. W.; Wesson, C. A.; Liou, L. E.; Fox, L. K.; Bohach, G. A.; Trumble, W. R. (1998):

Intracellular Staphylococcus aureus escapes the endosome and induces apoptosis in epithelial

cells. In: Infect Immun 66 (1), S. 336–342.

13. Bera, Agnieszka; Biswas, Raja; Herbert, Silvia; Gotz, Friedrich (2006): The presence of

peptidoglycan O-acetyltransferase in various staphylococcal species correlates with lysozyme

resistance and pathogenicity. In: Infect Immun 74 (8), S. 4598–4604. DOI: 10.1128/IAI.00301-

06.

14. Bischoff, M.; Entenza, J. M.; Giachino, P. (2001): Influence of a functional sigB operon on the

global regulators sar and agr in Staphylococcus aureus. In: J Bacteriol 183 (17), S. 5171–5179.

15. Bishayi, B.; Bandyopadhyay, D.; Majhi, A.; Adhikary, R. (2014): Possible role of Toll-like

receptor-2 in the intracellular survival of Staphylococcus aureus in murine peritoneal

macrophages: involvement of cytokines and anti-oxidant enzymes. In: Scand J Immunol 80 (2),

S. 127–143. DOI: 10.1111/sji.12195.

16. Blanchet, Charlene; Jouvion, Gregory; Fitting, Catherine; Cavaillon, Jean-Marc; Adib-Conquy,

Minou (2014): Protective or Deleterious Role of Scavenger Receptors SR-A and CD36 on Host

Resistance to Staphylococcus aureus Depends on the Site of Infection. In: PLoS One 9 (1), S.

e87927. DOI: 10.1371/journal.pone.0087927.

17. Blevins, Jon S.; Beenken, Karen E.; Elasri, Mohamed O.; Hurlburt, Barry K.; Smeltzer, Mark S.

(2002): Strain-dependent differences in the regulatory roles of sarA and agr in Staphylococcus

aureus. In: Infect Immun 70 (2), S. 470–480.

18. Blos, Martin; Schleicher, Ulrike; Soares Rocha, F Janaina; Meissner, Udo; Rollinghoff, Martin;

Bogdan, Christian (2003): Organ-specific and stage-dependent control of Leishmania major

infection by inducible nitric oxide synthase and phagocyte NADPH oxidase. In: Eur J Immunol

33 (5), S. 1224–1234. DOI: 10.1002/eji.200323825.


19. Boelens, J. J.; Dankert, J.; Murk, J. L.; Weening, J. J.; van der Poll, T; Dingemans, K. P. et al.

(2000): Biomaterial-associated persistence of Staphylococcus epidermidis in pericatheter

macrophages. In: J INFECT DIS 181 (4), S. 1337–1349. DOI: 10.1086/315369.

20. Bogdan, C.; Rollinghoff, M.; Diefenbach, A. (2000a): Reactive oxygen and reactive nitrogen

intermediates in innate and specific immunity. In: Curr Opin Immunol 12 (1), S. 64–76.

21. Bogdan, C.; Rollinghoff, M.; Diefenbach, A. (2000b): The role of nitric oxide in innate immunity.

In: Immunol Rev 173, S. 17–26.

22. Bosse, Michael J.; Gruber, Helen E.; Ramp, Warren K. (2005): Internalization of bacteria by

osteoblasts in a patient with recurrent, long-term osteomyelitis. A case report. In: J Bone Joint

Surg Am 87 (6), S. 1343–1347. DOI: 10.2106/JBJS.D.02649.

23. Bowden, M. Gabriela; Chen, Wei; Singvall, Jenny; Xu, Yi; Peacock, Sharon J.; Valtulina, Viviana

et al. (2005): Identification and preliminary characterization of cell -wall-anchored proteins of

Staphylococcus epidermidis. In: Microbiology 151 (Pt 5), S. 1453–1464. DOI:

10.1099/mic.0.27534-0.

24. Breitbach, Katrin; Klocke, Sonja; Tschernig, Thomas; van Rooijen, Nico; Baumann, Ulrich;

Steinmetz, Ivo (2006): Role of inducible nitric oxide synthase and NADPH oxidase in early control

of Burkholderia pseudomallei infection in mice. In: Infect Immun 74 (11), S. 6300–6309. DOI:

10.1128/IAI.00966-06.

25. Broekhuizen, C A N; Sta, M.; Vandenbroucke-Grauls, C M J E; Zaat, S A J (2010): Microscopic

detection of viable Staphylococcus epidermidis in peri-implant tissue in experimental biomaterial-

associated infection, identified by bromodeoxyuridine incorporation. In: Infect Immun 78 (3), S.

954–962. DOI: 10.1128/IAI.00849-09.

26. Broekhuizen, Corine A N; Boer, Leonie de; Schipper, Kim; Jones, Christopher D.; Quadir, Shan;

Vandenbroucke-Grauls, Christina M J E; Zaat, Sebastian A J (2008): Staphylococcus

epidermidis is cleared from biomaterial implants but persists in peri-implant tissue in mice despite

rifampicin/vancomycin treatment. In: J Biomed Mater Res A 85 (2), S. 498–505. DOI:

10.1002/jbm.a.31528.

27. Bronner, Stéphane; Monteil, Henri; Prévost, Gilles (2004): Regulation of virulence determinants

in Staphylococcus aureus: complexity and applications. In: FEMS Microbiol. Rev. 28 (2), S. 183–

200. DOI: 10.1016/j.femsre.2003.09.003.


28. Brouillette, Eric; Grondin, Gilles; Shkreta, Lulzim; Lacasse, Pierre; Talbot, Brian G. (2003): In

vivo and in vitro demonstration that Staphylococcus aureus is an intracellular pathogen in the

presence or absence of fibronectin-binding proteins. In: Microb Pathog 35 (4), S. 159–168.

29. Bur, Stephanie; Preissner, Klaus T.; Herrmann, Mathias; Bischoff, Markus (2013a): The

Staphylococcus aureus extracellular adherence protein promotes bacterial internalization by

keratinocytes independent of fibronectin-binding proteins. In: J Invest Dermatol 133 (8), S. 2004–

2012. DOI: 10.1038/jid.2013.87.

30. Bur, Stephanie; Preissner, Klaus T.; Herrmann, Mathias; Bischoff, Markus (2013b): The

Staphylococcus aureus extracellular adherence pro tein promotes bacterial internalization by

keratinocytes independent of fibronectin-binding proteins. In: J Invest Dermatol 133 (8), S. 2004–

2012. DOI: 10.1038/jid.2013.87.

31. Casey, A. L.; Lambert, P. A.; Elliott, T S J (2007): Staphylococci. In: Int J Antimicrob Agents 29

Suppl 3, S. S23-32. DOI: 10.1016/S0924-8579(07)72175-1.

32. Chakravortty, Dipshikha; Hensel, Michael (2003): Inducible nitric oxide synthase and control of

intracellular bacterial pathogens. In: Microbes Infect 5 (7), S. 621–627.

33. Chamberlain, Lisa M.; Godek, Marisha L.; Gonzalez-Juarrero, Mercedes; Grainger, David W.

(2009): Phenotypic non-equivalence of murine (monocyte-) macrophage cells in biomaterial and

inflammatory models. In: J Biomed Mater Res A 88 (4), S. 858–871. DOI: 10.1002/jbm.a.31930.

34. Cheung, Ambrose L.; Bayer, Arnold S.; Zhang, Gongyi; Gresham, Hattie; Xiong, Yan-Qiong

(2004): Regulation of virulence determinants in vitro and in vivo in Staphylococcus aureus. In:

FEMS Immunol. Med. Microbiol. 40 (1), S. 1–9.

35. Cheung, Gordon Y C; Rigby, Kevin; Wang, Rong; Queck, Shu Y.; Braughton, Kevin R.; Whitney,

Adeline R. et al. (2010): Staphylococcus epidermidis strategies to avoid killing by human

neutrophils. In: PLoS Pathog 6 (10), S. e1001133. DOI: 10.1371/journal.ppat.1001133.

36. Clauditz, Alexandra; Resch, Alexandra; Wieland, Karsten-Peter; Peschel, Andreas; Gotz,

Friedrich (2006): Staphyloxanthin plays a role in the fitness of Staphylococcus aureus and its

ability to cope with oxidative stress. In: Infect Immun 74 (8), S. 4950–4953. DOI:

10.1128/IAI.00204-06.

37. Clement, Sophie; Vaudaux, Pierre; Francois, Patrice; Schrenzel, Jacques; Huggler, Elzbieta;

Kampf, Sandy et al. (2005): Evidence of an intracellular reservoir in the nasal mucosa of patients


with recurrent Staphylococcus aureus rhinosinusitis. In: J INFECT DIS 192 (6), S. 1023–1028.

DOI: 10.1086/432735.

38. Cunha, F. Q.; Assreuy, J.; Moncada, S.; Liew, F. Y. (1993a): Phagocytosis and induction of nitric

oxide synthase in murine macrophages. In: Immunology 79 (3), S. 408–411.

39. Cunha, F. Q.; Moss, D. W.; Leal, L. M.; Moncada, S.; Liew, F. Y. (1993b): Induction of

macrophage parasiticidal activity by Staphylococcus aureus and exotoxins through the nitric

oxide synthesis pathway. In: Immunology 78 (4), S. 563–567.

40. da Silva Domingues, Joana F; van der Mei, Henny C; Busscher, Henk J.; van Kooten, Theo G

(2013): Phagocytosis of bacteria adhering to a biomaterial surface in a surface thermodynamic

perspective. In: PLoS One 8 (7), S. e70046. DOI: 10.1371/journal.pone.0070046.

41. Das, D.; Saha, S. S.; Bishayi, B. (2008): Intracellular survival of Staphylococcus aureus:

correlating production of catalase and superoxide dismutase with levels of inflammatory

cytokines. In: Inflamm Res 57 (7), S. 340–349. DOI: 10.1007/s00011-007-7206-z.

42. Das, Debaditya; Bishayi, Biswadev (2009): Staphylococcal catalase protects intracellularly

survived bacteria by destroying H2O2 produced by the murine peritoneal macrophages. In:

Microb Pathog 47 (2), S. 57–67. DOI: 10.1016/j.micpath.2009.04.012.

43. Das, Debaditya; Bishayi, Biswadev (2010): Contribution of Catalase and Superoxide Dismutase

to the Intracellular Survival of Clinical Isolates of Staphylococcus aureus in Murine Macrophages.

In: Indian J Microbiol 50 (4), S. 375–384. DOI: 10.1007/s12088-011-0063-z.

44. DeLeo, Frank R.; Diep, Binh An; Otto, Michael (2009): Host defense and pathogenesis in

Staphylococcus aureus infections. In: Infect Dis Clin North Am 23 (1), S. 17–34. DOI:

10.1016/j.idc.2008.10.003.

45. DeLoid, Glen M.; Sulahian, Timothy H.; Imrich, Amy; Kobzik, Lester (2009): Heterogeneity in

macrophage phagocytosis of Staphylococcus aureus strains: high-throughput scanning

cytometry-based analysis. In: PLoS One 4 (7), S. e6209. DOI: 10.1371/journal.pone.0006209.

46. Depke, Maren; Breitbach, Katrin; Dinh Hoang Dang, Khoa; Brinkmann, Lars; Salazar, Manuela

Gesell; Dhople, Vishnu Mukund et al. (2014): Bone marrow-derived macrophages from BALB/c

and C57BL/6 mice fundamentally differ in their respiratory chain complex proteins, lysosomal

enzymes and components of antioxidant stress systems. In: J Proteomics 103C, S. 72–86. DOI:

10.1016/j.jprot.2014.03.027.


47. Dewamitta, Sita R.; Nomura, Takamasa; Kawamura, Ikuo; Hara, Hideki; Tsuchiya, Kohsuke;

Kurenuma, Takeshi et al. (2010): Listeriolysin O-dependent bacterial entry into the cytoplasm is

required for calpain activation and interleukin-1 alpha secretion in macrophages infected with

Listeria monocytogenes. In: Infect Immun 78 (5), S. 1884–1894. DOI: 10.1128/IAI.01143-09.

48. Dey, Somrita; Bishayi, Biswadev (2015): Killing of Staphylococcus aureus in murine

macrophages by chloroquine used alone and in combination with ciprofloxacin or azithromycin.

In: J Inflamm Res 8, S. 29–47. DOI: 10.2147/JIR.S76045.

49. Dziewanowska, K.; Patti, J. M.; Deobald, C. F.; Bayles, K. W.; Trumble, W. R.; Bohac h, G. A.

(1999): Fibronectin binding protein and host cell tyrosine kinase are required for internalization

of Staphylococcus aureus by epithelial cells. In: Infect Immun 67 (9), S. 4673–4678.

50. Edwards, Andrew M.; Potter, Ursula; Meenan, Nicola A G; Potts, Jennifer R.; Massey, Ruth C.

(2011): Staphylococcus aureus keratinocyte invasion is dependent upon multiple high-affinity

fibronectin-binding repeats within FnBPA. In: PLoS One 6 (4), S. e18899. DOI:

10.1371/journal.pone.0018899.

51. Edwards, Andrew M.; Potts, Jennifer R.; Josefsson, Elisabet; Massey, Ruth C. (2010):

Staphylococcus aureus host cell invasion and virulence in sepsis is facilitated by the multiple

repeats within FnBPA. In: PLoS Pathog 6 (6), S. e1000964. DOI: 10.1371/journal.ppat.1000964.

52. Eiff, C. von; Becker, K.; Machka, K.; Stammer, H.; Peters, G. (2001a): Nasal carriage as a source

of Staphylococcus aureus bacteremia. Study Group. In: N Engl J Med 344 (1), S. 11–16. DOI:

10.1056/NEJM200101043440102.

53. Eiff, C. von; Proctor, R. A.; Peters, G. (2001b): Coagulase-negative staphylococci. Pathogens

have major role in nosocomial infections. In: Postgrad Med 110 (4), S. 63-4, 69-70, 73-6.

54. Eiff, Christof von; Peters, Georg; Becker, Karsten (2006): The small colony variant (SCV)

concept -- the role of staphylococcal SCVs in persistent infections. In: Injury 37 Suppl 2, S. S26-

33. DOI: 10.1016/j.injury.2006.04.006.

55. Eiff, Christof von; Peters, Georg; Heilmann, Christine (2002): Pathogenesis of infections due to

coagulase-negative staphylococci. In: Lancet Infect Dis 2 (11), S. 677–685.

56. Ellington, J. K.; Harris, M.; Webb, L.; Smith, B.; Smith, T.; Tan, K.; Hudson, M. (2003):

Intracellular Staphylococcus aureus. A mechanism for the indolence of osteomyelitis. In: J Bone

Joint Surg Br 85 (6), S. 918–921.


57. Ellson, Chris D.; Davidson, Keith; Ferguson, G. John; O'Connor, Rod; Stephens, Len R.;

Hawkins, Phillip T. (2006): Neutrophils from p40phox-/- mice exhibit severe defects in NADPH

oxidase regulation and oxidant-dependent bacterial killing. In: J Exp Med 203 (8), S. 1927–1937.

DOI: 10.1084/jem.20052069.

58. Eske, Kristin; Breitbach, Katrin; Kohler, Jens; Wongprompitak, Patimaporn; Steinmetz, Ivo

(2009): Generation of murine bone marrow derived macrophages in a standardised serum-free

cell culture system. In: J Immunol Methods 342 (1-2), S. 13–19. DOI: 10.1016/j.jim.2008.11.011.

59. Fang, Ferric C.; Vazquez-Torres, Andres (2002): Nitric oxide production by human

macrophages: there's NO doubt about it. In: Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 282 (5), S.

L941-3. DOI: 10.1152/ajplung.00017.2002.

60. Finlay, B. B.; Cossart, P. (1997): Exploitation of mammalian host cell functions by bacterial

pathogens. In: Science 276 (5313), S. 718–725.

61. Fischer, S. F.; Schwarz, C.; Vier, J.; Hacker, G. (2001): Characterization of antiapoptotic

activities of Chlamydia pneumoniae in human cells. In: Infect Immun 69 (11), S. 7121–7129.

DOI: 10.1128/IAI.69.11.7121-7129.2001.

62. Foster, Timothy J. (2005): Immune evasion by staphylococci. In: Nat Rev Microbiol 3 (12), S.

948–958. DOI: 10.1038/nrmicro1289.

63. Foster, Timothy J. (2009): Colonization and infection of the human host by staphylococci:

adhesion, survival and immune evasion. In: Vet. Dermatol. 20 (5-6), S. 456–470. DOI:

10.1111/j.1365-3164.2009.00825.x.

64. Foster, Timothy J.; Geoghegan, Joan A.; Ganesh, Vannakambadi K.; Höök, Magnus (2014):

Adhesion, invasion and evasion: the many functions of the surface proteins of Staphylococcus

aureus. In: Nat. Rev. Microbiol. 12 (1), S. 49–62. DOI: 10.1038/nrmicro3161.

65. Fournier, Benedicte (2012): The function of TLR2 during staphylococcal diseases. In: Front Cell

Infect Microbiol 2, S. 167. DOI: 10.3389/fcimb.2012.00167.

66. Fournier, Benedicte; Philpott, Dana J. (2005): Recognition of Staphylococcus aureus by the

innate immune system. In: Clin Microbiol Rev 18 (3), S. 521–540. DOI: 10.1128/CMR.18.3.521-

540.2005.

67. Fowler, T.; Wann, E. R.; Joh, D.; Johansson, S.; Foster, T. J.; Hook, M. (2000): Cellular invasion

by Staphylococcus aureus involves a fibronectin bridge between the bacterial fibronectin-binding

MSCRAMMs and host cell beta1 integrins. In: Eur J Cell Biol 79 (10), S. 672–679.


68. Fraunholz, Martin; Sinha, Bhanu (2012): Intracellular Staphylococcus aureus: live-in and let die.

In: Front Cell Infect Microbiol 2, S. 43. DOI: 10.3389/fcimb.2012.00043.

69. Gan, Yunn-Hwen (2005): Interaction between Burkholderia pseudomallei and the host immune

response: sleeping with the enemy? In: J INFECT DIS 192 (10), S. 1845–1850. DOI:

10.1086/497382.

70. Garzoni, Christian; Francois, Patrice; Huyghe, Antoine; Couzinet, Sabine; Tapparel, Caroline;

Charbonnier, Yvan et al. (2007): A global view of Staphylococcus aureus whole genome

expression upon internalization in human epithelial cells. In: BMC Genomics 8, S. 171. DOI:

10.1186/1471-2164-8-171.

71. Garzoni, Christian; Kelley, William L. (2009): Staphylococcus aureus: new evidence for

intracellular persistence. In: Trends Microbiol 17 (2), S. 59–65. DOI: 10.1016/j.tim.2008.11.005.

72. Garzoni, Christian; Kelley, William L. (2011): Return of the Trojan horse: intracellular phenotype

switching and immune evasion by Staphylococcus aureus. In: EMBO Mol Med 3 (3), S. 115–

117. DOI: 10.1002/emmm.201100123.

73. Gaupp, Rosmarie; Ledala, Nagender; Somerville, Greg A. (2012): Staphylococcal response to

oxidative stress. In: Front Cell Infect Microbiol 2, S. 33. DOI: 10.3389/fcimb.2012.00033.

74. Geiger, Tobias; Goerke, Christiane; Mainiero, Markus; Kraus, Dirk; Wolz, Christiane (2008): The

virulence regulator Sae of Staphylococcus aureus: promoter activities and response to

phagocytosis-related signals. In: J Bacteriol 190 (10), S. 3419–3428. DOI: 10.1128/JB.01927-

07.

75. Gertz, S.; Engelmann, S.; Schmid, R.; Ohlsen, K.; Hacker, J.; Hecker, M. (1999): Regulation of

sigmaB-dependent transcription of sigB and asp23 in two different Staphylococcus aureus

strains. In: Mol Gen Genet 261 (3), S. 558–566.

76. Gertz, S.; Engelmann, S.; Schmid, R.; Ziebandt, A. K.; Tischer, K.; Scharf, C. et al. (2000):

Characterization of the sigma(B) regulon in Staphylococcus aureus. In: J Bacteriol 182 (24), S.

6983–6991.

77. Giachino, P.; Engelmann, S.; Bischoff, M. (2001): Sigma(B) activity depends on RsbU in

Staphylococcus aureus. In: J Bacteriol 183 (6), S. 1843–1852. DOI: 10.1128/JB.183.6.1843-

1852.2001.

78. Giese, Bernd; Glowinski, Frithjof; Paprotka, Kerstin; Dittmann, Silvia; Steiner, Tobias; Sinha,

Bhanu; Fraunholz, Martin J. (2011a): Expression of delta-toxin by Staphylococcus aureus


mediates escape from phago-endosomes of human epithelial and endothelial cells in the

presence of beta-toxin. In: Cell Microbiol 13 (2), S. 316–329. DOI: 10.1111/j.1462-

5822.2010.01538.x.

79. Giese, Bernd; Glowinski, Frithjof; Paprotka, Kerstin; Dittmann, Silvia; Steiner, Tobias; Sinha,

Bhanu; Fraunholz, Martin J. (2011b): Expression of δ -toxin by Staphylococcus aureus mediates

escape from phago-endosomes of human epithelial and endothelial cells in the presence of β-

toxin. In: Cell. Microbiol. 13 (2), S. 316–329. DOI: 10.1111/j.1462-5822.2010.01538.x.

80. Gill, Steven R.; Fouts, Derrick E.; Archer, Gordon L.; Mongodin, Emmanuel F.; Deboy, Robert

T.; Ravel, Jacques et al. (2005): Insights on evolution of virulence and resistance from the

complete genome analysis of an early methicillin-resistant Staphylococcus aureus strain and a

biofilm-producing methicillin-resistant Staphylococcus epidermidis strain. In: J Bacteriol 187 (7),

S. 2426–2438. DOI: 10.1128/JB.187.7.2426-2438.2005.

81. Goerke, C.; Fluckiger, U.; Steinhuber, A.; Zimmerli, W.; Wolz, C. (2001): Impact of the regulatory

loci agr, sarA and sae of Staphylococcus aureus on the induction of alpha-toxin during device-

related infection resolved by direct quantitative transcript analysis. In: Mol Microbiol 40 (6), S.

1439–1447.

82. Gotz, Friedrich (2002): Staphylococcus and biofilms. In: Mol Microbiol 43 (6), S. 1367–1378.

83. Gresham, H. D.; Lowrance, J. H.; Caver, T. E.; Wilson, B. S.; Cheung, A. L.; Lindberg, F. P.

(2000): Survival of Staphylococcus aureus inside neutrophils contributes to infection. In: J

Immunol 164 (7), S. 3713–3722.

84. Grundmeier, Matthias; Hussain, Muzaffar; Becker, Petra; Heilmann, Christine; Peters, Georg;

Sinha, Bhanu (2004): Truncation of fibronectin-binding proteins in Staphylococcus aureus strain

Newman leads to deficient adherence and host cell invasion due to loss of the cell wall anchor

function. In: Infect Immun 72 (12), S. 7155–7163. DOI: 10.1128/IAI.72.12.7155-7163.2004.

85. Guzik, T. J.; Korbut, R.; Adamek-Guzik, T. (2003): Nitric oxide and superoxide in inflammation

and immune regulation. In: J Physiol Pharmacol 54 (4), S. 469–487.

86. Hacker, Georg; Kirschnek, Susanne; Fischer, Silke F. (2006): Apoptosis in infectious disease:

how bacteria interfere with the apoptotic apparatus. In: Med Microbiol Immunol 195 (1), S. 11–

19. DOI: 10.1007/s00430-005-0239-4.


87. Haggar, Axana; Hussain, Muzaffar; Lonnies, Helena; Herrmann, Mathias; Norrby -Teglund,

Anna; Flock, Jan-Ingmar (2003): Extracellular adherence protein from Staphylococcus aureus

enhances internalization into eukaryotic cells. In: Infect Immun 71 (5), S. 2310–2317.

88. Hamza, T.; Dietz, M.; Pham, D.; Clovis, N.; Danley, S.; Li, B. (2013): Intra-cellular

Staphylococcus aureus alone causes infection in vivo. In: Eur Cell Mater 25, S. 341-50;

discussion 350.

89. Hamza, Therwa; Li, Bingyun (2014): Differential responses of osteoblasts and macrophages

upon Staphylococcus aureus infection. In: BMC Microbiol 14, S. 207. DOI: 10.1186/s12866-014-

0207-5.

90. Harraghy, Niamh; Hussain, Muzaffar; Haggar, Axana; Chavakis, Triantafyllos; Sinha, Bhanu;

Herrmann, Mathias; Flock, Jan-Ingmar (2003): The adhesive and immunomodulating properties

of the multifunctional Staphylococcus aureus protein Eap. In: Microbiology 149 (Pt 10), S. 2701–

2707.

91. Harraghy, Niamh; Kormanec, Jan; Wolz, Christiane; Homerova, Dagmar; Goerke, Christiane;

Ohlsen, Knut et al. (2005): sae is essential for expression of the staphylococcal adhesins Eap

and Emp. In: Microbiology 151 (Pt 6), S. 1789–1800. DOI: 10.1099/mic.0.27902-0.

92. Haslinger-Loffler, B.; Wagner, B.; Bruck, M.; Strangfeld, K.; Grundmeier, M.; Fischer, U. et al.

(2006): Staphylococcus aureus induces caspase-independent cell death in human peritoneal

mesothelial cells. In: Kidney Int 70 (6), S. 1089–1098. DOI: 10.1038/sj.ki.5001710.

93. Haslinger-Loffler, Bettina; Kahl, Barbara C.; Grundmeier, Matthias; Strangfeld, Katrin; Wagner,

Britta; Fischer, Ute et al. (2005): Multiple virulence factors are required for Staphylococcus

aureus-induced apoptosis in endothelial cells. In: Cell Microbiol 7 (8), S. 1087–1097. DOI:

10.1111/j.1462-5822.2005.00533.x.

94. Hauck, Christof R.; Borisova, Marina; Muenzner, Petra (2012): Exploitation of integrin function

by pathogenic microbes. In: Curr Opin Cell Biol 24 (5), S. 637–644. DOI:

10.1016/j.ceb.2012.07.004.

95. Hauck, Christof R.; Ohlsen, Knut (2006): Sticky connections: extracellular matrix protein

recognition and integrin-mediated cellular invasion by Staphylococcus aureus. In: Curr Opin

Microbiol 9 (1), S. 5–11. DOI: 10.1016/j.mib.2005.12.002.


96. Hebert, A.; Sayasith, K.; Senechal, S.; Dubreuil, P.; Lagace, J. (2000): Demonstration of

intracellular Staphylococcus aureus in bovine mastitis alveolar cells and macrophages isolated

from naturally infected cow milk. In: FEMS Microbiol Lett 193 (1), S. 57–62.

97. Herbert, Silvia; Ziebandt, Anne-Kathrin; Ohlsen, Knut; Schafer, Tina; Hecker, Michael; Albrecht,

Dirk et al. (2010): Repair of global regulators in Staphylococcus aureus 8325 and comparative

analysis with other clinical isolates. In: Infect Immun 78 (6), S. 2877–2889. DOI:

10.1128/IAI.00088-10.

98. Hess, D. J.; Henry-Stanley, M. J.; Erickson, E. A.; Wells, C. L. (2003): Intracellular survival of

Staphylococcus aureus within cultured enterocytes. In: J Surg Res 114 (1), S. 42–49.

99. Hibbs, John B Jr (2002): Infection and nitric oxide. In: J INFECT DIS 185 Suppl 1, S. S9-17. DOI:

10.1086/338005.

100. Hirschhausen, Nina; Schlesier, Tim; Schmidt, M. Alexander; Gotz, Friedrich; Peters, Georg;

Heilmann, Christine (2010): A novel staphylococcal internalization mechanism involves the

major autolysin Atl and heat shock cognate protein Hsc70 as host cell receptor. In: Cell Microbiol

12 (12), S. 1746–1764. DOI: 10.1111/j.1462-5822.2010.01506.x.

101. Hoffmann, Christine; Ohlsen, Knut; Hauck, Christof R. (2011): Integrin-mediated uptake of

fibronectin-binding bacteria. In: Eur J Cell Biol 90 (11), S. 891–896. DOI:

10.1016/j.ejcb.2011.03.001.

102. Horsburgh, Malcolm J.; Aish, Joanne L.; White, Ian J.; Shaw, Les; Lithgow, James K.; Foster,

Simon J. (2002): sigmaB modulates virulence determinant expression and stress resistance:

characterization of a functional rsbU strain derived from Staphylococcus aureus 8325-4. In: J

Bacteriol 184 (19), S. 5457–5467.

103. Hussain, Muzaffar; Haggar, Axana; Heilmann, Christine; Peters, Georg; Flock, Jan-Ingmar;

Herrmann, Mathias (2002): Insertional inactivation of Eap in Staphylococcus aureus strain

Newman confers reduced staphylococcal binding to fibroblasts. In: Infect Immun 70 (6), S. 2933–

2940.

104. Jarry, Todd M.; Cheung, Ambrose L. (2006): Staphylococcus aureus escapes more efficiently

from the phagosome of a cystic fibrosis bronchial epithelial cell line than from its normal

counterpart. In: Infect Immun 74 (5), S. 2568–2577. DOI: 10.1128/IAI.74.5.2568-2577.2006.


105. Jarry, Todd M.; Memmi, Guido; Cheung, Ambrose L. (2008): The exp ression of alpha-

haemolysin is required for Staphylococcus aureus phagosomal escape after internalization in

CFT-1 cells. In: Cell. Microbiol. 10 (9), S. 1801–1814. DOI: 10.1111/j.1462-5822.2008.01166.x.

106. Jenkins, Amy; Diep, Binh An; Mai, Thuy T.; Vo, Nhung H.; Warrener, Paul; Suzich, Joann et al.

(2015): Differential expression and roles of Staphylococcus aureus virulence determinants

during colonization and disease. In: mBio 6 (1), S. e02272-14. DOI: 10.1128/mBio.02272-14.

107. Kahl, B. C.; Goulian, M.; van Wamel, W.; Herrmann, M.; Simon, S. M.; Kaplan, G. et al. (2000):

Staphylococcus aureus RN6390 replicates and induces apoptosis in a pulmonary epithelial cell

line. In: Infect Immun 68 (9), S. 5385–5392.

108. Kang, Seok-Seong; Ryu, Young Hee; Baik, Jung Eun; Yun, Cheol-Heui; Lee, Kangseok; Chung,

Dae Kyun; Han, Seung Hyun (2011): Lipoteichoic acid from Lactobacillus plantarum induces

nitric oxide production in the presence of interferon-gamma in murine macrophages. In: Mol

Immunol 48 (15-16), S. 2170–2177. DOI: 10.1016/j.molimm.2011.07.009.

109. Keim, Luiz S.; Torres-Filho, Sylvio R.; Silva, Patricia Vollu; Teixeira, Lenise A. (2011):

Prevalence, aetiology and antibiotic resistance profiles of coagulase negative staphylococci

isolated in a teaching hospital. In: Braz J Microbiol 42 (1), S. 248–255. DOI: 10.1590/S1517-

83822011000100031.

110. Kerdudou, Sylvain; Laschke, Matthias W.; Sinha, Bhanu; Preissner, Klaus T.; Menger, Michael

D.; Herrmann, Mathias (2006): Fibronectin binding proteins contribute to the adherence of

Staphylococcus aureus to intact endothelium in vivo. In: Thromb Haemost 96 (2), S. 183–189.

111. Khalil, Hesham; Williams, Rachel J.; Stenbeck, Gudrun; Henderson, Brian; Meghji, Sajeda; Nair,

Sean P. (2007): Invasion of bone cells by Staphylococcus epidermidis. In: Microbes Infect 9 (4),

S. 460–465. DOI: 10.1016/j.micinf.2007.01.002.

112. Kim, Nam Joong; Ahn, Ki Bum; Jeon, Jun Ho; Yun, Cheol-Heui; Finlay, B. Brett; Han, Seung

Hyun (2015): Lipoprotein in the cell wall of Staphylococcus aureus is a major inducer of nitric

oxide production in murine macrophages. In: Mol Immunol 65 (1), S. 17–24. DOI:

10.1016/j.molimm.2014.12.016.

113. Kockritz-Blickwede, Maren von; Rohde, Manfred; Oehmcke, Sonja; Miller, Lloyd S.; Cheung,

Ambrose L.; Herwald, Heiko et al. (2008): Immunological mechanisms underlying the genetic

predisposition to severe Staphylococcus aureus infection in the mouse model. In: Am J Pathol

173 (6), S. 1657–1668. DOI: 10.2353/ajpath.2008.080337.


114. Köhler, Jens; Breitbach, Katrin; Renner, Cäcilia; Heitsch, Anne-Katrin; Bast, Antje; van Rooijen,

Nico et al. (2011): NADPH-oxidase but not inducible nitric oxide synthase contributes to

resistance in a murine Staphylococcus aureus Newman pneumonia model. In: Microbes Infect.

13 (11), S. 914–922. DOI: 10.1016/j.micinf.2011.05.004.

115. Koziel, Joanna; Kmiecik, Katarzyna; Chmiest, Daniela; Maresz, Katarzyna; Mizgalska, Danuta;

Maciag-Gudowska, Agnieszka et al. (2013): The role of Mcl-1 in S. aureus-induced

cytoprotection of infected macrophages. In: Mediators Inflamm 2013, S. 427021. DOI:

10.1155/2013/427021.

116. Koziel, Joanna; Maciag-Gudowska, Agnieszka; Mikolajczyk, Tomasz; Bzowska, Malgorzata;

Sturdevant, Daniel E.; Whitney, Adeline R. et al. (2009): Phagocytosis of Staphylococcus aureus

by macrophages exerts cytoprotective effects manifested by the upregulation of antiapoptotic

factors. In: PLoS One 4 (4), S. e5210. DOI: 10.1371/journal.pone.0005210.

117. Krishna, Sheila; Miller, Lloyd S. (2012): Host-pathogen interactions between the skin and

Staphylococcus aureus. In: Curr Opin Microbiol 15 (1), S. 28–35. DOI:

10.1016/j.mib.2011.11.003.

118. Krut, Oleg; Utermohlen, Olaf; Schlossherr, Xenia; Kronke, Martin (2003): Strain-specific

association of cytotoxic activity and virulence of clinical Staphylococcus aureus isolates. In:

Infect Immun 71 (5), S. 2716–2723.

119. Kubica, Malgorzata; Guzik, Krzysztof; Koziel, Joanna; Zarebski, Miroslaw; Richter, Walter;

Gajkowska, Barbara et al. (2008): A potential new pathway for Staphylococcus aureus

dissemination: the silent survival of S. aureus phagocytosed by human monocyte -derived

macrophages. In: PLoS One 3 (1), S. e1409. DOI: 10.1371/journal.pone.0001409.

120. Kullik, I.; Giachino, P.; Fuchs, T. (1998): Deletion of the alternative sigma factor sigmaB in

Staphylococcus aureus reveals its function as a global regulator of virulence genes. In: J

Bacteriol 180 (18), S. 4814–4820.

121. Kuo, Chen-Tzu; Chiang, Ling-Ling; Lee, Chun-Nin; Yu, Ming-Chih; Bai, Kuan-Jen; Lee, Horng-

Mo et al. (2003): Induction of nitric oxide synthase in RAW 264.7 macrophages by lipoteichoic

acid from Staphylococcus aureus: involvement of protein kinase C- and nuclear factor-kB-

dependent mechanisms. In: J Biomed Sci 10 (1), S. 136–145.

122. Lazar Adler, Natalie R; Govan, Brenda; Cullinane, Meabh; Harper, Marina; Adler, Ben; Boyce,

John D. (2009): The molecular and cellular basis of pathogenesis in melioidosis: how does


Burkholderia pseudomallei cause disease? In: FEMS Microbiol Rev 33 (6), S. 1079–1099. DOI:

10.1111/j.1574-6976.2009.00189.x.

123. Leelahavanichkul, Asada; Bocharov, Alexander V.; Kurlander, Roger; Baranova, Irina N.;

Vishnyakova, Tatyana G.; Souza, Ana C P et al. (2012): Class B scavenger receptor types I and

II and CD36 targeting improves sepsis survival and acute outcomes in mice. In: J Immunol 188

(6), S. 2749–2758. DOI: 10.4049/jimmunol.1003445.

124. Liang, Xudong; Yu, Chuanxin; Sun, Junsong; Liu, Hong; Landwehr, Christina; Holmes, David;

Ji, Yinduo (2006): Inactivation of a two-component signal transduction system, SaeRS,

eliminates adherence and attenuates virulence of Staphylococcus aureus. In: Infect Immun 74

(8), S. 4655–4665. DOI: 10.1128/IAI.00322-06.

125. Liew, F. Y. (1994): Regulation of nitric oxide synthesis in infectious and autoimmune diseases.

In: Immunol Lett 43 (1-2), S. 95–98.

126. Longauerova, A. (2006): Coagulase negative staphylococci and their participation in

pathogenesis of human infections. In: Bratisl Lek Listy 107 (11-12), S. 448–452.

127. Lowy, F. D. (1998): Staphylococcus aureus infections. In: N Engl J Med 339 (8), S. 520–532.

DOI: 10.1056/NEJM199808203390806.

128. Lowy, F. D. (2000): Is Staphylococcus aureus an intracellular pathogen? In: Trends Microbiol 8

(8), S. 341–343.

129. Lundqvist-Gustafsson, H.; Norrman, S.; Nilsson, J.; Wilsson, A. (2001): Involvement of p38-

mitogen-activated protein kinase in Staphylococcus aureus-induced neutrophil apoptosis. In: J

Leukoc Biol 70 (4), S. 642–648.

130. Mack, Dietrich; Davies, Angharad P.; Harris, Llinos G.; Rohde, Holger; Horstkotte, Matthias A.;

Knobloch, Johannes K-M (2007): Microbial interactions in Staphylococcus epidermidis biofilms.

In: Anal Bioanal Chem 387 (2), S. 399–408. DOI: 10.1007/s00216-006-0745-2.

131. MacMicking, J.; Xie, Q. W.; Nathan, C. (1997): Nitric oxide and macrophage function. In: Annu

Rev Immunol 15, S. 323–350. DOI: 10.1146/annurev.immunol.15.1.323.

132. Mainiero, Markus; Goerke, Christiane; Geiger, Tobias; Gonser, Christoph; Herbert, Silvia; Wolz,

Christiane (2010): Differential target gene activation by the Staphylococcus aureus two-

component system saeRS. In: J Bacteriol 192 (3), S. 613–623. DOI: 10.1128/JB.01242-09.

133. Mal, Pinky; Dutta, Kallol; Bandyopadhyay, Debasish; Basu, Anirban; Khan, Rajni; Bishayi,

Biswadev (2013): Azithromycin in combination with riboflavin decreases the severity of


Staphylococcus aureus infection induced septic arthritis by modulating the production of free

radicals and endogenous cytokines. In: Inflammation research : official journal of the European

Histamine Research Society … [et al.] 62 (3), S. 259–273. DOI: 10.1007/s00011-012-0574-z.

134. Martinez-Pulgarin, Susana; Dominguez-Bernal, Gustavo; Orden, Jose A.; de la Fuente, Ricardo

(2009): Simultaneous lack of catalase and beta-toxin in Staphylococcus aureus leads to

increased intracellular survival in macrophages and epithelial cells and to attenuated virulence

in murine and ovine models. In: Microbiology 155 (Pt 5), S. 1505–1515. DOI:

10.1099/mic.0.025544-0.

135. Martins, Andre; Cunha, Maria de Lourdes R S (2007): Methicillin resistance in Staphylococcus

aureus and coagulase-negative staphylococci: epidemiological and molecular aspects. In:

Microbiol Immunol 51 (9), S. 787–795.

136. Menzies, B. E.; Kourteva, I. (1998): Internalization of Staphylococcus aureus by endothelial cells

induces apoptosis. In: Infect Immun 66 (12), S. 5994–5998.

137. Menzies, B. E.; Kourteva, I. (2000): Staphylococcus aureus alpha-toxin induces apoptosis in

endothelial cells. In: FEMS Immunol Med Microbiol 29 (1), S. 39–45.

138. Menzies, Barbara E. (2003): The role of fibronectin binding proteins in the pathogenesis of

Staphylococcus aureus infections. In: Curr Opin Infect Dis 16 (3), S. 225–229. DOI:

10.1097/01.qco.0000073771.11390.75.

139. Mestre, Maria Belen; Fader, Claudio M.; Sola, Claudia; Colombo, Maria Isabel (2010): Alpha-

hemolysin is required for the activation of the autophagic pathway in Staphylococcus aureus -

infected cells. In: Autophagy 6 (1), S. 110–125.

140. Mitchell, Gabriel; Lamontagne, Charles-Antoine; Brouillette, Eric; Grondin, Gilles; Talbot, Brian

G.; Grandbois, Michel; Malouin, François (2008): Staphylococcus aureus SigB activity promotes

a strong fibronectin-bacterium interaction which may sustain host tissue colonization by small -

colony variants isolated from cystic fibrosis patients. In: Molecular Microbiology 70 (6), S. 1540–

1555. DOI: 10.1111/j.1365-2958.2008.06511.x.

141. Molmeret, Maelle; Bitar, Dina M.; Han, Lihui; Kwaik, Yousef Abu (2004): Cell biology of the

intracellular infection by Legionella pneumophila. In: Microbes Infect 6 (1), S. 129–139.

142. Nathan, C. (1997): Inducible nitric oxide synthase: what difference does it make? In: J Clin Invest

100 (10), S. 2417–2423. DOI: 10.1172/JCI119782.


143. Nathan, C.; Shiloh, M. U. (2000): Reactive oxygen and nitrogen intermediates in the relationship

between mammalian hosts and microbial pathogens. In: Proc Natl Acad Sci U S A 97 (16), S.

8841–8848.

144. Nathan, C. F.; Hibbs, J B Jr (1991): Role of nitric oxide synthesis in macrophage antimicrobial

activity. In: Curr Opin Immunol 3 (1), S. 65–70.

145. Novick, Richard P. (2003): Autoinduction and signal transduction in the regulation of

staphylococcal virulence. In: Mol Microbiol 48 (6), S. 1429–1449.

146. Olivier, Aurelie C.; Lemaire, Sandrine; van Bambeke, Francoise; Tulkens, Paul M.; Oldfield, Eric

(2009): Role of rsbU and staphyloxanthin in phagocytosis and intracellular growth of

Staphylococcus aureus in human macrophages and endothelial cells. In: J INFECT DIS 200 (9),

S. 1367–1370. DOI: 10.1086/606012.

147. Otto, Michael (2012): Molecular basis of Staphylococcus epidermidis infections. In: Semin

Immunopathol 34 (2), S. 201–214. DOI: 10.1007/s00281-011-0296-2.

148. Otto, Michael (2014): Staphylococcus epidermidis pathogenesis. In: Methods Mol Biol 1106, S.

17–31. DOI: 10.1007/978-1-62703-736-5_2.

149. Palecanda, A.; Kobzik, L. (2001): Receptors for unopsonized particles: the role of alveolar

macrophage scavenger receptors. In: Curr Mol Med 1 (5), S. 589–595.

150. Palmqvist, Niklas; Foster, Timothy; Fitzgerald, J. Ross; Josefsson, Elisabet; Tarkowski, Andrzej

(2005): Fibronectin-binding proteins and fibrinogen-binding clumping factors play distinct roles

in staphylococcal arthritis and systemic inflammation. In: J INFECT DIS 191 (5), S. 791–798.

DOI: 10.1086/427663.

151. Pane-Farre, Jan; Jonas, Beate; Hardwick, Steven W.; Gronau, Katrin; Lewis, Richard J.; Hecker,

Michael; Engelmann, Susanne (2009): Role of RsbU in controlling SigB activity in

Staphylococcus aureus following alkaline stress. In: J Bacteriol 191 (8), S. 2561–2573. DOI:

10.1128/JB.01514-08.

152. Pareja, Maria Eugenia Mansilla; Colombo, Maria I. (2013): Autophagic clearance of bacterial

pathogens: molecular recognition of intracellular microorganisms. In: Front Cell Infect Microbiol

3, S. 54. DOI: 10.3389/fcimb.2013.00054.

153. Peschel, Andreas; Otto, Michael (2013): Phenol-soluble modulins and staphylococcal infection.

In: Nat Rev Microbiol 11 (10), S. 667–673. DOI: 10.1038/nrmicro3110.


154. Plouin-Gaudon, I.; Clement, S.; Huggler, E.; Chaponnier, C.; Francois, P.; Lew, D. et al. (2006):

Intracellular residency is frequently associated with recurrent Staphylococcus aureus

rhinosinusitis. In: Rhinology 44 (4), S. 249–254.

155. Pluddemann, Annette; Mukhopadhyay, Subhankar; Sankala, Marko; Savino, Silvana; Pizza,

Mariagrazia; Rappuoli, Rino et al. (2009): SR-A, MARCO and TLRs differentially recognise

selected surface proteins from Neisseria meningitidis: an example of fine specificity in microbial

ligand recognition by innate immune receptors. In: J Innate Immun 1 (2), S. 153–163. DOI:

10.1159/000155227.

156. Richardson, A. R.; Libby, S. J.; Fang, F. C. (2008): A Nitric Oxide -Inducible Lactate

Dehydrogenase Enables Staphylococcus aureus to Resist Innate Immunity. In: Science 319

(5870), S. 1672–1676. DOI: 10.1126/science.1155207.

157. Ridley, Robert A.; Douglas, Ian; Whawell, Simon A. (2012): Differential adhesion and invasion

by Staphylococcus aureus of epithelial cells derived from different anatomical sites. In: J Med

Microbiol 61 (Pt 12), S. 1654–1661. DOI: 10.1099/jmm.0.049650-0.

158. Rigby, Kevin M.; DeLeo, Frank R. (2012): Neutrophils in innate host defense against

Staphylococcus aureus infections. In: Semin Immunopathol 34 (2), S. 237–259. DOI:

10.1007/s00281-011-0295-3.

159. Robertson, Charles M.; Perrone, Erin E.; McConnell, Kevin W.; Dunne, W. Michael; Boody,

Barrett; Brahmbhatt, Tejal et al. (2008): Neutrophil Depletion Causes a Fatal Defect in Murine

Pulmonary Staphylococcus aureus clearance. In: Journal of Surgical Research 150 (2), S. 278–

285. DOI: 10.1016/j.jss.2008.02.009.

160. Rogasch, Kathrin; Ruhmling, Vanessa; Pane-Farre, Jan; Hoper, Dirk; Weinberg, Christin; Fuchs,

Stephan et al. (2006): Influence of the two-component system SaeRS on global gene expression

in two different Staphylococcus aureus strains. In: J Bacteriol 188 (22), S. 7742–7758. DOI:

10.1128/JB.00555-06.

161. Rogers, Kathie L.; Fey, Paul D.; Rupp, Mark E. (2009): Coagulase -negative staphylococcal

infections. In: Infect Dis Clin North Am 23 (1), S. 73–98. DOI: 10.1016/j.idc.2008.10.001.

162. Rohde, Kyle; Yates, Robin M.; Purdy, Georgiana E.; Russell, David G. (2007): Mycobacterium

tuberculosis and the environment within the phagosome. In: Immunol Rev 219, S. 37–54. DOI:

10.1111/j.1600-065X.2007.00547.x.


163. Sagy, Mayer; Al-Qaqaa, Yasir; Kim, Paul (2013): Definitions and pathophysiology of sepsis. In:

Curr Probl Pediatr Adolesc Health Care 43 (10), S. 260–263. DOI:

10.1016/j.cppeds.2013.10.001.

164. Saravia-Otten, P.; Muller, H. P.; Arvidson, S. (1997): Transcription of Staphylococcus aureus

fibronectin binding protein genes is negatively regulated by agr and an agr-independent

mechanism. In: J Bacteriol 179 (17), S. 5259–5263.

165. Sasaki, S.; Miura, T.; Nishikawa, S.; Yamada, K.; Hirasue, M.; Nakane, A. (1998): Protective role

of nitric oxide in Staphylococcus aureus infection in mice. In: Infect Immun 66 (3), S. 1017–1022.

166. Schnaith, Annabelle; Kashkar, Hamid; Leggio, Sonja A.; Addicks, Klaus; Kronke, Martin; Krut,

Oleg (2007): Staphylococcus aureus subvert autophagy for induction of caspase-independent

host cell death. In: J Biol Chem 282 (4), S. 2695–2706. DOI: 10.1074/jbc.M609784200.

167. Schoenfelder, Sonja M.K.; Lange, Claudia; Eckart, Martin; Hennig, Susanne; Kozytska, Svitlana;

Ziebuhr, Wilma (2010): Success through diversity – How Staphylococcus epidermidis

establishes as a nosocomial pathogen. In: International Journal of Medical Microbiology 300 (6),

S. 380–386. DOI: 10.1016/j.ijmm.2010.04.011.

168. Schroder, Andreas; Kland, Raphael; Peschel, Andreas; Eiff, Christof von; Aepfelbacher, Martin

(2006): Live cell imaging of phagosome maturation in Staphylococcus aureus infected human

endothelial cells: small colony variants are able to survive in lysosomes. In: Med Microbiol

Immunol 195 (4), S. 185–194. DOI: 10.1007/s00430-006-0015-0.

169. Schwartz, Jamie; Leidal, Kevin G.; Femling, Jon K.; Weiss, Jerrold P.; Nauseef, William M.

(2009): Neutrophil bleaching of GFP-expressing staphylococci: probing the intraphagosomal fate

of individual bacteria. In: J Immunol 183 (4), S. 2632–2641. DOI: 10.4049/jimmunol.0804110.

170. Seveau, Stephanie; Pizarro-Cerda, Javier; Cossart, Pascale (2007): Molecular mechanisms

exploited by Listeria monocytogenes during host cell invasion. In: Microbes Infect 9 (10), S.

1167–1175. DOI: 10.1016/j.micinf.2007.05.004.

171. Shibata, Takehiko; Nagata, Kisaburo; Kobayashi, Yoshiro (2011): Apoptotic neutrophils and

nitric oxide regulate cytokine production by IFN-γ-stimulated macrophages. In: Cytokine 53 (2),

S. 191–195. DOI: 10.1016/j.cyto.2010.10.003.

172. Shinji, H.; Sakurada, J.; Seki, K.; Murai, M.; Masuda, S. (1998): Different effects of fibronectin

on the phagocytosis of Staphylococcus aureus and coagulase-negative staphylococci by murine

peritoneal macrophages. In: Microbiol Immunol 42 (12), S. 851–861.


173. Shinji, Hitomi; Kamada, Minori; Seki, Keiko; Tajima, Akiko; Iwase, Tadayuki; Masuda, Shogo

(2007): Expression and distribution of very late antigen-5 in mouse peritoneal macrophages

upon ingestion of fibronectin-bound Staphylococcus aureus. In: Microbiol Immunol 51 (1), S. 63–

71.

174. Shinji, Hitomi; Seki, Keiko; Tajima, Akiko; Uchida, Atsuko; Masuda, Shogo (2003): Fibronectin

bound to the surface of Staphylococcus aureus induces association of very late antigen 5 and

intracellular signaling factors with macrophage cytoskeleton. In: Infect Immun 71 (1), S. 140–

146.

175. Shinji, Hitomi; Yosizawa, Yukio; Tajima, Akiko; Iwase, Tadayuki; Sugimoto, Shinya; Seki, Keiko;

Mizunoe, Yoshimitsu (2011): Role of fibronectin-binding proteins A and B in in vitro cellular

infections and in vivo septic infections by Staphylococcus aureus. In: Infect Immun 79 (6), S.

2215–2223. DOI: 10.1128/IAI.00133-11.

176. Shompole, Sankale; Henon, Kim T.; Liou, Linda E.; Dziewanowska, Katarzyna; Bohach, Gregory

A.; Bayles, Kenneth W. (2003): Biphasic intracellular expression of Staphylococcus aureus

virulence factors and evidence for Agr-mediated diffusion sensing. In: Mol Microbiol 49 (4), S.

919–927.

177. Sinha, B.; Francois, P.; Que, Y. A.; Hussain, M.; Heilmann, C.; Moreillon, P. et al. (2000):

Heterologously expressed Staphylococcus aureus fibronectin-binding proteins are sufficient for

invasion of host cells. In: Infect Immun 68 (12), S. 6871–6878.

178. Sinha, B.; Francois, P. P.; Nusse, O.; Foti, M.; Hartford, O. M.; Vaudaux, P. et al. (1999):

Fibronectin-binding protein acts as Staphylococcus aureus invasin via fibronectin bridging to

integrin alpha5beta1. In: Cell Microbiol 1 (2), S. 101–117.

179. Sinha, Bhanu; Fraunholz, Martin (2010): Staphylococcus aureus host cell invasion and post-

invasion events. In: Int. J. Med. Microbiol. 300 (2-3), S. 170–175. DOI:

10.1016/j.ijmm.2009.08.019.

180. Sinha, Bhanu; Herrmann, Mathias (2005): Mechanism and consequences of invasion of

endothelial cells by Staphylococcus aureus. In: Thromb Haemost 94 (2), S. 266–277. DOI:

10.1267/THRO05020266.

181. Speziale, Pietro; Pietrocola, Giampiero; Rindi, Simonetta; Provenzano, Maria; Provenza, Giulio;

Di Poto, Antonella et al. (2009): Structural and functional role of Staphylococcus aureus surface

components recognizing adhesive matrix molecules of the host. In: Future Microbiol 4 (10), S.

1337–1352. DOI: 10.2217/fmb.09.102.


182. Steinhuber, Andrea; Goerke, Christiane; Bayer, Manfred G.; Doring, Gerd; Wolz, Christiane

(2003): Molecular architecture of the regulatory Locus sae of Staphylococcus aureus and its

impact on expression of virulence factors. In: J Bacteriol 185 (21), S. 6278–6286.

183. Stuart, Lynda M.; Deng, Jiusheng; Silver, Jessica M.; Takahashi, Kazue; Tseng, Anita A.;

Hennessy, Elizabeth J. et al. (2005): Response to Staphylococcus aureus requires CD36-

mediated phagocytosis triggered by the COOH-terminal cytoplasmic domain. In: J Cell Biol 170

(3), S. 477–485. DOI: 10.1083/jcb.200501113.

184. Taylor, P. R.; Martinez-Pomares, L.; Stacey, M.; Lin, H-H; Brown, G. D.; Gordon, S. (2005):

Macrophage receptors and immune recognition. In: Annu Rev Immunol 23, S. 901–944. DOI:

10.1146/annurev.immunol.23.021704.115816.

185. Thomas, C. A.; Li, Y.; Kodama, T.; Suzuki, H.; Silverstein, S. C.; El Khoury, J. (2000): Protection

from lethal gram-positive infection by macrophage scavenger receptor-dependent phagocytosis.

In: J Exp Med 191 (1), S. 147–156.

186. Tuchscherr, Lorena; Heitmann, Vanessa; Hussain, Muzaffar; Viemann, Dorothee; Roth,

Johannes; Eiff, Christof von et al. (2010): Staphylococcus aureus small -colony variants are

adapted phenotypes for intracellular persistence. In: J INFECT DIS 202 (7), S. 1031–1040. DOI:

10.1086/656047.

187. Valour, Florent; Trouillet-Assant, Sophie; Rasigade, Jean-Philippe; Lustig, Sebastien; Chanard,

Emmanuel; Meugnier, Helene et al. (2013): Staphylococcus epidermidis in orthopedic device

infections: the role of bacterial internalization in human osteoblasts and biofilm formation. In:

PLoS One 8 (6), S. e67240. DOI: 10.1371/journal.pone.0067240.

188. van Belkum, Alex; Melles, Damian C.; Nouwen, Jan; van Leeuwen, Willem B; van Wamel,

Willem; Vos, Margreet C. et al. (2009): Co-evolutionary aspects of human colonisation and

infection by Staphylococcus aureus. In: Infect Genet Evol 9 (1), S. 32–47. DOI:

10.1016/j.meegid.2008.09.012.

189. Vaudaux, Pierre; Francois, Patrice; Bisognano, Carmelo; Kelley, William L.; Lew, Daniel P.;

Schrenzel, Jacques et al. (2002): Increased expression of clumping factor and fibronectin-

binding proteins by hemB mutants of Staphylococcus aureus expressing small colony variant

phenotypes. In: Infect Immun 70 (10), S. 5428–5437.

190. Vazquez-Torres, Andres; Stevanin, Tania; Jones-Carson, Jessica; Castor, Margaret; Read,

Robert C.; Fang, Ferric C. (2008): Analysis of nitric oxide -dependent antimicrobial actions in


macrophages and mice. In: Methods Enzymol 437, S. 521–538. DOI: 10.1016/S0076-

6879(07)37026-2.

191. Vignais, P. V. (2002): The superoxide-generating NADPH oxidase: structural aspects and

activation mechanism. In: Cell Mol Life Sci 59 (9), S. 1428–1459.

192. Voyich, Jovanka M.; Braughton, Kevin R.; Sturdevant, Daniel E.; Whitney, Adeline R.; Said-

Salim, Battouli; Porcella, Stephen F. et al. (2005): Insights into mechanisms used by

Staphylococcus aureus to avoid destruction by human neutrophils. In: J Immunol 175 (6), S.

3907–3919.

193. Voyich, Jovanka M.; Vuong, Cuong; DeWald, Mark; Nygaard, Tyler K.; Kocianova, Stanislava;

Griffith, Shannon et al. (2009): The SaeR/S Gene Regulatory System Is Essential for Innate

Immune Evasion by Staphylococcus aureus. In: J INFECT DIS 199 (11), S. 1698–1706. DOI:

10.1086/598967.

194. Wang, Qing-Qing; Li, Hong; Oliver, Tim; Glogauer, Michael; Guo, Jian; He, You-Wen (2008):

Integrin beta 1 regulates phagosome maturation in macrophages through Rac expression. In: J

Immunol 180 (4), S. 2419–2428.

195. Wann, E. R.; Gurusiddappa, S.; Hook, M. (2000): The fibronectin-binding MSCRAMM FnbpA of

Staphylococcus aureus is a bifunctional protein that also binds to fibrinogen. In: J Biol Chem 275

(18), S. 13863–13871.

196. Watanabe, Ikuko; Ichiki, Manami; Shiratsuchi, Akiko; Nakanishi, Yoshinobu (2007): TLR2 -

mediated survival of Staphylococcus aureus in macrophages: a novel bacterial strategy against

host innate immunity. In: J Immunol 178 (8), S. 4917–4925.

197. Watkins, Robert L.; Pallister, Kyler B.; Voyich, Jovanka M.; Diep, Binh An (2011): The SaeR/S

Gene Regulatory System Induces a Pro-Inflammatory Cytokine Response during

Staphylococcus aureus Infection. In: PLoS ONE 6 (5), S. e19939. DOI:

10.1371/journal.pone.0019939.

198. Wertheim, Heiman F L; Melles, Damian C.; Vos, Margreet C.; van Leeuwen, Willem; van Belkum,

Alex; Verbrugh, Henri A.; Nouwen, Jan L. (2005): The role of nasal carriage in Staphylococcus

aureus infections. In: Lancet Infect Dis 5 (12), S. 751–762. DOI: 10.1016/S1473-3099(05)70295-

4.


199. Wesson, C. A.; Liou, L. E.; Todd, K. M.; Bohach, G. A.; Trumble, W. R.; Bayles, K . W. (1998):

Staphylococcus aureus Agr and Sar global regulators influence internalization and induction of

apoptosis. In: Infect Immun 66 (11), S. 5238–5243.

200. Williams, Rachel J.; Henderson, Brian; Sharp, Lindsay J.; Nair, Sean P. (2002): Identification of

a fibronectin-binding protein from Staphylococcus epidermidis. In: Infect Immun 70 (12), S.

6805–6810.

201. Wolz, C.; Pohlmann-Dietze, P.; Steinhuber, A.; Chien, Y. T.; Manna, A.; van Wamel, W.; Cheung,

A. (2000): Agr-independent regulation of fibronectin-binding protein(s) by the regulatory locus

sar in Staphylococcus aureus. In: Mol Microbiol 36 (1), S. 230–243.

202. Xiong, Yan Q.; Willard, Julie; Yeaman, Michael R.; Cheung, Ambrose L.; Bayer, Arnold S. (2006):

Regulation of Staphylococcus aureus alpha-toxin gene (hla) expression by agr, sarA, and sae in

vitro and in experimental infective endocarditis. In: J INFECT DIS 194 (9), S. 1267–1275. DOI:

10.1086/508210.

203. Xu, Li; Luo, Zhao-Qing (2013): Cell biology of infection by Legionella pneumophila. In: Microbes

Infect 15 (2), S. 157–167. DOI: 10.1016/j.micinf.2012.11.001.

204. Yamamoto, Tomoko (2006): Bacterial strategies fo r escaping the bactericidal mechanisms by

macrophage. In: Yakugaku Zasshi 126 (12), S. 1235–1243.

205. Yarwood, Jeremy M.; Schlievert, Patrick M. (2003): Quorum sensing in Staphylococcus

infections. In: J Clin Invest 112 (11), S. 1620–1625. DOI: 10.1172/JCI20442.

206. Yimin; Kohanawa, Masashi; Zhao, Songji; Ozaki, Michitaka; Haga, Sanae; Nan, Guangxian et

al. (2013): Contribution of toll-like receptor 2 to the innate response against Staphylococcus

aureus infection in mice. In: PLoS One 8 (9), S. e74287. DOI: 10.1371/journal.pone.0074287.

207. Zecconi, Alfonso; Scali, Federico (2013): Staphylococcus aureus virulence factors in evasion

from innate immune defenses in human and animal diseases. In: Immunol Lett 150 (1-2), S. 12–

22. DOI: 10.1016/j.imlet.2013.01.004.

208. Ziebuhr, Wilma; Hennig, Susanne; Eckart, Martin; Kranzler, Hennes; Batzilla, Christoph;

Kozitskaya, Svetlana (2006): Nosocomial infections by Staphylococcus epidermidis: how a

commensal bacterium turns into a pathogen. In: Int J Antimicrob Agents 28 Suppl 1, S. S14-20.

DOI: 10.1016/j.ijantimicag.2006.05.012.

92

7 PUBLIKATION

Ergebnisse dieser Arbeit wurden veröffentlicht in:

Köhler J, Breitbach K, Renner C, Heitsch AK, Bast A, van Rooijen N, Vogelgesang S, Steinmetz I.

„NADPH-oxidase but not inducible nitric oxide synthase contributes to resistance in an acute

murine Staphylococcus aureus Newman pneumonia model.“

Microbes and Infection 13 (11), S. 914-922, 2011 May 27

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8 DANKSAGUNG

Ich danke Ivo Steinmetz und Katrin Breitbach für die hervorragende und ausdauernde Betreuung, sowie

die Möglichkeit, dass ich mit ihnen habe wissenschaftlich arbeiten können.

Intrazelluläres Überleben von Staphylococcus aureus in ... · puerperalis. Neben den...

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