Jennifer Carolina Gutiérrez Suárez · 2014-06-11 · tóxicos que van desde urticaria hasta...

Evaluación de la citotoxicidad y eficacia in vitro de los componentes para un sistema farmacéutico tipo

película, con antimoniato de meglumina como principio activo

Jennifer Carolina Gutiérrez Suárez

Universidad Nacional de Colombia

Facultad de Ciencias, Departamento de Farmacia

Bogotá, Colombia

2012

Evaluación de la citotoxicidad y eficacia in vitro de los componentes para un sistema farmacéutico tipo

película, con antimoniato de meglumina como principio activo

Jennifer Carolina Gutiérrez Suárez

Tesis o trabajo de investigación presentada(o) como requisito parcial para optar al título

de:

Magíster en Ciencias Farmacéuticas

Directora:

DrSc. Gabriela Delgado Murcia

Línea de Investigación:

Farmacología

Grupo de Investigación:

Grupo de Investigación en Inmunotoxicología

Universidad Nacional de Colombia

Facultad de Ciencias, Departamento de Farmacia

Bogotá, Colombia

2012

A ti Dios, tu misericordia me ha acompañado hasta este día.

A mi esposito, mi chiquis Marianita y a mis padres por el apoyo incondicional

“¡Pues el SEÑOR concede sabiduría! De su boca provienen el saber y el entendimiento.”

Proverbios 2:6 NTV

Agradecimientos

Quisiera en este pequeño espacio agradecer a tantas personas que fueron participes durante la realización de uno de mis metas. Primero, quiero agradecerte a ti DIOS MI SEÑOR, porque me has demostrado que siempre estas a mi lado y tengo tu favor, por darme las fuerzas físicas y emocionales para culminar esta meta…definitivamente sin ti no lo hubiera logrado…Te amo!!! A mi familia: mi esposito, mi hija, mi mamita, mi papá, mis hermanos Natalia y José David y mis tíos: Efraín, Martha y Omar, gracias porque con su apoyo moral y económico hicieron que este camino fuera un poco mas fácil de recorrer. A quien fue mi tutora, mi maestra, y en muchas circunstancias mi consejera, profesora Gabriela Delgado gracias por darme nuevamente la oportunidad de ingresar al grupo y hacer parte del equipo de trabajo. A mis compañeros del grupo de investigación en Inmunotoxicología, a ustedes: Diana Granados, Jeysson Sánchez, Ángela María Gómez, Erika Torres, Johana Domínguez, Magda Flórez, Leslie Peñaloza, quienes me apoyaron durante todo el desarrollo de mi tesis. Al Departamento de Farmacia y al grupo de Investigación Procesos de Transformación de Materiales para la Industria Farmacéutica, especialmente a Jhon Jairo Pinzón por la colaboración en algunas fases del desarrollo experimental de esta tesis. Al Instituto Colombiano por el Departamento Administrativo de Ciencia, Tecnología e Innovación, (proyecto aprobado 110151928476) y a la Dirección de Investigación sede Bogotá (DIB, proyecto No. 16015), quienes brindaron los recursos económicos para la realización de este proyecto. A la Universidad Nacional y su programa de Maestría en Ciencias Farmacéuticas por darme la oportunidad de aprender y suministrarme los espacios y herramientas para mi desarrollo académico.

VIII Evaluación de la citotoxicidad y eficacia in vitro de los componentes

Resumen y Abstract IX

Resumen La Organización Mundial de la Salud (OMS) sugiere el uso de las sales de antimonio pentavalente como tratamiento de primera elección para el control de la leishmaniosis, sin embargo, formulaciones con este ingrediente farmacéutico activo inducen efectos tóxicos que van desde urticaria hasta nefrotoxicidad y hepatotoxicidad (incluso como evento asociado con muertes secundarias al tratamiento). Por lo anterior, diversos grupos de investigación en el mundo han encaminado sus esfuerzos en la búsqueda de nuevas alternativas terapéuticas que disminuyan estos efectos, conservando ó mejorando la eficacia de los antimoniales. En este sentido, las películas poliméricas como sistemas de entrega, permiten entre otras cosas la administración localizada de un fármaco, reduciendo así los efectos secundarios sistémicos, por lo cual son consideradas como una opción para el tratamiento de enfermedades como la Leishmaniosis Cutánea (LC). De este modo, el objetivo del presente estudio fue evaluar la citotoxicidad de una película polimérica como sistema de entrega de antimoniato de meglumina (una clase de sal de antimonio pentavalente) sobre macrófagos humanos (MDMSP) y fibroblastos L929, así como evidenciar su eficacia in vitro sobre parásitos de Leishmania panamensis y Leishmania major, observándose que los materiales para la elaboración de este sistema indujeron citotoxicidad diferencial, representada en la respuesta encontrada con el uso de los tipos celulares evaluados, mientras que la mezcla prototipo mostró una mayor toxicidad que los materiales analizados individualmente. Igualmente, se evidenció que la forma farmacéutica final (sistema terapéutico tipo película polimérica) generó un grado 3 de toxicidad sobre fibroblastos, lo cual sumado a los hallazgos de eficacia del antimonio liberado, sugieren que algunos de los materiales o productos derivados de ellos, son cedidos a los sobrenadantes de cultivo generando toxicidad sobre estas poblaciones celulares. Por lo anterior, se sugiere modificar la formulación aquí mencionada, ó estudiarla en el contexto de piel (natural o artificial) lesionada, a fin de evidenciar sus verdaderos alcances y limitaciones.

Palabras clave: Leishmaniosis cutánea, Quitosán, citotoxicidad, macrófago, sistema terapéutico.

X Evaluación de la citotoxicidad y eficacia in vitro de los componentes

Abstract

Pentavalent antimonial salts as the first-line of treatment for leishmaniasis disease are suggested by the World Health Organization (WHO), however, formulations with this active ingredient induces several adverse effects (as urticaria, nephrotoxicity or hepatotoxicity, even associated with deaths secondary to administration of the treatment). Therefore, different research groups around the world have directed their efforts in order to find new therapeutic alternatives that reduce these adverse effects, conserving or improving the efficiency of antimoniate. Polymeric films as delivery systems allow a localized administration of an active pharmaceutical ingredient, thereby reducing the adverse effects associated with their systemic distribution, reason by which this alternative could be used as a good options to solve the mentioned problems. In this regard, the aim of this study was to evaluate the in vitro cytotoxicity of a polymeric film as delivery system meglumine antimoniate on human macrophages and fibroblasts L929, as also their effectiveness on parasites of Leishmania major and Leishmania panamensis, evidencing that the materials using for the elaboration of this system, showed a differential cytotoxic activity on all cell types tested, while the prototype mixture was more toxic than materials analyzed by separate. Likewise, the final form of this formulation (polymer film-based therapeutic system) induces a grade 3 of toxicity on fibroblasts L929, findings added to those obtained from the efficacy assays, suggested that could be materials or products derived from these, that are delivered to culture supernatants inducing a toxicity on the cells population tested here. Taking into account these results, we suggest that is necessary to modify this formulation or evaluate it in a skin context (natural or artificial) damaged in order to know the real scopes and limitations.

Keywords: Cutaneous Leishmaniasis, chitosan, cytotoxicity, macrophage, therapeutic system.

Contenido XI

Contenido

Pág.

Resumen ........................................... .............................................................................. IX

Lista de figuras .................................. .......................................................................... XIV

Lista de tablas ................................... ........................................................................... XV

Lista de abreviaturas ............................. ...................................................................... XVI

Introducción ...................................... .............................................................................. 1

1. Estado del arte.................................... ...................................................................... 4

1.1 Leishmaniosis .................................................................................................. 4

1.1.1 Patología y agente etiológico ................................................................ 4

1.1.2 Ciclo de vida ......................................................................................... 6

1.1.3 Vector ................................................................................................... 6

1.1.4 Transmisión y factores de riesgo ........................................................... 6

1.1.5 Manifestaciones clínicas ....................................................................... 7

1.1.6 Respuesta inmune ................................................................................ 9

1.1.7 Papel de los macrófagos en la patogenia del parásito......................... 10

1.1.8 Epidemiología ..................................................................................... 11

1.1.9 Diagnóstico ......................................................................................... 12

1.1.10 Tratamiento ......................................................................................... 12

1.2 Antimoniato de meglumina ............................................................................ 14

1.2.1 Generalidades ..................................................................................... 14

1.2.2 Farmacocinética .................................................................................. 14

1.2.3 Mecanismo de acción.......................................................................... 14

1.2.4 Eficacia ............................................................................................... 15

1.2.5 Vías de administración y dosis ........................................................... 15

1.2.6 Efectos adversos ................................................................................. 16

1.2.7 Alternativas terapéuticas en combinación con antimoniales ................ 16

1.3 Sistemas de entrega de ingredientes farmacéuticos activos .......................... 18

1.3.1 Generalidades ..................................................................................... 18

1.3.2 Mecanismos de liberación ................................................................... 18

1.3.3 Rutas de administración ...................................................................... 20

1.3.4 Polímeros usados en sistemas de liberación controlada ..................... 21

1.3.5 Sistemas de entrega usados para el tratamiento de la LC .................. 22

2. Materiales y Métodos .............................. ............................................................... 23

2.1 Muestras ........................................................................................................ 23

XII Evaluación de la citotoxicidad y eficacia in vitro de los componentes

2.2 Materiales (excipientes de formulación) .........................................................23

2.2.1 Preparación de polímeros y mezcla .....................................................24

2.3 Cultivos celulares ...........................................................................................24

2.3.1 Obtención de macrófagos ....................................................................24

2.3.2 Fibroblastos L929 ................................................................................24

2.3.3 Promastigotes de Leishmania panamensis y Leishmania major ..........25

2.4 Metodología para alcanzar el objetivo 1: “Establecer la citotoxicidad de los materiales usados en el sistema terapéutico, sobre macrófagos humanos y sobre promastigotes de Leishmania panamensis y Leishmania major”. ..............................25

2.4.1 Evaluación de la citotoxicidad de los materiales usados en el sistema de entrega, sobre células no parasitarias (macrófagos humanos y fibroblastos L929)….. ............................................................................................................25

2.4.2 Determinación de la citotoxicidad de los materiales usados en el sistema de entrega, sobre promastigotes de Leishmania panamensis y Leishmania major...............................................................................................26

2.4.3 Determinación de la citotoxicidad de los materiales usados en el sistema de entrega, sobre amastigotes internalizados de Leishmania panamensis y Leishmania major. .......................................................................27

2.5 Efecto inmunomodulador de los polímeros .....................................................28

2.5.1 Cuantificación de Interleuquinas ..........................................................28

2.5.2 Cuantificación de óxido nítrico .............................................................28

2.6 Metodología para alcanzar el objetivo 2: “Evaluar comparativamente la capacidad leishmanicida in vitro de la formulación convencional de antimoniato de meglumina respecto al sistema terapéutico tipo película (con antimoniato de meglumina, como ingrediente farmacéutico activo), empleando macrófagos humanos infectados experimentalmente con Leishmania panamensis y Leishmania major”. ...29

2.6.1 Evaluación de la liberación del antimonio pentavalente contenido en el sistema terapéutico tipo película. .......................................................................29

2.6.2 Evaluación in vitro de un parámetro de seguridad del sistema de entrega tipo película. ..........................................................................................30

2.6.3 Determinación de la efectividad in vitro del antimonio pentavalente liberado desde el sistema terapéutico sobre macrófagos infectados con Leishmania panamensis y Leishmania major. ....................................................31

2.7 Análisis de resultados de citotoxicidad y eficacia. ...........................................32

3. Resultados y Discusión ............................ ..............................................................33

3.1 Determinación de la seguridad del sistema terapéutico y sus componentes. .33

3.1.1 Evaluación de la citotoxicidad de excipientes para la elaboración de la película polimérica sobre MDMSP y fibroblastos de la línea L929. ....................33

3.1.2 Evaluación de la citotoxicidad de los excipientes para la elaboración de una película polimérica sobre promastigotes y amastigotes internalizados de Leishmania panamensis y Leishmania major. ....................................................36

3.2 Efecto inmunomodulador de los polímeros .....................................................39

3.2.1 Cuantificación de interleuquinas relacionadas con el proceso inflamatorio en sobrenadantes de cultivo de MDMSP sin infectar, MDMSP infectados con Leishmania panamensis y MDMSP infectados con Leishmania major, expuestos a los polímeros empleados en la película polimérica. .............39

3.3 Determinación de la eficacia del sistema de entrega tipo película cargada con antimoniato de meglumina versus la formulación convencional ................................44

3.3.1 Cuantificación de antimonio pentavalente liberado del sistema terapéutico .........................................................................................................44

Contenido XIII

3.3.2 Evaluación de la citotoxicidad del sistema de entrega sobre fibroblastos L929…… ........................................................................................................... 47

3.3.3 Eficacia comparativa entre el sistema terapéutico tipo película polimérica cargada con antimoniato de meglumina, respecto a la formulación convencional ..................................................................................................... 51

4. Conclusiones y perspectivas ....................... ......................................................... 53

A. Anexo: Proyecto financiado por la Dirección de Inve stigación de la Sede Bogotá (DIB) (código: 14452) ...................... ................................................................. 55

B. Anexo: Proyecto financiado por la Dirección de Inve stigación de la Sede Bogotá (DIB) (código: 16015) ...................... ................................................................. 57

C. Anexo: Proyecto financiado por Colciencias (código 202010015699)................ 59

D. Anexo: Presentación oral en el II Simposio de Inmun omodulación y III Encuentro Nacional de Investigación en Inmunología ............................................... 61

E. Anexo: Presentación oral en el XV Congreso de la Fe deración Farmacéutica Sudamericana ...................................... .......................................................................... 63

F. Anexo: Presentación poster en el XII Congreso Inter nacional del Colegio Nacional de Bacteriología. ........................ .................................................................... 65

G. Anexo: Articulo aceptado para publicación en el Jou rnal Immunopharmacology and Immunotoxicology .............................. ................................................................... 67

Bibliografía ...................................... .............................................................................. 69

Contenido XIV

Lista de figuras

Pág. Figura 3 -1: Microfotografías de MDMSP y fibroblastos L929 expuestos a S1………………36 Figura 3 -2: Concentración de mediadores solubles (IL-8, IL-1β, IL-6, IL-10, TNF-α

Y NO2-) expresadas en las diferentes células evaluadas...................................42

Figura 3 -3: Curva de Liberación de antimonio pentavalente desde la pelicula durante 96 horas..............................................................................................................46

Figura 3 -4: Microfotografías del control de fibroblastos sin exposición a sobrenadantes de elución…………………………………………………………………………...…47

Figura 3 -5: Microfotografías de fibroblastos expuestos a sobrenadantes de elución de controles y sistemas terapéuticos tipo película a las 24 y 72 horas…………….48

Contenido XV

Lista de tablas

Pág. Tabla 1-1: Clasificación de las especies del genero Leishmania……………………………...5 Tabla 2-1: Grados de reactividad de materiales poliméricos en la prueba de elución de

extractos…………………………………………………………………………….....30 Tabla 3-1: CL50 para cada excipiente y mezcla prototipo sobre MDMSP, fibroblastos

L929 y promastigotes de Leishmania panamensis y Leishmania major..…….35 Tabla 3-2: CL50 de cada excipiente sobre amastigotes internalizados de Leishmania

panamensis y Leishmania major……………………………………………………37 Tabla 3-3: Concentración de interleuquinas y NO2

- cuantificados en sobrenadantes de cultivo de MDMSP expuestos a Polímeros de QMP y P1..………………………43

Tabla 3-4: Concentración de interleuquinas y NO2- cuantificados en sobrenadantes de

cultivo de MDMSP infectados experimentalmente con Leishmania panamensis y expuestos a los polímeros QMP y P1…..…………………..…….43

Tabla 3-5: Concentración de interleuquinas y NO2- cuantificados en sobrenadantes de

cultivo de MDMSP infectados experimentalmente con Leishmania major y expuestos a los polímeros QMP y P1………………………………………………44

Tabla 3-6: Cinética de liberación del antimonio pentavalente desde el sistema terapéutico tipo película polimérica………………...............................................46

Tabla 3-7: Citotoxicidad cuantitativa y cualitativa del sistema terapéutico tipo película polimérica sobre fibroblastos L929 empelando tres distintas metodologías…...48

Tabla 3-8: Eficacia comparativa del antimoniato de meglumina formulado en un sistema terapéutico tipo película respecto a la formulación convencional Albiventriz®…51

Contenido XVI

Lista de abreviaturas Abreviatura Término ADN Acido desoxirribonucleico anti-IL4 Anticuerpo Anti- Interleuquina 4 BALB/c Cepa de ratones susceptibles a infección por Leishmania major C3b Fracción C3b de complemento activado C3bi Fracción de complemento C3b inactivo C57BL/6 Cepa de ratones resistentes a infección por Leishmania major C5b Fracción C5b de complemento activado C9 Fracción de complemento C9 CD4+ Clúster de diferenciación 4 (+) CD8+ Clúster de diferenciación 8 (+) CD80 Clúster de diferenciación 80 CD86 Clúster de diferenciación 86 CMH Complejo Mayor de Histocompatibilidad CMH II Complejo Mayor de Histocompatibilidad Tipo 2 Gp63 Glicoproteína 63 IFN-γ Interferón gamma IL Vía de administración Intralesional IL-1 Interleuquina 1 IL-10 Interleuquina 10 IL-12 Interleuquina 12 IL-18 Interleuquina 18 IL-4 Interleuquina 4 IM Vía de administración Intramuscular IV Vía de administración Intravenosa LC Leishmaniosis Cutánea LCNM Leishmaniosis Cutánea Nuevo Mundo LCVM Leishmaniosis Cutánea Viejo Mundo LMC Leishmaniosis Mucocutánea LPG Lipofosfoglicano LT Linfocito T LV Leishmaniosis Visceral LVVM Leishmaniosis Visceral Viejo Mundo MDMSP Macrófagos derivados de Monocitos de Sangre Periférica

Contenido XVII

NADPH Enzima Nicotinamida-Adenina-Dinucleótido-Fosfato OMS Organización Mundial de la Salud PCR Reacción en cadena de la Polimerasa PKDL Leishmaniosis dérmica post-Kala azar RFLP Polimorfismo de fragmentos por restricción SbIII Antimoniales forma trivalente SbV Antimoniales forma pentavalente SFB Suero Fetal Bovino SIVIGILA Sistema de Vigilancia en Salud Pública TDR1 Enzima Reductasa dependiente del tiol 1 TGF- β Factor de Crecimiento Transformante Beta Th1 Linfocitos "T helper" tipo 1 Th2 Linfocitos "T helper" tipo 2 TNFα Factor de Necrosis tumoral alfa UAF Unidades Arbitrarias de Fluorescencia VO Vía de administración Oral

Introducción

Las leishmaniosis son enfermedades parasitarias causadas por protozoarios del género Leishmania, los cuales ingresan al hospedero vertebrado a través de la picadura de mosquitos del género Phlebotomus infectados. Sus formas clínicas van desde leishmaniosis cutánea (LC), leishmaniosis mucocutánea (LMC) hasta la leishmaniosis visceral (LV), formas clínicas definidas por factores que incluyen la cantidad y especie de parásito inoculado, así como la respuesta inmune del hospedero, principalmente. Catalogada en el grupo de las enfermedades tropicales desatendidas, la leishmaniosis se caracteriza por ser endémica en 88 países en el mundo; se estima que aproximadamente 12 millones de personas padecen esta enfermedad y 350 millones están en riesgo de adquirirla [1]. En Colombia, las leishmaniosis se encuentran distribuidas en forma endémica en el 91% de todo el territorio nacional, presentándose las tres formas clínicas. En 2011 el SIVIGILA, reportó 8188 nuevos casos de la enfermedad, de los cuales la forma cutánea es la de mayor incidencia y prevalencia, sin embargo esta cifra resulta subestimada, dado el elevado número de casos no reportados [2].

El tratamiento de elección para el control de la leishmaniosis, se basa en la administración de sales de antimonio pentavalente, que logran inducir resolución de la enfermedad entre el 36% y el 96% de los casos [3-5]. El éxito de la terapia varía dependiendo de la forma clínica, la sensibilidad intrínseca de la especie infectiva y la farmacocinética del medicamento, por lo que la respuesta al tratamiento puede diferir de un individuo a otro [3]. Además, se han demostrado resistencia parasitaria y efectos adversos con esta quimioterapia, los cuales se han asociado con su distribución sistémica, reportándose incluso muertes secundarias a una hepatotoxicidad fulminante [3, 4].

La eficacia de los antimonios pentavalentes, como el antimoniato de meglumina y el estibogluconato de sodio ha sido muy variable a pesar de ser el tratamiento estándar de la forma cutánea desde 1929 [6, 7], por lo cual se ha implementado el uso de otros medicamentos como la anfotericina B (liposomal), Isetionato de pentamidina (vía intramuscular o intravenosa), paromomicina (tópica) como alternativas terapéuticas, sin embargo también se han reportado para estos fármacos, efectos adversos severos o variabilidad con tendencia a la baja en su eficacia, respecto a los antimonios pentavalentes. Algunos tratamientos utilizando terapias físicas como el uso de frio y calor, uso de luz ultravioleta, luz infrarroja, crioterapia (usando nitrógeno liquido), uso de terapia fotodinámica, entre otros, han sido experimentados para tratar la LC pero han presentado dificultades por factores como costos, uso de equipos especializados (fotodinámica), que hacen que su eficacia resulte muy variable [8]. De igual manera, la implementación de combinaciones (buscando efectos sinérgicos a menores concentraciones individuales)

2 Evaluación de la citotoxicidad y eficacia in vitro de componentes

entre medicamentos ya existentes o en combinación con inmunomoduladores (citoquinas) son una buena alternativa para el control de la leishmaniosis, pero su uso debe soportarse con más ensayos clínicos, antes de definir su uso como tratamiento de rutina [9]. En otro frente y con el fin de mejorar la seguridad del medicamento de primera línea, se han realizado estudios que conllevan a la administración intralesional de las sales de antimonio pentavalente (inyección periódica del medicamento en los bordes de la úlcera, en busca de limitar la distribución sistémica y por ende reducir la toxicidad), dando como resultado una eficacia variable, ya que si bien se presenta menor toxicidad, la administración es bastante dolorosa lo que genera abandono al tratamiento [6]. Por esta razón, otra aproximación en busca de terapias antileishmaniales más eficaces y seguras, es el estudio de nuevas formulaciones usando los ingredientes farmacéuticos activos ya existentes, que permitan superar las limitaciones de los medicamentos disponibles, incluida la vía de administración [10].

En este sentido, la tecnología farmacéutica, ha implementado el uso de sistemas de entrega de fármacos usando polímeros (biocompatibles y biodegradables) que permiten la liberación controlada y localizada del ingrediente farmacéutico activo. Un ejemplo en esta vía, es la anfotericina B liposomal utilizada en el tratamiento de la leishmaniosis visceral, cuyos efectos resultan superiores cuando se comparan con la formulación convencional [10].

Considerando el contexto anterior, en este proyecto se planteó como objetivo general “Evaluar la citotoxicidad y eficacia in vitro del antimoniato de meglumina formulado en copolímeros, utilizando macrófagos humanos infectados con amastigotes de Leishmania panamensis y Leishmania major”. Para alcanzar dicho objetivo se propusieron los siguientes objetivos específicos: (i) Establecer la citotoxicidad de los materiales usados en el sistema terapéutico, sobre macrófagos humanos y sobre promastigotes de Leishmania panamensis y Leishmania major, para lo cual se realizó la evaluación de cinco (5) polímeros, dos (2) solventes, dos (2) plastificantes y una (1) mezcla prototipo para la formulación de la película polimérica sobre macrófagos derivados de monocitos de sangre periférica de donantes voluntarios sanos y promastigotes de Leishmania panamensis y Leishmania major. Con base en los resultados derivados de este objetivo (y otros derivados de análisis farmacotécnicos), se seleccionarían los materiales para la formulación final para posteriores análisis. (ii) Evaluar comparativamente la capacidad leishmanicida in vitro de la formulación convencional de antimoniato de meglumina respecto al sistema terapéutico tipo película (con antimoniato de meglumina, como ingrediente farmacéutico activo), empleando macrófagos humanos infectados experimentalmente con Leishmania panamensis y Leishmania major, para lo cual se emplearon macrófagos infectados con promastigotes de Leishmania panamensis y Leishmania major respectivamente, expuestos al producto de la liberación de la película en medio de cultivo (liberación que asumimos permite la disponibilidad del antimoniato de meglumina). Los resultados del anterior experimento fueron comparados con los obtenidos mediante el uso macrófagos infectados con las dos especies y expuestos directamente al antimoniato de meglumina como medicamento. Si bien hasta acá se cumplió con el cien por ciento (100%) de los objetivos de la tesis, se consideró muy relevante el conocer parámetros de toxicidad adicionales, por lo cual se evaluó la capacidad citotóxica de los materiales y la forma farmacéutica final (sistema terapéutico tipo película) sobre fibroblastos L929 (teniendo en cuenta que estas células cumplen un papel fundamental en la reparación de piel lesionada, pudiendo también ser afectadas en

Introducción 3

la fisiopatología de la LC, así como por el contacto con el medicamento antileishmanial). Estos últimos además son considerados como la línea celular de elección para análisis de citotoxicidad por la farmacopea americana [11, 12].

1. Estado del arte

1.1 Leishmaniosis

1.1.1 Patología y agente etiológico

La leishmaniosis es una enfermedad de origen zoonótico que afecta piel, mucosas o vísceras, la cual es causada por la inoculación de protozoos del genero Leishmania, a través de la picadura de insectos flebótomos. Catalogada en el grupo de las enfermedades tropicales desatendidas, la leishmaniosis se caracteriza por ser endémica en aproximadamente el 30% del mundo [13].

Leishmania es un protozoo flagelado intracelular obligado, de la clase Kinetoplastea, orden Tripanosomatida, familia Trypanosomatidae. Existen alrededor de 20 especies de Leishmania caracterizadas. Aunque poseen la misma morfología, se diferencian por su distribución geográfica, comportamiento biológico, respuesta inmune generada en el hospedero y formas clínicas de la enfermedad [14].

Actualmente, se ha logrado secuenciar el genoma completo de tres especies de Leishmania (Leishmania major, Leishmania infantum, y Leishmania braziliensis). La diferencia genética entre estas tres especies, es de aproximadamente 200 genes y se conoce que el 8% de estos genes pueden evolucionar a diferentes presiones selectivas, lo cual puede ser un factor importante en la agresividad de esta enfermedad. Gracias a estos estudios, se ha permitido concluir, que aunque el género Leishmania comparte genes con otros géneros de la familia Trypanosomatidae, Leishmania posee aproximadamente 1000 genes específicos [15]. El género Leishmania, está clasificado en dos subgéneros, Leishmania y Viannia, cada subgénero comprende varios complejos los cuales se han clasificado según sus características bioquímicas, moleculares, así como el sitio de desarrollo en el tracto digestivo del vector [14,16-18]. Las especies de impacto clínico se muestran en la tabla 1-1.

Capitulo 1 5

Tabla 1-1. Clasificación de las especies del género Leishmania

Género: Leishmania

Subgénero: Leishmania

Complejo: L. donovani

Especies: Asociación a Forma clínica

L. donovani LVVM, LCVM

L. infantum LVVM, LCVM

L. chagasi LVNM

Complejo: L. tropica

Especies:

L. tropica LCVM, LCVM

L. major LCVM

L. aethiopica LCVM

L. killicki LCVM

Complejo: L. mexicana

Especies:

L. mexicana LCNM

L. amazonensis LCNM

L. venezuelensis LCNM

L. gamhami LCNM

L. pifanoi LCNM

Subgénero: Viannia

Complejo: L. braziliensis

Especies:

L. braziliensis LCNM,LMC

L. panamensis LCNM, LMC

L. guyanensis LCNM,LMC

L. peruviana LCNM

L. colombiensis LCNM

L. equatorensis LCNM

L. lainsoni LCNM

LCNM=Leishmaniosis Cutánea Nuevo Mundo. LCVM= Leishmaniosis Cutánea Viejo Mundo. LVVM= Leishmaniosis Visceral Nuevo Mundo Modificado de Botero. D. 2006 y Reithinger, et. Al. 2007

Leishmania spp. posee dos estadíos parasitarios: amastigote y promastigote. Los amastigotes son parásitos redondeados u ovalados que miden de 2 a 5 micras de longitud, no poseen flagelo, tienen una estructura denominada kinetoplasto (mitocondria que contiene ADN extranuclear de forma circular) y se localizan dentro de los macrófagos de hospederos vertebrados [14, 19]. Los promastigotes, son parásitos alargados que miden de 10 a 15 micras de longitud, son nucleados y poseen kinetoplasto que se ubica en el extremo terminal o subterminal del parásito y del cual se desprende un flagelo que le confiere movimiento al mismo; esta


forma se encuentra en el hospedero invertebrado (mosquito) y es la forma infectante para el ser humano y demás hospederos vertebrados [14].

1.1.2 Ciclo de vida

Leishmania tiene un ciclo de vida digenéico, el cual abarca un ciclo en el vector y otro en el hospedero. El vector (hembra hematófaga del género Phlebotomus) toma los amastigotes del hospedero infectado los cuales tienen predilección por diferentes segmentos del tubo digestivo (Hypopyloria: parte posterior del tubo digestivo, Suprapyloria: parte anterior y Peripyloria: ambas partes). Allí, se transforman en promastigotes y por división binaria comienzan a multiplicarse [14].

Pasados 4 a 5 días, migran a la proboscis del vector y obstruyen la luz del tubo faríngeo, por lo que al vector picar al hospedero, estas formas se desprenden e ingresan a la sangre del hospedero humano a través de la piel. Una vez dentro del huésped, los promastigotes son internalizados por los macrófagos, quedando englobados en los fagolisosomas de dichas células, donde se diferenciaran a su forma aflagelar, el amastigote. Dentro del compartimiento endosomal, el parásito se multiplica hasta causar la lisis de la célula infectada, quedando libre para invadir nuevas células blanco [14, 20, 21].

1.1.3 Vector

El vector involucrado en la infección de Leishmania spp. es un insecto de la familia Psychodidae, el cual incluye los géneros Phlebotomus (vector de especies del Viejo Mundo) y Lutzomyia (vector de especies del Nuevo Mundo). Se caracterizan por medir entre 2 a 4 mm, varían en color de gris a casi negro, sus alas toman la forma de V cuando se encuentran en reposo, su actividad es nocturna y a diferencia de los mosquitos tienen la capacidad de volar en silencio. Las hembras son las únicas que al picar al humano succionan su sangre, la cual utilizan para la producción de sus huevos; esta picadura se caracteriza por ser dolorosa [14]. A la fecha solo se ha demostrado que 30 especies de los géneros Phlebotomus y Lutzomyia, son vectores propios de Leishmania spp., ya que son las únicas especies capaces de succionar sangre de humanos y demás reservorios vertebrados y desarrollar el parásito en su interior [22].

En el vector, los promastigotes de Leishmania atacan el epitelio intestinal, se multiplican y diferencian a una forma metacíclica, que es transmitida al hospedero humano. Este paso es muy importante para la supervivencia del parásito y su ciclo de vida, ya que si no lo logra, puede ser eliminado en la materia fecal del insecto. El ataque del parásito a la pared del intestino del vector, es mediado por lipofosfoglicano (LPG), el mayor glicoconjugado de los promastigotes; la estructura de este es polimórfica, lo que ha permitido la diferenciación entre las especies [22].

1.1.4 Transmisión y factores de riesgo

Colombia, por sus características climáticas y geográficas, presenta las condiciones geoecológicas adecuadas para la transmisión de la enfermedad y la proliferación de focos. El ser humano se infecta cuando penetra en áreas ecoepidemiológicas favorables

Capitulo 1 7

como: bosques tropicales primarios, con abundancia de reservorios y vectores; en bosques secundarios, con selva húmeda tropical, y en bosques secos tropicales [23].

Los reservorios encontrados, han sido animales domésticos como el perro, y salvajes como los roedores salvajes, el oso hormiguero, el perezoso, los marsupiales, el zorro, la chucha o zarigüeya; el perro se considera como el reservorio más importante de leishmaniosis visceral. Por lo anterior la leishmaniosis es considerada en algunos casos una enfermedad de tipo zoonótico [23].

Finalmente, factores como la migración de población hacia lugares enzoóticos, aumentan las probabilidades de infección del ser humano, dada la interacción de este con los reservorios y los vectores de los parásitos. La colonización de áreas semiforestales, el movimiento de tropas insurgentes y militares, la explotación extensiva de recursos naturales, la inestabilidad social, las creencias y prácticas sobre la enfermedad, las actitudes y comportamientos encaminados a la protección para evitar el contacto hombre vector y el acceso inoportuno al tratamiento adecuado, son los principales condicionantes de la situación actual de le enfermedad en el país [19, 23].

1.1.5 Manifestaciones clínicas

La leishmaniosis, puede presentar múltiples síntomas, comenzando por una lesión a nivel de piel aparentemente inocua llamada leishmaniosis cutánea (LC), seguida de una forma más severa conocida como leishmaniosis mucocutánea (LMC) y por último una forma llamada leishmaniosis visceral (LV), que si no se trata a tiempo puede causar la muerte. 21 especies de Leishmania son transmitidas por 30 especies de flebótomos. La manifestación clínica de la enfermedad resulta de la replicación del parásito en las células del sistema mononuclear fagocítico, piel y mucosa nasofaríngea, respectivamente [19].

a. Leishmaniosis Cutánea (LC) Posterior a la picadura del flebótomo, las primeras manifestaciones comienzan con una lesión en forma de pápula, posteriormente se forma un nódulo y finalmente se ulcera dejando una depresión central de fondo limpio, con un borde indurado que con el tiempo resulta en una cicatriz atrófica, afectando la matriz celular. Algunas lesiones no se ulceran y en lugar, persisten como nódulos o placas [24]. En el Viejo Mundo, esta forma clínica es causada por Leishmania major, Leishmania tropica, Leishmania aethiopica y se han reportado algunos casos de LC causada por Leishmania infantum. En el Nuevo Mundo, especialmente Latinoamérica los agentes causales implicados en esta forma clínica son Leishmania braziliensis, Leishmania amazonensis, Leishmania guyanensis, y Leishmania panamensis, siendo este ultimo el representante para Colombia [19, 24]. Las especies prevalentes en el Viejo Mundo se caracterizan por causar lesiones localizadas ulcerativas, mientras que las especies del Nuevo Mundo pueden generar manifestaciones clínicas variadas ocasionando en algunos casos LMC [9].


Existen variantes de la forma cutánea:

� Leishmaniosis cutánea localizada: es la variante más prevalente de esta forma, la cual se caracteriza por presentarse como una úlcera indolora con formación de una costra delimitada, que a veces puede ser hemorrágica. Esta forma clínica puede curar espontáneamente, dejando una cicatriz fina lisa e hipopigmentada. Factores como la respuesta inmune del hospedero favorecen que en algunos casos, esta forma evolucione hacia otras formas más críticas de la enfermedad [9].

� Leishmaniosis recidivante: Se caracteriza por aparecer posterior a la curación de una úlcera, presentándose pápulas y lesiones vesiculares alrededor de la cicatriz de la úlcera. Es causada por especies del Viejo Mundo como Leishmania tropica y en algunos casos por Leishmania major; en el Nuevo Mundo hay casos reportados de Leishmania panamensis en Ecuador y Leishmania amazonensis en Brasil [25].

� Leishmaniosis cutánea diseminada: Se caracteriza por presentar múltiples lesiones pápulares que difieren en forma y tamaño, localizadas en dos o más áreas no contiguas del cuerpo y puede estar acompañada de una lesión en mucosa. Esta forma clínica se ha presentado en Brasil, donde el agente causal involucrado es Leishmania braziliensis [26].

� Leishmaniosis cutánea difusa: Se caracteriza por la presencia de lesiones nodulares que son ricas en parásitos, pero no llegan a ulcerarse. Esta forma clínica ha sido reportada en Suramérica, Centroamérica, donde han estado implicadas, especies del Nuevo Mundo como Leishmania mexicana y Leishmania amazonensis y en Etiopia, especies como Leishmania aethiopica (Viejo Mundo) [9, 24, 27].

b. Leishmaniosis Mucocutánea (LMC)

Esta se presenta por la diseminación hematógena o linfática de amastigotes de la piel a la mucosa nasofaríngea, ocasionando una destrucción de nariz, boca y garganta; provocando edema, hiperemia, ulceración y necrosis. Estas lesiones pueden presentarse simultáneamente con la lesión primaria en piel o aparecer meses o años después de que una lesión cutánea que ha cicatrizado espontáneamente. La LMC es causada por especies del subgénero Viannia, en particular Leishmania braziliensis, pero también por Leishmania guyanensis, Leishmania panamensis, Leishmania amazonensis y en algunos casos es causada por Leishmania major [19]. En Colombia, esta forma clínica se presenta con baja frecuencia [28].

c. Leishmaniosis Visceral (LV)

También llamada Kala-Azar, esta forma abarca un amplio rango de signos clínicos como picos febriles, pérdida de peso, hepato y esplenomegalia con índices de pancitopenia, asociada hipergammaglobulinemia concomitante con hipoalbuminemia; esta forma clínica puede ser fatal sino se trata a tiempo. El período de incubación es variable y los síntomas pueden aparecer de una forma muy gradual o abruptamente. Generalmente, suelen aparecer síntomas posteriores a 3 u 8 meses después de la picadura del flebótomo. En las formas subagudas y crónicas el inicio es insidioso con malestar general, dolor abdominal vago, aumento del abdomen, fiebre, debilidad, inapetencia,

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palidez, tos y pérdida de peso, éstos síntomas persisten varias semanas hasta que el paciente finalmente busca atención médica [19, 27].

La forma visceral es causada por especies del complejo Leishmania donovani que incluyen Leishmania donovani y Leishmania infantum en el Viejo Mundo y Leishmania chagasi en el Nuevo Mundo. En algunos casos se ha implicado Leishmania tropica y Leishmania amazonensis [19]. Las variaciones de la LV son: � Leishmaniosis dérmica post-kala azar: Una manifestación dérmica de la forma

visceral, que se desarrolla después de la resolución de ésta y que ha sido denominada como la “secuela infeliz” de la recuperación en el tratamiento. Se sugiere que estos pacientes, son reservorios ya que al tener el parásito en la dermis es más fácil el acceso de los vectores al parásito. Es causada por especies del complejo Leishmania donovani (Leishmania donovani y Leishmania infantum en el Viejo Mundo y Leishmania chagasi en el Nuevo Mundo; así como Leishmania tropica (Viejo Mundo) y Leishmania amazonensis (Nuevo Mundo) [29, 30].

� Leishmaniosis viscerotrópica: Síndrome oligoparasítico con manifestaciones no específicas, causada por Leishmania tropica [19].

En conclusión, el que un paciente presente una u otra forma clínica de leishmaniosis, depende de factores como el tipo de especie implicada, características geográficas (países donde se presenta principalmente una forma clínica) e indiscutiblemente respuesta inmunológica del hospedero ante la enfermedad [19].

1.1.6 Respuesta inmune

El uso de modelos animales, de los cuales el más utilizado es el ratón, ha permitido dilucidar el perfil de respuesta inmunológica, generada por Leishmania spp. En el modelo murino de infección con Leishmania major, se observa una clara dicotomía entre la producción de citoquinas por los nódulos linfáticos de ratones susceptibles versus ratones resistentes. Investigaciones han demostrado que en la mayoría de cepas de ratones C57BL/6 la infección subcutánea con Leishmania major, da como resultado el desarrollo de una respuesta protectora de tipo Th1 (T helper tipo 1) caracterizada por altos niveles de interferón gama (IFN-γ), Interleuquina 12 (IL-12) y Factor de Necrosis Tumoral alfa (TNFα) y resistencia a la reinfección. Contrario a esto, la infección en cepas BALB/c (catalogadas como susceptibles), muestra el desarrollo de una respuesta tipo Th2 (T helper tipo 2), caracterizada por la producción de Interleuquina 4 (IL-4) en los nódulos linfáticos [15, 19].

La IL-12, es producida principalmente por macrófagos, polimorfonucleares, células dendríticas y células B. Actúa induciendo la producción de IFN-γ y la polarización de células CD4+ hacia células Th1. Al haber un aumento en la producción de IFN-γ, hay disminución en la producción de IL-4 lo que permite la resolución de las lesiones. Así mismo se ha demostrado que la IL-12 puede sobreregular la expresión de Interleuquina 18 (IL-18), la cual actúa como co-factor en el desarrollo de células Th1 [15, 31-33]. Por otra parte, se ha determinado que el IFN-γ, es la mayor citoquina efectora producida por células Th1; juega un papel fundamental en la activación de macrófagos y se ha


demostrado que ratones resistentes a la infección (C57BL/6) deficientes en esta citoquina, desarrollan una respuesta Th2 y por lo tanto infección [15, 34].

Estudios usando modelos murinos de infección con Leishmania major, han establecido que la IL-4, durante los estadios tempranos de infección, juega un papel importante sobre el desarrollo de CD4+ hacia Th2. Se ha demostrado que ratones BALB/c (susceptibles) tratados con anti-IL4 durante los primeros días de infección con Leishmania major, fueron incapaces de desarrollar respuesta Th2 y por lo tanto se tornaron resistentes a la infección. De igual manera, se ha encontrado que los ratones C57BL/6 (resistentes), tienen niveles indetectables de IL-4 [15, 35].

La Interleuquina 10 (IL-10) inhibe la activación y producción de citoquinas de células Th1, desempeñando un papel importante en la supresión del sistema inmune, pero hasta el momento no se ha establecido con firmeza la promoción de esta citoquina en la susceptibilidad de la infección por Leishmania spp. [15, 36].

El papel del factor de crecimiento transformante β (TGF- β), también ha sido estudiado en el modelo murino de infección con Leishmania spp. y se ha encontrado que esta citoquina, contribuye a la bajo regulación de las citoquinas del perfil Th1, lo que favorecería el establecimiento de la infección por Leishmania spp.[37].

Aunque la población de células CD4+ es crítica en la inmunidad de infecciones causadas por Leishmania major, se ha encontrado un aumento en la producción de las células CD8+ durante la infección, pudiendo asociar esta última población con la curación de las lesiones y con la inmunidad a la reinfección [15].

1.1.7 Papel de los macrófagos en la patogenia del p arásito

Los macrófagos son células mononucleares que actúan como huéspedes definitivos del parásito, los cuales se han asociado con dos funciones principales: la destrucción y la presentación antigénica del parásito vía Complejo Mayor de Histocompatibilidad (CMH) a los Linfocitos T (LT), para llegar a potenciar la respuesta inmune y promover memoria inmunológica. Al ser esta la célula hospedera principal para Leishmania spp., el parásito ha desarrollado varios mecanismos para evitar el desarrollo de una respuesta inmune efectora por parte del macrófago. Además, ha desarrollado numerosas estrategias para manipular varias funciones del macrófago, incluyendo la modulación de la presentación antigénica, de la generación de radicales libres de oxígeno y óxido nítrico (esenciales para la destrucción del parásito), y de la producción de citoquinas, generado por las interacciones entre moléculas de la membrana del parásito, principalmente la glicoproteína Gp63 y lipofosfoglicano (LPG) con receptores de membrana del macrófago causando, la distorsión de señales intracelulares especificas [15].

Después del ingreso del promastigote, el primer sistema que favorecería la respuesta inmunológica para erradicar el parásito es el complemento, sin embargo se ha demostrado que el LPG del parásito, previene el ataque por parte de las subunidades C5b-C9 que actúan, como efectoras en la lisis del parásito. Por otra parte se conoce que, en especies de Leishmania amazonensis y Leishmania major Gp63 convierte la subunidad C3b en C3bi, la cual se fija a los promastigotes opsonizándolos y favoreciendo la fagocitosis por parte de los macrófagos, evitando estar extracelularmente por largos periodos [38].

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Posterior a la entrada vía fagocitosis o endocitosis, el parásito es incluido dentro de una vacuola pasitófora. En este lugar, el promastigote se diferencia a amastigote (forma aflagelada) con capacidad de replicación variable según la especie de Leishmania. Desde el fagosoma, el parásito obtiene todas las purinas, vitaminas, aminoácidos esenciales, poliaminas hexosas, esfingolípidos, HEMO y otros metabolitos esenciales que necesita para vivir y reproducirse por división binaria [39]. En el fagolisosoma, el amastigote es resistente a la acción de los productos reactivos del oxígeno debido a la presencia del LPG, y de moléculas recientemente descubiertas llamadas perodoxinas LcPxn1 y 2 y superoxidodismutasa [40]. También, la presencia de IL-10 en el medio externo, promueve la producción de arginasa, que inhibe la producción de óxido nítrico y favorece la sobrevida del amastigote. Otro mecanismo usado por el parásito para su supervivencia, es la inhibición de la activación del proceso NADPH oxidasa [41]. Por otra parte, el parásito puede inhibir la capacidad del macrófago de producir Interleuquina 1 (IL-1) e inhibir la expresión de moléculas del Complejo Mayor de Histocompatibilidad clase II (CMH II) y moléculas coestimuladoras como CD80 Y CD86 [42].

1.1.8 Epidemiología

Diseños en la cerámica precolombina y la existencia de cráneos milenarios con evidencia de la leishmaniosis, demuestran que la enfermedad ha estado presente en las Américas durante mucho tiempo. Así mismo, hallazgos indican que la enfermedad ha estado presente en África y la India por lo menos desde mediados del siglo XVIII. Catalogada en el grupo de las enfermedades tropicales desatendidas la leishmaniosis, se caracteriza por ser endémica en 88 países de los cuales 72 están en vías de desarrollo y 13 presentan los más altos índices de pobreza a nivel mundial en el mundo. Se estima que aproximadamente 12 millones de personas padecen esta enfermedad y 350 millones están en riesgo de adquirirla [3, 43, 44]. Colombia es uno de los países con mayor número de especies de Leishmania asociadas a casos clínicos en humanos. Esta parasitosis se encuentra distribuida de forma endémica en el 91% de todo el territorio nacional, presentándose las tres formas clínicas. Aunque la notificación de la enfermedad es obligatoria [5], también se reconoce un elevado subregistro. Los focos epidemiológicos están distribuidos en una gran diversidad de regiones donde se incluyen las zonas selváticas de la Costa Pacífica y del Amazonas, las áreas de bosque seco tropical (Costa Caribe), algunos departamentos de la zona Andina y áreas de los llanos y desiertos localizados en la región Interandina y en la Guajira [5, 44]. En el 2011, el Sistema de Vigilancia en Salud Pública (SIVIGILA) reportó 8188 nuevos casos de la enfermedad de los cuales, un 96% corresponde a LC [2]. El incremento en los casos de LC se debe a factores como la migración, el conflicto armado y los cambios en el comportamiento de los vectores (relacionado con factores climáticos o actividades humanas que favorecen la colonización del vector en nuevos ambientes), evidenciándose la urbanización de esta parasitosis en los últimos años [5, 44]. Los departamentos con mayor número de casos reportados según datos del SIVIGILA en el 2011 son: Antioquia con 1835 casos, seguido de Guaviare con 774 casos. Aunque en Bogotá no existen las condiciones climáticas para adaptación del vector, se reportaron 11 casos (debido al desplazamiento de individuos de zonas rurales hacia la capital, causado por el conflicto armado). Los reportes epidemiológicos indican que Leishmania


panamensis es responsable del 99% de los casos de LC, seguida de Leishmania braziliensis, Leishmania guyanensis, Leishmania colombiensis y Leishmania amazonensis [2, 5, 45].

1.1.9 Diagnóstico

El diagnóstico rutinario de la leishmaniosis se basa en la observación del parásito en el espécimen examinado. La identificación de estos a través de la coloración con Giemsa, es la técnica más comúnmente usada para visualizar el parásito. La muestra puede ser examinada en microscopio de luz, usando aceite de inmersión donde se observa la estructura propia de los amastigotes (citoplasma y núcleo de color azul claro y el kinetoplasto se ve fucsia o violeta). Otros métodos convencionales para el diagnóstico incluyen cultivo in vitro del tejido infectado o inoculación en animales como el hámster dorado [3, 15, 19].

Una nueva metodología se ha implementado para la visualización de parásitos intracelulares, mediante el uso de SYBR® Safe, colorante fluorescente que tiene afinidad por los ácidos nucléicos, se colorea el núcleo y kinetoplasto de estos parásitos, haciendo más fácil el recuento de células infectadas por microscopía de emisión UV. Las ventajas de esta técnica con respecto a la convencional (tinción con Giemsa), incluyen rapidez en la obtención de resultados, mayor reproducibilidad y observación más fiable de los parásitos internalizados en la célula hospedadora [46].

Para la identificación de las especies, se realiza un análisis isoenzimático de promastigotes, a partir de cultivo o mediante métodos moleculares o anticuerpos monoclonales, que suelen ser usados para diagnostico in situ [47, 48].

Combinaciones de diferentes técnicas moleculares (Polimorfismo de fragmentos por restricción (RFLP) y la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), son herramientas que permiten identificar parásitos de Leishmania spp. Es así como el desarrollo de diferentes ensayos de PCR, usando como sitio de blanco el ADN del kinetoplasto, regiones espaciadoras en el mini-exón, ADN genómico repetitivo, el gen de la tubulina entre otros, ha permitido contribuir a un diagnóstico mucho mas rápido y asertivo [49].

1.1.10 Tratamiento

La leishmaniosis es una de las enfermedades tropicales más desatendidas teniendo en cuenta que existen pocos medios de lucha contra ella y no existen criterios claros para definir métodos de control. La Organización Mundial de la Salud (OMS), ha centrado sus prioridades de investigación en el control de la leishmaniosis y en consecuencia, investigaciones estratégicas recientes han conducido al desarrollo de nuevos medicamentos y combinaciones de estos los cuales reduzcan el riesgo de resistencia [50, 51]. La terapia antileishmanial es en algunos casos complicada, debido a la complejidad de la enfermedad. En la mayoría de los casos no se han tenido en cuenta todos los factores alrededor de la enfermedad (como combinación de síndromes, regiones geográficas, especies) y el agente terapéutico más efectivo, resulta tener efectos secundarios no benéficos para el paciente. Desde 1940, el antimonio pentavalente compuesto por

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estibogluconato sódico (Pentostam®, Glaxo Wellcome, UK) o antimoniato de meglumina (Glucantime®, Rhône-Poulenc Rorer, France), han sido los pilares de la terapia antileishmanial [52, 53]. Aunque estos medicamentos son altamente efectivos, sus desventajas incluyen: Modo de administración parenteral (mayoría de veces dolorosa), larga duración del tratamiento (varias semanas), eficacia por debajo de lo óptimo en algunos casos, efectos tóxicos reversibles como fatiga, dolor corporal, anomalías electrocardiográficas, elevados niveles de enzimas hepáticas y pancreatitis, entre otros. La anfotericina B e Isetionato de Pentamidina (administrados vía parenteral), son usados como tratamiento de segunda línea, particularmente porque están más asociados con efectos tóxicos irreversibles como la falla renal. Sin embargo, han comenzado a resurgir debido a las nuevas formulaciones o régimen de dosis, para el uso clínico en algunos casos [53]. Una vía alterna de administración de antimoniales corresponde a la vía intralesional (IL), la cual se implementó, desde la década de los 60’S para el tratamiento de LC. Desde esta época, se han venido realizando diferentes ensayos clínicos controlados para determinar efectividad sobre pacientes con LC causada por especies tanto del Viejo Mundo como el Nuevo Mundo, de los cuales se reporta efectividad entre el 75% y el 91% a los tres meses de tratamiento, los cuales han permitido concluir que independiente de la frecuencia de dosificación, este tipo de administración, puede generar resultados bastante eficaces [54, 55]. Dentro de las ventajas de la vía IL, respecto a las parenterales, está la probabilidad de generarse mínimos efectos adversos y la administración ambulatoria del medicamento. Sin embargo, aunque este tipo de administración genera menos efectos adversos, se puede presentar dolor al momento de la inyección y en algunos casos reacciones locales transitorias, lo que podría generar abandono al tratamiento [54, 56]. En los últimos años nuevas terapias potenciales han sido introducidas para el tratamiento de la LV. Esto incluye la anfotericina B en formulación de liposomas registrado en EEUU y Europa como AmBisoma®; la miltefosina oral que ha sido registrada en India y esta ahora en fase IV, una formulación parenteral de paromomicina que completó fase III en ensayos clínicos en India y el Este de África y Sitamquina® oral que completó fase II en India, Kenya y Brasil. En el tratamiento para LC se ha implementado, el uso de formulaciones tópicas de paromomicina y otros compuestos incluyendo el inmunomodulador imiquimod®. Por otra parte, según reportes de ensayos en fase II realizados en Suramérica y América Central, algunas formas de LC han respondido eficazmente a la miltefosina oral [7]. En el Viejo Mundo, los tratamientos utilizados para la LC son, el uso tópico de paromomicina, crioterapia, entre otros. Sin embargo, un estudio realizado en Israel donde se utilizó anfotericina B liposomal para el tratamiento de LC causada por Leishmania tropica, de 13 pacientes incluidos en el estudio, 2 hicieron falla al tratamiento [57]. Nuevos enfoques terapéuticos han desarrollado el uso de la paromomicina junto al INF-γ, pero desafortunadamente, la mayoría de los agentes no parenterales que han sido evaluados a la fecha tienen actividad limitada contra algunas especies y/ó cepas de Leishmania. Por lo tanto actualmente, la necesidad más apremiante en materia de investigación para el control de la leishmaniosis, es la búsqueda de nuevos


medicamentos, de bajo costo y de administración oral, parenteral o tópica en ciclos terapéuticos más cortos [19, 50].

1.2 Antimoniato de meglumina

1.2.1 Generalidades

El antimoniato de meglumina es un medicamento perteneciente al grupo de los antimoniales pentavalentes, usado desde 1945 como primera línea para el tratamiento de la leishmaniosis en el Nuevo Mundo. Desde entonces, se han venido realizando ajustes en la dosificación como mecanismo para mantener su eficacia [58]. En 1975, la dosis total para un adulto de 65 kg era 4.25g (representados en una ampolla) durante 10 días; en 1984 la OMS, instauró la dosis de 20mg/kg día durante 20 días con dosis máximas diarias de 850mg y posteriormente en 1990 se eliminó la dosis máxima. En Colombia, este régimen es adoptado hasta el día de hoy [59]. Los antimoniales están contraindicados en individuos sensibles a estos medicamentos, en niños, mujeres embarazadas, mamás lactantes o en pacientes con algunas patologías crónicas [8].

1.2.2 Farmacocinética

Los antimonios pentavalentes (antimoniato de meglumina) se absorben por vía parenteral, vía intramuscular (IM), a razón de 10mg/ml en 1 a 2 horas y por vía intravenosa (IV) en forma inmediata cuando la dosis es de 10m/kg. Los antimoniales pentavalentes no son fijados por los eritrocitos y alcanzan concentraciones mucho mayores en el plasma que los compuestos trivalentes [1, 60].

En consecuencia, los compuestos pentavalentes son excretados más rápidamente por los riñones. Después de una inyección IM, más del 80% de la dosis administrada de antimoniales pentavalentes, aparece en la orina en el curso de 6 horas. Después de una inyección IV, la excreción urinaria comparable es superior a 95%, lo que indica que el medicamento no es metabolizado en forma apreciable. El 12% se acumula en un compartimento extravascular, el cual adquiere saturación después de 5 días de tratamiento, y desde donde el antimonio es lentamente liberado [61].

1.2.3 Mecanismo de acción

El blanco de los agentes quimioterapéuticos en leishmaniosis es el amastigote intracelular, ya que este evade los mecanismos naturales de destrucción, al sobrevivir y multiplicarse dentro de la vacuola parasitófora del macrófago. Las especies de Leishmania al parecer, ocupan diferentes macrófagos y ejercen actividades de adaptación variables, lo que explicaría en parte la diversidad en la respuesta frente a medicamentos [58, 62].

Los mecanismos de acción de los antimoniales pentavalentes no están totalmente dilucidados, pero se conoce que el antimonio pentavalente (SbV) se transforma dentro

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del amastigote en antimonio trivalente (SbIII), que es más tóxico y destruye al parásito ejerciendo su acción sobre la enzima reductasa dependiente del tiol (TDR1) y por inhibición de la tripanotion reductasa. De este modo, se afecta la vía del metabolismo tiol que participa en la síntesis de deoxirribonucleotidos, en la conjugación, secuestro y transporte de metales y medicamentos, y en la depuración de radicales tóxicos del oxígeno; quedando el parásito expuesto intracelularmente a la acción de los radicales reactivos del oxígeno, causando su muerte [58, 63]. Por otro lado se ha propuesto también como mecanismo de acción, la capacidad del Sb(V) de formar complejos con nucleótidos, interfiriendo en el metabolismo e inhibiendo la topoisomerasa del parásito [63]. Esta hipótesis está respaldada por el hecho de que, los nucleósidos y polinucleótidos presentan elevado número de funciones oxigenadas y nitrogenadas convirtiéndose en ligandos potenciales de iones metálicos [61]. A diferencia de lo observado en células de mamíferos, los protozoarios son incapaces de volver a sintetizar purinas, por lo que estos parásitos utilizan mecanismos bioquímicos alternativos, que tienen como punto de partida la translocación de purinas pre-formadas. Esta estrategia, de una alta producción de purinas en la leishmaniosis, puede contribuir también en la formación de complejos Sb(V)-purina, los cuales a su vez tendrían influencia negativa en toda la bioquímica del ADN del parásito [61].

1.2.4 Eficacia

La eficacia del antimoniato de meglumina para el control de la leishmaniosis derivada de múltiples estudios en pacientes colombianos con LC, varía entre 25% y 93% [3, 64]. Asociada a esta variabilidad, se encuentran factores la vía de administración parenteral, relacionada con la adherencia al tratamiento que hace que su empleo se límite y además soporte las investigaciones para encontrar alternativas terapéuticas [64]. La variación en la respuesta clínica a los antimonios pentavalentes estibogluconato de sodio y antimoniato de meglumina en casos de LV, LC y LMC, ha sido un persistente problema en el tratamiento en los últimos 50 años. Una explicación para este fenómeno, es la diferencia intrínseca en la sensibilidad de las especies a estos ingredientes farmacéuticos activos. En este sentido, estudios que emplearon macrófagos infectados con amastigotes de Leishmania donovani y Leishmania braziliensis reportan que, pueden ser tres a cinco veces más sensibles al estibogluconato que Leishmania major, Leishmania tropica y Leishmania mexicana, respecto a otras especies [7, 64]. En un estudio realizado en Guatemala, donde se comparó el grado de curación con antimoniales en LC causada por diferentes especies, el estibogluconato demostró una significativa respuesta curativa en pacientes con Leishmania braziliensis respecto a Leishmania mexicana [7, 65].

1.2.5 Vías de administración y dosis

El antimoniato de meglumina para el tratamiento de la leishmaniosis es administrado vía parenteral: IM o IV. Se administran dosis de 20mg/Kg peso por día durante 20 días para LC y 28 días para LMC y LV. La vía IM es la más usada, sin embargo en algunos casos cuando el paciente presenta dolor en el sitio de inyección posterior a múltiples aplicaciones y ya se ha agotado la rotación de las zonas de aplicación, se recurre a la


vía IV, la cual ofrece algunas ventajas como concentraciones plasmáticas de antimonio superiores y más rápidas, y disminuye el dolor ya que se aplica por infusión. No obstante, se recomienda que el uso de esta vía sea transitorio y el tratamiento continúe administrándose vía IM [3].

1.2.6 Efectos adversos

La toxicidad del antimoniato de meglumina es bien conocida. Aproximadamente el 65% de los pacientes han presentado efectos adversos entre leves y moderados (desde dolor en el sitio de aplicación, nauseas, vomito, dolor abdominal, fiebre, urticaria, dolor de cabeza, mialgias, artralgias, anorexia hasta trombocitopenia), síntomas que en la mayoría de casos terminan en abandono del tratamiento. Así mismo en algunos pacientes se han reportado efectos adversos graves presentes entre el día 7 y 14 del tratamiento, tales como: cardiopatías, nefrotoxicidad y hepatotoxicidad los cuales han llegado a comprometer la vida del paciente [3, 8]. En la actualidad, se ha venido implementando el uso de antimoniales vía IL (donde se somete al paciente a una inyección del medicamento directamente en la lesión), éste tiene un régimen de dosificación 50 mg / 0,5 ml cada 2-3 semanas por 12 semanas y aunque los efectos adversos generados usando esta vía de administración son menores, se presenta dolor localizado al momento de la inyección lo cual se hace molesto para el paciente, afectando también, la adherencia al tratamiento [19, 54, 66].

1.2.7 Alternativas terapéuticas en combinación con antimoniales

Actualmente, se ha indagado en la búsqueda de nuevas formulaciones que permitan mejorar la terapia y efectos secundarios. Es así, que se ha implementado el uso de terapias locales (Ejemplo: la paromomicina en combinación con otros compuestos), que aunque pueden tener ventajas como la comodidad de la administración (no se presenta dolor) y menos efectos adversos, no siempre se absorben de la manera adecuada y por lo tanto, no siempre es exitosa. Este tipo de tratamientos es más utilizado en LC del Viejo Mundo que en el Nuevo Mundo [8].

Combinaciones de antimoniales con diferentes medicamentos como alopurinol y paromomicina han sido probadas en ensayos clínicos [8]. Así mismo, se reportó un ensayo en el que se uso, antimonio pentavalente vía IL, en comparación con la administración mediante mesoterapia (técnica en la cual se usa un dispositivo para la inyección del medicamento); esta última tiene la ventaja de disminuir el temblor al momento de la inyección (respecto a la metodología convencional) y genera más comodidad para el paciente [67].

Los antimoniales pentavalentes usados convencionalmente, no pueden ser administrados por vía oral debido a que no se absorben y son inactivados en el estómago. En un estudio donde se utilizaron ratones BALB/c, se administró el antimoniato de meglumina en combinación con ciclodextrina (oligosacárido cíclico compuesto de glucosa que permite mejorar la biodisponibilidad oral de ingredientes farmacéuticos activos insolubles en agua). Este estudio estableció, por primera vez, el potencial del antimoniato de meglumina en formulación oral [10].

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Por otra parte, estudios realizados en 1980 mostraron que, los parásitos de Leishmania no pueden multiplicarse a temperaturas superiores a los 39ºC, por lo cual se han implementado una serie de terapias físicas como la termoterapia donde se usan dispositivos que produce calor o baños de agua caliente aplicados directamente en la lesión, el uso de luz infrarroja, luz láser y ondas de radiofrecuencia, como terapias alternativas para el control de la leishmaniosis. Aunque los pacientes no presentaron efectos adversos significativos, algunos desarrollaron celulitis local moderada o severa, quemaduras superficiales e infecciones bacterianas secundarias [8].

La inmunoquimioterapia, como alternativa terapéutica, usa combinaciones de antimonios pentavalentes con inmunomoduladores como interferón-gama o factor estimulante de colonias granulocíticas-macrófagos, para el tratamiento de LC. Al parecer estas formulaciones, pueden tener ventajas sobre la terapia convencional ya que pueden reducir la duración del tratamiento y la dosificación, lo que impide la resistencia a antimonios pentavalentes. Sin embargo, su alto costo limita su uso en países subdesarrollados [8].

La crioterapia, es un tratamiento efectivo para la leishmaniosis debido a que las especies de Leishmania spp. son termosensibles. Es un método simple, usado en el tratamiento de LC en niños, no requiere anestesia local y produce la destrucción rápida de los parásitos. Aunque es un procedimiento doloroso, no presenta efectos secundarios sistémicos. Sin embargo, requiere de varias sesiones y se produce fracaso del tratamiento hasta de un 50%; además algunos pacientes pueden presentar recaídas. Varios estudios han comparado, el tratamiento con glucantime intralesional versus crioterapia y la combinación de estos dos, donde concluyen que estas metodologías terapéuticas tienen buena eficacia y no generan efectos secundarios graves [68].

Aunque las terapias mencionadas anteriormente (solas o en combinaciones), la mayoría de veces puede mostrar resultados promisorios, hasta el momento ninguna ha reemplazado el uso de los antimoniales (a dosificación y vía de administración convencional) como terapia para el control de la LC [8]. Por lo anterior, la OMS ha venido apoyando la investigación de nuevos medicamentos contra la leishmaniosis [64]. Sin embargo al ser la leishmaniosis una enfermedad marginada, no existe un cambio a nivel comercial, lo cual genera una insuficiencia de fondos para la investigación y desarrollo de nuevos ingredientes farmacéuticos activos [66].

En este contexto, las estrategias basadas en la mejora de los medicamentos existentes han sido más exitosas, que aquellas basadas en el diseño e investigación de nuevos principios activos. Los avances incluyen el desarrollo de formulaciones más seguras para los medicamentos que actualmente son eficaces y combinaciones de estos con diferentes protocolos terapéuticos [10].


1.3 Sistemas de entrega de ingredientes farmacéutic os activos

1.3.1 Generalidades

Los medicamentos pueden distribuirse en el organismo dependiendo de propiedades físicas como solubilidad, coeficiente de partición y carga. En consecuencia, alcanzan variedad de sitios que se encuentren fuera de su intervalo terapéutico, lo que ocasiona que sean inactivos, o que su acción sea indeseada o nociva, y por lo tanto generar efectos secundarios negativos [69]. Actualmente existen dos métodos para mejorar la acción de los fármacos: a. Liberación controlada: Buscan eliminar o reducir un poco los efectos secundarios

produciendo, una concentración terapéutica del ingrediente farmacéutico activo estable dentro del organismo. Tiene como ventaja que no suelen existir cambios concentración del ingrediente farmacéutico activo en el organismo, comparándolo con los cambios intermitentes en las dosificaciones convencionales [69].

b. Liberación dirigida hacia lugares específicos: Buscan asegurar que el ingrediente

farmacéutico activo sea liberado en el lugar requerido, y al mismo tiempo mantiene el ingrediente farmacéutico activo inactivo en cualquier otro lugar del organismo [69].

Los sistemas avanzados de liberación controlada, ofrecen un grado significativo de libertad en la elección del lugar de aplicación. Mientras que muchas formulaciones convencionales deben ser aplicadas IM, IV o vía oral (VO), los sistemas poliméricos de liberación controlada pueden ser localizados virtualmente en cualquier cavidad corporal, de modo que estos soportes, pueden situarse en el organismo cerca o en la zona afectada; pueden ser implantados, o pueden ser adheridos externamente a la piel. Gracias a esto, se han creado nuevas rutas posibles de administración de ingredientes farmacéuticos activos [70].

1.3.2 Mecanismos de liberación

En los sistemas de liberación controlada el ingrediente farmacéutico activo, se introduce en el interior de un polímero el cual será transportador. La velocidad de liberación del ingrediente farmacéutico activo, está controlada por las propiedades del polímero, aunque existen otros factores menos influyentes como el pH del medio en el que se va a realizar la liberación. Teniendo en cuenta tales factores, es posible conseguir sistemas de liberación que actúen lentamente y de forma continua durante largos periodos de tiempo [70]. Con la mayoría de los sistemas convencionales para la administración de un ingrediente farmacéutico activo, el nivel de este en el organismo, alcanza un valor máximo y después cae hasta un mínimo, siendo necesaria la aplicación de una nueva dosis. Asimismo, si el máximo o el mínimo de concentración del fármaco en el medio, se sitúan por encima del nivel de toxicidad o por debajo del nivel mínimo efectivo, se pueden producir de forma alternante períodos de toxicidad y de ineficacia [70].

Capitulo 1 19

Respecto a este punto, los sistemas poliméricos presentan una ventaja ya que son capaces de mantener la concentración de ingrediente farmacéutico activo sin presentarse los fenómenos de toxicidad e ineficacia a partir de una única dosis, así como de liberarla de una forma continua en un tiempo determinado [70]. Para que el ingrediente farmacéutico activo que se va a entregar alcance el nivel de liberación deseado, se tiene que producir la difusión del mismo desde la superficie de su transportador hasta el medio que lo rodea y, a partir de este punto, alcanzará el nivel sobre el que deberá ejercer su efecto [70]. Existen cuatro mecanismos mediante los cuales, es posible clasificar los sistemas de liberación controlada: a. Sistemas activados por un disolvente Consisten en matrices poliméricas o sistemas con depósito, donde la liberación es activada por la penetración de un disolvente, vía ósmosis o hinchamiento, en la que se permitirá una liberación controlada del ingrediente farmacéutico activo [70]. b. Sistemas controlados químicamente En este sistema la liberación del ingrediente farmacéutico activo, se produce mediante reacciones químicas de hidrólisis, ionización, protonación o catálisis por acción de enzimas. Los dos tipos principales de sistemas controlados químicamente son, los sistemas bioerosionables en los que la liberación del ingrediente farmacéutico activo está influenciada por la velocidad de degradación del polímero en el que se encuentra disperso. En este tipo de sistemas no es necesaria una eliminación quirúrgica, puesto que los polímeros biodegradables son gradualmente absorbidos por el organismo. Sin embargo, los productos resultantes pueden ser tóxicos, inmunogénicos o cancerígenos. El otro sistema, es el sistema polimérico transportador, en el que el ingrediente farmacéutico activo se encuentra unido covalentemente al polímero mediante un enlace, el cual puede romperse por hidrólisis o reacciones enzimáticas [70]. c. Sistemas controlados magnéticamente Es un sistema en el que se usan campos magnéticos para permitir que el ingrediente farmacéutico activo logre atravesar la piel. Es usado para el paso de macromoléculas como proteínas y péptidos, reduciendo las limitaciones relacionadas con peso y tamaño molecular, entre otros [70, 71]. d. Sistemas controlados por difusión Se caracteriza por que la cantidad de producto bioactivo que llega a una zona determinada de aplicación, es controlada mediante un fenómeno de difusión del compuesto (directamente a través de la estructura molecular del polímero o a través de macro o microporos) [70]. A su vez, estos sistemas pueden presentarse en dos formas bien diferenciadas: � Sistemas con depósito (sistemas con un núcleo interno que contiene el ingrediente

farmacéutico activo, el cual se encuentra rodeado por una membrana delgada,


homogénea y no porosa. El ingrediente farmacéutico activo está contenido dentro de una capa de polímero, la cual puede hincharse o no, en el medio biológico donde se aplica [70].

� Sistemas matrices o dispositivos monolíticos: En el cual, el compuesto bioactivo se encuentra uniformemente distribuido en un soporte de polímero sólido. El ingrediente farmacéutico activo puede encontrarse disuelto en la matriz polimérica o disperso si su contenido es mayor que el límite de solubilidad [70].

El comportamiento de liberación de agentes bioactivos es el resultado del “fenómeno de difusión en el polímero y de restricciones de transferencia de masa en la interfase polímero/líquido”. Por esta razón, el diseño de un sistema de liberación controlada, exige el conocimiento previo del mecanismo de difusión del soluto a través del material polimérico [70].

Independientemente del sistema de liberación, modelos matemáticos han permitido definir que el coeficiente de difusión del agente bioactivo, a través del polímero depende, de los parámetros estructurales y morfológicos del mismo, así como de la concentración de soluto en él [72]. Una de las tareas más laboriosas en el campo de la tecnología de la liberación controlada, reside en el desarrollo de formulaciones polímeros (tipo matriz) capaces de liberar ingredientes farmacéuticos activos a velocidad constante durante un tiempo determinado [70, 73].

1.3.3 Rutas de administración

Se ha investigado la administración sistémica de medicamentos a través de diferentes rutas como las membranas nasales (ruta nasal), membranas mucosas de la boca (ruta oral), del ojo (ruta oftálmica), de la piel (ruta transdermal), entre otras [69]. • Ruta transdermal: Fue comercialmente aceptada desde 1995. En esta ruta, el

sistema de liberación se adhiere externamente a la piel, evitando de este modo efectos sistémicos al no presentarse metabolismo hepático del medicamento (principal desventaja de los sistemas de liberación orales) [69, 71, 73].

El paso a través de la piel es un proceso complejo, por lo que las sustancias capaces de atravesarla, requieren características como bajo peso molecular, adecuada liposolubilidad del ingrediente farmacéutico activo, facilidad para difundirse a través de la piel, que el medicamento cargado en el sistema sea potente (ejerza su acción terapéutica a dosis bajas) y no debe ser irritante para la piel. Así mismo, el proceso de absorción transdermal, depende factores como la concentración del ingrediente farmacéutico activo, el tipo de sistema, el área superficial de contacto, la oclusión, la región anatómica de aplicación, las condiciones de la piel, edad, metabolismo en la piel, grado de irrigación sanguínea en la misma, entre otros [71, 74].

Una de las limitaciones de estos sistemas es la inducción de ciertas reacciones de irritación o sensibilización de la piel, las cuales pueden deberse al ingrediente farmacéutico activo o, al material empleado en la fabricación del dispositivo transdermal. En la mayoría de los casos las reacciones de la piel son producidas por el dispositivo transdermal y no por los ingredientes farmacéuticos activos empleados [74].

Capitulo 1 21

Es por esta razón, que es necesario el uso de biopolímeros compatibles, con bajo potencial antigénico, que brinden un alto grado de seguridad para los pacientes [73].

1.3.4 Polímeros usados en sistemas de liberación co ntrolada

Es importante tener en cuenta al momento de la elaboración de cualquier sistema de liberación de ingredientes farmacéuticos activos, que todos los materiales (polímeros, solventes, plastificantes, etc.) usados en para su elaboración, así como sus productos de degradación, deben ser biocompatibles [75].

Actualmente existen diferentes polímeros utilizados en sistemas terapéuticos para la liberación controlada de ingredientes farmacéuticos activos, los cuales se han clasificado entre muchos parámetros, acorde con su origen (natural o sintético). A su vez dentro de los polímeros de origen sintético, existen dos tipos de polímeros: los biodegradables y los no biodegradables [75].

Dentro de los polímeros de origen Natural se encuentra el Quitosán el cual se localiza abundantemente en la naturaleza [75].

a. Quitosán

Es un polímero catiónico, formado por unidades repetitivas de D-glucosamina, el cual es obtenido a partir de la quitina que hace parte de la estructura de algunos artrópodos como los crustáceos e insectos, moluscos y hongos. De ahí, que sea de fácil acceso. La obtención de quitosán a partir de quitina se realiza por procesos de desacetilación, donde quedan libres grupos amino. Por lo anterior, al momento de caracterizar este polímero, es importante conocer la fuente de quitosán y el método para su obtención, debido a que estos factores van a influenciar el grado de desacetilación y su peso molecular [75].

El polímero de quitosán, se caracteriza por su biodegradabilidad, biocompatibilidad, mucoadhesión, capacidad filmogénica (formación de películas), capacidad hemostática y de promoción de la absorción, además que puede tener actividad antimicrobiana y antioxidante. Dadas estas características, el uso del quitosán es ampliamente distribuido para diferentes usos [75].

Respecto a lo anterior, en la industria agrícola se conoce que el quitosán puede ser usado como aditivo en fertilizantes, además de ser usado en el tratamiento de plantas cuando estas presentan una contaminación de tipo viral. A su vez, se ha reportado que este polímero puede servir como agente quelante de metales [76].

A nivel de la industria cosmética, el quitosán, por sus características bioquímicas y su capacidad filmogénica, es usado como hidratante, emulsificante, emoliente y espesante, en la preparación de cremas y otros preparados [77]. En la industria alimentaria, por su capacidad de unirse a grasas, se le ha reconocido al quitosán, como agente hipocolesterolémico, el cual es usado en la preparación de productos dietéticos [76]. De igual manera, para el quitosán, debido a su actividad inmunoestimuladora, propiedades anticoagulantes, acción antibacterial y antifúngica y su acción como promotor en la reparación tisular de heridas, se ha reportado su uso en medicina e investigación biomédica [76]. Además, debido a que favorece la producción de


fibroblastos, osteoconductividad y por sus propiedades mucoadhesivas, se utiliza en el campo de la odontología para la liberación controlada de ingredientes farmacéuticos activos en la mucosa bucal. En este mismo campo, se ha reportado que puede tener un efecto inhibitorio, sobre el crecimiento fúngico y la adhesión de Cándida albicans a células epiteliales de la mucosa oral [78, 79].

En la industria farmacéutica, se ha sido utilizado debido a su carácter catiónico y a sus propiedades filmogénicas y gelificantes, en el desarrollo de sistemas de liberación de ingredientes farmacéuticos activos, ya que se ha reportado que este polímero sirve como vehículo para la encapsulación del ingredientes farmacéuticos activos, protegiéndolo y liberándolo de manera controlada, promoviendo además su absorción a través del epitelio. Así mismo, se ha encontrado que este polímero, presenta propiedades como la biodegradabilidad, biocompatibilidad y no toxicidad, por lo que favorece su empleo en la industria farmacéutica [75, 76].

1.3.5 Sistemas de entrega usados para el tratamient o de la LC

La leishmaniosis al ser una parasitosis de tipo intracelular obligada, se ha convertido en un gran desafío para el descubrimiento de nuevos ingredientes farmacéuticos activos. El potencial de los sistemas de entrega basados en la liberación controlada de ingredientes farmacéuticos activos ha surgido como una gran herramienta para la formulación de diferentes ingredientes farmacéuticos activos en el contexto de esta parasitosis. En comparación con los medicamentos convencionales, los medicamentos antileishmaniales cargados en un sistema de entrega lucen más efectivos, menos tóxicos e inducen menos efectos adversos. Uno de los primeros alcances de esta tecnología fue la anfotericina B liposomal la cual ha mostrado eficacia sobre la leishmaniosis visceral, sin embargo no ha mostrado la misma eficacia para tratar la forma cutánea. Estos logros han servido como base para el diseño y desarrollo de nuevos sistemas de entrega que involucren también, nuevas rutas de administración aportando así a la terapia antileishmanial [80, 81].

Recientemente, un estudio realizado en Brasil empleó liposomas cargados con antimoniato de meglumina, direccionados hacia una posible administración oral usando como modelo, infecciones experimentales in vitro con Leishmania major. Este estudio reportó una eficacia diez veces mayor a la del medicamento convencional (en su forma libre), además este sistema fue cinco veces más selectivo sobre el parásito [82].

Otro estudio permitió el desarrollo de microesferas elaboradas con diferentes polímeros, dentro de los cuales incluyeron quitosán. Estas microesferas fueron cargadas con antimoniato de meglumina y su eficacia fue evaluada in vitro usando macrófagos peritoneales de ratón infectados con parásitos de Leishmania infantum, en donde al igual que en el estudio anterior se demostró mayor efectividad que el antimoniato de meglumina no encapsulado, la cual podría favorecer su uso en formulaciones orales o parenterales [83].

Considerando estos antecedentes, el desarrollo de un sistema de entrega tipo película polimérica, es una herramienta adecuada con la cual se podrían disminuir efectos adversos generados por el medicamento y administración convencional, favoreciendo quizá de este modo su eficacia.

2. Materiales y Métodos

2.1 Muestras

Para los ensayos de citotoxicidad sobre macrófagos humanos, se utilizó el paquete de glóbulos blancos (leucoféresis de banco de sangre) derivado de seis muestras de voluntarios sanos. Para los ensayos de citotoxicidad sobre amastigotes intracelulares, así como para los ensayos de eficacia comparativa entre el sistema farmacéutico tipo película polimérica y la formulación convencional, se usaron leucocitos provenientes de veinte voluntarios sanos cuyas muestras de sangre fueron obtenidas por venopunción (40 mL de sangre heparinizada).

2.2 Materiales (excipientes de formulación)

Se evaluaron cinco polímeros: Quitosán de mediano peso molecular (QMP, SIGMA-ALDRICH, Saint Louis, USA), Quitosán de bajo peso molecular (QBP, SIGMA-ALDRICH, Saint Louis, USA) y otros tres polímeros a los que denominamos, P1, P2 y P3* previamente seleccionados por su biocompatibilidad y biodegradabilidad (datos suministrados por el Grupo de Investigación en Procesos de Transformación de Materiales para la Industria, de la Universidad Nacional de Colombia), dos solventes* (S1 y S2) y dos plastificantes* (PL1 y PL2), así como una mezcla prototipo de formulación en la que se usaron varios de estos materiales, los cuales también fueron proporcionados por el grupo de investigación anteriormente mencionado. Se usó el antimoniato de meglumina, como ingrediente farmacéutico activo (sin auxiliares de formulación), y como medicamento (Albiventriz®), los cuales fueron gentilmente proporcionados por la empresa Arbofarma LTDA. Además como control se uso el isetionato de pentamidina (Pentacarinat®, Sanofi-aventiz, UK), usado como tratamiento de segunda elección para LC y reportado previamente como citotóxico [3]. * Este Trabajo hace parte de un proyecto financiado por Colciencias, en el que el producto final a entregar será una patente sobre nueva formulación para el tratamiento de Leishmaniosis por lo que durante todo el documento nos estaremos refiriendo a tres polímeros denominados de P1 a P3, así como solvente S1 y S2 y plastificantes PL1 y PL2 sin hacer descripción de los mismos. Es de aclarar que a los jurados asignados para la evaluación de esta tesis se les entregará un documento anexo clasificado como confidencial en donde se describirán en su totalidad a que corresponde cada componente evaluado y usado en la formulación final.


2.2.1 Preparación de polímeros y mezcla

Teniendo en cuenta que el quitosán es un polímero soluble en medio ácido [76], se decidió usar el solvente que iría en la formulación final para su dispersión, por lo que el QBP y el QMP se llevaron a medio de cultivo RPMI 1640 [(Gibco BRL-life Technologies Inc, Grand Island, NY) para mantener las condiciones óptimas de viabilidad celular] con 1% de S1, mezclando hasta tener una solución con concentración final de 20mg/mL. Los demás polímeros también se prepararon en medio de cultivo RPMI 1640 a las siguientes concentraciones P1: 8% (p/v) y P2 y P3: 1% (p/v), así como para la preparación de la mezcla final, adicionando además 1% de S1 (p/v) (Estos ensayos fueron realizados bajo la supervisión del químico John Pinzón del Grupo de Investigación en Procesos de Transformación de Materiales para la Industria).

2.3 Cultivos celulares

2.3.1 Obtención de macrófagos

Los macrófagos se obtuvieron a partir de fracción de glóbulos blancos de sangre periférica de voluntarios sanos. La fracción de glóbulos blancos se aisló mediante centrifugación con gradiente de Ficoll-Hypaque (SIGMA-ALDRICH -St. Louis. USA) a 3500 rpm durante 30 minutos. Posteriormente, se realizaron tres lavados, usando solución salina estéril (Laboratorios BAXTER SA Cali-Colombia), mediante centrifugación y seguidamente se sembraron en cajas de petri de poliestireno (BD Biosciences, Falcon) con medio RPMI 1640 (Gibco BRL-life Technologies Inc, Grand Island, NY) suplementado con 10% de plasma autólogo (CRPMI); y se mantuvieron a 37ºC con 5% de CO2 durante 90 minutos, para permitir la adhesión de los monocitos a la caja. Posteriormente, se procedió a remover la fracción no adherente haciendo un lavado con solución salina estéril (Laboratorios BAXTER SA Cali-Colombia), mientras que la fracción adherente, se cultivó durante siete días adicionales bajo las mismas condiciones de incubación inicial, haciendo reemplazos con medio fresco cada 48 horas. Luego de este periodo, se recolectaron los macrófagos derivados de monocitos de sangre periférica (MDMSP) usando un cell scrapper (Techno Plastic Products AG, Suiza), se tomaron 50 µl de esta suspensión celular y se adicionó 50µl de azul de tripan para determinar la viabilidad y el número de células obtenidas, por conteo en cámara de Neubauer y calcular el número de células para cada ensayo [84].

2.3.2 Fibroblastos L929

Se usaron fibroblastos murinos de la línea celular L929 [Gentilmente donados por la Fundación Instituto de Inmunología de Colombia (FIDIC)], los cuales fueron mantenidos en cajas de poliestireno de 25cm2 con medio RPMI 1640 (Gibco BRL-life Technologies Inc, Grand Island, NY) suplementado con 5% de Suero Fetal Bovino (Microgen LTDA) e incubados a 37ºC con 5% de CO2 (CRPMI). Se realizó cambio de medio según los requerimientos, teniendo en cuenta el cambio de color de este dado por el indicador rojo de fenol. Cuando el cultivo alcanzó una confluencia entre el 80 a 90% se retiró el medio

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de cultivo para eliminar las células en suspensión, se procedió a desprender la monocapa usando un cell scrapper (Techno Plastic Products AG, Suiza) y se determinó la cantidad de células y su viabilidad, usando azul de tripan como se explico en el ítem anterior [84].

2.3.3 Promastigotes de Leishmania panamensis y Leishmania major

Se usaron promastigotes de las especies Leishmania panamensis (MHom/CO/87/UA140), gentilmente donada por la Dra. Sara María Robledo de la Universidad de Antioquia) y Leishmania major (Friedlin V1, gentilmente donada por al Dra. Ximena Cortés de la Universidad Autónoma de España), las cuales se cultivaron en cajas de poliestireno de 25cm2, (Techno Plastic Products AG, Suiza), usando medio CRPMI suplementado con 1% de L-Glutamina (Gibco-BRL Life Technologies, Inc, GrandIsland, NY), a 26ºC. Los parásitos se mantuvieron entre 5 a 6 mL de medio durante 6 días. Para el cambio de medio, se colocó el cultivo de parásitos en tubos de poliestireno de 15 mL (BD Biosciences, Falcón), se centrifugó a 1500 rpm por 5 minutos, posteriormente se agregó medio fresco. Para calcular la densidad parasitaria, se realizó un conteo de los mismos en cámara de Neubauer, tomando una alícuota de 50 µL del cultivo y mezclándola con 50 µL de solución salina que contenía una solución de Giemsa al 2% (v/v) y 2% (v/v) de Formol (este último, para inmovilización de parásitos), para posterior análisis microscópico [84].

2.4 Metodología para alcanzar el objetivo 1: “Establecer la citotoxicidad de los materiales usados en el sistem a terapéutico, sobre macrófagos humanos y sobre promastigotes de Leishmania panamensis y Leishmania major”.

2.4.1 Evaluación de la citotoxicidad de los materia les usados en el sistema de entrega, sobre células no parasitaria s (macrófagos humanos y fibroblastos L929).

Con el fin de determinar la seguridad de cada componente del sistema de entrega, se utilizó el modelo de citotoxicidad sobre macrófagos humanos. Para esto se tomaron 100 µL de suspensión celular (1x104 células/pozo en RPMI 1640 (Gibco BRL-life Technologies Inc, Grand Island, NY) suplementado con 10% de plasma autólogo), se sembraron en una caja de 96 pozos fondo plano (Techno Plastic Products AG, Suiza) y se incubaron durante 24 horas para permitir su adhesión. Por otra parte, se realizaron 4 diluciones seriadas 1:3 para cada componente, partiendo de una concentración inicial de 10 mg/mL para QBP y QMP, 1% para P1-P3, 2% para S1-S2; estas diluciones se realizaron en cajas de 96 pozos fondo curvo (Techno Plastic Products AG, Suiza), usando el mismo medio de cultivo en el que se encontraban los MDMSP [84]. Posterior a la adhesión de las células, se agregaron 100 µL de cada dilución de los materiales y mezcla (teniendo en cuenta que las células fueron sometidas a cada uno de


estos componentes por separado) y se llevaron a incubación a 37ºC con 5% de CO2 durante 72 horas. La determinación del parámetro citotoxicidad (representada como células no viables), se realizó utilizando un método indirecto: reducción de rezasurina, el cual se basa en que este colorante puede ser reducido por oxidoreductasas presentes en la mitocondria de células viables, a un compuesto denominado resorufina, la cual es excretada al medio en una forma altamente fluorescente que permite su detección mediante un espectrofluorómetro. Para la interpretación de citotoxicidad es importante tener en cuenta que los resultados que arroja esta metodología, serán inversamente proporcionales: a mayor viabilidad (mayor concentración de resorufina), menor citotoxicidad y viceversa [84, 85]. Más en detalle, después de la exposición de las células a los compuestos, se agregó a cada pozo rezasurina (SIGMA-ALDRICH St. Louis, USA) en concentración final de 44µM y se llevó a incubación a 37ºC con 5% de CO2 durante 4 horas. Finalmente, se determinó la cantidad de resorufina, utilizando el lector de placas Tecan GENios Microplate Reader (Tecan Trading AG, Suiza), el cual arroja como medida Unidades Arbitrarias de Fluorescencia (UAF). Para efecto de los cálculos se tuvieron en cuenta los pozos control donde solo se encontraban células sin ningún tipo de exposición; por lo tanto se consideró el valor de las UAF de estos pozos como 100% de viabilidad. Para determinar la viabilidad de las células en cada pozo bajo tratamiento, se usó la siguiente fórmula: (UAF de cada pozo x 100/UAF de pozos de células sin exposición) [84]. En este ensayo se tuvieron en cuenta como controles, pozos con medio de cultivo, pozos con MDMSP en medio de cultivo y pozos con MDMSP con Isetionato de Pentamidina en 8 diluciones seriadas 1:2, partiendo de una concentración inicial de 20µg/mL [84, 86]. Adicionalmente y teniendo en cuenta que los fibroblastos son células que hacen parte de la arquitectura de la piel y en una formulación de aplicación tópica pudieran verse afectadas, se determinó la capacidad citotóxica de los materiales sobre fibroblastos de la línea L929 para lo cual se usó la misma metodología descrita para MDMSP para determinar la actividad citotóxica. Posterior a la obtención de los resultados de citotoxicidad, se seleccionaron los materiales para la elaboración de distintos prototipos de formulación y su valoración farmacotécnica (estudios realizados por el Grupo de Investigación Transformación de Materiales para la Industria Farmacéutica). Con base en estos resultados se realizó la determinación de la actividad citotóxica de una mezcla prototipo final, cuyo protocolo experimental fue igual al mencionado al inicio de este ítem; para estos análisis se utilizaron 4 diluciones seriadas de la mezcla partiendo de una concentración inicial de 1% (p/v).

2.4.2 Determinación de la citotoxicidad de los mate riales usados en el sistema de entrega, sobre promastigotes de Leishmania panamensis y Leishmania major

En primera instancia, se realizaron 4 diluciones seriadas 1:3 para cada material (polímeros, solventes, plastificantes) y mezcla prototipo, las cuales se realizaron en cajas de 96 pozos fondo plano (Techno Plastic Products AG, Suiza). Posteriormente, a partir de un cultivo de Leishmania panamensis y Leishmania major en fase logarítmica, se

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tomaron 100 µL en concentración de 2 x 105 parásitos/pozo y se llevaron a la placa de 96 pozos que contenía las diferentes concentraciones (iguales a las usadas en el ensayo con MDMSP) de los materiales para luego incubar a 26ºC durante 72 horas. Seguidamente, se medió la viabilidad parasitaria usando el método de resazurina (descrito en el ítem anterior) agregando 44µM/pozo y se incubó nuevamente a 26ºC por 48 horas. La resorufina, se midió utilizando el lector de placas Tecan GENios Microplate Reader (Tecan Trading AG, Suiza) y la interpretación de los resultados, se realizó de la misma manera que en el ensayo de citotoxicidad de MDMSP, donde las UAF de los pozos en los que se colocaron parásitos sin ningún tipo de tratamiento, fueron interpretados como 100% de viabilidad parasitaria [84]. Como controles se usaron pozos con promastigotes en medio de cultivo, pozos con solo medio de cultivo y como control de citotoxicidad positiva, se usaron pozos con promastigotes expuestos a Isetionato de Pentamidina en 8 diluciones seriadas 1:2 partiendo de concentración inicial de 20µg/mL [84, 86].

2.4.3 Determinación de la citotoxicidad de los mate riales usados en el sistema de entrega, sobre amastigotes interna lizados de Leishmania panamensis y Leishmania major.

Teniendo en cuenta que la función de los polímeros y solventes en la formulación es servir de vehículo para el antimoniato de meglumina, se decidió determinar si éstos pudieran tener un efecto deletéreo sobre los parásitos en su forma intracelular (forma causante de todas las manifestaciones clínicas de la enfermedad). Es importante resaltar que, acorde con las condiciones farmacotécnicas para la elaboración de la formulación final de la película (evaluadas por el Grupo de Investigación en Procesos de Transformación de Materiales para la Industria) y los resultados de citotoxicidad obtenidos en nuestro estudio, se seleccionó al QMP, S1 y P1, como excipientes para la preparación de una mezcla prototipo para formular el antimoniato de meglumina como ingrediente farmacéutico activo. Por lo anterior, de aquí en adelante todos los ensayos se realizaron usando estos materiales. Se tomaron 100µl de una suspensión de 2x104 MDMSP/pozo en medio RPMI 1640 (Gibco BRL-life Technologies Inc, Grand Island, NY) con 10% de plasma autólogo y se sembró en una placa de 96 pozos fondo plano (Techno Plastic Products AG, Suiza). Posterior a la incubación a 37ºC con 5% de CO2 durante 24 horas para permitir su adherencia, los cultivos se expusieron a promastigotes de Leishmania panamensis y Leishmania major respectivamente, en proporción: 1:60 (células: parásitos) y nuevamente se incubaron a 35ºC con 5% de CO2. Por otra parte, se realizaron 4 diluciones seriadas 1:2 para cada componente, partiendo de una concentración inicial de 4 mg/mL para QMP, 0.5 % para P1, 0.05% para S1; estas diluciones se realizaron en cajas de 96 pozos fondo curvo (Techno Plastic Products AG, Suiza), usando el mismo medio de cultivo en el que se encontraban los MDMSP [84]. Pasadas las 24 horas post infección, se retiró el sobrenadante para eliminar los parásitos que no fueron internalizados, se agregaron 100µl medio de cultivo fresco (RPMI con 10% de plasma autólogo), 100µl de cada una de las diluciones de los materiales y se incubó nuevamente a 35ºC con 5% de CO2 durante 48 horas. Para la establecer el porcentaje de células infectadas, se utilizó el método de SYBR® Safe, donde posterior al periodo de


incubación, se eliminó el sobrenadante de cada pozo y se agregaron 100uL de este colorante en concentración 5X manteniendo en oscuridad durante 10 minutos. La placa fue observada usando un microscopio invertido de fluorescencia (Carl Zeiss Axiovert 40 CFL, Germany) [46].

2.5 Efecto inmunomodulador de los polímeros

Teniendo en cuenta el papel que cumple el sistema inmunológico en el desarrollo fisiopatológico de la Leishmaniosis (Numeral 1.1.6.), activando ó reduciendo mediadores inmunes relacionados con la inflamación, dada su participación demostrada en polarización hacia un fenotipo de resistencia y susceptibilidad, respectivamente, se propuso determinar si alguno de los polímeros específicamente el QMP, quien ha sido catalogado como un polímero inmunomodulador [87], tendría efecto sobre MDMSP sin infectar así como sobre la infección in vitro (MDMSP infectados con promastigotes de Leishmania panamensis o Leishmania major).

2.5.1 Cuantificación de Interleuquinas

Se determinaron los niveles de interleuquinas (IL) [IL-8, IL-1β, IL-10, IL-6, IL-12p70 y TNF-α (Factor de Necrosis Tumoral alfa)], mediante Citometría de Flujo usando el Kit CBA para detección de interleuquinas proinflamatorias humanas (B.D. Biosciences - San Diego, CA, USA), para lo cual se siguió el protocolo establecido por el fabricante en donde se tomaron 50µL de perlas de captura mezcladas con 50µL de reactivo de detección PE y 50µL de sobrenadante de cultivo de las células infectadas y expuestas cada material y controles, realizando una curva de calibración para cada citoquina. Estas mezclas fueron incubadas a temperatura ambiente y en oscuridad durante 3 horas y posteriormente se lavaron por centrifugación a 1500 rpm por 15 minutos, para remover el reactivo de detección PE que no se unió. Las muestras se llevaron a lectura y análisis por Citometría de Flujo (FacsCanto II – B.D. Biosciences – San Diego, CA, USA) usando el software BDFACSDiva (B.D. Biosciences – San Diego, CA, USA) para la adquisición de los datos. Para el análisis de los datos se uso el software FCAP ArrayTM (Soft flow Inc., USA) en el que se extrapolaron las intensidades medias de fluorescencia a una curva estándar para cada interleuquina y se determinó la concentración en pg/mL para cada una de ellas en los sobrenadantes analizados [88]. El análisis de la relación entre la concentración de citoquinas liberadas por los MDMSP (infectados y no infectados), posterior a la exposición o no con cada material (excipiente), se realizó utilizando el programa Graph Pad (Versión 5.00 (Graph Pad Software, USA), utilizando un test no paramétrico, para determinar diferencias estadísticamente significativas entre las variables.

2.5.2 Cuantificación de óxido nítrico

Dentro de los mecanismos microbicidas de activación del macrófago, está la producción de óxido nítrico. Este puede ser cuantificado en muestras biológicas, mediante la detección de metabolitos secundarios como los nitritos (NO2

-), los cuales son detectados usando el sistema de reactivos de Griess [89].

Capitulo 2 29

Se tomaron 50 µL de los sobrenadantes de cultivo de MDMSP infectados con cada especie de parásito y expuestos a los excipientes (QMP, S1, P1 y mezcla de estos). A estos, se les adicionaron 50 µL de sulfanilamida al 1% preparada en 5% de ácido fosfórico y se incubó a temperatura ambiente bajo oscuridad, durante 10 minutos. Posteriormente, se agregaron 50 µL de diclorhidrato de N-1 naftiletilendiamina al 0,1% y se incubó nuevamente durante 20 minutos. Finalmente, esta reacción fue leída por espectrofotometría a una longitud de onda 550 nm (Spectofotometer T70, Instruments Ltda.). La cuantificación de NO2

- se realizó usando una curva de calibración, preparada a partir de concentraciones conocidas de nitrito de sodio [84]. Para el análisis de los resultados, se usó el programa Graph Pad Versión 5.00 (Graph Pad Software, USA).

2.6 Metodología para alcanzar el objetivo 2: “Evaluar comparativamente la capacidad leishmanicida in vitro de la formulación convencional de antimoniato de meglumina respecto a l sistema terapéutico tipo película (con antimoniato de meglumina, como i ngrediente farmacéutico activo), empleando macrófagos humanos infectados ex perimentalmente con Leishmania panamensis y Leishmania major”.

2.6.1 Evaluación de la liberación del antimonio pen tavalente contenido en el sistema terapéutico tipo película.

Para permitir la liberación del antimoniato de meglumina (ingrediente farmacéutico activo), se tomaron las películas poliméricas (producto final del sistema terapéutico) cargadas con 32 mg de antimoniato de meglumina (esterilizadas previamente usando exposición directa a luz ultravioleta durante 30 minutos por cada lado), se llevaron a cajas de petri de 9.2 cm2 (Techno Plastic Products AG, Suiza) que contenían 3 mL de buffer fosfato salino (PBS) grado analítico (Merck, Darmstadt, Alemania) y se colocaron en incubación a 35°C con 5% CO2 para simular la temperatura de la piel. La determinación del antimoniato liberado, se realizó tomando 300µL de PBS de la caja de petri a la hora, 2 horas, 4 horas, 6 horas, 8 horas, 24 horas, 48 horas y 72 horas. Para calcular la concentración de antimoniato liberado en cada uno de los tiempos se realizó una modificación a la metodología de Rojas [90] en donde se tomaron 10µL de sobrenadante, y se llevaron a un balón aforado de 5mL, se agregó 1mL de solución de Ioduro de Potasio grado analítico (Merck, Darmstadt, Alemania) mas 1mL de Acido clorhídrico al 37% grado analítico (Merck, Darmstadt, Alemania) y se completó a volumen con PBS. Posterior a agregar el HCL se contaron 10 minutos, luego de los cuales se tomó 1mL de esta reacción y se llevó a una celda para lectura en un T70 UV/VIS Spectofotometer PG (Instruments Ltda) a longitud de onda de 352 nm. Finalmente, para definir la concentración en este sobrenadante, se interpoló la absorbancia obtenida sobre una curva estándar de antimoniato de meglumina [91]. Este análisis permitió establecer, el tiempo mínimo para liberar la mayor concentración del ingrediente farmacéutico activo. Como control de este ensayo de efectividad se tomaron sobrenadantes de películas sin cargar con ingrediente farmacéutico activo.


2.6.2 Evaluación in vitro de un parámetro de seguridad del sistema de entrega tipo película.

Adicional a determinar la cantidad de antimonio liberado fue necesario evidenciar si alguno de los componentes de la película podría eluirse de la misma, por lo que se realizó un ensayo establecido por la Farmacopea para este tipo de evaluaciones. Según la Farmacopea Norteamericana, de la cual se estableció la Norma Técnica Colombiana NTC 5036 (norma equivalente con ISO 10993-5:99) se determina que dentro de las pruebas biológicas in vitro que permiten determinar la seguridad de biomateriales para uso humano está la prueba citotoxicidad sobre líneas celulares, denominada ensayo de citotoxicidad por elución de extractos, en la que a partir de los cambios morfológicos que presenten los fibroblastos L929 posterior a la exposición a los polímeros, se establece un grado de toxicidad (ver Tabla 2-1). La muestra cumple con los requisitos de la prueba si la respuesta frente a la elución del sistema no es mayor que grado 2 (levemente reactiva) [11, 12]. No obstante, esta clasificación puede llegar a ser muy subjetiva por lo que se podría complementar con el uso de colorantes supravitales como el azul de tripan, o métodos indirectos de viabilidad como por el uso de resazurina [85, 92].

Tabla 2-1. Grados de reactividad de materiales poliméricos en la prueba de elución de extractos

Grado Reactividad Condiciones de las células

0 Ninguna Gránulos intracitoplasmáticos diferenciados, sin lisis celular

1 Escasa

No más del 20% de las células son redondas, levemente adheridas, sin gránulos intracitoplasmáticos; hay

algunas células lisadas

2 Leve

No más del 50% de las células son redondas y desprovistas de gránulos

intracitoplasmáticos; no hay lisis celular extensiva y áreas vacías entre células

3 Moderada No más del 70% de las capas celulares contienen células redondas o lisadas

4 Grave Destrucción casi total de las capas celulares

Se tomaron películas de 3 cm2 y 0,5mm de grosor cargadas con antimoniato de meglumina (formulación final) y sin cargar y se esterilizaron por exposición a luz UV durante 30 minutos por cada lado. Así mismo, como controles se usaron cortes de 9cm2 de los siguientes materiales de referencia: Láminas de Polyvinyl chloride polymer “Positive Bioreaction” (USP Reference Standard, 12601 Twinbrook Parkway Rockville, MD 20852 USA) como control positivo y láminas de high density polyetilen (USP Reference Standard, 12601 Twinbrook Parkway Rockville, MD 20852 USA) como control negativo, las cuales se esterilizaron por autoclave a 121°C durante 30 minutos. La extracción se realizó colocando cada una de las láminas de referencia y películas en cajas de Petri de 9,2cm2 (Techno Plastic Products AG, Suiza) en 2 mL de un medio de extracción de baja polaridad [RPMI 1640 (Gibco BRL-life Technologies Inc, Grand Island, NY) con 10% de Suero Fetal Bovino (Microgen LTDA)]. Por otra parte, cortes de

Capitulo 2 31

controles y películas fueron expuestas a un medio de extracción con alta polaridad [RPMI 1640 (Gibco BRL-life Technologies Inc, Grand Island, NY) ,10% de Suero Fetal Bovino (Microgen LTDA) y 0,25% de Dimetilsulfóxido (DMSO) Panreac Quimica S.A] y se mantuvieron a durante 24h a 37ºC con 5% de CO2, para permitir que los componentes de la película fueran liberados al medio de cultivo [11,12].

En paralelo, a partir de un cultivo de fibroblastos de la línea L929, se tomaron 5x104 células/pozo, se sembraron en una caja de 24 pozos (Techno Plastic Products AG, Suiza) y se incubaron durante 24h para permitir su adhesión. Pasado este tiempo, los fibroblastos fueron expuestos a cada uno de los medios de extracción y se llevaron a incubar a 37ºC con 5% de CO2 durante 72h. Se realizó la determinación de citotoxicidad mediante tres métodos, el primero realizando observaciones microscópicas a 20X y 40X, a las 24, 48 y 72h de incubación, cuyo parámetro de evaluación asociado al grado de toxicidad de los componentes tiene en cuenta la granularidad de las células (Procedimiento descrito en el item anterior). El segundo método se realizó cuantificando la viabilidad mediante la exclusión de un colorante supravital (Azul de tripán [92]) el cual permite discriminar células viables de las que no lo están, dado que la pérdida de integridad de la membrana celular permite el ingreso no selectivo del colorante azul logrando evidenciar las células muertas teñidas, mientras que las células viables (con su permeabilidad selectiva en operación) se visualizan refringentes con la observación en cámara de Neubauer. El tercer método de valoración se realizó con el método de la resazurina (anteriormente descrita) posterior a 72h de exposición a los extractos de controles y películas [85, 93].

2.6.3 Determinación de la efectividad in vitro del antimonio pentavalente liberado desde el sistema terapéutico sobre macrófagos infectados con Leishmania panamensis y Leishmania major.

Inicialmente se realizo la determinación de la CL50 de los sobrenadantes, para lo cual se tomaron MDMSP, se expusieron a concentraciones de sobrenadantes a 7,5%, 4%, 1,5% y 0,5% (v/v) y se determino la viabilidad celular posterior a las 48 horas de exposición, mediante la metodología de reducción de la resazurina (anteriormente descrita).

Posterior a esto, MDMSP infectados con promastigotes de Leishmania panamensis o Leishmania major (ensayos realizados para cada uno de los parásitos), fueron expuestos a los sobrenadantes de películas cargadas y sin cargar (obtenidos de los ensayos descritos en el ítem anterior, cuyas concentraciones usadas fueron seleccionadas con base en los resultados de citotoxicidad para dichos sobrenadantes) y se incubaron a 35ºC con 5%de CO2 durante 48 horas. Como controles se utilizaron pozos con medio, pozos en donde había células sin exposición al parásito, pozos con células infectadas sin tratamiento y pozos con células infectadas y tratadas con antimoniato de meglumina (como medicamento).

La efectividad del antimoniato de meglumina liberado del sistema terapéutico, se estableció mediante la cuantificación de células infectadas usando el método de SYBR® safe, que para este caso se tuvo en cuenta la reducción del número de células


infectadas. En cada lectura se contaron 100 células y se consideró como el máximo porcentaje de infección los recuentos obtenidos de los pozos que contenían células infectadas pero sin exposición a tratamiento. Estos resultados se compararon con los obtenidos de pozos en los que se encontraban las células infectadas y expuestas a los sobrenadantes de la película que contenían el antimoniato de meglumina liberado [Es de aclarar que con anterioridad se verificó por espectrofotometría (como se indicó en el ítem inmediatamente anterior), que los sobrenadantes efectivamente contenían el antimoniato de meglumina]. A su vez, se comparó el resultado de la disminución de la infección en pozos donde las células se sometieron al antimoniato de meglumina que fue liberado del sistema terapéutico respecto los pozos en donde las células se sometieron al antimoniato de meglumina como medicamento y así determinar la eficacia comparativa del sistema terapéutico, respecto al tratamiento con la formulación convencional de antimoniato de meglumina.

2.7 Análisis de resultados de citotoxicidad y efica cia .

Para cada experimento se tuvieron en cuenta como mínimo tres replicas para el análisis de los resultados Respecto a los resultados obtenidos en cada uno de los ensayos y utilizando el software estadístico Graph Pad Prism Versión 5.00 (Graph Pad Software, USA) se calcularon: Concentración Letal 50 (CL50) de los polímeros, el solvente y la mezcla, la cual correspondió a la concentración donde se observó una inhibición del 50% de la viabilidad en la población celular después de la exposición a estos materiales de MDMSP, fibroblastos L929, promastigotes, amastigotes intracelulares y amastigotes axénicos de Leishmania panamensis y Leishmania major. Así mismo, se calculó la Concentración Efectiva 50 (CE50) del sistema terapéutico cargado con antimoniato de meglumina, correspondiente a la concentración en la cual se obtuvo una reducción del 50% de células infectadas respecto al control, en los ensayos de efectividad sobre los MDMSP infectados sin exposición a tratamiento [84].

Con estos análisis se estableció un perfil de seguridad, manifiesta en la determinación de las concentraciones más inocuas de los materiales usados en el sistema terapéutico. Así también, se estableció el potencial terapéutico in vitro (nivel de eficacia igual o mayor) del antimoniato de meglumina formulado en un sistema terapéutico tipo película, respecto al tratamiento con la formulación convencional de antimoniato de meglumina.

3. Resultados y Discusión

3.1 Determinación de la seguridad del sistema terapéutico y sus componentes.

3.1.1 Evaluación de la citotoxicidad de excipientes para la elaboración de la película polimérica sobre MDMSP y fibroblastos de la línea L929.

La materia prima utilizada para la elaboración de sistemas poliméricos con potencial uso en humanos, debe cumplir con parámetros que aseguren la inocuidad sobre cualquier tejido o célula con la que vaya a tener contacto. De este modo, los estudios de citotoxicidad sobre diferentes tipos celulares son una herramienta que permite asociar la potencial actividad que tendrían estos materiales sobre tejidos expuestos. Acorde con lo anterior y analizando nuestros resultados, se evidenció que la exposición a los diversos materiales evaluados, inducen citotoxicidad diferencial acorde con el tipo de célula valorada (ver Tabla 3-1). Los componentes y características de las membranas citoplasmáticas de cada población celular, confieren particulares respuestas cuando interactúan con moléculas del medio ambiente donde se encuentran, en este caso donde son cultivadas. Activación de receptores, afectación por cargas, alteraciones dependientes de la concentración de moléculas o compuestos en el medio donde se encuentran las células, son algunas de las principales causas por las cuales células eucariotas de distintos linajes, responden también de manera distinta a un determinado tratamiento [94]. En el análisis detallado según el tipo de material analizado (polímeros de quitosán, otros polímeros denominados P1, P2 y P3, los solventes S1 y S2 y los plastificantes denominados PL1 y PL2), encontramos que el quitosán, tanto de bajo como de mediano peso molecular, induce citotoxicidades en rangos similares cuando se emplea como tratamiento sobre los distintos tipos celulares evaluados y analizando las CL50, se observa que los MDMSP son más resistentes al efecto de este material, respecto a fibroblastos y a las formas libres de Leishmania (ver Tabla 3-1).

Comparando nuestros hallazgos respecto a los resultados reportados en la literatura, encontramos que a la fecha solo hay un estudio en el que se describe la citotoxicidad del quitosán en solución (dispersión molecular) sobre macrófagos murinos, en el cual se establece una CL50 mayor a 25 mg/mL (comparativamente mayor a la encontrada en nuestro estudio, la cual fue cercana a los 10mg/mL) [83]. Dadas las diferencias propias de las células sobre las cuales se realizó la evaluación y el solvente en el que se


dispersó el polímero, se puede justificar la variabilidad del resultado en los dos estudios. Se resalta, que el presente trabajo, constituye el primer reporte de citotoxicidad de Quitosán sobre MDMSP, como célula blanco de la infección en la LC humana. Relacionado con lo anterior -como se mencionó en la metodología (numeral 2.2.1)- el solvente S1 al 1%, fue usado para la solubilización de los dos polímeros de Quitosán (QBP y QMP), sin embargo a la concentración empleada, se evidenció toxicidad sobre todas las poblaciones celulares (lo que además se confirmó, por observación microscópica, ver figura 3-1). Por lo anterior sugerimos que este solvente podría ser el responsable de la toxicidad encontrada para los dos polímeros de Quitosán en su forma soluble (ver Tabla 3-1), teniendo en cuenta que a este punto el solvente no ha sido evaporado.

En la LC así como en cualquier patología que involucre procesos fisiopatológicos sobre la piel, los tipos celulares que hacen parte de su arquitectura pueden verse afectados. Un ejemplo de estas células son los fibroblastos, cuya función principal es degradar y sintetizar constantemente los diferentes elementos de la matriz extracelular y a su vez promover la reparación de tejidos [95-97]. Por esta razón, para determinar el efecto tóxico de los excipientes, se utilizó la línea celular L929 (línea celular avalada por la farmacopea norteamericana para estudios de citotoxicidad) [11], encontrando una CL50 de 4.182 mg/mL para QMP, resultado equiparable al del estudio de Tanjak y col. en el que se reportó una CL50 de 5 mg/mL (cercana a la aquí reportada) sobre la misma línea celular [98]. Respecto a los otros polímeros, solamente el identificado como P1 fué inocuo sobre las poblaciones celulares, a las concentraciones evaluadas. En relación con los solventes, fue absolutamente evidente la gran toxicidad inducida sobre todas las poblaciones celulares analizadas, resultado esperado teniendo en cuenta que los solventes evaluados durante este estudio, son de naturaleza ácida y se ha postulado que éstos pueden modificar el pH del medio en el que se encuentren, ocasionando desnaturalización de proteínas y afectando el funcionamiento de la membrana celular (principalmente a nivel de la pérdida de la permeabilidad selectiva o de la inducción de lisis celular) [99]. Sin embargo, debido a que la solubilidad del quitosán solo es posible en medio ácido [76], se hace necesario el uso de alguno de estos como solvente, esperando que su posterior evaporación durante la gelificación de la película, limite la citotoxicidad evidenciada.

El análisis de la citotoxicidad de los plastificantes, evidenció que los fibroblastos exhibieron una mayor CL50 para PL1 y PL2 comparado con los MDMSP, siendo el PL1 el más tóxico entre los dos plastificantes. Simultáneamente con el desarrollo de estos estudios in vitro, análisis farmacotécnicos fueron realizados por la estudiante de Maestría Ariadna Pulido y el Químico Jhon Pinzón [91]. En conjunto estos resultados permitieron seleccionar como materiales para la elaboración de la película, el QMP (que indujo una actividad homogénea sobre las dos especies/cepas de parásito), el P1 (el cual no indujo toxicidad a las concentraciones evaluadas) y el S1 (que aunque tóxico, era necesario para la solubilización del QMP). A pesar de haber analizado los plastificantes, las condiciones farmacotécnicas determinaron que no era necesario su incorporación en el prototipo de película, por lo

Capitulo 3 35

cual y sumado al hecho de limitar las variables con potencial citotóxico, la forma farmacéutica sólida no incluyó plastificantes.

Con respecto a lo anterior, la evaluación de una mezcla prototipo (conformada por QMP, P1 y S1), permitió evidenciar una citotoxicidad marcada representada en CL50 muy bajas, respecto a las obtenidas con los materiales analizados de forma independiente, observando mayor susceptibilidad por parte de los MDMSP. La toxicidad observada puede deberse al efecto sinérgico entre los materiales, a un efecto producto de algún metabolito tóxico producto de la interacción de los materiales en un medio ácido, ó a la marcada toxicidad del solvente S1 (no eliminado/evaporado), que no alcanza a ser neutralizada de forma suficiente por los demás materiales.

Los controles de tratamiento antileishmanial tuvieron la actividad esperada. El antimoniato de meglumina (Albiventriz®) en su forma pentavalente no indujo efecto tóxico sobre células eucariotas, siendo por ende inocuo para las formas libres de Leishmania, mientras que el mecanismo de acción de la pentamidina demuestra una actividad sobre las células eucariotas, particularmente sobre promastigotes (ver Tabla 3-1). En este sentido, se puede concluir que los fibroblastos son más resistentes al efecto de la pentamidina que las demás poblaciones celulares analizadas.

A la luz de las diferencias encontradas, al comparar la toxicidad de los excipientes y de la mezcla prototipo sobre MDMSP y fibroblastos L929, se hace importante la evaluación de la actividad citotóxica de estos materiales, sobre distintos tipos celulares derivados tanto de cultivos continuos, como de líneas terminales a fin de tener un mayor espectro de sus potenciales efectos adversos, dada la importancia que tienen estas células en la fisiopatología de la LC. Tabla 3-1. CL50 para cada excipiente y mezcla prototipo sobre MDMSP, fibroblastos L929 y promastigotes de Leishmania panamensis y Leishmania major.

COMPUESTO [(mg/mL) o (%)]

MDMSP FIBROBLASTOS L929 Promastigotes de Leishmania panamensis

Promastigotes de Leishmania major

CL50* Intervalo de Confianza * CL50

Intervalo de Confianza CL50

Intervalo de Confianza CL50

Intervalo de Confianza

QBP (10-0.37mg/mL) >10±0 ND 6,36±3,11 3,86 - 10,48 1,99±0,02 1,64 - 2,42 7,5±1,11 6,39 - 8,80

QMP (10-0.37mg/mL) 9,25±0,06 4,71 - 18,18 4,18±1,67 2,73 - 6,40 2,88±1,23 2,31 - 3,58 5,70±3,24 3,77 - 8,61

P1 (1-0.037%) >1±0 ND >1±0 ND >1± 0 ND >1± 0 ND P2 (1-0.037%) >1±0 ND >1±0 ND 0,94±0,15 0,55 - 2,40 0,89±0,02 0,64 - 1,24 P3 (1-0.037%) >1±0 ND >1±0 ND 0,93±0,06 0,55 - 2,22 0,91±0,01 0,62 - 2,62 S1 (2-0.07%) <0.07±0 ND <0.07±0 ND <0.07±0 ND <0.07± 0 ND S2 (2-0.07%) <0.07±0 ND <0.07±0 ND <0.07±0 ND <0.07± 0 ND

PL1 (10-0.37%) 0,90±0,85 0,48 - 1,66 1,42±0,17 1,03 -1,95 5,26±3,93 2,63 - 10,49 5,31±2,65 3,33 - 8,46 PL2 (10-0.37%) 0,99±0,97 0,25 - 3,96 8,46±2,88 5,82 – 12,30 7,22±1,77 5,65 - 9,22 8,28±2,68 5,95 - 11,53 MEZCLA (0,5-

0.018%) 0,08±0,02 0,04- 0,12 0,31±0,07 0,25 – 0,37 0,21±0,14 0,15 - 0,27 0,14±0,001 0,12 - 0,15

ALBIVENTRIZ (10-0.037 mg/mL) >10±0 ND >10±0 ND >2±0 ND >2±0 ND

PENTAMIDINA (20- 0,04 ug/mL) 0,44±0,26 0,22-0,89 >20±0 ND 0,06±0,01 0,05 - 0,06 0,14±0,03 0,12 – 0,16

MDMSP: Macrófagos humanos derivados de monocitos de sangre periférica; QBP: Quitosán de bajo peso; QMP: Quitosán de mediano peso; P1, P2, P3: Polímeros; S1 y S2: solventes; PL1 y PL2: Plastificantes; CL50: Concentración letal para el 50% de la población celular; ND: no determinado * Los valores (media e intervalos de confianza 95%) fueron obtenidos de cinco experimentos independientes cada uno por duplicado.


Figura 3-1 Microfotografías de MDMSP y fibroblastos L929 expuestos a S1.

A. Control de MDMSP sin exposición a S1 observados posterior a 72 horas de cultivo; B. MDMSP expuestos a 2% de S1 (máxima concentración usada en los ensayos), observados posterior a 72 horas de cultivo; C. MDMSP expuestos a 0,07% de S1 (mínima concentración usada en los ensayos), observados posterior a 72 horas de cultivo; D. MDMSP expuestos a S1 y coloreados con azul de tripán, observados posterior a 72 horas de cultivo (nótese la coloración azul intracelular lo que indica muerte celular); E. Control de fibroblastos L929 sin exposición a S1, observadas posterior a 72 horas de cultivo; F. fibroblastos L929 expuestos a 2% de S1 (máxima concentración usada en los ensayos), observados posterior a 72 horas de cultivo; G. Fibroblastos L929 expuestos a 0,07% de S1 (mínima concentración usada en los ensayos), observados posterior a 72 horas de cultivo; H. Fibroblastos L929 expuestos a S1 y coloreados con azul de tripán, observados posterior a 72 horas de cultivo (nótese la coloración azul intracelular lo que indica muerte celular). Estas microfotografías fueron tomadas usando el objetivo de 40X en un microscopio invertido Carl Zeiss Axiovert 40 CFL, Germany).

3.1.2 Evaluación de la citotoxicidad de los excipie ntes para la elaboración de una película polimérica sobre promas tigotes y amastigotes internalizados de Leishmania panamensis y Leishmania major.

Se logró calcular la CL50 sólo para los dos polímeros de quitosán, P2, P3 y los plastificantes, sobre las formas extracelulares [promastigote (forma infectiva)] de Leishmania panamensis y Leishmania major, encontrando mayor susceptibilidad de esta forma parasitaria frente a P2 y P3 respecto al quitosán, resaltando que esta diferencia no fue estadísticamente significativa. Al evaluar la actividad que tuvieron los demás excipientes, encontramos que éstos, inducen toxicidad fuera del rango de concentraciones evaluadas (S1 y S2), o no mostraron ser tóxicos frente a esta forma infectiva (comportamiento también encontrado sobre MDMSP y fibroblastos L929) (ver Tabla 3-1). Por otra parte se evidenció que, la CL50 del QBP sobre promastigotes de Leishmania panamensis fue menor respecto a Leishmania major, sugiriendo que esta especie del nuevo mundo, pudiera ser más sensible a este tratamiento respecto a la especie responsable de la leishmaniosis en el viejo continente (ver Tabla 3-1).

A B C D

E F G H

400X 400X 400X 400X

400X 400X 400X 400X

Capitulo 3 37

Habiendo considerado los materiales que conformarían la película, y a fin de analizar un potencial efecto antileishmanial inespecífico proveniente del sistema de entrega y no del ingrediente farmacéutico activo, se procedió a analizar la citotoxicidad del QMP, del P1, y del S1 sobre la forma infectiva de la Leishmania, el amastigote (ver Tabla 3-2). Las concentraciones aquí usadas, son más bajas respecto a las empleadas en los ensayos de citotoxicidad debido a que se consideró como partida la concentración tóxica sobre los MDMSP, limitando el daño sobre la célula fagocítica (se puede ver reducción de células parasitadas, no por efecto antiparasitario inespecífico, sino por toxicidad sobre la células blanco). En relación con lo anterior encontramos una mayor susceptibilidad de los amastigotes de Leishmania major al QMP (CL50=2,99mg/mL), que al compararse con la CL50 encontrada en nuestro estudio sobre MDMSP (9,25 mg/mL), podría sugerir actividad selectiva del QMP sobre la forma intracelular de Leishmania major, ya que se necesitaría aproximadamente 3 veces la concentración de QMP, para generar un efecto tóxico sobre la célula hospedera (ver Tabla 3-2).

Con respecto a la evaluación de la formulación convencional para el tratamiento en la leishmaniosis (el antimoniato de meglumina, cuya marca comercial usada fue el Albiventriz®) se demostró el efecto leishmanicida selectivo esperado sobre amastigotes internalizados de las dos especies parasitarias estudiadas (ver Tabla 3-2).

Las diferencias de toxicidad encontradas para los promastigotes respecto amastigotes intracelulares, pueden deberse a que la exposición de los excipientes es directa sobre los promastigotes, lo cual favorecería su interacción y podría inducir efectos notorios; mientras que la interacción de los excipientes con los amastigotes intracelulares, depende de variables como el paso a través de la membrana de la célula hospedera -el macrófago- siendo menos tóxico para la célula hospedera y más selectivo para el parásito, así como del metabolismo celular fagocítico (generando posibles metabolitos), lo que influiría individualmente o en conjunto, en la capacidad tóxica de estos materiales. Aunque si bien, los resultados obtenidos con QMP como tratamiento, sugieren un efecto antileishmanial selectivo, se recuerda que esta forma (soluble) no será la que se encuentra en la película final con aplicaciones farmacéuticas, por lo cual era indispensable analizar si dicho evento, se sostenía aún con el empleo de la forma farmacéutica sólida, para lo cual se planteó el segundo objetivo.

Tabla 3-2. CL50 de cada excipiente sobre amastigotes internalizados de Leishmania panamensis y Leishmania major

COMPUESTO [(mg/mL) o (%)]

Amastigotes internalizados de

Leishmania panamensis

Amastigotes internalizados de Leishmania major

CL50 Intervalo de Confianza CL50

Intervalo de Confianza

QMP (4-0.5mg/mL) >4±0 ND 2,29±0,54 0,8656 - 6,067

P1 (0,5-0.062%)

>0,5±0 ND >0,5±0 ND

S1 (0,05-0.0062% ND ND ND ND

ALBIVENTRIZ (1-0.125mg/mL)

0,122±0,03 0,1050 – 0,1483

0,24±0,13 0,01057 – 2,073

QMP: Quitosán de mediano peso; P1, Polímero; S1: solvente; CL50: Concentración letal para el 50% de la población celular; ND: no determinado a Concentraciones utilizadas en los experimentos sobre amastigotes intracelulares b Concentraciones utilizadas en los experimentos sobre amastigotes axénicos

* Los valores (media e intervalos de confianza 95%) de los resultados obtenidos para amastigotes intracelulares, fueron obtenidos de tres experimentos Independientes corridos por duplicado. Los resultados obtenidos sobre amastigotes axénicos corresponden a un solo experimento por duplicado.


Las diferencias entre los resultados de toxicidad para las dos especies, revelan la importancia del tamizaje de los materiales sobre cada especie (cepa de parásito), ya que si bien estas dos especies son responsables de la misma forma clínica de leishmaniosis, presentan distintos comportamientos frente a los tratamientos, lo que se podría relacionar con aspectos inherentes a su capacidad infectiva o probablemente con aspectos de virulencia de cada especie. Finalmente, los análisis de citotoxicidad para los excipientes bajo las condiciones experimentales contempladas en los protocolos experimentales in vitro utilizados (MDMSP, fibroblastos L929, promastigotes y amastigotes intracelulares de Leishmania panamensis y Leishmania major), demostraron un efecto tóxico constante del S1, sobre las líneas celulares analizadas. Sin embargo, cuando el S1 se usó en conjunto con el QMP (recordando que este polímero fue solubilizado en el solvente S1) se evidenció un reducción en la actividad tóxica, respecto a la exposición directa de este solvente frente a los modelos celulares evaluados, lo que podría sugerir un efecto “neutralizante” del QMP sobre el solvente ó quizá “protector” sobre las células eucariotas expuestas a la solución. No obstante y referente a la exposición de las células a la mezcla prototipo (en la que se usó el QMP, S1 y P1), a diferencia de lo observado con el QMP, se volvió a evidenciar una toxicidad marcada, lo que hace pensar que la interacción entre los excipientes, ya sea entre QMP y P1 o P1 y S1, puede ser la causante de esta toxicidad (justificación soportada en el análisis de las CL50 reportadas en este estudio). Aunque el objetivo del presente trabajo, fue determinar la citotoxicidad de los excipientes sobre diferentes tipos celulares relacionadas con la fisiopatología de la leishmaniosis (relación piel-parásito), evaluando específicamente el efecto farmacológico de estos sobre una infección experimental (tóxico sobre el parásito e inocuo sobre los MDMSP), la formulación final para tratar las lesiones presentadas en la LC, constituye un sistema terapéutico tipo película polimérica, por lo que la respuesta tóxica entre los excipientes por separado, excipientes en mezcla (solución) y la película (forma farmacéutica sólida) puede variar. Lo anterior se sustenta en lo observado en el trabajo realizado por la Tesista Ángela María Gómez Galindo, quien evaluó esta formulación sobre el modelo de Hámster dorado, encontrando que el sistema farmacéutico tipo película polimérica cargada con antimoniato de meglumina favoreció procesos de reparación tisular y no existió aparente toxicidad a nivel de piel adyacente a las lesiones ulcerativas, en este modelo animal [100].

Capitulo 3 39

3.2 Efecto inmunomodulador de los polímeros

3.2.1 Cuantificación de interleuquinas relacionadas con el proceso inflamatorio en sobrenadantes de cultivo de MDMSP sin infectar, MDMSP infectados con Leishmania panamensis y MDMSP infectados con Leishmania major, expuestos a los polímeros empleados en la película polimérica.

Recientemente los biomateriales se han clasificado como un "material interactivo" que como su nombre lo indica, permite una interacción adecuada con el tejido circundante sin inducir efectos adversos [101]. Sin embargo en algunos casos, los biopolímeros podrían estar asociados con eventos inflamatorios. Tal es el caso del quitosán, el cual posterior a ser implantado, exhibe efectos inmunomoduladores, como el incremento en la activación de leucocitos [101,102]. Si bien los efectos inmunomoduladores pueden considerarse como una respuesta deletérea (si no hacen parte de la farmacodinámica de la formulación), una respuesta inflamatoria moderada, puede considerarse un evento deseable, en especial cuando se requiere una reabsorción del biomaterial. No obstante, una potente respuesta inflamatoria frente a cuerpo extraño, puede inducir destrucción masiva del tejido al que este expuesto el biopolímero [101], lo que soporta la relevancia del sutil balance requerido en cualquier proceso que esté mediado por el sistema inmune, y en general por cualquier sistema secretor. Por esta razón, adicional a los estudios de citotoxicidad, el determinar mediadores solubles (citoquinas) relacionados con inflamación, como marcadores de una respuesta inmunomoduladora, apoya en gran medida la determinación de biocompatibilidad de un biomaterial. Reportes en la literatura han demostrado que el QMP posee actividad inmunomoduladora sobre macrófagos, favoreciendo la producción de mediadores solubles principalmente el TNF-α y óxido nítrico, por interacción con los receptores de manosa de la membrana de estas células [103], por lo que la posibilidad de un efecto inmunomodulador era probable (considerando la selectividad encontrada para el QMP en los ensayos de citotoxicidad sobre los amastigotes de Leishmania major). Dada esta posibilidad, se planteó la cuantificación de citoquinas en los sobrenadantes de cultivo de MDMSP sin infectar, así como sobre MDMSP infectados con Leishmania panamensis y Leishmania major y expuestos a concentraciones variables de QMP y P1 (concentraciones cercanas a la CL25, que para QMP fue entre 3,3 y 4 mg/mL y para P1 fue de 0,25 y 0,33% y la CL10, que para QMP fue entre 1 y 1,1 mg/mL y para P1 fue de 0,11y 0,12%, en las que el efecto tóxico se disminuye marcadamente). Si bien el otro polímero (P1) no demostró ningún efecto sobre las formas intracelulares de las dos especies, fue necesario determinar el comportamiento inmunomodulador de éste, por dos razones: sería también utilizado en la formulación final y era necesario establecer si cualquier otro polímero distinto al quitosán, pudiera también inducir un efecto inmunomodulador. En relación con los resultados obtenidos respecto al efecto inmunomodulador de los polímeros sobre MDMSP sin infectar, se observó que el QMP logra incrementar la producción de IL-1β y TNF- α (ver figuras 3-2B y E), definida una tendencia concentración dependiente en la que a medida que disminuye la concentración de QMP


la célula incrementa la producción de este mediador soluble; estos resultados podrían ser justificados a la luz de un fenómeno conocido como hormesis, en el cual una molécula a bajas concentraciones genera un estimulo o efecto superior, pero a altas concentraciones genera un efecto menor al esperado [104]. Como se mencionó anteriormente, estudios realizados sobre macrófagos peritoneales y macrófagos derivados de medula ósea de murinos, han permitido describir que la interacción del quitosán con el macrófago, se lleva a cabo a través de los receptores de manosa, generando la activación de los macrófagos, promoviendo la producción de óxido nítrico, TNF-α e IL-1β (estas dos últimas a concentraciones que constituyan un delicado balance de la respuesta inmune, se han relacionado con procesos de reparación tisular [87, 102, 103, 105]. No obstante, aunque las condiciones experimentales de esos estudios no son comparables con las empleadas en este trabajo (MDMSP humanos) y en este ultimo no encontramos diferencias estadísticamente significativas, se observaron tendencias que pudieran sugerir que el QMP induce la producción de mediadores solubles (citoquinas). Estudios relacionados con el control natural de la infección por Leishmania, han demostrado que esta resistencia, está relacionada con un perfil proinflamatorio, en el cual las células fagocíticas juegan un papel crítico en la respuesta microbicida, liberando citoquinas que promueven o amplifican la respuesta necesaria para el control de la enfermedad [106]. Por consiguiente, al analizar la concentración de mediadores solubles secretados (IL-8, IL-1β, IL-6, IL10, IL12, TNF- α, y NO2

-) por las células infectadas y expuestas a los tratamientos, se evidenció una respuesta relevante en aquellas células infectadas con Leishmania panamensis y únicamente para IL-8 frente a la exposición al QMP encontrando una bajoregulación en la secreción de esta citoquina (ver figura 3-2G). Es decir, el parásito parece promover la secreción de IL-8, pero el QMP parece suprimir el efecto del parásito. Lamentablemente, la variabilidad del resultado no permite concluir acerca del impacto del tratamiento con QMP sobre la interacción hospedero-patógeno. Dado que esta misma bajoregulación en la producción de IL-8 fue marcada como consecuencia de la exposición de células infectadas con Leishmania panamensis a P1, se sugiere analizar la actividad de co-tratamientos que involucren simultáneamente la exposición a QMP y P1. Reiteramos que aunque en la literatura se reporta la actividad inmunomoduladora del Quitosán, relacionada con la activación de células como los macrófagos, dichos ensayos emplean macrófagos peritoneales murinos, lo cual no nos permite comparar/extrapolar nuestros resultados a lo reportado. Adicionalmente, los estudios de activación se han realizado sobre macrófagos libres de infecciones, razón por la cual nuestros resultados no son similares a lo reportado, debido a que cuando el MDMSP es infectado y expuesto al QMP, hay una bajo regulación de estas interleuquinas, sugiriendo que el parásito puede regular la potencial actividad inmunomoduladora del QMP sobre el macrófago. Respecto a los MDMSP infectados con Leishmania major se observó una bajo regulación de la IL-8 derivada de la exposición a P1 (ver figura 3-2M). Por su parte, la exposición de los MDMSP infectados con Leishmania major a QMP indujo la producción de IL-6, IL-10 y TNF-α (concentración dependiente, a mayor concentración de QMP mayor producción de IL-6) (ver figura 3-2O, P y Q). Particularmente para el caso del TNF- α, se observó un comportamiento similar de los MDMSP infectados y expuestos al polímero P1. Si bien en el contexto de la respuesta inmune frente a parásitos de Leishmania, la IL-6 se ha relacionado con un perfil de susceptibilidad (Th2), en el contexto de reparación tisular

Capitulo 3 41

puede ejercer un efecto favorable ya que induce angiogénesis y depósitos de colágeno [107]. La producción de estas tres citoquinas generadas de forma diferencial, a consecuencia de la infección por dos especies cutaneotrópicas de Leishmania, permite sugerir que la respuesta a los tratamientos puede ser dependiente de la especie-cepa que media el proceso de invasión. Más en detalle, Leishmania major y Leishmania panamensis son las especies representativas asociadas a la forma cutánea de la enfermedad para el viejo mundo y el nuevo mundo, respectivamente y aunque estas dos especies son responsables de la misma forma clínica, estudios han demostrado diferencias filogenéticas entre estas [14]. Por la anterior razón, el estudio en MDMSP infectados con diferentes especies causantes de una misma forma clínica, es importante a la luz del análisis de potenciales tratamientos, que involucren actividad inmunomoduladora concomitante, ya que el comportamiento que demostraron los MDMSP infectados con Leishmania panamensis y MDMSP infectados con Leishmania major, expuestos a los materiales, permite sugerir que la capacidad inmunomoduladora de los tratamientos (especialmente el QMP) puede estar influenciada por el patógeno. En este punto, dejamos abierto el debate a la utilidad de excipientes funcionales -inmunomoduladores- para el control de enfermedades infecciosas, en las cuales la respuesta terapéutica, depende de un potencial “sinérgico” entre la respuesta inmune del hospedero y el antimicrobiano. Considerando los resultados de inmunomodulación para los polímeros usados en la formulación se sugiere estudiar si este efecto se conserva en la formulación final (como forma farmacéutica solida) con el fin de determinar si actuaría solo como sistema de entrega o posiblemente cumpla funciones adicionales a su objetivo principal, liberar el ingrediente farmacéutico activo.

En las Tablas 3-3, 3-4 y 3-5, se presentan los resultados de las concentraciones de IL-8, IL-1β, IL-6, IL-10, TNF-α, IL-12 y NO2

- liberados por los MDSMP sin infectar e infectados y, con y sin exposición a los polímeros.


A G M

B H N

C I O

D J P

E K Q

Capitulo 3 43

Figura 3-2 Concentración de mediadores solubles (IL-8, IL-1β, IL-6, IL-10, TNF-α y NO2

- expresadas en las diferentes células evaluadas. Figuras A-F corresponden a la concentración de mediadores solubles producidos por MDMSP sin infectar y expuestos o no a los materiales y a la mezcla de materiales; Figuras G-L corresponden a la concentración de los mediadores solubles derivados de MDMSP infectados con Leishmania panamensis expuestos y sin exposición a los materiales, la mezcla de materiales y los sobrenadantes provenientes de la liberación del antimoniato de meglumina desde el sistema terapéutico; Figuras M-R corresponden a concentración de mediadores solubles en MDMSP infectados con Leishmania major expuestos y sin exposición a los materiales, a la mezcla de materiales y los sobrenadantes provenientes de la liberación del antimoniato de meglumina desde el sistema terapéutico. Las barras representan las dos concentraciones utilizadas del material, siendo la barra gris oscura la concentración cercana a la CL25 y la barra de color gris claro la concentración cercana a la CL10; la barra blanca corresponde a los MDMSP sin infectar y sin exposición a tratamientos y la barra con relleno corresponde a los MDSMP infectados con cada especie de parasito (según sea el caso) y sin exposición. CS: MDMSP sin infectar y sin exposición; CI: MDMSP infectados con cada especie de parásito (según sea el caso); QMP: Quitosán de mediano peso molecular; P1: Polímero 1.

Tabla 3-3. Concentración de interleuquinas y NO2- cuantificados en sobrenadantes de

cultivo de MDMSP expuestos a los polímeros de QMP y P1. IL-8

(pg/mL)* IL-1β

(pg/mL)* IL-6

(pg/mL)* IL-10

(pg/mL)* TNF-α

(pg/mL)* IL-12p70 (pg/mL)*

NO2-

(mM) Células solas a

2933,93± 1277,07

3,77±3,63 1288,4±1118,96 6,23±1,90 4,24±3,78 0,00±0 ,00 6,57±5.09

QMP 2 3849,64±1972,32 12,36±17,47 1179,82±1608,43 13,1±3,49 11,30±15,98 0,00±0,00 6,68±0,002 QMP 3 1896,88±46,34 58,17±82,26 1925,35±2714,29 20,28±26,35 224,30±313,93 0,00±0,00 6,15±0,53 P1 b 2283,51±1461,92 4,15±5,87 1069,63±1477,92 7,43±4,30 0,00±0,00 0,00±0,00 3,23±0,26 P1 c 2857,96±1758,29 4,03±5,69 1405,35±1943,07 7,84±0,31 3,20±4,53 0,00±0,00 3,15±0,05

MDMSP: Macrófagos humanos derivados de monocitos de sangre periférica; QMP: Quitosán de mediano peso (los números 2 y 3 indican concentraciones usadas de QMP en donde 2 es la concentración cercana a la CL25 y la 3 a la concentración cercana a la CL10; P1: Polímero 1 (Las letras b y c indican concentraciones usadas de P1 en donde b es la la concentración cercana a la CL25 y c a la concentración cercana a la CL10); a Niveles basales de Interleuquinasy oxido nítrico (representada en nitritos NO2

-) en MDMSP + Los valores presentados para cada columna fueron obtenidos de dos experimentos independientes

Tabla 3-4. Concentración de interleuquinas y NO2

- cuantificados en sobrenadantes de cultivo de MDMSP infectados experimentalmente con Leishmania panamensis y expuestos a los polímeros QMP y P1.

IL-8 (pg/mL)*

IL-1β (pg/mL)*

IL-6 (pg/mL)*

IL-10 (pg/mL)*

TNF-α (pg/mL)*

IL-12p70 (pg/mL)*

NO2-

(mM)

Células solas a 4017,36±3328,49 0,62±0,88 624,61±843,05 1,75±2,48 1,75±2,48 29,69±8 ,58 10,73±5,96

Células infectadas sin exposición b 3882,15±5336,01 0,85±1,20 292,97±411,04 1,14±1,61 1,14±1,61 21,14±18,58 9,27±3,93 QMPc 1 793,33±279,84 0,41±0,7 1,78±1,58 2,61±2,61 1,29±1,11 20,79±18,06 4,14±0,26 QMP 3 792,77±385,36 0,00±0,00 0,72±1,02 1,67±2,35 3,30±2,90 9,96±14,09 3,11±0,21 P1 ad 105,39±44,01 0,60±1,05 2,07±1,89 2,47±2,36 2,33±2,23 15,25±13,21 3,34±1,50 P1 c 183,71±94,47 1,71±2,97 3,35±3,11 3,94±3,42 4,97±4,32 36,39±31,57 2,35±0,42

a Niveles basales de Interleuquinas en MDMSP b Niveles de interleuquinas en MDMSP infectados con promastigotes de L. panamensis, sin exposición a QMP y P1 c Niveles de interleuquinas en MDMSP infectados con promastigotes de L. panamensis y expuestos a QMP (los números 1 y 3 indican concentraciones usadas de QMP en donde 1 es la concentración cercana a la CL25 y la 3 a la concentración cercana a la CL10

F L R


d Niveles de interleuquinas en MDMSP infectados con promastigotes de L. panamensis y expuestos a P1 (Las letras a y c indican concentraciones usadas de P1 en donde a es la concentración cercana a la CL25 y c a la concentración cercana a la CL10); * Los valores (pg/mL) presentados para cada interleuquina fueron obtenidos de tres experimentos independientes

Tabla 3-5. Concentración de interleuquinas y NO2- cuantificados en sobrenadantes de

cultivo de MDMSP infectados experimentalmente con Leishmania major y expuestos a los polímeros QMP y P1.

IL-8 (pg/mL)*

IL-1β (pg/mL)*

IL-6 (pg/mL)*

IL-10 (pg/mL)*

TNF-α (pg/mL)*

IL-12p70 (pg/mL)*

NO2-

(mM) Células solas a 607,87±509,50 0,00±0,00 0,76±0,95 2,25±2,04 0,28±0, 57 0,00±0,00 6,57±5,09

Células infectadas

sin exposición b

2416,72±783,02 0,00±0,00 6,88±7,89 2,65±2,14 0,47±0 ,82 0,00±0,00 7,71±1,55

QMPc 1 2223,91±542,68 0,00±0,00 32,62±22,47 16356,48±6,80 24,56±19,15 176186,67±352187,22

9,87±4,18

QMP 3 2576,93±836,58 0,00±0,00 1,69±1,98 4,06±0,17 2,28±1,28 15,825±7,80 8,12±2,36 P1ad 133,17±1,31 0,76±1,08 2,31±1,23 2,28±1,20 2,89±1,41 25,07±6,65 2,43±0,85 P1c 126,30±75,73 1,36±1,93 3,40±1,80 3,71±3,34 3,00±2,09 19,46±27,53 2,28±0,10

a Niveles basales de Interleuquinas en MDMS b Concentración de interleuquinas en MDMSP infectados con promastigotes de Leishmania major, sin exposición a QMP o P1. c Concentración de interleuquinas en MDMSP infectados con promastigotes de Leishmania major y expuestos a QMP (los números 1 y 3 indican concentraciones usadas de QMP en donde 1 es la concentración cercana a la CL25 y la 3 a la concentración cercana a la CL10. d Concentración de interleuquinas en MDMSP infectados con promastigotes de Leishmania major y expuestos a P1 (Las letras a y c indican concentraciones usadas de P1 en donde a es la concentración cercana a la CL25 y c a la concentración cercana a la CL10); * Los valores (pg/mL) presentados para cada interleuquina fueron obtenidos de tres experimentos independientes. Las casillas presentadas como – corresponden a porcentajes de infección que que no fue posible establecer.

3.3 Determinación de la eficacia del sistema de ent rega tipo película cargada con antimoniato de meglumina versus la formulación convencional

3.3.1 Cuantificación de antimonio pentavalente libe rado del sistema terapéutico

A partir de una película polimérica de 3x3 cm cargada con 36 mg de antimoniato de meglumina, se estableció el perfil de liberación del antimoniato, en el cual se encontró que durante la primera hora, la película liberó 8,81 mg, correspondientes a un 24,46% del total de ingrediente farmacéutico activo con el que fue cargada la película. Durante las siguientes 8 horas se observó, un incremento paulatino en la cantidad de antimoniato liberado (1 a 2mg cada 2 horas), mientras que entre las 24 y 48 se observó un incremento entre el 4 al 10% respecto a las primeras 8 horas (desde 4mg hasta 9mg). Entre las 72 y 96 horas la película alcanzo una liberación entre el 67,27 y 69,09% (24,22 y 24,87 mg) del total de antimonio pentavalente con el que fue cargada la película; entre estos dos puntos finales no se observaron cambios significativos en los porcentajes de liberación de antimonio pentavalente (ver Tabla 3-6 y figura 3-3). Nuestos resultados fueron similares a los obtenidos por la estudiante de maestría Ariadna Pulido (Maestría en Ciencias Farmacéuticas, 2012), quien usando películas de composición similar, reportó que el antimoniato liberado alcanzó un 60% a las 72 horas [91]. No obstante en nuestros ensayos, la liberación alcanzada a las 72 horas fue de un 67,23% del total de antimoniato con el que se cargó el sistema (superó un 7,23% al estudio anteriormente referenciado), lo cual pudo deberse a que en nuestro caso, la exposición de la película con el medio de liberación fue directa (lo que aumentaría el coeficiente de difusión del antimonio pentavalente), mientras que en la tesis en mención, se usaron celdas de Franz, por lo cual las películas no tuvieron contacto directo con el

Capitulo 3 45

medio de liberación. Se aclara que por razones asociadas con la esterilidad obligada para los cultivos celulares, no fue posible que usáramos este tipo de celdas para el desarrollo de este proyecto. Con base en los resultados obtenidos entre las 72 y las 96 horas de liberación (donde la concentración de antimonio fue constante) y considerando los resultados de los estudios de bioadhesión de las películas en el modelo de Hámster Dorado (Tesis de Maestría Ángela María Gómez), los cuales demostraron que las películas permanecen íntegras sobre las lesiones hasta un máximo de 72 horas [100], para nuestros ensayos se contempló este periodo como tiempo final en el cual se cuantificó el máximo de ingrediente farmacéutico activo liberado. En la Tabla 3-6 se puede observar que la máxima diferencia encontrada en el perfil de liberación, en relación con la cantidad liberada respecto al tiempo, fue detectada entre las 24 y 48 horas. A partir de ese momento y hasta las 72 horas la película solo liberó aproximadamente 1 mg más, a partir de este tiempo y hasta las 96 horas la cantidad de antimonio fue similar lo que se refleja en la curva de liberación evidenciandose una meseta (ver figura 3-3). Como se mencionó en el capítulo de sistemas de entrega de ingredientes farmacéuticos activos (numeral 1.3.2), independientemente del sistema de liberación, el coeficiente de difusión del agente bioactivo a través del polímero depende, de parámetros estructurales y morfológicos del mismo, así como de la concentración de soluto (ingrediente farmacéutico activo) contenido en éste y su contacto con el solvente [72]. Este coeficiente de difusión, se relaciona directamente con la velocidad de liberación del ingrediente farmacéutico activo, por lo que además de las propiedades intrínsecas del polímero, existen otros factores menos influyentes como el pH del medio en el que se va a realizar la liberación. Adicionalmente, propiedades inherentes al ingrediente farmacéutico activo, como la solubilidad, son también indispensables al momento de estudiar el desarrollo de este tipo de formulaciones [70]. La metodología utilizada en este trabajo para la liberación del antimoniato de meglumina, permitió un contacto directo con el solvente (PBS), lo que creemos favorece la rápida liberación del antimoniato, observada durante la primera hora. Otro parámetro que podría afectar el perfil de liberación, es la distribución del ingrediente farmacéutico activo en el sistema polimérico. Según este parámetro, los sistemas se han clasificado como sistemas con depósito, en los cuales el ingrediente farmacéutico activo se encuentra en un núcleo interno rodeado por el polímero y sistemas matrices, en los que el activo se encuentra distribuido uniformemente en el sistema [70, 73]. No obstante, en este último, el grado de entrecruzamiento del polímero es un factor a tener en cuenta en el perfil de liberación del ingrediente farmacéutico activo [73]. Dados estos antecedentes y teniendo en cuenta que la elaboración del sistema terapéutico tipo película cargada con antimoniato de meglumina fue de tipo matriz [91], la liberación de solo un 67,27% del total del ingrediente farmacéutico activo con el que fue cargado el sistema, podría relacionarse con el grado de entrecruzamiento del polímero en el momento de la fabricación de la película (ver Tabla 3-6), sin embargo esto debería confirmarse en estudios analíticos posteriores.


Tabla 3-6. Cinética de liberación del antimonio pentavalente desde el sistema terapéutico tipo película polimérica.

TIEMPO DE LIBERACIÓN

(Horas)

CANTIDAD DE ANTIMONIATO LIBERADO

(mg)

PORCENTAJE DE LIBERACIÓN (%)

1 8,81±0,06 24,46±0,19

2 10,25±0,51 28,46±1,44

4 11,26±0,30 31,27±0,85

6 13,15±0,45 36,52±1,25

8 14,75±0,92 40,98±2,56

24 18,40±0,80 51,12±2,25

48 23,47±0,69 65,18±1,94

72 24,22±1,32 67,27±3,67

96 24,87±0,074 69,09±0,20

Los datos corresponden a la media de dos ensayos realizados de manera independiente. Notese el au mento progresivo de la cantidad de antimoniato libe rado en el tiempo. En negrilla se muestran los datos donde la concentración de antimoniato aum ento hasta 10% (entre 4-5 mg), diferente a lo o bservado durante las primeras 8 horas en las cuales el aumento no superó un 5% (1-2mg)

Figura 3-3. Curva de liberación de antimonio pentavalente desde la pelicula durante 96

horas

Los datos obtenidos durante este ensayo aportan conocimiento en relación al diseño farmacotécnico de este sistema, cuyo objetivo fue alcanzar una liberación de antimoniato de meglumina adecuada para ejercer el efecto farmacológico deseado.

Capitulo 3 47

3.3.2 Evaluación de la citotoxicidad del sistema de entrega sobre fibroblastos L929.

Un punto importante en la evaluación de la biocompatibilidad de un biopolímero, es el estudio de citotoxicidad in vitro, realizado con el fin de obtener información útil para su aplicación biomédica. Desde este punto de vista, la elección de un polímero biocompatible depende en gran medida del equilibrio entre la degradación relacionada con la reacción de cuerpo extraño y citotoxicidad, así como con la duración (prolongada o corta) o permanencia del biopolímero o para este caso, del sistema terapéutico sobre el tejido a tratar [87, 93]. La citotoxicidad de materiales poliméricos por elución de extractos, permite determinar en dos medios distintos (medio con mayor polaridad y medio con menor polaridad) qué tanto del polímero u otros materiales se ceden al medio. En este caso, se pretendió establecer qué tanto se cede al medio, derivado de un sistema terapéutico tipo película cargado y sin cargar con antimoniato de meglumina (este último de aquí en adelante nombrado solo como película). Según la evaluación cualitativa de la exposición de la película cargada con antimoniato de meglumina y sin cargar frente a fibroblastos de la línea L929, se evidenció un grado de toxicidad 3 (toxicidad moderada) a las 24 horas, 48 horas y 72 horas post exposición, en la cual se encontró una pérdida de la densidad celular con áreas intercelulares vacías (ver figuras 3-4 y 3-5). Considerando lo anterior, al evaluar la toxicidad de los sobrenadantes provenientes de la elución en cada uno de los medios, no se encontraron diferencias estadísticamente significativas a nivel del tipo de medios extracción (ver Tabla 3-7). Figura 3-4 . Microfotografías del control de fibroblastos sin exposición a sobrenadantes de elución.

B A 400X 400X

A. Células sin exposición cultivadas en medio con menor polaridad durante 72 horas (aumento 40X). B. Células sin exposición cultivadas en medio con mayor polaridad durante 72 horas (observadas con el objetivo de 40X, usando un microscopio invetido Carl Zeiss Axiovert 40 CFL, Germany ).


Figura 3-5. Microfotografías de fibroblastos expuestos a sobrenadantes de elución de controles y sistemas terapéuticos tipo película a las 24 y 72 horas. A. Células expuestas al control negativo, observadas a las 24 horas post-exposición; B. Células expuestas al control positivo, observadas a las 24 horas post-exposición; C: Células expuestas a la película cargada, observadas a las 24 horas post-exposición; D: Células expuestas a la película no cargada, observadas a las 24 horas post-exposición; E: Células expuestas al control negativo, observadas a las 72 horas post-exposición; F: Células expuestas al control positivo, observadas a las 72 horas post-exposición; G: Células expuestas a la película cargada, observadas a las 72 horas post-exposición; H: Células expuestas a la película no cargada, observadas a las 24 horas post-exposición .Estas microfotografías fueron tomadas en aumento 400 X, usando un microscopio invetido Carl Zeiss Axiovert 40 CFL, Germany ). Al realizar la evaluación de la citotoxicidad mediante metodologías cuantitativas como exclusión de colorantes supravitales (azul de tripan) y la reducción de la resazurina, se detectó un efecto tóxico por parte la película (cargada y sin cargar) posterior a las 72 horas de exposición, representados en los resultados de viabilidad [entre 5,52% (incluso por debajo de control positivo) y 24,68%] valorada por el método de resazurina y un 0% cuando se usó coloración con azul de tripán. Lo anterior demuestra la marcada toxicidad del sistema terapéutico sobre esta línea celular (ver Tabla 3-7).

A B

C D

E F

G H 400X 400X 400X 400X

400X 400X 400X 400X

Capitulo 3 49

Tabla 3-7. Citotoxicidad cuantitativa y cualitativa del sistema terapéutico tipo película polimérica sobre fibroblastos L929 empleando tres distintas metodologías.

EXPOSICIÓN

EVALUACIÓN CUANTITATIVA % VIABILIDAD

EVALUACION CUALITATIVA NTC5036

TRIPAN RESAZURINA GRADO DE TOXICIDAD CARACTERISTICAS

CSBP 86,56±11,68 97,31±2,70 0 No se observó lisis celular. Morfología normal,

gránulos intracitoplasmáticos diferenciados

CSAP 90,23±4,40 96,90±3,60 0 No se observó lisis celular. Morfología normal, gránulos intracitoplasmáticos diferenciados

CP 0,00±0,00 7,65±6,80 4 Células redondeadas, desprendidas, destrucción

total de la capa celular

CN 96,65±4,06 93,87±4,64 0 No se observó lisis celular. Morfología normal, gránulos intracitoplasmáticos diferenciados

PCFBP 0,00±0,00 17,93±10,43 3 Se observaron pocas células con áreas vacías

entre células, no más del 70% de células redondas

PCFAP 0,00±0,00 24,68±14,7 3 Se observaron pocas células con áreas vacías entre células, no más del 70% de células redondas

PSFBP 0,00±0,00 5,64±2,84 3 Se observaron pocas células con áreas vacías

entre células, no más del 70% de células redondas

PSFAP 0,00±0,00 5,52±0,17 3 Se observaron pocas células con áreas vacías entre células, no más del 70% de células redondas

CSP: Control de células sin exposición mantenidas durante el ensayo en medio polar; CSA: Control de células sin exposición mantenidas durante el ensayo en medio polar; CP: Células expuestas al control positivo de citotoxicidad; CN: Células expuestas al control negativo de citotoxicidad; PCFBP: Células expuestas a la extracción de la película cargada con antimoniato de meglumina en medio con baja polaridad; PCFAP: Células expuestas a la extracción de la película cargada con antimoniato de meglumina en medio con alta polaridad; PSFP: Células expuestas a la extracción de la película no cargada medio con baja polaridad; PSFA: Células expuestas a la extracción de la película no cargada medio con alta polaridad. Los datos corresponden a la media de tres experimen tos independientes corridos por duplicado.

Tanto la película cargada con antimoniato de meglumina, como la que no contenía este ingrediente farmacéutico activo, provocaron una pérdida significativa de viabilidad con respecto al control de células sin ninguna exposición y células expuestas al control negativo (P<0,001). Este resultado comparado con el comportamiento que tuvo el antimoniato de meglumina (Albiventriz®) en los ensayos de citotoxicidad sobre fibroblastos L929 (ítem 3.1.1) en la que se reportó una CL50 >10mg/mL, sugiere que la toxicidad de la película, demostrada en estos ensayos puede deberse por algún material, mezcla de estos o posiblemente subproductos, eluidos durante el proceso de extracción. Tratando de hallar una explicación a la toxicidad encontrada frente a la exposición a la película, retomamos el hallazgo del contacto del solvente (S1 de naturaleza ácida) con el medio RPMI 1640, el cual cambió de color pasando de rojo a amarillo, siendo un indicativo de reducción del pH (ácido). En condiciones de cultivo celular, el RPMI 1640 cuyo indicador es el rojo fenol (color rojo a pH 7,4) -condición fisiológica ideal en cultivo celular- frente a cambios de pH, se torna naranja a pH 7,0, amarillo a pH 6,5, azul-rojo a pH 7,6 y púrpura a pH 7,8, dichos cambios en el pH del medio pueden presentarse, entre otros por el metabolismo celular, por lo cual cuando el medio se torna color amarillo (indicativo de pH ácido) señala la necesidad de recambio de medio en un cultivo celular [108, 109], pues las condiciones ácidas del medio podrían alterar significativamente la viabilidad celular [99]. Sin embargo, consideramos que este no fue el caso, pues la confluencia celular de en la caja de cultivo no denotaba multiplicación celular. Por tanto, la modificación del pH observada a consecuencia de la exposición con S1, puede sugerir que este solvente es el responsable de alteraciones tóxicas a nivel del pH (que no son toleradas por las células tratadas). Lo anterior, se refuerza en que este mismo cambio en el indicador, se observó para el QMP pero no para P1, cuya diferencia en el protocolo de solubilización radica el usó de S1 como solvente para el QMP. Más en detalle, en los experimentos para determinar la citotoxicidad de la película sobre fibroblastos L929,


cuando ésta entró en contacto con el medio de cultivo RPMI 1640 (como medio de extracción) se evidenció un cambio de color de rojo a amarillo, lo que indicaría la presencia de residuos de S1 en la formulación final, situación probablemente responsable de la toxicidad encontrada para el sistema, representada en la concentración letal para S1 sobre MDMSP y fibroblastos (CL50 <0.07%). Al comparar las dos metodologías cuantitativas (azul de tripán y resazurina), se encontraron diferencias estadísticamente significativas (P<0,001) entre los resultados obtenidos por las dos metodologías. No obstante, la determinación de la viabilidad por exclusión de azul de tripán, utiliza solo una alícuota representativa del cultivo celular (sobre ó subestimando en la mayoría de los casos, el total de células contadas) [110], mientras que técnicas espectrofluorométricas como la reducción de resazurina, tienen mayor representatividad, dado que utilizan toda la densidad celular del cultivo para establecer el porcentaje de viabilidad [92, 93, 110]. Acorde con nuestros resultados, la metodología de reducción de resazurina nos brindó una información más certera sobre el efecto tóxico de la película y sus componentes (ver Tabla 3-7). Si bien estas dos metodologías permiten inferir sobre la viabilidad celular, cada una de ellas evalúa diferentes parámetros relacionados con la toxicidad. Por una parte el uso del azul de tripán evidencia la pérdida en la permeabilidad selectividad por parte de la membrana celular, permitiendo la entrada de este colorante, como uno de los últimos pasos en el proceso de apoptósis [92], mientras que el método de resazurina que determina la actividad metabólica de una célula viable que es capaz de reducir resazurina a resorufina (detectable espectrofluorométricamente) mediante las oxidoreductasas mitocondriales [85]. Analizando el conjunto de resultados, se resalta la importancia de emplear diferentes métodos complementarios, para determinar viabilidad, dado el alcance de cada técnica. Dados los hallazgos encontrados con estos ensayos y teniendo en cuenta que según la Farmacopea Norteamericana (USP) para la aceptación de biomateriales usados para la elaboración de sistemas terapéuticos se puede presentar hasta grado 2 de citotoxicidad [11,12], nuestro sistema terapéutico tipo película con antimoniato de meglumina como principio activo, no cumpliría con este requisito parcial para su potencial uso en humanos [presentó grado 3 por la técnica de elución de extractos (técnica recomendada por la USP) y por técnicas cuantitativas no superó el 25% de viabilidad]. No obstante, acorde con lo establecido por la USP para los estudios de biocompatibilidad de materiales y dispositivos médicos se requiere complementar este tipo de ensayos, con estudios de reactividad biológica usando modelos in vivo que permitan determinar el alcance del efecto tóxico [11,12]. Con los resultados obtenidos hasta este momento, logramos determinar que la película liberaba el ingrediente farmacéutico activo, como objetivo principal del sistema de entrega; sin embargo encontramos que también “cede” componentes tóxicos que inducen efectos deletéreos sobre las poblaciones celulares expuestas. Por lo anterior se decidió realizar los ensayos que se presentan en el siguiente ítem.

Capitulo 3 51

3.3.3 Eficacia comparativa entre el sistema terapéu tico tipo película polimérica cargada con antimoniato de megl umina, respecto a la formulación convencional

El antimoniato de meglumina administrado vía IM, ha sido usado desde 1950 como tratamiento de primera elección para todas las formas clínicas de leishmaniosis, incluidas las asociadas con parásitos del Nuevo Mundo [58]. No obstante como bien se ha documentado, este tratamiento se relaciona con severos efectos adversos, lo que interfiere además con su eficacia, dando como resultado falla terapéutica [3, 8]. Por consiguiente, una de las alternativas tendientes a resolver este problema, es el uso de sistemas de entrega, que permiten liberar de manera localizada (no sistémica) el ingrediente farmacéutico activo, conservando su eficacia y disminuyendo los efectos adversos (asociados con los niveles plasmáticos presentes en la administración vía IM) [1,60, 69]. Dentro de los sistemas terapéuticos usados para liberación de activos en la piel (sistemas transdérmicos), se encuentran las películas poliméricas [71], que para nuestro caso, son una opción favorable para el tratamiento de las lesiones características de la LC, dado que adicional al efecto leishmanicida del ingrediente farmacéutico activo liberado (antimoniato de meglumina), el sistema tipo película protege las lesiones de sobreinfección bacteriana (común en las lesiones de LC). Teniendo como antecedentes los resultados de citotoxicidad de la película, evidenciados sobre el modelo de fibroblastos L929 (ítem anterior), se procedió a analizar en primer lugar el efecto tóxico de estos sobrenadantes sobre los MDMSP como célula hospedera, antes de analizar si el antimonio pentavalente liberado cumplía o no su función leishmanicida. Para ello, calculamos la CL50 de los sobrenadantes obtenidos durante los ensayos de liberación usando diferentes concentraciones [7,5%, 4%, 1,5% y 0,5% (v/v)] de sobrenadantes, seleccionadas con base en la cantidad calculada de antimonio pentavalente (SbV) que se encontraría en estas concentraciones y que fuera capaz de ejercer un efecto leishmanicida in vitro. Con base en lo anterior, se encontró que la CL50 de dichos sobrenadantes, sobre MDMSP fue de 1,49% (v/v). Teniendo en cuenta los resultados de la cinética de liberación, en la cual se observó que la cantidad de antimonio pentavalente liberado desde la película fue de 24,22 mg (cantidad liberada en 3 mL, ver protocolo experimental), lo que equivale a una concentración de 8 mg/mL. Haciendo el cálculo teórico, la concentración de SbV, contenida en esta proporción de sobrenadante es de 0,11mg/mL. No obstante, era necesario confirmar este resultado mediante la cuantificación espectrofotométrica de SbV, encontrando con el uso de esta técnica, una concentración de 0,09mg/mL. Teniendo en cuenta lo anterior, se realizaron los experimentos para determinar si a esta concentración de SbV (0,09mg/mL) se observaba actividad leishmanicida bajo nuestras condiciones experimentales (amastigotes de Leishmania panamensis y Leishmania major internalizados), encontrando que a esta concentración no se presentó actividad leishmanicida (ver Tabla 3-8). Al comparar las CE50 reportadas en nuestro estudio, para la formulación comercial de antimoniato de meglumina (Albiventriz®, con una CE50=0,12mg/mL para Leishmania panamensis y una CE50=0,24 mg/mL para Leishmania major) respecto a la concentración


liberada, podemos sugerir que el SbV liberado de la película a los sobrenadantes de cultivo, en las proporciones a las que no se evidencia actividad citotóxica sobre la célula hospedera (MDMSP), no fue suficiente para ejercer un efecto leishmanicida sobre amastigotes de Leishmania panamensis y de Leishmania major internalizados en MDMSP. Tabla 3-8: Eficacia comparativa del antimoniato de meglumina formulado en un sistema terapéutico tipo película respecto a la formulación convencional Albiventriz®

FORMULACIÓN

Amastigotes internalizados de

Leishmania panamensis % Infección al inicio del

tratamiento

% Infección posterior al tratamiento

Amastigotes internalizados de Leishmania major % Infección al

inicio del tratamiento

% Infección posterior al tratamiento

CL50 Intervalo

de Confianza

CL50 Intervalo

de Confianza

ALBIVENTRIZ (1-0.125mg/mL) 0,122±0,03 0,1050 –

0,1483 70±7,07 48,96±1,5 0,24±0,13 0,01057 – 2,073 70,1±10,5 29,76±10,45

SbV liberado desde el Sistema Terapéutico

tipo película (0,09-0,045 mg/mL)

>0,09 ND 48±9,89 49±4,24 >0,09 ND 68,5±10,6 72,15±0 ,35

Los resultados obtenidos con estos experimentos, permiten sugerir que adicional a la liberación del ingrediente farmacéutico activo, se ceden al medio uno o varios materiales, o posiblemente subproductos, los que pudieran ser responsables de la citotoxicidad generada sobre los MDMSP (resultado que ha sido reiterativo durante todo el estudio). Además, considerando que la CL50 para el antimoniato de meglumina sobre MDMSP (reportada por nosotros) fue cercana a los 10mg/mL, sugerimos que es poco probable que este ingrediente farmacéutico activo, sea el responsable de la citotoxicidad.

4. Conclusiones y perspectivas

I. Se logró calcular la CL50 para el QBP, QMP, PL1, PL2 y para una mezcla empleada en la elaboración de una película polimérica como sistema de entrega del antimoniato de meglumina, empleando MDMSP y fibroblastos. Las concentraciones evaluadas de los polímeros P1, P2 y P3, demostraron ser inocuas sobre las poblaciones celulares evaluadas. Se resalta que para S1 y S2 no fue posible determinar la CL50, debido a que se presentó elevada toxicidad a todas las concentraciones evaluadas. Se encontraron diferencias en el comportamiento de los dos tipos celulares frente a estos excipientes.

II. Los resultados del análisis de citotoxicidad (Datos de la CL50) establecidos para cada material, fueron criterio de selección de los materiales usados para la elaboración del prototipo final del sistema terapéutico tipo película (QMP, P1 y S1).

III. Se evidenció toxicidad para la mezcla prototipo, la cual puede ser atribuida al S1 o a la interacción entre excipientes.

IV. Se encontró que el potencial inmunomodulador encontrado para los polímeros de QMP y P1, puede estar influenciado por el patógeno y las particularidades antigénicas de cada especie, lo cual está soportado en las diferencias encontradas en la infección experimental de MDMSP infectados con Leishmania panamensis y MDMSP infectados con Leishmania major.

V. La toxicidad evidenciada para la película polimérica cargada con antimoniato de meglumina y sin cargar, permite sugerir modificaciones en la formulación (cambios de excipientes, modificaciones en el protocolo de elaboración de la película) y/ó analizar los resultados de la exposición a la película sobre un sistema de piel natural o artificial lesionada, a fin de establecer el verdadero alcance de los efectos observados.

VI. La comparación entre la metodología avalada por la Farmacopea Norteamericana (determinación cualitativa) y dos metodologías cuantitativas (azul de tripán y resazurina), permitió evidenciar mayor sensibilidad por parte de las técnicas cuantitativas, especialmente la metodología de reducción de resazurina, la cual brindó una información más certera sobre el efecto tóxico de la película. Por lo anterior se sugiere el uso de metodologías cuantitativas como la resazurina, para confirmar los hallazgos encontrados en la evaluación avalada por la farmacopea.

54 Evaluación de la citotoxicidad y eficacia in vitro de los componentes

VII. Se determinó el perfil de liberación del sistema terapéutico tipo película, en el que se reportó un pico de liberación a la primera hora, y un máximo de liberación a las 72 horas, a las cuales se alcanzó una liberación del 67% del antimoniato de meglumina con el que fue cargada la película.

VIII. Se propone que algunos de los materiales o productos derivados de estos son cedidos a los sobrenadantes de cultivo, generando una interferencia derivada de su toxicidad sobre MDMSP, la cual limitó la evaluación de la eficacia del antimoniato de meglumina liberado en este diseño experimental, por lo que se sugiere complementar estos estudios usando distintos modelos como los in vivo para determinar la eficacia de este ingrediente farmacéutico liberado (tesis de la estudiante Ángela Gómez) [100].

A. Anexo: Proyecto financiado por la Dirección de Investigación de la Sede Bogotá (DIB) (código: 14452)

B. Anexo: Proyecto financiado por la Dirección de Investigación de la Sede Bogotá (DIB) (código: 16015)

C. Anexo: Proyecto financiado por Colciencias (código 202010015699)

D. Anexo: Presentación oral en el II Simposio de Inmunomodulación y III Encuentro Nacional de Investigación en Inmunología

E. Anexo: Presentación oral en el XV Congreso de la Federación Farmacéutica Sudamericana

F. Anexo: Presentación poster en el XII Congreso Internacional del Colegio Nacional de Bacteriología.

G. Anexo: Articulo aceptado para publicación en el Journal Immunopharmacology and Immunotoxicology

Bibliografía 69

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Jennifer Carolina Gutiérrez Suárez · 2014-06-11 · tóxicos que van desde urticaria hasta...

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