Klinische Chemie und LaboratoriumsdiagnostikVorlesung: Immunologische Labormethoden

Dr. rer. nat. Manfred Fobker Centrum für Laboratoriumsmedizin

– Zentrallaboratorium –Universitätsklinikum MünsterAlbert-Schweitzer-Campus 1

D-48149 MünsterTel.: 0251 83-48701Fax: 0251 83-47225

fobker@uni-muenster.dewww.klichi.uni-muenster.de

Sommersemester 2014 - 1 -

Immunglobulin-Antigenbindung

Antigen

Fab

Fc

COOH COOH

S-S S-SS-SS-S

VH

CH1

VL

CL

Schwere Kette

CH2

CH3CH3

CH2

CH1

VH

CL

VL

Flexible Übergangsregion

NH2NH2

NH2

NH2Antigen Bindung sregion

AntigenEpitop

Paratop Leichte Kette

- 2 -

Spezifität von Antikörpern

Antigen: Stoffe (z.B. Proteine), die „Antikörper-generierend“ sind

Analytische Spezifität: Fähigkeit nur den gesuchten Analytennachzuweisen

Kreuzreaktivität: Antikörper erkennt ähnliche Antigene

- 3 -

Was möchte ich messen? Beispiel: PSA-Fraktionen

PSAPSA PSA

Freies PSA PSA-ACT PSA- 2M

10-15% 85-90% nicht detektierbar

ACT= 1-antichymotrypsin 2M= 2-Makroglobulin- 4 -

Stimulanzien

Verbotene Dopingsubstanzen

Narkotika

Anabolika

Diuretika

Peptidhormone

- 5 -

• Bildung von Antigen-Antikörper-Netzwerken (Präzipitate)• bivalent•Vernetzungsgrad von ihren relativen Mengen abhängig

Antikörper-Reaktionen

- 6 -

Quantitative immunchemische Verfahren:Nephelo- und Turbidimetrie

- 7 -

PSA

Antigen Antikörper Markierung

• radioaktive Isotope

• fluorogene Moleküle

• Enzym

• luminogene Moleküle

• polyklonal• monoklonal

Spezifität:

Herkunft:• Mensch/Tier

- 8 -

Immunoassay-Testformen (heterogen)

Konzentration

A. Kompetitive Testform

Sign

al

Ag

AgAgAg

AgAg

- 9 -

Immunoassay-Testformen (heterogen)

B. Sandwich-Typ (immunometrischer Test)

Mes

ssig

nal

Ag

Ag

Ag

Ag

Konzentration

Waschen

Ag

Ag

Ag

- 10 -

Enzyme Linked Fluorescent Assay (ELFA)

Antigen markierter AK

Ag

„ Sandwich-Prinzip “

AP

MUP

MU

O O

CH3

R

+P

4-Methylumbelliferyl-Phosphat- 11 -

TeststreifenGLORIA-Technik (Gold Labelled Optical-read Rapid Immuno Assay)

FilterMischzone Testfeld Kontrolle Löschpapier

PSA

PSA

PSA

POSITIV

FilterMischzone Testfeld Kontrolle Löschpapier

NEGATIV- 12 -

+ +AgAg

a) EMIT (Enzyme-Multiplied Immunoassay Technique)

AgAgAg

Substrat

Produkt

Substrat

ProduktProduktAg

E

AgAgAg

E

Ag

E

AgAgAgAg

E

hohe Ag-Konzentration

niedrige Ag-Konzentration

hohe Ag-Konzentration

niedrige Ag-Konzentration

Homogene Immunoassays („Eintopfverfahren“)

- 13 -

Test-Spezifikationen

Probenmaterial: SerumHaltbarkeit: wenige Stunden- mehrere Wochen

(Peptide !)

Probenvolumen: 10-50 µl

Kalibratoren: WHO-Standard (methodenabhängige Werte)

Inkubationszeit: 10 min-60 min

- 14 -

Immunoassays-Anwendungen-

• Hormonbestimmungen (Schilddrüsen- und Fertilitätshormone, Insulin)

• Tumormarker (z.B. CEA, PSA, CA 15-3)• Medikamentenspiegel (z.B. Digoxin, Antibiotika)• Herzmarker (z.B. Troponin I)• Virusdiagnostik (z.B. HBsAg)

- 15 -

PSA_Kalibration

0

5

10

15

20

25

30

0 10 20 30 40 50 60

Konzentration ng/ml

Sign

alst

ärke

Wie sensitiv ist mein Verfahren?

Analytische Sensitivität (Nachweisgrenze)

- 16 -

Immunologische Messmethoden sind die sensitivsten Verfahren zum Nachweis von Substanzen in menschlichen Körperflüssigkeiten.

mg (10g-3)

ng (10g-9)

g (10g-6)

pg (10g-12)

fg (10g-15)

- 17 -

Die Nachweisgrenze AaseeFläche: 40 HektarTiefe: 2 m= 8 x 108 Liter

Immunologischer Test: z.B. PSANachweisgrenze 0,01 ng/ml = 10-8 g/lZuckerwürfel 2 g:

- 18 -

Nachweisgrenzen

Analytisch: „0-Kalibrator“ 20 Messungen + 2-3 SD

Biologisch: „Analyt-freies“ Serum 20 Messungen + 2-3 SD

Funktionell: „Analyt-freies“ Serum Konzentration, bei der VK > 20%oder aufgehobene Verdünnungslinearität

- 19 -

Untere Nachweisgrenze - ErgebnisseUntere Nachweisgrenze - Ergebnisse

Analytische untere Nachweisgrenze

Biologische untere Nachweisgrenze (Männer nach Zystoprostatektomie)

Biologische untere Nachweisgrenze (Frauen ohne Grunderkrankung)

0.5

0

0.0

9

0.0

5

0.0

4

0.0

1 0.0

7

0.4

0

0.5

8 0.6

3

0.3

8

0.2

9

0.2

9

0.5

0

0.3

0

0.2

1 0.2

7

0.1

0

0.0

3

0.6

9

0.0

5

0.5

0

0.00

0.10

0.20

0.30

0.40

0.50

0.60

0.70

0.80

1 2 3 4Assay

5 6 7

PS

A (

ng

/ml 0.5

0

0.0

9

0.0

5

0.0

4

0.0

1 0.0

7

0.4

0

0.5

8 0.6

3

0.3

8

0.2

9

0.2

9

0.5

0

0.3

0

0.2

1 0.2

7

0.1

0

0.0

3

0.6

9

0.0

5

0.5

0

0.00

0.10

0.20

0.30

0.40

0.50

0.60

0.70

0.80

1 2 3 4Assay

5 6 7

PS

A (

ng

/ml

(Junker R et al.: Measurement of prostate-specific antigen: No advantage to ultrasensitive assays? J Natl Cancer Inst 1996;88:1594)

- 20 -

PSA_Kalibration

0

5

10

15

20

25

30

0 10 20 30 40 50 60

Konzentration ng/ml

Sign

alst

ärke

Kalibration (Standardkurve)

- 21 -

„High-dose-hook-Effekt“

• Sandwich-Typ (immunometrischer Test) Mes

ssig

nal

Ag

Ag

Ag

Ag

PSA-Konzentration

Waschen

Ag

Ag

AgAg

AgAg

Ag

AgAg

Ag

Ag

Ag

- 22 -

- 23 -

Messgrenze bzw. Linearitätsgrenze

- 24 -

Schwanger?

Kontrolle

Testfeld

1. Positiv

2. Negativ

3. Schwach schwanger

Auch schwache Signale sind positiv!

- 25 -

Entscheidungsgrenzen im Serum/Urin

20 postmenopausal

20

Serum Urin

- 26 -

OK!

Vorsicht !!!

- 27 -

- 28 -

Störfaktoren

Serumproteine (z.B. Rheuma-faktoren, Bindungsproteine)

heterophile Antikörper

Anti-Tier-Antikörper

Medikamente

Hämolyse, Lipämie,Hyperbilirubinämie

kreuzreagierende Substanzen

Störungen bei Immunoassays

Niereninsuffizienz, nephrotisches Syndrom, Schwangerschaft, Transfusionen

- 29 -

PSA falsch hohes Ergebnis

HAMAEpitop

PSA falsch niedriges Ergebnis

Human-Anti-Maus-Antikörper (HAMA)

- 30 -

- 31 -

T-PSA-AssaysAbbott PSA AxSymAbbott PSA IMxBaxter/Dade Stratus-PSABayer Technicon Immuno 1Behring Berilux PSABehring N Latex PSABehring Opus PSABiochem Immunosystems

MAIAcloneBiochem Immunosystems

SR1 PSABiomar PSA ELISABiomar psaQuick stickBioMedTech BioSign PSAbioMerieux Vidas PSABoehringer Elecsys PSA

Boehringer Enzymun PSAByk-Sangtec IRMA-matByk-Sangtec LiaisonByk-Sangtec LIA-matCanAg Equi-molar EIAChembio PSA Membrane T.Chimica PSA ELISAChiron ACS2 PSACIS ELSA2 PSACIS Kryptor PSACIS RIACT PSADiag. Systems Active PSADiag. Systems Active Ultrasens PSADianova PSA DIA 0301 EDianova PSA ELISA TM 10DiaSorin ETI-PSAKDiaSorin PSACTKDPC Biermann Coat-A-CountDPC Biermann Immulite 3. Gen.

- 32 -

DPC Biermann Immulite PSADPC Biermann IRMA-countDPC Biermann Milenia PSADRG Instruments PSA EIAEiken PSAEurogen./Tosoh AIA-Pack PAFF Diagnost. PSA OncoquantFF Diagnost. PSA OncoscreenHybritech Tandem-EHybritech Tandem-RImmunocorp PSA IRMAImmunotech Liana PSAInt. Immunodiagn. PSA IEMAJant Pharmacal Accustrip PSAMedpro PSA EIAMedpro PSA Membrane T.Melotec SA Melotest PSAMerck PSA-US MagiaMitsui Pharm. High-Sens-MPMitsui Pharm. PSA-MP Quartus

Nichols PSA CELIANobis Nobi-Well TMBOrtho-Clin.-Diag. Vitros PSAPrinceton BioSign PSARoche Cobas Core PSASeratec PSA ELISA 270 Seratec PSA SemiquantSerono PSA MAIAcloneSerono SR1 PSASorin/Yang Pros-CheckSyntron QuikPac 2Syntron QuikStrip 1United Biotech Ubi MagwelVeda Lab PSA EIAVeda Lab PSA Membrane T.Wallac Delfia PSA EQMWallac Dual Label

= 70 Assays- 33 -

Analytische Beurteilung und Wertigkeit einer Bestimmungsmethode

•Präzision

•Richtigkeit

•Stabilität (Drift)

•Verschleppung

•Robustheit

•Analytische Sensitivität und Spezifität

•Diagnostische Sensitivität und Spezifität

- 34 -

Diagnostische Sensitivität:

Wahrscheinlichkeit mit der Kranke richtig erkannt werden (alle richtig positiven Ergebnisse/ alle Kranken)

Diagnostische Spezifität:

Wahrscheinlichkeit mit der Nicht-Kranke richtig erkannt werden (alle richtig negativen Ergebnisse/ alle Gesunden)

Positiver prädiktiver Wert:

Wahrscheinlichkeit bei positivem Testergebnis, das der Patient krank ist (alle richtig positiven Ergebnisse/ alle positiven Ergebnisse) abhängig von der Prävalenz

- 35 -

- 36 -

- 37 -

- 38 -

Krankheit “Y” ist asymptomatisch (Inzidenz: 1 / 1000)

Krankheit “Y” ist im Serum nachweisbar

Sensitivität: “Y”-Assay = 99 % (1 von 100 Kranken wird übersehen)

Spezifität “Y”-Assay = 98 % ( 2 von 100 Gesunden fälschlich im Verdacht

Screeninguntersuchung

- 39 -

Screeninguntersuchung

•Assay “Y” ergibt ein positivesTestergebnis in Ihrer Probe

•Wie hoch schätzen Sie Ihr Risikoein, an Krankheit “Y” zu leiden ?

- 40 -

Screeninguntersuchung

Bei einem positiven Testergebnis im Assay “Y” würde ich schätzen, daß ich mit dieser Wahrscheinlichkeit tatsächlich an Krankheit “Y” leide:

~ 99 % ~ 98 % ~ 95 % ~ 50 % ~ 5 % ~ 1 %

- 41 -

Screeninguntersuchung

Bei einem positiven Testergebnis im Assay “Y” würde ich schätzen, daß ich mit dieser Wahrscheinlichkeit tatsächlich an Krankheit “Y” leide:

~ 99 % ~ 98 % ~ 95 % ~ 50 % ~ 5 % ~ 1 %X

- 42 -

Screeninguntersuchung100.100 getestet100 Kranke, 100 000 Gesunde99 der 100 Kranken erkannt, 1 übersehen98.000 der Gesunden als gesund erkannt2.000 der Gesunden falsch-positives Testergebnis99 + 2000 haben positives Testergebnis

Wahrscheinlichkeit, daß Sie bei positivem Testergebnis an Krankheit “Y” leiden: richtig positiv / alle positiven Ergebnisse

99 / 2099 = 0,047 x 100 = 4,7 %- 43 -

Screeninguntersuchung100.100 getestet100 Kranke, 100 000 Gesunde99 der 100 Kranken erkannt, 1 übersehen98.000 der Gesunden als gesund erkannt2.000 der Gesunden falsch-positives Testergebnis99 + 2000 haben positives Testergebnis

Wahrscheinlichkeit, daß Sie bei negativem Testergebnis nicht an Krankheit “Y” leiden: richtig negativ / alle negativen Ergebnisse

98000 / 98001 = 0,99 x 100 = 99,9999 %- 44 -

- 45 -

Ausgangspunkt

TSH – Alter Bereich: 0.35 – 4.5 mIU/LTSH – Neuer Bereich: 0.55 – 4.78 mIU/L

Patient: Ergebnis zwischen 4.5 und 4.78Frage: War er krank und ist jetzt gesund?

- 46 -

Referenzbereich

MW‐2s +2s

Die Wahrschein‐lichkeit in einer gesunden Population, einen Wert, außerhalb des Referenzbereiches zu finden, beträgt 5% (1 in 20)

- 47 -

ReferenzbereichReferenzpopulation

Stichprobe(gesunde Probanden)

(Probenteilung)

Bestimmung vonReferenzwerten

Bestimmung derDistribution

Normalisierung

Bereinigung vonAusreißer

• mindestens 120 Probanden• optimal 200 Probanden• bei der Verteilung, die von normaler sehr abweicht, bis 700 Probanden

Berechnung desReferenzbereiches

- 48 -

Bestimmung von ReferenzwertenBeispiel: Natrium

Charakteristika der Methode

• Homogenität des Analyts gut• Matrixeffekte niedrig• Präzision gut• Standardisierung gut•IntraindividuelleVariabilität niedrig

• InterindividuelleVariabilität niedrig

- 49 -

Intraassay-Präzision – NatriumCentrum für Laboratoriumsdiagnostik – Monatliche QK

Ermitellte Präzision

0.9 %

- 50 -

Bestimmung des ReferenzbereichsBeispiel: Natrium

Konzentration des Analyts im Plasma

135 – 145 mEq/L

- 51 -

Bestimmung von ReferenzwertenBeispiel: TSH

Charakteristika der Methode

• Homogenität des Analyts schlecht• Matrixeffekte mittel• Präzision mittel• Standardisierung mittel•IntraindividuelleVariabilität hoch

• InterindividuelleVariabilität hoch

Beispiel: MEIA

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TSH - Intraassay-Präzision Centrum für Laboratoriumsdiagnostik – QK

Ermittelte Präzision

8.1 %

- 53 -

TSH Interindividuelle Variabilität

TSH (mIU/L)

Prob

and

12 Probanden16 Messungen1 x pro Woche

- 54 -

Bestimmung des ReferenzbereichsBeispiel: TSH

Konzentration des Analyts im Plasma

Natrium

TSH

- 55 -

TSHMethodenabhängige Referenzbereiche

Assay Erwartungswerte(µIU/L)

Zahl derProbanden

Referenz-population

SIEMENSAdvia Centaur

0.35 – 5.50 174 EuthyroidePatienten

ABBOTT Architect 0.35 – 4.94 549 Normale Individuen

SIEMENS Immulite 0.4 – 4.00 NA NA

ROCHE Cobas 0.27 – 4.20 516 Gesunde Probanden

- 56 -

Referenzbereichvs.

Medizinische Entscheidungsgrenze

Konzentration von TSH im Plasma

Gesund SymptomatischeHypothyreose

- 57 -

- 58 -