Isolierung und Charakterisierung potentieller ... · Dieses Protein scheint als Gerüst zu dienen,...

Isolierung und Charakterisierung potentieller Kontrollelemente

der MEK Ste7p

von Saccharomyces cerevisiae

Dissertation

zur Erlangung des Grades

eines Doktors der Naturwissenschaften

der Fakultät für Biologie

der Ruhr-Universität Bochum

angefertigt im Institut für Physiologische Chemie,

Arbeitsgruppe für Biochemie der Differenzierung

der Fakultät für Medizin

vorgelegt von

Markus Neugebauer

aus Dinslaken

Bochum 1999

Erstgutachter: Prof. Dr. W. Duntze

Zweitgutachter: Prof. Dr. W. E. Weiler

Abgabe der Arbeit: 30. Juni 1999

Tag der mündlichen Prüfung: 6. September 1999

Inhaltsverzeichnis

I

Seite

Abkürzungen IV

1. Einleitung 1

2. Material und Methoden 10

2.1. Fein- und Biochemikalien 10

2.2. Saccharomyces cerevisiae-Stämme 11

2.3. Escherichia coli-Stämme 12

2.4. Plasmide 12

2.5. Genbibliothek 12

2.6. Antikörper 13

2.7. Synthetische Oligonucleotide 13

2.8. Methoden zur Kultivierung von Mikroorganismen 15

2.8.1. Kultivierung von Saccharomyces cerevisiae 15

2.8.2. Zelldichtebestimmung von S.cerevisiae-Flüssigkulturen 16

2.8.3. Kultivierung von Escherichia coli 16

2.8.4. Glycerindauerkulturen 17

2.9. Molekularbiologische Methoden 18

2.9.1. Präparation und Transformation CaCl2-kompetenter E. coli-Zellen 18

2.9.2. Amplifikation und Isolierung von Plasmid-DNA aus E. coli-Zellen 18

2.9.3. Amplifikation der verwendeten Genbibliothek 18

2.9.4. Präparation und Transformation LiAc-kompetenter S. cerevisiae-

Zellen

19

2.9.5. Isolierung von Plasmid-DNA aus S. cerevisiae-Zellen 20

2.9.6. Isolierung genomischer DNA aus S. cerevisiae-Zellen 20

2.9.7. PCR-Amplifikation von DNA-Fragmenten 21

2.9.8. Gendeletion durch homologe Rekombination 22

2.9.9. Sequenzierung von DNA 23

Inhaltsverzeichnis

II

2.9.10. Trennung von DNA in Agarosegelen 23

2.9.11. Isolierung von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen 23

2.9.12. Reinigung und Konzentrierung von DNA-Fragmenten 24

2.9.13. Quantifizierung von DNA 24

2.9.14. Restriktion von DNA-Molekülen 24

2.9.15. Ligation von DNA-Fragmenten 24

2.9.16. Phosphorylierung von 5’-DNA-Enden 25

2.10. Biochemische und immunologische Methoden 26

2.10.1. Herstellung von Proteinextrakten aus Hefezellen 26

2.10.2. SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese 27

2.10.3. Westernblotting und Immundetektion 27

2.10.4. β-Galaktosidase-Enzymtest mit flüssigen Hefekulturen (quantitativ) 28

2.10.5. β-Galaktosidase-Enzymtest membrangebundener Hefezellen

(qualitativ)

29

2.11. Hefegenetische Methoden 30

2.11.1. Konjugation (qualitativ) 30

2.11.2. Sporulation 30

2.11.3. Separation der Ascosporen 31

2.11.4. Quantitative Konjugation 31

2.12. Methoden des 2-Hybrid-Systems 32

2.12.1. Detektion von Proteininteraktionen in vivo mit dem 2-Hybrid-System 32

2.12.2. Segregation von pAS2-1-Plasmiden aus Hefezellen 33

3. Ergebnisse 35

3.1. Isolierung Ste7p-bindender Proteine durch das 2-Hybrid-Screening

einer Genbank

35

3.1.1. Systemvoraussetzungen des 2-Hybrid-Screenings 36

3.1.1.1. far1∆-Modifikation des 2-Hybrid-Stamms Y190 36

3.1.1.2. Konstruktion des ‘Bait’-Plasmids pAS2-1-STE7 38

3.1.1.3. Konstruktion eines FUS1P-lacZ-Reportersystems 41

3.1.2. Überprüfung der Systemvoraussetzungen 44

3.1.2.1. Kontrolle der Vitalität 44

Inhaltsverzeichnis

III

3.1.2.2. Kontrolle unspezifischer Reportergen-Aktivierung 45

3.1.2.3. Expressions- und Modifikationsüberprüfung des Ste7p-

Fusionsproteins

46

3.1.2.4. Überprüfung der funktionalen Integrität des Ste7p-Fusionsproteins 48

3.1.3. Isolierung potentieller Ste7p-Bindungspartner aus der pACT2-FRYL-

Genbank durch ein 2-Hybrid-Screening

52

3.1.4. Verifizierung der Protein-Interaktionen 53

3.2. Identifizierung der selektierten Ste7p-Bindungspartner 63

3.3. Charakterisierung Ste7p-bindender Proteine mit unbekannter

Zellfunktion

68

3.3.1. Voraussetzungen der phänotypischen Analysen 69

3.3.1.1. Deletionsmutationen der korrespondierenden Gene 69

3.3.1.2. Konstruktion eines Überexpressionsvektors für das Gen YLR033w 71

3.3.1.3. Kontrolle der Zytotoxizität und der Expression des Myc-Ylr033Wp-

Fusionsproteins

73

3.3.2. Phänotypische Untersuchungen zur Charakterisierung der Proteine mit

unbekannter Zellfunktion

76

3.3.2.1. Konfrontation mit dem Pheromon α-Faktor 76

3.3.2.2. Quantitative Konjugation 78

4. Diskussion 80

5. Zusammenfassung 93

6. Literatur 95

Abkürzungen

IV

Abkürzungen

Abb. Abbildung

AD Aktivierungsdomäne

Ade Adenin

Amp Ampicillin

As Aminosäuren

3-AT 3-Amino-1,2,4-triazol

ATP Adenosintriphosphat

BD Bindedomäne

bp Basenpaare

dNTP Desoxyribonucleosidtriphosphat

E. coli Escherichia coli

EDTA Ethylendiamintetraessigsäure

DMSO Dimethylsulfoxid

DNA Desoxyribonucleinsäure

g Erdbeschleunigung

His Histidin

KAc Kaliumacetat

kb Kilobasenpaare

kDa Kilodalton

LiAc Lithiumacetat

Leu Leucin

MAT Paarungstyp

MCS multiple Klonierungsstelle

min. Minuten

NaAc Natriumacetat

NaF Natriumfluorid

NH4Ac Ammoniumacetat

nm Nanometer

OD optische Dichte

ONPG ortho-Nitrophenyl-β-D-galaktopyranosid

ORF offener Leserahmen

PCR Polymerase Kettenreaktion

Abkürzungen

V

PEG Polyethylenglykol

PMSF Phenylmethylsulfonylfluorid

PPi Pyrophosphat

Pwo Pyrococcus woesei

RT Raumtemperatur

SDS Natriumdodecylsulfat

sec. Sekunden

Taq Thermus aquaticus

TCA Trichloressigsäure

Tris Tris-(hydroxymethyl-)aminomethan

Trp Tryptophan

Ura Uracil

v/v Volumen pro Volumen

w/v Gewicht pro Volumen

X-Gal 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-galaktopyranosid

1. Einleitung

1

1. Einleitung

Die Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae ist der am besten charakterisierte, niedere

Eukaryont und bietet sich hinsichtlich vieler Stoffwechsel- und Regulationsvorgänge als

Modellorganismus für höher organisierte Metazoen an.

Um auf extrazelluläre Einflüsse bzw. Umweltveränderungen physiologisch reagieren zu

können, besitzt dieser Einzeller verschiedene Signalübertragungswege, die in der

Evolution stark konserviert bis zu den Mammaliern als MAPK (mitogen aktivierte

Proteinkinase) bzw. ERK (extrazellulär regulierte Kinase) -Aktivierungswege wiederzu-

finden sind.

Dabei werden Signale an der Zelloberfläche von Rezeptoren detektiert und

zytoplasmatisch über sequentielle Proteinkinasereaktionen zu multiplen Effektoren im

Zellkern und zu anderen Zielorten übertragen.

Das zentrale Modul dieser Signaltransduktionskaskaden besteht aus der MAPK bzw.

ERK, die durch eine vorgeschaltete MAPK/ERK-Kinase (MEK) phosphoryliert und

aktiviert wird. Diese MEK wird vorher selbst von einer übergeordneten MAPK/ERK-

Kinase-Kinase (MEKK) durch Phosphorylierung aktiviert (Blumer und Johnson, 1994).

Von S. cerevisiae sind bisher sechs Signalwege mit einer derartigen Strukturver-

wandtschaft zur Einleitung unterschiedlichster Zellprozesse bekannt. Diese steuern

einfache Differenzierungsprozesse und die Übergänge im Lebenszyklus, wie die

Konjugation und das invasive Wachstum bei haploiden Zellen sowie die Pseudo-

hyphenentwicklung und die Sporulation bei diploiden Zellen. Zwei weitere Signalwege

steuern die Zellwandbiosynthese und die Adaptation an hyperosmotische Bedingungen

(Herskowitz, 1995).

Hinsichtlich der einzelnen Komponenten, deren Wechselwirkungen und Rangfolge

zueinander ist unter diesen Signaltransduktionswegen der sogenannte Pheromonsignal-

weg bisher am besten charakterisiert.

1. Einleitung

2

Im Lebenszyklus von S. cerevisiae werden durch ihn alle relevanten Prozesse zur Vorbe-

reitung und Durchführung der Konjugation gesteuert. Dabei fusionieren jeweils zwei

haploide Zellen der entgegengesetzten Paarungstypen a und α zu einer diploiden Zelle

a/α. Die drei wesentlichen Reaktionen, die durch eine Signalwegaktivierung ausgelöst

werden, beinhalten die Synchronisation des Zellstadiums beider Konjuganten durch eine

Blockade des Zellteilungszyklus in der späten G1-Phase, die morphologische

Differenzierung (Ausbildung von Konjugationsfortsätzen) sowie die Expression

konjugationsrelevanter Gene, deren Produkte für die Agglutination, die darauf folgende

Plasmogamie und für die abschließende Karyogamie erforderlich sind (Konopka und

Fields, 1992)

Die Aktivierung dieses Signalwegs wird durch paarungstypspezifische, extrazelluläre

Signalpeptide, sogenannte Pheromone, initiiert. Das Pheromon des Paarungstyps α, das

als α-Faktor bezeichnet wird, ist ein unmodifiziertes Tridecapeptid (Kurjan und

Herskowitz, 1982). Dagegen ist das Pheromon des Paarungstyps a (a-Faktor) ein

carboxyterminal methyliertes und farnesyliertes Dodecapeptid (Anderegg et al., 1988).

Frühe genetische Analysen führten zu einer Sammlung von Mutanten, die gegenüber

dem proliferationshemmenden Effekt dieser Pheromone resistent waren und die als ste-

Mutanten (steril) bezeichnet wurden. Die meisten Produkte der daraus abgeleiteten STE-

Gene sind im Pheromonsignalweg integriert (Hartwell, 1980), für den in der

Zwischenzeit noch weitere Komponenten gefunden und charakterisiert werden konnten.

Ein Modell des Pheromonsignalwegs, das die derzeitigen Kenntnisse der Signaltrans-

duktion von der Zellmembran bis zu den Zielorten vereinfacht zusammenfaßt, ist in

Abbildung 1 dargestellt.

1. Einleitung

3

Abb. 1: Modell des Pheromonsignalwegs von Saccharomyces cerevisiae (verändert nach Edwards et al., 1997)

Die Signaltransduktion wird durch die Bindung der Pheromone an die nur in haploiden

Zellen paarungstypspezifisch exprimierten Zelloberflächenrezeptoren initiiert. Deren

Stimulation aktiviert daraufhin in beiden Zelltypen den gleichen Signalweg. Der

α-Faktor-Rezeptor wird im Paarungstyp a durch das Gen STE2 (Burkholder und

Hartwell, 1985) und der a-Faktor-Rezeptor im Paarungstyp α durch das Gen STE3

(Hagen et al., 1986) codiert. Beide Rezeptoren besitzen durch ihre sieben

transmembranen Domänen eine strukturelle Homologie zu verschiedenen

Hormonrezeptoren in höheren Eukaryonten, die gewöhnlich mit einem heterotrimeren

G-Protein gekoppelt sind (Dohlman et al., 1991).

1. Einleitung

4

Auch in S. cerevisiae interagieren die Pheromonrezeptoren mit einem derartigen Gαβγ-

Proteinkomplex, dessen Untereinheiten durch die Gene GPA1 (Gα), STE4 (Gβ) und

STE18 (Gγ) codiert werden (Dietzel und Kurjan, 1987b; Whiteway et al., 1989). Bei

Stimulation des Rezeptors durch das Pheromon kommt es an der katalytischen Gα-

Untereinheit des Komplexes zu einem Guanin-Nucleotidaustausch (GDP => GTP),

wodurch ihre Affinität zu den anderen Untereinheiten reduziert wird. Der trimere

Komplex dissoziiert in das GTP-Gα-Protein und das die nachgeschalteten

Signalwegkomponenten aktivierende Gβγ-Dimer (Whiteway et al., 1989). Die

intrinsische GTPase-Aktivität der Gα-Untereinheit wird durch ein GTPase-aktivierendes

Protein (GAP) stimuliert, das durch das Gen SST2 codiert wird (Chan und Otte, 1982;

Apanovitch et al., 1998). Nach GTP-Hydrolyse kommt es durch eine Reassoziation der

drei Untereinheiten zu keiner weiteren Aktivierung des Signalwegs.

Auf welche Weise das Signal von dem Gβγ-Dimer an die sich anschließende

Proteinkinase-Kaskade übermittelt wird, ist noch nicht eindeutig aufgeklärt. Jedoch

konnte die Rangfolge der an der weiteren Signaltransduktion beteiligten Komponenten

durch epistatische Analysen ermittelt werden. Demzufolge ist die Signalübermittlung an

die nachfolgende MAPK-Kaskade von der Proteinkinase Ste20p abhängig (Leberer et

al., 1992; Ramer und Davis, 1993) .

Diese Kaskade setzt sich aus den Proteinkinase-Komponenten Ste11p (Chaleff und

Tatchell, 1985; Rhodes et al., 1990), Ste7p (Chaleff und Tatchell, 1985; Teague et al.,

1986), Fus3p (Elion et al., 1990) und Kss1p (Courchesne et al., 1989) zusammen, die

alle mit unterschiedlichen Domänen des Ste5p (Perlman et al., 1993) unabhängig

voneinander assoziieren. Dieses Protein scheint als Gerüst zu dienen, um die

Proteinkinasen zusammenzuführen und mit ihnen einen Signalübertragungskomplex zu

bilden (Marcus et al., 1994; Choi et al., 1994).

Durch in vitro Analysen konnte eine selektive Serin/Threonin-spezifische

Phosphorylierung des Ste11p durch Ste20p nachgewiesen werden (Wu et al., 1995).

1. Einleitung

5

Aktiviertes Ste11p wiederum phosphoryliert und aktiviert die Threonin/Tyrosin-

spezifische Proteinkinase Ste7p (Neiman und Herskowitz, 1994). Dazu sind die

Aminosäurereste Serin-359 und Threonin-363 essentiell (Yashar et al., 1995; Zheng und

Guan, 1994). Mittels der aktivierten Ste7p-Kinase werden die zwei partiell redundanten

Kinasen Fus3p und Kss1p durch die Phosphorylierung an den Threonin- und

Tyrosinresten eines TPEYP-Motivs aktiviert (Gartner et al., 1992; Ma et al., 1995).

Diese Mechanismen und die daran beteiligten Komponenten weisen eine große Überein-

stimmung zu den zentralen Modulen der MAPK-Regulationswege in höheren

Eukaryonten auf. Der davon am besten untersuchte Signalweg, dessen Aktivierung

durch Wachstumsfaktoren und Differenzierungsagonisten erfolgt, setzt sich aus den

homologen Kinasen Raf (MEKK), MEK1/2 (MEK) und ERK1/2 = p42/p44 (MAPK)

zusammen. Die außerordentliche Homologie der Einzelkomponenten beruht sowohl auf

strukturelle Übereinstimmungen (40 - 55 % Sequenzidentität der katalytischen Domäne)

als auch auf funktionale Übereinstimmungen durch die Phosphorylierungsmotive des

Substrats (TPXYP-Konsensus bei MEK’s und PX(TP/SP)-Konsensus bei MAPK’s). In

Folge der Signalwegaktivierung wird eine Zellproliferation oder Zelldifferenzierung

ausgelöst (Brunet und Pouyssegur, 1997; Errede et al., 1995).

Bei S. cerevisiae werden in Abhängigkeit von der pheromoninduzierten Fus3p/Kss1p-

Aktivierung zwei wichtige Folgereaktionen eingeleitet.

Beide Enzyme sind unabhängig voneinander in der Lage, den Transcriptionsfaktor

Ste12p zu aktivieren (Elion et al., 1991). Die Signifikanz der damit korrelierten

Phosphorylierungen ist noch nicht eindeutig geklärt (Hung et al., 1997; Song et al.,

1991). Aktiviertes Ste12p initiiert die Transcription vieler konjugationsrelevanter Gene

(u.a. FUS1 und FAR1) durch die Bindung an spezifische Promotorbereiche, die als

‘Pheromon response elements’ (PRE’s) bezeichnet werden (Sprague, 1991).

1. Einleitung

6

Der zur Konjugation erforderliche G1-Arrest des Zellteilungszyklus wird durch das

FAR1-Genprodukt herbeigeführt. far1-mutierte Zellen können durch eine Pheromon-

induktion nicht mehr in der G1-Phase des Zellzyklus arretiert werden, zeigen aber noch

eine normale Transcriptionsaktivierung (Chang und Herskowitz, 1990). Far1p, auch als

CKI (cyclin-dependent kinase inhibitor) bezeichnet, wird in der frühen G1-Phase

akkumuliert (Oehlen et al., 1996) und ausschließlich durch aktiviertes Fus3p

phosphoryliert (Peter et al., 1993). Als Folge dieser Modifikation wird die Assoziation

mit einem für die Zellzyklusprogression essentiellen Komplex, bestehend aus der CDK

(cyclin-dependent kinase) Cdc28p und einem der drei redundanten, G1-spezifischen

Cycline Cln1p, Cln2p oder Cln3p, ermöglicht. Durch die damit einhergehende

Kinaseinhibierung ist die Progression von der G1- zur S-Phase im Zellzyklus nicht mehr

gewährleistet, und die Zellen verharren in der späten G1-Phase an einem Kontrollpunkt,

der als ‘Start’ bezeichnet wird (Tyers und Futcher, 1993; Peter und Herskowitz, 1994).

Dieser ist analog zu dem von höheren Eukaryontenzellen bekannten ‘Restriktionspunkt’.

Neben der pheromoninduzierten Genexpression und dem G1-Arrest ist die

morphologische Differenzierung eine weitere wichtige Voraussetzung zur Erlangung

einer Paarungskompetenz. Das polarisierte Zellwachstum wird in Form eines Aktin-

Cytoskelettumbaus bei der Ausbildung von Konjugationsfortsätzen, ebenso wie bei der

Knospenbildung im vegetativen Lebenszyklus, u.a. durch einen Proteinkomplex

vermittelt. Daran sind die Proteine Cdc42p, eine essentielle Rho-homologe GTPase

(Johnson und Pringle, 1990), Cdc24p, ein essentieller Guanin-Nucleotid-

Austauschfaktor des Cdc42p und Bem1p, ein nichtessentielles Protein mit zwei SH3-

Domänen (Src homology 3) beteiligt (Chenevert et al., 1994; Lyons et al., 1996;

Peterson et al., 1994). Bem1p interagiert ebenfalls mit Ste5p, Ste20p und Aktin, und

wird deshalb als vermittelnde Komponente zwischen dem Pheromonsignalweg und dem

Cytoskelettumbau an der Plasmamembran angesehen (Leeuw et al., 1995).

1. Einleitung

7

Weitere zu diesem Zweck am Konjugationsfortsatz lokalisierte Proteine sind das Spa2p

(spindle pole antigen) und das Sph1p (Spa2p homolog), die mehrere strukturhomologe

Bereiche besitzen. Diese Domänen bestimmen teilweise die richtige Lokalisierung dieser

für die morphologische Differenzierung essentiellen Proteine (Arkowitz und Lowe,

1997; Roemer et al., 1998).

Problemstellung

Nach einer Aktivierung dieses Signalwegs durch Pheromoninduktion werden die Zellen

eines erfolglosen Konjugationsversuchs durch einen Inaktivierungsprozeß in den

vegetativen Lebenszyklus zurückgeführt (‘Recovery’) und mögliche Zellschäden eines

durch Daueraktivierung anhaltenden G1-Arrests vermieden.

Diese Adaptation haploider Zellen äußert sich offensichtlich bereits kurze Zeit nach

einer Pheromoninduktion durch den Wiedereintritt in die Proliferation.

Eine aktive Beendigung der Induktion erfolgt dabei sowohl durch die extrazelluläre

Proteolyse des Pheromons (MacKay et al., 1988) als auch durch die Internalisierung des

Pheromon-Rezeptorkomplexes (Jenness und Spatrick, 1986). Des weiteren ist zu einer

Desensibilisierung ebenfalls die Rückführung des aktivierten Signalwegs in den Grund-

zustand erforderlich. Im Gegensatz zu den gut charakterisierten Mechanismen der

Aktivierung, sind die antagonistischen Prozesse der Signalweginaktivierung noch nicht

so detailliert aufgeklärt.

Die meisten der bekannten Prozesse beschränken sich auf die Modulation der Fus3p-

MAPK, an deren Dephosphorylierung und damit verbundener Inaktivierung die

Threonin/Tyrosin-spezifische Phosphatase Msg5p beteiligt ist, die in Abhängigkeit von

einer Signalwegaktivierung exprimiert wird (Doi et al., 1994).

Eine zusätzliche Gegenregulation dieser MAP-Kinase erfolgt durch die Tyrosin-

spezifischen Phosphatasen Ptp3p und Ptp2p. Im Gegensatz zu Msg5p, dessen Aufgabe in

der Adaptation nach einer erfolgten Signalwegaktivierung liegt, werden diese

1. Einleitung

8

coregulierenden Phosphatasen unabhängig von der Signalwegaktivierung exprimiert und

erfüllen demnach eher die Aufgabe einer Determinierung der Basisaktivität (Zhan et al.,

1997).

Darüber hinaus sind die beiden MAP-Kinasen Fus3p und Kss1p auch durch eine

Retrophosphorylierung ihrer übergeordneten MEK Ste7p an den antagonistischen

Prozessen beteiligt. Diese aminoterminale Modifikation geht mit einer partiellen MEK-

Inaktivierung einher und wird deshalb als Rückkopplungsmechanismus zu einer

Begrenzung der Signalstärke (Attenuierung) verstanden (Errede und Ge, 1996; Zhou et

al., 1993).

Vergleichbare molekulare Mechanismen der Signalweginaktivierung sind bei

Säugerzellen wiederzufinden. So existieren für die extrazellulär regulierten Kinasen

(ERK) äquivalente Mechanismen der Dephosphorylierung und damit verbundener

Inaktivierung durch Threonin/Tyrosin- (Alessi et al., 1993; Shin et al., 1997; Sun et al.,

1993), Serin/Threonin- und Tyrosin-spezifische Proteinphosphatasen (Alessi et al.,

1995; Gopalbhai und Meloche, 1998), wobei die Identität der letztgenannten noch nicht

festgestellt werden konnte. Neben der auch hier bekannten MEK-Retrophosphorylierung

mit einer daraus resultierenden Attenuierung durch eine ERK (Brunet et al., 1994),

weisen in vitro- und in vivo-Experimente auf eine zusätzliche negative Regulation durch

die Serin/Threonin-spezifische Proteinphosphatase PP2A hin (Dudley et al., 1995;

Sontag et al., 1993).

Für S. cerevisiae ist eine derartige Inaktivierung der MEK Ste7p durch spezifische

Dephosphorylierung in vivo nicht bekannt, jedoch legt die Analogie der Mechanismen

und die Homologie der beteiligten Komponenten nahe, daß auch in diesen Zellen die

Retrophosphorylierung der Ste7p-Kinase nicht den einzigen Inaktivierungsmechanismus

darstellt und eine andere spezifische Inaktivierung durch eine Dephosphorylierung

möglich ist.

1. Einleitung

9

Einen Hinweis darauf geben die Untersuchungen von Errede und Ge (1996) die zeigten,

daß das Ste7p in vitro ein Substrat der PP2A ist und durch diese Proteinphosphatase

inaktiviert werden kann.

Diese Hinweise wurden zum Anlaß genommen, um der Frage nachzugehen, durch

welche Komponenten ein derartiger Ste7p-Inaktivierungsprozeß in vivo erfolgen könnte.

Im Rahmen dieser Arbeit sollte ihre Identität durch einen zielgerichteten

Methodenansatz festgestellt werden.

Dazu wurde die Isolierung entsprechender Komponenten (‘negative Kontrollelemente’)

aus einer Genbibliothek vorgesehen. Im Gegensatz zu den bisherigen methodischen

Ansätzen, durch die wichtige Komponenten der Desensibilisierung isoliert werden

konnten (4.), die aber nicht zu einer Identifizierung der hier angesprochenen

Kontrollelemente führten, sollte diese Isolierung nicht auf der Basis einer Protein-

funktionalität sondern ausschließlich durch das Protein-Protein-Bindungsverhalten in

vivo erfolgen.

Hierzu wurde das 2-Hybrid-System unter der Verwendung des Ste7p als Zielprotein

vorgesehen. Von den so isolierten Bindungspartnern sollten im Anschluß daran die

Proteine mit einer potentiellen Aufgabe als MEK-Kontrollelement in ihrer relevanten

Funktion überprüft werden.

2. Material und Methoden

10


2.1. Fein- und Biochemikalien

Amersham Buchler GmbH & Co KG, Braunschweig, BRDECL Westernblot-Detektionsreagens

Bachem, Heidelberg, BRDα-Faktor

Bio-Rad Laboratories GmbH, München, BRD30 % Acrylamid-/Bisacrylamid-Lösung, APS, Molekulargewichts-Proteinmarker

Boehringer Mannheim GmbH, Mannheim, BRDPwo DNA-Polymerase, Proteaseinhibitoren-Cocktail

Clontech Laboratories, Inc., Palo Alto, California, USAMatchmaker Two-Hybrid System 2

Difco Laboratories GmbH, Augsburg, BRDBacto-Agar, Bacto-Pepton, Bacto-Trypton, Hefe-Extrakt, Hefe-Stickstoffbasis

Eurogentec, Seraing, BelgienRestriktionsendonucleasen, Oligonucleotidsynthesen

Genomed GmbH, Bad Oeynhausen, BRDJetsorb Gelextraktions-Kit

Gibco BRL, Eggenstein, BRDLachssperm DNA-Lösung, T4-DNA-Ligase, Geneticin® (G418 Sulfat)

MBI Fermentas GmbH, St. Leon-Rot, BRDTaq DNA-Polymerase, dNTP-Mix, 1kb DNA-Leitermarker

Medac GmbH, Hamburg, BRDZymolyase 100T

Perkin-Elmer Corporation, Norwalk, Connecticut, USAABI PRISM™ Taq DyeDeoxy Terminator Cycle Sequenzierungs-Kit

Pharmacia-LKB GmbH, Freiburg, BRDT4-Polynucleotid-Kinase, pUC18 SmaI/BAP

Qiagen GmbH, Hilden, BRDQIAprep Spin Miniprep-Kit, QIAGEN-tip 100, QIAGEN-tip 500

Schleicher & Schuell GmbH, Dassel, BRDNYTRAN® 0,45 µm neutrale Nylontransfermembran, Einmal-Sterilfilter 0,2 µm,Nitrocellulosemembran 0,45 µm

Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Deisenhofen, BRD3-Amino-1,2,4-triazol, Cycloheximid, Ampicillin, Aminosäuren, Adenin, Uracil,Polyethylenglykol (P3640), Röntgenfilm Kodak BioMax MR, Orange G,pBR322 DNA-Marker

Nicht aufgeführte Chemikalien wurden in p.A.-Qualität von unterschiedlichenHerstellern aus der BRD bezogen.


11

2.2. Saccharomyces cerevisiae-Stämme

Stamm-bezeichnung MAT Genotyp

Referenz/Herkunft

Y190 a ura3-52 his3-200 lys2-801 ade2-101 trp1-901 leu2-3,112 gal4∆ gal80∆ cyhr2 LYS2::GAL1UAS-HIS3TATA-HIS3 URA3::GAL1UAS-GAL1TATA-lacZ

(Harper et al.,1993) /Clontech1

Y190∆ a ura3-52 his3-200 lys2-801 ade2-101 trp1-901 leu2-3,112 gal4∆ gal80∆ cyhr2 LYS2::GAL1UAS-HIS3TATA-HIS3 URA3::GAL1UAS-GAL1TATA-lacZ far1::kanMX4

diese Arbeit

381G-43A a SUP4-3(t.s.amber) cry1-1 his4-580amber trp1amber ade2-1tyr1 lys2 gal1 ste7amber

(Hartwell,1980)

FY1679 a/α ura3-52/ura3-52 trp1∆63/TRP1 his3∆200/HIS3leu2∆1/LEU2

(Winston etal., 1995)

X2180-1A a SUC2 mal mel gal2 CUP1 YGSC2

UTL-7A a ura3-52 trp1 leu2-3,112 FKZ3

ycl024w∆ a ura3-52 trp1 leu2-3,112 ycl024w::loxP-kanMX4-loxP diese Arbeit

yhl023c∆ a ura3-52 trp1 leu2-3,112 yhl023c::loxP-kanMX4-loxP diese Arbeit

ykr038c∆ a ura3-52 trp1 leu2-3,112 ykr038c::loxP-kanMX4-loxP diese Arbeit

yol078w∆ a ura3-52 trp1 leu2-3,112 yol078w::loxP-kanMX4-loxP diese Arbeit

FY1679-1A α ura3-52 trp1∆63 leu2∆1 diese Arbeit

FYα-ycl024w∆ α ura3-52 trp1∆63 leu2∆1 ycl024w::loxP-kanMX4-loxP diese Arbeit

FYα-yhl023c∆ α ura3-52 trp1∆63 leu2∆1 yhl023c::loxP-kanMX4-loxP diese Arbeit

FYα-ykr038c∆ α ura3-52 trp1∆63 leu2∆1 ykr038c::loxP-kanMX4-loxP diese Arbeit

FYα-yol078w∆ α ura3-52 trp1∆63 leu2∆1 yol078w::loxP-kanMX4-loxP

diese Arbeit

FYα-yol087c∆ α ura3-52 his3∆200 leu2∆1 yol087c::loxP-kanMX4-loxP EUROSCARF4

FY1679-7C a ura3-52 his3∆200 diese Arbeit

FYa-ycl024w∆ a ura3-52 his3∆200 ycl024w::loxP-kanMX4-loxP diese Arbeit

FYa-yhl023c∆ a ura3-52 his3∆200 yhl023c::loxP-kanMX4-loxP diese Arbeit

FYa-ykr038c∆ a ura3-52 his3∆200 ykr038c::loxP-kanMX4-loxP diese Arbeit

FYa-yol078w∆ a ura3-52 his3∆200 yol078w::loxP-kanMX4-loxP diese Arbeit

FYa-yol087c∆ a ura3-52 trp1∆63 yol087c:: loxP-kanMX4-loxP EUROSCARF4

1 Clontech Laboratories, Inc., Palo Alto, California, USA2 Yeast Genetic Stock Center, University of California, Berkeley, USA3 F. K. Zimmermann, Technische Hochschule Darmstadt, BRD4 EUROPEAN SACCHAROMYCES CEREVISIAE ARCHIVE FOR FUNCTIONAL ANALYSIS, Johann Wolfgang Goethe-Universität Frankfurt, BRD


12

2.3. Escherichia coli-Stämme

Stamm-bezeichnung Genotyp

Referenz/Herkunft

TG1 supE hsd∆5 thi ∆(lac-proAB) F’[traD36proAB+ lacIq lacZ∆M15]

(Gibson, 1984)

DH5α supE44 ∆lacU169 (φ80 lacZ∆M15) hsdR17recA1 endA1 gyrA96 thi-1 relA1

(Hanahan, 1983)

2.4. Plasmide

Plasmidbezeichnung Referenz/HerkunftYEp13 (Broach et al., 1979)pAS2-1 (Harper et al., 1993) / Clontech1

pAS2-1-STE7 diese ArbeitpACT2 (Durfee et al., 1993) / Clontech1

pVA3-1 (murine p53(72-390) in pAS2-1) (Iwabuchi et al., 1993) / Clontech1

pLAM5’-1 (human lamin C(66-230) in pAS2-1) (Bartel et al., 1993) / Clontech1

pTD1-1 (SV40 large T-antigen(84-708) in pACT2) (Li und Fields, 1993) / Clontech1

pCL1 (Wildtyp GAL4 in YCp50-Derivat) (Fields und Song, 1989) / Clontech1

YEp357R (Myers et al., 1986)YEp357R-LEU2-FUS1P diese ArbeitpRS6myc (Erdmann und Blobel, 1996)pRS6myc-YLR033w diese ArbeitpFA6-kanMX4 (Wach et al., 1994)pUG6 (Güldener et al., 1996)pUC18 (Yanisch-Perron et al., 1985)

1 Clontech Laboratories, Inc., Palo Alto, California, USA

2.5. Genbibliothek

Bezeichnung pACT2-FRYL-GenbibliothekVektor pACT2Insertierte DNA ~ 0,8 - 2,5 kb-Fragmente genomischer DNA des Stamms

Ym955: (MATa ura3-52 his3-200 ade2-101 lys2-801leu2-3,112 trp1-901 tyr1-501 gal4-542 gal80-538)

Genregulation konstitutiver ADH1-FremdpromotorE. coli-Wirt MR32Zahl unabhängiger Klone ~ 5 x 106

Referenz/Herkunft (Fromont-Racine et al., 1997)


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2.6. Antikörper

Bezeichnung Referenz/HerkunftMaus α-Human Myc-Epitop, monoklonal, 9E10 (Evan et al., 1985)

Kaninchen α-S. cerevisiae Gal4p(BD), polyklonal Santa Cruz Biotechnology, Inc.,Santa Cruz, California, USA

Ziege α-Maus IgG - Peroxidase(Zweitantikörper-Konjugat), polyklonal

Sigma-Aldrich Chemie GmbH,Deisenhofen, BRD

Ziege α-Kaninchen IgG - Peroxidase(Zweitantikörper-Konjugat), polyklonal

Sigma-Aldrich Chemie GmbH,Deisenhofen, BRD

2.7. Synthetische Oligonucleotide

Genomische Substitutionen

Bezeichnung Basensequenz1 (5’ →→ 3’)FARKAN(FW) ATCCACTGGAAAGCTTCGTGGGCGTAAGAAGGCAATA-

TATTAATGcgtacgctgcaggtcgacFARKAN(RE) AAAAGCAAAAGCCTCGAAATACGGGCCTCGATTCCCG-

AACTACTAatcgatgaattcgagctcgYCLKAN(FW) CTTGATAATAGTGCTGACGTAAATTACCAGAACTACT-

GCAGTATGcagctgaagcttcgtacgcYCLKAN(RE) CAAGAGTACGCTGTTAGGTGGCTTTTTTACTGTAGTA-

GGGCATTCataggccactagtggatctgYHLKAN(FW) GGGAACAGAGTCATCTTTTGGGTAGAAACTAAGCTTC-

AATGGATGcagctgaagcttcgtacgcYHLKAN(RE) GTTACAATAGAGAGATTTACCAATGGTGTATCTCGAT-

TAAATACTataggccactagtggatctgYKRKAN(FW) CCTGTAATATCGCTTTATACGGAAAAACTGAATTCTT-

TCATTATGcagctgaagcttcgtacgcYKRKAN(RE) ATTCGTAGTGTGAACATTAGGCTAACTGTAACAAAAA-

TCGTTAATataggccactagtggatctgYOLKAN(FW) ACAGTGTTTGTAAAACCCCCACCACACCATAATAAGA-

CGATAATGagctgaagcttcgtacgcYOLKAN(RE) ACCAAAATTAATGCTGGTAAGATGCAGTATAATGGG-

TTTTACTTAataggccactagtggatctg

1 Die zur Amplifikation des kanMX4-Moduls erforderliche Sequenz der Primerhybriden sind in kleinen Lettern notiert.


14

Genomische Substitutionsanalysen

Bezeichnung Basensequenz (5’ →→ 3’)kan(RE) ACCCATATAAATCAGCATCCFAR1(FW) CAGCGATGCAATTTTCAACAFAR1(RE) CAGCGTCACGATCTCCACTTYCL(FW) ATGCACACCTTCGTAAGAAGYHL(FW) AATGCCATCTCCTAGAATCGYKR(FW) GTAGAGGTACCAATTCGACGYOL78(FW) CATATTGGGTTGTACTACTGYOL87(FW) CTTGAAGAACGACTACATCG

Genomische Amplifikationen zur Klonierung von Genen

Bezeichnung Basensequenz1 (5’ →→ 3’) SchnittstellenSTE7(FW) GGTTGTTGCATATGTTTCAACGAAAGACT NdeISTE7(RE) CGCGGATCCTCAATGGGTTGATCTTTC BamHIFUS1P(FW) GGCAACCAGAACCGCTACT FUS1P(RE) GCCGAAATAACCGTGAGAAC YLR(FW) AATCGAAAGTTTTGATCATGACAGAAAGTG BclIYLR(RE) CTACCGCTGACTCGAGTTATTTCTTGTG XhoI

1 Substituierte, nicht homologe Basenpositionen sind in fetten Lettern notiert.

Amplifikation und Sequenzierung plasmidinsertierter DNA

Bezeichnung Basensequenz (5’ →→ 3’)pACT(FW) ACTATCTATTCGATGATGAAGATACCpACT(RE) AATTGAGATGGTGCACGATGCACApAS(FW) TCATCGGAAGAGAGTAGpRS(FW) CATATAGAAGTCATCG


15

2.8. Methoden zur Kultivierung von Mikroorganismen

2.8.1. Kultivierung von Saccharomyces cerevisiae

Die Kultivierung der Hefestämme erfolgte mit Ausnahme des Stamms 381G-43A bei

30°C in YEPD-Vollmedium oder unter Selektivbedingungen in synthetischen SD- bzw.

MV-Mangelmedien. Zur Anzucht adeninauxotropher Mutanten wurden die Medien bei

entsprechender Erfordernis mit 80 mg/l Adenin-Hemisulfat supplementiert.

Flüssigkulturen wurden in einem 5-fachen Gefäßvolumen aerob auf einem Schüttler bis

zum Erreichen der gewünschten Zelldichte inkubiert.

Zur Anzucht auf festen Nährböden wurde den Medien 2 % (w/v) Bacto-Agar zugesetzt.

Die aus Dauerkulturen in einem Verdünnungsausstrich beimpften Agarplatten wurden

bis zur Kolonienbildung 2 - 3 Tage inkubiert und nach Überprüfung der relevanten

Genmarker als Stammplatten bei 4°C gelagert. Diese wurden im Turnus von zwei

Wochen erneuert.

Alle Medien wurden durch Autoklavieren (20 min. 121°C) sterilisiert.

YEPD-Medium MV-Medium1 % (w/v) Hefe-Extrakt 0,67 % (w/v) Hefe-Stickstoffbasis ohne2 % (w/v) Bacto-Pepton Aminosäuren2 % (w/v) Glucose 2 % (w/v) Glucose

SD-MediumMV-Medium + 10 % (v/v) Aminosäuren/Basen-Stammlösung(pH 5,8) 0,3 g/l L-Isoleucin

1,5 g/l L-Valin0,2 g/l L-Arginin HCl0,2 g/l L-Histidin HCl Monohydrat1,0 g/l L-Leucin0,3 g/l L-Lysin HCl0,2 g/l L-Methionin0,5 g/l L-Phenylalanin2,0 g/l L-Threonin0,2 g/l L-Tryptophan0,3 g/l L-Tyrosin0,2 g/l Uracil0,2 g/l Adenin-Hemisulfat

In Abhängigkeit von den notwendigen Selektivbedingungen wurdendie entsprechenden Aminosäuren und Basen ausgelassen.


16

Weiterhin wurden die verwendeten Hefemedien je nach Erfordernis mit folgenden

Komponenten supplementiert:

Stammlösung Medienkonzentrationα-Faktor 1 mg/ml in EtOH (= 0,59 mM) 10 nM - 3 µM3-Amino-1,2,4-triazol 1 M in H2O (sterilfiltriert) 25 mMCycloheximid 1 mg/ml in H2O (sterilfiltriert) 10 µg/mlCuSO4 2,5 mg/ml in H2O (sterilfiltriert) 25 µg/mlGeneticin 10 mg/ml in H2O (sterilfiltriert) 0,2 mg/ml

2.8.2. Zelldichtebestimmung von S. cerevisiae-Flüssigkulturen

Bei der Erfordernis genauer Zelldichtebestimmungen erfolgten diese mit dem Coulter

Counter (Modell Industrial D, Coulter Electronics, Ltd., Luton, Bedfordshire, England).

Dazu wurde ein 0,5 ml Kulturaliquot zunächst zur Auflösung von Zellaggregaten 10 sec.

bei einer Leistung von 50 Watt mit einem Ultraschallgerät (Labsonic 2000, Braun

Melsungen AG, Melsungen, BRD) behandelt und anschließend mit einer

Elektrolytlösung (ISOTON II, Coulter Electronics) 1:50 verdünnt. Aus dem Zählwert

ergab sich mit Hilfe einer Koinzidenz-Korrekturtabelle die Zelldichte.

Alternativ dazu wurden die Zelldichten anhand der optischen Dichte mit dem Spektral-

photometer V-530 (Jasco GmbH, Groß-Umstadt, BRD) bei einer Wellenlänge von

600 nm bestimmt. Dabei entspricht eine OD600 von 1 der Zelldichte von ~ 3 x 107/ml

(Ausubel et al., 1994).

2.8.3. Kultivierung von Escherichia coli

Die Kultivierung von E. coli-Stämmen erfolgte bei 37°C in LB-Medium. Für Stämme

mit einem plasmidlokalisierten β-Lactamase-Gen wurde dem Medium 100 µg/ml

Ampicillin aus einer Stammlösung (10 mg/ml, sterilfiltriert) zugesetzt. Flüssigkulturen

wurden in einem 5-fachen Gefäßvolumen aerob auf einem Schüttler bis zum Erreichen


17

der gewünschten Zelldichte inkubiert. Die Zelldichtebestimmung erfolgte mit dem

Spektral-photometer V-530 (Jasco GmbH, Groß-Umstadt, BRD) bei einer Wellenlänge

von 600 nm. Eine OD600 von 1 entspricht der Zelldichte von 0,66 - 1,0 x 109/ml in

Abhängigkeit von dem verwendeten E. coli-Stamm.

Zur Anzucht auf festen Nährböden wurde den Medien 1,5 % (w/v) Bacto-Agar

zugesetzt. Die aus Dauerkulturen in einem Verdünnungsausstrich beimpften Agarplatten

wurden über Nacht inkubiert und als Stammplatten bei 4°C gelagert. Die Stammplatten

wurden im Turnus von zwei Wochen erneuert.

Die verwendeten Medien wurden durch Autoklavieren (20 min. 121°C) sterilisiert und

bis zum Gebrauch bei 4°C aufbewahrt.

LB-Medium1,0 % (w/v) Bacto-Trypton0,5 % (w/v) Hefe-Extrakt1,0 % (w/v) NaClpH 7,5 (NaOH)

2.8.4. Glycerindauerkulturen

Die Stämme von S. cerevisiae und E. coli wurden in 50 % (v/v) Glycerin bei -70°C

aufbewahrt und jährlich überprüft.


18

2.9. Molekularbiologische Methoden

2.9.1. Präparation und Transformation CaCl2-kompetenter E. coli-Zellen

Die Präparation von CaCl2-kompetenten E. coli-Zellen und deren Transformation mit

Plasmid-DNA erfolgte nach den Angaben der bei Sambrook et al. (1989) beschriebenen

Methoden. Die Selektion der Transformanten erfolgte auf LB-Amp-Agarplatten.

2.9.2. Amplifikation und Isolierung von Plasmid-DNA aus E. coli-Zellen

Aus den nach 2.8.3. in einem Kulturvolumen von 4 ml, 25 ml oder 100 ml gezüchteten

Zellen wurden die Plasmide im Mini-, Midi- oder Maxi-Präparationsmaßstab mittels des

QIAprep Spin Miniprep-Kit, QIAGEN-tip 100 oder QIAGEN-tip 500 der Firma Qiagen

durch eine Adsorption an Silicagel-Membranen bzw. Anionenaustauscher nach den

Angaben des Herstellers isoliert. Die DNA-Konzentrationen der Plasmideluate wurden

nach 2.9.13. bestimmt. Die Ausbeuten betrugen dabei maximal 20 µg, 100 µg bzw.

500 µg Plasmid-DNA. Eine Lagerung erfolgte bei -20°C.

2.9.3. Amplifikation der verwendeten Genbibliothek

Um die durch den Vermehrungsprozeß bedingten Quantitätsasymmetrien zwischen den

einzelnen Plasmidspezies zu reduzieren, wurde die Kultivierung der E. coli-Zellen zur

Amplifikation der darin enthaltenen Genbankplasmide auf festen Nährböden in großen

Petrischalen (φ 15 cm) durchgeführt. Dazu wurde der Glycerin-Dauerkultur zunächst

ein Aliquot entnommen, mehrere sukzessive Verdünnungen auf LB-Amp-Medium

ausplattiert und der Zelltiter anhand der Kolonienanzahl nach einer Inkubation über

Nacht (37°C) bestimmt.


19

Mit einer daraus resultierenden Verdünnung wurde ein Mehrfaches der als ‘Anzahl

unabhängige Klone’ angegebenen Zellen auf LB-Amp-Nährböden ausplattiert. Die

Zelldichte wurde dabei auf ~ 80.000/Platte begrenzt, um ein konfluierendes Kolonien-

wachstum zu vermeiden. Nach einer Inkubation über Nacht bei 37°C wurden die Zell-

kolonien durch zweimaliges Spülen der Nährböden mit Medium abgewaschen und die

Zelldichte der Suspension nach 2.8.3. bestimmt. Diese wurde daraufhin in die für Maxi-

Plasmidpräparationen erforderlichen Zellmengen aliquotiert, die Zellen sedimentiert

(15 min. 6.000 x g 4°C) und jedes Pellet in 10 ml Puffer P1 (50 mM Tris-HCl pH 8,0

10 mM EDTA) resuspendiert. Die weitere Maxipräparation der Plasmide erfolgte

unmittelbar nach 2.9.2. oder zu einem späteren Zeitpunkt mit den bei -20°C gelagerten

Zellaliquots.

Die Konzentrationen und Ausbeuten dieser Präparationen wurden nach 2.9.13. bestimmt

und die Isolate bei -20°C gelagert, bis sie zur Transformation von Hefezellen verwendet

wurden.

2.9.4. Präparation und Transformation LiAc-kompetenter S. cerevisiae-Zellen

Zur einfachen Routinetransfomation von Hefezellen mit Plasmid-DNA wurden Zell-

kolonien von Agarplatten entnommen und damit das ‘Quick and Easy’-Transformations-

protokoll nach Gietz und Woods (1994) durchgeführt.

Bei der Notwendigkeit einer höheren Transformationseffizienz wurde die Anzucht und

die Transformation der Hefezellen nach der Methode von Gietz et al. (1992) mit einer

10 % (v/v) DMSO-Supplementierung vor dem Hitzeschock nach Hill et al. (1991)

durchgeführt. Dieses Protokoll wurde zur Transformation von Hefezellen mit der

Plasmid-Genbibliothek und mit den Gen-Deletionskassetten verwendet.

Die Ausplattierungen der Transformanten erfolgten auf entsprechenden Selektivagar-

platten.


20

2.9.5. Isolierung von Plasmid-DNA aus S. cerevisiae-Zellen

Von einer stationären S. cerevisiae-Kultur in Selektivmedium wurden 1,5 ml 5 Minuten

bei 2.000 x g sedimentiert, der Überstand abgenommen und zu dem Zellpellet 200 µl

Aufschlußpuffer, 200 µl Glasperlen (φ = 0,5 mm) und 200 µl Phenol/Chloroform/

Isoamylalkohol (25:24:1 v/v/v) gegeben. Nach 2 min. Schütteln auf einem Vortex und

5 min. Zentrifugation (16.000 x g) wurde der wässrige Überstand mit 1/10 Vol. 10 M

NH4Ac-Lösung und 2,5 Vol. Ethanol versetzt und die enthaltene DNA 10 min. auf Eis

gefällt. Nach einer Sedimentation (10 min. 16.000 x g) wurde das Pellet mit 70 % (v/v)

Ethanol gewaschen, getrocknet und in TE-Puffer resuspendiert. Diese Plasmidlösung

konnte zur Transformation von E. coli-Zellen eingesetzt werden.

Aufschlußpuffer2 % (v/v) Triton X-1001 % (w/v) SDS100 mM NaCl1 mM EDTA10 mM Tris-HCl pH 8,0

2.9.6. Isolierung genomischer DNA aus S. cerevisiae-Zellen

Diese Präparation erfolgte nach einer Standardmethode. Einer Sphäroplastierung mit

Zymolyase folgte eine SDS-Lyse der Zellen mit anschließender KAc-Fällung der

Proteine und Ethanolpräzipitation der DNA nach Struhl et al. (1979).


21

2.9.7. PCR-Amplifikation von DNA-Fragmenten

Als Vorlage-DNA (Template) wurden bei der Polymerase-Kettenreaktion (PCR)

isolierte Plasmide (10 - 100 ng), genomische DNA (0,1 - 0,2 µg) oder Plasmide bzw.

genomische DNA microwellenlysierter Hefezellen verwendet. Zur Herstellung von

Microwellen-lysaten wurde eine mittelgroße Zellkolonie eine Minute bei max. Energie

in der Microwelle lysiert.

Die PCR-Ansätze enthielten weiterhin 1x PCR-Puffer, 0,2 mM dNTP’s, 1 µM Primer,

2,5 mM MgCl2 und 2,5 U DNA-Polymerase bei 50 µl Gesamtvolumen in besonders

dünnwandigen 0,5 ml PCR-Reaktionsgefäßen (Molecular Bio-Products, San Diego,

California, USA). Die Reaktionen wurden im Biometra TRIO-Thermoblock (Biometra

GmbH, Göttingen, BRD) mit Heizdeckel folgenden Bedingungen unterworfen:

2,0 min. 94°C Denaturierung0,5 min. 94°C Denaturierung0,5 min. 45 - 60°C Hybridisierung 25 - 30 Zyklen1,5 min. 72°C DNA-Synthese4,0 min. 72°C DNA-Restsynthese

Zu analytischen Routinezwecken wurden die Reaktionen mit Taq-DNA-Polymerase

durchgeführt und anschließend auf einem Agarosegel getrennt. Bei vorgesehener

Klonierung der Syntheseprodukte wurden die Reaktionen mit Pwo-Proofreading-DNA-

Polymerase und einer reduzierten Anzahl der Zyklen (≤ 25), oder im Fall der Ampli-

fikation von Gen-Deletionskassetten mit einem Taq/Pwo-Gemisch (5:1) bei ≤ 28 Zyklen

durchgeführt.

Bei der Notwendigkeit einer Konzentrierung und Reinigung wurden die

Syntheseprodukte anschließend durch die Zugabe von 1/10 Vol. 3 M NaAc-Lösung und

2,5 Vol. Ethanol 10 min. auf Eis gefällt. Nach einer Sedimentation (20 min. 16.000 x g

4°C) wurde das Pellet mit 70 % (v/v) Ethanol gewaschen, getrocknet, in TE-Puffer

resuspendiert und ein Aliquot zur Analyse in einem Agarosegel getrennt.

TE-Puffer10 mM Tris-HCl pH 7,5 1 mM EDTA


22

2.9.8. Gendeletion durch homologe Rekombination

Die chromosomalen Deletionen von Genloci in S. cerevisiae erfolgten durch die

homologe Rekombination mit linearen Rekombinationskassetten. Diese bestanden aus

dem Modul des heterologen Resistenzmarkers kanMX4 (kanr-Strukturgen mit

regulatorischen Bereichen), das von kurzen, homologen Zielsequenzen des Genoms

flankiert war. Im Gegensatz zu auxotrophen Komplementationsmarkern wie HIS3 oder

LEU2 bleiben hierbei vorhandene Auxotrophien in den Zellen für andere

Selektionszwecke erhalten und die Rekombinationsorte beschränken sich im

Wesentlichen auf den Ziellocus.

Die zur Rekombination erforderlichen Kassetten wurden durch PCR-Amplifikationen

nach 2.9.7. erzeugt (Baudin et al., 1993; Wach et al., 1994). Die dazu verwendeten

Hybrid-Primer bestanden an den 5’-Enden aus 45 bp einer Sequenz, die zu den nicht-

codierenden Bereichen des Ziellocus homolog waren und an den 3’-Enden aus 19 - 20

bp einer Sequenz, die zu den Anfangs- und Endsequenzen des Resistenzmarkers

homolog waren. Als Template dieser Reaktionen dienten die Vektoren pFA6 (Wach et

al., 1994) oder pUG6 mit dem darin integrierten kanMX4-Markermodul. Das Konstrukt

pUG6 besitzt zusätzlich flankierende loxP-Rekombinationssequenzen zum Verlust des

Resistenzmarkers aus dem Genom (Güldener et al., 1996). Durch dieses System sind

Mehrfachdeletionen mit einem einzigen Selektionsmarker möglich, was jedoch im

Rahmen dieser Arbeit keine Anwendung fand.

Nach einer Transformation von S. cerevisiae (2.9.4.) mit diesen Deletionskassetten

ließen sich die Zellen mit stabilen Genomrekombinationen auf YEPD-Medium plus 200

µg/ml Geneticin (G418) als G418r-Mutanten selektieren. Die Überprüfung einer

korrekten Substitution am vorgesehenen Locus erfolgte durch PCR mit

Microwellenlysaten der selektierten Mutanten als Template (2.9.7.). Die dazu

verwendeten Primerpaare waren jeweils zu einer genomischen Sequenz außerhalb des

Ziellocus (sense) und zu einer Sequenz im kanr-Strukturgen (antisense) homolog. Eine

Analyse der Produkte erfolgte durch die Trennung in Agarosegelen (2.9.10.).


23

2.9.9. Sequenzierung von DNA

Die Sequenzierungsreaktionen wurden mit dem ‘ABI PRISM™ Taq DyeDeoxy

Terminator Cycle Sequenzierungs-Kit’ (Perkin-Elmer Corporation, Norwalk,

Connecticut, USA) nach Herstellerangaben im Biometra TRIO-Thermoblock (Biometra

GmbH, Göttingen, BRD) mit Heizdeckel durchgeführt. Als Vorlage-DNA (Template)

wurden 0,5 µg Plasmid-DNA oder 50 ng isolierte PCR-Fragmente in die 25 Zyklen

umfassende PCR-Reaktion eingesetzt. Die Auswertung erfolgte mit dem ABI 373 DNA-

Sequencer (Perkin-Elmer).

2.9.10. Trennung von DNA in Agarosegelen

Die elektrophoretische Trennung von DNA-Fragmenten erfolgte bei einer Feldstärke

von 5 V/cm durch 0,8 - 2,0 % (w/v) Agarosegele in TBE-Puffer. Durch das in der

Agarose-lösung enthaltene Ethidiumbromid (1 µg/ml) konnte die DNA mit einer UV-

Lichtquelle (254 nm) durch Fluoreszenz visualisiert werden.

Als Größenstandard diente der ‘1kb DNA-Leitermarker’ (MBI Fermentas GmbH) mit

den Fragmentgrößen 10/8/6/5/4/3,5/3/2,5/2/1,5/1/0,75/0,5/0,25 kb. Soweit keine anderen

Angaben erfolgen, wurden davon 0,3 µg zur elektrophoretischen Trennung eingesetzt.

TBE-Puffer (10x) Probenauftragungspuffer (6x)900 mM Tris-Base 40 % (w/v) Saccharose in H2O900 mM Borat 0,4 % (w/v) Orange G 20 mM EDTA (pH 8,0)

2.9.11. Isolierung von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen

Die Rückgewinnung von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen erfolgte mit dem Jetsorb

Gelextraktions-Kit (Genomed GmbH, Bad Oeynhausen, BRD) unter der Verwendung

von DNA-bindenden Silica-Gelpartikeln nach den Angaben des Herstellers.


24

2.9.12. Reinigung und Konzentrierung von DNA-Fragmenten

Alternativ zu einer Phenolextraktion mit anschließender Ethanol-Präzipitation wurden

die DNA-Fragmente durch die Verwendung von DNA-bindenden Silica-Gelpartikeln

des Jetsorb Gelextraktions-Kit sowohl von Salzen und Enzymen befreit, als auch in ihrer

Konzentration gesteigert. Das Protokoll ist entsprechend einer Isolierung aus Agarose-

gelen, wobei das Gelvolumen durch die DNA-Lösung und H2O ersetzt wird.

2.9.13. Quantifizierung von DNA

Die Konzentrationen von DNA in Lösungen wurden mit Quarzglasküvetten im

Spektralphotometer V-530 (Jasco GmbH, Groß-Umstadt, BRD) bei einer Wellenlänge

von 260 nm bestimmt. Eine OD260 von 1 entspricht dabei ~ 50 µg doppelsträngiger DNA

oder ~ 20 µg einzelsträngiger Oligonucleotide. Verunreinigungen wurden durch den

Quotienten OD260/OD280 erfaßt, der optimal zwischen 1,8 und 2 liegen sollte.

2.9.14. Restriktion von DNA-Molekülen

Die Restriktion von DNA-Molekülen (0,1 - 0,5 µg / 10 µl Ansatz) erfolgte unter den

individuellen Puffer- und Temperaturbedingungen für die jeweilige Endonuclease nach

Herstellerangaben bei einer Inkubationsdauer von 1 Stunde.

2.9.15. Ligation von DNA-Fragmenten

Zur Ligation wurden 50 - 200 ng linearisierte Plasmid-DNA mit der 1 - 2 fachen

molaren Menge Insert-DNA und 1 U T4-DNA-Ligase vereinigt. Die Reaktionen

erfolgten in einem Endvolumen von 10 - 20 µl mit dem Puffer des Herstellers über


25

Nacht bei 16°C. Um ungewollte Falschhybridisierungen von kohäsiven Fragmentenden

untereinander zu reduzieren, wurden die Ansätze vor der Enzymzugabe 5 min. auf 45°C

erhitzt und dann sofort in Eis überführt.

2.9.16. Phosphorylierung von 5’-DNA-Enden

In Vorbereitung auf die Einklonierung von stumpfen PCR-Fragment-Enden (aus Ampli-

fikationen mit Pwo-DNA-Polymerase) in einen stumpfendigen, dephosphorylierten

Vektor, wurde ~ 0,3 pmol dieser Fragmente zur 5’-Phosphorylierung in einem Volumen

von 20 µl mit 10 U T4-Polynucleotid-Kinase und 1 µM ATP im dazugehörigen Puffer

für 30 min. bei 37°C inkubiert. Das Enzym wurde durch eine Inkubation von 10 min. bei

68°C inaktiviert und die Produkte anschließend nach 2.9.12. gereinigt.


26

2.10. Biochemische und immunologische Methoden

2.10.1. Herstellung von Proteinextrakten aus Hefezellen

Die mit 5 ml einer Übernachtkultur angeimpfte Hauptkultur von 50 ml wurde bis zu

einer Zelldichte von OD600 ≅ 0,6 nach 2.8.1. kultiviert. CuSO4-Induktionen erfolgten

unmittelbar beim Ansetzen der Kultur, während Induktionen mit α-Faktor erst ~ 1,5

Stunden vor der Zellernte erfolgten. Die anschließende Präparation von Proteinextrakten

erfolgte nach einer sogenannten TCA-Methode (Clontech, Yeast Protocols Handbook).

Alle folgenden Schritte wurden auf Eis oder bei 4°C durchgeführt. Pro 7,5 OD600-

Einheiten des 5 min. bei 1.500 x g sedimentierten Zellmaterials wurden 100 µl TCA-

Puffer zur Resuspendierung des Zellpellets sowie 100 µl Glasperlen (φ = 0,5 mm) und

100 µl einer eiskalten 20 % (w/v) TCA-Lösung zum Zellaufschluß zugesetzt. Dieser

erfolgte 4 x 60 sec. auf einem Vortex mit zwischenzeitlichen Kühlpausen (30 sec. Eis).

Nach der Sedimentation der Glasperlen (1 min. Eis) wurde der Überstand in ein neues

Gefäß überführt und die Glasperlen mit 0,5 ml einer 1:1-Mischung aus 20 % (w/v) TCA-

Lösung und TCA-Puffer 2 x 60 sec. auf einem Vortex gewaschen und abermals

sedimentiert (1 min. Eis). Die beiden Überstände wurden vereinigt und 10 min. bei

16.000 x g zentrifugiert. Das sedimentierte Präzipitat wurde in 10 µl modifizierten SDS-

Probenpuffer pro 1 OD600-Einheit des eingesetzten Zellmaterials resuspendiert und der

pH-Wert gegebenenfalls mit 1 M Tris-Lösung nachgestellt. Vor der Gelauftragung

wurden die Proben 5 min. in kochendem Wasser inkubiert und unlösliche Bestandteile

durch Zentrifugation (5 min. 16.000 x g) sedimentiert.

TCA-Puffer SDS-Probenpuffer (modifiziert)20 mM Tris-HCl pH 8,0 62,5 mM Tris-HCl pH 6,850 mM Ammoniumacetat 2 % (w/v) SDS0,2 mM EDTA 10 % (v/v) GlycerinProtease-/Phosphataseinhibitoren: 5 % (v/v) β-Mercaptoethanol1 µl/ml Proteaseinhibitoren-Cocktail 0,001 % (w/v) Bromphenolblau1 mM PMSF Protease-/Phosphataseinhibitoren:10 mM PPi 1 µl/ml Proteaseinhibitoren-Cocktail10 mM NaF 1 mM PMSF

10 mM PPi

10 mM NaF


27

2.10.2. SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese

Die Elektrophorese zur Trennung von Proteinen erfolgte nach der Methode von

Laemmli (1970) in einem diskontinuierlichen Gelsystem. Das Trenngel wurde für die

Mini-Protean II-Elektrophoresekammer (Bio-Rad Laboratories GmbH, München, BRD)

mit den Maßen 80 x 50 x 0,75 mm erstellt. Es besaß eine Acrylamid-/Bisacrylamid-

Konzentration von 10%T / 3%C, während die des darauf geschichteten Sammelgels

4%T / 3%C betrug. Die Elektrophorese der aufgetragenen Proben wurde bei einer

konstanten Spannung von 180 V durchgeführt, bis das Bromphenolblau das Gelende

erreichte.

Elektrodenpuffer (5x)0,124 M Tris0,96 M Glycin0,5 % (w/v) SDS

2.10.3. Westernblotting und Immundetektion

Der Transfer von Proteinen aus Polyacrylamid-Gelen an eine aufliegende Nitrocellulose-

membran erfolgte in einem Sandwich aus zwei Doppellagen Whatman-Papier mit einer

Semi-Dry Blotkammer (Bio-Rad Laboratories GmbH, München, BRD) nach den

Angaben des Herstellers unter Verwendung des Transferpuffers nach Bjerrum und

Schafer-Nielsen (1986). Die Transferdauer betrug 30 - 45 min. bei einer maximalen

Stromdichte von 5 mA/cm2 Filterfläche.

Transferpuffer Ponceau S-Färbelösung (10x)48 mM Tris 30 % (w/v) Sulfosalicylsäure39 mM Glycin 30 % (w/v) TCA0,0375 % (w/v) SDS 2 % (w/v) Ponceau S20 % (v/v) Methanol


28

Die Markerbanden wurden durch eine reversible Ponceau S-Färbung (Sambrook et al.,

1989) auf den Blot eingetragen. Nach einer Entfärbung mit TBS-Puffer erfolgte die

Absättigung unspezifischer Bindestellen mit Blocking-Puffer für 1 Stunde. Darauf folgte

eine einstündige Inkubation mit den Primär-Antikörpern (1 : 500 der polyklonalen und

1 : 5.000 der monoklonalen Antikörper in Blocking-Puffer), 3 x 5 min. Waschen mit

TBST-Puffer und eine 30 min. Inkubation mit den Peroxidase konjugierten Sekundär-

Antikörpern (1 : 2000 in Blocking-Puffer). Nach 3 x 5 min. Waschen mit TBST-Puffer

und einmaligem Waschen mit TBS-Puffer konnten unter Verwendung des ECL

Westernblot-Detektionsreagens (Amersham Buchler GmbH & Co KG, Braunschweig,

BRD) die chemilumineszenten Signale mit einem Röntgenfilm nach Expositionszeiten

von 10 - 300 sec. detektiert werden.

Die Färbung und alle Inkubations- und Waschschritte der Immundetektion erfolgten bei

Raumtemperatur auf einem Schüttler.

TBS-Puffer TBST-Puffer Blocking-Puffer10 mM Tris-HCl pH 8,0 TBS-Puffer TBST-Puffer150 mM NaCl 0,05 % (v/v) Tween-20 5 % (w/v) Magermilch-

pulver

2.10.4. ββ-Galaktosidase-Enzymtest mit flüssigen Hefekulturen (quantitativ)

Der aus Vorkulturen auf eine Zelldichte von OD600 = 0,2 angeimpften Hauptkulturen

wurden in den vorgesehenen Zeitabständen Aliquots von 1 ml zur Zelldichtebestimmung

nach 2.8.2. und von 1,5 ml für den β-Galaktosidase-Enzymtest entnommen. Für den

Enzymtest wurden die Zellen mit Z-Puffer gewaschen (Sedimentation: 30 sec.

16.000 x g), 5-fach konzentriert und die Zellen von 100 µl Suspension durch dreimaliges

Schockgefrieren (1 min. flüssiger Stickstoff) und Auftauen (1 min. 37°C-Wasserbad)

permeabilisiert. Diesem Ansatz wurden 0,7 ml Z-Puffer mit β-Mercaptoethanol und

160 µl ONPG-Lösung als Substrat zugegeben und bei 30°C inkubiert, bis durch das

Spaltprodukt Nitrophenol eine ausreichende Gelbfärbung erzeugt wurde. Die Reaktion


29

wurde durch die Zugabe von 0,4 ml 1 M Na2CO3-Lösung gestoppt, die Zelltrümmer

sedimentiert (10 min. 16.000 x g) und die Extinktionen der Überstände bei 420 nm in

einem Spektralphotometer V-530 (Jasco GmbH, Groß-Umstadt, BRD) gemessen.

Die Aktivität in Units ergab sich aus dem Quotienten 1.000 x OD420/Reaktionszeit (min.)

x 0,5 ml Kulturvolumen x OD600 nach Miller (1972).

Z-Puffer ONPG-Lösung60 mM Na2HPO4∗7H20 0,4 % (w/v) ONPG in Z-Puffer pH 7,040 mM NaH2PO4∗H2010 mM KCl1 mM MgSO4∗7H20pH 7,0(+/- 2,7 µl/ml (v/v) β-Mercaptoethanol)

2.10.5. ββ-Galaktosidase-Enzymtest membrangebundener Hefezellen (qualitativ)

Von den auf Agarnährböden kultivierten Hefezellen (Kolonien oder Impfstriche) wurde

ein Replikationsabzug auf eine Nylontransfermembran erstellt. Die daran haftenden

Zellen wurden durch Schockgefrieren (10 sec. flüssiger Stickstoff) und Auftauen (2 min.

Raumtemperatur) permeabilisiert und die Membran anschließend auf ein mit Z-Puffer/

X-Gal-Lösung getränktes Whatman-Papier gelegt. Die Inkubation erfolgte bis zum

deutlichen Auftreten der Indol-Spaltprodukte bei 30°C für 1 - 10 Stunden.

X-Gal-Stammlösung4 % (w/v) X-Gal in N,N-Dimethylformamid

Z-Puffer/X-Gal-Lösung1,6 % (v/v) X-Gal-Stammlösung in Z-Puffer


30

2.11. Hefegenetische Methoden

2.11.1. Konjugation (qualitativ)

Frisch angezüchtete Zellen der zu konjugierenden Stämme wurden auf einer YEPD-

Platte miteinander vermengt und für 6 Stunden bei 30°C inkubiert. Die Isolierung der

gebildeten Zygoten erfolgte anhand der charakteristischen Morphologie mit der Hilfe

eines Mikromanipulators (Singer MSM System, Singer Instrument Co. Ltd., Somerset,

England) oder über die Komplementation von auxotrophen Selektionsmarkern auf

Minimalmedien.

2.11.2. Sporulation

Die Sporulationen wurden auf festen Nährböden durchgeführt. Dazu wurden die

diploiden Zellen zunächst über Nacht auf GNA-Präsporulationsmedium nach Miller et

al. (1955) bei 30°C kultiviert, auf Fogel’s Sporulationsmedium nach Fowell (1952)

überstempelt und bis zu einer Woche bei 30°C inkubiert.

GNA-Präsporulationsmedium Fogel’s Sporulationsmedium5,0 % (w/v) Glucose 0,89 % (w/v) Kaliumacetat1,0 % (w/v) Hefe-Extrakt 0,10 % (w/v) Glucose0,8 % (w/v) Nutrient Broth 0,25 % (w/v) Hefe-Extrakt

Die Ausbildung von Ascosporen wurde durch eine Sporenanfärbung überprüft. Diese

erfolgte mit Malachitgrün nach McClung (1943). Zur Gegenfärbung des Ascus wurde

dabei Safranin O verwendet.


31

2.11.3. Separation der Ascosporen

Die Asci der Sporulationsplatten wurden als Suspension zum partiellen Zellwandverdau

mit 100 µg/ml Zymolyase in 1 M Sorbitol bei 30°C für 10 min. inkubiert. Dieser Prozeß

wurde durch das Waschen der Zellen mit 1 M Sorbitol beendet. Die Asci wurden als

Impfstrich auf eine nivellierte YEPD-Platte übertragen und die Sporen jeder Tetrade mit

dem Mikromanipulator (Singer MSM System, Singer Instrument Co. Ltd., Somerset,

England) entsprechend der Vorschrift nach Sherman und Hicks (1991) systematisch

separiert. Zur Keimung und Kolonienbildung wurden die Platten 7 Tage bei 30°C inku-

biert. Im Anschluß daran wurden die Genmarker der Klone durch Replikaplattierungen

analysiert.

2.11.4. Quantitative Konjugation

Die quantitative Bestimmung des Konjugationsverhaltens von Hefestämmen erfolgte

nach einer Methode von Hartwell (1980). Die zu testenden Stämme wurden bis zu einer

Zelldichte von < 2 x 107/ml in YEPD-Medium kultiviert. 2 x 106 Zellen jedes Paarungs-

typs wurden vermengt auf einen sterilen Millipore-Filter (HA, 0,45 µm Porengröße,

φ 2,5 cm) aufgetragen und für 6 Stunden auf einem YEPD-Nährboden bei 30°C

inkubiert. Der anschließenden Resuspendierung in 10 ml YNB (1,7 g/l Hefe-

Stickstoffbasis ohne Aminosäuren, ohne Ammoniunsulfat, pH 5,8) folgte zur Auflösung

von Zellaggregaten eine 10 sec. Ultraschallbadbehandlung.

200 µl der in YNB erstellten 10-3- und 10-4-fachen Verdünnungen wurden auf MV-

Medium (plus eventuell erforderlicher Supplementierung) plattiert und durch die

Komplementation von auxotrophen Markern nur die gebildeten Zygoten (MATa/α)

selektiv angezüchtet. Ein weiteres Aliquot wurde auf MV-Medium mit zusätzlicher

Basen- bzw. Aminosäurensupplementierung aufgetragen und dadurch die gebildeten

MATa/α-Zellen und zusätzlich die MATa-Ausgangszellen selektiv kultiviert. Aus der

Anzahl der nach 3 Tagen bei 30°C gebildeten Kolonien ergab sich die Paarungseffizienz

aus dem Quotienten der MATa/α-Zellen : MATa/α-Zellen + MATa-Zellen.


32

2.12. Methoden des 2-Hybrid-Systems

2.12.1. Detektion von Proteininteraktionen in vivo mit dem 2-Hybrid-System

Diese Methode bedient sich der genetischen Selektion von Genen in S. cerevisiae, deren

Proteine in vivo interagieren (Chien et al., 1991; Fields und Song, 1989). Die Selektion

begründet sich auf eine Aktivierung von Reportergenen auf der Transcriptionsebene.

Kommt es in den Zellen zur Bindung zweier Proteine, deren codierende Sequenzen in

zwei unterschiedlichen Plasmidspezies (BD- und AD-Plasmid) vorliegen, so assoziieren

auch die daran fusionierten DNA-Binde- und Aktivierungsdomänen des Gal4p-

Transcriptionsfaktors. Diese Rekonstitution zu einer funktionalen Einheit bewirkt die

spezifische DNA-Bindung an einer genomischen GAL1-Enhancersequenz und

Aktivierung der dadurch regulierten, voneinander unabhängigen und mit

unterschiedlichen Promotoren versehenen Reportergene HIS3 und lacZ des verwendeten

S. cerevisiae-Stamms Y190 (Harper et al., 1993) bzw. Y190∆ (diese Arbeit). Während

das HIS3-Gen der Wachstumsselektion dient, kann durch das lacZ-Gen eine

kolorimetrische Signaldetektion erfolgen.

Im Rahmen des 2-Hybrid-Screenings wurde aufgrund der höheren Effizienz eine

sequentielle Cotransformation gegenüber einer simultanen Cotransformation bevorzugt.

Zunächst wurde das rekombinante BD-Plasmid (pAS2-1-Derivat) nach einer

Schnellmethode (2.9.4.) in die Zellen befördert, diese Trp+-Transformanten selektiv in

100 ml SD-Trp-Medium über Nacht angezüchtet und in 300 ml YEPD-Medium

verdünnt als Hauptkultur für 3 - 5 Stunden bis zur mittellogarithmischen

Wachstumsphase (OD600 ~ 0,6) kultiviert. Darauf folgte die zweite Transformation mit

der in AD-Plasmiden (pACT2) enthaltenen Genbibliothek nach dem zweiten der in

2.9.4. angeführten Protokolle. Pro großer Petrischale (φ 15 cm) mit einem SD-Trp,-

Leu,-His,+3-AT-Nährboden wurde 1/30 der Zellmenge einer Hauptkultur ausplattiert,

die mit 0,5 µg Plasmid-DNA der Genbibliothek transformiert wurde. Nach 4 - 7 Tagen

bei 30°C bildeten die Cotransformanten mit einer potentiellen Proteinwechselwirkung

His+-prototrophe Kolonien aus.


33

Parallel dazu wurde die Effizienz dieser sequentiellen Cotransformationen durch ver-

dünnte Ausplattierungen auf SD-Trp,-Leu-Nährböden überprüft und lag in der Regel bei

~ 1 x 105/µg Plasmid-DNA der Genbibliothek.

Zur Etablierung des jeweils essentiellen Genbankplasmids in der Zelle wurden die Klone

ein weiteres mal hinsichtlich ihrer His+-Prototrophie auf neuen Medien selektiert und

nicht essentiellen, cotransformierten Genbankplasmiden die Gelegenheit gegeben, aus

den Zellen zu segregieren.

Die in vivo-Interaktionen der etablierten, His+-prototrophen Klone wurden zur

Eliminierung falsch-positiver Klone durch eine anschließende Überprüfung der lacZ-

Reportergen-Aktivierung nach 2.10.5. verifiziert. Die daraus hervorgegangenen

His+/lacZ+-Klone wurden zu weiteren Analysen einer Segregation des BD-Plasmids

(2.12.2.) zugeführt.

2.12.2. Segregation von pAS2-1-Plasmiden aus Hefezellen

Diese Methode bezieht sich auf die Kombination von 2-Hybrid-Stämmen wie Y190 bzw.

dessen Derivat Y190∆, die ein mutiertes cyhr2-Allel des ribosomalen Proteins L29

besitzen, mit dem BD-Plasmid pAS2-1, das ein entsprechendes Wildtypallel CYHs2

enthält. Bei einer Plasmidsegregation kommt es zum Verlust der durch das dominante

CYHs2-Allele bestehenden Sensitivität gegenüber dem ribosomalen Elongationsinhibitor

Cycloheximid (Harper et al., 1993).

Eine nach dieser Methodik durchgeführte Segregation von BD-Plasmiden erspart die

sonst zu weiteren Analysen notwendige Isolierung und Retransformation von AD-

Plasmiden cotransformierter Zellen des 2-Hybrid-Stamms.

Zur Herbeiführung dieser Segregation wurden die cotransformierten Zellen einer

Kolonie in geringer Zelldichte (1:10 und 1:100 in H2O verdünnt) auf den Nährboden

SD-Leu,+Cycloheximid (10 µg/ml) plattiert. Durch die Tryptophansupplementierung

entfiel der Selektionsdruck zum Erhalt des BD-Plasmids und entsprechende Cyhr, Trp-,

Leu+-Segreganten konnten bei 30°C in 4-7 Tagen unter der Selektion des Cycloheximids


34

zu Kolonien heranwachsen. Zur Verifizierung des Plasmidverlustes wurden diese Klone

durch Replikaplattierung auf SD-Trp,-Leu-Nährböden hinsichtlich ihrer Tryptophan-

Auxotrophie überprüft und der lacZ-Phänotyp in einem β-Galaktosidase-Enzymtest mit

membranfixierten Zellen (2.10.5) ermittelt.

3. Ergebnisse

35

3. Ergebnisse

3.1. Isolierung Ste7p-bindender Proteine durch das 2-Hybrid-Screening einer Genbank

Die in 2.12.1. beschriebene Methodik des 2-Hybrid-Systems eignet sich, um in vivo-

Proteininteraktionen in einer großen Anzahl von Kombinationen durch ein Genbank-

Screening auf der Ebene einer genetischen Selektion zu erfassen. Die Selektion

beschränkt sich auf die Wechselwirkungen von Proteinen und stellt deren zelluläre

Funktionen in den Hintergrund. Anders als bei biochemischen Methoden behalten die

Proteine durch in vivo-Bedingungen ihre native Konformation, wodurch optimale

Voraussetzungen zur Interaktion existieren.

Zu der nach diesem Prinzip vorgesehenen Isolierung Ste7p-bindender Proteine und der

anschließenden Verifizierung dieser Interaktionen wurde das ‘Matchmaker Two-Hybrid

System 2’ (Clontech Laboratories) verwendet.

Die Detektion der Proteinwechselwirkungen erfolgt in diesem System durch den

2-Hybrid-Stamm Y190, der durch die TATA-Boxen des HIS3- und des GAL1-Promotors

gegenüber anderen Stämmen eine stärkere Reportergen-Aktivierung des HIS3-Gens zur

konditionalen Wachstumsselektion und des lacZ-Gens zur kolorimetrischen Detektion

entwickelt. Dadurch wird eine ausreichende Erfassung auch schwacher oder transienter

Interaktionen gewährleistet. Allerdings muß dieser Stamm zur Suppression des Hinter-

grundwachstums bei der Selektion mit dem kompetitiven Inhibitor 3-Amino-1,2,4-

triazol (3-AT) kultiviert werden.

Des weiteren beinhaltet dieses System noch den BD-Vektor pAS2-1, zur Einklonierung

des Zielprotein codierenden Gens (‘Bait’), den AD-Leervektor pACT2 zur Negativ-

kontrolle sowie die BD- und AD-Vektoren pVA3-1 und pTD1-1 zur positiven Inter-

aktionskontrolle des Systems. Das pCL1-Plasmid hingegen exprimiert das vollständige

Gal4-Protein zur kolorimetrischen Positivkontrolle und das pLAM5-1’-Plasmid dient zur

Detektion falsch positiver Interaktionspartner (2.4.).

3. Ergebnisse

36

Für die Bindung und Isolierung potentieller negativer Kontrollelemente der MEK Ste7p

mit dem 2-Hybrid-System aus einer Genbank müssen als wichtige Systemvoraussetzun-

gen der native Konformationszustand dieses Proteins mit einer daraus resultierenden

Funktionalität als Proteinkinase (MEK) und dessen Modifikationsstatus gewährleistet

sein.

Im Rahmen des geplanten Genbank-Screenings sollte dieses einerseits durch die in vivo-

Expression des vollständigen Ste7-Proteins mit dem BD-Vektor pAS2-1 und

andererseits durch die pheromoninduzierte Aktivierung des Pheromonsignalwegs mit der

daraus resultierenden Phosphorylierung dieser Kinase erzielt werden.

3.1.1. Systemvoraussetzungen des 2-Hybrid-Screenings

3.1.1.1. far1∆∆-Modifikation des 2-Hybrid-Stamms Y190

Da zu erwarten war, daß negative Kontrollelemente spezifisch mit der durch Aktivierung

modifizierten Ste7p-Kinase interagieren, war es sinnvoll, das 2-Hybrid-Screening unter

der Bedingung eines aktivierten Pheromonsignalwegs durchzuführen. Die dazu erforder-

liche Pheromoninduktion der Indikatorzellen hätte jedoch auch einen Arrest des Zell-

teilungszyklus in der G1-Phase zur Folge, wodurch Interaktionen nicht detektiert werden

könnten.

Dieses Problem konnte durch die Verwendung FAR1-gendeletierter Zellen umgangen

werden, denn far1∆-Mutanten besitzen einen intakten Signalweg mit einer vollständig

davon entkoppelten Zellzyklusprogression (Chang und Herskowitz, 1990).

Zur Deletion des FAR1-Gens erfolgte eine Transformation von Zellen des 2-Hybrid-

Stamms Y190 mit einer durch PCR erzeugten Substitutionskassette (2.9.8.), die aus

einem kanMX4-Resistenzmarker und kurzen Flankierungen der Zielsequenz zur

homologen Rekombination bestand. In dieser PCR diente das Plasmid pFA6-kanMX4 als

3. Ergebnisse

37

Template und die Oligonucleotide FARKAN(FW) und FARKAN(RE) als Hybrid-

Primer.

Die Überprüfung einer korrekten Substitution der auf YEPD+Geneticin selektierten

G418r-Mutanten erfolgte durch genomische PCR-Amplifikationen microwellenlysierter

Zellen. Die dazu in einem Ansatz vereinigten Primer FAR1(FW), FAR1(RE) und

kan(RE) waren homolog zum nichtcodierenden 5’-Genbereich von FAR1 (sense), zum

codierenden Genbereich von FAR1 (antisense) und zum codierenden Genbereich des

kanr-Strukturgens (antisense).

Wie in Abbildung 2 ersichtlich ist, erzeugten nur die Y190∆-Klone 1 bis 5 als Bestäti-

gung einer far1::kanMX4-Substitution durch die Primerkombination FAR1(FW)/

kan(RE) eine erwartete Produktbande von 776 bp, während der Wildtyplocus des

Stamms Y190 durch die Primerkombination FAR1(FW)/FAR1(RE) ausschließlich die

erwartete Produktbande von 366 bp bildete.

Abb. 2: Genomische PCR-Analyse des Wildtyplocus (WT) imAusgangsstamm Y190 und der far1::kanMX4-Substitution in denerzeugten Y190∆-Mutanten. Zur Analyse wurden jeweils 3 µl derReaktionsansätze in einem 2 % (w/v) Agarosegel elekrophoretischgetrennt.

3. Ergebnisse

38

Zur phänotypischen Überprüfung des veränderten Genotyps wurden die Zellen in einem

Hemmhoftest mit dem Pheromon α-Faktor konfrontiert.

Wie Abbildung 3 zeigt, reagierten die far1∆-Mutanten (Y190∆) gegenüber dem Wildtyp

Y190 nicht auf diese Pheromoninduktion und waren somit aufgrund der fehlenden

Zellzyklusinhibierung α-Faktor-resistent.

Y190∆∆ Y190

Abb. 3: Hemmhoftest (Halo-Assay) einer far1∆-Mutante (Y190∆) und des ent-sprechenden Wildtyps Y190 mit α-Faktor.Es wurden jeweils ~ 5 x 103 Zellen auf einen YEPD-Nährbodenplattiert und sterile, mit 1 nmol (rechte Filter) bzw. 10 nmol (linke Filter)α-Faktor versetzte Filterplättchen auf die Medienoberfläche plaziert.Die Inkubation erfolgte für 2 Tage bei 30°C.

3.1.1.2. Konstruktion des ‘Bait’-Plasmids pAS2-1-STE7

Zur Klonierung des ‘Bait’-Konstrukts wurde der gesamte proteincodierende Bereich des

Gens STE7 durch eine PCR (2.9.7.) mit einer Proofreading-DNA-Polymerase (Pwo) und

mit dem Primerpaar STE7(FW)/STE7(RE), die durch eine NdeI- und eine BamHI-

Schnittstelle modifiziert waren, aus der genomischen DNA des Wildtyp-Stamms

3. Ergebnisse

39

X2180-1A amplifiziert und das Produkt mit einer Länge von 1.568 bp nach einer

elektophoretischen Trennung aus dem Agarosegel isoliert (2.9.11.). Diese Fragmente

wurden nach einer Phosphorylierung der glatten 5'-Enden gereinigt (2.9.16., 2.9.12.) und

zur Zwischenklonierung mit den glatten Enden des SmaI-linearisierten und durch BAP

dephosphorylierten Vektors pUC18 ligiert.

Direkte Einklonierungsversuche in den pAS2-1-Vektor ließen sich zuvor nicht reali-

sieren, da die 5'-Endsequenz zur NdeI-Restriktion vermutlich keine ausreichende Länge

aufwies.

Nach Transformation und Amplifikation dieser Ligationsprodukte in E. coli DH5α

wurde die nach 2.9.2. aus Ampr-Einzelklonen isolierte Plasmid-DNA durch eine

NdeI/BamHI- und eine NdeI- Restriktion auf einem Agarosegel analysiert.

Abbildung 4a zeigt die erwartete Fragmentbildung von 2.444/1.550/246/(14) bp und

3.994/260 bp bei einer der zwei möglichen Insertorientierungen im Plasmid, was die

korrekte Klonierung bestätigte.

Abb. 4: Analyse der Kontrollrestriktionen nach elektrophoretischer Trennung in1 % (w/v) Agarosegelen.a) NdeI/BamHI-Restriktion, NdeI-Restriktion und unrestringierte Probe

(ko) der Zwischenklonierung pUC18-STE7b) EcoRI/NdeI- und EcoRI/BamHI-Restriktion des pAS2-1-STE7-

Konstrukts

3. Ergebnisse

40

Das aus dem Agarosegel präparierte NdeI/BamHI-Fragment (1.550 bp) dieses pUC18-

STE7-Konstrukts wurde mit dem durch eine NdeI/BamHI-Restriktion und

anschließender Fragmentisolierung aus einem Agarosegel vorbereiteten pAS2-1-Vektor

ligiert (2.9.15.). Der von den codierenden Basen 1 bis 441 der vektorintegrierten GAL4-

DNA-Bindedomäne vorgegebene Leserahmen wurde dabei stromabwärts der NdeI-

Schnittstelle durch das STE7-Gen fortgesetzt. Nach erfolgter Transformation von E. coli

DH5α wurde die aus Ampr-Einzelklonen isolierte Plasmid-DNA hinsichtlich der

Regenerierung dieser Schnittstellen voneinander unabhängig durch eine EcoRI/NdeI-

und eine EcoRI/BamHI-Restriktion überprüft. Die Restriktionsstelle EcoRI existiert

dabei singulär im einklonierten STE7-Genfragment.

Die Fragmentbildung von 9.514/402 bp und 8.768/1.148 bp dieses pAS2-1-STE7-

Konstrukts zeigte die Analyse einer elektrophoretischen Trennung (Abbildung 4b) und

bestätigte das korrekte Klonierungsprodukt.

Die richtige Fortsetzung des durch die GAL4-Bindedomäne vorgegebenen Leserahmens

konnte über den Fusionsbereich der NdeI-Ligationsstelle hinaus durch eine DNA-

Sequenzierung (2.9.9.) mit dem 63 bp stromaufwärts zur Fusionsstelle hybridisierenden

Primer pAS(FW) bestätigt werden.

.......ATC GTA TCG CCG GTA TTG CAA TAC CCA GCT TTG ACT CAT ATG TTT CAA.......

Abb. 5: Schematische Darstellung des GAL4(BD)-STE7-Fusionsbereichs ausdem Vektorkonstrukt pAS2-1-STE7.

STE7

GAL4(BD)

pAS2-1

BamHI

ATG

ADH1P GAL4(1-441)

TGA

ADH1T

441

STE7

EcoRINdeI

3. Ergebnisse

41

Nach erfolgter Transformation des Stamms Y190∆ mit diesem in Abbildung 5

schematisch dargestellten pAS2-1-STE7-Konstrukt, wurde das dadurch codierte Produkt,

das durch den konstitutiven ADH1-Promotor regulierte Gal4p(BD)-Ste7p-Fusions-

protein, weiteren Analysen (3.1.2.) unterzogen.

3.1.1.3. Konstruktion eines FUS1P-lacZ-Reportersystems

Um Wechselwirkungen mit der nativen, phosphorylierten Form der extrachromosomal

codierten Ste7p-Signalwegkinase in dem geplanten 2-Hybrid-System erfassen zu

können, mußte sichergestellt sein, daß dieses Protein unter den vorgesehenen

experimentellen Bedingungen durch Modifizierung aktivierbar war und eine

Funktionalität als MEK besaß.

Die Aktivierung der plasmidcodierten Ste7p-Kinase und ihre funktionale Integrität im

Pheromonsignalweg kann in den Zellen mit Hilfe eines Reporterplasmids überprüft

werden, bei dem das lacZ-Gen aus E. coli an den Promotor des FUS1-Gens, einem

fusionsrelevanten Konjugationsgen aus S. cerevisiae (McCaffrey et al., 1987), fusioniert

ist. Im Gegensatz zu anderen Ste12p-regulierten Promotoren, enthält der FUS1-Promotor

drei Bindestellen für den Transcriptionsfaktor Ste12p, die als PRE’s (pheromone-

response elements) bezeichnet werden. Aufgrund einer kooperativen Bindung der durch

das Fus3p aktivierten Ste12-Proteine an diese Elemente, wird bei einer Aktivierung des

Pheromonsignalwegs das Reportergen lacZ bis zu 1.000-fach induziert. (Chang und

Herskowitz, 1990; Herskowitz, 1995). Dadurch ist eine ausreichende Detektions-

möglichkeit gewährleistet. Die vom lacZ-Gen codierte β-Galaktosidase wird dabei

proportional der Induktionsstärke exprimiert und läßt durch die Bestimmung der

katalytischen Aktivität eine differenzierbare Quantifizierung zu.

Zur Konstruktion eines derartigen Reporterplasmids wurde die erforderliche FUS1-

Promotorsequenz in einem Fragment von 455 bp vor dem Startcodon bis einschließlich

3. Ergebnisse

42

der ersten 390 bp der proteincodierenden FUS1-Gensequenz per PCR mit dem

Primerpaar FUSP(FW)/FUSP(RE) und der Proofreading-Polymerase Pwo aus der

genomischen DNA des Stamms X2180-1A amplifiziert (2.9.7.). Nach der

Fragmentisolierung aus einem präparativen Gel erfolgte eine Phosphorylierung der

5’-Produktenden (2.9.16.) und eine EcoRI-Restriktion an den 3’-Enden. Dieses 748 bp-

Fragment wurde im Anschluß einer weiteren Isolierung aus einem Agarosegel in die

Ligation (2.9.15.) mit dem Promotor-Testvektor YEp357R eingesetzt, der zuvor durch

eine SmaI/EcoRI-Restriktion und anschließender Isolierung aus einem Agarosegel

vorbereitet wurde. Der von den codierenden Basen 1 bis 293 des FUS1-Gens

vorgegebene Leserahmen wurde dabei stromabwärts der EcoRI-Schnittstelle durch das

vektorintegrierte lacZ-Gen fortgesetzt.

Nach Transformation und Amplifikation dieser Ligationsprodukte in E. coli DH5α

wurde die nach 2.9.2. aus Ampr-Einzelklonen isolierte Plasmid-DNA mit der

Endonuclease PstI restringiert. Ein Restriktionsort befindet sich jeweils in der

Klonierungsstelle (MCS) des Vektors und ein anderer am Anfang des Insertfragments.

Die korrekte Fragmentbildung dieses YEp357R-FUS1P-Konstrukts von 217 bp und

8.531 bp zeigte die Analyse einer elektrophoretischen Trennung (Abbildung 6a).

3. Ergebnisse

43

Abb. 6: Restriktionsanalysen zur Bestätigung korrekter Klonierungen.a) PstI-Restriktion und unrestringierte Probe (ko) des YEp357R-

FUS1P-Konstrukts. Die elektrophoretische Trennung erfolgte ineinem 2 % (w/v) Agarosegel.

b) EcoRI-Restriktion des YEp357R-LEU2-FUS1P-Konstrukts mitrichtiger Fragmentbildung (Klon 7) und falschen Fragmentbildungen(Klone 1 - 6 und 8) der Ligationsprodukte. Die elektrophoretischeTrennung erfolgte in einem 1 % (w/v) Agarosegel.

Zur Anwendung in Kombination mit dem 2-Hybrid-Stamm Y190∆ mußte dieses

Konstrukt noch um den auxotrophen Komplementationsmarker LEU2 erweitert

werden.

Dieses Gen konnte als Bestandteil eines 4.066 bp-Fragments aus dem Plasmid YEp13

durch eine PstI-Restriktion und Trennung in einem Agarosegel isoliert werden. Das

YEp357R-FUS1P-Konstrukt wurde mit dem gleichen Enzym linearisiert und ebenfalls

als Fragment aus einem Agarosegel isoliert. Nach anschließender Ligation und erfolgter

Transformation von E. coli DH5α konnte die korrekte Klonierung und die

Regenerierung der entscheidenden EcoRI-Fusionsstelle durch eine Restriktion der aus

Ampr-Einzelklonen isolierten Plasmid-DNA mit der Endonuclease EcoRI bestätigt

werden. Eine zweite Schnittstelle befindet sich dabei im LEU2-Gen.

3. Ergebnisse

44

Die Abbildung 6b zeigt die entsprechende Gelanalyse mit der erwarteten Fragment-

bildung von 2.420 bp und 10.200 bp des Ligationsprodukts bei Klon 7 als Bestätigung

einer korrekten Klonierung, während die übrigen Klone eine falsche Fragmentbildung

der Ligationsprodukte aufwiesen.

Die wesentlichen Bestandteile dieses Klonierungsprodukts zeigt Abbildung 7. Eine

Funktionalitätsüberprüfung dieses YEp357R-LEU2-FUS1P-Konstrukts erfolgte im

Rahmen der Untersuchung zur Signalwegintegrität der Gal4p(BD)-Ste7p-Fusion

(3.1.2.4.).

.......CTT AAA AGG AAT TCC CAG CTT GCT CCC.......

Abb. 7: Schematische Darstellung der wesentlichen Bestandteile des YEp357R-LEU2-FUS1P Reporterkonstrukts, das auf einer FUS1P-lacZ-Fusionbasiert.

3.1.2. Überprüfung der Systemvoraussetzungen

3.1.2.1. Kontrolle der Vitalität

Besonders bei regulatorischen Proteinen, wie den Fus3p/Kss1p-Kinasen und der Ste7p-

Kinase, die intrazellulär nur in einer geringer Anzahl von ~ 5.000 und < 2.000

Molekülen vorhanden sind (Bardwell et al., 1996), besteht bei einer starken

Überexpression wie durch den konstitutiven ADH1-Promotor des pAS2-1-Plasmids die

Gefahr, daß die Zellvitalität beeinträchtigt wird.

lacZFUS1-Promotor

FUS1

FUS1(1-293)LEU2

PRE PRE PRE

PstI EcoRIEcoRI

lacZ

3. Ergebnisse

45

Zur Überprüfung dieser Möglichkeit wurde der mit dem Konstrukt pAS2-1-STE7 und zur

positiven Kontrolle mit dem Leerplasmid pAS2-1 transformierte Stamm Y190∆ hinsicht-

lich des Wachstums auf SD-Trp Selektivmedium überprüft. Da hierbei zwischen den

beiden Transformanten keine Wachstumsunterschiede festgestellt wurden, konnte eine

Vitalitätsbeeinflussung durch das Gal4p(BD)-Ste7p-Produkt ausgeschlossen werden,

wobei von dessen vollständiger und stabiler Expression zunächst ausgegangen wurde.

3.1.2.2. Kontrolle unspezifischer Reportergen-Aktivierung

Die Aktivierung der im Stamm Y190∆ enthaltenen Reportergene HIS3 und lacZ sollte

im Rahmen des 2-Hybrid-Screenings ausschließlich auf eine spezifische Protein-Protein-

Wechselwirkung der Gal4p(BD)-Fusion mit einer Gal4p(AD)-Fusion zurückzuführen

sein. Deshalb mußte das Gal4p(BD)-Ste7p-Fusionsprotein zuvor darauf überprüft

werden, ob es eventuell unspezifische Aktivierungen der Reportergene in den Zellen

verursacht. Mögliche Ursachen dafür könnten eine unspezifische Bindung an die Gal4p-

Aktivierungsdomäne oder eine autonome Transcriptionsaktivierung durch die

unspezifische Bindung an die relevanten Promotorelemente sein.

Die zu diesem Nachweis erzeugten Cotransformanten des Stamms Y190∆ beinhalteten

jeweils ein GAL4(BD)-Plasmid und ein GAL4(AD)-Plasmid in den Kombinationen

pAS2-1-STE7/pACT2; pAS2-1/pACT2 (negative Kontrolle) und pVA3-1/pTD1-1

(positive Kontrolle). Die HIS3-Aktivierung wurde durch einen Vergleich des

konditionalen Wachstums auf SD-Trp,-Leu,-His,+3-AT-Medium und die lacZ-

Aktivierung durch einen β-Galaktosidase-Enzymtest mit dem Substrat X-Gal nach

2.10.5. überprüft.

Die mit dem STE7-Konstrukt cotransformierten Zellen wiesen ebenso wie die

Negativkontrolle den erwarteten His-/lacZ--Phänotyp auf, während die Positivkontrolle

den erwarteten His+/lacZ+-Phänotyp erkennen ließ. Somit war bestätigt, daß unter der

3. Ergebnisse

46

Voraussetzung einer vollständigen und stabilen Expression von dem Gal4p(BD)-Ste7p-

Fusionsprotein keine unspezifische Reportergen-Aktivierung ausging.

3.1.2.3. Expressions- und Modifikationsüberprüfung des Ste7p-Fusionsproteins

Die stabile und vollständige Expression der an die Gal4p-Bindedomäne fusionierten 515

Aminosäuren des Ste7-Proteins ist eine essentielle Voraussetzung, um potentielle

Bindungspartner mit dem 2-Hybrid-System erfassen zu können. Deshalb mußte dessen

Existenz in entsprechenden Zellysaten zunächst nachgewiesen werden.

Ein weiterer, nicht unwesentlicher Aspekt war die Tatsache, daß durch die Gal4p(BD)-

Fusionierung eine Konformationsänderung des Ste7p nicht ausgeschlossen werden

konnte, was unter Umständen die Modifikation dieses Proteins beeinträchtigen würde.

Daher sollte zusätzlich gezeigt werden, daß die entsprechenden Acceptordomänen des

Ste7p für eine Phosphorylierungsreaktion frei zugänglich sind.

Dieser Nachweis kann durch einen unmittelbaren Vergleich des Ste7p aus zwei

parallelen Kulturen mit und ohne α-Faktor-Induktion erfolgen. Da die multiple

Phosphorylierung des Ste7-Proteins in der Gelelektrophorese eine Bandenretardierung

verursacht, die einer Molekulargewichtsdifferenz von ~ 12,0 kDa entspricht (Yashar et

al., 1995), können entsprechende Isoformen leicht differenziert werden.

Um die Expression und Modifikation des Ste7p durch eine Immundetektion in einem

Westernblot überprüfen zu können, erfolgte zunächst eine elektrophoretische Trennung

der nach 2.10.1. von den Kulturen Y190∆ + pAS21-STE7 (ohne α-Faktor-Induktion),

Y190∆ + pAS21-STE7 (mit 2 µM α-Faktor-Induktion) und Y190∆ + pVA3-1

(Kontrolle) erstellten Proteinextrakte in einem Polyacrylamid-Gel.

In dem daraus angefertigten Westernblot konnten die Gal4p(BD)-Fusionsproteine nach

2.10.3. durch eine Bindung Gal4p(BD)-spezifischer Primär-Antikörper (Kaninchen α-

S. cerevisiae Gal4p(BD)) mit Peroxidase-konjugierten Sekundär-Antikörpern (Ziege α-

3. Ergebnisse

47

Kaninchen IgG - Peroxidase) und einem Luminol-Substrat (ECL Westernblot-Detek-

tionsreagens) als Signal auf einem Röntgenfilm detektiert werden (Abbildung 8).

Abb. 8: Immunoblot-Analyse des Gal4p(BD)-fusionierten Ste7-Proteins auseiner nicht induzierten und einer α-Faktor induzierten Kultur (pAS2-1-STE7), sowie des p53-Proteinfragments der Kontrollkultur (pVA3-1).Von jedem Proteinextrakt wurde das Zelläquivalent von 0,2 OD600-Einheiten zur Elektrophorese auf ein 10 % (w/v) Acrylamidgelaufgetragen. Die Positionen des Molekulargewichtsmarkers entsprechender elektrophoretischen Trennung in Nachbarspuren des gleichen Gels.Die Expositionsdauer des Röntgenfilms betrug 1 min.

Das von dem Lysat der Kontrollkultur (pVA3-1) erzeugte Primärsignal ( [ ) mit der

apparenten Masse von ~ 52 kDa entspricht dem erwarteten Molekulargewicht des

Gal4p(BD)-fusionierten p53-Fragments (318 Aminosäuren-Fragment: ~ 35,7 kDa +

Gal4p(BD): ~ 16,6 kDa).

Im Gegensatz dazu dominiert in dem Lysat der pAS2-1-STE7-transformierten Kultur

ohne α-Faktor ein Signal ( ) in Höhe der apparenten Masse von ~ 86 kDa, das

dem erwarteten Molekulargewicht des Gal4p(BD)-fusionierten Ste7p in seiner

3. Ergebnisse

48

hyperphosphorylierten Isoform (Ste7p: ~ 57,7 kDa + Phosphate: ~ 12,0 kDa

+ Gal4p(BD): ~ 16,6 kDa) entspricht. Das wesentlich schwächere Signal ( ) hingegen,

mit einer schnelleren Migration in Höhe von ~ 74 kDa, korrespondiert zu der

unphosphorylierten Isoform dieses Proteins, während die dazu retardierte Bande ( )

eine intermediäre Übergangsform darstellt. Diese beiden Isoformen konnten durch die

α-Faktor-Induktion der Parallelkultur offenbar vollständig in den hyperphosphorylierten

Zustand überführt werden.

Diese Analysen zeigten, daß das Gal4p(BD)-fusionierte Ste7p des pAS2-1-STE7-

Konstrukts vollständig und stabil in den Zellen exprimiert wurde, und daß die

Phosphorylierungsdomänen zu Modifikationen frei zugänglich waren.

3.1.2.4. Überprüfung der funktionalen Integrität des Ste7p-Fusionsproteins

Nachdem die vollständige Expression und Modifizierbarkeit des fusionierten Ste7p

nachgewiesen war, wurde mit zwei voneinander unabhängigen Versuchsansätzen die

funktionale Integrität der extrachromosomal codierten Ste7p-Proteinkinase im Pheromon-

signalweg als weitere Voraussetzung für eine optimale Interaktionskompetenz überprüft.

Zunächst sollte untersucht werden, ob durch das Ste7p-Fusionsprotein nach einer

Aktivierung des Pheromonsignalwegs eine verstärkte, Ste12p-abhängige Transcriptions-

aktivierung des FUS1P-regulierten lacZ-Reportergens ermöglicht ist. Bei einer

funktionalen Integrität des extrachromosomal codierten Ste7p wurde gegenüber einem

nicht überexprimierenden Stamm ein amplifiziertes Aktivierungssignal erwartet.

Um dieses quantitativ erfassen zu können, wurden die Stämme Y190∆ + pAS2-1-STE7

und Y190∆ + pAS2-1 (Leervektor) mit dem in 3.1.1.3. erstellten FUS1P-lacZ-

Reporterkonstrukt YEp357R-LEU2-FUS1P cotransformiert. Die daraus in SD-Trp,-Leu

selektiv angezüchteten Flüssigkulturen wurden in ein YEPD-Vollmedium umgesetzt, um

3. Ergebnisse

49

während des Induktionszeitraums eine unlimitierte Nährstoffversorgung zu

gewährleisten. Dabei ist die Gefahr einer gravierenden Plasmidsegregation als Folge des

fehlenden Selektionsdrucks in der Zeitspanne von 6 Stunden zu vernachlässigen.

0

50

100

150

200

250

300

350

400

0 50 100 150 200 250 300 350 400

Zeit (min)

Akt

ivit

ät (

Uni

t)

Abb. 9: Grafische Darstellung der Pheromonsignalweg-Aktivierung in Abhän-gigkeit von der Zeit.Die Induktion der Zellen erfolgte mit 1 µM α-Faktor zum Zeitpunktt = 0 und wurde durch die Ste12p-abhängige Transcriptionsaktivierungeines FUS1P-lacZ-Reportersystems detektiert.oo Y190∆ + pAS2-1 + YEp357R-LEU2-FUS1P /− α-Faktorn Y190∆ + pAS2-1 + YEp357R-LEU2-FUS1P /+ α-Faktor∆∆ Y190∆ + pAS2-1-STE7 + YEp357R-LEU2-FUS1P /− α-Faktors Y190∆ + pAS2-1-STE7 + YEp357R-LEU2-FUS1P /+ α-Faktor

3. Ergebnisse

50

Diese Kulturen wurden nach einer Vorinkubation in der logarithmischen

Wachstumsphase bei einer Zelldichte von OD600 = 0,2 mit 1 µM α-Faktor induziert und

jeweils eine Parallelkultur zur Kontrolle nicht induziert. Mit den in 60 bzw. 90

minütigem Abstand entnommenen Zellaliquots wurde die β-Galaktosidase-

Enzymaktivität nach 2.10.4. kolorimetrisch bestimmt. Die Abbildung 9 zeigt eine

grafische Auswertung dieser Meßergebnisse.

Wie dieser Grafik zu entnehmen ist, konnte in der Ste7p-überexprimierenden Kultur

bereits ohne α-Faktor-Induktion eine moderate Erhöhung der Basisaktivität gegenüber

der mit dem Leerplasmid transformierten Kultur verzeichnet werden.

Durch die Induktion mit α-Faktor erfolgte in der überexprimierenden gegenüber der

nicht überexprimierenden Kultur eine signifikante Steigerung der Ste12p-vermittelten

FUS1P-Induktion.

Sowohl der Befund des amplifizierten Aktivierungssignals als auch der des amplifizierten

Basissignals lassen auf eine Integrität des plasmidcodierten Ste7p in diesem Signalweg

schließen, wodurch sich die Funktionsfähigkeit als aktivierbare MEK ableiten läßt.

Unabhängig von dieser Induktionsanalyse sollte die funktionale Integrität des

extrachromosomal codierten Ste7p auch durch die homologe Komplementation einer

ste7-Mutation in einem S. cerevisiae-Stamm, dessen Zellen einen sterilen Phänotyp

aufweisen, bestätigt werden. Für diese Analyse eignete sich der Stamm 381G-43A. Das

ste7- und das trp1-Allel dieser Zellen beinhalten Amber-Mutationen, die aufgrund eines

thermosensitiven Suppressors SUP4-3(t.s.amber) konditional nur bei restriktiver

Temperatur (34°C) phänotypisch ausgeprägt werden.

Nach einer Transformation dieses Stamms mit dem Konstrukt pAS2-1-STE7 bzw. mit

dem Leervektor pAS2-1 (negative Kontrolle) wurden die modifizierten Zellen bei 34°C

auf einem selektiven SD-Trp-Nährboden mit dem Pheromon α-Faktor konfrontiert.

3. Ergebnisse

51

381G-43A (ste7) + pAS2-1-STE7 381G-43A (ste7) + pAS2-1

Abb. 10: Überprüfung der Komplementation einer ste7-Zellmutation durchdas plasmidcodierte Ste7p-Fusionsprotein in einem Hemmhoftest(Halo-Assay) mit α-Faktor.Von den Kulturen 381G-43A (ste7) + pAS2-1-STE7 und 381G-43A(ste7) + pAS2-1 (negative Kontrolle) wurden jeweils ~ 5 x 103 Zellenauf einen SD-Trp-Nährboden plattiert und ein steriles, mit 10 nmolα-Faktor versetztes Filterplättchen auf die Medienoberfläche plaziert.Die Inkubation erfolgte für 2 Tage bei 34°C.

Wie der Abbildung 10 zu entnehmen ist, bildete die Kultur mit der plasmidcodierten

Überexpression der Ste7p-Fusion einen Hemmhof um den α-Faktor-Auftragungsort aus.

Der ste7-Defekt dieser Zellen wird demnach durch das Fusionsprotein komplementiert,

was einen fertilen Phänotyp zur Folge hat. Die Kontrollzellen mit dem Leerplasmid

hingegen wiesen erwartungsgemäß einen sterilen Phänotyp auf, der dem ste7-Genotyp

entspricht.

Dieses Ergebnis bestätigt, unabhängig von der vorherigen FUS1P-Induktionsanalyse, die

funktionale Integrität der als Fusionsprotein überexprimierten Ste7p-Proteinkinase in der

MEK-Position des Pheromonsignalwegs.

3. Ergebnisse

52

3.1.3.Isolierung potentieller Ste7p-Bindungspartner aus der pACT2-FRYL-Genbank durch ein 2-Hybrid-Screening

Nachdem für den 2-Hybrid-Stamm Y190∆ die far1∆-Modifikation und für das

Gal4p(BD)-fusionierte Zielprotein Ste7p das Ausbleiben einer Zytotoxizität und einer

unspezifischen Reportergen-Aktivierung, sowie die vollständige Expression und die

funktionale Integrität bestätigt waren, bestanden damit die erforderlichen Systemvoraus-

setzungen für das 2-Hybrid-Screening einer Genbank.

Aufgrund des vorgesehenen Konzepts und des dazu relevanten Untersuchungsergeb-

nisses (3.1.2.3., 3.1.2.4.), wonach nur mit einer Pheromoninduktion der Signalweg

aktiviert und das plasmidcodierte Ste7p vollständig in die vorgesehene Modifikations-

form überführt werden konnte, wurden die Interaktionspartner unter dem Einfluß einer

α-Faktor-Induktion isoliert.

Dazu wurden die Zellen des Stamms Y190∆ + pAS2-1-STE7 mit der nach 2.9.3.

amplifizierten Genbibliothek pACT2-FRYL transformiert und die Ausplattierung der

Cotransformanten auf den mit 1 µM α-Faktor supplementierten SD-Trp,-Leu,-His,

+3-AT-Nähragar entsprechend 2.12.1. durchgeführt. Eine Wachstumsselektion erfolgte

dabei durch das konditional in Folge von in vivo-Proteininteraktionen exprimierte HIS3-

Gen.

Die Anzahl der auf einer großen Selektionsplatte (φ 15 cm) aufgetragenen

Cotransformanten wurde auf durchschnittlich 60.000 begrenzt, da wegen des α-Faktor-

degradierenden ‘Barrier’-Faktors (= Bar1p-Protease) (MacKay et al., 1988), der von den

MATa-Zellen sezerniert wird, die biologische Wirksamkeit des zugefügten Pheromons

durch die Zelldichte limitiert ist.

Zur Wachstumskontrolle wurde der mit den Plasmiden pVA3-1/pTD1-1 (positive

Kontrolle) und pAS2-1-STE7/pACT2 (negative Kontrolle) cotransformierte, isogene

Stamm verdünnt auf dem gleichen Medium ausplattiert.

Insgesamt wurden durch sukzessive Transformationsetappen nach dieser Methodik

~ 15 x 106 Cotransformanten überprüft. Das entspricht dem 3-fachen der als ‘Anzahl

3. Ergebnisse

53

unabhängiger Klone’ angegebenen, ursprünglich erzeugten Genbank-Einzelklone und

korreliert mit den Vorgaben nach Fromont-Racine et al. (1997) und dem ‘Matchmaker

Two-Hybrid System 2’-Handbuch der Firma Clontech.

Aus diesem 2-Hybrid-Screening gingen insgesamt 527 His+-prototrophe Einzelklone mit

einer potentiellen Ste7p-Proteinwechselwirkung hervor, die durch weitere Analysen

bestätigt werden mußten.

3.1.4. Verifizierung der Protein-Interaktionen

Zur Überprüfung der unmittelbar aus dem 2-Hybrid-Screening isolierten His+-

prototrophen Klone wurden weitere Analysen nach einer Strategie durchgeführt, die in

der Abbildung 11 schematisch dargestellt ist. Das Ziel dieses Konzepts war eine

effiziente Differenzierung der potentiell positiven Bindungspartner in positive und falsch

positive Proteininteraktionen.

Falsch positive Befunde können aus unspezifischen Reportergen-Aktivierungen

resultieren, die nicht auf eine spezifische Wechselwirkung des Ste7p mit den

genbankcodierten Proteinen zurückzuführen sind. Die möglichen Ursachen werden im

Zusammenhang mit den jeweiligen Gegenmaßnahmen in den einzelnen Schritten dieser

Selektion dargestellt, die zu der Eliminierung falsch positiver Klone führen.

Des weiteren wurde im Rahmen dieser Selektion auch die Eliminierung von Klonen

berücksichtigt, die mehrfach mit identischen Genbankplasmiden durch dieses 2-Hybrid-

Screening isoliert wurden.

3. Ergebnisse

54

Y190∆ + pAS2-1-STE7 Transformation mit der pACT2-FRYL-Genbibliothek

His+, Trp+, Leu+

Segregation nichtessentieller Genbankplasmide

His+, Trp+, Leu+

β-Galaktosidase-Filtertest

His+, lacZ+, Trp+, Leu+

Gruppierung identischer Klone durch PCR/HaeIII-Restriktion

Gruppenrepräsentanten

BD-Plasmid-Segregation (pAS2-1-STE7)

Cyhr, lacZ-, Trp-, Leu+

Retransformation

+ pAS2-1 + pAS2-1-STE7 + pLAM5’-1

His-, lacZ-, Trp+, Leu+ His+, lacZ+, Trp+, Leu+ His-, lacZ-, Trp+, Leu+

Abb. 11: Schematischer Ablauf des 2-Hybrid-Screenings und der anschließen-den Überprüfung daraus isolierter, potentiell positiver Klone.Der für den jeweiligen Selektionsschritt relevante Phänotyp ist infetten Lettern notiert.

In Vorbereitung auf diese Analysen wurden die isolierten Klone zunächst auf dem zuvor

verwendeten Medium erneut ausgestrichen und nochmals angezüchtet. Zum einen sollte

durch diese Nachselektion die His+-Prototrophie der einzelnen Klone bestätigt werden,

zum anderen wurde dadurch auch die Segregation nichtessentieller Genbankplasmide

aus mehrfachtransformierten Zellen initiiert, deren Produkte keinen Bezug zu einer

Ste7p-Interaktion haben.

Sequenzierung

3. Ergebnisse

55

Die parallele Aufnahme multipler Plasmidspezies in eine Rezipientenzelle ist durch den

Transformationsprozeß unvermeidbar. Durch eine Begrenzung der dazu verwendeten

Plasmidmengen konnte die Häufigkeit mehrfachtransformierter Zellen jedoch schon im

Voraus reduziert werden. Für eine erfolgreiche Durchführung der anschließenden

Analysen war die ausschließliche Etablierung der zur Reportergen-Aktivierung

essentiellen Plasmidspezies unbedingte Voraussetzung.

Diese Anzuchten zur Nachselektion dienten auch gleichzeitig als ‘Masterkulturen’ zur

Bereitstellung des Zellmaterials für die anschließenden Versuche.

Um zu überprüfen, ob für die Protein-Interaktion eines dieser Klone die Notwendigkeit

der Signalwegaktivierung durch eine α-Faktor-Induktion bestand, wurden die Zellen

parallel auf identische Selektionsplatten ohne α-Faktor ausgestrichen und das

Wachstumsverhalten verglichen. Es ergab sich jedoch in keinem Fall ein Wachstums-

unterschied durch eine veränderte HIS3-Reportergen-Aktivierung zu den entsprechenden

Ausstrichen mit α-Faktor.

Eine häufige Ursache für das Auftreten falsch positiver, His+-prototropher Cotrans-

formanten des ersten Selektionsschrittes kann eine sequenzspezifische Affinität der

Gal4p(AD)-fusionierten Proteine zu dem HIS3-Promotor, der dieses Reportergen

reguliert, mit einer daraus resultierenden Transcriptionsaktivierung sein (Bartel et al.,

1993b). Deshalb ist es sinnvoll, die Proteininteraktionen dieser Klone zunächst mit Hilfe

eines zweiten, von HIS3 unabhängigen Reportersystems zu verifizieren. In dem hier

verwendeten Stamm Y190∆ wird dieses durch das lacZ-Gen unter der Kontrolle eines

GAL1-Promotors ermöglicht.

Die lacZ-Reportergen-Aktivierung der isolierten His+-Phänotypen wurde analog zur

HIS3-Aktivierung wiederum durch zwei Parallelansätze in Anwesenheit und

Abwesenheit von 1 µM α-Faktor analysiert.

Dazu wurden die Klone zu Impfstrichen auf SD-Trp,-Leu-Nährböden kultiviert, die

wegen der Ade--Auxotrophie dieses Stamms mit Adenin (60 mg/l) supplementiert waren.

3. Ergebnisse

56

Unter Adeninmangel würde dieser Stamm aufgrund der ade2-Mutation rote Pigmente

aus einem Stoffwechselintermediat (Aminoimidazol-Ribonucleotid-Derivat)

akkumulieren, das die blaufarbigen Spaltprodukte des folgenden Enzymtests überlagern

könnte.

Der β-Galaktosidase-Enzymtest wurde mit den auf Nylontransfermembranen erstellten

Replikationsabzügen nach 2.10.5. durchgeführt. Die fixierten Zellen wurden dazu durch

Kälteschock und Auftauen permeabilisiert. Zur positiven und negativen Kontrolle

dienten die bereits oben beschriebenen Cotransformanten.

Eine qualitative Beurteilung der lacZ-Phänotypen erfolgte nach ~ 8 stündiger Umsetzung

des chromogenen Substrates X-Gal. Abbildung 12 zeigt dieses Versuchsergebnis

exemplarisch anhand einer repräsentativen Auswahl isolierter Klone.

Abb. 12: lacZ-Phänotypüberprüfung His+-prototropher Klone am Beispiel derrepräsentativen Klone 341 - 367. Eine Differenzierung der lacZ-Aktivierung erfolgte ebenso wie zuvor bei der HIS3-Aktivierungdurch die Zellkultivierung (3 Tage bei 30°C) in Anwesenheit undAbwesenheit von 1 µM α-Faktor. Die davon erzeugten Filter-replikate wurden nach einer Permeabilisierung der gebundenenZellen 8 Stunden mit dem Substrat X-Gal bei 30°C inkubiert.

3. Ergebnisse

57

In Übereinstimmung mit der zur His+-Prototrophie durchgeführten Parallelanalyse von

α-Faktor induzierten und nichtinduzierten Zellen ergab sich auch in diesem Test keine

Differenz zwischen den induzierenden und nichtinduzierenden Kultivierungs-

bedingungen.

Aufgrund dieses Ergebnisses wurde im weiteren Verlauf von Parallelanalysen dieser Art

Abstand genommen und die entsprechenden Versuche ohne weitere α-Faktor-

Induktionen durchgeführt.

Als Bilanz dieses Selektionsschrittes konnten 63 % der in dem Test eingesetzten His+-

prototrophen Klone aufgrund einer fehlenden lacZ-Reportergen-Aktivierung verworfen

werden. Die übrigen Klone mit einem His+/lacZ+-Phänotyp wurden den weiteren

Analysen zugeführt.

Bevor weitere Analysen zur Verifizierung der Proteininteraktionen durchgeführt werden

konnten war es sinnvoll, die selektierten His+/lacZ+-Klone, die in ihren AD-Vektoren

identische Genbank-DNA enthielten, in Gruppen zusammenzufassen und nur jeweils

einen Gruppenrepräsentanten weiter zu untersuchen. Die Gruppierung wurde an dieser

Position durchgeführt, da die nachfolgenden Versuche wegen des hohen Aufwands mit

einer möglichst geringen Anzahl von Klonen erfolgen sollten.

Eine Gruppenzuordnung durch die Entwicklung von Fragmentmustern einer Restriktion

der kompletten Genbankplasmide erschien hierbei nicht sinnvoll. Hexanucleotid-

spezifische Restriktionsenzyme würden aufgrund zu weniger Restriktionsstellen in der

kurzen Insert-DNA (0,8 - 2,5 kb) keine differenzierbaren Fragmentmuster bilden. Ein

häufiger restringierendes, tetranucleotidspezifisches Enzym hingegen würde zu starke

Überlagerungen durch die Fragmente der 8,1 kb umfassenden Vektorsequenz

verursachen.

Deshalb wurde die genomische Insert-DNA der Genbankplasmide zur Gruppierung der

selektierten His+/lacZ+-Klone zunächst durch eine PCR amplifiziert und die

entsprechenden Produkte später durch eine häufig restringierende Endonuclease in gut

differenzierbare Muster fragmentiert.

3. Ergebnisse

58

Zu dieser Amplifikation dienten die Microwellenlysate der entsprechenden Zellen als

DNA-Template und die mit ihren 3’-Enden 95 bp stromaufwärts und 68 bp strom-

abwärts zur Einklonierungsstelle hybridisierenden Oligonucleotide pACT(FW) und

pACT(RE) als Primer.

Zur Kontrolle der Amplifikation und zur weiteren Bestätigung, daß in den Zellen eines

Klons nur eine uniforme Plasmidspezies etabliert war, wurde ein Aliquot dieser PCR-

Ansätze direkt in einem Agarosegel analysiert. In Abbildung 13a ist diese Analyse

exemplarisch für die Klone 109 - 125 dargestellt.

Ein weiteres Aliquot wurde mit der tetranucleotidspezifischen Endonuclease HaeIII

verdaut und die Fragmentbildung nach einer elektrophoretischen Trennung analysiert

(Abbildung 13b). Die Gruppenzuordnung der einzelnen Klone erfolgte unmittelbar

durch diese Analyse unter der Berücksichtigung einer Größenzuordnung der

unfragmentierten Produktbanden. Ermöglichte das, wie in wenigen Ausnahmen, keine

eindeutige Zuordnung, wurde jeweils ein weiteres Aliquot dieser PCR-Produkte mit der

Endonuclease Sau3AI verdaut, die eine andere Tetranucleotidspezifität besitzt, und

entsprechend analysiert.

Nach dieser Erfassung von Klonen mit identischen Genbank-Inserts wurde von jeder

differenzierbaren Gruppe, deren Mitgliederzahl zwischen 1 und 12 variierte, jeweils ein

Repräsentant im Folgenden weiter untersucht.

3. Ergebnisse

59

Abb. 13: Exemplarische Gruppenzuordnung einzelner Klone (109 - 125)anhand der in pACT2 insertierten Genbank-DNA, die durch PCRamplifiziert wurde.Die Zuordnung erfolgte durch die Analyse der unrestringiertenAmplifikate nach elektrophoretischer Trennung in einem 1 % (w/v)Agarosegel (a) und der Fragmentmuster einer HaeIII-Restriktiondieser Produkte nach elektrophoretischer Trennung in einem 2 %(w/v) Agarosegel (b). Die aufgetragenen Quantitäten entsprechenjeweils 3 µl eines PCR-Ansatzes.Der Marker 2 (pBR322/HaeIII; Sigma-Aldrich Chemie GmbH)besteht aus Fragmenten von 587 bis 8 bp.

3. Ergebnisse

60

Der letzte Schritt in diesem Gesamtkonzept der Überprüfung potentieller Ste7p-

Interaktionspartner diente dem Ausschluß jener Klone, bei denen eine unspezifische

Aktivierung beider Reportergene durch die Gal4p(AD)-Fusionsproteine der Genbank-

plasmide verursacht wurden.

Als mögliche Ursache für eine autonome Transcriptionsaktivierung kommt die

unspezifische Bindung an das relevante Promotorelement GAL1-UAS (upstream

activating sequence = Gal4p-DNA-Bindestelle) der beiden Reportergene bzw. an dort

lokalisierte Proteine in Betracht. In manchen Fällen erfordert dieses noch die

Anwesenheit eines ansonsten belanglosen Gal4p(BD)-Fusionsproteins (z.B. Lamin C).

Des weiteren kann auch eine unspezifische Bindung an die Gal4p-Bindedomäne für eine

falsch positive Aktivierung ursächlich sein (Bartel et al., 1993a).

Eine Differenzierung der Ste7p-spezifischen Aktivierungen von den erwähnten

unspezifischen Aktivierungen konnte dadurch erfolgen, daß die Genbankplasmide der

selektierten Klone nur mit dem pAS2-1-Leervektor oder dem pLAM5’-1-Plasmid

(Lamin C-Kontrollplasmid) als Negativkontrollen in einer Zelle vereinigt wurden und

die Aktivierung der zwei Reportergensysteme gegenüber der Aktivierung durch das

pAS2-1-STE7-Konstrukt verglichen wurden.

Dazu wurde bei den His+/lacZ+-Gruppenrepräsentanten zunächst ein Verlust des BD-

Plasmids pAS2-1-STE7 durch eine Segregation unter Cyhr-Selektion nach 2.12.2.

herbeigeführt, wobei das jeweilige Genbankplasmid erhalten blieb. Das ersparte die

sonst erforderliche Prozedur einer Isolierung und Retransformation dieser AD-Plasmide.

Die Cyhr, Trp-, Leu+-Segreganten wurden anschließend einem β-Galaktosidase-Filtertest

(2.10.5.) unterzogen, um eine eventuell autonome Reportergen-Aktivierung ermitteln zu

können. Zur positiven Kontrolle wurde der nur mit dem pCL1-Plasmid transformierte,

isogene Stamm verwendet. Dieses Plasmid exprimiert das vollständige Gal4-Protein und

komplementiert ebenfalls die Leu--Auxotrophie dieses Stamms. Von den so überprüften

Klonen erwiesen sich 7 % als lacZ+ und wurden deshalb nicht weiter berücksichtigt.

Die so erhaltenen Zellen des Phänotyps Cyhr, lacZ-, Trp-, Leu+ wurden in drei parallelen

Ansätzen jeweils mit den Plasmiden pAS2-1, pAS2-1-STE7 und pLAM5’-1 nach der

3. Ergebnisse

61

Schnellmethode (Gietz und Woods, 1994) retransformiert. Eine Option, die Plasmide

nach einer effizienten Methode durch die Konjugation mit den zuvor transformierten

Zellen des Stamms Y187 (MATα) (Harper et al., 1993) zusammenzuführen bestand

hierbei nicht, da die far1∆-modifizierten Zellen konjugationsdefekt sind (Chang und

Herskowitz, 1990).

Abb. 14: Überprüfung der lacZ-Reportergen-Aktivierung nach einerRetransformation potentiell positiver Klone am Beispiel der reprä-sentativen Klone 217, 220 und 221 mit den drei BD-PlasmidenpAS2-1, pAS2-1-STE7 und pLAM5’-1.Der lacZ-Phänotyp wurde nach 8 stündiger X-Gal-Umsetzung derpermeabilisierten Filterreplikate bestimmt.Die Überprüfungen der His+-Prototrophie waren dazu überein-stimmend.

Von den auf SD-Trp,-Leu-Medium selektierten Cotransformanten wurden jeweils drei

unabhängige Klone jeder Plasmidkombination auf SD-Trp,-Leu,-His,+3-AT-Nährböden

replikaplattiert, um die Aktivierung des HIS3-Reportergens zu überprüfen, während die

lacZ-Aktivierung eines Replika-Abzugs durch einen β-Galaktosidase-Filtertest bestimmt

wurde (Abbildung 14).

3. Ergebnisse

62

Bei allen Klonen waren die Ergebnisse der His3-Aktivierung mit der lacZ-Aktivierung

übereinstimmend. Von den so untersuchten Gruppenrepräsentanten zeigten 51 % ein

falsch positives Verhalten durch die zusätzliche, unspezifische Reportergen-Aktivierung

in Kombination mit dem pAS2-1-Leerplasmid und/oder dem pLAM5’-1-Kontroll-

plasmid. Diese Klone wurden verworfen, während von den übrigen Klonen, die nur in

Kombination mit dem pAS2-1-STE7-Konstrukt eine spezifische Aktivierung der

Reportergene aufwiesen, die genomische Insert-DNA der entsprechenden Genbank-

plasmide einer Sequenzanalyse zugeführt wurden.

3. Ergebnisse

63

3.2. Identifizierung der selektierten Ste7p-Bindungspartner

Zur Identifizierung der durch die Genbankplasmide codierten Ste7p-Interaktionspartner

erfolgte zunächst eine DNA-Sequenzierung (2.9.9.) des GAL4-AD-Fusionsbereichs

dieser pACT2-Plasmide mit der sich stromabwärts fortsetzenden Insert-DNA der

Genbibliothek.

Alternativ zu einer Plasmidisolierung aus den Hefezellen mit anschließender Ampli-

fizierung durch E. coli-Transformanten wurde hierbei das Genbank-Insertfragment durch

eine PCR mit den Primern pACT(FW) und pACT(RE) amplifiziert. Als Template

dienten die microwellenlysierten Zellen der entsprechenden Klone. Die PCR-Produkte

wurden nach erfolgter Elektrophorese aus dem Agarosegel isoliert und ein Aliquot dieser

Eluate zur Quantifizierung mit DNA-Standards abermals elektrophoretisch getrennt. Die

anschließenden DNA-Sequenzierungen (2.9.9.) erfolgten mit jeweils 50 ng der isolierten

Produktbande als Template und dem Oligonucleotid pACT(FW) als Primer, dessen 3’-

Ende 95 bp stromaufwärts zur Fusionsstelle hybridisiert.

Die daraus erhaltenen Sequenzdaten, mit einer auswertbaren Sequenzlänge von 250 -

800 bp, wurden nach einer manuellen Korrektur der entsprechenden Diagramme mit

dem Suchprogramm ‘blastn’ (Version 2.0) des ‘National Center for Biotechnology

Information’ (NCBI) (Benson et al., 1998) gegen die Sequenzdaten der genomischen

S. cerevisiae-Nucleotiddatenbank verglichen.

Aufgrund der von S. cerevisiae vollständig bekannten Genomsequenz ergab sich aus der

jeweils stromabwärts zur Fusionsstelle enthaltenen DNA-Sequenz mit lückenloser

Homologie der exakte Anfangsbereich zu der genomischen DNA des jeweiligen

Chromosoms.

Da Introns enthaltende Gene bei S. cerevisiae im Gegensatz zu anderen Eukaryonten

eine Ausnahme sind, entsprach dies in der Regel dem nicht unterbrochenen

Codierungsbereich eines offenen Leserahmens (= ORF: Open Reading Frame).

Hierdurch konnte ebenfalls die Übereinstimmung der Insertorientierung im Vektor mit

der Leserichtung des chromosomalen Homologs festgestellt werden. Die maximale

3. Ergebnisse

64

Länge dieser ORF’s war durch das zweite Ende der Insert-DNA im Plasmid begrenzt

und ließ sich durch die elektrophoretisch getrennten PCR-Produktbanden anhand der

Fragmentgröße rekonstruieren.

Des Weiteren wurde überprüft, ob der durch die Gal4p-Aktivierungsdomäne

vorgegebene und im insertierten DNA-Bereich fortgesetzte Leserahmen dieser

sequenzierten DNA mit dem Leserahmen des korrespondierenden Genomhomologs

korrekt übereinstimmt. Dazu wurden die Sequenzierungsdaten mit dem Programm ‘ORF

Finder’ des NCBI translatiert und derjenige von den dort ausgewiesenen Leserahmen

ausgewählt, dessen Anfangsbereich der Gal4p(AD)-Proteinsequenz entsprach. Diese

Aminosäuresequenz wurde daraufhin mit Hilfe des Programms ‘blastp’ (NCBI)

gegenüber den Sequenzdaten der S. cerevisiae-Proteindatenbank verglichen und das der

Gal4p(AD)-fusionierten Sequenz entsprechende Protein-/Polypeptidhomolog, mit einer

offensichtlichen Sequenzübereinstimmung, registriert.

Falsche Orientierungen oder Leserahmenverschiebungen einiger der Gal4p(AD)-

fusionierten Sequenzen führten in der Regel zu früh terminierten Peptiden mit einer

Länge von 20 bis 45 Aminosäuren. Ein Vergleich dieser Sequenzen gegen die

Proteineintragungen der entsprechenden Datenbank mit dem ‘blastp’-Programm (NCBI)

ergab in keinem Fall eine sinnvolle Übereinstimmung. Diese Ergebnisse wurden deshalb

nicht weiter berücksichtigt.

Die als genomisch codierten Proteine oder Proteinfragmente identifizierten Ste7p-

Interaktionspartner konnten häufig durch die Genbank-DNA in mehreren unabhängigen

Klonen wiedergefunden werden, die sich im Codierungsbereich meistens durch die

Anfangs- und/oder Endposition unterschieden. Um die bindungsrelevanten

Proteinbereiche einzugrenzen, wurden nur die Klone mit den für jedes Protein

minimalsten Codierungsbereichen in die tabellarische Auswertung (Tabelle 1)

aufgenommen.

Anhand verschiedener Kriterien wurde eine Einteilung dieser Proteine in Kategorien

vorgenommen.

3. Ergebnisse

65

Kate-gorie

Locus Protein Protein-länge (As)

Gal4p(AD)-Fusionsbereich

KlonNr.

I YBL016w Fus3p 353 8 - Ende 388YDR103w Ste5p 917 226 - ~ 893 346YGR040w Kss1p 368 6 - Ende 386YLL021w Spa2p 1466 -17* - ~ 166 186YLR362w Ste11p 717 34 - ~ 300 119

II YHR084w Ste12p 688 278 - ~ 428 399YMR199w Cln1p 546 -18* - ~ 210 319YPL256c Cln2p 545 49 - ~ 232 526

III YBR257w Pop4p 279 1 - Ende 431YCR038c Bud5p 538 -85* - ~ 315 334YDL101c Dun1p 513 25 - ~ 208 357YDR235w Prp42p 544 459 - Ende 58YGL201c Mcm6p 1017 821 - Ende 416YLL026w Hsp104p 908 708 - ~ 858 120

IV YCL024w Ycl024Wp 915 24 - ~ 357 360YHL023c Yhl023Cp 1146 138 - ~ 338 437YKR038c Ykr038Cp 421 182 - Ende 293YLR033w Ylr033Wp 502 2 - ~ 401 516YOL078w Yol078Wp 1176 1093 - Ende 502YOL087c Yol087Cp 1116 1014 - Ende 179

Tabelle 1: Zusammenstellung der in diesem 2-Hybrid-Screening identifiziertenSte7p-Interaktionspartner. In die Tabellierung wurde für jedesProtein nur der Klon mit dem minimalsten Codierungsbereicheingetragen. Die Kategorisierung ist im Text erläutert.* Die Aminosäuren mit negativen Vorzeichen werden durch DNA- Insertsequenzen codiert, die vor dem Startcodon der Gene beginnen, aber eine durchgehende Translation im richtigen Leserahmen erzeugen.

In der Kategorie I sind alle bisher bekannten, direkten Interaktionspartner des Ste7-

Proteins zusammengefaßt, die zu dieser Proteinkinase im Rahmen des Konjugations-

prozesses einen funktionalen Bezug besitzen. Dazu gehören die Komponenten des

Pheromonsignalwegs Ste11p, Ste5p, Fus3p und Kss1p, sowie das an der Ausbildung von

Konjugationsfortsätzen beteiligte Protein Spa2p (1.).

3. Ergebnisse

66

Die Kategorie II faßt alle Proteine zusammen, die zwar als Transcriptionsfaktor (Ste12p)

und G1-spezifische Cycline (Cln1p und Cln2p) mit dem Pheromonsignalweg und dem

Ste7p in einem funktionalen Zusammenhang stehen (siehe Einleitung), von denen jedoch

bisher keine direkte Interaktion mit dem Ste7p bekannt ist.

Proteine mit einer bekannten Zellfunktion, die nach bisherigem Kenntnisstand jedoch

keinen sinnvollen Zusammenhang mit einer Ste7p-Interaktion erkennen lassen, sind in

der Kategorie III vereinigt.

Dazu gehört das Pop4p (processing of precursors), das an der rRNA- und tRNA-

Prozessierung beteiligt ist (Chu et al., 1997), der Guanin-Nucleotid-Austauschfaktor

Bud5p (bud), der im Zusammenhang mit anderen Proteinen bei der vegetativen

Vermehrung die Knospungsstellen determiniert (Camus et al., 1994) und die nucleäre

Dun1p-Proteinkinase (DNA-damage uninducible), die nach einer DNA-Schädigung die

Expression von Reparaturgenen induziert (Zhou und Elledge, 1993). Weitere Proteine

dieser Gruppierung sind das Ribonucleoprotein Prp42p (pre mRNA processing), das in

einem großen Proteinkomplex (U1 snRNP) am Prozeß des prä-mRNA-Spleißens

beteiligt ist (McLean und Rymond, 1998), das DNA-bindende Mcm6p (minichromosom

maintenance deficient) mit einer replikationsinitiierenden Funktion (Rowles und Blow,

1997) und das als Chaperon zur einer Thermotoleranz beitragende Hsp104p (heat shock

protein) (Glover und Lindquist, 1998).

Die Kategorie IV beinhaltet alle Ste7p-interagierenden Proteine mit unbekannter

Zellfunktion, die nicht nur von hypothetischen Leserahmen codiert werden, sondern von

denen die Expression entsprechender Transcripte bereits nachgewiesen werden konnten

(DeRisi et al., 1997).

Die Charakterisierung dieser Proteine beschränkt sich auf vereinzelte Domänen-

homologien, die sich aus den Strukturdaten ableiten lassen und in der MIPS-Datenbank

(Munich Information Center for Protein Sequences) (Mewes et al., 1998) zusammen-

gefaßt sind.

3. Ergebnisse

67

Demnach besitzt das Ycl024W-Protein eine große Domänenhomologie zu Serin/-

Threonin-spezifischen Proteinkinasen, wobei der in Klon 360 codierte N-Terminus die

Strukturen einer ATP-Bindestelle und des katalytischen Bereichs beinhaltet.

Das Protein Ykr038Cp hingegen weist eine hohe Sequenzübereinstimmung zu den

konservierten Regionen der Glycoproteasen (O-Sialoglycoprotein Endopeptidasen) auf

und enthält die Struktur einer Calcium-Bindedomäne (EF-Hand), die Bestandteil des in

Klon 293 codierten Proteinbereichs ist.

Demgegenüber weist das Protein Yol087Cp die homologe Struktur der β-Transducin-

Proteinfamilie in Form eines repetitiven WD-40 Segments (Tryptophan-Asparaginsäure-

Wiederholungen) auf, das allerdings kein Bestandteil des codierten Proteinbereichs in

Klon 179 ist. Dieses Protein ist nicht essentiell (Pearson et al., 1998).

Die übrigen dieser Kategorie zugeordneten Proteine Yhl023Cp, Ylr033Wp und

Yol078Wp besitzen keine markanten Charakteristika.

3. Ergebnisse

68

3.3. Charakterisierung Ste7p-bindender Proteine mit unbekannter Zellfunktion

Aufgrund bisher bekannter Charakterisierungen und Funktionszuweisungen der in den

ersten drei Kategorien (Tabelle 1) zusammengefaßten 2-Hybrid-Interaktionspartner des

Ste7p, konnte keinem dieser Proteine die offensichtliche Aufgabe eines MEK-

regulierenden Kontrollelements zugewiesen werden.

Im Gegensatz dazu beschränken sich die Informationen zu den nachweislich

exprimierten Ste7p-Bindungspartnern der vierten Kategorie im Wesentlichen auf deren

Primärstrukturen und davon ableitbare, vereinzelt vorhandene Domänenhomologien.

Über weitere Eigenschaften oder Funktionen ist hingegen bisher nichts bekannt. Daher

konnte bei diesen Proteinen nicht ausgeschlossen werden, daß sie eine Funktion in der

Ste7p-Regulation besitzen.

Aus diesem Grund erschien eine darauf ausgerichtete Charakterisierung dieser

Bindungspartner sinnvoll.

Ein elementarer Versuchsansatz, zur Charakterisierung von Proteinen unbekannter

Funktion, ist die Erzeugung von Deletionen des relevanten Gens und der anschließende

Nachweis eines dadurch veränderten Zellphänotyps, wodurch sich gegebenenfalls eine

Aufgabenzuordnung ableiten läßt.

Diese Methodik ließ sich auch zur Charakterisierung der Proteine Ycl024Wp,

Yhl023Cp, Ykr038Cp, Yol078Wp und Yol087Cp anwenden.

Zur Charakterisierung des Proteins Ylr033Wp erschien dieser Methodenansatz jedoch

nicht zweckmäßig. Aus den Untersuchungen im Rahmen eines europäischen

Genomprojektes war bereits bekannt, daß YLR033w ein essentielles Gen von

S. cerevisiae ist und entsprechende Deletionsmutanten haploider Zellen nicht lebensfähig

sind (R. Erdmann, persönliche Mitteilung). Wie in solchen Fällen üblich, wurden zur

alternativen Funktionsanalyse dieses Proteins deshalb äquivalente Phänotypcharakteri-

sierungen bei einer Überexpression des codierenden Gens vorgesehen.

3. Ergebnisse

69

Mit den in dieser Weise durch Deletion und Überexpression modifizierten Stämmen

konnten eventuelle Veränderungen relevanter, phänotypischer Verhaltensmerkmale und

daraus ableitbare Funktionsrückschlüsse der entsprechenden Proteine durch zwei

unabhängige Methodenansätze aussagekräftig erfaßt werden.

Als ein relevanter Funktionstest bot sich die Konfrontation von modifizierten MATa-

Zellen mit dem Pheromon α-Faktor in einem Hemmtest an. Bei einer Bedeutung eines

dieser sechs Gene der Kategorie IV, hinsichtlich der Regulation des Pheromonsignalwegs

auf der Ebene der Ste7p-Proteinkinase, sollte sich ein verändertes Hemmverhalten im

Vergleich zu den jeweiligen Wildtypzellen ergeben, das sich durch die Intensität des

G1-Arrests differenzieren läßt. Diese Überprüfung wurde mit zwei voneinander

unabhängigen S. cerevisiae-Stämmen vorgesehen, da der genetische Hintergrund des

Genoms unter Umständen den Phänotyp beeinflussen kann (Bilsland et al., 1998).

Die Aussagekraft dieses Versuchs kann durch eine weitere Überprüfung der modifi-

zierten Zellen in einer quantitativen Konjugation ergänzt werden. Im Gegensatz zum

Hemmtest werden hierdurch außer einer Regulation des G1-Arrests auch andere,

mögliche Funktionen dieser sechs Ste7p-Interaktionspartner in der Vielzahl aller

konjugationsrelevanten Prozesse durch eine Verhaltensänderung erfaßt. Um paarungs-

typspezifische Effekte einzubeziehen, sollten die Konjugationen mit gleichartig

modifizierten Zellen beider Paarungstypen durchgeführt werden.

3.3.1. Voraussetzungen der phänotypischen Analysen

3.3.1.1. Deletionsmutationen der korrespondierenden Gene

Die zu den phänotypischen Analysen erforderlichen Deletionsmutanten der Loci

YCL024w, YHL023c, YKR038c und YOL078w wurden durch homologe Rekombination

nach Zelltransformationen mit den durch PCR synthetisierten Substitutionskassetten

erzeugt (2.9.8.).

3. Ergebnisse

70

Der darin enthaltene Resistenzmarker kanMX4 wurde dabei von den jeweiligen

Zielsequenzen der zu deletierenden Loci durch die Primerpaare YCLKAN(FW/RE),

YHLKAN(FW/RE), YKRKAN(FW/RE) und YOLKAN(FW/RE) flankiert. In der

Amplifikationsreaktion diente das Plasmid pUG6 als Template. Rezipienten dieser PCR-

Produkte waren die Zellen der Stämme UTL-7A und die aus einer Sporulation (2.11.2.,

2.11.3.) des Stamms FY1679 isolierten Derivate FY1679-1A (MATα) und FY1679-7C

(MATa). Die durch eine kanMX4-Substitution des Locus YOL087c modifizierten

MATa- und MATα-Zellen des Stamms FY1679 konnten von dem europäischen

Gemeinschaftsprojekt ‘EUROSCARF’ bezogen werden.

Abb. 15: Genomische PCR-Analysen der kanMX4-substituierten LociYCL024w, YHL023c, YKR038c, YOL078w und YOL087c inMutanten der MATa-Derivate des Stamms FY1679 und der nichtmodifizierten Parentalzellen (WT) zur negativen Kontrolle.Die Mutanten-Analysen des Stamms UTL-7A und der MATα-Derivate des Stamms FY1679 waren hierzu identisch.Die Probentrennung erfolgte in einem 1 % (w/v) Agarosegel.

Bei allen Deletionsmutanten wurde die korrekte Substitution der Loci durch genomische

PCR-Amplifikationen mikrowellenlysierter Zellen überprüft. Dazu wurden die in den

3. Ergebnisse

71

jeweiligen nichtcodierenden 5’-Genbereichen (sense) hybridisierenden Primer

YCL(FW), YHL(FW), YKR(FW), YOL78(FW), YOL87(FW) in Kombination mit dem

spezifisch im kanr-Strukturgen (antisense) hybridisierenden Primer kan(RE) verwendet.

Die elektrophoretische Analyse der Produkte (Abbildung 15) bestätigte die korrekte

kanMX4-Substitution der Loci YCL024w, YHL023c, YKR038c, YOL078w und YOL087c

in den Mutanten durch den Nachweis der erwarteten PCR-Fragmente von 1.060 bp,

814 bp, 750 bp, 944 bp und 742 bp während die Signale bei den zur negativen Kontrolle

verwendeten, nicht modifizierten Parentalzellen fehlten.

3.3.1.2. Konstruktion eines Überexpressionsvektors für das Gen YLR033w

Zur konditionalen Überexpression des Gens YLR033w wurde ein Konstrukt mit dem

Vektor pRS6myc erstellt. Dieser besitzt einen durch Kupfer induzierbaren CUP1-

Promotor, durch den die Expressionsstärke bei einer Zytotoxizität des Produktes

gegebenenfalls durch eine Änderung der Induktorkonzentration moduliert werden kann.

Im Gegensatz zu den durch Galaktose induzierbaren Promotoren kann bei den

vorgesehenen Phänotypanalysen die gleiche Kohlenstoffquelle wie für die Deletions-

mutanten benutzt werden, so daß hierdurch gleiche Versuchsbedingungen gewährleistet

sind.

Des weiteren wird durch eine dem Promotor folgende Partialsequenz des c-myc-Proto-

Onkogens die Translation eines Myc-Epitops (16 Aminosäuren des N-Terminus) initiiert,

wodurch die Expression eines daran C-terminal fusionierten Proteins mit Hilfe

spezifischer α-Myc-Antikörper immunologisch detektiert werden kann. Die Transcrip-

tion wird durch die abschließende Terminationssequenz des CYC1-Gens beendet.

Zur Erzeugung solch einer Fusion wurde der codierende Genbereich des YLR033w per

PCR mit einer Proofreading-DNA-Polymerase (Pwo) aus dem Genom des Wildtyp-

stamms X2180-1A amplifiziert (2.9.7.). Die dazu verwendeten Primer YLR(FW) und

3. Ergebnisse

72

YLR(RE) enthielten eine BclI-Restriktionsstelle, die zu BglII kompatible Enden erzeugt,

und eine XhoI-Restriktionsstelle. Nach der Restriktion dieses Produkts (1.542 bp) mit

den entsprechenden Endonucleasen wurde das aus einem Agarosegel isolierte Fragment

mit dem linearisierten Vektor pRS6myc ligiert, der zuvor durch eine BglII/XhoI-

Restriktion und der anschließenden Isolierung aus einem Agarosegel vorbereitet wurde.

Der durch das Myc-Epitop vorgegebene Leserahmen wird dabei stromabwärts der

BglII/BclI-Fusionsstelle durch das YLR033w-Gen fortgesetzt (Abbildung 16).

........GGT ATG CAG ATC ATG ACA GAA AGT..........

Abb. 16: Schematische Darstellung des c-myc-YLR033w-Fusionsbereichs ausdem Vektorkonstrukt pRS6myc-YLR033w.

Mit diesem Ligationsprodukt wurde der E. coli-Stamm DH5α transformiert und aus

kultivierten Ampr-Einzelklonen die isolierte Plasmid-DNA durch eine BamHI/XhoI-

Restriktion überprüft.

Die erwartete Fragmentbildung dieses pRS6myc-YLR033w-Konstrukts von 4.898 bp und

2.002 bp zeigte die Analyse einer elektrophoretischen Trennung (Abbildung 17) und

bestätigte das richtige Klonierungsprodukt der Isolate aus den überprüften Klonen 1

und 2.

CYC1T pRS6mycYLR033wc-myc(1-48)CUP1P

BamHI BglII/BclI XhoI

ATG TAA

c-myc YLR033w

3. Ergebnisse

73

Abb. 17: Elektrophoretische Trennung des BamHI/XhoI-restringierten pRS6-myc-YLR033w-Konstrukts der überprüften Klone 1 und 2, sowie despRS6myc-Leervektors (ko) als Kontrolle in einem 1 % (w/v)Agarosegel.

Die korrekte Einhaltung des Leserahmens, der durch das Myc-Epitop vorgegeben ist,

konnte über den Fusionsbereich hinaus durch eine DNA-Sequenzierung (2.9.9.) dieses

Konstrukts mit dem Primer pRS(FW) bestätigt werden, der mit seinem 3’-Ende 84 bp

stromaufwärts zur Fusionsstelle hybridisiert.

3.3.1.3. Kontrolle der Zytotoxizität und der Expression des Myc-Ylr033Wp- Fusionsproteins

Zur Überprüfung einer eventuellen Zytotoxizität dieses Fusionsproduktes wurden die mit

dem Konstrukt pRS6myc-YLR033w und mit dem Leerplasmid pRS6myc transformierten

Stämme FY1679-7C und UTL-7A auf selektiven SD-Ura-Nährböden angezüchtet, die

zur Induktion des CUP1-Promotors mit 25 µg/ml CuSO4 supplementiert waren.

Zwischen beiden Transformanten eines Stamms konnten keine Wachstumsunterschiede

festgestellt werden. Von dem Ylr033Wp-Fusionsprotein ging, unter der Annahme einer

vollständigen und stabilen Überexpression, somit keine Beeinträchtigung der Zell-

vitalität aus.

3. Ergebnisse

74

Da die stabile und vollständige Expression des c-myc-fusionierten YLR033w-Gens eine

wichtige Voraussetzung für die vorgesehene phänotypische Charakterisierung war,

erfolgte zur Klärung des Sachverhalts eine Analyse von Proteinextrakten durch einen

Westerblot mit anschließender Immundetektion dieses Fusionsproteins.

Dazu wurden aus den unter Induktionsbedingungen in SD-Ura,+CuSO4 (25 µg/ml)

angezüchteten Hauptkulturen der Stämme FY1679-7C und UTL-7A, die mit dem

Konstrukt pRS6myc-YLR033w oder dem Leervektor pRS6myc (negative Kontrolle)

transformiert waren, Proteinextrakte nach 2.10.1. erstellt und diese nach einer

elektophoretischen Trennung in einem Polyacrylamid-Gel auf eine Nitrocellulose-

membran transferiert (2.10.3.).

Das Fusionsprotein konnte auf diesem Westernblot durch die Bindung von monoklonalen

Primär-Antikörpern (Maus α-Human Myc-Epitop) mit den Peroxidase konjugierten

Sekundär-Antikörpern (Ziege α-Maus IgG - Peroxidase) und dem ECL-Westernblot-

Detektionsreagens als chemilumineszentes Signal auf einem Röntgenfilm detektiert

werden.

3. Ergebnisse

75

Abb. 18: Überprüfung der Expression des Myc-Ylr033Wp-Fusionsproteinsdurch die Immunoblot-Analyse von Proteinextrakten CuSO4-induzierter Parallelkulturen UTL7A + pRS6myc-YLR033w undUTL7A + pRS6myc.Das zusätzlich auftretende Signal des Myc-Ylr033Wp-Fusions-proteins ist gekennzeichnet (Ù). Die Probenanalyse des StammsFY1679-7C war hierzu identisch.Von jedem Proteinextrakt wurde das Zelläquivalent aus 0,2 OD600-Einheiten zur Elektrophorese auf ein Acrylamidgel aufgetragen. DiePositionen des im gleichen Gel getrennten Molekulargewichts-markers sind links eingetragen. Die Expositionsdauer des Röntgen-films betrug 0,5 min.

Wie die Röntgenfilmanalyse in Abbildung 18 zeigt, trat bei der Kultur der pRS6myc-

YLR033w transformierten Zellen gegenüber der mit dem pRS6myc-Leervektor trans-

formierten Kontrollkultur ein zusätzliches, dominantes Signal (Ù) auf. Die Migration in

der Höhe von ~ 60 kDa entspricht eindeutig dem erwarteten Molekulargewicht des

Fusionsproteins (Ylr033Wp: ~ 57,8 kDa + Myc-Epitop: ~ 1,7 kDa).

Die stabile und vollständige Expression dieses Myc-Ylr033Wp-Fusionsproteins konnte

somit in den Stämmen FY1679-7C und UTL-7A bestätigt werden.

3. Ergebnisse

76

3.3.2. Phänotypische Untersuchungen zur Charakterisierung der Proteine mit unbekannter Zellfunktion

3.3.2.1. Konfrontation mit dem Pheromon αααα-Faktor

Um eine Funktionszuweisung durch die Charakterisierung eines veränderten Phänotyps

zu ermöglichen, wurden die deletionsmutierten Zellen und die YLR033w-überexpri-

mierenden Zellen zunächst in einem Hemmtest mit unterschiedlichen Konzentrationen

des Pheromons α-Faktor konfrontiert. Dabei wurde eine zeitlich veränderte Rückkehr in

den normalen Proliferationszyklus (‘Recovery’) im Vergleich zu dem parentalen

Wildtypstamm erwartet, die durch die Kolonienbildung aus Einzelzellen differenziert

werden kann.

Dazu wurden jeweils 1.000 Zellen vereinzelt auf Nährböden ausplattiert, die mit 500,

100, 50, 10 und 0 nM α-Faktor supplementiert waren. Für die Deletionsmutanten, sowie

deren parentale Kontrollstämme FY1679-7C und UTL-7A, wurden dazu YEPD-Medien

benutzt, während die mit dem Überexpressionskonstrukt pRS6myc-YLR033w und dem

Leervektor pRS6myc (Kontrolle) transformierten Stämme FY1679-7C und UTL-7A zum

Plasmiderhalt auf SD-Ura-Medium unter Induktionsbedingungen (25 µg/ml CuSO4)

kultiviert wurden. Die Inkubationen erfolgten bei einer täglichen Bewertung des

Zellwachstums über 5 Tage bei 30 °C.

Die Abbildung 19 zeigt das Stadium der Kolonienausbildung als Folge eines

Zellwachstums der ausplattierten Mutante ykr038c∆ (UTL-7A) im Vergleich zu den

nichtmodifizierten Zellen des Parentalstamms (UTL-7A) nach einer dreitägigen

Inkubation.

3. Ergebnisse

77

Abb. 19: Phänotypische Analyse der Mutante ykr038c∆ durch einenHemmtest mit unterschiedlichen α-Faktor-Konzentrationen.Als Kontrolle dienten die Zellen des Parentalstamms UTL-7A (WT).Pro Nährboden wurden ~ 1.000 Zellen ausplattiert und diese 3 Tagebei 30°C inkubiert.

Ohne α-Faktor ergaben sich demnach keine Wachstumsunterschiede zwischen den

deletionsmutierten und den parentalen Zellen. Damit wurde bestätigt, daß durch die

Modifikation keine Vitalitätsbeeinträchtigung erfolgt, was eine unbedingte Voraus-

setzung für den direkten Wachstumsvergleich auf den pheromonsupplementierten

Medien war.

In Abhängigkeit von der verwendeten α-Faktor-Konzentration kehrten die Zellen

unterschiedlich schnell in den Proliferationszyklus zurück. Zwischen den durch Deletion

bzw. Überexpression modifizierten Zellen und den jeweiligen Kontrollzellen der nicht

transformierten Parentalstämme bzw. der mit dem Leervektor pRS6myc transformierten

3. Ergebnisse

78

Parentalstämme, traten durch die Konfrontation mit der jeweils gleichen α-Faktor-

Konzentration keine Wachstumsdifferenzen der Kolonienbildung auf.

Diese Darstellung ist aufgrund eines identischen Wachstumsverhaltens für alle anderen,

auf gleiche Weise überprüften Deletionsmutanten und überexprimierenden Zellen der

beiden Stämme FY1679-7C und UTL-7A repräsentativ.

Demnach konnte unter den gewählten Bedingungen dieses α-Faktor-Hemmtests für

keines der hier überprüften Gene YCL024w, YHL023c, YKR038c, YLR033w, YOL078w

und YOL087c eine Einflußnahme auf die Intensität des G1-Arrests erwiesen werden.

3.3.2.2. Quantitative Konjugation

Ein weiterer, zu dem vorausgehenden Hemmtest unabhängiger Methodenansatz, der sich

zur Erfassung einer relevanten Funktion der betreffenden Gene in der Regulation des

Pheromonsignalwegs oder in anderen konjugationsrelevanten Prozessen anbietet, beruht

auf dem Nachweis eines veränderten Konjugationsverhaltens der Deletionsmutanten

bzw. der überexprimierenden Zellen.

Zur Überprüfung einer Bedeutung der Gene YCL024w, YHL023c, YKR038c, YLR033w,

YOL078w und YOL087c für den Konjugationsprozeß wurde mit den entsprechend

modifizierten, haploiden MATα- und MATa-Derivaten des Stamms FY1679 eine

quantitative Konjugation (2.11.4.) durchgeführt und die Anzahl der in einer definierten

Zeiteinheit aus den haploiden Ausgangszellen gebildeten diploiden Zellen als

Paarungsrate ermittelt. Als Referenz dienten die Parentalstämme FY1679-1A und

FY1679-7C bzw. die mit dem Leerplasmid pRS6myc transformierten, identischen

Stämme. Im Gegensatz zu den Deletionsmutanten wurden die mit den Plasmiden

pRS6myc und pRS6myc-YLR033w transformierten Zellen dabei nicht in YEPD-

Vollmedium, sonder in SD-Ura-Medium unter Induktionsbedingungen (25 µg/ml

CuSO4) angezüchtet.

Nach der erfolgten Konjugation wurden die diploiden Zellen mit den komplementieren-

den Genmarkern zur Bestimmung der Paarungsrate in Verdünnungen auf MV+Ura- bzw.

3. Ergebnisse

79

MV-Medien selektiv angezüchtet. Durch Supplementierung dieser Medien mit Histidin

bzw. Tryptophan wurden auf parallelen Nährböden zusätzlich die verbliebenen haploiden

Ausgangszellen des Paarungstyps MATa dieser Konjugationsansätze zu Kolonien

kultiviert. Die Paarungsrate ergab sich aus dem jeweiligen Quotienten der Kolonien-

anzahl. Sie bezeichnet den Anteil der Ausgangszellen, der in dem definierten Zeitraum

eine Konjugation eingegangen ist.

KonjugationsansätzeFY-1679 MATa x FY-1679 MATα

Paarungsrate[%]

Wildtyp x Wildtyp 70,2

ycl024w∆ x ycl024w∆ 83,2

yhl023c∆ x yhl023c∆ 82,7

ykr038c∆ x ykr038c∆ 82,9

yol078w∆ x yol078w∆ 88,6

yol087c∆ x yol087c∆ 87,1

pRS6myc x pRS6myc 62,6

pRS6myc-YLR033w x pRS6myc-YLR033w 52,6

Tabelle 2: Paarungsraten aus einer quantitativen Konjugation von MATα- undMATa-Deletionsmutanten bzw. überexprimierenden Zellen sowieder entsprechenden Wildtypstämme als Referenz.Die Auswertung erfolgte anhand ausplattierter 10-3-Verdünnungs-stufen mit einer Kolonienanzahl von 200 bis 600 pro Medienplatte.Angegeben sind die jeweiligen Mittelwerte aus unabhängigenDoppelbestimmungen.

Wie die in der Tabelle 2 dargestellten Versuchsergebnisse zeigen, wies keine der so

überprüften Mutanten und überexprimierenden Zellen eine von der jeweiligen Wildtyp-

kontrolle signifikant abweichende Paarungsrate auf.

Demzufolge konnte durch diese Analyse eine Relevanz der hier überprüften Proteine, die

von den Genen YCL024w, YHL023c, YKR038c, YLR033w, YOL078w und YOL087c

codiert werden, für den Konjugationsprozeß nicht nachgewiesen werden.

4. Diskussion

80

4. Diskussion

Unter den geschilderten Aspekten (1.) sollte im Rahmen dieser Arbeit eine gezielte

Isolierung von potentiell negativen Kontrollelementen der zentralen Proteinkinase Ste7p

des Pheromonsignalwegs von S. cerevisiae aus einer Genbibliothek erfolgen.

Die meisten der bisherigen, genetischen Methodenansätze zur Identifizierung von

Komponenten, die eine Aktivierung des Pheromonsignalwegs negativ beeinflussen,

waren in der Regel sehr unspezifisch ausgerichtet.

Dazu gehörten die klassischen Screeningkonzepte von Genbanken, bei denen ein

ausgelöster G1-Arrest durch Komplementation oder Suppression revertiert werden

konnte, was mit Multicopyplasmiden wie zum Beispiel dem YEp13 (Nasmyth und

Tatchell, 1980) unter der Expressionskontrolle geneigener Promotoren erfolgte.

Zum einen konnten durch die Komplementation von Mutationen auf diese Weise

Faktoren mit einer adaptierenden Funktion, wie z.B. die Gene SSL2/SST2 und BAR1

(Steden et al., 1989; Dietzel und Kurjan, 1987; MacKay et al., 1988), gefunden werden.

Zum anderen wurde durch den Effekt der Gendosiserhöhung (‘dominante Genetik’) mit

parentalen Wildtypzellen die Fus3p-MAPK negativ regulierende Proteinphosphatase

Msg5p (Doi et al., 1994) und die dazu coregulierenden Proteinphosphatasen

Ptp2p/Ptp3p (Zhan et al., 1997) als dominante Inhibitoren (‘Multicopysuppressoren’)

des aktivierten Signalwegs isoliert und identifiziert.

Eine häufig angewendete Variation dieser ‘dominant negativen Selektion’ von Genen,

die mit dem Zellzyklusarrest des aktivierten Signalwegs interferieren, erfolgte durch

Plasmidbibliotheken, deren genomische Insertfragmente oder cDNA-Äquivalente durch

starke Fremdpromotoren überexprimiert wurden und bei entsprechender Relevanz

ebenfalls einen selektierbaren Far--Phänotyp in parentalen Wildtypzellen verursachten

(Edwards et al., 1997; Caponigro et al., 1998).

4. Diskussion

81

Durch diese methodischen Ansätze konnten bisher jedoch keine Proteine ermittelt

werden, durch die eine negative Kontrolle der übergeordneten Signalwegkomponente

MEK (Ste7p) oder der MEKK (Ste11p) analog zu einer Regulation der MAPK

vollzogen wird, obwohl für Ste7p dazu Hinweise bestehen.

Das kann einerseits darin begründet sein, daß Gene mit stringent regulierten Eigen-

promotoren auch bei einer Gendosiserhöhung keinen Effekt der Multicopysuppression

zeigen können (Ramer et al., 1992). Andererseits besteht im Fall der Überexpression

durch Multicopyplasmide sowie unter der Kontrolle von Fremdpromotoren die

Möglichkeit, daß notwendige Intermediärelemente, wie regulatorische Untereinheiten,

die z.B. für eine spezifische Substratbindung multifunktionaler Phosphatasen notwendig

sind, durch die endogene Codierung nicht proportional exprimiert vorliegen und deshalb

kein phänotypischer Effekt hervorgerufen werden kann.

Die Isolierung von negativen Ste7p-Kontrollelementen aus einer Genbibliothek unter der

Verwendung des 2-Hybrid-Systems, bei der die genetische Selektion ausschließlich auf

in vivo-Proteinwechselwirkungen beschränkt ist und Funktionsaspekte zunächst

unberücksichtigt bleiben, stellt demgegenüber einen bisher noch nicht verwendeten,

innovativen Methodenansatz dar, mit dem sich die oben genannten Probleme umgehen

lassen.

Durch die Verwendung eines einzigen Zielproteins ist dieses System im Vergleich zu

den anderen Methoden außerdem sehr spezifisch auf die Komponenten ausgerichtet, die

nur mit diesem Protein in einem Zusammenhang stehen, und eignet sich deshalb

besonders, um der hier aufgegriffenen Fragestellung nachzugehen.

Zu den Systemvoraussetzungen dieses Konzepts gehörten der native Konformations-

zustand mit einer daraus resultierenden Funktionalität als Proteinkinase und die

Modifikationsmöglichkeit des als Zielprotein durch das pAS2-1-STE7-Konstrukt

exprimierten Ste7p, um eine optimale Kompetenz für die Bindung der erwarteten

Interaktionspartner zu gewährleisten.

4. Diskussion

82

Die dazu durchgeführte Überprüfung durch eine Westernblot-Analyse (3.1.2.3.) ergab,

daß ein beträchtlicher Anteil dieses vollständig exprimierten Proteins bereits ohne eine

vorausgegangene Signalwegaktivierung in der hyperphosphorylierten Isoform

modifiziert vorlag, die normalerweise dem Zustand nach einer Aktivierung entspricht.

Dieser Effekt konnte bereits von Cairns et al. (1992) beobachtet werden. Seine genauen

Ursachen sind noch nicht eindeutig geklärt, jedoch scheint die starke Protein-

überexpression dafür maßgeblich zu sein. Da auch in fus3∆/kss1∆-Doppelmutanten mit

einem daraus resultierenden Attenuierungsdefekt bei einer starken Überexpression ein

beträchtlicher Anteil des Ste7p in der hyperphosphorylierten Isoform vorliegt, werden

inadäquate Mechanismen wie intermolekulare Autophosphorylierungen oder

Modifikationen durch strukturverwandte, nicht am Pheromonsignalweg beteiligte

Kinasen in Betracht gezogen (Zhou et al., 1993).

Es ist jedoch erwiesen, daß von einer starken STE7-Überexpression keine

konjugationsrelevante, autonome Aktivierung des Signalwegs ausgeht, was im

Gegensatz dazu bei anderen Komponenten dieser Transduktionskaskade wie z.B. STE4,

STE5, STE11 oder STE12 (Akada et al., 1997; Akada et al., 1996; Dolan und Fields,

1990; Whiteway et al., 1990) der Fall ist.

Daß die starke Hyperphosphorylierung in keinem äquivalenten Zusammenhang mit einer

Signalwegaktivierung steht, konnte auch mit der Funktionsanalyse des Ste7p durch die

Induktion eines FUS1-Promotorkonstrukts (3.1.2.4.) bestätigt werden.

Ohne α-Faktor-Induktion war hierbei eine geringe Erhöhung der Basisaktivität dieses

Signalwegs zu verzeichnen. Da Proteinkinasen auch eine geringe Aktivität in

Abwesenheit eines Signals besitzen und sich daraus eine Basisaktivität dieses

Signalweges ergibt (Zhou et al., 1993), resultierte durch die Überexpression der

zentralen MEK erwartungsgemäß eine adäquate Amplifikation dieses Signals.

4. Diskussion

83

Durch die α-Faktor-Induktion einer Parallelkultur konnte hingegen eine signifikante

Aktivitätssteigerung des Signalwegs gegenüber der nicht Ste7p überexprimierenden

Kultur verzeichnet werden, die ebenfalls in der Signalamplifikation durch die MEK-

Überexpression begründet ist.

Beide Fakten weisen auf die Integrität des plasmidcodierten Ste7p in der Transduktions-

kaskade hin.

Daß es sich dabei um einen Amplifikationseffekt durch die funktionale Integrität des

überexprimierten Proteins handelt und nicht um Sekundärmechanismen, wie etwa

unbekannte Kompetitionseffekte der Überexpression, konnte durch einen weiteren

Versuch (3.1.2.4.) zur Überprüfung der Funktionalität belegt werden.

Dabei erwies sich das Ste7p-Fusionsprotein in einer ste7-Mutante durch die

Regenerierung des fertilen Phänotyps als mutationskomplementierend und bestätigte

somit eine Funktionalität als Proteinkinase auf der MEK-Ebene des Signalwegs. Das

Protein erfüllte damit die geforderten Voraussetzungen.

Bemerkenswert ist an diesem Ergebnis jedoch, daß es in einem Widerspruch zu den

Untersuchungsergebnissen von Edwards et al. (1997) steht. Dort wurde im Rahmen

eines Genbank-Screenings nach Far1--Phänotypen das STE7-Gen isoliert, dessen

Überexpression eine Pheromonresistenz verursachte.

Im Vergleich zu anderen Untersuchungsergebnissen scheint dieses jedoch eine

Ausnahmeerscheinung zu sein. Weder durch analoge Genbank-Screenings (Espinet et

al., 1995; Ramer et al., 1992) noch durch gezielte Analysen mit überexprimiertem Ste7p

(Cairns et al., 1992; Zhou et al., 1993) ist dieser Effekt bei ähnlichen Expressionsstärken

bisher bekannt geworden. Diese Ergebnisse stehen in Übereinstimmung zu dem eigenen

Befund und bestätigen das hier erzielte Versuchsresultat.

Neben den Systemvoraussetzungen, die für das Zielprotein bestanden, waren die

Eigenschaften der verwendeten Plasmidbibliothek für eine erfolgreiche Isolierung der

erwarteten Interaktionspartner ebenso bedeutend.

4. Diskussion

84

Dieses wurde durch die im 2-Hybrid-Screening verwendete Genbank pACT2-FRYL

(2.5.) berücksichtigt.

Der rekombinante Anteil dieser Plasmide, durch den die Gal4p(AD)-Fusionsproteine

codiert werden, besteht aus genomischen DNA-Fragmenten, die bei S. cerevisiae zur

direkten Einklonierung besonders geeignet sind, weil im Gegensatz zu anderen

Eukaryonten für diesen Organismus Introns enthaltende Gene eher die Ausnahme sind.

Gegenüber den sonst üblichen cDNA-Bibliotheken ergeben sich dadurch prägnante

Vorteile, die in der ausgewogeneren und vollständigeren Repräsentation der protein-

codierenden Genbereiche dieses Genoms bestehen.

Zudem sind in cDNA-Bibliotheken die Genäquivalente als rekombinante Plasmidanteile

nur entsprechend dem jeweiligen Expressionsmuster in der Zelle vertreten, was zu einer

starken Unterrepräsentierung von schwach oder konditional exprimierten Genen führen

könnte. Hinsichtlich der Isolierung von signalmodulierenden bzw. regulatorischen

Proteinen, wie in diesem Fall vorgesehen, könnte das eine ungünstige Voraussetzung

sein.

Da die Selektion mit diesem System auf den Bindungseffekten und nicht auf den

funktionalen Effekten der Proteine basiert, kann die insertierte DNA der pACT2-

Genbankplasmide aus relativ kurzen Genomfragmenten (0,8 - 2,5 kb) bestehen, die nicht

die gesamten proteincodierenden Genbereiche repräsentieren. Dadurch wird die

Komplexität der Genbank erhöht und gewährleistet, daß ein heterogener Pool mit

unterschiedlichen Fusionsstellen jedes Gens Bestandteil der Genbibliothek ist. Auf diese

Weise lassen sich unter Umständen Faltungs- und Stabilitätsprobleme mancher Proteine

umgehen (James et al., 1996) und führt bei ihnen zu einem bindungskompetenten

Verhalten.

Ferner wurde durch die Verwendung genomische DNA aus einem deletionsmutierten

gal4-542, his3-200, gal80-538 S. cerevisiae-Stamm (Fromont-Racine et al., 1997) bei

der Erstellung dieser Genbank schon im Vorfeld dafür gesorgt, daß bei der

nachfolgenden Selektion von genbankcodierten Bindungspartnern weder durch Gal4-

4. Diskussion

85

Proteine eine falsch positive Aktivierung der Reporterpromotoren noch durch His3-

Proteine eine Interferenz mit der konditionalen Wachstumsselektion oder durch Gal80-

Proteine eine Inhibierung der assoziierten Gal4p-Domänen erfolgen kann.

Aufgrund des Befunds (3.1.2.3.), daß nur durch eine pheromoninduzierte Signalweg-

aktivierung die Modifikation des gesamten plasmidcodierten Ste7-Proteins erfolgt,

wurde die Isolierung potentieller Bindungspartner durch das 2-Hybrid-Screening (3.1.3.)

in Gegenwart des Pheromons α-Faktor durchgeführt. Bei der anschließenden

Verifizierung dieser Interaktionen durch eine Überprüfung der HIS3- und der lacZ-

Aktivierung (3.1.4.) wurde zusätzlich versucht, die Phänotypen der isolierten Klone in

Abhängigkeit von dem Aktivierungszustand des Pheromonsignalwegs (+/- α-Faktor) zu

differenzieren. Diese Versuche ergaben jedoch keine offensichtliche Abweichung in der

Aktivierung der Reportergene.

Dies könnte darin begründet sein, daß der methodische Nachweis der Aktivierung nur

eine semiquantitative Differenzierung zuläßt.

In Analogie zu dem eigenen Befund konnten von Printen und Sprague bei gezielten

2-Hybrid-Bindungsstudien mit zentralen Komponenten des Pheromonsignalwegs in

Abhängigkeit von deren Aktivierungszustand ebenfalls keine differenzierbaren

Wechselwirkungen festgestellt werden, obwohl diese offensichtlich bestehen (Printen

und Sprague, 1994).

Das verdeutlicht die offenbaren Grenzen dieses Systems. Die erzeugten Signalstärken

korrelieren zwar mit den aus in vitro-Versuchen bekannten Bindungsverhalten von

Proteinen, lassen aber nur in einer groben Abstufung sehr undifferenziert auf die

Wechselwirkungsintensität rückschließen (Estojak et al., 1995).

Auf der anderen Seite konnte durch die Westernblot-Analyse (3.1.2.3.) festgestellt

werden, daß der überwiegende Anteil des Ste7p-Fusionsproteins bereits ohne eine

Aktivierung des Signalwegs in der phosphorylierten Modifikationsform vorlag. Dieser

4. Diskussion

86

könnte bei einer entsprechenden Interaktion den geringeren Anteil des Ste7-Proteins

überlagern, der in Abhängigkeit von der Signalwegaktivierung modifiziert wird und

auch nur davon abhängig interagieren kann, so daß eine deutliche Differenzierung nicht

nachzuweisen wäre.

Demnach konnte aus diesen zwei Möglichkeiten geschlossen werden, daß eventuell

unter den isolierten Interaktionspartnern durchaus pheromonabhängige

Wechselwirkungen bestehen, diese jedoch aufgrund unzureichender

Differenzierungsmöglichkeiten nicht detektierbar sind.

Nachdem diese und weitere Interaktionsüberprüfungen zur Aussonderung falsch

positiver Wechselwirkungen (3.1.4.) abgeschlossen waren, erfolgte die Identifizierung

der auf diese Weise selektierten Ste7p-Bindungspartner (3.2.).

Dabei konnten u.a. die Proteine Ste5p, Ste11p, Fus3p und Kss1p ermittelt werden, die

alle an der Signaltransduktion im Pheromonsignalweg beteiligt sind und einen

unmittelbaren, funktionalen Bezug zum Ste7-Protein besitzen (1.). Zusammen mit dem

für die morphologische Differenzierung relevanten Spa2p repräsentieren diese Proteine

somit das Spektrum bekannter Interaktionspartner, die auch aufgrund der Ergebnisse

gezielter Bindungsanalysen erwartet werden konnten (Printen und Sprague, 1994; Sheu

et al., 1998; Marcus et al., 1994; Inouye et al., 1997).

Ihre Isolierung bestätigte einerseits, daß unter den gewählten Bedingungen das

Detektionssystem erfolgreich eingesetzt werden konnte und zum anderen, daß die

Anzahl der ~ 15 x 106 so überprüften Cotransformanten ausreichte sowie, daß das

Genom in der verwendeten Genbank vollständig repräsentiert war.

Deren genügende Komplexität konnte ferner durch die oftmalige Isolierung

unabhängiger Klone mit verschiedenen Codierungsbereichen des selben Gens erwiesen

werden.

Aufgrund dieses Resultats wurden die Voraussetzungen zur Isolierung der erwarteten

Kontrollelemente als aussichtsreich betrachtet.

4. Diskussion

87

In Übereinstimmung mit den oben genannten Proteinen besitzt der als Ste7p-

Interaktionspartner isolierte, pheromonabhängige Transcriptionsfaktor Ste12p und die

G1-spezifischen Cycline der Zellzyklusregulation Cln1p und Cln2p ebenso einen

funktionalen Bezug zum Pheromonsignalweg (1.). Direkte Wechselwirkungen mit dem

Ste7p sind hingegen nicht bekannt und aufgrund bisheriger Untersuchungsergebnisse

auch nicht anzunehmen. Wahrscheinlicher ist in diesen Fällen eine indirekte Interaktion,

die durch endogen codierte ‘Brückenproteine’ vermittelt werden könnten. Diese

Ausbildung trimerer Interaktionskomplexe ist ein bekanntes Phänomen (Finley und

Brent, 1994) und wird unter Umständen, wie in diesem Fall, durch die

Interaktionsanalyse in einem homologen System gefördert.

Als mögliche Brückenproteine kämen für die indirekten Interaktionen des Ste12p,

entsprechend der bisherigen Auffassung der Komponentenkonstellationen durch

epistatische und funktionale Analysen (Elion et al., 1993; Errede et al., 1993), die MAP-

Kinasen Fus3p und Kss1p in Betracht. Ein Hinweis für diesen Sachverhalt besteht

dadurch, daß der isolierte Codierungsbereich des Ste12p genau der bekannten Kss1p-

Interaktionsdomäne entspricht (Bardwell et al., 1998).

Für die Interaktion der isolierten Cycline hingegen, die untereinander eine sehr hohe

Sequenzhomologie aufweisen, wäre eine indirekte Wechselwirkung durch das Ste11p

durchaus denkbar. Wie von Wassmann und Ammerer nachgewiesen werden konnte,

interferiert das überexprimierte Cln2p mit der Signaltransduktion auf dem Niveau der

MEKK Ste11p (Wassmann und Ammerer, 1997), wodurch eine indirekte

Wechselwirkung mit dem Ste7p möglich werden könnte.

Eine genaue Aufklärung dieser Möglichkeiten könnte u.a. durch 2-Hybrid-Analysen mit

Deletionsmutanten der vermuteten Intermediärkomponenten erfolgen (Printen und

Sprague, 1994).

Die weiteren als Bindungspartner von Ste7p isolierten Proteine Pop4p, Bud5p, Dun1p,

Prp42p, Mcm6p und Hsp104p, die bereits in 3.2. kurz charakterisiert wurden, lassen

aufgrund ihrer bekannten Zellfunktionen keinen unmittelbaren Zusammenhang für die

Ste7p-Interaktionen erkennen.

4. Diskussion

88

Möglich wären hierbei entfernte Strukturverwandtschaften mit Proteinen, die einen

Funktionsbezug zu dem Ste7p besitzen. In Folge der starken Überexpression könnte das

ein falschpositives Interaktionsverhalten provozieren. Als Beispiel dafür kann die

Hyperphosphorylierung des überexprimierten Ste7p ohne vorherige Signalweg-

aktivierung betrachtet werden.

Dieses Phänomen könnte durch Interaktionsanalysen mit AD-Vektoren der pGAD-Serie

(Bartel et al., 1993) verifiziert werden, die einen verkürzten ADH1-Promotor besitzen

und dadurch eine schwächere Expression der einklonierten DNA aufweisen als der hier

verwendete pACT2-Vektor.

Analog zu den Proteinen Ste12p und Cln1p/Cln2p ist auch bei diesen Proteinen eine

indirekte Wechselwirkung durch trimere Komplexbildungen nicht auszuschließen,

wobei die Zuordnung verantwortlicher Brückenproteine kaum möglich ist und dadurch

eine gezielte Verifizierung mit entsprechenden Deletionsmutanten nicht in Betracht

kommt. Möglicherweise könnte die Interaktion dieser Proteine mit dem Ste7p durch eine

Immuncopräzipitation aus dem Zellysat aufgeklärt werden.

Mit den Proteinen Ycl024Wp∗, Yhl023Cp, Ykr038Cp, Ylr033Wp, Yol078Wp und

Yol087Cp wurden schließlich Ste7p-Bindungspartner identifiziert, deren Charakteri-

sierungen sich auf Domänenhomologien durch die Strukturdaten beschränkten (3.2.) und

denen darüber hinaus keine zellulären Funktionen zugewiesen werden konnten.

Das machte diese Proteine gegenüber den zuvor beschriebenen Proteinen besonders

interessant, da bei ihnen eine mögliche Aufgabe als MEK-Kontrollelement nicht

auszuschließen war, auch wenn die Domänenhomologie zu Serin/Threonin-spezifischen

Proteinkinasen bei dem Ycl024Wp und zu Glycoproteasen bei dem Ykr038Cp für diese

Proteine nicht unmittelbar auf eine negative Kontrollfunktion durch Dephosphory-

lierungsreaktionen hinwiesen.

∗ Nach dem Abschluß der eigenen Arbeit konnte diesem Protein eine Zellfunktion zugewiesen werden.Demnach erfüllt das Ycl024Wp (= Kcc4p) eine Aufgabe bei der Regulation des Zellteilungszyklus durch dasCytoskelett (Barral et al., 1999).

4. Diskussion

89

Es war jedoch nicht auszuschließen, daß sie durch einen anderen, noch nicht bekannten

Prozeß indirekt, mit der Funktion ihres Domänencharakters, an dieser Aufgabe beteiligt

sein könnten, zumal bei einer Überprüfung der stromaufwärts gelegenen Gensequenzen

bei dem Gen YKR038c, im Gegensatz zu den übrigen fünf Genen, 444 bp vor dem

Startcodon eine PRE-Sequenz (pheromone-response element) ermittelt werden konnte,

was auf die Möglichkeit einer pheromoninduzierten, Ste12p-abhängigen Regulation

dieses Gens hinwies.

Die Familienzuordnung des Yol087Cp aufgrund des WD-40 Segments hingegen ließ

wegen der bekannten Funktionsheterogenität der übrigen Familienmitglieder (Smith et

al., 1999) ebensowenig auf eine spezifische Zellfunktion schließen, wie das Fehlen von

markanten Charakteristika bei den übrigen Proteinen Yhl023Cp, Ylr033Wp und

Yol078Wp.

Auch bei diesen vier Proteinen konnte allein aufgrund fehlender Domänenhomologien

zu den Familien bekannter, katalytischer Proteine nicht ausgeschlossen werden, daß sie

an einer negativen Ste7p-Kontrolle beteiligt sind.

So existieren z.B. für viele multifunktionale Proteinphosphatasen, die in ihren

katalytischen Domänen hochkonservierte Homologiebereiche besitzen, eine große

Anzahl unterschiedlicher, regulatorischer Proteine ohne derartig hochkonservierte

Domänen, die für die Aktivitätsmodulation, die Substratspezifität und die Lokalisation in

der Zelle erforderlich sind.

Aus diesem Grund erschien es sinnvoll, zur Funktionsanalyse eine Charakterisierung

dieser Proteine mit Hilfe modifizierter Zellen durchzuführen (3.3.), die eine

Deletionsmutation des codierenden Gens enthielten (3.3.1.1.) oder im Fall des

essentiellen Gens YLR033w das Protein überexprimierten (3.3.1.2.).

4. Diskussion

90

Die phänotypischen Charakterisierungen dieser Zellen erfolgten durch zwei spezifische

Untersuchungen, die für eine Beeinflussung der Pheromonsignalwegregulation eine hohe

Aussagekraft besitzen. Das war zum einen die Überprüfung eines veränderten G1-Arrests

durch die Konfrontation mit dem Pheromon α-Faktor und zum anderen das

Konjugationsverhalten mit den Zellen des reziproken Paarungstyps (3.3.2.).

Aus beiden Untersuchungen ergaben sich keine eindeutigen Verhaltensabweichungen

der modifizierten Zellen zu den als Referenz verwendeten, unmodifizierten

Wildtypzellen.

Aufgrund dieser Kriterien konnte keinem der sechs als Interaktionspartner isolierten

Proteine mit unbekannter Zellfunktion unmittelbar eine Funktion in der negativen

Kontrolle der MEK Ste7p zugewiesen werden.

Diesem Befund entsprechend könnte unter Berücksichtigung der identifizierten Proteine

mit bekannter Zellfunktion gefolgert werden, daß mit diesem 2-Hybrid-System keine

Isolierung des gesuchten Kontrollelements aus der Genbank erzielt wurde, wodurch auch

dessen Existenz zunächst fragwürdig erscheint.

Obwohl die Effizienz des Systems durch die Isolierung der bekannten Ste7p-

Bindungspartner bestätigt wurde, kann trotzdem nicht ausgeschlossen werden, daß

systembedingte Eigenschaften zu diesem Ergebnis führten und andere System-

komponenten hinreichendere Bedingungen bieten könnten.

So ist zum Beispiel bekannt, daß die Mediensupplementierung mit hohen 3-Amino-

1,2,4-triazol-Konzentrationen (25 mM), die aufgrund des nicht stringent regulierten

HIS3-Promotors für den Stamm Y190 notwendig sind, das Detektionssystem

unempfindlich machen und dadurch positive Interaktionen inhibiert werden können

(James et al., 1996). Die Verwendung von 2-Hybrid-Stämmen wie HF7c oder CG-1945

hingegen, bei denen das HIS3-Reportergen zur Wachstumsselektion unter der

stringenten Kontrolle eines GAL1-Promotors steht (Feilotter et al., 1994), würde sich als

eine mögliche Systemverbesserung anbieten.

4. Diskussion

91

Außerdem könnte das Fehlen der erwarteten Ste7p-Interaktionspartner auch mit einer

möglichen Zytotoxizität der Gal4p(AD)-Fusionsprodukte in einem Zusammenhang

stehen. Dieser Effekt kann bei der konstitutiven, starken Überexpression, wie in diesem

Fall durch den ADH1-Promotor des pACT2-Vektors, besonders für regulatorische

Proteine nicht ausgeschlossen werden. Die Verwendung von Vektoren mit schwächeren

Promotor-Konstrukten, wie z.B. die pGAD-Vektoren (Bartel et al., 1993), wären zur

Isolierung derartiger Proteine eine mögliche Alternative.

Ungeachtet dieser Möglichkeiten, die eine Isolierung der gesuchten Kontrollelemente

beeinträchtigt haben könnten, besteht weiterhin die Frage nach der Bedeutung der

Interaktionen des Ste7p mit den Proteinen unbekannter Zellfunktion, denen durch die

phänotypischen Analysen offensichtlich nicht die erwartete Funktion zugewiesen werden

konnten.

Auch hierfür könnte die Ursache in der Methodik des 2-Hybrid-Systems liegen.

So ist es nicht auszuschließen, daß es sich auch bei diesen Proteinen, ähnlich wie bei

Ste12p und Cln1p/Cln2p, um indirekte Interaktionen des Ste7p handeln könnte, die

durch Brückenproteine vermittelt werden. Da jedoch die Brückenproteine unbekannt

sind, kann diese Möglichkeit nicht mit Hilfe von entsprechenden Deletionsmutanten

überprüft werden. Gegebenenfalls könnten hier biochemische und immunologische

Methoden zu einer Aufklärung verhelfen.

Andererseits kann durch die ausschließliche Selektion auf der Basis von

Proteinwechselwirkungen in diesem System nicht verhindert werden, daß durch

Bindungspartner anderer Signalwege möglicherweise Interferenzen auftreten, die nicht

differenziert werden können.

Es kann deshalb nicht ausgeschlossen werden, daß die hier isolierten Interaktionspartner

mit einer unbekannten Zellfunktion in einem anderen MAPK-Regulationsweg einen

funktionalen Bezug zum Ste7-Protein besitzen. Potentiell kommt dafür der

4. Diskussion

92

Regulationsweg des Pseudohyphenwachstums von diploiden Zellen bzw. des invasiven

Wachstums von haploiden Zellen in Betracht, da dort neben anderen Komponenten des

Pheromonsignalwegs auch das Ste7p an der Signaltransduktion beteiligt ist. Diese

Möglichkeit könnte jedoch durch darauf ausgerichtete, spezifische Phänotypanalysen der

hier modifizierten Zellen verifiziert werden (Roberts und Fink, 1994).

Neben diesen möglichen Ursachen aufgrund von systembedingten Gegebenheiten, durch

die unterstellt werden könnte, daß keines der isolierten und charakterisierten Proteine

mit unbekannter Zellfunktion dem gesuchten Kontrollelement entspricht, besteht

dennoch Grund zu der Annahme, daß eines dieser Ste7p-Bindungspartner durchaus diese

regulatorische Aufgabe besitzen kann.

So ist nicht auszuschließen, daß durch die funktionale Redundanz eines weiteren,

unbekannten Zellproteins die jeweilige Deletionsmutation unwirksam geworden sein

könnte. Dadurch verursachte Null-Phänotypen oder subtile Phänotypen ließen sich mit

den hier angewendeten Methoden der Phänotypanalysen nicht differenzieren.

Die Frage, ob die in dieser Arbeit charakterisierten Proteine eine relevante Funktion bei

der negativen Kontrolle des Ste7p besitzen, kann deshalb nicht unbedingt verneint

werden.

5. Zusammenfassung

93

5. Zusammenfassung

Der Pheromonsignalweg von Saccharomyces cerevisiae, ein repräsentatives und

experimentell gut zugängliches Modellsystem der bei Eukaryonten weitverbreiteten

mitogen-aktivierten-Proteinkinase-(MAPK)-Regulationswege, ist hinsichtlich der

Aktivierungsmechanismen durch die sukzessive Abfolge einzelner Kinasereaktionen gut

charakterisiert. Im Gegensatz dazu beschränken sich die bisher bekannten Dephosphory-

lierungsreaktionen zur notwendigen Reversion des aktivierten Signalwegzustands auf

die MAP-Kinase Fus3p.

Da Hinweise für eine ähnliche Regulation der übergeordneten MEK Ste7p bestanden,

wurde versucht, die dazu in Frage kommenden ‘negative Kontrollelemente’ auf der

Basis einer Proteinbindung mit Hilfe des 2-Hybrid-Systems zu isolieren. Die relevante

Funktionszuweisung sollte im Anschluß durch eine spezifische Charakterisierung

erfolgen.

Das dazu verwendete System beinhaltete den BD-Vektor pAS2-1, den AD-Vektor

pACT2 (Genbank) und den Detektorstamm Y190, der aufgrund des Screeningkonzepts

durch eine far1∆-Mutation modifiziert werden mußte.

Die Bindungskompetenz des als Zielprotein exprimierten Ste7p sollte dabei durch die

native Konformation des vollständigen Proteins mit einer darauf beruhenden Funktion

als MEK und durch den modifizierten Phosphorylierungsgrad in Folge einer Pheromon-

induktion gewährleistet sein. Diese Eigenschaften konnten vorab durch eine Westernblot-

Analyse, eine MEK-spezifische Signalamplifikation und eine Mutationskomplemen-

tation bestätigt werden.

5. Zusammenfassung

94

Unter den aus einer genomischen Plasmidbibliothek isolierten Bindungspartnern

konnten nach einer Verifizierung der Wechselwirkungen vier Kategorien von Proteinen

identifi-ziert werden.

1. Komponenten des Pheromonsignalwegs (Ste5p, Ste11p, Fus3p, Kss1p) und das

Spa2p, die einen konjugationsrelevanten Funktionsbezug zu dem Ste7p besitzen und

deren erwartete Isolierung die Effizienz des 2-Hybrid-Systems sowie die

vollständige Repräsentation des Genoms in der Genbibliothek bestätigten.

2. Proteine, die mit dem Pheromonsignalweg in einem Zusammenhang stehen

(Ste12p, Cln1p, Cln2p), die jedoch nach den bisherigen Erkenntnissen keinen

direkten Funktionsbezug zu dem Ste7-Protein besitzen.

3. Proteine mit einer bekannten Zellfunktion (Pop4p, Bud5p, Dun1p, Prp42p Mcm6p

und Hsp104p), die in keinem offensichtlichen Zusammenhang zu der Interaktion mit

Ste7p stehen.

4. Proteine, die aufgrund unbekannter Zellfunktionen potentiell für die Aufgabe als

Ste7p-Regulationsproteine in Betracht kamen (Ycl024Wp, Yhl023Cp, Ykr038Cp,

Ylr033Wp, Yol078Wp und Yol087Cp).

Die spezifische Charakterisierung dieser Proteine der 4. Kategorie erfolgte durch die

Phänotypanalysen deletionsmutierter Zellen bzw. überexprimierender Zellen und ergab

keine Verhaltensabweichungen. Somit konnte diesen Proteinen keine offensichtliche

Funktion der MEK-Regulation zugewiesen werden.

Inwieweit ungeeignete Systemparameter bei der Isolierung der Interaktionspartner oder

ein mit den angewendeten Analysen nicht ermittelbarer Phänotyp dafür verantwortlich

waren kann nicht eindeutig entschieden werden.

Deshalb muß die Frage nach ‘negativen Kontrollelementen’ der Ste7p-Regulation

derzeit noch unbeantwortet bleiben.

6. Literatur

95

6. Literatur

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signal transduction in Saccharomyces cerevisiae requires the sequential function

of three protein kinases Mol Cell Biol, 13, 2069-80.

Danksagung

Bei Herrn Prof. Dr. W. Duntze möchte ich mich persönlich für die

Überlassung des interessanten Themas, sowie für die Unterstützung

und Betreuung während der Anfertigung dieser Arbeit bedanken.

Herrn Prof. Dr. E. W. Weiler danke ich für die freundliche Übernahme

des Koreferats.

Herrn Dr. R. Betz danke ich für die Diskussionsbereitschaft und Hilfe-

stellungen bei Versuchsdurchführungen.

Frau S. Wütrich möchte ich für die engagierten Fotoarbeiten danken.

Schließlich möchte ich mich bei den ehemaligen und jetzigen

Mitarbeitern des Lehrstuhls für Physiologische Chemie für Rat und Tat

und für die gute Zusammenarbeit bedanken.

Isolierung und Charakterisierung potentieller ... · Dieses Protein scheint als Gerüst zu dienen,...

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