![Human Lactate Dehydrogenase A subunit (LDHA) AlphaLISA … · 2017. 11. 15. · Vol. of [LDHA (µL) Vol. of diluent (µL) * LDHA] in standard curve (g/mL in 5 µL) (pg/mL in 5 µL)](https://static.fdokument.com/doc/165x107/5fd904a304a8e8573530cadf/human-lactate-dehydrogenase-a-subunit-ldha-alphalisa-2017-11-15-vol-of-ldha.jpg)
Isolierung von Glyoxysomen · 2013-11-18 · Glyoxysomen 4.1. Enzymtest Ansatz für Enzymtest: 400...
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Glyoxysomen Isolierung von Glyoxysomen 1. Glyoxysomen: Aufbau Alle eukaryontischen Zellen enthalten Peroxysomen. Das sind kleine, mit nur einer Membran gegenüber dem Cytoplasma abgegrenzte Vesikel mit einem Durchmesser von ca. 0,2 - 1,5 µm. Die Membranen besitzen keine Invaginationen und sind stets ohne Ribosomenbesatz. Peroxysomen enthalten Enzyme die die bei verschiedenen Stoffwechselvorgängen entstehenden freien Radikale unschädlich machen. Glyoxysomen sind spezialisierte Peroxysomen, die nur in Pflanzenzellen -hier vor allem in keimenden Samen- vorkommen. In ihnen sind Enzyme der Fettsäureoxidation und des Glyoxylatzyklus lokalisiert. Mit Beginn der Keimung entstehen die Glyoxysomen in großer Zahl in den fettspeichernden Zellen des Endosperms bzw. der Kotyledonen, vermutlich durch Abschnürung vom Endoplasmatischen Retikulum. Die Enzyme werden erst später in die Vesikel eingelagert. 1.2. Glyoxysomen: Funktion Bei den Pflanzensamen dienen vor allem Fette als Energiespeicher. Mit Beginn der Keimung besteht aber auch ein Bedarf an Kohlenhydraten (z.B. zur Synthese von Zellulose). Da der Keimling in den ersten Tagen noch nicht zur Photosynthese in der Lage ist, muß der gesamte Energie- und Baustoffbedarf aus dem gespeicherten Material gedeckt werden. Die Glyoxysomen enthalten hierzu einen Teil der Enzyme, die zum Fettsäureabbau und zur Gluconeogenese notwendig sind. Der Reaktionszyklus der zur Überführung eines C2-Körpers (Acetyl-CoA, dem Endprodukt des Fettsäureabbaus) in einen C4-Körper (Succinat) führt, wird als Glyoxylat- oder Krebs-Kornberg-Zyklus bezeichnet. Der Glyoxylatzyklus kann auch von Bakterien durchgeführt werden, hier befinden sich die entsprechenden Enzyme jedoch in/an der Cytoplasmamembran und im Cytoplasma. Der Glyoxylatzyklus in Pflanzenzellen ist auf drei intrazelluläre Kompartimente aufgeteilt, zwischen denen ein reger Stoffaustausch herrscht (Abb. 1). Von den Enzymen, die sowohl am Zitronensäure- als auch am Glyoxylatzyklus beteiligt sind, gibt es jeweils zwei Isoenzyme. Nachdem die Fettsäuren in den Glyoxysomen über die β-Oxidation zu Acetyl-CoA abgebaut wurden, wird Acetyl-CoA mit Oxalacetat durch die Citrat-Synthase zu Citrat kondensiert. Es erfolgt eine Umlagerung über cis-Aconitat zu Isocitrat. Isocitrat wird von der Isocitrat-Lyase, einem der beiden Leitenzyme der Glyoxysomen, zu Succinat und Glyoxylat gespalten. Succinat wird in die Mitochondrien transportiert und über die Reaktionen des Zitronensäure- oder Krebs- Zyklus zu Oxalacetat umgesetzt. Durch eine Transaminierung entsteht Aspartat, das wieder in die Glyoxysomen gelangt. Das Aspartat wird hier wieder zu Oxalacetat desaminiert und steht für 1
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Glyoxysomen
Isolierung von Glyoxysomen
1. Glyoxysomen: Aufbau
Alle eukaryontischen Zellen enthalten Peroxysomen. Das sind kleine, mit nur einer Membrangegenüber dem Cytoplasma abgegrenzte Vesikel mit einem Durchmesser von ca. 0,2 - 1,5 µm.Die Membranen besitzen keine Invaginationen und sind stets ohne Ribosomenbesatz.Peroxysomen enthalten Enzyme die die bei verschiedenen Stoffwechselvorgängenentstehenden freien Radikale unschädlich machen.
Glyoxysomen sind spezialisierte Peroxysomen, die nur in Pflanzenzellen -hier vor allem inkeimenden Samen- vorkommen. In ihnen sind Enzyme der Fettsäureoxidation und desGlyoxylatzyklus lokalisiert. Mit Beginn der Keimung entstehen die Glyoxysomen in großer Zahlin den fettspeichernden Zellen des Endosperms bzw. der Kotyledonen, vermutlich durchAbschnürung vom Endoplasmatischen Retikulum. Die Enzyme werden erst später in die Vesikeleingelagert.
1.2. Glyoxysomen: Funktion
Bei den Pflanzensamen dienen vor allem Fette als Energiespeicher. Mit Beginn der Keimungbesteht aber auch ein Bedarf an Kohlenhydraten (z.B. zur Synthese von Zellulose). Da derKeimling in den ersten Tagen noch nicht zur Photosynthese in der Lage ist, muß der gesamteEnergie- und Baustoffbedarf aus dem gespeicherten Material gedeckt werden. DieGlyoxysomen enthalten hierzu einen Teil der Enzyme, die zum Fettsäureabbau und zurGluconeogenese notwendig sind. Der Reaktionszyklus der zur Überführung eines C2-Körpers(Acetyl-CoA, dem Endprodukt des Fettsäureabbaus) in einen C4-Körper (Succinat) führt, wirdals Glyoxylat- oder Krebs-Kornberg-Zyklus bezeichnet. Der Glyoxylatzyklus kann auch vonBakterien durchgeführt werden, hier befinden sich die entsprechenden Enzyme jedoch in/an derCytoplasmamembran und im Cytoplasma.
Der Glyoxylatzyklus in Pflanzenzellen ist auf drei intrazelluläre Kompartimente aufgeteilt,zwischen denen ein reger Stoffaustausch herrscht (Abb. 1). Von den Enzymen, die sowohl amZitronensäure- als auch am Glyoxylatzyklus beteiligt sind, gibt es jeweils zwei Isoenzyme.Nachdem die Fettsäuren in den Glyoxysomen über die β-Oxidation zu Acetyl-CoA abgebautwurden, wird Acetyl-CoA mit Oxalacetat durch die Citrat-Synthase zu Citrat kondensiert. Eserfolgt eine Umlagerung über cis-Aconitat zu Isocitrat. Isocitrat wird von der Isocitrat-Lyase,einem der beiden Leitenzyme der Glyoxysomen, zu Succinat und Glyoxylat gespalten. Succinatwird in die Mitochondrien transportiert und über die Reaktionen des Zitronensäure- oder Krebs-Zyklus zu Oxalacetat umgesetzt. Durch eine Transaminierung entsteht Aspartat, das wieder indie Glyoxysomen gelangt. Das Aspartat wird hier wieder zu Oxalacetat desaminiert und steht für
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eine erneute Kondensation mit Acetyl-CoA zur Verfügung. Aus dem bei der Spaltung vonIsocitrat entstandenen Glyoxylat entsteht durch Malat-Synthase Malat. Malat wird insCytoplasma transportiert und steht hier zur Synthese von Glucose (Gluconeogenese) zurVerfügung. Die Malat-Synthase ist das zweite Leitenzym der Glyoxysomen.
Als Summe der Reaktionen des Glyoxylatzyklus ergibt sich:
2 Acetyl-CoA + NAD+ + 2H2O → Succinat + 2 CoA + NADH + H+
Die Reaktionen des Glyoxylatzyklus sind in Abb.2 übersichtlich dargestellt.
Abb. 1. Aufteilung der Reaktionen des Glyoxylatzyklus in verschiedene Kompartimente.
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Abb.2. Reaktionen des Glyoxylatzyklus.
1.3. Der Begriff „Leitenzym“
Die eukaryontischen Zellen bestehen aus verschiedenen Kompartimenten wie Cytosol,Zellkern, Mitochondrien etc. Bei Pflanzenzellen kommen noch verschiedene andere Organellenwie z.B. Plastiden und Glyoxysomen vor. In diesen Organellen sind spezifischeStoffwechselreaktionen mit den dazugehörigen Enzymen lokalisiert. Man bezeichnet das dortvorherrschende und charakteristische, nicht in anderen Organellen vorkommende Enzym alsLeitenzym dieser Struktur. Dessen spezifische Aktivität hilft bei der differentiellen Zentrifugation,aber auch bei der Gradientenzentrifugation, Zellfraktionen zu identifizieren.
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2. Isolierung von Glyoxysomen
Die Isolierung der Glyoxysomen erfolgt durch differentielle Zentrifugation und eineranschließenden Auftrennung der verschiedenen Zellfraktionen in einem Saccharose-dichtegradienten.Als Ausgangsmaterial dienen 20 g vorgekeimte (3 Tage bei 26°C) Sonnenblumenkerne.Alle Präparationsschritte sollten auf Eis und mit vorgekühlten Puffern durchgeführt werden, umden durch Proteasen bedingten Proteinverlust zu minimieren.
Das Endospermgewebe wird unter Zusatz von 2 Volumen (1 Volumen = g eingesetztes Gewebein ml) Puffer 1 mit einem Zwiebelhacker fein zerkleinert und anschließend in einem Mörserweiter zerrieben.Der resultierende Brei wird durch 4 Lagen Verbandsmull filtriert, und der Filterkuchen vorsichtigausgepreßt. Das Filtrat, welches die Glyoxysomen enthält, wird nach folgendem Schema weiteraufgearbeitet:
Filtrat
Zentrifugation Rotor SS341500 rpm (270 g), 10 min
Überstand 1 (Ü1) Pellet 1 (P1)
Zentrifugation Rotor SS349300 rpm (10000 g), 30 min
Überstand 2 (Ü2) Pellet 2 (P2) Iin wenig Puffer 1 (2 ml) aufnehmen I10 - 15 mg Protein auf einenSaccharosegradienten auftragen IZentrifugation Rotor SW 2828000 rpm (110000 g), 2 h IGradient am Fraktionssammler absaugen und fraktioniert auffangen(F1 - F4)
Puffer1: 0,5 M Saccharaose Saccharosegradient: 60 % (w/w) Saccharose0,15 M Tris/HCL, pH 7,5 57 % (w/w) Saccharose10 mM KCl 50 % (w/w) Saccharose alle mit 1 mM EDTA1 mM MgCl2 44 % (w/w) Saccharose1 mM EDTA 33 % (w/w) Saccharose10 mM Dithiothreitol 25 % (w/w) Saccharose
Von allen Proben (Filtrat, Überstände, Pellets und Gradientenfraktionen) werden Protein-bestimmungen sowie Enzymtests gemacht um die Aufreinigung der Glyoxysomen zu verfolgen.
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3. Proteinbestimmung nach Bradford
Bei der Proteinbestimmung nach Bradford handelt es sich um eine kolorimetrische Protein-bestimmung. Die Methode beruht auf der Bindung des Farbstoffs Coomassie Brilliant BlueG250 an Proteine. Hierbei kommt es zu einer Verschiebung des Extinktionsmaximums desFarbstoffs von 465 nm nach 595 nm. Da der Proteintest schnelle Ergebnisse liefert, aufSaccharose und die meisten Salze nicht anspricht und nur durch Detergentien in höherenKonzentrationen beeinflußt wird, kommt er häufig zur Anwendung.
Testansatz: 790 µl Wasser10 µl Proteinlösung (max. 10 mg Protein)200 µl Bradford-Reagenz
5 min bei Raumtemperatur stehen lassen
Extinktion bei 595 nm im Photometer gegen Blindwert messen
Die Proteinkonzentration wird anhand einer Eichgeraden berechnet und in dieAufreinigungstabelle eingetragen. Es gilt (eine evtl. Verdünnung der Probe ist zuberücksichtigen!):
Extinktion595nm / Faktor aus Eichgerade = µg Protein / 10µl Lösung
4. Bestimmung der Enzymkinetik
Es wird die katalytische Aktivität der Isocitrat-Lyase, einem der beiden Leitenzyme derGlyoxysomen, bestimmt.
Das bei dieser Reaktion entstehende Glyoxylat reagiert sofort mit Phenylhydrazin zu Glyoxylat-Phenylhydrazon weiter. Die Entstehung dieser Verbindung kann durch Messung der Extinktionbei 324 nm verfolgt werden.
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4.1. Enzymtest
Ansatz für Enzymtest:
400 µl 0,5 M Kalium-Phosphat-Puffer, pH 6,85 100 µl 150 mM MgCl2 100 µl 100 mM Phenylhydrazin 100 µl 60 mM Cystein 2090 µl entmineralisiertes Wasser 200 µl Protein-Probe (evtl. verdünnen) Zum Starten der Reaktion: 10 µl 0,5 M Isocitrat
Es wird die Extinktionszunahme bei 324 nm (ΔE324) für 3-4 min gemessen.
Der Reinheitsgrad eines Enzyms wird durch die spezifische Aktivität beschrieben. Sie ist alsVerhältnis der katalytischen Aktivität zum Proteingehalt der Probe definiert:
katalytische Aktivität (Enzymeinheiten)(1) spez. Aktivität =
Protein (mg)
Ein Maß für die katalytische Aktivität ist die Änderung der Extinktion (s.o.). Die Extinktions-änderungist proportional der Konzentrationsänderung der untersuchten Verbindung. Dieser Zusammenhangwird durch das Lambert-Beer´sche Gesetz (2) beschrieben:
ε: molarer Extinktionskoeffizient(2) ΔE324 = ε × Δc × d Δc: Konzentrationsänderung der
untersuchten Substanz
d: Schichtdicke der Meßküvette
Die katalytische Aktivität wird in Enzymeinheiten (Units) U angegeben. Eine Enzymeinheit ist alsdiejenige Enzymmenge definiert, die pro Minute 1 µmol Substrat umsetzt. (Die abgeleitete SI-Einheitist das Katal [kat]. Für die Umrechnung gilt: 1 U = 16,67 nkat).
Substratumsatz (Δc)(3) Enzymeinheiten (U) =
Zeit (min)
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Der Substratumsatz wird durch Messen der Extinktionszunahme bei 324 nm erfaßt. Durch Einsetzenvon Gleichung (2) in (3) erhält man
ΔE324
(4) Enzymeinheiten (U) = ε × d × min
Um die spezifische Aktivität zu bestimmen werden die Enzymeinheiten in Beziehung zumProteingehalt gesetzt, d.h. Gleichung (4) wird in (1) eingesetzt. Da ε, d und die Minute feste Größensind, werden sie zu einer Konstanten K zusammengefaßt. Mit Gleichung (5) kann die spezifischeAktivität aus den experimentell ermittelten Daten bestimmt werden:
ΔE324 ΔE324
(5) spez. Aktivität = = × Kε × d × min × mg Protein mg Protein
K = 1,7 × 10-4
Aufreinigungstabelle:
Probe Volumenml
Protein mg/ml
Gesamt-protein
spezifischeAktivität
Gesamt-Aktivität
Filtrat
Ü1
P1
Ü2
P2
F1
F2
F3
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Schema Stufengradient: 3 und 5 stufiger Gradient:
Beispiele für den Proteingehaltsverlauf bei Stufengradienten unter verschiedenen Bedingungen:
Auftrag: 1000µl Probe (ca. 50 mg Protein): Auftrag: 500 µl Probe (ca. 25 mg Protein):
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