Kleines hämatologisches und immunologisches Praktikum · Ziel der Versuche in diesem großen,...

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© Gläsernes Labor, Helmholtz Zentrum München – Deutsches Forschungszentrum für Gesundheit und Umwelt Skriptversion: 17.06.2008 Kleines hämatologisches und immunologisches Praktikum für die Mittelstufe Skriptum

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© Gläsernes Labor, Helmholtz Zentrum München – Deutsches Forschungszentrum für Gesundheit und Umwelt

Skriptversion: 17.06.2008

Kleines hämatologisches und immunologisches Praktikum für die Mittelstufe

Skriptum

Kleines hämatologisches und immunologisches Praktikum Als „Saft des Lebens“ wurde das Blut früher auch bezeichnet und mit der Seele gleichgesetzt. Auf welchen biologischen Tatsachen beruht aber der mystisch verklärte Ruf des Blutes? Ziel der Versuche in diesem großen, hämatologischen Praktikum ist es, den Schülerinnen und Schülern die Zusammensetzung, die Funktionen und die Leistungsfähigkeit des Blutes zu vermitteln und auf gesundheitsrelevante Bezüge wie Doping und Rauchen aufmerksam zu machen. Über die Bestimmung der Immunzellen führt die Diskussion direkt zur Geißel des 20. und 21. Jahrhunderts, der Krankheit AIDS. Experimente 1. Blutausstrich 2. Osmotische Erythrozytenresistenz 3. Hämatokritwertbestimmung 4. Sauerstoffminderung durch CO 5. Das ELISA-Verfahren: Diagnostischer Nachweis von Antikörpern (oder

Antigenen)

Kleines Hämatologisches Praktikum 1 – Blutausstrich

1 - Der Blutausstrich A) Blutausstrich anfertigen

Der Blutausstrich dient ungefärbt zur mikroskopischen Untersuchung auf Parasiten. Gefärbt ermöglicht der Blutausstrich Gestalt und Aussehen der Leukozyten (der Begriff Leukozyt kommt aus dem griechischen: leukos = weiss; kytos = Zelle; Synonym: Weißes Blutkörperchen) gut sichtbar zu machen und sie den verschiedenen Gruppen zuzuordnen. Parallel dazu betrachtet man auch die Erythrozyten (der Begriff Erythrozyt kommt aus dem griechischen: erythros = rot; kytos = Zelle; Synonym: Rotes Blutkörperchen) und beurteilt sie nach Größe, Form und Farbe. Diese Basisuntersuchung des Blutes wird als kleines Blutbild bezeichnet. Eine weitere sehr wichtige Untersuchung des Blutes ist das Differentialblutbild. Mit dem Differentialblutbild wird das Mengenverhältnis der verschiedenen Leukozyten ermittelt. Auf diese Weise lassen sich z.B. die Ursache und die Schwere von Infektionen annäherungsweise bestimmen.

Material: entfettete und staubfreie Objektträger, Glasstab, Folienstift zum Beschriften der Ausstriche, EDTA-Blut, Alkohol

Versuchsablauf Bemerkungen

Sicherheitsvorschriften für den Umgang mit Blut beachten! Handschuhe tragen!!

1. Legen Sie zwei Objektträger in einer Linie ausgerichtet nebeneinander

Unbedingt die Objektträger mit Alkohol reinigen!

2. Mischen Sie das Blut durch mehrmaliges Kippen des Blutröhrchens und geben Sie dann mit dem Glasstab einen kleinen Bluttropfen auf das äußere Drittel eines Objektträgers

Den Glasstab dazu schräg an den Objektträger heranführen!

3. Platzieren Sie die schmale Kante des zweiten Objektträgers vor den Blutstropfen auf den liegenden Objektträger

4. Ziehen Sie den Objektträger langsam auf den Blutstropfen und warten Sie, bis sich das Blut entlang der Glaskante verteilt hat

5. Stoßen Sie das Blut mit Hilfe des Objektträgers in einem Winkel von etwa 30° langsam über den liegenden Objektträger

Kontrollieren Sie die Qualität des Ausstrichs durch Betrachten im Gegenlicht (vergleiche unten!)

6. Beschriften Sie sofort den Ausstrich am unteren Rand, um Verwechslungen vorzubeugen

7. Der Blutausstrich wird anschließend zum Trocknen ausgelegt Die Trocknung des Ausstrichs lässt sich durch kurzes Wedeln beschleunigen

Qualität von Blutausstrichen

(1) Zu dünn und zu lang

(2) Richtig!!

(3) Zu kurz (zu kleiner Blutstropfen?)

(4) Zu dick

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Kleines Hämatologisches Praktikum 1 – Blutausstrich

Anleitung zur Anfertigung des Blutausstrichs

Bluttropfen

Objektträger zur Aufnahme des Bluttropfens

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Bluttropfen (im Winkel verlaufen)

Ausstrichrichtung

Mit dem Objektträger vorsichtig an den

Bluttropfen andocken

Bluttropfen

Kleines Hämatologisches Praktikum 1 – Blutausstrich

Der Blutausstrich

B) Blutausstrich färben Ein wichtiger Bestandteil der täglichen Laborarbeit ist das Färben biologischer Präparate. In der Hämatologie hat sich die May-Grünwald-Giemsa-Färbung (Synonym: Pappenheim-Färbung oder panoptische Färbung) als Standardfärbung etabliert. Das Wesen der Pappenheim-Färbung ist durch eine Farbsalzbildung basischer Farbstoffbestandteile mit sauren Zelleiweißanteilen bzw. sauren Farbstoffkomponenten mit basisch reagierenden Zellsubstanzen zu erklären. Mit dieser Färbemethode ist es möglich, Blutzellen so anzufärben, dass alle geformten Blutbestandteile eines getrockneten Blutausstrichs unterscheidbar werden. Der Vorteil der Pappenheim-Färbung liegt in der sehr feinen morphologischen Differenzierung der Zellen, was ein hohes Maß an diagnostischer Sicherheit gewährleistet.

Material: gut getrockneter Blutausstrich, Schnellfärbeset bestehend aus Fixierlösung, zwei Färbelösungen und einem Becherglas mit Pufferlösung, Fliesspapier zum Trocknen der gefärbten Ausstriche, Mikroskop

Versuchsablauf Bemerkungen

1. Tauchen Sie den getrockneten Blutausstriche 5mal je eine Sekunde in die Fixierlösung (Reagenz 1). Lassen Sie die überschüssige Fixierlösung auf dem Fließpapier ablaufen.

Durch den in dieser Lösung vorhandenen Methylalkohol (giftig!) werden die Zellen fixiert.

2. Tauchen Sie den Objektträger 3mal je eine Sekunde in Färbelösung 1 (Reagenz 2). Lassen Sie die überschüssige Färbelösung 1 auf dem Fließpapier ablaufen.

3. Tauchen Sie den Objektträger nun 6mal je eine Sekunde in Färbelösung 2 (Reagenz 3). Lassen Sie die überschüssige Färbelösung 2 auf dem Fließpapier ablaufen.

Standardisierte und pH-eingestellte Färbelösungen mit Methylenblau (färbt saure Zellbestandteile blau), Methyl-Azur (färbt basische Zellbestandteile rot-violett) und Eosin (färbt basische Zellbestandteile orange-rot), wobei der pH-Wert der Lösung für das färberische Verhalten ausschlag-gebend ist. Da alle Zellbestandteile gefärbt werden, wird diese Färbung auch panoptisch genannt.

4. Geben Sie zum Abschluss den Objektträger für 45 Sekunden in das Becherglas mit der Pufferlösung.

Auswaschen der überschüssigen Färbelösungen

5. Legen Sie den Objektträger zum Trocknen mit der Schichtseite nach oben auf das Fliesspapier. Die Auswertung erfolgt anschließend mit dem Mikroskop.

Auswertung von Blutausstrichen:

• Die Auszählung der weißen Blutkörperchen erfolgt mikroskopisch mit 400 facher Vergrößerung

• • In der Praxis werden 100 Zellen ausgezählt (mäanderförmig durchmustern, siehe Bild unten!) und als

Ergebnis erhält man den Prozent-Anteil der einzelnen Gruppen der weißen Blutzellen. Führe diese Prozedur durch und notiere deine Ergebnisse!

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Kleines Hämatologisches Praktikum 1 – Blutausstrich

Färbeanleitung

5 x 1 sec 3 x 1 sec 6 x 1 sec 45 sec

Reagenz 1 Reagenz 2 Reagenz 3 Pufferlösung pH 7,2

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Kleines Hämatologisches Praktikum 1 – Blutausstrich

Aufgabe zum Blutausstrich

Versuchen Sie mit Hilfe der ausgelegten Folie („Die Leukozyten“) mindestens drei verschiedene Formen der weißen Blutzellen zu unterscheiden und skizzieren Sie diese.

A B C

Kleines Hämatologisches Praktikum 1 – Blutausstrich

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Kleines Hämatologisches Praktikum 2 – Osmotische Erythrozytenresiszenz

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2 - Messung der Osmotischen Erythrozytenresistenz Eine ausreichende Zeitspanne vorausgesetzt, wird so gut wie jedes Molekül durch eine Plasmamembran in Richtung seines Konzentrationsgradienten diffundieren. Die Geschwindigkeit, mit der dies geschieht, variiert jedoch enorm, in Abhängigkeit von der Größe des Moleküls, hauptsächlich aber von seiner relativen Löslichkeit in Öl (d.h. je hydrophober oder unpolarer es ist). So sind Plasmamembranen für Wasser 109-mal durchlässiger als selbst für solch kleine Ionen wie Na+ und K+. Da die Plasmamembran für Wasser schwach durchlässig ist, fließt dies entsprechend seinem Konzentrationsgradienten langsam in die Zelle ein oder aus der Zelle heraus. Dieser Prozess wird als Osmose bezeichnet. Wird die Solutkonzentration im äußeren Milieu (hypotonische Lösung) erniedrigt, bedingt dies eine Gesamtbewegung von Wasser in die Zelle (die Zelle schwillt!). Umgekehrt führt eine hypertonische Lösung zum Austritt von Wasser aus der Zelle (die Zelle schrumpft!). Viele Säugetierzellen enthalten außerdem besondere Wasserkanäle in ihrer Plasmamembran, die Aquaporine, die den osmotischen Wasserfluss erleichtern. In Abhängigkeit von einer sich ändernden Osmolarität der extrazellulären Flüssigkeit können solche Änderungen des Wasserflusses mikroskopisch sehr gut an Erythrozyten beobachtet werden. Wie lange ein Erythrozyt einem Wassereinstrom standhält, bevor er schließlich platzt (osmotische Hämolyse), ist Ausdruck seiner physiologischen Funktionsfähigkeit und damit von großem diagnostischen Interesse, denn es gibt Krankheiten, bei denen die osmotische Widerstandskraft der Erythrozyten erhöht ist und solche, bei denen sie vermindert ist. Besonders um die letzteren zu erkennen, misst man die osmotische Erythrozytenresistenz.

Material: Reagenzgläser, Reagenzglasständer, weißer Papierstreifen, Tropfpipette, NaCl-Konzentrationsreihe von 0,2 - 0,9%, EDTA-Blut

Versuchsablauf Bemerkungen

Sicherheitsvorschriften für den Umgang mit Blut beachten! Handschuhe tragen!!

1. Beschriften Sie zunächst 8 Reagenzgläser entsprechend der NaCl-Konzentrationsreihe von 0,2 – 0,9% und befüllen diese dann mit jeweils 3 ml der vorbereiteten NaCl-Lösungen.

2. Mischen Sie das Blut durch mehrmaliges Kippen des Blutröhrchens und geben Sie dann mit der Tropfpipette je2 Tropfen Blut in die Reagenzgläser.

3. Röhrchen gut schütteln und bei Zimmertemperatur 10 min stehen lassen.

4. Danach Zentrifugation der Reagenzgläser für 5 min bei 1370 U/min (entspricht 280 g).

Wird von der Kursassistenz durchgeführt!

5. Direkt nach der Zentrifugation feststellen, in welchen Reagenzgläsern Hämolyse auftritt.

Um eine evtl. auftretende Trübung besser beurteilen zu können, empfiehlt es sich hinter die aufgereihten Reagenzgläser einen weißen Papierstreifen zu halten

Auswertung:

• Man sucht das Röhrchen, in dem die Salzlösung nicht mehr ganz farblos sondern schon leicht rötlich ist. Das ist die Konzentration, bei der die ersten Erythrozyten zerplatzt sind. (Für normale menschliche Erythrozyten wäre das etwa bei einer NaCl-Konzentration von 0.46% der Fall).

• Dann sucht man das Röhrchen, in dem überhaupt keine Erythrozyten mehr am Boden des Röhrchens sind. In diesem Röhrchen sind offenbar alle Zellen zerplatzt. (Für normale menschliche Erythrozyten wäre das etwa bei einer NaCl-Konzentration von 0.3% der Fall).

• Für normale menschliche Erythrozyten wird der Referenzbereich für diese Methode daher mit 0.30 und 0.46 angegeben.

Kleines Hämatologisches Praktikum 2 – Osmotische Erythrozytenresiszenz

Messung der Osmotischen Erythrozytenresistenz

Beispiel für die Messung der Osmotischen Erythrozytenresistenz: Die Erythrozyten des Patienten wurden in ca. 20 Röhrchen mit ansteigender NaCl-konzentration gegeben, von fast reinem Wasser bis zu der Kochsalzkonzentration, die für rote Blutkörperchen ideal ist (0,9%ige NaCl-Lösung*). Die Reagenzgläser wurden für 24h stehen gelassen und dann visuell ausgewertet. Der Übersichtlichkeit halber sind nur 4 Röhrchen dargestellt.

Erhöhung der Erythrozytenresistenz Bei einigen Krankheiten setzt die komplette Auflösung der Erythrozyten erst später als bei 0.30%, eventuell erst bei NaCl-Konzentrationen um 0.06% ein. Dazu zählen z.B. die:

• Thalassämie (Erbkrankheit) • Sichelzellen-Anämie (Erbkrankheit) • Eisenmangel-Anämie • Leberschäden • Gelbsucht durch Gallenabflussbehinderung

Eine Erhöhung der Erythrozytenresistenz ist keine große Hilfe für die Diagnose, denn für die damit assoziierten Krankheiten gibt es heute weit bessere Diagnosemöglichkeiten.

Verminderung der Erythrozytenresistenz Bei einigen Krankheiten beginnt die Auflösung der Erythrozyten bereits bei Konzentrationen von 0.7%, die vollständige Auflösung der Erythrozyten bereits bei 0.4%. Dazu zählen z.B.:

• Kugelzellen-Anämie (Erbkrankheit) • andere hämolytische Anämien

Da es für die Kugelzellen-Anämie nicht viele diagnostische Möglichkeiten gibt, hat die Messung der osmotischen Erythrozytenresistenz hier noch ihre Berechtigung.

* Eine Lösung von 0,9% Kochsalz in Wasser entspricht 154 mMol pro Liter. Die Lösung wird auch als „physiologische Kochsalzlösung“ oder „plasma-isotonische“ Lösung bezeichnet. Physiologisch oder plasma-isotonisch bedeutet, dass der osmotische Druck der Kochsalzlösung dem des Blutplasmas entspricht. Physiologische Kochsalzlösungen werden in der Medizin eingesetzt, um kurzfristig den Verlust eines größeren Blutvolumens auszugleichen und zudem recht häufig als Trägerlösung für die Infusion von Medikamenten verwendet.

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Kleines Hämatologisches Praktikum 2 – Osmotische Erythrozytenresiszenz

Aufgabe zur Messung der Osmotischen Erythrozytenresistenz

Überlegen Sie sich, wie die Form der Erythrozyten in hypotonischer und hypertonischer NaCl-Lösung aussieht und stellen Sie dies zusammen mit der Bewegung der H2O-Moleküle durch die Zellmembran zeichnerisch dar.

hypotonisch isotonisch hypertonisch

H2O

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Kleines Hämatologisches Praktikum 2 – Osmotische Erythrozytenresiszenz

Kleines Hämatologisches Praktikum 3 – Hämatokritwertbestimmung

3 - Hämatokritwertbestimmung

Was ist der Hämatokrit-Wert? Der Hämatokrit-Wert (der Begriff Hämatokrit kommt aus dem griechischen: haima = Blut und krinein= trennen, absondern) bezeichnet den Anteil der zellulären Bestandteile am Gesamtvolumen des Blutes und gibt Auskunft über die Fließeigenschaften des Blutes.

Wie wird der Hämatokrit-Wert gemessen? Bestimmt wird der Hämatokrit-Wert, indem man eine ungerinnbar gemachte Blutprobe in einem Mikro-Hämatokritröhrchen zentrifugiert. Die schwereren Erythrozyten setzen sich dabei ab. Die so gebildete rote Blutsäule wird gemessen und als prozentuales Verhältnis der Gesamtblutsäule angegeben. Den Anteil der Leukozyten (ca. 1%) an den zellulären Bestandteilen des Blutes kann man dabei vernachlässigen. Der Hämatokrit ist sowohl von der Anzahl als auch vom Volumen der Erythrozyten abhängig.

Material: entfettete und staubfreie Objektträger, Tropfpipette, Mikro-Hämatokritröhrchen, Zentrifuge, EDTA-

Blut

Versuchsablauf Bemerkungen

Sicherheitsvorschriften für den Umgang mit Blut beachten! Handschuhe tragen!! 1. Mischen Sie das Blut durch mehrmaliges Kippen des

Blutröhrchens und geben Sie dann mit der Tropfpipette 2 große Bluttropfen auf einen Objektträger

2. Das Hämatokrit-Röhrchen waagrecht, mit der nicht markierten Seite an den Blutstropfen heranführen und durch Kapillarwirkung zu ca. ¾ füllen

Keine Luftblasen einsaugen!

3. Zentrifugation der so vorbereiteten Kapillaren für 15 min bei 9 000 U/min (entspricht 7 700 g)

Wird von der Kursassistenz durchgeführt!

4. Direkt nach der Zentrifugation mit Hilfe der Schablone die verschiedenen Fraktionen ausmessen

Auswertung:

• Die ausgemessenen Fraktionen in %-Anteile umrechnen

• Den %-Anteil der festen Bestandteile berechnen

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Plastikmasse

Erythrozyten

Plasmasäule

Leukozyten

REFERENZWERTE BEREICH Männer 40-54 %

Frauen 37-47 %

Auf dem Notebook finden Sie ein Lernmodul mit Fragen und Hintergrundwissen zum Hämatokrit!

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Kleines Hämatologisches Praktikum 3 – Hämatokritwertbestimmung

Kleines Hämatologisches Praktikum 4 – Sauerstoffminderung durch CO

4 - Sauerstoffaufnahmeminderung durch Kohlenstoffmonooxid Erythrozyten bestehen zu etwa 34% aus dem roten Blutfarbstoff Hämoglobin (der Begriff Hämoglobin kommt aus dem griechischen: haima = Blut und globus =Kugel, wobei mit Globinen kugelartige Eiweißstoffe gemeint sind), der große Bedeutung für den O2 und CO2-Transport und die Pufferfunktion des Blutes hat. Das Molekül setzt sich aus 4 Polypedtidketten mit je einer Farbstoffkomponente (Häm) zusammen, die zentral ein zweiwertiges Eisenatom trägt. Die rote Farbe des Hämoglobins und damit auch des Blutes ist dadurch bedingt, dass kurzwelliges Licht (blau) relativ stark, langwelliges Licht (rot) von Hämoglobin kaum absorbiert wir. Durch Anlagerung von O2 und CO2 verändert sich das Hb-Molekül, und damit sein charakteristisches Absorptionsspektrum, was sich photometrisch quantifizieren lässt, aber auch mit dem bloßen Auge als Farbänderung zu beobachten ist. Der reversibel an das Hämoglobin gebundene O2 führt zu einer hellroten Färbung, wohingegen desoxygeniertes Hämoglobin dunkelrot erscheint. Etwa 10% der aus dem Gewebe aufgenommenen CO2-Menge bindet sich an die Aminogruppe der Proteinkomponente des Hämoglobins, wodurch das Blut eine bläulich-dunkelrote Farbe annimmt. Aufgrund der größeren Affinität des giftigen Kohlenmonoxids (CO) zu Hämoglobin wird O2 aus der Bindung mit Hämoglobin verdrängt. Es entsteht das kirschrot aussehende CO-Hämoglobin. Der weitere O2-Transport wird dabei blockiert wird. Hierin liegt die Giftigkeit des farb- und geruchlosen CO-Gases begründet.

Material: 2 Stative mit Muffen und Klammern, 2 Messzylinder (50 mL), 3 Gaswaschflaschen, Schläuche, Pipette, 2 Bechergläser, Tiegelzange, Oxalatblut, Alkohol, Zigarette

Versuchsablauf Bemerkungen

Sicherheitsvorschriften für den Umgang mit Blut beachten! Handschuhe tragen!!

1. Die Gaswaschflasche mit ca. 50 ml Oxalatblut füllen.

2. Geben Sie eine Pipette voll Alkohol in die Waschflasche und stopfen Sie anschließend Watte in den Verschluss.

Durch Zugabe von Alkohol wird die Oberflächenspannung des Blutes und damit die Schaumbildung unterdrückt

3. Die Gaswaschflasche mit Hilfe eines Stativ fixieren, über die Schlauchverbindung an die Wasserstrahlpumpe anschließen und dann Luft langsam perlend durch das Blut in der Waschflasche leiten. BEOBACHTUNG?!

Vor Inbetriebnahme den jeweiligen Aufbau unbedingt von einem Betreuer kontrollieren lassen! Jeweils die ungeöffneten Waschflaschen bis zum Ende des Versuchs als Referenz stehen lassen!

4. Anschließend wird im zweiten Versuch die CO2-Zuleitung am linken, oberen Hahn geöffnet und das Gas langsam perlend durch das Blut geleitet.

5. Folgend werden gesamten Schwelgase einer Zigarette durch das Blut in der Waschflasche hindurch gesaugt. Der Rauch soll durch den Filter der Zigarette und durch eine weitere, wasserbefüllte Waschflasche geleitet werden, um den Teer vom Blut weitgehend fern zu halten.

Unter dem Abzug arbeiten! Es darf kein Rauch in den Laborraum gelangen!

6. Nach Veränderungen des Blutes können die Waschflaschen gegeneinander ausgetauscht werden, um die Reversibilität des Vorgangs zu verdeutlichen.

Auswertung

1. Zeigen Sie die Unterschiede der Bindungsfähigkeit der verwendeten Gase im Blut auf, indem Sie durch andere Reihenfolgen der oben beschriebenen Versuchsschritte dies nachweisen!

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Kleines Hämatologisches Praktikum 4 – Sauerstoffminderung durch CO

2. Notieren Sie die Beobachtungen und erklären sie die Ursachen für die Veränderungen des Blutes!

Kleines Hämatologisches Praktikum 4 – Sauerstoffminderung durch CO

Was macht Rauchen so gefährlich? Zigarettenrauch ist ein chemischer Cocktail aus ca. 3.500 bis 4.000 verschiedenen Substanzen. Mehr als 40 Inhaltsstoffe, wie z.B. Teer, Arsen, Benzol und Cadmium, können Krebserkrankungen verursachen; andere Stoffe, wie z.B. Kohlenmonoxid, sind für ihre Giftigkeit bekannt. In der Schwangerschaft wird das heranwachsende Baby über die Nabelschnur mit den lebensnotwendigen Nährstoffen versorgt. Die schädigenden Bestandteile des Rauchens erreichen auf diesem Weg das ungeborene Kind. Durch das Rauchen fällt ein beträchtlicher Teil der mütterlichen Erythrozyten für seine eigentliche Aufgabe als Sauerstoffträger aus. Als Folge kommt es zur Unterversorgung des Kindes mit Sauerstoff. Konsequenzen für das Ungeborene wurden bereits ab einem regelmäßigen Konsum von sieben Zigaretten/Tag beobachtet. Eine starke Reduzierung der Zigarettenmenge ist daher - zumindest während Schwangerschaft und Stillzeit - unbedingt anzuraten. Am besten für Mutter und Kind wäre jedoch ein vollständiger Verzicht. Dies betrifft natürlich auch den Partner, weil Passivrauchen dem Ungeborenen ebenso schadet (denn der Tabakrauch in der Raumluft enthält die gleichen giftigen und Krebs erregenden Inhaltsstoffe wie der direkt inhalierte Rauch). Vorteile für das ungeborene Baby

Wenn Schwangere aufhören zu rauchen, tragen sie entscheidend dazu bei, dass:

• das Risiko einer Fehlgeburt vermindert wird

• sich die Gefahr einer Frühgeburt um die Hälfte reduziert

• ihr Baby eine größere Chance hat, normal gewichtig auf die Welt zu kommen

• das Risiko einer Totgeburt um ein Drittel sinkt

Vorteile für den Säugling

Auch wenn das Kind geboren ist, sollte es nicht dem Zigarettenrauch ausgesetzt werden. Ohne Passivrauchbelastung kann das Risiko für eine Reihe von Krankheiten bei Ihrem Kind vermieden werden:

• akute Atemwegserkrankungen • Bronchitis und Lungenentzündungen

• Chronische Mittelohrentzündungen • Asthmatische Erkrankungen und allergische Reaktionen

• „Plötzlicher Kindstod“

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Versuch 5 – ELISA-Verfahren

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Das ELISA-Verfahren: Diagnostischer Nachweis von Antikörpern (oder Antigenen)

Der Beitrag der B-Zellen zur Immunabwehr besteht in der Bereitstellung von Antikörpern, die sich in der flüssigen Phase des Blutes (Plasma) und in der extrazellulären Flüssigkeit der Gewebe ansammeln und dort Krankheitserreger oder ihre toxischen Produkte zunächst binden um sie anschließend zu beseitigen (siehe dazu die Abbildungen und Erklärungen ab Seite 3). In vielen Bereichen nutzen heute Standardverfahren die Spezifität (Spezifität nennt man die Fähigkeit, das jeweilige Immunogen von körpereigenen und anderen körperfremden Antigenen zu unterscheiden) und die Stabilität der Antigen-Antikörper-Bindung. So werden z.B. in der Medizin Antikörper als molekulare Sonden zur Bestimmung von Hormonspiegeln in Blut und Gewebeflüssigkeiten oder zum Nachweis von zirkulierenden Antikörpern zur diagnostischen Abklärung von Infektionen (z.B. HIV) eingesetzt. Bei diesen diagnostischen Testverfahren handelt es in der Regel um ein sog. ELISA-Testsysteme (Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay; enzymgekoppelter Immunadsorptionstest), die leicht zu automatisieren und an internationalen Standards abgeglichen sind (siehe dazu die schematische Darstellung auf Seite 2).

Im Rahmen des Praktikums soll nur auf die die Grundzüge des ELISA-Verfahrens eingegangen werden. Eine Abwandlung des hier vorgestellten Testprinzips wird im medizinischen Alltag für die Bestimmung der erzeugten Antikörper nach Impfungen verwendet. Durch diesen Antikörpernachweis kann direkt auf den Immunschutz geschlossen bzw. Rückschlüsse für eine eventuelle Impfauffrischung gezogen werden.

Material: Mikrotiterplatte beschichtet mit den Testproben, Pipette, Lösung mit

enzymgekoppeltem Antikörper, Waschlösung, Substratlösung

Versuchsablauf Bemerkungen

1. Pro Testansatz werden 100 µl einer antigenhaltigen Lösung werden in die Vertiefung der Mikrotiterplatte eingefüllt

Grundsätzlich werden Doppel-bestimmungen durchgeführt!

2. Die so behandelten Mikrotiterplatte werden über Nacht stehen gelassen

Während dieser Zeit vollzieht sich der Prozess der Adsorption des Antigens an die Plastikoberfläche der Vertiefung. Dieser Vorgang ist rein physikalischer Natur!

3. Nicht adsorbiertes Antigen wird durch mehrfaches Waschen mit antigenfreiem Waschlösung aus der Vertiefung entfernt

Der Prozess der Beschichtung (Adsorptionsphase) ist damit abgeschlossen

In diesem Zustand werden Ihnen die Vertiefungen zur „Durchführung des ELISA-Verfahrens“ zur Verfügung gestellt!

4. 100 µl einer enzymgekoppelten Antikörperlösung wird in die Vertiefungen der Mikrotiterplatte pipettiert und der Ansatz für mindestens 30 min bei Raumtemperatur stehen gelassen

Während der Inkubationsphase bindet der Enzym-markierte Antikörper an sein Antigen (spezifische Interaktion von Antigen und Antikörper)

5. Nach der Inkubation werden die Vertiefungen 5-mal mit 200 µl Waschlösung behandelt

Ungebunden Antikörper werden durch den Waschvorgang entfernt. In der Vertiefung verbleibt nur der gebundene Antikörper.

Wird von der Kursassistenz durchgeführt!

6. An den Waschvorgang schließt sich die enzymatische Nachweisreaktion an. Dazu werden jeweils 100 µl Substratlösung in die Vertiefungen gefüllt und etwa 5 min unter Lichtabschluss inkubiert

Enzymatische Nachweisreaktion!

Wird von der Kursassistenz durchgeführt!

Auswertung:

• Die Auswertung der Tests und die Besprechung der Ergebnisse erfolgt am Ende des Praktikums.

Versuch 5 – ELISA-Verfahren

Grundzüge des enzymgekoppelten Immunadorptionstests (ELISA)

Beschichtung mit Antigen

Zugabe von enzymgekoppelten Anti-A-Antikörpern

Auswaschen nicht gebundener Antikörper

Enzym erzeugt farbiges Produkt aus farblosem Substrat

Probe 2 (Antigen B)

Probe 1 (Antigen A)

Grundsätzliches: Die Basis jedes Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA) stellen 3 chemisch-physikalische Prozesse dar:

A: Adsorption von Antigen oder Antikörper an eine Festphase (Plastikoberfläche)

B: spezifische Interaktion (Bindung) von Antigen und Antikörper

C: enzymatische Nachweisreaktion

Die Kombination dieser drei Prozesse bildet den immunchemischen Nachweis „ELISA“, der heute eines der häufigsten Verfahren der medizinischen Diagnostik ist. Er findet zudem eine breite Anwendung in der biologischen Forschung. Dazu trägt insbesondere die extrem geringe Nachweisgrenze für Antigene bei, die häufig bei wenigen Picogramm (1 pg = 10-12 g) Antigen liegt. Die gute Standardisierbarkeit und Reproduzierbarkeit ist ein weiteres wesentliches Argument für die Verbreitung des ELISA-Verfahrens.

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Versuch 5 – ELISA-Verfahren

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Die Antikörper-vermittelte Immunität

– die Anheftung von Bakterien an Körperzellen verhindern

– bakterielle Toxine neutralisieren

– Infektionen durch Viren blockieren

Versuch 5 – ELISA-Verfahren

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Die wichtigsten Eigenschaften einer Antikörperantwort sind die Spezifität, die Menge, die Klasse und die Bindungsstärke der erzeugten Antikörper. Spezifität nennt man die Fähigkeit, das jeweilige Immunogen von körpereigenen und anderen körperfremden Antigenen zu unterscheiden. So sind Antikörper in der Lage so eng verwandte Proteine wie z.B. menschliches und Schweineinsulin klar voneinander abzugrenzen. Die Menge ist ein Maß für die Zahl der reagierenden B-Zellen, die Geschwindigkeit der Antikörpersynthese und die Lebensdauer der Antikörper. Die Zusammensetzung der Klassen einer Antikörperantwort bestimmt deren biologische Funktionen, sowie die Körperregionen, in denen sie auftritt. Die Bindungsstärke ist von großer Bedeutung, denn je höher sie ist, umso weniger Antikörpermoleküle sind für die Beseitigung des Krankheitserregers oder seines toxischen Produktes erforderlich.

Schematische Darstellung der Antikörper-Klassen

IgG IgD

IgA

IgM

IgE

Versuch 5 – ELISA-Verfahren

IgG Die weitaus größte Menge der Antikörper ist mit ungefähr 75 Prozent das Immunglobulin G (IgG). IgG wird bei einer Erstinfektion erst nach ungefähr drei Wochen gebildet. Tritt dieselbe Infektion aber noch einmal auf, so werden IgG Antikörper sehr schnell und in sehr großer Menge produziert. Das verhindert in der Regel den erneuten Ausbruch einer Erkrankung. Eine weitere Besonderheit von IgG ist, dass es bei einer Schwangerschaft die schützende Plazenta durchdringen kann. So wird auch das Kind vor und auch nach der Geburt vor einer Infektion geschützt. Dieser Schutz hält aber nur etwa ein halbes Jahr an.

IgD Das Immunglobulin D (IgD) ist im Serum nur in sehr geringen Mengen nachweisbar. Über seine genaue Funktion und Bedeutung ist bisher nicht sehr viel bekannt. Da es auf der Oberfläche der B-Lymphozyten „sitzt“, spielt es zumindest bei der Aktivierung der B-Zellen eine wesentliche Rolle.

IgE Das Immunglobulin E (IgE) ist ebenfalls stark spezialisiert und spielt bei der Abwehr von Wurminfektionen und bei Allergien eine Rolle. IgE ist üblicherweise nur in winzigen Mengen nachweisbar. Nur rund 0,001 Prozent aller Immunglobuline sind IgE. Trotzdem spielt es bei über 90 Prozent aller allergischen Prozesse eine wichtige Rolle. IgE kann sich leicht an bestimmte Immunzellen (z.B. Mastzellen) ankoppeln. Diese sind vor allem in der Haut und in den Schleimhäuten zu finden. Kommen Allergene mit dem Zell-gebundenen IgE in Berührung, bewirkt das eine Veränderung in der Funktion dieser Zellen. Diese Veränderungen führen zur Ausschüttung von Stoffen aus den Zellen, die in der Folge eine Entzündungsreaktion hervorrufen. Diese Stoffe werden Mediatoren oder Mittlersubstanzen genannt. Der bekannteste Mediator ist das Histamin.

IgA Das Immunglobulin A (IgA) ist spezialisiert auf Abwehr von Antigenen an den Oberflächen der menschlichen Schleimhäute z. B. in Nase, Rachen und Darm. Ihr Anteil an der gesamten Antikörpermenge beträgt ungefähr 17 Prozent. Häufig werden Krankheitserreger und Allergene schon durch IgA abgefangen und neutralisiert. Dringen die Erreger aber tiefer ein, kommt es zu einer Immunreaktion. IgA gelangt in die Milch einer stillenden Mutter, die so ihre Abwehrstoffe auf den Säugling übertragen kann.

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IgM Wenn ein fremder Erreger in den Organismus gelangt, reagiert der Körper als erstes mit der Produktion von Immunglobulin M (IgM). Weil IgM so schnell zur Verfügung steht, wird es gelegentlich auch als Frühantikörper bezeichnet. Ist die akute Phase einer Infektion überwunden, sinkt die Konzentration des IgM wieder. Handelt es sich um eine Zweitinfektion, dann bleibt die IgM Konzentration gering.

Notizen

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