Klinische Chemie und Laboratoriumsdiagnostik

Teil 3Analytische Verfahren

Klinische Chemie & Immunologie

Prof. Dr. Ralf LichtinghagenMedizinische Hochschule Hannover

Klinische ChemieTel.: 0511-5323940

Spektroskopie: Photometer (Grundbausteine)

Spektroskopie: Lambert-Beersches Gesetz

Absorbance A hat Messbereich von Null bis UnendlichI = I0 A = 0I = 0 A = Unendlich

Transmission T (I/I0) hat Messbereich von 0 bis 1

log 1/T = A

I = I0 T = 1 (%T = 100)I = 0 T = 0

log Io/I = A = ac x c x d

A: Absorbance (im Deutschen früher Extinktion E)(spektrales dekadisches Absorptionsmaß)

ac: Proportionalitätsfaktor (Extinktionskoeffizient)c: Schichtdicke in cmd: Konzentration in mol/l

Photometrie: Prinzipien

Direkte Photometrie Substanz ist farbig oder absorbiert im UV-Bereich: z.B. Bilirubin, freies Hb

Indirekte Photometrie Analyt wird in Messreaktion zu photometrisch messbarem Produkt (z.B.enzymatisch) umgewandelt.(Glucose, Lactat, Ethanol...)

Berechnung erfolgt nach Lambert-Beer-Gesetz (ac=A/c x d) mittels Standard mit bekannter Konzentration

c(Probe) = A(Probe)/A(Standard) x c(Standard)

oder aus einer KalibrationskurveCAVE: Gültigkeit nur innerhalb der des linearen Messbereichs

Photometrie: Prinzipien

Gültigkeit des Lambert-Beer-Gesetzes nur für stark

verdünnte Lösungen: Keine gegenseitige

Beeinflussung chromo-phorer Gruppen

verschiedener Moleküle

Photometrie: Prinzipien

Indikatorreaktion in diesem Zusammenhang häufig Bildung bzw. Verbrauch von NAD(P)H.Im Gegensatz zu NAD(P)+ hat NADH ein Absorptionsmaximum bei 340 nm

Beispiel: Bestimmung von Glucose mittels Hexokinase-Reaktion:

Glucose + ATP Glucose-6-Phosphat + ADP

Indikatorreaktion:

Glucose-6-Phosphat + NADP+ 6-Phosphogluconat + NADPH + H+

Hexokinase

Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase

Absorption bei 340 nm korreliert mit gebildetem NADPH und mit Glucosekonzentration

FlammenphotometrieBestimmung von Natrium, Kalium Calcium, Lithium

Färbung einer nicht leuchtenden Flamme durch Alkali- und Erdalkalisalze aufgrund thermischer Anregung von Valenzelektronen. Freiwerdende Energie als Licht mit elementspezifischen Wellenlängen

Verwendung des Prinzips rückläufig im Vergleich zur Potentiometrie

a: Lösungsmittel verdampftorg. Verbindungen verbrennend: Zerfall von NaCl in freie Atome,die thermisch angeregt werden

Je mehr Atome in der Flamme vorhanden sind, umso intensiver ist die Flammenfärbung und damit die Emissionsstrahlung

Atomabsorptionsspektroskopie (AAS)Bestimmung von z.B. Kupfer, Selen, Zink, Schwermetalle

Hohlkathodenlampen (gibt es für ca. 60 Elemente) erzeugen elementspezifisches Licht

Atomisiertes Probenmaterial absorbiert monochromatischesfür das zu bestimmende Element spezifische Licht

Absorption als Maß für die Konzentration des entsprechenden Elementes in der Messlösung

PotentiometrieBeispiel der Glaselektrode zur pH-Messung

Messung eines Potentials erfolgt fast stromlosals Potentialdifferenz bezogen auf das Potential einer ReferenzelektrodePotentiometrische Messung erfordert somit:Messelektrode und Referenzelektrode mit ionenselektiver Membran.

Einstab-Glaselektrodemit H+-sensitiver Glasmembran

Messanordnung für Potentiometrie

(Ionen-sensitiv)

PotentiometrieDie ISE-Einheit zur Bestimmung von Natrium, Kalium und Chlorid

In nahezu jedem klinisch-chemischen Analysengerät befindet sich eine sogenannte ISE-Einheit.Diese Elektroden können aufgrund z.B. der Beschaffenheit ihrer Membran spezifisch die Ionenaktivität von Ionen wie Kalium, Natrium, Chlorid und im Bedarfsfall auch Calciummessen. Wichtigste Methode zur Bestimmung dieser Messgrößen.

z.B. Kalium-Elektrode mit spezieller ionenselektiver Kunstoffmembran, in welche das Antibiotikum Valinomycin eingebettet ist (bindet spezifisch Kalium-Ionen).

Indirekte ISE: Probe wird zuerst pipettiert und vorverdünnt (z.B. 1:20) in der ISE-Einheit gemessen.

Direkte ISE:Anwendung in Blutgasgeräten zurMessung aus Vollblut, keine Vorverdünnung

ISE- Chipmodul

Immunologische VerfahrenAntikörper

80%)

IgG IgM IgA IgD IgEProzent. Anteil am Serum Ig-Pool 70-75 10 15-20 <1 SpurenMolekulargewicht (x1000) 150 970 385(Dimer)

SerumelektrophoreseInformation aus densitometrischer Auswertung

polyklonal

monoklonal

IgG, IgA und IgM mit unterschiedlicher Verteilung

Immunologische VerfahrenImmunelektrophorese/ Immunfixation

Qualitative Methodezum Nachweis vonmonoklonalen Immunglobulinen

mittels monospezifischenAntiseren gegen

Anti-IgGAnti-IgAAnti-IgMAnti-KappaAnti-Lambda

Immunologische VerfahrenNephelometrie/ Turbidimetrie

Bei diesen immunchemischen Verfahren wird durch Antikörper-Antigen-Aggregate das Licht gestreut. Anwendung beim Nachweis vieler Serumproteine (Albumin, Immunglobuline, Akute-Phase-Proteine, Speicher- und Transportproteine) und Urinproteine (Albumin, α1-Mikroglobulin).

Nephelometrie: Messung eines Anteils des gestreuten Lichtes (A)

Turbidimetrie: Messung der Abschwächung der Lichtintensität (B)

(A) (B)

Immunologische VerfahrenHeidelberger-Kurve als Grundlage bei Trübungs- und Streulichtmessungen

Antigenüberschuss:Aggregate werden wieder kleiner und somit besser löslich. Zahl der AK reicht nicht aus alle AG zu verküpfen.

Antikörperüberschuss:Jede Steigerung der AG-Menge führt zu weiter Vernetzung, die im Äquivalenzbereich am stärksten ist.

Immunologische VerfahrenImmunoassay zur Messung zahlreicher Analyten (Proteine, Pharmaka...)

z.B. ELISAEnzyme linked immuno-adsorbent assay (photometrisches Detektionsprinzip)

Alternative Detektionsprinzipen(z.T. deutlich sensitiver als der enzymatische Substratumsatz):z.B.FluoreszenzChemiluminiszenz (LIA)Elektrochemiluminiszenz (ECLIA)

Immunologische VerfahrenSandwich-Assay

Einsatz eines „Capture“-Antikörpers und eines markierten ZweitantikörpersArt der Markierung legt Detektionsprinzip fest (ELISA, RIA, LIA, ECLIA...)

Immunologische Verfahrenkompetitiver ELISA

Ein Indikator (Tracer, Label, Konjugat) konkurriert mit der Probe um BindungsstellenArt der Markierung gibt Detektionsprinzip vor

EnzymkinetikAnwendung in der Diagnostik von Erkrankungen

von Leber, Herz, Pankreas...

Für die Diagnostik und Verlaufskontrolle zahlreicher Erkrankungen werden in der Klinischen Chemie Aktivitätsbestimmungen von zahlreichen Enzymen durchgeführt.

Biochemische GrundlageEnzyme erhöhen die Reaktionsgeschwindigkeit einer Reaktion durch Herabsetzung der Aktivierungsenergie. Ohne Enzyme würden biochemische Reaktionen im Organismus nicht in nennenswertem Umfang ablaufen. Enzyme verlassen die katalysierte Reaktion unverändert.

Für den Einsatz in der Labordiagnostik ist weniger die biochemische Grundlage von Bedeutung als vielmehr der Bildungsort im Organismus und innerhalb der einzelnen Zelle und damit die Art der Freisetzung eines Enzyms.

Kinetischer TestErfassung der Reaktionsgeschwindigkeit einer enzymatischen Umwandlung zur Bestimmung der Enzymaktivität. Messung der Enzymaktivität in U/l.

Bedingungen für enzymatische Tests

Damit enzymatische Bestimmungen auch von Labor zu Labor verglichen werden können (Standardisierung), sind u.a. die Einhaltung folgender Rahmenbedingungen unbedingt erforderlich

Optimale SubstratkonzentrationOptimaler pH-WertOptimale CoenzymkonzentrationOptimale Konzentration von Aktivatoren

Definierte Temperatur (37°C)

Veränderung der Temperatur um 1° C verändert das Ergebnis eines enzymatischen Tests um ca. 10%

Zusammenhang zwischen Substratkonzentration und Reaktionsgeschwindigkeit

Enzymkinetik nach Michaelis-Menten

Michaeliskonstante

Mit steigender Substratkonzentration nimmt die Reaktionsgeschwindigkeit (v) zu1) Wenig Substrat, Enzymmoleküle vorwiegend noch frei2) Zunahme des Substrats, Hälfte der Enzyme frei, halbmaximale v3) Hohe Substratkonzentration, kein Enzym mehr zur Verfügung, maximale v.

weitere Substratzugabe erhöht v nicht

Messung der Enzymaktivität

Aufnahme einer Absorptions-Zeit-Kurve in einem vorgegebenen Messintervall zur Bestimmung der Reaktionsgeschwindigkeit

Beispiel: Bestimmung der Aktivität der Lactatdehydrogenase (LDH)

Lactat + NAD+ Pyruvat + NADH + H+

Messung der Absorptionszunahme bei 340 nm (Zunahme von NADH)

LDH

Besonderheiten enzym. Tests

Der optische Test nach Warburg beruht auf der Oxidation von NADH bzw. der Reduktion von NAD+

Man unterscheidet: Einfacher optischer Test: z.B. LDH-Bestimmung

Zusammengesetzter optischer Test mit Indikatorreaktion:Direkte Messung der enzymatischen Reaktion ist nicht möglich(z.B. ALT)

L-Alanin + α-Ketoglutarat L-Glutamat + Pyruvat

Pyruvat + NADH + H+ Lactat + NAD+

Messung der Absorptionsabnahme bei 340 nm (Abnahme von NADH)

LDH

ALT

Besonderheiten enzym. Tests

Zusammengesetzter optischer Test mit Hilfs- und Indikatorreaktion:Direkte Kopplung von enzymatischer Reaktion und Indikatorreaktion nicht möglich (z.B. Creatinkinase (CK))

Creatinphosphat + ADP Creatin + ATP

Hilfsreaktion

Glucose + ATP Glucose-6-Phosphat + ADP

Indikatorreaktion

Glucose-6-Phosphat + NADP+ 6-Phosphogluconat + NADPH + H+

Messung der Absorptionszunahme bei 340 nm (Zunahme von NADPH)

CK

Hexokinase

Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase