Klinische Relevanz der MDR1-, MRP1- und MRP2-Genexpression ...

Aus der Klinik für kleine Haustiere

der Tierärztlichen Hochschule Hannover

Klinische Relevanz der MDR1-, MRP1- und MRP2-Genexpression beim

malignen Lymphom des Hundes

THESE

Zur Erlangung des Grades eines

Philosophical Doctor

-Ph.D.-

im Fachgebiet

Kleintierkrankheiten

durch die Tierärztliche Hochschule Hannover

Vorgelegt von

Katja Culmsee

aus Köln

Hannover 2004

2

Supervisor: Univ.-Prof. Dr. I. Nolte

Betreuungsgruppe: Univ.-Prof. Dr. J. Bullerdiek

Univ.-Prof. Dr. W. Löscher

Univ.-Prof. Dr. I. Nolte

1. Gutachten: Univ.-Prof. Dr. J. Bullerdiek, Zentrum für Humangenetik,

Universität Bremen

Univ.-Prof. Dr. W. Löscher, Institut für Pharmakologie,

Tierärztliche Hochschule Hannover

Univ.-Prof. Dr. I. Nolte, Klinik für kleine Haustiere,

Tierärztliche Hochschule Hannover

2. Gutachten: Univ.-Prof. Dr. M. Reinacher, Institut für Veterinärpathologie,

Justus Liebig Universität Giessen

Tag der mündlichen Prüfung: 10. November 2004

3

MEINEN ELTERN

5

Inhaltsverzeichnis

1 EINLEITUNG ..................................................................................................................... 11

2 LITERATURÜBERSICHT................................................................................................ 13

2.1 MALIGNES LYMPHOM DES HUNDES ................................................................................ 13

2.2 P-GLYKOPROTEIN ........................................................................................................... 16

2.3 MULTIDRUG RESISTANCE-ASSOCIATED PROTEIN (MRP) ................................................. 21

2.3.1 MRP1....................................................................................................................... 21

2.3.2 MRP2....................................................................................................................... 22

2.4 APOPTOSE UND ZYTOSTATIKARESISTENZEN ................................................................... 23

2.4.1 Survivin.................................................................................................................... 24

2.5 WEITERE MECHANISMEN ................................................................................................ 26

3 TIERE, MATERIAL UND METHODEN........................................................................ 27

3.1 TIERE .............................................................................................................................. 27

3.2 DIAGNOSE UND KLINISCHE STADIENEINTEILUNG ............................................................ 29

3.3 CHEMOTHERAPIE............................................................................................................. 30

3.3.1 Beurteilung des Therapieerfolges ........................................................................... 32

3.4 ENTNAHME UND LAGERUNG DER PROBEN ...................................................................... 33

3.5 IMMUNPHÄNOTYPISIERUNG............................................................................................. 33

3.6 IMMUNHISTOCHEMISCHER NACHWEIS VON P-GLYKOPROTEIN ....................................... 35

3.7 MOLEKULARBIOLOGISCHE UNTERSUCHUNGEN............................................................... 37

3.7.1 Isolierung von Gesamt-RNA.................................................................................... 37

3.7.2 DNase-Behandlung ................................................................................................. 38

3.7.3 Reinigung der Gesamt-RNA.................................................................................... 38

3.7.4 Reverse Transkription (RT)..................................................................................... 39

3.7.5 Quantifizierung der MDR1-, MRP1- und MRP2-Genexpression ........................... 40

3.7.6 Nachweis von Survivin mRNA in kaninem Gewebe ................................................ 45

3.8 STATISTISCHE AUSWERTUNG .......................................................................................... 46

3.9 REAGENZIEN UND VERBRAUCHSMATERIALIEN ............................................................... 47

3.9.1 Probenentnahme und Lagerung .............................................................................. 47

6

3.9.2 Immunphänotypisierung.......................................................................................... 47

3.9.3 Immunhistochemische Untersuchung...................................................................... 48

3.9.4 Molekularbiologische Untersuchungen .................................................................. 49

4 ERGEBNISSE ..................................................................................................................... 50

4.1 ALLGEMEINE PATIENTENCHARAKTERISTIKA .................................................................. 50

4.2 KLINISCHE STADIENEINTEILUNG..................................................................................... 51

4.3 IMMUNPHÄNOTYPISIERUNG............................................................................................. 52

4.4 KALZIUMPLASMASPIEGEL ............................................................................................... 52

4.5 CHEMOTHERAPIE............................................................................................................. 53

4.5.1 Initiale Chemotherapie............................................................................................ 53

4.5.2 Zweite Chemotherapie............................................................................................. 55

4.6 REAL-TIME RT-QPCR..................................................................................................... 56

4.6.1 Sensitivität der qPCR .............................................................................................. 56

4.6.2 MDR1-Genexpression ............................................................................................. 57

4.6.3 MRP1- und MRP2-Genexpression .......................................................................... 67

4.7 RT-PCR ZUM NACHWEIS VON SURVIVIN MRNA............................................................ 76

4.8 IMMUNHISTOCHEMISCHE UNTERSUCHUNG DER P-GLYKOPROTEINEXPRESSION.............. 77

5 DISKUSSION ...................................................................................................................... 79

6 ZUSAMMENFASSUNG .................................................................................................... 88

7 SUMMARY.......................................................................................................................... 90

8 LITERATURVERZEICHNIS ........................................................................................... 92

9 ANHANG ........................................................................................................................... 126

9.1 RASSE UND ALTER DER AN LYMPHOM ERKRANKTEN HUNDE........................................ 126

9.2 REZEPTUREN DER VERWENDETEN LÖSUNGEN UND GELE.............................................. 128

9.3 VERWENDETE FORMELN UND GLEICHUNGEN................................................................ 129

9.4 ERGEBNISSE DER RT-QPCR-MESSDURCHGÄNGE ......................................................... 130

7

Abkürzungsverzeichnis

® ...................................................eingetragenes Warenzeichen

A ...................................................Adenin

ADM .............................................Doxorubicin

AP .................................................Antisense-Primer

Art.-Nr. .........................................Artikelnummer

bp ..................................................Basenpaare

C ...................................................Cytosin

ca ..................................................kanine

CD ................................................cluster of differentiation

cDNA ...........................................komplementäre DNA

CR .................................................komplette Remission

Ct ..................................................cycle threshold

CTX ..............................................Cyclophosphamid

CV ................................................Variationskoeffizient

DAB .............................................3,3 Diaminobenzidin

DEPC ............................................Diethylpyrocarbonat

dest. ..............................................destilliert

DNA .............................................Deoxyribonukleinsäure

DNase ...........................................Deoxyribonuclease

dNTP ............................................Desoxynucleotidtriphosphat

dR .................................................Grundlinien korrigierte Fluoreszenz

dRn ...............................................Grundlinien korrigierte normalisierte Fluoreszenz

dt.....................................................deutscher

DTT ..............................................Dithiothreitol

Fa. .................................................Firma

FAM .............................................6-Carboxy-Fluorescein

FITC .............................................Fluoreszeinisothiocyanat

FNA ..............................................Feinnadelaspirat

g ....................................................Gravitationsbeschleunigung (9,81 m/sec²)

8

G ...................................................Guanin

GSH ..............................................Gluthation

h ....................................................Stunde

HPRT ............................................Hypoxanthinphosphoribosyltransferase

i.v. ................................................. intravenös

kDa ...............................................Kilodalton

kg ..................................................Kilogramm

KGW ............................................Körpergewicht

KOF ..............................................Körperoberfläche

kum. ..............................................kumulativ

L-Asp ............................................L-Asparaginase

LCS ................................................Lymphonodus cerficalis superficialis dexter

LCSS ............................................Lymphonodus cerficalis superficialis sinister

LJ ..................................................Lymphonodus jejunalis

LMD .............................................Lymphonodus mandibularis dexter

LMS ..............................................Lymphonodus mandibularis sinister

LPD ..............................................Lymphonodus popliteus dexter

LPS ...............................................Lymphonodus popliteus sinister

MDR .............................................multidrug resistance

mg .................................................Milligramm

MGB .............................................minor groove binder

MRP .............................................Multidrug Resistance Associated Protein

MTX .............................................Methotrexat

MW ...............................................arithmetischer Mittelwert

n ....................................................Anzahl an Tieren / Proben

Nr. .................................................Nummer

OD ................................................optische Dichte

p ....................................................Irrtumswahscheinlichkeit

PBS ...............................................Phosphat gepufferte Kochsalzlösung

PCR ..............................................Polymerase-Kettenreaktion

PE .................................................Phycoerythrin

9

PerCP ............................................Peridin-Clorophyll-a-Prpteinkomplex

PR .................................................partielle Remission

Pred ...............................................Prednisolon

qPCR ............................................quantitative Polymerasekettenreaktion

R ...................................................Korrelationskoeffizient nach Pearson

Real-time RT-qPCR .....................Real-time Reverse Transcription- quantitative PCR

RFI ................................................rezidivfreies intervall

RNA .............................................Ribonukleinsäure

RNase ...........................................Ribonuclease

ROX .............................................6-Caboxy-X-Rhodamin

RT .................................................Reverse Transkription

s.c. .................................................subkutan

SD...................................................Standardabweichung

SP .................................................Sense-Primer

T ...................................................Thymin

tägl. ............................................... täglich

TAMRA .......................................6-Carboxy-tetramethylrhodamin

Tm .................................................Schmelzpunkt

™ ..................................................Warenzeichen

u ....................................................units

VCR ..............................................Vincristin

WHO ............................................Weltgesundheitsorganisation

11

1 EINLEITUNG

Die Chemotherapie ist ein wichtiger Bestandteil der Tumortherapie beim Kleintier. Sie wird

mit dem Ziel der Heilung (z.B. beim Stiker-Sarkom des Hundes (CALVERT et al. 1982)), zur

Verbesserung der Lebensqualität und Verlängerung des Überlebens (z.B. bei multiplen

Myelomen, Mastozytomen oder Lymphomen (MATUS et al. 1986; MCCAW et al. 1997;

LINK u. HIRSCHBERGER 1999; THAMM et al. 1999)) sowie im Anschluss an eine

chirurgische Tumortherapie zur Vernichtung okkulter Mikrometastasen und Verbesserung der

lokalen Tumorkontrolle (z.B. bei Hunden mit Osteosarkomen (STRAW et al. 1991))

durchgeführt.

Die Wirksamkeit der Chemotherapie wird häufig durch Resistenzen der Tumoren gegen die

verfügbaren Zytostatika begrenzt (STEWART u. GORMAN 1991; BERGMAN u. OGILVIE

1995). Grundsätzlich wird in der Onkologie zwischen intrinsischen und erworbenen

Zytostatikaresistenzen unterschieden. Tumoren mit intrinsischer Resistenz sind von

vornherein chemotherapeutisch nicht beeinflussbar. Als Beispiele hierfür werden beim

Kleintier hepatozelluläre und gastrointestinale Karzinome genannt (STEWART u. GORMAN

1991). Tumoren mit erworbener Zytostatikaresistenz reagieren dagegen zunächst auf eine

Chemotherapie mit einer Regression. Nach einer gewissen Zeitspanne entwickelt sich jedoch

unter der Chemotherapie eine Resistenz gegen die eingesetzten Zytostatika. Es kommt zur

Ausbildung eines Rezidivs, und die Tumorzellen werden therapierefraktär (LEHNERT 1996).

Diese erworbene Zytostatikaresistenz treten beim Kleintier vor allem in der Therapie von

lymphoproliferativen Neoplasien auf (MADEWELL 1999).

Eine gleichzeitige Resistenz von Tumorzellen gegen verschiedene, strukturell

unterschiedliche Chemotherapeutika wird als Vielfachresistenz oder multidrug resistance

(MDR) bezeichnet (BIEDLER u. RIEHM, 1970; DANO 1973). In vitro können

Vielfachresistenzen durch eine intermittierende oder langanhaltende Exposition von

Tumorzellen mit nur einem Zytostatikum induziert werden (TURKER et al. 1991).

Häufig geht eine MDR mit der Überexpression bestimmter Zellmembranproteine, wie zum

Beispiel des sogenannten P-Glykoproteins, und einer herabgesetzten Akkumulation der

Zytostatika in der Zelle einher (KARTNER et al. 1983). Beim individuellen Patienten können

jedoch auch Veränderungen der Pharmakokinetik (Absorption, Verteilung, Metabolisierung

12

und Elimination) der eingesetzten Zytostatika den Behandlungserfolg beeinträchtigen

(BERGMAN u. OGILVIE 1995).

Das maligne Lymphom zählt zu den beim Kleintier am häufigsten chemotherapeutisch

behandelten Tumoren. Die überwiegende Mehrheit der an malignem Lymphom erkrankten

Hunde entwickelt im Therapieverlauf eine Vielfachresistenz (MADEWELL 1998). In ersten

Studien wurde bereits ein Zusammenhang zwischen der Expression von P-Glykoprotein und

der Überlebenszeit bei an malignem Lymphom erkrankten Hunden beschrieben (BERGMAN

et al. 1996; Lee et al. 1996). Seit langem ist bekannt, dass neben der Expression von

P-Glykoprotein zahlreiche weitere Mechanismen, wie z.B. die Expression von Mitgliedern

der Familie der multidrug resistance-associated proteins (MRPs) oder Inhibitoren der

Apoptose zur Ausprägung von Vielfachresistenzen in vitro führen können.

Im Gegensatz zu vielfachresistenten Zelllinien exprimieren in vivo viele Tumoren die eine

Vielfachresistenz vermittelnden Zellmembranproteine nur verhältnismäßig niedrig

(BROXTERMAN et al. 1996). Als sehr sensitives Verfahren zum Nachweis einer Expression

von P-Glykoprotein und Mitgliedern der Familie der MRPs auf Nukleinsäureebene wird die

Reverse Transkription-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) angesehen (MURPHY et al.

1990).

Ziel der vorliegenden Studie war es, eine RT-PCR zu entwickeln, mit der P-Glykoprotein,

MRP1, MRP2 und Survivin auf Nukleinsäureebene beim Hund sicher quantifiziert werden

können, mit diesem Verfahren die Expression der Gene in malignen Lymphomen zu

bestimmen sowie den Zusammenhang zwischen der Höhe der jeweiligen Genexpression und

der chemotherapeutischen Beeinflussbarkeit in vivo zu untersuchen.

13

2 LITERATURÜBERSICHT

2.1 Malignes Lymphom des Hundes

Maligne Lymphome sind Tumoren des lymphoretikulären Gewebes und verlaufen fast immer

systemisch (ETTINGER 2003). Häufig nehmen sie ihren Ursprung im Lymphknoten, seltener

in extranodalen lymphoretikulären Geweben (FAN 2003).

Entsprechend der anatomischen Lokalisation des Lymphoms werden multizentrische (etwa

80% der Fälle beim Hund), gastrointestinale, mediastinale, kutane und sogenannte „sonstige“

Formen unterschieden (OWEN 1980; CROW 1987).

Die Ätiologie ist unbekannt (MADEWELL 1999). In verschiedenen Studien wurde ein

Zusammenhang zwischen der Entstehung von Lymphomen beim Hund und einer Infektion

mit Retroviren (TOMLEY et al. 1983), Herbizid- (HAYES et al. 1991) oder

Magnetfeldexposition (REIF et al. 1995), dem Leben in Industriegebieten (GAVAZZA et al.

2001), Chromosomenaberrationen (HAHN et al. 1994) sowie einer Störung des

Immunsystems (WEIDEN et al. 1974; OWEN et al. 1975) vermutet. Jedoch konnte keine der

Hypothesen bisher ausreichend bewiesen werden.

Unterbleibt eine adäquate Therapie, ist die Prognose schlecht, die Patienten versterben

durchschnittlich vier bis sechs Wochen nach Diagnosestellung (MACEWEN et al. 1981).

Durch hochdosierte Kortikosteroidgaben kann zwar bei etwa 50 % der Patienten ein

Tumorrückgang erreicht werden, jedoch rezidivieren die Tumoren zum Großteil innerhalb

von 4 bis 8 Wochen (SQUIRE et al. 1973; CROW 1982). Die Therapie der Wahl bei Hunden

mit Lymphomen ist heute im allgemeinen die Chemotherapie (ROSENTHAL 1996).

Chemotherapie

Bei an malignem Lymphom erkrankten Hunden wird die Chemotherapie in erster Linie

palliativ zur Verbesserung der Lebensqualität und Verlängerung der Überlebenszeit eingesetzt

(CROW 1987; ETTINGER 2003).

Die Zahl der in den letzten 30 Jahren eingesetzten Therapieprotokolle ist relativ beträchtlich

(Tabelle 1). Neben der Monochemotherapie mit Doxorubicin haben sich vor allem

Kombinationschemotherapien bewährt (ROSENTHAL 1996).

14

Tabelle 1: Ergebnisse einiger in den letzten Jahrzehnten durchgeführten Studien zur Wirksamkeit verschiedener Chemotherapieprotokolle bei an malignem Lymphom erkrankten Hunden

Substanzen (Kurzname) n CR PR Remissionsdauer (Median) Ref.

ASP, CTX, VCR, MTX 59 90% 7% 132 Tage bei CR 1

77 75% 14% 180 Tage bei CR 2 CTX, VCR, Pred (COP)

20 70% 100 Tage bei CR 3

21 76% 206 Tage bei CR 3 DOX

37 59% 22% 151 Tage bei CR 4

VCR, CTX, DOX, Pred (COPA) 45 84% 7% 210 Tage bei CR 5

41 76% 12% 330 Tage bei CR 5

112 73% 25% 238 Tage bei CR 6 ASP, VCR, CTX, Dox, Pred (ACOPA)

34 94% - 214 Tage bei CR 7

ASP, VCR, CTX, CBL, DOX, MTX, Pred (Madison-Wisconsin)

55 84% 7% 252 Tage 8

Abkürzungen und Fußnoten ASP: L-Asparaginase 1 MACEWEN et al. 1981 DOX: Doxorubicin 2 COTTER 1983 CBL: Chlorambucil 3 CARTER et al. 1987 CR: komplette Remission 4 POSTORINO et al. 1989 CTX: Cyclophosphamid 5 STONE et al.1991 MTX: Methotrexat 6 GREENLEE et al. 1990 n: Patientenanzahl 7 MACEWEN et al. 1992 PR: partielle Remission 8 KELLER et al. 1993 Pred: Prednison Ref.: Referenzen VCR: Vincristin

15

Je nach verwendetem Chemotherapieprotokoll kann bei bis zu 90% der behandelten Patienten

ein Rückgang des Tumors erreicht werden (MACEWEN et al 1981; KELLER et al. 1993;

VALERIUS et al. 1997). Heilungen sind jedoch sehr selten (MADEWELL 1999).

Die Hälfte der Patienten entwickelt innerhalb der ersten sieben bis neun Monate nach

Therapiebeginn ein Tumorrezidiv (Tabelle 1). Bei einem Teil der Patienten, die ein Rezidiv

entwickeln, kann durch eine Wiederholung der Chemotherapie der Tumor zurückgedrängt

und eine erneute Remission induziert werden. Die Dauer der zweiten Remission ist zumeist

jedoch deutlich kürzer als die Dauer der ersten Remission. Die Lymphome werden

zunehmend gegen die eingesetzten Zytostatika resistent (ETTINGER 2003).

Durch Verwendung von Zytostatika, die nicht Bestandteil der ursprünglichen Chemotherapie

waren (sogenannte Rettungsprotokolle), können bestehende Zytostatikaresistenzen teilweise

umgangen werden (MADEWELL 1999). Bei fast allen bisher erprobten Rettungsprotokollen

liegen die Remissionsraten jedoch unter 50% (26-65%) und die mittlere Remissionsdauer

unter vier Monaten (61 bis 126 Tage) (VANVECHTEN et al. 1990; MOORE et al. 1994;

LUCROY et al. 1998; MOORE et al. 1999; RASSNICK et al. 2002).

Letztendlich entsteht bei fast allen Patienten nach einer unterschiedlichen Anzahl an

Remissionen eine Vielfachresistenz (multidrug resistance) des Tumors und die Patienten

versterben infolge der Lymhomerkrankung (VANVECHTEN et al. 1990). Die 1-Jahres- und

2-Jahres-Überlebensraten liegen bei Hunden mit multizentrischen Lymphomen in der Regel

unter 45% bzw. 25% (ETTINGER 2003).

Die zellulären Mechanismen, die zur Ausprägung einer multidrug resistance (MDR) in vitro

führen, sind zahlreich. Häufig geht eine MDR mit der Überexpression bestimmter

Zellmembranproteine und einer herabgesetzten Akkumulation der Zytostatika in der Zelle

einher (KARTNER et al. 1983). Zu den Zellmembranproteinen, die eine MDR vermitteln,

zählen u.a. das P-Glykoprotein und Mitglieder der Familie der Multidrug resistance-

associated proteins (MRPs). Aufgrund der großen Bedeutung der MDR für den Erfolg

chemotherapeutischer Behandlung wurden diese Proteine nach ihrer Erstbeschreibung in

zahlreichen Studien untersucht (RAPPA et al. 1999).

16

2.2 P-Glykoprotein

Der bisher am weitesten erforschte Mechanismus, der zur Ausprägung einer MDR führen

kann, ist die Expression eines 170 kDa schweren Zellmembranproteins, des sogenannten

P-Glykoproteins (KARTNER et al. 1983; UEDA et al. 1987b; SIKIC 1997). Das

P-Glykoprotein wurde erstmals 1976 von Victor Ling und Mitarbeitern in Colchicin-

resistenten Ovarzelllinien von Hamstern beschrieben (JULIANO u. LING 1976). Es gehört

zur Familie der ABC (adenosine triphosphate (ATP)-binding cassette) Transporterproteine

und ist eine ATP-abhängige Efflux-Pumpe, welche die Substratmoleküle aus dem Zytoplasma

hinauspumpt und sie damit wirkungslos macht (OBST 2000; DEAN et al. 2001). Substrate für

das P-Glykoprotein sind zahlreiche Substanzen, darunter verschiedene hydrophobe

Zytostatika (Tabelle 2).

Tabelle 2: Zytostatika, die beim Menschen durch das P-Glykoprotein transportiert werden (modifiziert nach GOLDSTEIN 1996)

Anthracycline Taxane Doxorubicin Docetaxel Daunomycin Sonstige

Vinkaalkaloide Actinomycin-D Vincristin Mitoxantron Vinblastin

Epiphylotoxine Etoposide

Bei Säugetieren wird das P-Glykoprotein von einer kleinen Gen-Familie kodiert (RIORDAN

et al. 1985). Bisher sind beim Menschen zwei, beim Hamster, bei der Maus und Ratte drei

und beim Schwein fünf Isoformen des P-Glycoproteins beschrieben worden (DG et al. 1989;

DEUCHARS et al. 1992; CHILDS u. LING 1996; DEAN et al. 2001). Die mit der

Ausbildung der MDR in Zusammenhang stehende Isoform des P-Glykoproteins wird beim

Menschen vom MDR1-Gen kodiert (GROS et al. 1986; UEDA et al. 1987a). Bei Hund und

17

Katze wurde das MDR1-Gen mittlerweile ebenfalls sequenziert (STEINGOLD et al. 1998;

OKAI et al. 2000). Die Sequenzhomologie zum MDR1-Gen des Menschen beträgt beim Hund

93% (STEINGOLD et al. 1998). Über weitere Isoformen des P-Glykoproteins ist bei diesen

Tierarten, soweit aus der Literatur ersichtlich, bisher nichts bekannt.

Physiologische Funktion

Das P-Glykoprotein wird beim Menschein und Hund vor allem in der Leber

(Gallengangskanäle), in den Nebennierenrinden, im Pankreas und Kolon, in den Nieren

(proximale Tubulusepithelien) und im Gehirn (Kapillarendothelien) exprimiert (FOJO et al.

1987; GINN 1996).

Es wird vermutet, dass das P-Glykoprotein sowohl am Transport exogener als auch endogener

Metaboliten, wie zum Beispiel Cortisol, in verschiedenen Geweben beteiligt ist (WOLF u.

HURVITZ 1992; VAN KALKEN et al. 1993; FISHER et al. 1996; LEONARD et al. 2003).

Eine Bedeutung des P-Glykoproteins für die Funktion der Blut-Hirnschranke konnte anhand

von mdr1a/1b (-/-) Knockout-Mäusen nachgewiesen werden (SCHINKEL et al. 1997). Die

Mäuse waren vital und fertil, wiesen jedoch eine erhöhte Sensitivität gegen das neurotoxische

Pharmakon Ivermectin sowie gegen Vinblastin auf (SCHINKEL et al. 1994).

Ähnliche neurologische Nebenwirkungen wie bei mdr1a/1b (-/-) Knockout-Mäusen treten

nach Gabe von Ivermectin bei etwa 1/3 der Hunde der Rasse Collie auf (PAUL et al. 1987).

In verschiedenen Studien konnte bei Collies mit einer Überempfindlichkeit gegen Ivermectin,

Loperamid oder Zytostatika eine Mutation des MDR1-Gens nachgewiesen werden (MEALY

et al. 2001; ROULET et al. 2003; MEALEY et al. 2003; SARTOR et al. 2004). Bei der

Mutation handelt es sich um eine 4 Basenpaare umfassende Deletion, die zur Verschiebung

des Leserasters und vorzeitigem Abbruch der Proteinsynthese führt (MEALY et al. 2001).

Der Anteil an Collies, bei denen beide Allele des MDR1-Gens mutiert sind, liegt in den USA

nach einer ersten Studie bei 36% (MEALEY et al. 2002).

Neben seiner Bedeutung für die Funktion der Blut-Hirn-Schranke konnte mittels Knockout-

Mäusen auch eine Beteiligung des P-Glykoproteins an der Absorption und Elimination

verschiedener Medikamente sowie beim Schutz vom Knochenmark gegen zytotoxische

Chemotherapeutika aufgezeigt werden (SCHINKEL et al. 1997).

18

Modulation der Expression durch Zytostatika und Glukokortikoide

Nach dem derzeitigen Erkenntnisstand ist davon auszugehen, dass die Expression von P-

Glykoprotein und anteren Mitgliedern der ABC Transporterfamilie umfangreichen

Regulationsmechanismen unterliegt (SCOTTO 2003). Grundsätzlich kann die Genexpression

auf verschiedenen Ebenen (Transkrption, RNA posessing, Translation und Proteinaktivität)

reguliert werden (PASSARGE 2001).

Schon länger ist bekannt, dass verschiedene Steroidhormone Substrate für das P-Glykopotein

sind (UEDA et al. 1992). Auch synthetische Glukokortikoide, wie zum Beispiel Prednisolon

und Dexamethason, werden durch das P-Glykoprotein transportiert (UEDA et al. 1992,

KARSSEN et al. 2002). Sowohl in vitro als auch in vivo kann in verschiedenen Geweben

durch Dexamethason die Höhe der P-Glykoproteinexpression beeinflußt werden (ZHAO et al.

1993, DEMEULE et al. 1999). So führte die Gabe von Dexamethason bei Ratten zu einer

Erhöhung der P-Glykoproteinexpression in Leber und Lunge, aber einer Reduktion der

Erxpression in den Nieren (DEMEULE et al. 1999).

Auch durch eine Exposition mit Zytostatika kann die Transkription des MDR1-Gens in vitro

induzieren werden (SCOTTO 2003). Desweiteren wurde in Leukämiezellen eine MDR1-

Überexpression durch mRNA Stabilisierung und Translationsinduktion beschrieben (YAGUE

et al. 2003). SCOTTO (2003) vermutet daher die Existenz multipler, in verschiedenen

Zellarten vorkommender Mechanismen, welche die MDR1-Genexpression regulieren.

Klinische Relevanz bei Tumorerkrankungen

Eine Expression von P-Glykoprotein wurde beim Menschen und Hund in zahlreichen

Tumoren beschrieben (FOJO et al. 1987; GINN 1996). Insbesondere in Tumoren, die von

Ursprungsgewebe mit physiologisch hoher P-Glykoproteinexpression abstammen, wie z.B.

Lebertumoren, ist P-Glykoprotein relativ konstant nachweisbar (CHENIVESSE et al. 1993;

ITSUBO et al. 1994; GINN 1996). Bei anderen Tumoren lässt sich P-Glykoprotein

immunhistochemisch dagegen nur inkonstant darstellen. Beim Hund werden maligne

Lymphome (BERGMAN et al. 1996, GINN 1996, LEE et al. 1996), kutane Mastozytome

(MIYOSHI et al. 2002) und Harnblasenkarzinome (ROCHA et al. 2000) zu dieser Gruppe

gezählt.

19

Für zahlreiche Tumoren des Menschen, wie z.B. myeloische Leukämien oder Non-Hodgkin-

Lymphome, wurde eine klinische Relevanz der Expression von P-Glykoprotein nachgewiesen

(PILERI et al. 1991; YUEN u. SIKIC 1994; KANG 1995; SONNEVELD 2000). So kann eine

Expression von P-Glykoprotein in Tumoren mit einer herabgesetzten Anreicherung von

verschiedenen Zytostatika in der Zelle und einer erhöhten Chemotherapieresistenz

einhergehen (LING, 1989). In ersten Untersuchungen beim Hund konnte ebenfalls ein

Zusammenhang zwischen der Expression von P-Glykoprotein im Tumorgewebe und dem

Erfolg einer chemotherapeutischen Behandlung aufgezeigt werden (BERGMAN et al. 1996;

LEE et al. 1996).

Therapeutische Beeinflussbarkeit

Seit über 20 Jahren ist bekannt, dass die Transportfunktion des P-Glykoproteins in vitro durch

verschiedene Substanzen, darunter viele zugelassene Arzneimittel, nicht-selektiv gehemmt

wird (ECKER u. CHIBA 1995). Zu diesen als P-Glykoproteinantagonisten der 1. Generation

bezeichneten Substanzen zählen u.a. Verapamil, Ciclosporine und Steroide (TSURO et al.

1981; YANG et al. 1989; TWENTYMAN 1992). Zur Umgehung bestehender

Vielfachresistenzen in vivo erwiesen sich die P-Glykoproteinantagonisten der 1. Generation

jedoch als wenig geeignet. So liegt die zur Modulation der P-Glykoproteinfunktion

erforderliche Plasmakonzentration dieser Substanzen häufig über ihrer therapeutischen Breite

(FISHER 1996; SIKIC 1997; COVELLI 1999).

Beim Hund wurde in einer Phase-I Studie die Wirksamkeit von Tamoxifen, einem

Antiöstrogen, zur Hemmung der P-Glykoproteinfunktion geprüft (WADDLE et al. 1999).

Plasmakonzentrationen von Tamoxifen, die in vitro zu einer Hemmung der

P-Glykoproteinfunktion führen, konnten in der Studie nur bei einer hochdosierten

Tamoxifengabe (600 mg/m²) erreicht werden (WADDLE et al. 1999). Bei einer kombinierten

Gabe von Tamoxifen (600 mg/m², zweimal täglich per os) und Doxorubicin (1,25 mg/kg i.v.)

traten bei Hunden mit verschiedenen Tumoren jedoch bei etwa 50% gastrointestinale

Nebenwirkungen auf (WADDLE et al. 1999). In früheren Studien beschriebene

östrogenähnliche Nebenwirkungen von Tamoxifen (MORRIS et al. 1993) wurden in der

Studie von Waddle und Mitarbeiter (WADDLE et al. 1999) nicht beobachtet.

20

Im Gegensatz zu den P-Glykoproteinantagonisten der 1. Generation wurden die Antagonisten

der 2. Generation, wie z.B. Valspodar (PSC 833), gezielt zur Umgehung von

Vielfachresistenzen entwickelt (BOESCHE et al. 1991; LEONARD u. BATES 2003). Es hat

sich jedoch gezeigt, dass Valspodar und andere P-Glykoproteinantagonisten der 2. Generation

nicht nur die Transportfunktion von P-Glykoprotein sondern auch den Cytochrom P450 3A4

vermittelten Metabolismus vieler Zytostatika hemmen (WANDEL et al. 1999). Aufgrund der

verzögerten Elimination der Zytostatika ist bei Gabe von P-Glykoproteinantgonisten der 2.

Generation daher zumeist eine Reduktion der Zytostatikadosis zur Vermeidung schwerer

Nebenwirkung erforderlich (DORR et al. 2001).

Im Gegenstaz zu den Antagonisten der 2. Generation hemmen die Antagonisten der 3.

Generation das Cytochrom P450 3A4-Isoenzym nicht (DANTZIG et al. 1999). Zu den P-

Glykoproteinantagonisten der 3. Generation zählen Tariquidar und Laniquidar. Sie werden

derzeit beim Menschen klinisch erprobt (THOMAS u. COLEY 2003).

Weitere sich in Prüfung befindliche Therapieansätze beruhen auf der nicht kompetitiven

Hemmung der P-Glykoproteinfunktion durch monoklonale Antikörper oder der Beeinflussung

der MDR1-Genexpression mittels Antisense-MDR1-Oligonukleotiden (WAGNER 1995;

ALAHARI et al. 1996; BOUFFORD et al. 1996).

Gentherapie

Auch für die Gentherapie ist das P-Glykoprotein bzw. das MDR1-Gen von Interesse

(SORRENTINO et al. 1995; LICHT et al. 2000). Eine Therapiestrategie ist es Zytostatika-

sensitives Gewebe, wie das Knochenmark, durch Gentranfer vor den toxischen Effekten einer

Chemotherapie zu schützen und somit die Verträglichkeit der Chemotherapie zu verbessern

bzw. die Gabe höherer Zytostatikadosen zu ermöglichen (SORRENTINO et al. 1995).

21

2.3 Multidrug resistance-associated protein (MRP)

In den Jahren nach der Entdeckung des P-Glykoproteins wurden von verschiedenen

Arbeitsgruppen vielfachresistente Zelllinien, bei denen P-Glykoprotein nicht nachweisbar

war, beschrieben. Auf der Suche nach weiteren Mechanismen, die zur Ausprägung einer

MDR führen können, entdeckten Cole und Mitarbeiter 1992 in einer Lungenzelllinie

(H69AR) ein weiteres Membrantransporterprotein, das eine Vielfachresistenz gegen

Zytostatika vermitteln kann (COLE et al. 1992). Es wurde als multidrug resistance-associated

protein (MRP) bezeichnet. Wie das P-Glykoprotein gehört das MRP zur Familie der ABC

Transporterproteine und fungiert als Efflux-Pumpe (COLE et al. 1992; ZAMAN et al. 1994,

DEAN et al. 2001). Mittlerweile sind beim Menschen sieben (MRP1 bis MRP7) und beim

Hund zwei (MRP-1 und MRP-2) Isoformen des MRP beschrieben worden (BORST et al.

2000; CONRAD et al. 2001).

2.3.1 MRP1

Das MRP1 ist ein 190-kDa schweres Zellmembranprotein (KRISHNAMACHARY u.

CENTER 1993). Es wurde erstmals 1992 in vielfachresistenten Lungenzelllinien beschrieben

(COLE et al. 1992). Später durchgeführte Transfektionsexperimente belegten, dass eine

Überexpression des MRP1 beim Menschen in vitro u.a. eine Resistenz gegen Vincristin,

Doxorubicin, Etoposid und Methotrexat vermitteln kann (COLE et al. 1994; GRANT et al.

1994; HOOIJBERG et al. 1999).

Das kanine MRP1-Gen wurde erstmals 2001 sequenziert (CONRAD et al. 2001). Bisher

konnte in vitro eine durch canine MRP-1 vermittelte MDR gegen Vincristine und Etoposide,

aber im Gegensatz zum Menschen nicht gegen Doxorubicin nachgewiesen werden (MA et al.

2002).

Auch wenn das MRP1 und das P-Glykoprotein zum größten Teil Resistenzen gegen dieselben

Zytostatikaklassen vermitteln, unterscheiden sie sich in ihrer Substratspezifität (LOE et al.

1996). Studien belegen, dass durch das MRP1 vor allem Konjugate lipophiler Substanzen mit

Gluthation (GSH), Glukuronsäure- und Schwefelsäure transportiert werden (JEDLITSCHKY

et al. 1994, LEIER et al. 1994; MÜLLER et al. 1994; ZAMAN et al. 1995; JEDLITSCHKY

22

et al. 1996). Einige nicht konjugierte hydrophobische Substanzen, wie z.B. Vincristin oder

Daunorubicin, scheinen ebenfalls, jedoch nur in Anwesenheit von reduziertem GSH, durch

das MRP1 transportiert werden zu können (ZAMAN et al. 1995; RENES et al. 1999).

Beim Menschen und Hund wird MRP1 in zahlreichen Organen und Geweben exprimiert

(FLENS et al. 1996; HIPFNER et al. 1999; CONRAD et al. 2001). Die höchsten

mRNA-Gehalte werden beim Menschen in der Skelettmuskulatur, dem Herz, den Nieren, der

Lunge und den Hoden nachgewiesen.

Studien haben gezeigt, dass verschiedene endogene Substanzen, wie z.B. Leukotrin C4, und

Metabolite exogener Substanzen, wie z.B. Aflatoxin B1, durch das MRP1 transportiert werden

(JEDLITSCHKY et al. 1994; LEIER et al. 1994; LOE et al. 1996; JEDLITSCHKY et al.

1996; LOE et al. 1997). Zusätzlich zu der Transporterfunktion wird eine Beteiligung des

MRP1 an der Regulation verschiedener Ionenkanäle vermutet (LOE et al. 1999). Eine

Einschränkung der Vitalität und Fertilität bestand bei mrp(-/-) Knockout-Mäusen, ähnlich

wie bei mdr1a/1b (-/-) Knockout-Mäusen, nicht (RAPPA et al. 1999).

Zwar wurde MRP1 beim Menschen in zahlreichen Tumoren nachgewiesen (FLENS et al.

1996), die klinische Relevanz der Expression ist jedoch noch relativ unbekannt (BORST et al.

2000) Ein Zusammenhang zwischen der Expression und dem Erfolg chemotherapeutischer

Behandlung wurde u.a. bei Patienten mit Retinoblastom aufgezeigt. So wiesen

Retinoblastome, die trotz der Gabe von Ciclosporin zum Zwecke der Umgehung einer

P-Glykoprotein induzierten MDR nicht auf eine Chemotherapie reagierten, eine Expression

von MRP1 auf (CHAN et al. 1997).

2.3.2 MRP2

MRP2 wurde aufgrund seiner Funktion als Transporter organischer Anionen in der

kanikulären Membran von Hepatozyten ursprünglich als canicular multispecific anion

transporter (cMOAT) bezeichnet. 1996 gelang es Paulusma und Mitarbeiter zu zeigen , dass

das cMOAT der Ratte dem humanen MRP1 entspricht (PAULUSMA et al. 1996).

Das MRP2 wird beim Menschen und anderen Spezies vor allem in der Leber, in der Niere

und im Darm exprimiert (PAULUSMA et al. 1996; BORST et al. 2000). Seine Lokalisation

in der Zelle ist apikal (KÖNIG et al. 1999).

23

Als wichtigste physiologische Funktion des MRP2 wird die hepatobiliäre Exkretion von

verschiedenen organischen Anionen angesehen. So führt bei Ratten eine Mutation des

MRP2-Gens (TR- Ratten) zu einem Defekt der hepatobiliären Exkretion verschiedener

organischer Anionen und dem klinischen Bild einer chronischen Hyperbilirubinämie

(PAULUSMA et al. 1996). In den Nieren ist MRP2 vermutlich an der Exkretion organischer

Anionen in den Harn beteiligt (KÖNIG et al. 1999). Im Darm wird aufgrund von

Untersuchungen an Ratten eine Rolle des MRP2 bei der Sekretion von Glutathionkonjugaten

vermutet (GOTOH et al. 2000).

Die Bedeutung des MRP2 in der Vermittlung von Zytostatikaresistenzen ist noch relativ

unbekannt. In Transfektionsexperimenten konnte nachgewiesen werden, dass MRP2 in

Zellkulturen eine Resistenz gegen Methrotrexat, Etoposid, Vincristin, Cisplatin, Doxorubicin

und Epirubicin vermitteln kann (CUI et al. 1999, HOOIJBERG et al. 1999). In einer weiteren

Studie wiesen Taniguchi und Mitarbeiter in drei Cisplatin-resistenten Tumorzellinien eine

vier- bis sechsfach erhöhte Expression des MRP2-Gens nach (TANIGUCHI et al. 1996).

Beim Menschen wurde eine Expression von MRP2 in Nierenkarzinomen, Lungen-, Kolon-,

Rektum- und Magentumoren sowie hepatozellulären Karzinomen beschrieben (SCHAUB et

al. 1997; NARASAKI et al. 1997). Die klinische Relevanz der Expression ist jedoch unklar.

Beim Hund wurde das MRP2-Gen im Jahre 2001 sequenziert (CONRAD et al. 2001). Die

Sequenzhomologie zum Menschen beträgt 83%. Über die Expression von MRP2 in kaninen

Tumoren ist, soweit aus der Literatur ersichtlich, nichts bekannt.

2.4 Apoptose und Zytostatikaresistenzen

Als Apoptose wird ein genetisch programmierter, geregelter physiologischer Zelluntergang

bezeichnet (HOCKENBERRY 1995). Eine Apoptose kann sowohl durch physiologische

Stimuli, exogene Insulte (z.B. DNA-Schädigung durch γ-Strahlen) als auch durch Entzug von

Vitalitätsfaktoren ausgelöst werden (REED 1997).

Viele derzeit in der Tumortherapie gängigen Zytostatika lösen durch ihre zellschädigende

Wirkung eine Determination der Apoptose aus (REED 1997). Eine herabgesetzte Fähigkeit

der Zellen zur Apoptose kann somit die Empfindlichkeit gegenüber Zytostatika einschränken

und zur Ausprägung von Zytostatikaresistenzen führen. Über die Bedeutung der Apoptose für

die chemotherapeutische Beeinflussbarkeit von Lymphomen beim Hund ist wenig bekannt. In

24

einer 2000 veröffentlichten Studie wiesen Hunde mit einer relativ niedrigen Apoptoserate im

Tumor ein etwas längeres rezidivfreies Intervall (Median 202 Tage) auf als die restlichen

Patienten (Median 162 Tage). Der Unterschied war jedoch statistisch nicht signifikant.

(PHILIPS et al. 2000).

An der Regulation der Apoptose sind verschiedene Gene und Genprodukte beteiligt (REED

1997). Das sogenannte BCL-2-Genprodukt war der erste in Säugetierzellen nachgewiesene

Apoptoseinhibitor (TSUJIMOTO et al. 1985) und ist Namensgeber einer Familie strukturell

verwandter Proteine, die neben Inhibitoren der Apoptose auch pro-apoptotisch wirkende

Proteine beinhalteten (REED 1997). Ein weiteres Mitglied der BCL-2 Familie, das

sogenannte BCL-XL Gen, wurde kürzlich beim Hund kloniert und sequenziert (SANO et al.

2003). Das BCL-XL Protein ist wie das BCL-2-Genprodukt ein Apoptoseinhibitor.

Neben der BCL-2 Familie spielt auch das Tumorsuppressorgen P53 bei der Induktion der

Apoptose durch DNA schädigende Zytostatika eine Rolle (LOWE et al. 1994; HICKMAN

1996; MANFREDI 2003). Eine erste Studie beim Hund weist darauf hin, dass sowohl

germinative als auch somatische Mutationen des P53-Gens bei Hunden mit malignen

Lymphomen vorkommen (VELDHOEN et al. 1998).

Weitere bisher bekannte Inhibitoren der Apoptose gehören zur IAP (inhibitor of apoptosis)

Familie (LACASSE et al. 1998).

2.4.1 Survivin

1997 wurde von Ambrosini und Mitarbeitern beim Menschen ein bis dahin unbekanntes Anti-

Apoptosegen beschrieben (AMBROSINI et al. 1997). Das sogenannte Survivingen gehört zur

Familie der Apoptosenhibitoren (inhibitor of apoptosis, IAPs) und besteht aus drei Introns

und vier Exons, wobei das 3. Intron und das 4. Exon bei der Maus länger sind als beim

Menschen (AMBROSINI et al. 1997). Das zugehörige Protein ist 16,5 kDa schwer

(AMBROSINI et al. 1997).

Survivin wird als bifunktionales Protein angesehen, da es sowohl Apoptose unterdrückt als

auch bei der Regulierung der Zellteilung beteiligt ist (ALTIERI u. MARCHISIO 1999; REED

2001). Survivin bindet und hemmt die Caspase-3 und Caspase-7, welche Apoptose in Zellen

induzieren (TAMM et al. 1998). Es wird während der G2/M-Phase des Zell-Zyklus exprimiert

(LI et al. 1998). In Transfektionsexperimenten konnte gezeigt werden, dass Survivin sowohl

25

einer Apoptose durch Entzug von Vitalitätfaktoren als auch einer durch Fas (CD95), Bax,

Etoposid oder UVB-Strahlen induzierten Apoptose entgegenwirkt (AMBROSINI et al. 1997;

TAMM et al. 1998; GROSSMAN et al. 2001).

Survivin wird beim Menschen in den meisten Geweben nur während der Fetalphase

exprimiert. Beim erwachsenen Menschen konnte Survivin bisher nur in wenigen Geweben

(Thymus, Plazenta, Kolon) nachgewiesen werden (AMBROSINI et al. 1997).

Im Gegensatz zu unveränderten Geweben wurde eine Expression von Survivin beim

Menschen bereits in verschiedenen Tumoren nachgewiesen (ALTIERI u. MARCHISIO 1999)

(Tabelle 3). In menschlichen Nierenkarzinomzelllinien konnten zwei Splicevarianten

identifiziert werden. Der Isoform Survivin-∆Ex3 fehlt das Exon3, wohingegen die Isoform

Survivin-2B ein Stück des Intron 2 als kryptisches Exon enthält. Im Gegensatz zur

Spilcevarante Survivin-∆Ex3 ist bei der Isoform Survivin2B die antiapoptotische Wirkung

reduziert (MAHOTKA et al. 1999). Eine prognostische Relevanz der Expression von

Survivin wurde beim Menschen u.a. bei Übergangszellkarzinomen, hepatocellulären

Karzinomen und Lungentumoren beschrieben. (MONZO et al. 1999; SWANA et al. 1999;

IKEGUCHI et al. 2002).

Tabelle 3: Häufigkeit der Expression von Survivin in verschiedenen Tumoren beim Menschen (modifiziert und erweitert nach ALTIERI u. MARCHISIO 1999)

Tumor n Methode Survivin positiv Referenzen

Magenkarzinom 174 IHC 34% LU et al. 1998 Kolonkarzinom 171 IHC 53% KAWASAKI et al. 1998 Blasenkarzinom 36 IHC 78% SWANA et al. 1999 Neuroblastom 72 IHC / IB 47% ADIDA et al. 1999 B-Zell-Lymphom 222 IHC 60% ADIDA et al. 2000 Kolonkarzinom 20 IHC 100% GIANINI et al. 2001 Astrozytom 18 70% Glioblastom 20

RT-PCR 90%

KAJIWARA et al. 2003

Mammakarzinom 293 IHC 60% KENNEDY et al. 2003

Abkürzungen: IB: Immunoblot IHC: Immunhistochemie RT-PCR: Reverse Transkription- Polymerasekettenreakton

26

2.5 Weitere Mechanismen

Neben der Überexpression von P-Glykoprotein und Mitgliedern der MRP-Familie sind

weitere zelluläre Mechanismen beschrieben worden, die in vitro eine Zytostatikaresistenz

vermitteln können (TEW 1994; NITISS u. BECK 1996; LIST 1997 (Tabelle 4). Die

Bedeutung dieser Mechanismen für die Ausprägung von Zytostatikaresistenzen beim Hund ist

weitestgehend unbekannt.

Tabelle 4: Mechanismen, die zur Ausprägung von Zytostatikaresistenzen führen können (modifiziert nach DALTON 1997 und LIST 1997)

Membrantransportmechanismen

P-Glykoprotein

multidrug resistance-associated proteins (MRPs)

lung-resistance protein (LRP)

protein transporter of antigenic peptides (TAP)

DNA-Reparaturmechanismen

Hemmung der Apoptose

P53

BCL-2

Survivin

Alteration der Topoisomerasen

Topoisomerase I

Topoisomerase II

Metabolische Zytostatika-Detoxifikation

Glutathion-S-Transferase-System

27

3 TIERE, MATERIAL UND METHODEN

3.1 Tiere

An malignem Lymphom erkrankte Hunde

In die Studie wurden 50 an malignem Lymphom erkrankte Hunde (Tier-Nr. P1 bis P50) aus

dem Patientenkollektiv der Klinik für kleine Haustiere der Tierärztlichen Hochschule

Hannover aufgenommen. 11 Hunden war im Vorfeld der Studie durch den Haustierarzt eine

Behandlung mit Glukokortikoiden erfolgt (Tabelle 5). Keiner der Patienten hatte vor

Aufnahme in die Studie Zytostatika erhalten.

Tabelle 5: Mit Glukokortikoiden vorbehandelte Hunde. Tier-Nr., verabreichter Wirkstoff, Dosis und Behandlungsdauer

Tier-Nr. Wirkstoff Dosis Dauer

P04 Prednisolon unbekannt 2 Tage

P07 Prednisolon 0,5 mg/kg KGW jeden 2. Tag per os unbekannt

P10 Prednisolon 0,5 mg/kg KGW einmal tägl. per os 4 Tage

P16 unbekannt alle drei Tage parenteral 20 Tage

P27 Dexamethason unbekannt unbekannt


P29 Prednisolon unbekannt >7 Tage


P41 Prednisolon 0,05 mg/kg KGW einmal tägl. per os unbekannt

P44 unbekannt unbekannt unbekannt


28

Kontrolltiere

Als Kontrolltiere standen 9 etwa ein Jahr alte, gesunde Beagle aus dem Institut für

Parasitologie (Tier-Nr. K1 bis K9) sowie 10 zwischen 3 Monate und 9 Jahre alte an

verschiedenen Krankheiten leidende Hunde aus dem Patientenkollektiv der Klinik für kleine

Haustiere (Tier-Nr. K10 bis K19) zur Verfügung. (Tabelle 6). Keiner der Kontrolltiere wies

klinische oder anatomisch-pathologische Anzeichen einer Veränderung der Leber bzw. der

Lymphknoten auf. Alle Kontrolltiere wurden vor Aufnahme in die Studie aus einem nicht mit

der Studie im Zusammenhang stehenden Grund mit Pentobarbital euthanasiert.

Tabelle 6: Kontrolltiere aus dem Patientenkollektiv der Klinik für kleine Haustiere. Tier-Nr., Rasse, Alter, diagnostizierte Erkrankungen und verabreichte Medikamente

Tier-Nr. Rasse Alter Diagnosen Medikamente

K10 Neufundländer 4 Jahre Kardiomyopathie -

K11 Boxer 5 Monate Beckenfraktur Antibiotika

K12 Dt. Kurzhaar 8 Jahre Nasentumor Antibiotika

K13 Border Collie 9 Jahre Ösophagusdilatation Antibiotika

K14 Dt. Schäferhund 4 Jahre Darmdrehung Infusion

K15 Rauhaardackel 9 Jahre Mammatumor -

K16 Malteser 6 Jahre Perianalhernie Antibiotika, Caprofen

K17 Berner Sennenhund 4 Jahre Niereninsuffizienz Infusion, Furosemid

K18 Dt. Schäferhund 9 Jahre Analfissur -

K19 Bordeuxdogge 3 Monate Darminvagination Infusion

29

3.2 Diagnose und klinische Stadieneinteilung

Die Diagnose des malignen Lymphoms erfolgte bei 28 der Patienten zytologisch und bei

22 Hunden histopathologisch. Anhand der Befunde der röntgenologischen Untersuchung des

Thorax und Abdomens, Blutbildbestimmung, klinisch-chemischer Blutuntersuchung,

sonographischer Untersuchung des Abdomens und Knochenmarkuntersuchung wurden die

anatomische Form und der Ausbreitungsgrad der Erkrankung bestimmt.

Bei Hunden mit einem multizentrischen Lymphom wurde das klinische Erkrankungsstadium

entsprechend der TNM-Klassifikation der Weltgesundheitsorganisation (WHO) (OWEN,

1980) (Tabelle 7) beurteilt. Zusätzlich wurde bei allen Patienten das klinische Substadium

bestimmt. Dabei wurden Patienten mit einer Hyperkalzämie, Fieber, Hyphema, Uveitis,

gastrointestinalen und / oder respiratorischen Symptomen in Anlehnung an die Studie von

Moore und Koautoren (MOORE et al. 2001) dem klinischen Substadium b zugeordnet.

Tabelle 7: Klinische Stadieneinteilung beim malignen Lymphom des Hundes nach WHO (OWEN, 1980)

Stadium Definition

I Befall nur eines Lymphknotens oder Organs (mit Ausnahme des Knochenmarks)

II Befall zahlreicher Lymphknoten einer Körperregion (± Tonsillen)

III generalisierter Lymphknotenbefall

IV Befall von Milz und/oder Leber (± Stadium III)

V Befall von Blut und / oder Knochenmark und / oder anderen Organsystemen (± Stadium I-IV)

Substadium a ohne Allgemeinsymptome

Substadium b mit Allgemeinsymptomen

30

3.3 Chemotherapie

Eine Chemotherapie erfolgte bei 25 der an malignem Lymphom erkrankten Hunden. Initial

wurde bei allen Patienten eine Kurzzeit-Kombinationtherapie (Tabelle 8) durchgeführt. Von

den Hunden, die im Verlauf der Studie ein Tumorrezidiv entwickelten, wurden 7 erneut

chemotherapeutisch behandelt. 3 Patienten erhielten eine Kurzzeit-, 3 eine Langzeit-

Kombinationschemotherapie (Tabelle 9, Seite 31) und ein Hund Cytarabin und Carboplatin.

Tabelle 8: Kurzzeit-Kombinationstherapie der Spezialistengruppe für Onkologie der Fachgruppe für Kleintierkrankheiten (FK) der Deutschen Veterinärmedizinischen Gesellschaft (DVG)

Woche L-Asp1 VCR CTX2 ADM1, 3 Pred

1 X X X

2 X X

3 X X

4 X X

5 X X

6 X X

7 X X

8 X X

9 X X

10 X X

11 X X

12 X X

ADM: Doxorubicin; 30 mg/m² KOF, einmalig i.v. L-Asp: L-Asparaginase; 400 I.E./kg KGW, einmalig s.c. CTX: Cyclophosphamid; 200 mg/m² KOF, einmalig i.v. Pred: Prednisolon; 50 mg/m² KOF, einmal täglich per os über drei Tage VCR: Vincristin; 0,7 mg/m² KOF, einmalig i.v. 1 30 min vor der Injektion: Dexamethason 1mg/kg KGW i.v. 2 in Kombination mit Mesna (40% der Cyclophosphamid-Einzeldosis; 0, 4 und 8 h nach Gabe von Cyclophosphamid, einmalig per os) 3 bei Patienten mit Anzeichen einer dilatativen Kardiomyopathie oder bei Erreichen einer Doxorubicin-Gesamtdosis von 180 m² KOF alternativ Mitoxantron 6 mg/m² KOF, einmalig i.v.

31

Tabelle 9: Langzeit-Kombinationstherapie der Spezialistengruppe für Onkologie der Fachgruppe für Kleintierkrankheiten (FK) der Deutschen Veterinärmedizinischen Gesellschaft (DVG)

Woche L-Asp1 VCR CTX ADM1, 2 MTX Pred

Induktion

1 X X X

2 X X

3 X X

4 X

5 X

6 X

Erhaltung: Zyklus 1

8 X

10 X

12 X

14 X

Zyklus 2: Zyklus 1 bis Woche 52 wiederholen

Zyklus 3: Zyklus 1 im 3-Wochen-Abstand bis Woche 104 wiederholen

Zyklus 4: Zyklus 1 im 4-Wochen-Abstand bis Woche 130 wiederholen

ADM: Doxorubicin; 30 mg/m² KOF, einmalig i.v. L-Asp: L-Asparaginase; 400 I.E./kg KGW, einmalig s.c. CTX: Cyclophosphamid; 200 mg/m² KOF, einmalig i.v. Pred: Prednisolon; Woche 1: 30 mg/m² KOF, einmal täglich per os Woche 2: 20 mg/m² KOF, einmal täglich per os Woche 3: 10 mg/m² KOF, einmal täglich per os VCR: Vincristin; 0,7 mg/m² KOF, einmalig i.v. MTX Methotrexat: 0,7 mg/kg KGW i.v., maximale Gesamtdosis 25 mg 1 30 min vor der Injektion: Dexamethason 1mg / kg KGW i.v. 2 bei Patienten mit Anzeichen einer dilatativen Kardiomyopathie oder bei Erreichen einer Doxorubicin-Gesamtdosis von 180 mg/m² KOF alternativ Mitoxantron 6 mg/m² KOF, einmalig i.v.

32

3.3.1 Beurteilung des Therapieerfolges

Therapieantwort

Die Therapieantwort wurde als komplette Remission (CR), partielle Remission (PR) oder

keine Remission (stationäres Tumorverhalten oder Progression) beurteilt (Tabelle 10). Zur

Bewertung der Therapieantwort wurde bei Hunden mit einem multizentrischen Lymphom

eine Palpation der oberflächlichen Körperlymphknoten, bei Patienten mit einem

gastrointestinalen Lymphom zusätzlich eine sonographische Untersuchung des Abdomens

durchgeführt.

Tabelle 10: Schema und Kriterien zur Beurteilung der Therapieantwort (modifiziert nach WILMANNS 2001)

Therapieantwort Definition

Komplette Remission (CR) Vollständiger Rückgang aller Tumorzeichen. Bestätigung nach 3 Wochen erforderlich.

Partielle Remission (PR) Rückgang aller Tumorparameter um mindestens 50% der initialen Größe. Bestätigung nach 3 Wochen erforderlich.

Stationäres Tumorverhalten Tumorrückgang um weniger als 50 % oder Zunahme um weniger als 25 %. Keine neuen Tumormanifestationen.

Progression Tumorzunahme um über 25 % oder Auftreten neuer Tumormanifestationen.

Rezidivfreies Intervall (RFI) Bei Patienten mit einer kompletten oder partiellen Remission wurde das rezidivfreie Intervall

(RFI) als Zeitspanne zwischen dem Tag der ersten chemotherapeutischen Behandlung und der

Diagnose eines Tumorrezidivs bestimmt.

33

3.4 Entnahme und Lagerung der Proben

Die Entnahme der Proben für die Untersuchung der Genexpression erfolgte unter sterilen

Kautelen mittels Feinnadelaspiration oder mittels Inzisionsbiopsie unter Allgemeinanästhesie

(Tier-Nr. P19 und P20) bzw. nach Euthanasie mit Pentobarbital (Tier-Nr. K1 bis K20, P02 bis

P06, P21 und P25). Bei den Kontrolltieren und den Lymphompatienten P02 bis P06, P21 und

P25 wurden die Gewebeproben innerhalb von 20 min nach Eintritt des Todes im Rahmen

einer Sektion entnommen. Die Proben wurden unmittelbar nach der Entnahme in 1,5 ml

Kryoröhrchen überführt, in flüssigem Stickstoff kryokonserviert und bis zur weiteren

Bearbeitung bei -80 °C gelagert.

Für die Immunphänotypisierung der Lymphome wurden Feinnadelaspirate entnommen,

umgehend in 1 ml RPMI suspendiert und bei Raumtemperatur gelagert.

Die Entnahme der Proben für die histologische und immunhistologische Untersuchung

erfolgte mittels Tru-cut-Biopsie bzw. Inzisionsbiopsie im Rahmen der initialen Diagnostik.

Die Proben wurden in 10 %igem, neutral gepuffertem Formalin (Rezeptur siehe Anhang S.

128) fixiert. Die Entwässerung in einer aufsteigenden Alkoholreihe und Paraffineinbettung

erfolgte automatisiert. Die Paraffinblöcke wurden bis zur weiteren Bearbeitung bei

Raumtemperatur gelagert.

3.5 Immunphänotypisierung

Zur Immunphänotypisierung der Lymphome wurden hundespezifische Antikörper gegen

verschiedene T-Lymphozytenantigene (CD3, CD4, CD5, CD8) sowie hundespezifische B-

Lymphozytenmarker (anti B-cells, anti IgM) verwendet. Die Tumorzellen wurden in drei

verschiedenen Ansätzen (zwei Doppel-, eine Dreifachfärbung) gefärbt (Tabelle 11).

Pro Färbeansatz wurden 100 µl der Probensuspension (5 bis 10 x 105 Zellen) mit jeweils 5 µl

der unverdünnten Primärantikörper für 15 min bei Raumtemperatur im Dunkeln in einem

Plastikzentrifugenglas inkubiert. Die Proben wurden mit 1 ml Cellwash® (Fa. Becton

Dickinson) für 5 min bei 300 x g gewaschen. Der Ansatz der Dreifachfärbung wurde

anschließend mit 5 µl des unverdünnten Sekundärantikörpers (PerCP-konjugiertes anti Maus

IgG1) für 15 min im Dunklen inkubiert. Etwaige Erythrozyten wurden mittels

einfachkonzentrierter FACS Lysing Solution® (Fa. Becton Dickenson) für 10 min lysiert.

34

Die Proben wurden für 5 min bei 300 x g zentrifugiert, der Überstand verworfen und die

Zellen einmal mit 1 ml Cellwash® gewaschen. Die Zellen wurden in 250 µl 1x CellFix™ (Fa.

Becton Dickinson) fixiert. Pro Ansatz wurden mindestens 5.000 Zellen analysiert

(FACSCalibur®, Fa. Becton Dickinson).

Die Messdaten wurden mit Hilfe der Software Cellquest® (Fa. Becton Dickinson)

ausgewertet. Zunächst wurden die Zellen anhand der gemessenen Vorwärts- und

Seitwärtsstreulichtintensitäten als Punkthistogramm (Streulichtdiagramm) dargestellt.

Anschließend wurde ein Auswertungsfenster (engl. gate) um die Zellen gelegt (Ausschluss

von Zelltrümmern). Anhand der mitgeführten Negativkontrolle (Ansatz 1) wurde die

Autofluoreszenz bzw. die durch unspezifische Bindung verursachte Fluoreszenz der Zellen

bestimmt. Bei der Auswertung der nachfolgenden Färbungen (Ansatz 2 bis 4) wurden alle

Zellen mit einer höheren Fluoreszenzintensität als der in der Negativkontrolle gemessenen

Intensität (Ansatz 1) als positiv bewertet. Lymphome, bei denen über 80 % der Zellen mit

Antikörpern gegen caCD3, caCD4, caCD8 und /oder caCD5 reagierten, wurden der T-Zell-

Linie zugeordnet. Als B-Zell-Lymphome wurden Tumoren klassifiziert, bei denen über 80 %

der Zellen mit Antikörpern gegen kanine B-Zellen und / oder IgM reagierten.

Tabelle 11: Durchgeführte Färbungen zur Immunphänotypiesierung der Lymphome

Ansatz Antikörperspezifität Fluorochrom

1 Maus IgG1 PerCP

caCD45 PE 2

caIgM FITC

caCD4 FITC

caCD8 PE 3

caCD3 PerCP

caCD5 FITC 4

caB cells PE

Abkürzungen: ca: kanine PE: Phycoerythrin CD: cluster of differentiation PerCP: Peridin-Clorophyll-a-Proteinkomplex FITC: Fluoreszeinisothyocyanat

35

3.6 Immunhistochemischer Nachweis von P-Glykoprotein

Probenaufbereitung

Das Schneiden der in Paraffin eingebetteten Gewebeproben erfolgte mit einem

Schlittenmikrotom (Mikrotom HM400, Fa. Microm) bei einer eingestellten Schnittdicke von

2 µm. Die Paraffinschnitte wurden in 40 °C warmem, destilliertem Wasser gestreckt (Paraffin

Streckbad TFB45, Fa. Medite Medizintechnik), auf Objektträger (Superfrost® Plus, Fa.

Menzel-Gläser) aufgezogen und für 60 min bei 65 °C im Trockenschrank getrocknet.

Immunhistochemische Färbung

Die getrockneten Schnitte wurden dreimal für 5 min in Roticlear® (Fa. Roth) entparaffiniert,

in einer absteigenden Alkoholreihe (5 min in 100%igem Isopropanol, je 2 bis 3 min in

96%igem Ethanol und 70%igem Ethanol) rehydriert und in 0,05 molarer phosphatgepufferter

Kochsalzlösung (PBS) (Herstellung und Zusammensetzung siehe Anhang, Seite 128) dreimal

für 5 min gewaschen.

Zur Antigendemaskierung wurden die Schnitte 10 min in Citratpuffer (0,01 molar, pH-Wert

6,0) bei 600 Watt in einem Mikrowellenherd gekocht. Nach einer Abkühlungszeit von 15 min

bei Raumtemperatur wurden die Schnitte dreimal in PBS für 5 min gewaschen. Zur

Hemmung der endogenen Peroxidase wurden die Schnitte für 30 min in 1,5%igem

Wasserstoffperoxid in Methanol (≤99,8%) inkubiert. Anschließend wurden die Schnitte

dreimal für 5 min in PBS gewaschen, in Coverplates (Fa. Shandon) überführt und für 20 min

bei Raumtemperatur mit 1:5 mit PBS verdünntem Ziegennormalserum überschichtet.

Die Inkubation der Schnittpräparate mit dem Primärantikörper erfolgte über Nacht (12 - 18 h)

bei 4 °C. Als Primärantikörper zum Nachweis von P-Glykoprotein wurde ein monoklonaler

Antikörper gegen menschliches P-Glykoprotein (Klon C219) verwendet. Seine Anwendung

zum P-Glykoproteinnachweis beim Hund wurde erstmals von GINN 1996 beschrieben. Der

Antikörper wurde in einer Verdünnung von 1:200 eingesetzt. Als Verdünnungsmedium wurde

PBS plus 0,05 % Tween-20 plus 1 % bovines Serumalbumin (BSA) verwendet. Am nächsten

Tag wurden die Schnittpräparate dreimal für 5 min in PBS plus 0,05 % Tween-20 gewaschen

36

und mit dem biotinylierten Sekundärantikörper (Ziege anti Maus IgG, Fa. Vektor

Laboratories; 1:200 mit PBS verdünnt) für 30 min bei Raumtemperatur inkubiert. Danach

wurden die Schnitte erneut dreimal für 5 min in PBS gewaschen.

Die Ansetzung des Avidin-Biotin-Peroxidase-Komplexes (Fa. Vector Laboratories) erfolgte

nach Herstellerangaben (siehe Anhang, Seite 128). Die Schnitte wurden 30 min bei

Raumtemperatur mit dem Avidin-Biotin-Peroxidase-Komplex inkubiert, dreimal für 5 min in

PBS gewaschen und in Küvetten überführt.

Als Chromogen wurde 3,3 Diaminobenzidin (DAB) verwendet. Die Schnitte wurden in

0,05%iger Diaminobenzidin-Lösung mit Wasserstoffperoxid als Katalysator (Rezeptur siehe

Anhang, Seite 128) für 5 min bei Raumtemperatur inkubiert und mindestens 20 min unter

fließendem Leitungswasser gewaschen. Zur Gegenfärbung wurden die Schnitte anschließend

5 min in Hämalaun nach MEYER (Rezeptur siehe Anhang, Seite 128) eingestellt und 10 min

unter fließendem Leitungswasser gebläut. Zuletzt wurden die Schnitte in einer aufsteigenden

Alkoholreihe (70%iges Ethanol, 96%iges Ethanol, 100%iges Isopropanol) dehydriert, dreimal

für 5 min in Roticlear® (Fa. Roth) eingestellt und mit Roti® Histokitt (Fa. Roth) eingedeckt.

Kontrollen

Als positive Gewebekontrolle wurde in jeder Serie unverändertes Lebergewebe mitgeführt.

Zur Überprüfung unspezifischer Reaktionen wurde der Primärantikörper durch eine negative

Reagenzienkontrolle (Maus IgG2a) ersetzt.

Lichtmikroskopische Beurteilung

Die Auswertung der immunhistochemischen Reaktionsergebnisse erfolgte mit einem

Standard-Binokular-Lichtmikroskop bei 100-, 200- und 400-facher Vergrößerung.

37

3.7 Molekularbiologische Untersuchungen

3.7.1 Isolierung von Gesamt-RNA

Inzisionsbiopsien

Zur Isolierung der Gesamt-RNA aus den Inzisionsbiopsien wurde das Verfahren der Phenol-

Chloroform-Extraktion verwendet. Etwa 100 mg der Gewebeprobe wurden in einem

Porzellantiegel in flüssigem Stickstoff mit einem Pistill zerrieben und in 2 ml TRIzol®

Reagent (Fa. Invitrogen) suspendiert. Zum Scheren der DNA wurde die Gewebesuspension

zehnmal durch eine 18’Einmalkanüle in eine Einmalspritze aufgezogen. 1 ml des

Homogenisates wurde mit 0,2 ml Chloroform (99%) in einem 1,5-ml-Mikroreaktionsgefäß

vermischt, für 3 min bei Raumtemperatur inkubiert und für 15 min bei 12.000 x g bei 4 °C

zentrifugiert. Die obere wässrige Phase wurde unter Vermeidung der Interphase in ein neues

1,5-ml-Mikroreaktionsgefäß überführt, mit 0,5 ml Isopropanol (≥99,7%) für 10 min bei

Raumtemperatur inkubiert und für 15 min bei 12.000 x g bei 4 °C zentrifugiert. Das RNA-

Pellet wurde in 75%igem Ethanol gewaschen, getrocknet und in 100 µl DEPC behandeltem

destilliertem Wasser (siehe Anhang S. 129) für 2 min im Wasserbad bei 70 °C gelöst. Die

Proben wurden in flüssigem Stickstoff kryokonserviert und bei -80 °C gelagert.

Feinnadelaspirate (FNA)

Zur Isolierung der Gesamt-RNA aus den Feinnadelaspiraten wurde ein von der Firma Qiagen

entwickelter Kit (RNeasy® Mini Kit) verwendet. Die FNA wurden in 600 µl Buffer RLT

(RNeasy® Mini Kit) suspendiert. Die Probensuspension wurde auf eine QIAshredder™-

Spinsäule pipettiert und für 3 min bei 10.000 x g in einem 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen

zentrifugiert. Das Lysat wurde mit 600 µl 70%igem Ethanol in einem

1,5-ml-Mikroreaktionsgefäß vermischt. 700 µl der Probe wurden auf eine Rneasy®-Spinsäule

(RNeasy® Mini Kit) pipettiert und bei 10.000 x g 15 sec bei Raumtemperatur in einem

2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen zentrifugiert. Das Lysat wurde verworfen und der Vorgang

mit dem restlichen Probenvolumen wiederholt.

38

Die Säule wurde in ein neues 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen überführt und nacheinander mit

700 µl RW1 Puffer (RNeasy® Mini Kit) für 15 sec, mit 500 µl RPE Puffer (RNeasy® Mini

Kit) für 15 sec und mit 500 µl RPE Puffer für 2 min bei 10.000 x g gewaschen. Nach jedem

Waschschritt wurde das Mikrozentrifugenröhrchen gewechselt. Anschließend wurde die

Säule für 1 min bei 10.000 x g getrocknet. Zur Elution der Gesamt-RNA wurde 50 µl DEPC

behandeltes destilliertes Wasser auf die Säule pipettiert und die Säule für 1 min bei 10.000 x g

zentrifugiert. Das Eluat wurde in ein 0,5-ml-Mikroreaktionsgefäß überführt, in flüssigem

Stickstoff kryokonserviert und bis zur weiteren Verwendung bei -80 °C gelagert.

Bestimmung der Konzentration an Gesamt-RNA

Die Bestimmung der Gesamt-RNA-Konzentration erfolgte über die Messung der optischen

Dichte (OD) bei einer Wellenlänge von 260 nm mittels Absorptionsspektrophotometrie (siehe

Anhang, Seite 129).

3.7.2 DNase-Behandlung

20 µg Gesamt-RNA wurden mit 10 Units DNase (RQ1 RNase-Free DNase®, Fa. Promega)

und 10 µl RQ1 DNase 10 x Reaction Buffer (Bestandteil des RQ1 RNase-Free DNase®-Kits)

in einem Reaktionsvolumen von 100 µl für 60 min bei 37 °C inkubiert. Die Reaktion wurde

durch Zugabe von 10 µl RQ1 DNase Stop Solution (Bestandteil des RQ1 RNase-Free

DNase®-Kits) beendet und die DNase durch Inkubation der Proben für 10 min bei 65 °C

inaktiviert.

3.7.3 Reinigung der Gesamt-RNA

Die Reinigung der Gesamt-RNA erfolgte mittels RNeasy® Mini Kit (Fa. Qiagen). 100 µl der

RNA-Lösung wurden mit 350 µl Buffer RLT (RNeasy® Mini Kit) und 250 µl 96%igem

Ethanol vermischt, in eine RNeasy®-Spinsäule überführt und bei 10.000 x g für 15 sec in

einem 2 ml-Mikrozentrifugenröhrchen zentrifugiert. Die Säule wurde mit je 500 µl Buffer

RPE (RNeasy® Mini Kit) für 15 sec bzw. 2 min bei 10.000 x g gewaschen und anschließend

für 1 min bei 10.000 x g getrocknet.

39

Zur Elution der Gesamt-RNA wurde 50 µl DEPC behandeltes destilliertes Wasser auf die

Säulenmembran pipettiert und die Säule für 1 min bei 10.000 x g zentrifugiert. Das Eluat

wurde in ein 0,5 ml-Mikroreaktionsgefäß überführt und umgehend in flüssigem Stickstoff

kryokonserviert. Die Gesamt-RNA-Konzentration (siehe Anhang, Seite 129) wurde über die

Messung der optischen Dichte (OD) bei einer Wellenlänge von 260 nm mittels

Absorptionsspektrometrie bestimmt. Die Lagerung der isolierten Gesamt-RNA erfolgte bei -

80 °C.

3.7.4 Reverse Transkription (RT)

Die gereinigte Gesamt-RNA wurde in komplementäre DNA (cDNA) umgeschrieben. Als

Reverse Transkriptase wurde bis November 2001 Superscript II™ Reverse Transcriptase

(Fa. Invitrogen) und anschließend Omniscript™ Reverse Transcriptase (Fa. Qiagen)

verwendet.

Sofern ausreichende Mengen Gesamt-RNA nach der Isolierung vorlagen, wurden pro

20 µl-Reaktionsvolumen 1 µg Gesamt-RNA umgeschrieben. Bei sechs Feinnadelaspiraten

lagen die isolierten Gesamt-RNA-Mengen unter 0,1 µg/µl bzw. 0,05 µg/µl. Bei diesen Proben

wurden 0,5 µg (Tier-Nr. P18, P24, P41 bei Diagnose) bzw. 0,4 µg Gesamt-RNA (Tier-Nr.

P08, P13, P14 bei Diagnose und P09 beim 1. Rezidiv) als Template für die RT eingesetzt.

Für die RT mittels Superscript II Reverse Transcriptase® wurde 1 µg Gesamt-RNA mit

destilliertem Wasser auf 11 µl aufgefüllt und mit 1 µl Random Hexamers (250µg/ml) für

10 min bei 25 °C inkubiert. Anschließend wurde das Reaktionsgefäß wurde auf Eis gestellt,

4 µl 5x First Strand Buffer, 2 µl 0,1 M Dithiothreitol (DTT), 1 µl RNaseOUT™ (10 units / µl)

und 1 µl 10 mM dNTP zugegeben und für 2 min bei 42 °C inkubiert. Nach der Zugabe von

1 µl Superscript II™ Reverse Transcriptase erfolgte eine weitere Inkubation für 50 min bei

42 °C. Anschließend wurde die Reverse Transkriptase für 15 min bei 70 °C inaktiviert.

Für die RT mittels Omniscript™ Reverse Transcriptase (Fa.Qiagen) wurde 1 µg Gesamt-RNA

mit destilliertem Wasser auf 13 µl aufgefüllt und mit 1 µl Random Hexamers (250µg/ml),

2 µl 10x First Strand Buffer, 1 µl RNaseOUT™ (10 units / µl), 2 µl 5 dNTP und

1 µl Omniscript™ Reverse Transkriptase für 10 min bei 25 °C und anschließend für 60 min

bei 37 °C inkubiert. Die Reverse Transkriptase wurde für 5 min bei 93 °C inaktiviert. Die

cDNA wurde bei -20 °C gelagert.

40

3.7.5 Quantifizierung der MDR1-, MRP1- und MRP2-Genexpression

Die Quantifizierung der MDR1-, MRP1- und MRP2-Genexpression erfolgte mittels real-time

RT-quantitative Polymerase-Kettenreaktion (RT-qPCR). Als Housekeeping-Gen wurde

Hypoxanthinphosphoribosyltransferase (HPRT) verwendet.

3.7.5.1 Primer- und Sondendesign

Die Primer und Sonden für die RT-qPCR wurden mit Hilfe der Software ABI PRISM®

Primer Express (Fa. PE Applied Biosystems) ausgewählt (Tabelle 12).

Tabelle 12: Sequenzen und Schmelztemperaturen (Tm) der Primer und Sonden für die RT-qPCR

Abkürzungen und Fußnoten: AP: Antisense-Primer FAM: 6-Carboxyfluorescein SP: Sense-Primer TAMRA: 6-Carboxy-tetramethyl-rhodamin * bei 100 mM Na+ MGB: Minor-groove-binder

Oligonukleotid Sequenz (5’→ 3’) Tm*

MDR1 Sonde FAM-CCAGAAAAGGCCGGACTACCATTGTGA-TAMRA 77,1 °C

MDR1 SP CAGTGGTTCAGGTGGCCCCT 68,5 °C

MDR1 AP CGAACTGTAGACAAACGATGAGCT’ 67,0 °C

MRP1 Sonde FAM-AGAAAGAGGCTCCCTGGCAAATCCA– TAMRA 75,7 °C

MRP1 SP TGGAGAGGCTGAAGGAGTAT 61,5 °C

MRP1 AP CGTTGATGGTGATGTTGATGT 64,3 °C

MRP2 Sonde FAM-ATTCACGGCCTCATTT-MGB 56,8 °C

MRP2 SP AAGATGCCTCCTCAAATAATCCAT 66,3 °C

MRP2 AP TCATACCAACTAAACGTAATGCTACTCA 68,1 °C

HPRT Sonde FAM-CTTGATTGGTTGAAGATCTCATTGACACAGGCA-TAMRA 76,9 °C

HPRT SP GAGATGACCTCTCAACTTTAACTGAAAA 66,5 °C

HPRT AP GGGAAGCAAGGTTTGCATTG 69,9 °C

41

Die mRNA-Sequenzen wurden der Genbank entnommen (kanines HPRT: Genbank-Nr.

CFU16661; kanines MDR1: Genbank-Nr. AF045016; kanines MRP1: Genbank-Nr.

AF403241 und kanines MRP2: Genbank-Nr. CFA18220). Für die Messung der MDR-,

MRP1- und HPRT-Genexpression wurden TaqMan®-Sonden, für den Nachweis von MRP2

Minor groove binder-Sonden eingesetzt. Als Reporterfarbstoff wurde 6-Carboxyfluorescein

(FAM), als Quencherfarbstoff 6-Carboxy-tetramethyl-rhodamin (TAMRA) verwendet. Die

Amplikonlänge betrug für den Nachweis von HPRT 89 bp, für MDR1 79 bp, für MRP1

174 bp und für MRP2 70 bp. Alle Sonden und Primer wurden über die Firma Applied

Biosystems bezogen.

3.7.5.2 Herstellung der Standards für die qPCR

Die Herstellung der Standards für die qPCR erfolgte mittels Polymerase-Kettenreaktion. Die

erforderlichen Primer (Tabelle 13) wurden so konstruiert, dass die Sequenz des jeweiligen

PCR-Produktes die Zielsequenz der jeweiligen qPCR einschloss. Die PCR-Produkte waren

123 bp (HPRT), 224 bp (MDR1), 369 bp (MRP1) und 616 bp (MRP2) lang.

Tabelle 13: Sequenzen und Schmelztemperatur (Tm) bei 100 mM Na+ der Primer (AP: Antisense-Primer; SP: Sense-Primer) für die Herstellung der Standards für die RT-qPCR

Primer Sequenz (5’→ 3’) Tm*

Standard MDR1 SP CCACAATGACTCCATCATC 62,4 °C

Standard MDR1 AP CAGAGAATCGCCATTGCT 59,4 °C

Standard MRP1 SP AGTGTGTGGGCAACTGCAT 67,2 °C

Standard MRP1 AP CCACGATGCCCACCTTT 65,5 °C

Standard MRP2 SP CCTTGGGTTTCCTTTGGC 65,4 °C

Standard MRP2 AP AACTTGCTGACCAGTGCCTTG 67,7 °C

Standard HPRT SP ATAAAAGTAATTGGTGGAGATG 57,8 °C

Standard HPRT AP ATTATACTGCGCGACCAAG 61,5 °C

42

Die PCR-Reaktion erfolgte für jeden Standard in zehnfachem Ansatz (inklusive

Negativkontrollen). Als Template wurde aus Lebergewebe gesunder Hunde isolierte cDNA

verwendet. In jedem Ansatz waren 200 µM dNTP, 1,6 mM MgCl2, 1 µl des jeweiligen

Templates und 200nM der jeweiligen Primer in 50 µl 1 x Buffer enthalten. Nach der initialen

Denaturierung (2 min bei 94,5 °C) wurden jedem Ansatz 2,5 Units Taq DNA Polymerase (Fa.

Promega) zugesetzt (Hot-Start-PCR). Insgesamt wurden 35 Zyklen (Denaturierung für 45 sec

bei 94,5 C°, Annealing für 45 sec bei 55 °C, Elongation für 2 sec im ersten Zyklus zuzüglich

2 sec Zeitinkrement je Folgezyklus bei 72 °C) durchgeführt. Die PCR wurde mit einer

Elongation (10 min bei 72 °C) beendet.

200 µl des jeweiligen PCR-Produktes wurden mit 20 µl 3 M Natriumacetat (pH-Wert 7) und

550 µl Ethanol (>99,8 %, -20 °C) über Nacht bei -20 °C inkubiert. Anschließend wurde die

Probe für 10 min bei 12.000 x g zentrifugiert und das Pellet in 35 µl autoklaviertem dest.

Wasser gelöst. Die elektrophoretische Auftrennung des PCR-Produkts erfolgte in einem

1%igen Agarosegel (Herstellung des Gels siehe Anhang Seite 129). Die gewünschte DNA-

Bande wurde unter UV-Lichtexposition mit einem sterilen Skalpell ausgeschnitten. Etwa

100 g des ausgeschnittenen Gelstücks wurden mit 300 µl Buffer QG (QIAqick® Gel

Extraction Kit) für 10 min bei 50 °C unter gelegentlichem Mischen in einem Wasserbad

inkubiert. Die Probelösung wurde mit 100 µl Isopropanol (≥99,7%) vermengt, in eine

Glasmilchsäule (QIAquick® Gel Extraction Kit) überführt und für 1 min bei 10.000 x g in

einem Mikrozentrifugenröhrchen zentrifugiert. Der Durchlauf wurde verworfen und die Säule

je einmal mit 500 µl Buffer QB und 750 µl Buffer PE (QIAqick Gel Extraction Kit®) für

1 min bei 10.000 x g gewaschen. Der Durchlauf wurde verworfen und die Säule für 1 min bei

10.000 x g getrocknet. Die Säule wurde in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen überführt. Zur

Elution der DNA wurden 50 µl autoklaviertes dest. Wasser auf die Säulenmembran pipettiert

und die Säule für 1 min bei 10.000 x g zentrifugiert.

Die Bestimmung der DNA-Konzentration erfolgte über die Messung der optischen Dichte

(OD) bei einer Wellenlänge von 260 nm mittels Absorptionsspektrophotometrie. Aus der

DNA-Konzentration wurde die Anzahl an PCR-Produkten errechnet (Formel siehe Anhang

Seite 129). Für jedes Gen wurden Standardverdünnungsreihen um den Faktor 10 mit einer

Kopienzahl von100 bis 108 Kopien pro µl erstellt. Die internen Standards wurden aliquotiert

und bei -20 °C gelagert.

43

3.7.5.3 Durchführung der RT-qPCR

Die real-time RT-qPCR wurde mittels Mx4000™ Multiplex Quantitative PCR System der Fa.

Stratagene durchgeführt. Zusätzlich zur Expression des jeweiligen Gens wurde in jedem Lauf

die Expression des Housekeeping-Gens HPRT in den Proben gemessen.

In jedem PCR-Lauf wurden Standardverdünnungsreihen für das jeweilige Gen und für HPRT

(MDR1, MRP1 und HPRT: 103 bis 108 Kopien; MRP2: 101 bis 106) mitgeführt. Die Proben

und die Negativkontrollen wurden in jedem Lauf in Dreifach-Ansätzen, die

Standardverdünnungen in Zweifach-Ansätzen gemessen. Alle Messungen wurden einmal

wiederholt.

Als Reaktionsgefäß wurden MicroAmp Optical 96-well plates (Fa. Stratagene) verwendet, die

mit MicroAmp Optical caps (Fa. Stratagene) verschlossen wurden.

Die Komponenten für den Reaktionsansatz wurden einem entsprechenden Kit (Brilliant™

Quantitative PCR Core Reagent Kit, Fa. Stratagene) entnommen. In einem PCR-

Reaktionsvolumen von 25 µl waren 80 µM dNTP mix, 5 mM MgCl2, 300 nM der jeweiligen

Primer, 100 nM der jeweiligen Sonde, 75 nM 6-Carboxy-X-Rhodamin (ROX) als

Referenzfarbstoff und 0,025 units / µl SureStart™ Taq DNA Polymerase in 1x PCR-Puffer

enthalten.

An eine initiale Denaturation über 10 min bei 95 °C schlossen sich 40 PCR-Zyklen mit 15 sec

bei 95 °C (Denaturation) und 1 min bei 61 °C (MDR1) bzw. 60 °C (MRP2) oder 59 °C

(MRP1) an (Anlagerung und Verlängerung).

44

3.7.5.4 Auswertung der RT-qPCR

Die Auswertung erfolgte für jeden PCR-Lauf separat unter Verwendung der dem Gerät

zugehörigen Software.

Zunächst wurde aus den in den ersten PCR-Läufen erhobenen Messdaten für jeden Ansatz

eine Grundlinie (baseline) bestimmt. Die Festlegung der Spannweite der PCR-Zyklen für die

Erstellung der baseline erfolgte Software-gesteuert (Software-Einstellung: adaptive baseline).

Durch Subtraktion des Wertes der Gradenfunktion der baseline von den in den Ansätzen in

den PCR-Zyklen gemessenen Fluoreszenzintensitäten wurden die baseline korrigierte

Fluoreszenz (dR) und hinterher als Quotient der dR von Reporterfarbstoff und

Referenzfarbstoff (ROX) das sogenannte normalisierte baseline-korrigierte Reportersignal

(dRn) berechnet.

Anschließend wurde anhand der in fünf der ersten zehn PCR-Zyklen gemessenen

Fluoreszenzintensitäten (Hintergrundfluoreszenz) der sogenannte Grenzwert (Threshold)

bestimmt und für jeden Ansatz der Threshold Cycle (Ct-Wert), d.h. der PCR-Zyklus, bei dem

die dRn den Grenzwert erstmals übersteigt, ermittelt.

Zur Bestimmung der Ausgangskopienzahl in den Proben wurde mittels der Software eine

Standardkurve erstellt. Die Ct-Werte der jeweiligen Standardverdünnungen wurden gegen die

logarithmierte Kopienzahl aufgetragen und die Standardkurve algorithmisch generiert. Aus

der Gradengleichung wurden die Effizienz der Amplifikation und die Ausgangskopienzahl in

den Proben durch Interpolation bestimmt.

Aus den in der gleichen Probe (dreifacher Ansatz) im selben Lauf ermittelten Ct-Werten bzw.

cDNA Kopienzahlen wurden der arithmetischer Mittelwert (MW) und die

Standardabweichung (SD) berechnet. Die mittlere Kopienzahlen des jeweiligen Gens wurden

durch die im selben Lauf in der gleichen Probe ermittelten Kopienzahlen des

Housekeeping-Gens (HPRT) geteilt. Zuletzt wurde aus den in zwei separaten Läufen

ermittelten normalisierten Kopienzahlen für MDR1, MRP1 bzw.MRP2 der MW und die SD

berechnet.

45

3.7.6 Nachweis von Survivin mRNA in kaninem Gewebe

Die Untersuchung der Survivin-Expression in kaninem Gewebe erfolgte mittels RT-PCR.

Die kanine Survivin mRNA- Sequenz wurde der Genbank (Genbank-Nr. AB095108)

entnommen. Die Primerpaare, SURV1 bis SURV3 (Tabelle 14), wurden aus

Sequenzabschnitten ausgewählt, bei denen gemäß den in der Genbank enthaltenen Sequenzen

eine 100% Homologie zwischen Mensch und Hund besteht.

Als Positivkontrolle dienten menschliches Kolonkarzinomgewebe, kanines Plazentagewebe

sowie genomische DNA (c=50ng/ml) von Mensch und Hund. Für die Negativkontrollen

wurde das jeweilige Template durch ein identisches Volumen an destilliertem Wasser ersetzt.

In jedem PCR-Ansatz waren 200 µM dNTP, 1,6 mM MgCl2, 1 µl des jeweiligen Templates

und 200nM der jeweiligen Primer in 50 µl 1 x Buffer enthalten. Nach der initialen

Denaturierung (2 min bei 94,5 °C) wurden jedem Ansatz 2,5 Units Taq DNA Polymerase

zugesetzt (Hot-Start-PCR). Insgesamt wurden 35 Zyklen (Denaturierung für 45 sec bei

94,5 C°, Annealing für 45 sec bei 55 °C (SURV1 60°C), Elongation für 2 sec im ersten

Zyklus, zuzüglich 2 sec Zeitinkrement je Folgezyklus bei 72 °C) durchgeführt. Die PCR

wurde mit einer Elongation (10 min bei 72 °C) beendet.

Die elektrophoretische Auftrennung der PCR-Produkte erfolgte in einem 1%igen Agarosegel.

Etwaige Banden wurden unter UV-Lichtexposition (BiodocAnalyserSystem, Biometra)

beurteilt und fotografiert.

Tabelle 14: Primer (SP: Sense Primer; AP: Antisense Primer) für den Nachweis von Survivin mRNA. Sequenz, Produktlänge und Schmelzpunkt (Tm) bei 100 mM Na+

Oligonukleotid Sequenz (5’→ 3’) Produktlänge Tm

SURV1 SP GCATGGGTGCCCCGACGTTG 73,2 °C

SURV1 AP GCTCCGGCCAGAGGCCTCAA 448 bp

71,3 °C

SURV2 SP TGCCCCGACGTTGCC 62,9 °C

SURV2 AP CAGTTCTTGAATGTAGAGATGCGGT 69 bp

64,2 °C

SURV3 SP GGTAACAGTGGCTGCTTCTCTC 59,5 °C

SURV3 AP TCTAGCAAAAGGGACACTGCCT 120 bp

60,1 °C

46

3.8 Statistische Auswertung

Zur statistischen Auswertung wurde das Programm SPSS verwendet.

Die in den verschiedenen Stichproben ermittelten normalisierten MDR1, MRP1 und MRP2

mRNA Kopienzahlen wurden mit dem Kolmogorov-Smirnov-Test auf Normalverteilung

geprüft.

Zum Vergleich der Höhe der Genexpression zwischen den Kontrollgeweben (Leber versus

Lymphknoten) und zwischen den Kontrolltieren (Beagle versus Klinikpatienten) wurde der t-

Test nach Student verwendet.

Mit Hilfe des Korrelationskoeffizienten nach Pearson wurde der Zusammenhang zwischen

der Höhe der MDR1, bzw. MRP1-Genexpression in Leber- und Lymphknotengewebe

bestimmt.

Zum Vergleich der Höhe der MDR1- bzw. MRP1-Genexpression zwischen Patienten mit

unterschiedlichen Krankheitscharakteristika (Immunphänotyp, anatomische Form und

Vorbehandlungsstatus) wurde der U-Test nach Mann und Whitney und zum Vergleich der

Höhe der MDR1- bzw. MRP1-Genexpression zwischen verschiedenen Messzeitpunkten

(Diagnosestellung und 1. Rezidiv) der Wilcoxon-Test verwendet.

Der Zusammenhang zwischen einer Hyperkalzämie und dem Immunphänotyp sowie

zwischen dem Erreichen einer kompletten Remission und der Höhe der MDR1- bzw. MRP1-

Genexpression wurde mit dem Fishers exakter Test evaluiert.

Für die Überlebensanalyse wurden die Hunde, die sich bei Ende der Studie in Remission

befanden bzw. bei denen keine Informationen über den Gesundheitsstatus zum Ende der

Studie vorlagen, zensiert. Zur Darstellung des zeitlichen Verlaufs des rezidivfreien

Überlebens wurden eine Kaplan-Meier-Überlebenskurven erstellt und das mittlere RFI sowie

das zugehörige 95% Konfidenzintervall des Medians nach der Methode von Kaplan-Meier

berechnet (KAPLAN 1958). Zum Vergleich der Dauer des rezidivfreien Überlebens zwischen

verschiedenen Patientengruppen wurde der Lok-Rang-Test verwendet (PETO et al., 1977).

Bei allen angewandten statistischen Testverfahren wurden Aussagen, die mit einer

Irrtumswahrscheinlichkeit von p<0,05 behaftet waren, als signifikant bewertet.

47

3.9 Reagenzien und Verbrauchsmaterialien

3.9.1 Probenentnahme und Lagerung

Tru-cut Biopsienadel, Fa. Allegiance Heathcare Cooperation, USA

RPMI 1640, Fa. Promo Cell, Heidelberg, Art.-Nr. C-76010

Formaldehyd 37%ig, stabilisiert in 10% Methanol, Fa. Roth, Karlsruhe, Art.-Nr.4979.2

3.9.2 Immunphänotypisierung

3.9.2.1 Reagenzien und Verbrauchsmaterialien

CellWASH ™, Fa. Becton Dickinson, Heidelberg, Art.-Nr. 349524

BD FACS ™ Lysing Solution, Fa. Becton Dickinson, Heidelberg, Art.-Nr. 342003

FALCON® Teströhrchen 12 x 75 mm, Fa. Becton Dickinson

FACS Flow ™, Fa. Becton Dickinson, Heidelberg, Art.-Nr. 342003

3.9.2.2 Antikörper

Primärantikörper: Fa. Serotec, Düsseldorf

Mouse anti canine CD3: purified, Klon CA17.2A12, Art.-Nr. MCA1774

Rat anti canine CD4: FITC, Klon YKIX 302.9, Art.-Nr. MCA1038F

Rat anti canine CD5: FITC, Klon YKIX 332.3, Art.-Nr. MCA137F

Rat anti canine CD8a: RPE, Klon YCATE 55.9, Art.-Nr. MCA1039PE

Rat anti canine CD45: RPE, Klon YKIX716.13, Art.-Nr. MCA1042PE

Mouse anti canine B-Cells: RPE, Klon CA2.1D6, Art.-Nr. MCA1781PE

Goat anti canine IgM: FITC, Art.-Nr. AA130F

Sekundärantikörper

Rat Anti Mouse IgG1: PerCP, Fa. Becton Dickinson, Heidelberg, Art.-Nr: 340272

48

3.9.3 Immunhistochemische Untersuchung

Verbrauchsmaterialien

Coverplates, Fa. Shandon, Frankfurt / Main, Art.-Nr. 7210013

Objekträger Superfrost® Plus, Fa. Menzel-Gläser, Art.-Nr. 041300

Deckgläser 24 x 40 mm , Fa. Roth, Art.-Nr. 1870

Reagenzien

Bovines Serumalbumin (BSA), Fa. Serva Feinchemie, Art.-Nr.13182

Citrat-Puffer-Konzentrat pH 6,0, Fa. ProTaqstura, Art.-Nr. 400300692

3,3’-Diaminobenzidintetrahydrochlorid (DAB), Fa. Fluka, Art.-Nr. 32750

Ethanol ≥ 99,8%, Fa. Roth, Art.-Nr. 9065.1

Hämalaun nach Mayer (Rezeptur siehe S.128)

Isopropanol ≥ 99,7%, Fa. Roth, Art.-Nr. 6752.1

Natriumchlorid (NaCl), Fa. Fluka, CH-9471 Buchs, Art.-Nr. 71381

Natriumdihydrogenphosphat (NaH2PO4), Fa. Fluka, Art.-Nr. 71496

Natronlauge, 1 mol/l (1 N), Fa. Merck, Art.-Nr. 9137

Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS), 0,05 molar, pH-Wert 7,25 (Rezeptur siehe S.128)

Roti®-Histokitt, Fa. Roth, Art.-Nr. 6638.1

Roticlear®, Fa. Roth, Art-Nr. A5381

Vectastain® ABC Kit, Fa. Vektor Laboratories Inc, Art-Nr. PK-6100

Tween 20, Fa. Serva Feinbiochemie, Art.-Nr.37470

Wasserstoffperoxid 30% (Perhydrol®), Fa. Merck, Art.-Nr. 1.07209.0250

Antikörper

Maus anti P-Glycoprotein, Klon C219, Fa. Dako., Art.-Nr.M3521

Ziege anti Maus IgG (H+L), biotinyliert, Fa. Vektor Laboratories, Art.-Nr. CA 94010

49

3.9.4 Molekularbiologische Untersuchungen

100 mM dNTP Set, Fa. Invitrogen, Art.-Nr. 10297-018

Agarose NA, Fa Pharmacia LKB; Art.-Nr. 17-0554-02

Borsäure, Fa. Roth, Art.-Nr. 6943.2

Brilliant™ Quantitative PCR Core Reagent Kit, Fa. Stratagene, Art.-Nr.600530

Chloroform, Fa. Sigma, Art.-Nr. C2423

Diethylpyrocarbonat (DEPC), Fa. Aldrich, Art.-Nr. 27238-8

EDTA Dinatriumsalz Dihydrat, Fa. Roth, Art.-Nr. 8043.1

Ethanol ≥ 99,8%, Fa. Roth, Art.-Nr. 9065.1

Ethidiumbromid, Fa. Pharmacia LKB, Art.-Nr.80-1129-13

Isopropanol ≥ 99,7%, Fa. Roth, Art.-Nr. 6752.1

Mercaptoethanol, Fa. Sigma, Art.-Nr.M6250

Mineral oil, Fa. Sigma, Art.-Nr. M5904

Natriumacetat-Trihydrat, Fa. Roth, Art.-Nr. 6779.1

Omniscript™ Reverse Transcriptase, Fa. Qiagen, Art.-Nr. 205110

QIAquick® Gel Extraction Kit, Fa. Qiagen, Art.-Nr. 28704

QIAshredder™, Fa. Qiagen, Art.-Nr. 79654

Random Hexamers, Fa. Promega, Art.-Nr. C1181

RNaseOUT™, Fa. Invitrogen, Art.-Nr. 10777-019

RNeasy® Mini Kit, Fa. Qiagen, Art.-Nr. 74104,

RQ1™ RNase-free DNase, Fa. Promega, Art.-Nr. M6101

Superscript™ II Rnase H- Reverse Transcriptase, Fa. Invitrogen, Art.-Nr. 18064-022

TBE-Puffer (Rezeptur siehe Anhang, S.129)

Taq DNA Polymerase, Fa. Promega, Art.-Nr. M1665

TRIS, Fa. Roth, Art.-Nr. 8043.1

TRIzol® Reagent , Fa. Invitrogen, Art.-Nr. 15596

50

4 ERGEBNISSE

4.1 Allgemeine Patientencharakteristika

Die in die Studie aufgenommenen, an malignem Lymphom erkrankten Hunde (n=50) waren

bei Diagnosestellung zwischen 4 Monate und 13 Jahre alt. Das Durchschnittsalter betrug

7 Jahre. Die Hunde gehörten 24 verschiedenen Rassen an (Tabelle 15). Am häufigsten waren

Mischlinge (n=9), Berner Sennenhunde (n=4) und West Highland White Terrier (n=4)

vertreten. 33 Patienten waren männlich (25 intakt, 8 kastriert) und 17 weiblich (11 intakt, 6

kastriert). Bei 44 Hunden lag ein multizentrisches und bei 6 Patienten ein gastrointestinales

Lymphom vor.

Tabelle 15: Rasseverteilung der an malignem Lymphom erkrankten Hunde

Rasse Anzahl

Mischling 9

Berner Sennenhunde, West Highland White Terrier 4

Bouvier des Flandres, Boxer, Dobermann, Golden Retriever 3

Bobtail, Jack-Russel-Terrier, Schweißhund, Yorkshire-Terrier 2

Collie, Dandie-Diamond Terrier, Deutsch-Drahthaar, Deutscher Schäferhund, Foxterrier, Hovawart, Kleiner Münsterländer, Neufundländer, Pon, Riesen Schnauzer, Rottweiler, Staffordshire-Terrier, Weimaraner

1

Summe 50

51

4.2 Klinische Stadieneinteilung

Bei der Mehrheit der Hunde mit multizentrischem Lymphom (n=44) lag bei Diagnosestellung

ein fortgeschrittenes Erkrankungsstadium (Stadium IV oder V) vor (Tabelle 16). Bei einem

Hund wurde das klinische Stadium als I, bei 3 Patienten als III, bei 20 als IV und bei 9 als V

klassifiziert. Bei den restlichen 11 Hunden war aufgrund des Verzichts auf eine

Knochenmarkuntersuchung keine zuverlässige Stadieneinteilung möglich.

Die Beurteilung des klinisches Substadiums ergab bei 20 der Patienten eine Erkrankung des

Substadiums a und bei 30 Patienten des Substadiums b. Bei allen Hunden mit einem

gastrointestinalen Lymphom (n=6) lag eine Erkrankung des Substadiums b vor (Tabelle 16).

Tabelle 16: Klinische Stadien- und Substadienverteilung der an multizentrischem Lymphom erkrankten Hunde

klinisches Substadium Klinisches Stadium a b

Summe

I 1 - 1

III 3 - 3

IV 11 9 20

V 3 6 9

unbekannt 2 9 11

Summe 20 24 44

52

4.3 Immunphänotypisierung

Eine Immunphänotypisierung des Lymphoms erfolgte bei 36 Hunden. Bei 28 Patienten wurde

das Lymphom der B-Zelllinie und bei 8 Patienten der T-Zelllinie zugeordnet. Bei den

restlichen 14 Hunden konnte aus Mangel an Probenmaterial keine durchflusszytometrische

Immunphänotypisierung durchgeführt werden.

Alle 28 als B-Zell-Lymphom klassifizierten Tumoren reagierten mit den Antikörpern gegen

kanine B-Lymphozyten und kanines IgM, jedoch nicht mit den verwendeten

T-Lymphozytenmarkern (Tabelle 17).

Alle acht als T-Zell-Lymphome klassifizierten Tumoren reagierten sowohl mit dem

Antikörper gegen caCD3 als auch gegen caCD5. Bei sieben T-Zell-Lymphomen war

zusätzlich eine Expression von caCD4 und bei einem Tumor von caCD8 nachweisbar

(Tabelle 17).

Tabelle 17: Ergebnisse der durchflusszytometrischen Immunphänotypisierung

Antigenexpression

B-cell IgM CD3 CD5 CD4 CD8 n

+ + - - - - 28

- - + + + - 7

- + + + - + 1 + positiv - negativ

4.4 Kalziumplasmaspiegel

Bei 6 der Patienten lag der Kalziumspiegel im Plasma über dem Referenzbereich.

Bei 5 der Patienten mit einer Hyperkalzämie lag ein T-Zell-Lymphom vor. Bei dem

verbleibenden Patienten war der Immunphänotyp des Lymphoms unbekannt. Der

Zusammenhang zwischen dem erhöhten Kalziumplasmaspiegel und dem Immunphänotyp

erwies sich als statistisch signifikant (Fishers exakter Test; p<0.001).

53

4.5 Chemotherapie

4.5.1 Initiale Chemotherapie

Eine Chemotherapie (Kurzzeit-Kombinationsprotokoll) wurde bei 25 Patienten durchgeführt.

Die Krankheitscharakteristika (anatomische Form, klinisches Stadium- und Substadium,

Immunphänotyp, Vorbehandlung mit Glukokortikoiden und Kalziumgehalt im Plasma) der

therapierten Patienten sind in Tabelle 18 enthalten.

Tabelle 18: Chemotherapeutisch behandelte Patienten: Anatomische Erkrankungsform, klinisches Stadium und Substadium, Glukokortikoidvorbehandlung und Kalziumgehalt im Plasma

Faktor Anzahl

anatomische Form - multizentrisch 23

- gastrointestinal 2 klinisches Stadium (multizentrische Lymphome)

- I 1 - III 3 - IV 13 - V 3 - unbekannt 3

klinisches Substadium - a 17 - b 8

Immunphänotyp - B-Zell-Lymphom 19 - T-Zell-Lymphom 2 - unbekannt 4

Glukokortikoide - vorbehandelt 7 - nicht vorbehandelt 18

Kalziumgehalt im Plasma - im Referenzbereich 25

54

4.5.1.1 Behandlungsergebnisse

Bei 22 Patienten konnte durch die Kurzeit-Chemotherapie eine komplette Remission und bei

2 Hunden eine partielle Remission erreicht werden. Nur bei einem Hund reagierte der Tumor

nicht auf die Chemotherapie.

Von den 24 Patienten mit einer Tumorremission entwickelten 16 im Beobachtungszeitraum

ein Rezidiv. Ein Hund erfüllte die Studienkriterien aufgrund einer langfristigen Gabe von

Prednisolon nach Abschluss der Chemotherapie nicht mehr. 4 Hunde befanden sich bei

Beendigung der Studie noch in der ersten Remission. Bei den restlichen 3 Hunden waren

keine Angaben über den Gesundheitsstatus bei Studienende verfügbar.

Das rezidivfreie Intervall (RFI) war bei den Patienten, die im Beobachtungszeitraum ein

Rezidiv entwickelten, zwischen 30 und 511 Tage lang. Das mittlere RFI betrug 222 Tage, das

zugehörige 95 % Konfidenzintervall für den Median lag bei 143 bis 301 Tagen.

Ein Zusammenhang zwischen dem klinischen Stadium, Substadium oder einer

Vorbehandlung mit Glukokortikoiden und der Dauer des RFI war bei den Hunden mit einem

multizentrischen B-Zell-Lymphom (n=19) nicht nachweisbar (Tabelle 19). Auf eine

statistische Überprüfung des Einflusses des Immunphänotyps sowie der anatomischen Form

auf die Länge des RFIs wurde aufgrund einer zu geringen Anzahl an Patienten mit einem

T-Zell-Lymphom (n=2) bzw. einem gastrointestinalen Lymphom (n=2) verzichtet.

Tabelle 19: Einfluss des klinischen Stadiums und Substadiums sowie einer Vorbehandlung mit Glukokortikoiden auf die Dauer des rezidivfreien Intervalls (RFI) bei Patienten mit einem multizentrischen B-Zell-Lymphom (n=19)

Faktor n RFI Median Log-Rang-Test

Klinisches Stadium - III und IV 14 222 Tage

- V 3 224 Tage p=0,77

Klinisches Substadium - a 14 224 Tage - b 5 157 Tage

p=0,6

Glukokortikoide - vorbehandelt 6 222 Tage - nicht vorbehandelt 13 273 Tage

p=0,86

55

4.5.2 Zweite Chemotherapie

Bei 7 Patienten, die ein Tumorrezidiv entwickelten, stimmten die Besitzer einer zweiten

Chemotherapie zu. 3 Hunde erhielten eine Langzeitchemotherapie, ein Patient wurde mit

einer Kombination aus Cytarabin und Carboplatin behandelt und bei 3 Patienten wurde das

ursprüngliche Kurzzeit-Kombinationsprotokoll wiederholt.

Durch die erneute chemotherapeutische Behandlung konnte bei 5 Hunden eine komplette und

bei einem Patienten eine partielle Remission erreicht werden. Bei einem Hund reagierte das

Tumorrezidiv nicht mehr auf die Chemotherapie (Tabelle 20). Der Median des zweiten RFI

betrug bei den Patienten mit einem Tumorrückgang (n=6) 139 Tage (95% Konfidenzintervall

59 bis 219 Tage).

Tabelle 20: Behandlungsergebnisse der zweiten Chemotherapie

Tier-Nr. Protokoll Therapie-antwort RFI

P07 Kurzzeitchemotherapie PR 190 Tage

P09 Cytarabin / Carboplatin CR 42 Tage

P11 Langzeitchemotherapie CR 139 Tage

P12 Langzeitchemotherapie CR 128 Tage

P10 Kurzeitchemotherapie CR 94 Tage*

P39 Kurzzeitchemotherapie CR 42 Tage**

P46 Langzeitchemotherapie PD -

Abkürzungen und Fußnoten: CR: komplette Remission PR : partielle Remission PD: progressive Tumorerkrankung RFI: rezidivfreies Intervall * Verlauf nach letzter Vorstellung in der Klinik unbekannt ** bei Studienende in Remission

56

4.6 Real-time RT-qPCR

4.6.1 Sensitivität der qPCR

Zur Überprüfung des sicheren Nachweises geringer Kopienzahlen wurden Verdünnungen der

Standards für MDR1, MRP1 und MRP2 von 106 bis 100 Kopien pro µl erstellt und in

dreifachen Ansätzen gemessen. Bei allen drei etablierten qPCR-Assays waren 10 Kopien pro

µl Reaktionsvolumen noch sicher detektierbar (Tabelle 21).

Tabelle 21: Sensitivitätskontrolle der qPCR. Arithmetischer Mittelwert (MW) und Standardabweichung (SD) der als Triplikate in verschiedenen Verdünnungsstufen der Standards gemessenen Ct-Werte

Ct-Wert Gen Kopienzahl je PCR-Reaktion MW SD

MDR1 106 19,79 0,50 105 23,09 0,25 104 27,67 0,22 103 30,75 0,45 102 32,90 0,24 101 37,17 1,24 100 kein Ct - 0 kein Ct - MRP1 106 20,31 0,17 105 23,35 0,21 104 26,61 0,25 103 28,65 0,43 102 32,13 0,23 101 34,80 0,47 100 Kein Ct - 0 Kein Ct - MRP2 106 18,59 0,24 105 22,00 0,40 104 25,73 0,30 103 29,35 0,23 102 33,00 0,43 101 37,24 0,65 100 39,36 0,71 0 kein Ct -

57

4.6.2 MDR1-Genexpression

4.6.2.1 Leber- und Lymphknotengewebe der Kontrolltiere

In allen unveränderten Leber- (n=14) und Lymphknotenproben (21 Proben von 15 Hunden)

war mittels der etablierten RT-qPCR eine Expression des MDR1-Gens nachweisbar.

Im Lebergewebe (n=14) waren durchschnittlich 147 (Spannweite 69 bis 246) und im

Lymphknotengewebe (15 Proben von 15 Hunden) 14 (Spannweite 5 bis 28) MDR1 cDNA

Kopien pro HPRT cDNA Kopie nachweisbar. Der Unterschied in der Höhe der

MDR1-Genexpression zwischen den beiden Geweben erwies sich im t-Test nach Student als

hoch signifikant (p<0,001).

Zwischen den Klinikpatienten und den Beaglen unterschied sich die Höhe der MDR1-

Genexpression im Leber- und im Lymphknotengewebe dagegen nur unwesentlich (Leber:

p=0,956; Lymphknoten: p=0,22) (Abbildung 1).

Lymphknoten LeberGewebe

0

50

100

150

200

MD

R1

Kop

ien

pro

HPR

T K

opie

A B

A B

"Sonstige"Beagle

Beagle "Sonstige"

Abbildung 1: MDR1-Genexpression (arithmetischer Mittelwert und Standardabweichung der MDR1 cDNA Kopienzahl pro HPRT cDNA Kopie) im unveränderten Lymphknoten- und Lebergewebe gesunder Beagle (Leber n=6; Lymphknoten n=9) und Hunde aus der Klinik für kleine Haustiere („Sonstige“) (Leber: n=8; Lymphknoten: n=6)

58

Eine statistisch signifikante Korrelation zwischen der Höhe der MDR1-Genexpression im

Lebergewebe und im Lymphknotengewebe bestand bei Hunden, bei denen Proben aus beiden

Geweben untersucht wurden (n=10), nicht (Korrelationskoeffizient nach Pearson (R) =0,056

p=0,88).

MDR1 Kopien pro HPRT Kopie / Lymphknoten

3020100

MD

R1

Kop

ien

pro

HP

RT

Kop

ie /

Lebe

r

300

200

100

0

Abbildung 2: Korrelation der Höhe der MDR1-Genexpression in Leber- und Lymphknotengewebe der Kontrolltiere (n=10) (R=0,056, p=0,88)

Zum Ausschluss einer relevanten Schwankung in der Höhe der MDR1-Genexpression

zwischen Lymphknoten verschiedener Körperregionen wurde bei einem Beagle (Tier-Nr. K9)

die Höhe der MDR1 Geneexpression in sieben verschiedenen Lymphknoten (ein Popliteal-

sowie je zwei Zervikal-, Mandibular- und Darmlymphknoten) bestimmt. Die gemessene

MDR1 cDNA Kopienzahl pro HPRT cDNA Kopie in den sieben Biopsien schwankte

zwischen 12 und 28 und variierte weniger als zwischen Biopsien aus den

Popliteallymphknoten von 9 verschiedenen Beaglen (Spannweite 5 bis 28).

59

4.6.2.2 Maligne Lymphome

Bei allen 50 an malignem Lymphom erkrankten Hunden war bei Diagnosestellung eine

Expression des MDR1-Gens im Tumorgewebe mittels der etablierten RT-q PCR nachweisbar.

Die Höhe der gemessenen MDR1-Genexpression variierte zwischen den Patienten und reichte

von 0,1 bis 369 MDR1 cDNA Kopien pro HPRT cDNA Kopie.

Die Mehrheit der untersuchten Lymphome wies bei Diagnosestellung eine relativ niedrige

MDR1-Genexpression auf (Median 1,7 MDR1 cDNA Kopien pro HPRT cDNA Kopie). Nur

bei drei Lymphomen war die MDR1-Genexpression höher als im unveränderten

Lymphknotengewebe der Kontrolltiere (Abbildung 3). Bei zehn Hunden lag die Höhe der

MDR1-Geneexpression innerhalb des im Lymphknotengewebe der Kontrolltiere gemessenen

Wertebereiches. Bei den restlichen 37 Patienten war die MDR1-Genexpression im

Tumorgewebe bei Diagnosestellung niedriger als im Lymphknotengewebe der Kontrolltiere.

< Ln. = Ln. > Ln.MDR1-Genexpression bei Diagnose

0

10

20

30

Anz

ahl a

n Pa

tient

en

n=37 n=10 n=3

Abbildung 3: MDR1-Genexpression im Tumorgewebe von an malignem Lymphom erkrankten Hunden bei Diagnosestellung (n=50). Ln.: Lymphknotengewebe der Kontrolltiere (n=15)

60

Vergleich von multizentrischen und gastrointestinalen Lymphomen

Von den 50 untersuchten Patienten wiesen 44 ein multizentrisches und 6 ein gastrointestinales

Lymphom auf. Bei den Patienten mit einem multizentrischen Lymphom waren

durchschnittlich (Median) 1,4 (Spannweite 0,1 bis 369), bei den Hunden mit einem

gastrointestinalen Lymphom durchschnittlich 11,4 (Spannweite 2,4 bis 50) MDR1 cDNA

Kopien pro HPRT cDNA Kopie im Tumorgewebe bei Diagnosestellung nachweisbar

(Abbildung 4). Im Mittelwertvergleich (U-Test nach Mann und Whitney) erwies sich der

beobachtete Unterschied in der Höhe der MDR1-Genexpression zwischen den beiden

anatomischen Lymphomformen als signifikant (p=0,002).

multizentrisch gastrointestinalanatomische Form

0

100

200

300

MD

R1

cDN

A K

opie

n pr

o H

PRT

cDN

A K

opie

RRRRR RRRRRRRRRRRRR R

R

R

RRRR

RRRRRRRRRRRRRRR

R

RRRRRRRRR

Abbildung 4: MDR1-Genexpression im Tumorgewebe bei Diagnosestellung von Hunden mit einem multizentrischen (n=44) und Hunden mit einem gastrointestinalen Lymphom (n=6). (U-Test von Mann und Whitney: p=0,002)

61

Vergleich von B-Zell- und T-Zell-Lymphomen

Zwischen den Patienten mit einem multizentrischem T-Zell-Lymphom (n=8) und den Hunden

mit einem multizentrischem B-Zell-Lymphom (n=18) unterschied sich die Höhe der MDR1-

Genexpression im Tumorgewebe bei Diagnosestellung dagegen nicht deutlich (U-Test von

Mann und Whitney p=0,54).

Durchschnittlich (Median) waren bei den an einem T-Zell-Lymphom erkrankten Hunden im

Tumorgewebe 2,8 (Spannweite 0,1 bis 132) und bei den an einem B-Zell-Lymphom

erkrankten Patienten 1,2 (Spannweite 0,2 bis 10) MDR1 cDNA Kopien pro HPRT cDNA

Kopie nachweisbar (Abbildung 5).

B-Zell-Lymphom T-Zell-LymphomImmunphänotyp

0

50

100

150

MD

R1

cDN

A K

opie

n pr

o H

PRT

cDN

A K

opie

RRRRRR RRRRRRRR

R

R

RRRR RRRRRR

R

RRRRRRRR R

Abbildung 5: Vergleich der MDR1-Genexpression in multizentrischen T-Zell-Lymphomen (n=8) und B-Zell-Lymphomen (n=18) bei Diagnosestellung (U-Test nach Mann und Whitney p=0,54)

62

Einfluss von Glukokortikoiden auf die MDR1-Genexpression

Ein Einfluss einer Vorbehandlung mit Glukokortikoiden auf die Höhe der MDR1-

Geneexpression war anhand der vorliegenden Daten nicht nachweisbar (U-Test von Mann

und Whitney p=0,52). Der Median der MDR1 cDNA Kopienzahl pro HPRT cDNA Kopie

betrug bei den 11 vorbehandelten Hunden 2,6 (Spannweite 0,2 bis 132) und bei den 33 nicht

vorbehandelten Hunden 1,3 (Spannweite 0,1 bis 369) (Abbildung 6).

ja neinVorbehandlung mit Glukokortikoiden

0

100

200

300

MD

R1

cDN

A K

opie

n pr

o H

PRT

cDN

A K

opie

RR RR RRR RRRRRR RR

R

RRRRRRR RRRRR RRRRRR

R

RRR RRRR RR

Abbildung 6: MDR1-Genexpression im Tumorgewebe bei Diagnosestellung von an multizentrischem Lymphom erkrankten Hunden, die mit Glukokortikoiden vorbehandelt waren (n=11), und von an malignem Lymphom erkrankten Hunden, bei denen keine Vorbehandlung mit Glukokortikoiden durch den Haustierarzt erfolgt war (n=33) (U-Test nach Mann und Whitney p=0,521)

63

Einfluss der MDR1-Genexpression auf die Therapieantwort

Von 3 Patienten, bei denen die MDR1-Genexpression im Tumorgewebe höher als im

unveränderten Lymphknotengewebe der Kontrolltiere war (>Ln.), reagierte keiner auf die

Chemotherapie mit einer Vollremission (CR). Bei einem Hund honnte eine Teilremission

(PR), bei den anderen beiden Hunden kein Rückgang des Tumors (NC) erreicht werden. Im

Vergleich dazu reagierten 27 von 29 Hunden, bei denen die MDR1-Genexpression gegenüber

dem Lymphknotengewebe der Kontrolltiere nicht erhöht war (≤ Ln.), auf die Chemotherapie

mit einer kompletten Remission (Abbildung 7).

Die Überprüfung des beobachteten Zusammenhangs zwischen der Höhe der

MDR1-Genexpression (> Ln. gegenüber ≤ Ln.) und der Therapieantwort (CR gegenüber PR

oder NC) auf statistische Signifikanz ergab eine deutliche Assoziation zwischen dem

Fortbestehen klinischer Anzeichen einer Tumorerkrankung (PR oder NC) und einer erhöhten

MDR1-Genexpression im Tumorgewebe vor Therapiebeginn (Fishers exakter Test; p= 0.002)

MDR1 Genexpression vor Therapiebeginn

> Ln.= Ln.< Ln.

Anz

ahl a

n P

atie

nten

30

20

10

0

NC

PR

CR2

4

23

Abbildung 7: MDR1-Genexpression im Tumorgewebe an malignem Lymphom erkrankter Hunde vor Beginn der ersten (n=25) bzw. zweiten Chemotherapie (n=7) und jeweilige Therapieantwort der Patienten. Ln.: Lymphknotengewebe der Kontrolltiere; NC: kein deutlicher Tumorrückgang; PR: Teilremission; CR: Vollremission

64

Einfluss der MDR1-Genexpression auf das rezidivfreie Intervall

Aufgrund des nachgewiesenen Zusammenhanges zwischen der Remissionsdauer und dem

Immunphänotyp, der anatomischen Form und der Anzahl vorangegangener Chemotherapien

wurden nur Hunde mit einem multizentrischen B-Zell-Lymphom und die Dauer des ersten

RFIs in der Analyse berücksichtigt.

Von den 19 an einem multizentrischen B-Zell-Lymphom erkrankten therapierten Hunden

wiesen 16 zum Zeitpunkt der Diagnosestellung eine in Relation zu unverändertem

Lymphknotengewebe erniedrigte MDR1-Genexpression auf (Gruppe IIb). Bei den restlichen 3

Hunden entsprach die Höhe der MDR1-Genexpression den in den Lymphknoten der

Kontrolltiere gemessenen Werten (Gruppe IIa). Die Spannweite des ersten RFI reichte in der

Gruppe IIa von 30 bis 93 Tagen und in der Gruppe IIb von 126 bis 511 Tagen. Der Log-

Rang-Test ergab einen p-Wert von 0,0001 (Abbildung 8).

RFI in Tagen

6004002000

Kum

. re

zidi

vfre

ies

Übe

rlebe

n

1,0

,8

,6

,4

,2

0,0

Abbildung 8: Dauer des ersten rezidivfreien Intervalls (RFI) der Hunde mit multizentrischem B-Zell-Lymphom (n=19) als Kaplan-Meier Überlebenszeitkurve. Gestrichelte Linie: Patienten, bei denen die MDR1-Genexpression im Tumor niedriger als im Lymphknotengewebe der Kontrolltiere war (Gruppe IIb, n=16). Durchgezogene Linie: Hunde, bei denen die Höhe der MDR1-Genexpression im Tumor den in den Lymphknoten der Kontrolltiere gemessenen Werten entsprach (Gruppe IIa; n=3)

65

MDR1-Genexpresssion in Tumorrezidiven

Bei 12 Hunden konnte sowohl vor Therapiebeginn als auch bei Ausbildung des ersten

Tumorrezidivs eine Gewebeprobe entnommen werden.

Ein deutlicher (≥ Faktor 2) Anstieg der MDR1-Genexpression im Tumorrezidiv war bei 7

Hunden nachweisbar (Tabelle 22). Bei einem Hund wurde ein undeutlicher Anstieg (Faktor

1,8), bei 4 Patienten keine nennenswerte Änderung (Faktor 0,6 bis 1,1) der MDR1-

Genexpression vermerkt.

Im Wilcoxon-Test erwies sich der Anstieg der MDR1-Genexpression zum Zeitpunkt des

ersten Rezidivs als signifikant (p=0,032).

Tabelle 22: MDR1 cDNA Kopienzahl pro HPRT cDNA Kopie im Tumorgewebe von an malignem Lymphom erkrankten Hunden (n=12) bei Diagnosestellung und bei Ausbildung des ersten Tumorrezidivs sowie der errechnete Anstiegsfaktor (1.Rezidiv/Diagnose)

MDR1 Kopien pro HPRT Kopie Tier-Nr.

Diagnose 1. Rezidiv Faktor

P07 0,4 0,3 0,8 P09 1,3 0,8 0,6 P11 1,7 3,6 2,1 P12 2,6 2,9 1,1 P22 1,8 1,7 0,9 P26 0,5 5,7 11,4 P28 4,6 8,1 1,8 P30 0,4 1,1 2,8 P32 1,5 7,3 4,9 P39 1,0 2,0 2,0 P42 0,3 0,6 2,0 P46 5,2 39,4 7,6

66

Beim Vergleich der Länge des ersten RFIs von Patienten mit und ohne Anstieg der MDR1-

Genexpression im Tumorrezidiv zeigten sich deutliche Unterschiede. Die mittlere Dauer des

ersten RFI war bei den 8 Patienten, bei denen eine gesteigerte (≥ Faktor 1,8) MDR1-

Genexpression im Tumorrezidiv nachweisbar war, deutlich kürzer (Median 133 Tage,

95% Konfidenzintervall 90 bis 176 Tage) als bei den 4 Hunden ohne einem Anstieg der

MDR1-Genexpression im Tumorrezidiv (Median 312 Tage, 95% Konfidenzintervall 216 bis

408 Tage). Im Log-Rang-Test erwies sich der Unterschied als signifikant (p=0,012).

RFI in Tagen

6004002000

Kum

. re

zidi

vfre

ies

Übe

rlebe

n

1,0

,8

,6

,4

,2

0,0

Abbildung 9: Kaplan-Meier Überlebenszeitkurve des rezidivfreien Intervalls (RFI), getrennt für Hunde mit einem Anstieg (≥ Faktor 1,8) der MDR1-Genexpression bei Rezidivierung (durchgezogene Linie) und für Hunde ohne einem deutlichen Anstieg (< Faktor 1,1) der MDR1-Genexpression bei Rezidivierung (gestrichelte Linie)

67

4.6.3 MRP1- und MRP2-Genexpression

4.6.3.1 Leber- und Lymphknotengewebe der Kontrolltiere

Eine Expression des MRP1 Gens war sowohl in allen untersuchten Leber- (n=14) als auch

Lymphknotenproben (n=14) mittels der etablierten qPCR nachweisbar. Die Höhe der

Expression war im unveränderten Lebergewebe mit durchschnittlich 25 (SD 13) MRP1 cDNA

Kopien pro HPRT cDNA Kopie deutlich niedriger als im Lymphknotengewebe (130 (SD 57)

MRP1 cDNA Kopien pro HPRT cDNA Kopie; p<0,001) (Abbildung 10).

Zwischen den gesunden Beaglen (Leber: n=6; Lymphknoten: n=8) und den Hunden aus dem

Patientenkollektiv der Klinik für kleine Haustiere (Leber: n=8; Lymphknoten: n=6)

unterschied sich die Höhe der MRP1-Genexpression in beiden Geweben nur undeutlich

(Leber: p=0,435; Lymphknoten: p=0,387) (Abbildung 10).

Lymphknoten LeberGewebe

0

50

100

150

200

MR

P1 c

DN

A K

opie

n pr

o H

PRT

cDN

A K

opie

A

B

AB

Beagle

Beagle

" Sonstige"

" Sonstige"

Abbildung 10: MRP1-Genexpression in unverändertem Leber- und Lymphknotengewebe von gesunden Beaglen (Leber: n=6; Lymphknoten: n=8) und Hunden aus dem Patientenkollektiv der Klinik für kleine Haustiere („Sonstige“) (Leber: n=8; Lymphknoten: n=6)

68

Die Höhe der MRP1-Geneexpression im unveränderten Lymphknotengewebe variierte

zwischen Biopsien von verschiedenen Beaglen (nur Popliteallymphknoten; n=9) stärker als

zwischen Biopsien von verschiedenen Lymphknoten (n=7) desselben Beagles (Spannweite 59

bis 247 bzw. 114 bis 221 MRP1 cDNA Kopien pro HPRT cDNA Kopie).

Es bestand keine deutliche Korrelation zwischen der Höhe der MRP1-Genexpression im

Lebergewebe und im Lymphknotengewebe der Kontrolltiere (n=10; R=-0,007; p=0,985)

(Abbildung 11).

MRP1 Kopien pro HPRT Kopie / Lymphknoten

3002001000

MR

P1 K

opie

n pr

o H

PRT

Kop

ie /

Lebe

r

100

75

50

25

0

Abbildung 11: Korrelation der Höhe der MRP1-Genexpression in Leber- und Lymphknotengewebe der Kontrolltiere (n=10) (R=-0,007; p=0,985)

Eine deutliche Expression des MRP2-Gens (>10 Kopien pro 50 ng Gesamt-RNA) war nur in

den Leberproben, nicht aber im unveränderten Lymphknotengewebe nachweisbar.

Durchschnittlich waren im Lebergewebe 21 (SD 13) MRP2 cDNA Kopien pro HPRT cDNA

Kopie enthalten. Ein signifikanter Unterschied in der Höhe der MRP2-Geneexpression

zwischen den Beaglen (n=6) und den Hunden aus dem Patientenkollektiv der Klinik (n=8)

bestand nicht (p=0,662).

69

4.6.3.2 Maligne Lymphome

Eine Expression des MRP1-Gens war bei allen 50 an malignem Lymphom erkrankten Hunden

bei Diagnosestellung im Tumorgewebe nachweisbar. Die Höhe der MRP1-Genexpression

variierte zwischen den Patienten und reichte von 11 bis 2499 (Median 268) MRP1 cDNA

Kopien pro HPRT cDNA Kopie.

Eine in Relation zu den im Lymphknotengewebe der Kontrolltiere gemessenen Werten

(Spannweite 55 bis 247 MRP1 cDNA Kopien pro HPRT cDNA Kopie) erniedrigte MRP1-

Genexpression wiesen acht Lymphome auf (Abbildung 11). Bei 28 Lymphomen lag die Höhe

der MRP1-Genexpression über den im Lymphknotengewebe der Kontrolltiere gemessenen

Werten.

< Ln. = Ln. > Ln.MRP1-Genexpression bei Diagnose

5

10

15

20

25

Anz

ahl a

n Pa

tient

en

n=8 n=14 n=28

Abbildung 12: MRP1-Genexpression im Tumorgewebe von an malignem Lymphom erkrankten Hunden bei Diagnosestellung (n=50). Ln.: Lymphknotengewebe der Kontrolltiere (n=15)

Im Gegensatz zu MRP1 war eine deutliche Expression des MRP2-Gens (>10 MRP2 cDNA

Kopien pro 50 ng Gesamt-RNA) in keinem der untersuchten Lymphome bei Diagnosestellung

nachweisbar.

70

Vergleich von multizentrischen und gastrointestinalen Lymphomen

Durchschnittlich (Median) waren bei den Hunden mit multizentrischem Lymphom (n=44) im

Tumorgewebe 273 (Spannweite 11 bis 2499) und bei den an einem gastrointestinalen

Lymphom erkrankten Patienten (n=6) 192 (Spannweite 11 bis 542) MRP1 cDNA Kopien pro

HPRT cDNA Kopie bei Diagnosestellung nachweisbar (Abbildung 13). Der Unterschied

zwischen Lymphomen unterschiedlicher anatomischer Lokalisation erwies sich im U-Test

nach Mann und Whitney als nicht signifikant (p=0,179).

multizentrisch gastrointestinalanatomische Form

0

1000

2000

MR

P1 c

DN

A K

opie

n pr

o H

PRT

cDN

A K

opie

R R

R

R

R

RRRR

R

RR

RR

R

RR

R

R

R

R

RR

R R

R

RRR

R

R

RRRRRRRRR

R

RRRRR

R

R

R

R

Abbildung 13: MRP1-Genexpression im Tumorgewebe bei Diagnosestellung von Hunden mit einem multizentrischen (n=44) und Hunden mit einem gastrointestinalen Lymphom (n=6) (U-Test von Mann und Whitney: p=0,179)

71

Vergleich von B-Zell- und T-Zell-Lymphomen

Die Höhe der MRP1-Genexpression unterschied sich im U-Test nach Mann und Whitney

deutlich (p=0,001) zwischen Hunden mit multizentrischem T- Zell- und B-Zell-Lymphom.

Bei Hunden mit einem B-Zell-Lymphom (n=28) waren durchschnittlich 406 (Spannweite 142

bis 2499), bei den an einem T-Zell-Lymphom erkrankten Patienten (n=8) durchschnittlich 95

(Spannweite 11 bis 735) MRP1 cDNA Kopien pro HPRT Kopie nachweisbar.

B-Zell-Lymphom T-Zell-LymphomImmunphänotyp

0

1000

2000

MR

P1 c

DN

A K

opie

n pr

o H

PRT

cDN

A K

opie

RRR

R

RR

R

R

RR

RRR

R

R

RRR

R

R

RR

RRRR

R

RR RRR

R

R

R

R

Abbildung 14: Vergleich der MRP1-Genexpression in multizentrischen T-Zell-Lymphomen (n=8) und B-Zell-Lymphomen (n=18) bei Diagnosestellung (U-Test nach Mann und Whitney p=0,001)

72

Einfluss von Glukokortikoiden auf die MRP1-Genexpression

Aufgrund des Einflusses des Immunphänotyps auf die Höhe der MRP1-Genexpression

wurden nachfolgend nur Hunde mit einem B-Zell-Lymphom berücksichtigt.

Hunde, die bei Diagnosestellung mit Glukokortikoiden vorbehandelt waren, wiesen im

Durchschnitt eine höhere MRP1-Genexpression im Tumorgewebe auf (Median 508,

Spannweite 407 bis 2499 MRP1 cDNA Kopien pro HPRT Kopie) als nicht mit

Glukokortikoiden vorbehandelte Hunde (Median 355, Spannweite 142 bis 1551 MRP1 cDNA

Kopien pro HPRT Kopie) (Abbildung 15). Im U-Test nach Mann und Whitney erwies sich

der Unterschied jedoch als nicht signifikant (p=0,055).

ja neinVorbehandlung mit Glukokortikoiden

500

1000

1500

2000

2500

MR

P1 c

DN

A K

opie

n pr

o H

PRT

cDN

A K

opie

RRR

R

RR

R

R RRRR

R

RRR

R

R

RRRRRRR

R

R

R

Abbildung 15: MRP1-Genexpression im Tumorgewebe bei Diagnosestellung von an multizentrischem B-Zell-Lymphom erkrankten Hunden, die mit Glukokortikoiden vorbehandelt waren (n=7), und von Hunden, bei denen keine Vorbehandlung mit Glukokortikoiden durch den Haustierarzt erfolgt war (n=21) (U-Test nach Mann und Whitney p=0,055)

73

Einfluss der MRP1-Genexpression auf die Therapieantwort

Ingesamt reagierten 8 von 9 (89%) der Patienten, bei denen die Höhe der MRP1-

Genexpression im Tumorgewebe den im Lymphknotengewebe der Kontrolltiere gemessenen

Werten entsprach (=Ln.), mit einer Vollremission auf die erste bzw. zweite Chemotherapie.

Bei den Patienten mit einer in Relation zu unverändertem Lymphknotengewebe erhöhten

MRP1-Genexpression (>Ln.) konnte in 19 von 23 (83%) der Fälle eine Vollremission erzielt

werden. Die Überprüfung auf statistische Signifikanz ergab keine deutliche Assoziation

zwischen der Therapieantwort (CR gegenüber PR oder NC) und der MRP1-Genexpression im

Tumorgewebe vor Therapiebeginn (>Ln. gegenüber =Ln.) (Fishers exakter Test: p= 0,65).

MRP1-Genexpression

>Ln.= Ln.

Anz

ahl a

n Pa

tient

en

30

20

10

0

Therapieantwort

NR

PR

CR

2

2

19

8

Abbildung 16: MRP1-Genexpression im Tumorgewebe von an Lymphom erkrankten Hunden vor Beginn der ersten (n=25) bzw. zweiten Chemotherapie (n=7) und Therapieantwort der Patienten. Ln.: Lymphknotengewebe der Kontrolltiere; NR: kein deutlicher Tumorrückgang; PR: Teilremission; CR: Vollremission

74

Einfluss der Höhe der MRP1-Genexpression auf das rezidivfreie Intervall

Aufgrund des nachgewiesenen Zusammenhanges zwischen der Remissionsdauer und dem

Immunphänotyp, der anatomischen Form und der Anzahl vorangegangener Chemotherapien

wurden nur Hunde mit einem multizentrischem B-Zell-Lymphom und die Dauer des ersten

rezidivfreien Intervalls in der Analyse berücksichtigt.

Von den 19 an einem multizentrischen B-Zell-Lymphom erkrankten therapierten Hunden

wiesen 15 zum Zeitpunkt der Diagnosestellung eine in Relation zu unveränderten

Lymphknotengewebe erhöhte MRP1-Genexpression auf (Gruppe I). Bei den restlichen

4 Hunden entsprach die Höhe der MRP1-Genexpression den in den Lymphknoten der

Kontrolltieren gemessenen Werten (Gruppe IIa).

Das mittlere erste RFI (Median) war bei den Hunden der Gruppe IIa (MRP1-Genexpression =

Ln.) 224 Tage (95% Konfidenzintervall 67 bis 381 Tage) und bei Hunden der Gruppe I

(MRP1-Genexpression > Ln.) 281 Tage (95% Konfidenzintervall 166 bis 396 Tage). Der

Log-Rang-Test ergab einen p-Wert von 0,323.

75

MRP1-und MRP2-Genexpresssion bei Tumorrezidiven

Bei 12 Hunden konnten sowohl vor Therapiebeginn als auch bei Ausbildung des ersten

Tumorrezidivs Gewebeproben entnommen werden.

Im Wilcoxon-Test erwiesen sich die Unterschiede in der MRP1-Genexpression im

Tumorgewebe zwischen den beiden Untersuchungszeitpunkten (Diagnose und erstes Rezidiv)

als nicht signifikant (p=0,53).

Nur bei einem Hund war ein deutlicher (≥ Faktor 2) Anstieg der MRP1-Genexpression

zwischen Diagnose und erstem Rezidiv nachweisbar (Tabelle 23). Bei allen anderen

schwankte die Höhe der MRP1-Genexpression zwischen den Untersuchungszeitpunkten nur

unwesentlich (Faktor 0,5 bis 1,4).

Im Gegensatz zum MRP1-Gen war keine deutliche Expression des MRP2-Gens (>10 MRP2

cDNA Kopien pro 50 ng Gesamt-RNA) in den untersuchten Tumorrezidiven nachweisbar.

Tabelle 23: MRP1 cDNA Kopienzahl pro HPRT cDNA Kopie im Tumorgewebe bei Diagnosestellung und Ausbildung des ersten Tumorrezidivs bei 12 an multizentrischem Lymphom erkrankten Hunden und errechneter Anstiegsfaktor

MRP1 Kopien pro HPRT Kopie Tier-Nr.

Diagnose 1. Rezidiv Faktor

P07 475 445 0,9 P09 355 344 1,0 P11 229 220 1,0 P12 380 424 1,1 P22 406 1095 2,7 P26 1057 913 0,9 P28 507 517 1,0 P30 870 545 0,6 P32 141 96 0,7 P39 142 132 0,9 P42 171 283 1,7 P46 475 461 1,0

76

4.7 RT-PCR zum Nachweis von Survivin mRNA

Mit allen drei PCR-Assays war eine Expression von Survivin mRNA in menschlichem

Kolonkarzinomgewebe nachweisbar (Tabelle 24). In Plazentagewebe vom Hund war dagegen

mit keinem der Primerpaare eine Expression von Survivin mRNA detektierbar.

Bei zwei Primerpaaren ließ sich das jeweilige PCR-Produkt aus genomischer DNA vom

Menschen, nicht aber aus genomischer DNA vom Hund amplifizieren (Tabelle 24).

Tabelle 24: Ergebnisse der zum Nachweis von Survivin durchgeführten PCR-Assays

Primerpaar Template Spezies

SURV1 SURV2 SURV3

cDNA Kolonkarzinom Mensch positiv positiv positiv

cDNA Plazenta Hund negativ negativ negativ

gDNA Hund negativ negativ negativ

gDNA Mensch negativ positiv positiv

77

4.8 Immunhistochemische Untersuchung der P-Glykoproteinexpression

Zum immunhistochemischen Nachweis von P-Glykoprotein wurde der Antikörperklon C219

verwendet. Die Färbung wurde an Lebergewebe etabliert. Das Färbemuster im Lebergewebe

(multifokale Färbung der kanikulären Oberfläche der Hepatozyten) entsprach den Angaben

zur P-Glykoproteinexpression im Lebergewebe aus der Literatur (GINN 1996).

Nach Etablierung des Antikörpers wurde bei 20 der an malignem Lymphom erkrankten

Hunden die Expression von P-Glykoprotein im Tumorgewebe bei Diagnosestellung

untersucht. Bei 19 von 20 Hunden reagierten nur einzelne Tumorzellen mit dem Antiköper

gegen P-Glykoprotein (< 1%) (Abbildung 17). Nur bei einem Patienten (Tier-Nr.P20) ließen

sich multifokal Tumorzellgruppen mit dem Antikörperklon C219 anfärben (Abbildung 17).

Bei dem Tumor dieses Patienten handelte es sich um ein gastrointestinales, nicht mit

Glukokortikoiden vorbehandeltes Lymphom, welches nicht auf eine Chemotherapie reagierte.

Die Höhe der MDR1-Genexpression betrug bei dem Lymphom mit der deutlichen

P-Glykoproteinexpression 50 MDR1 cDNA Kopien pro HPRT cDNA Kopie. Bei den

restlichen 19 Hunden, bei denen nur sehr wenige Tumorzellen mit dem Antikörperklon C219

reagierten, war die mittels RT-qPCR gemessene Höhe der MDR1-Genexpression im

Tumorgewebe dagegen mit 0,4 bis 16 MDR1 cDNA Kopien pro HPRT cDNA Kopie deutlich

niedriger.

78

Abbildung 17: Immunhistochemischer Nachweis von P-Glykoprotein. Oberes Bild. Lymphom, bei dem nur einzelne Zellen mit dem Antikörperklon C219 reagierten. Umteres Bild. Lymphom mit deutlicher Immunreaktivität gegen den Antikörperklon C219 (Balken = 50 µm)

79

5 DISKUSSION

Voraussetzung für die Durchführung von klinischen Studien zur MDR beim Hund ist die

Möglichkeit, die Expression von Zellmembranproteinen, die eine Vielfachresistenz vermitteln

können, in Tumorbiopsien reproduzierbar quantifizieren zu können. Zur Untersuchung der P-

Glykoprotein-, MRP1- und MRP2-Expression stehen verschiedene Verfahren zur Verfügung

(BECK et al. 1996; BROXTERMAN et al. 1996). Die Proteine können mittels monoklonaler

Antikörper nachgewiesen werden oder die Expression der für die Proteiene kodierenden Gene

kann untersucht werden (NOONAN et al. 1990; HERZOG et al. 1992; FLENS et al. 1994;

HIPFNER et al. 1994). Zwar können hohe Expressionsdichten mit allen Verfahren

zuverlässig bestimmt werden, die Messung geringer Expressionsdichten bereitet jedoch

häufig Schwierigkeiten (BECK et al. 1996, BROXTERMAN et al. 1996; MARIE et al. 1997).

Beim Hund werden zur Untersuchung der P-Glykoproteinexpression sowohl

immunhistochemische Techniken als auch Western Blots eingesetzt und zur Bestimmung der

MDR1-Genexpression konventionelle RT-qPCRs verwendet (MOORE et al. 1995; GINN

1996; STEINGOLD et al. 1998). Mit keiner dieser Techniken können jedoch präzise

quantitative Daten, die einen Vergleich der Expressionshöhe zwischen verschiedenen

Geweben, Tumorentitäten oder Krankheitsstadien ermöglichen, erhoben werden.

In der vorliegenden Studie wurde zur Quantifizierung der MDR1-, MRP1- und MRP2-

Genexpression in kaninen Lymphomen eine RT-qPCR im real-time-Modus etabliert. Die

Untersuchungsmethode wurde erstmals 1996 von GIBSON und Mitarbeitern beschrieben

(GIBSON et al. 1996). Als allgemeine Vorzüge der RT-qPCR im real-time-Modus gelten u.a.

eine hohe Spezifität, Sensitivität und Reproduzierbarkeit der Daten, (BUSTIN 2002;

GINZINGER 2002). Als Housekeeping-Gen wurde Hypoxanthinphophoribosyltransferase

(HPRT) verwendet. HPRT wird im Vergleich zu anderen Housekeeping-Genen sehr niedrig

und konstant exprimiert (FOSS et al. 1998). Die in der eigenen Studie gemessenen HPRT

cDNA Kopienzahlen entsprachen in etwa den in den MDR1 niedrig exprimierenden

Lymphomen gemessenen MDR1 cDNA Kopienzahlen. HPRT ist somit als endogenes

Kontrollgen für die etablierten qPCR-Assays geeignet.

80

Zur Beurteilung der Sensitivität der etablierten RT-qPCR wurden Verdünnungen der MDR1-,

MRP1- und MRP2-Standards mit 106 bis 100 Kopien pro 25 µl PCR-Ansatz analysiert.

Sowohl bei MDR1 als auch bei MRP1 und MRP2 konnten 10 Kopien pro PCR-Ansatz sicher

nachgewiesen werden. Die Streuung der Ct-Werte innerhalb der als Triplikate gemessenen

Ansätze war relativ gering (SD < 1,25). Dies unterstreicht die Zuverlässigkeit der

Messergebnisse. Zur Bewertung der Reproduzierbarkeit der Messergebnisse wurde der

Variationskoeffizient der Ct-Werte herangezogen. Alle cDNA-Proben wurden in zwei

verschiedenen Messdurchgängen jeweils als Triplikat untersucht. Der Variationskoeffizient

der Ct-Werte innerhalb der Messdurchgänge und zwischen den Messdurchgängen reichte von

0,1% bis 5% und entsprach den von BUSTIN veröffentlichten Empfehlungen (BUSTIN

2000).

Aufgrund der in verschiedenen Studien nachgewiesenen Expression von P-Glykoprotein,

MRP1 und MRP2 in der Leber beim Hund (GINN 1996; CONRAD et al. 2001) wurde

unverändertes Lebergewebe als Positivkontrolle verwendet. Lymphknotengewebe diente als

Vergleichsgewebe. In allen untersuchten Lymphknoten- und Leberproben war eine

Expression von MDR1 mRNA und MRP1 mRNA mittels der etablierten RT-qPCR

nachweisbar. Eine Expression des MRP2-Gens war dagegen nur in unverändertem

Lebergewebe, nicht aber in Lymphknotengewebe sicher detektierbar. Die Höhe der

MRP2-Genexpression war jedoch auffallend niedrig. Beim Menschen wird MRP2 in der

Leber relativ hoch exprimiert. Unterschiede im MRP2-Expressionsmuster zwischen Hund und

Menschen werden vermutet (CONRAD et al. 2001).

Zur Verbesserung der Repräsentativität der Vergleichswerte wurden neben gesunden Beaglen

auch Patienten der Klinik für kleine Haustiere als Kontrolltiere verwendet. Die Höhe der

MDR1-, MRP1- und MRP2-Genexpression im Leber- bzw. Lymphknotengewebe unterschied

sich zwischen den Klinikpatienten und den gesunden Beaglen nicht deutlich. Dies

unterstreicht die Repräsentativität des Kontrollkollektivs.

Die interindividuelle Variation der MDR1-, MRP1- und MRP2-Genexpression im Leber- und

Lymphknotengewebe der Kontrolltiere war verhältnismäßig hoch. Ähnliche Messwert-

schwankungen wurden auch in Lebergeweben von gesunden Menschen gefunden (SCHUETZ

et al. 1995). Ursache und Bedeutung der Schwankungen sind ungeklärt. Möglicherweise

spielen Alter, Abstammung oder Ernährung eine Rolle.

81

In früheren Studien zur P-Glykoproteinexpression beim Hund wurde unverändertes

Lymphknotengewebe als Negativkontrolle verwendet (MOORE et al. 1995; BERGMAN et

al. 1996; LEE et al. 1996). Bemerkenswerterweise war in der eigenen Studie in allen

untersuchten Lymphknotenproben eine Expression des MDR1-Gens mittels RT-qPCR

nachweisbar. Die Höhe der Expression war jedoch deutlich niedriger als in den untersuchten

Lebergeweben. Es ist anzunehmen, dass die in der vorliegenden Studie etablierte RT-qPCR

sensitiver ist als die in anderen Studien verwendeten immunhistochemischen

Nachweisverfahren. Studien, in denen eine Expression von P-Glykoprotein in Lymphozyten

des peripheren Blutes beim Menschen nachgewiesen wurde, unterstützen diese Annahme

(KLIMECKI et al. 1994; LOHRI et al. 1997).

Die Chemotherapie ist derzeit fast immer die Therapie der Wahl bei an malignem Lymphom

erkrankten Hunden (MADEWELL 1999). Zu Beginn der Behandlung kann bei bis zu 90%

der an einem multizentrischem Lymphom erkrankten Hunde ein Tumorrückgang erreicht

werden (ETTINGER 2003). Mittels der etablierten real-time RT-qPCR wurde die MDR1-,

MRP1- und MRP2-Genexpression in 50 Lymphomen bei Diagnosestellung und in

12 Tumorrezidiven quantifiziert. In allen Lymphomen war eine Expression des MDR1-Gens

nachweisbar. In der Mehrzahl der untersuchten Fälle war die Expression jedoch relativ

niedrig. Nur 3 von 50 Lymphomen wiesen bei Diagnosestellung eine in Relation zu gesundem

Lymphknotengewebe gesteigerte MDR1-Genexpression auf. Dieser niedrige Anteil steht im

Einklang mit der im Allgemeinen guten chemotherapeutischen Beeinflussbarkeit der

Lymphome des Hundes zu Behandlungsbeginn.

In früheren Studien konnte eine Expression von P-Glykoprotein mittels Western Blot oder

Immunhistochemie in 3 bis 33 % der Lymphome des Hundes bei Diagnosestellung

nachgewiesen werden (MOORE et al. 1995; GINN 1996; LEE et al. 1996). Ähnlich

variierende Angaben werden für das Non-Hodgkin-Lymphom des Menschen berichtet

(YUEN u. SIKIC 1994). Zumeist wurden zum Nachweis von P-Glykoprotein beim Hund die

Antikörperklone C219 und C494 verwendet (MOORE et al. 1995; BERGMAN et al. 1996;

GINN 1996; LEE et al. 1996) Es ist bekannt, dass die Verwendung unterschiedlicher

Antikörperklone gegen P-Glykoprotein beim Menschen zu abweichenden Färbeergebnissen

führen kann (PILERI et al. 1991; BECK et al. 1996). Ähnliches könnte unter Umständen auch

82

für den Hund gelten. In der eigenen Studie war nur bei einem der 20 immunhistochemisch

untersuchten Lymphome eine deutliche Immunreaktivität mit dem Antikörperklon C219

feststellbar. Im Vergleich zu früheren Studien erscheint dieser Anteil zunächst als

verhältnismäßig gering. In zwei von drei Studien, die ebenfalls den Antikörperklon C219

verwendeten, wurden jedoch ähnlich niedrige Anteile P-Glykoprotein-positiver Lymphome

gefunden (MOORE et al. 1995; GINN 1996).

Interessanterweise wies das stark P-Glykoprotein-positive Lymphom eine deutlich höhere

MDR1-Genexpression auf als die restlichen 19 immunhistochemisch untersuchten

Lymphome. Eine Korrelation zwischen der Höhe der MDR1-Genexpression und der

Expression von P-Glykoprotein wurde beim Menschen u.a. bei Non-Hodgkin-Lymphomen

beschrieben (LIU et al. 2001). Im Allgemeinen war nur bei Non-Hodgkin-Lymphomen mit

einer relativ hohen MDR1-Expression auch eine Expression von P-Glykoprotein

immunhistochemisch nachweisbar (LIU et al. 2001). Nach den eigenen Untersuchungs-

ergebnissen kann eine Korrelation zwischen der Expressionsdichte von P-Glykoprotein und

der Höhe der MDR1-Genexpression ebenfalls vermutet werden.

Die etablierte RT-qPCR bietet zwar gegenüber dem immunhistochemischen Nachweis den

Vorteil der höheren Sensitivität, ermöglicht aber im Gegensatz zur Immunhistologie keine

morphologische Zuordnung der Expression. Somit ist eine Beeinflussung der

Untersuchungsergebnisse durch einen hohen Gehalt an nicht neoplastisch entarteten Zellen

denkbar. Bisher gelang es jedoch nicht, einen deutlichen Einfluss einer Kontamination mit

T-Lymphozyten auf die gemessene Höhe der MDR1-Genexpression in Lymphomen des

Menschen nachzuweisen (KANG et al. 1995). Dennoch erscheint eine gewisse Beeinflussung

möglich. Der Einsatz neuerer Techniken zur Gewebeisolierung könnte zur Klärung dieser

Problematik dienlich sein.

Maligne Lymphome können sich sowohl in ihrem pathologisch-anatomischen

Erscheinungsbild als auch in ihren tumorbiologischen Eigenschaften erheblich unterscheiden

(FAN 2003). Unter anderem gelten gastrointestinale Lymphome als im Allgemeinen

schlechter chemotherapeutisch beeinflussbar als multizentrische Verlaufsformen (COUTO et

al. 1989). Interessanterweise war in der vorliegenden Studie die mittlere Höhe der MDR1-

Genexpression im Tumorgewebe von Hunden mit gastrointestinalen Lymphomen bei

Diagnosestellung deutlich höher als bei Patienten mit multizentrischen Verlaufsformenn. Bei

83

gesunden Hunden unterschied sich die Höhe der MDR1-Genexpression zwischen

Darmlymphknoten und Lymphknoten anderer Körperregionen dagegen nicht. Eine

Chemotherapie wurde nur bei zwei der Hunde mit einem gastrointestinalen Lymphom

durchgeführt. Ein Patient reagierte mit einer Teilremission, der andere mit einem stationären

Tumorverhalten. Ein direkter Zusammenhang zwischen der höheren MDR1-Genexpression

und der schlechteren therapeutischen Beeinflussbarkeit gastrointestinaler Lymphome lässt

sich somit vermuten. Inwieweit sich dieser Zusammenhang in zukünftigen Studien bestätigt,

bleibt allerdings abzuwarten.

In zwei früheren Studien wurde bereits eine prognostische Relevanz der Expression von

P-Glykoprotein für die Überlebenszeit von Hunden mit malignem Lymphom beschrieben

(BERGMAN et al. 1996; Lee et al. 1996). Dagegen konnten Steingold und Koautoren keinen

Zusammenhang zwischen der Höhe der MDR1-Genexpression und dem Therapieerfolg

nachweisen (STEINGOLD et al. 1998).

In der eigenen Studie bestand eine deutliche Assoziation zwischen der Höhe der MDR1-

Genexpression und der Therapieantwort. So konnte bei keinem der Lymphome mit einer

gesteigerten MDR1-Genexpression durch die Chemotherapie eine vollständigen Rückbildung

des Tumors erreicht werden. Auch die Länge des ersten rezidivfreien Intervalls war bei den

Patienten mit einer erniedrigten MDR1-Genexpression vor Therapiebeginn deutlich länger als

bei Hunden, bei denen die gemessenen Werte den in gesundem Lymphknotengewebe

ermittelten normalisierten MDR1 cDNA Kopienzahlen entsprachen. Die Ergebnisse lassen

eine Relevanz der gesteigerten MDR1-Expression für den Behandlungserfolg bei einem Teil

der untersuchten Patienten vermuten.

Bei verschiedenen Tumoren des Menschen wurde eine Zunahme der P-Glykoprotein- bzw.

MDR1-Genexpression im Therapieverlauf nachgewiesen. 1979 wurde von GOLDIE und

COLDMAN ein Modell aufgestellt, nach dem - ausgehend von einer Mutationsrate von 10–5

bis 10–6 - die Wahrscheinlichkeit, bereits in einem Tumor mit 107 Zellen keine resistenten

Tumorzellen zu finden, äußerst gering ist (GOLDIE u. COLDMAN 1979). Etwaige resistente

Tumorzellen weisen unter dem Selektionsdruck der Chemotherapie einen Überlebensvorteil

auf. Letztendlich entsteht ein therapierefraktäres Tumorrezidiv (NÜSSLER u. GIESELER

2000). In der vorliegenden Studie konnte bei 7 von 12 Patienten ein deutlicher Anstieg der

MDR1-Genexpression zwischen Diagnosestellung und Rezidivausbildung nachgewiesen

84

werden. Interessanterweise war bei diesen Patienten auch die Länge des rezidivfreien

Intervalls gegenüber den Patienten ohne Anstieg der Höhe der MDR1-Genexpression im

Tumorrezidiv deutlich verkürzt.. Bei vier der Patienten mit einem Anstieg der MDR1-

Genexpression im Tumorrezidiv wurde die Chemotherapie wiederholt. Bei einem Patienten

erwies sich das Lymphom als therapierefraktär, bei den restlichen drei Patienten konnte eine

vollständige Remission erzielt werden. Bemerkenswerterweise war bei dem Patienten mit

dem therapierefraktären Lymphom die MDR1-Genexpression deutlich höher als bei den

restlichen Patienten. Die Ergebnisse der Studie zeigen, dass bei einem Teil der Lymphome

des Hundes die MDR1-Genexpression im Therapieverlauf ansteigt. Ein Zusammenhang

zwischen einem Anstieg der MDR1-Genexpression im Tumorrezidiv und der Abnahme der

chemotherapeutischen Beeinflussbarkeit ist zu vermuten.

Im Gegensatz zur Expression von P-Glykoprotein ist über die klinische Relevanz der

Expression von MRP1 und MRP2 beim malignen Lymphom des Hundes, soweit aus der

Literatur ersichtlich, noch nichts bekannt. In der vorliegenden Studie konnte bei einem

Patienten mit einer geringen MDR1-Genexpression kein vollständiger Tumorrückgang

erreicht werden. Somit ist ein Vorkommen alternativer Resistenzmechanismen bei kaninen

Lymphomen zu vermuten.

Beim Menschen wurde bereits eine Expression des MRP1 in Non-Hodgkin-Lymphomen

nachgewiesen und eine Beteiligung bei der Ausprägung von Zytostatikaresistenzen bei einem

Teil der Patienten vermutet (FLENS 1996; ZHAN et al. 1997). In der vorliegenden Studie war

MRP1 mittels real-time RT-qPCR in allen untersuchten Lymphomen nachweisbar. Ein

Zusammenhang zwischen der Höhe der MRP1-Genexpression und der Therapieantwort oder

der Länge des rezidivfreien Intervalls war jedoch nicht feststellbar. Ein deutlicher Anstieg der

MRP1-Expression zum Zeitpunkt des ersten Rezidivs war ebenfalls nur bei einem von 12

Patienten nachweisbar. Die Ergebnisse lassen vermuten, dass MRP1 bei der Mehrheit der

untersuchten Hunde als Resistenzmechanismus nicht von wesentlicher Bedeutung war.

Inwieweit die MRP1-Überexpression bei dem Patienten mit der gesteigerten MRP1-

Expression bei Rezidivausbildung von klinischer Relevanz war, ist ungewiss. Zwar kann in

vitro durch eine Steigerung der MRP1-Expresssion um 50% eine deutliche Herabsetzung der

Empfindlichkeit von Zellen gegen Doxorubicin (Senkung der IC50 um 50%) erzielt werden,

85

jedoch ist die Höhe der MRP1-Genexpression, die in vivo eine MDR vermitteln kann, bisher

nicht bekannt (GRANT et al. 1994; ZHAN et al. 1997).

In Transfektionsversuchen konnte gezeigt werden, dass neben P-Glykoprotein und MRP1

auch MRP2 eine Resistenz gegen verschiedene Zytostatika in vitro vermitteln kann (CUI et

al. 1999). In der vorliegenden Studie war weder in den unveränderten Lymphknotengeweben

noch in den Lymphomen zum Zeitpunkt der Diagnose oder Rezidivausbildung eine deutliche

Expression von MRP2 nachweisbar. Dieses weist darauf hin, dass MRP2 kein

Resistenzmechanismus bei den untersuchten Patienten war.

Schon seit einiger Zeit ist bekannt, dass die MDR1-Genexpression in Zellkulturen beim

Menschen durch Dexamethason zelltypspezifisch aktiviert werden kann (ZHAO et al. 1993).

Eine Behandlung mit Glukokortikoiden vor Chemotherapiebeginn gilt bei Hunden mit

Lymphomen als prognostisch ungünstig (PRICE et al. 1991). BERGMAN (2003) vermutet,

dass die schlechtere chemotherapeutische Beeinflussbarkeit von mit Glukokortikoiden

vorbehandelten Hunden möglicherweise mit einer Induktion der Expression von

P-Glykoprotein im Zusammenhang steht. Zur Prüfung dieser Hypothese wurde in der

vorliegenden Studie die Höhe der MDR1-Genexpression zwischen den mit Glukokortikoiden

vorbehandelten und den nicht mit Glukokortikoiden vorbehandelten Lymphomen verglichen.

Ein deutlicher Unterschied war jedoch nicht feststellbar. Auch bestand zwischen diesen

beiden Patientengruppen kein deutlicher Unterschied in der Länge des ersten rezidivfreien

Intervalls. An Zellkulturen gelang es ZHAO und Mitarbeitern zu zeigen, dass die Induktion

der MDR1-Genexpression durch Dexamethason sowohl zeit- als auch dosisabhängig ist

(ZHAO et al. 1993). Die Intensität und Dauer der Vorbehandlung variierten im eigenen

Patientenkollektiv stark. Es kann somit nicht ausgeschlossen werden, dass die Dosis und

Dauer der Glukokortikoidbehandlung bei einem Teil der untersuchten Patienten zu niedrig

waren, um eine Induktion der MDR1-Genexpression auszulösen.

Über den Effekt von Glukokortikoiden auf die MRP1-Expression ist bisher wenig bekannt.

ZHU und CENTER zeigten, dass der Promotor des humanen MRP1-Gens ein sogenanntes

glucocorticoid response element (GRE) enthält und vermuteten eine mögliche

Expressionssteigerung des MRP1-Gens durch Glukokortikoide (ZHU u. CENTER 1994). In

vitro konnte jedoch kein Einfluss von Dexamethason auf die Expression von MRP1 in

kaninen Osteosarkomzellinien oder humanen Kapillarendothelzellen nachgewiesen werden

86

(MEALEY et al. 2003, TOROK et al. 2003). Überraschenderweise wiesen in der

vorliegenden Studie die mit Glukokortikoiden vorbehandelten Lymphome eine höhere MRP1-

Genexpression auf als die nicht mit Glukokortikoiden vorbehandelten Tumoren. Eine

systematischere Prüfung des Zusammenhanges wäre wünschenswert.

Der Immunphänotyp gilt derzeit als einer der wichtigsten prognostischen Faktoren beim

malignen Lymphom des Hundes (MADEWELL 1999). In zahlreichen Studien ist ein

Zusammenhang zwischen dem Immunphänotyp und der Remissionsdauer oder der

Überlebenszeit aufgezeigt worden (GREENLEE et al. 1990; TESKE et al. 1994; DOBSON et

al. 2001). Es stellt sich somit die Frage, inwieweit sich T-Zell- und B-Zell-Lymphome

hinsichtlich der Höhe der MDR1-Genexpression unterscheiden. Beim Menschen ist eine

Korrelation zwischen der P-Glykoproteinexpression und dem Immunphänotyp von

Lymphomen bereits beschrieben worden (CHENG et al. 1993). Lee und Mitarbeiter konnten

dagegen beim Hund keinen Zusammenhang nachweisen (LEE et al. 1996). In der

vorliegenden Studie unterschied sich die Höhe der MDR1-Genexpression zwischen T-Zell-

und B-Zell-Lymphomen ebenfalls nicht deutlich. Überraschenderweise wiesen Hunde mit

einem T-Zell-Lymphom jedoch eine deutlich niedrigere MRP1-Genexpression im

Tumorgewebe auf als die Patienten mit einem B-Zell-Lymphom. Zukünftige Studien sind

erforderlich, um diese unerwarteten Studienergebnisse zu überprüfen.

Im Gegensatz zu MDR1, MRP1 und MRP2 gelang eine Etablierung einer RT-PCR zum

Nachweis einer Expression von Survivin auf Nukleinsäureebene beim Hund in dieser Studie

nicht. Alle zum Nachweis verwendeten Primer wurden so ausgewählt, dass eine 100%iger

Sequenzhomologie des Amplikons zwischen Mensch und Hund bestand. Zwar gelang der

Nachweis von Survivin in Kolonkarzinomgewebe und genomischer DNA vom Menschen,

jedoch nicht in genomischer DNA oder Plazentagewebe vom Hund. Die Integrität der

verwendeten cDNA und genomischen DNA wurde überprüft. Die Ergebnisse der

durchgeführten Vorversuche lassen weitere Untersuchungen, wie eine Überprüfung der aus

der Genbank entnommenen Survivinsequenz, als notwendig erscheinen.

In verschiedenen Studien wurde das maligne Lymphom des Hundes als mögliches Modell für

das Non-Hodgkin-Lymphom des Menschen vorgeschlagen. Als Voraussetzung für Studien

zur Modulation bestehender Vielfachresistenzen beim malignen Lymphom des Hundes wird

die Etablierung eines sensitiven und reproduktiven Untersuchungsverfahrens zum Nachweis

87

möglicher, mit der Ausprägung einer MDR in Zusammenhang stehender Mechanismen

angesehen. Mit den in der vorliegenden Studie etablierten RT-qPCR-Assays steht ein solches

Nachweisverfahren zur Verfügung.

Die Ergebnisse der Studie lassen vermuten, dass ein Teil der an malignem Lymphom

erkrankten Hunde von einer Modulation der P-Glykoprotein-Transporterfunktion profitieren

würde. Zukünftige Studien sind erforderlich, um diese Patienten prospektiv zu erfassen und

die Wirksamkeit und Sicherheit einer etwaigen Therapie zu prüfen.

88

6 ZUSAMMENFASSUNG

K. Culmsee

Klinische Relevanz der MDR1-, MRP1- und MRP2-Genexpression beim malignen

Lymphom des Hundes

Eine systemische Chemotherapie ist derzeit die Therapie der Wahl bei Hunden mit

multizentrischen Lymphomen. Zwar spricht zu Behandlungsbeginn die überwiegende

Mehrheit der Tumoren sehr gut auf die Chemotherapie an, jedoch sind Rezidive aufgrund

erworbener Vielfachresistenzen (multidrug resistance, MDR) im Therapieverlauf relativ

häufig. Es wird angenommen, dass eine Steigerung der Expression verschiedener Gene, wie

z.B. des multidrug resistance 1–Gens (MDR1); der multidrug resistance associated-protein 1

(MRP1)- und 2 (MRP2)-Gene zur Ausprägung einer MDR führen können.

In der vorliegenden Studie wurde eine Reverse Transkription quantitative-Polymerase-

Kettenreaktion (RT-qPCR) im real time Modus zur Quantifizierung der MDR1-, MRP1- und

MRP2-Genexpression in gesunden und neoplastischen Geweben beim Hund etabliert.

Die MDR1-, MRP1- und MRP2-Genexpression wurde bei 50 an malignem Lymphom

erkrankten Hunden gemessen. Tumorgewebeproben wurden bei allen Patienten zum

Zeitpunkt der Diagnosestellung und bei 12 Hunden zusätzlich bei Ausbildung eines

Tumorrezidivs entnommen. 25 Hunde wurden mit einer Kombinationschemotherapie aus

L-Asparaginase, Vincristin, Cyclophosphamid, Doxorubicin und Prednisolon behandelt.

In allen untersuchten Tumorproben war eine Expression des MDR1- und MRP1-Gens

nachweisbar. Die Höhe der Expression variierte bei beiden Genen zwischen den untersuchten

Proben. Zum Zeitpunkt der Diagnosestellung wiesen 3 von 50 Lymphomen eine im Vergleich

zu unveränderten Lymphknotengewebe erhöhte MDR1- und 28 von 50 Lymphomen eine

erhöhte MRP1-Genexpression auf. Im Gegensatz zum MDR1- und MRP1-Gen war eine

Expression des MRP2-Gens in keinem der untersuchten Lymphome bei Diagnosestellung

oder zum Zeitpunkt des ersten Tumorrezidivs nachweisbar. Gastrointestinale Lymphome

wiesen eine höhere MDR1-Genexpression auf als multizentrische Lymphome (p=0,002).

Lymphompatienten, bei denen die MDR1-Genexpression im Vergleich zum

Lymphknotengewebe der Kontrolltiere nicht erhöht war, reagierten deutlich häufiger auf eine

89

Chemotherapie mit einer Vollremission als Hunde, bei den die MDR1-Genexpression

gesteigert war (p=0,002). So konnte bei keinem von drei Tumoren mit einer MDR1-

Genexpression höher als im Lymphknotengewebe der Kontrolltiere, aber bei 27 von 29

Tumoren ohne gesteigerter MDR1-Genexpression eine Vollremission erreicht werden. Ein

Zusammenhang zwischen der Therapieantwort und der Höhe der MRP1-Genexpression

bestand bei den untersuchten Patienten dagegen nicht (p=0,56).

Bei Patienten mit einem multizentrischen B-Zell-Lymphom unterschied sich die Länge des

ersten rezidivfreien Intervalls in Abhängigkeit zur Höhe der MDR1-Genexpression (p<0,001),

nicht aber in Abhängigkeit zur Höhe der MRP1-Genexpression.

Ein deutlicher Anstieg (≥ Faktor 2) der MDR1-Genexpression zwischen Diagnosestellung und

Rezidivausbildung war bei 7 von 12 Hunden nachweisbar. Dagegen war die Höhe der MRP1-

Genexpression zwischen Diagnosestellung und Rezidivausbildung mit Ausnahme eines

Hundes nicht wesentlich verändert. Bei den Hunden mit einem deutlichen Anstieg der MDR1-

Genexpression zwischen Diagnose und erstem Rezidiv war die mittlere Dauer des

rezidivfreien Intervalls signifikant kürzer (Median 133 Tage, 95% Konfidenzintervall 90 bis

176 Tage) als bei den Hunden ohne deutliche Änderung der MDR1-Genexpression

(n=4;Median 312 Tage, 95% Konfidenzintervall 216 bis 408 Tage; p=0,012).

Die Ergebnisse lassen vermuten, dass MDR1, aber nicht MRP1 oder MRP2 für die

Ausprägung einer Vielfachresistenz bei einem Teil der Patienten von Bedeutung war.

90

7 SUMMARY

K. Culmsee:

Clinical relevance of MRD1, MRP1 and MRP2 gene expression in canine lymphoma

In dogs, systemic chemotherapy for management of multicentric lymphoma is rewarding.

Although the majority of lymphomas initially respond well to chemotherapy, the development

of disease relapse due to multidrug resistance (MDR) is relatively common. Upregulation of

several genes thought to be involved in MDR including multidrug resistance 1 (MDR1),

multidrug resistance-associated protein 1 (MRP1) and 2 (MRP2).

In the present study, a real-time reverse transcription quantitative polymerase chain reaction

assay (RT-qPCR) was established to accurately and reproducibly quantify the expression

levels of MDR1, MRP1 and MRP2 in canine normal and neoplastic tissues.

mRNA levels of MDR1, MRP1 and MRP2 were quantified in 50 dogs with lymphoma by RT-

qPCR. Tumor tissue samples were taken from all dogs at diagnosis and from 12 dogs at the

first relapse. All dogs underwent a combination chemotherapy (L-asparaginase, vincristine,

cyclophosphamide, doxorubicin, prednisolone).

MDR1 and MRP1 gene expression levels were detected in all samples analysed, with varying

copy numbers between the samples. At diagnosis in 3 of 50 lymphomas MDR1 expression

levels were higher than in normal lymph node tissue. Wheras, distinctly higher MRP1

expression levels were measuerd in 28 of 50 lymphomas. In contrast to MDR1 and MRP1, no

significant expression of MRP2 in any of the lymphomas at diagnosis or first relapse was

detectable. Interestingly, gastrointestinal lymphomas expressed higher MDR1-RNA levels

than multicentric lymphomas (p=0,002). When lymphomas were assigned based on their

MDR1 gene expression to groups there was a significant difference in ability to induce

complete (p=0,002) In none of three tumors with MDR1 expression levels higher than in

normal lymph node tissue, but in 27 of 29 tumors with no increase in MDR1 expression a

complete remission was achieved. In contrast there was no association between MRP1 mRNA

expression levels and achievement of complete remission detectable (p=0,56). Also, only high

MDR1 mRNA levels (p<0,001) but not high MRP1 levels, were associated with shorter

relapse-free intervals in dogs with multicentric B-cell lymphoma. There was a significant

91

increase (≥ factor 2) in MDR1 mRNA expression between diagnosis and first relapse in 7 of

12 dogs. Whereas MRP1 mRNA expression levels between diagnosis and first relapse were,

with the exception of one dog, unchanged. In dogs with an increase in MDR1 gene expression

between diagnosis and the first relapse (n=8) the median duration of relapse free interval was

significant shorter (median 133 days, 95% confidence interval 90 to 176 days) than in the

dogs with no clear change in MDR1 gene expression (n=4;median 312 days, 95% confidence

interval 216 to 408 days; p=0,012).

In conclusion the results of this study suggest that in contrast to MDR1, expression of MRP1

and MRP2 may not be a major mechanism of multidrug resistance for the majority of dogs

with lymphoma.

92

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9 ANHANG

9.1 Rasse und Alter der an Lymphom erkrankten Hunde

Tabelle 25: Rasse und Alter der an malignem Lymphom erkrankten Hunde

Tier-Nr. Rasse Alter (Jahre) P1 Dandie-Diamond-Terrier 11 P2 Dobermann 5 P3 Bouvier des Flandres 7 P4 Bouvier des Flandres 7 P5 Kleiner Münsterländer 7 P6 Weimaraner 5 P7 Deutsch-Drahthaar 6 P8 Dandie-Diamond-Terrier 1 P9 Bouvier des Flandres 5 P10 Berner Sennenhund 6 P11 Berner Sennenhund 7 P12 Boxer 6 P13 Neufundländer 4 P14 Riesen Schnauzer 5 P15 West Highland White Terrier 11 P16 Dobermann 7 P17 Rottweiler 4 P18 Schweißhund 7 P19 Schweißhund 5 P20 Dobermann 7 P21 Mischling 5 P22 Berner Sennenhund 5 P23 Mischling 7 P24 Mischling 6 P25 Mischling 7

127

Tabelle 25 Fortsetzung

Tier-Nr. Rasse Alter (Jahre) P26 Mischling 8 P27 Mischling 6 P28 West Highland White Terrier 11 P29 Golden Retriever 8 P30 Deutsche Schäferhund 8 P31 Yorkshire-Terrier 13 P32 Boxer 6 P33 Hovawart 7 P34 Bobtail 6 P35 Staffordshire-Terrier 5 P36 Yorkshire-Terrier 13 P37 Jack-Russel-Terrier 8 P38 West Highland White Terrier 8 P39 Collie 10 P40 West Highland White Terrier 8 P41 Boxer 11 P42 Foxterrier 8 P43 Mischling 11 P44 Golden Retriever 4 P45 Mischling 10 P46 Jack-Russel-Terrier 10 P47 Mischling 7 P48 Golden Retriever 8 P49 Berner Sennenhund 9 P50 Pon 0

128

9.2 Rezepturen der verwendeten Lösungen und Gele

10%iges, neutralgepuffertes Formalin nach LILLIE

100 ml Formalin (37%iges Formaldehyd) werden mit 4 g Natriumdihydrogenphosphat und

6,5 g Dinatriumhydrogenphosphat in 1 l dest. Wasser gelöst.

Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (0,05 molar, pH=7,25)

40g Natriumchlorid und 7,8 g Natriumdihydrogenphosphat werden in etwas weniger als

5 l dest. Wasser gelöst. Der PH-Wert wird mit Normalnatronlauge (ca. 40 ml) auf 7,25

eingestellt und die Lösung mit dest. Wasser auf 5 l aufgefüllt.

Avidin-Biotin-Peroxidase-Komplex (Fa. Vector Laboratories)

Für 1 ml Reagenz werden 1ml PBS, 15 µl Avidin-Lösung (Reagenz A) und 15 µl biotinylierte

Peroxidase (Reagenz B) für 30 min bei Raumtemperatur inkubiert (nach Zugabe der

Reagenzien A und B Lösung jeweils kurz mischen).

Lösung für die enzymhistochemische Farbreaktion (3,3 Diaminobenzidin 0,05%)

Für 200 ml Lösung werden 100 mg 3,3’-Diaminobenzidintetrahydrochlorid (DAB) in

50 ml PBS über mehrere Stunden gelöst (Stammlösung 0,2%ig, Lagerung bei –25 °C im

Dunkeln). Vor Gebrauch wird die Stammlösung 1:4 mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung

verdünnt und filtriert (Faltenfilter, Fa. Schleicher & Schuell). Der filtrierten Lösung werden

2 ml Wasserstoffperoxid (3%ig) zugesetzt.

Färbelösung Hämalaun nach MAYER

Für 2 l Färbelösung werden 1g Hämatoxylin mit 1 l dest. Wasser gelöst. Anschließend werden

in der Hämatoxylinlösung 200 mg Natriumjodat (NaJO3) und 50 g Kalialaun unter Schütteln

gelöst (blauviolette Lösung). Die Lösung wird mit 50 g Chloralhydrat und 1 l Zitronensäure

versetzt (rotviolette Lösung).

129

DEPC-behandeltes destilliertes Wasser (0,01%)

100 mg Diethylpyrocarbonat (DEPC) mit 1 l dest. Wasser in Glasflasche vermischen. Über

Nacht stehen lassen und autoklavieren.

Tris-Borat-EDTA-(TBE)-Puffer (5 x)

Für 1 l einer 5-fach konzentrierten Stocklösung des TBE-Puffers werden 54 g TRIS,

27,5 g Borsäure (H3BO3) und 20 ml 0,5 M EDTA (pH=8) mit dest. Wasser auf 1 l aufgefüllt.

1% iges Agarosegel

Für ein 1%iges Agarosegel werden 1 g Agarose in 100 ml 0,5 x TBE-Puffer suspendiert, in

der Mikrowelle kurz aufgekocht und bei Raumtemperatur auf 50-60 °C abkühlen gelassen.

Nach Zugabe von Ethidiumbromid (10 µg) wird die Lösung in die abgedichtete Gelkammer

mit eingesetzter Taschenschablone gegossen und 30-60 min bei Raumtemperatur bis zur

Gelbildung stehen gelassen.

9.3 Verwendete Formeln und Gleichungen

Berechnung der Gesamt-RNA-Konzentration

c (µg/ml) = OD260 x VF x 40 mg/µl

(c: Gesamt-RNA-Konzentration der Ausgangslösung; VF: Verdünnungsfaktor)

Berechnung der DNA-Konzentration

c (µg/ml) = OD260 x VF x 50 µg/ml

(c: DNA-Konzentration der Ausgangslösung; VF: Verdünnungsfaktor)

Berechnung der PCR-Produktanzahl

1µg eines 4361 bp langen PCR-Produktes entsprechen 2,1 x1011 Moleküle

130

9.4 Ergebnisse der RT-qPCR-Messdurchgänge

Tabelle 26: Ergebnisse der RT-qPCR zur Messung der MDR1-Genexpression in unverändertem Leber- und Lymphknotengewebe. Messdurchgang I. MW: arithmetischer Mittelwert, s: Standardabweichung

Ct-Wert Kopien pro 50 ng Gesamt-RNA MDR1 HPRT MDR1 HPRT Nr.

MW SD MW SD MW SD MW SD - Lebergewebe - K1 25,22 0,01 31,41 0,21 30.053 172 201 27 K2 25,05 0,31 31,33 0,21 34.090 6.978 212 28 K3 24,37 0,02 31,60 0,62 23.597 235 239 87 K4 25,71 0,45 32,04 0,23 22.347 6.278 133 20 K5 24,86 0,44 32,24 0,50 14.847 805 156 54 K6 24,71 0,29 32,73 0,53 42.577 7.983 169 57 K10 26,09 0,15 33,07 0,30 5.506 562 46 8 K11 25,86 0,28 32,64 0,38 9.376 1.862 95 13 K12 25,01 0,11 33,06 0,19 11.310 774 74 10 K13 24,02 0,11 31,28 0,19 28.617 2.121 216 28 K16 23,90 0,11 31,91 0,39 24.207 1.791 135 34 K17 26,13 0,05 33,53 0,33 7.721 254 51 12 K18 25,35 0,20 32,91 0,10 26.234 3.450 154 10 K19 25,31 0,18 32,21 0,01 9.162 1.117 108 0

- Lymphknotengewebe - K1 27,44 0,10 29,72 0,17 4.573 361 571 61 K2 27,52 0,06 30,95 0,20 4.289 175 254 34 K3 27,00 0,18 30,18 0,10 6.075 729 419 27 K4 27,80 0,15 29,20 0,19 3.581 338 805 105 K5 27,73 0,07 30,26 0,33 3.735 156 405 90 K6 28,10 0,14 30,67 0,31 1.684 155 207 44 K7 27,60 0,04 30,07 0,20 4.083 93 452 60 K8 27,84 0,13 30,04 0,02 3.487 305 461 7 K9 / LMD 25,59 0,10 30,29 0,48 4.284 287 339 104 K9 / LMS 25,96 0,18 30,29 0,11 3.209 417 330 24 K9 / LCSD 26,13 0,05 31,09 0,23 3.024 99 196 28 K9 / LCSS 25,77 0,31 30,75 0,24 4.130 725 244 36 K9 / LPD 27,47 0,37 33,97 0,25 3.102 731 80 13 K9 / LPS 25,87 0,38 30,31 0,20 7.456 2.287 246 34 K9 / LJ1 25,02 0,08 30,22 0,34 6.409 339 350 79 K9 / LJ2 25,24 0,14 30,46 0,16 5.549 501 295 30 K10 27,56 0,11 30,33 0,12 4.185 309 381 30 K11 27,41 0,19 31,55 0,30 1.302 167 102 28 K12 29,72 0,16 34,07 0,08 550 58 44 10 K13 27,66 0,24 33,27 0,85 1.106 179 48 25 K14 26,71 0,14 30,88 0,16 5.251 488 314 33 K15 26,95 0,07 31,17 0,12 4.426 216 254 21

131

Tabelle 27: Ergebnisse der RT-qPCR zur Messung der MDR1-Genexpression in unverändertem Leber- und Lymphknotengewebe. Messdurchgang II. MW: arithmetischer Mittelwert, s: Standardabweichung

Ct -Wert Kopien pro 50 ng Gesamt-RNA MDR1 HPRT MDR1 HPRT Nr.

MW SD MW SD MW SD MW SD - Lebergewebe - K1 25,42 0,11 32,79 0,22 11.970 856 106 15 K2 23,60 0,45 31,25 0,28 23.857 6.855 221 39 K3 24,16 0,53 31,87 0,15 16.683 6.114 146 15 K4 24,16 0,21 32,17 0,18 16.035 2.199 120 14 K5 24,99 0,33 32,81 0,35 9.333 2.178 79 18 K6 24,56 0,02 32,45 0,33 17.403 210 73 17 K10 26,10 0,34 35,04 0,67 6.988 1680 56 22 K11 26,09 0,14 34,24 0,52 3.464 324 46 14 K12 25,04 0,19 35,10 0,65 14.030 1798 52 22 K13 23,37 0,07 32,75 0,14 1.397 1.019 119 11 K16 24,25 0,19 31,91 0,33 2.537 2.807 122 27 K17 25,78 0,24 32,32 0,24 9.536 1.539 63 10 K18 25,41 0,15 32,41 0,36 24.286 2.482 120 28 K19 25,65 0,06 32,19 0,58 8.552 343 111 22

- Lymphknotengewebe - K1 26,70 0,22 29,78 0,56 3.654 505 384 26 K2 26,97 0,17 30,63 0,34 3.068 347 238 18 K3 26,43 0,15 30,25 0,17 4.370 418 349 42 K4 26,90 0,16 29,19 0,16 3.182 326 702 75 K5 26,03 0,13 29,58 0,14 5.669 461 543 52 K6 26,43 0,30 29,62 0,09 4.409 823 481 60 K7 25,92 0,09 29,19 0,14 6.077 354 703 63 K8 25,38 0,13 29,06 0,11 8.688 772 756 56 K9 / LMD 26,09 0,60 31,23 0,17 9.388 4.012 819 92 K9 / LMS 25,50 0,29 31,09 0,36 13.190 2.616 912 208 K9 / LCSD 25,64 0,43 30,84 0,10 4.839 1.312 320 21 K9 / LCSS 25,75 0,81 31,16 0,22 12.216 6.921 857 116 K9 / LPD 26,17 0,36 31,28 0,22 7.477 1.578 247 38 K9 / LPS 26,25 0,36 30,92 0,20 8.050 2.000 311 43 K9 / LJ1 24,08 0,38 30,80 0,65 33.620 8.579 1.142 467 K9 / LJ2 24,96 0,47 29,90 0,36 8.567 2.621 523 63 K10 27,19 0,10 30,51 0,10 3.738 242 461 30 K11 27,90 0,10 31,31 0,17 2.347 157 276 30 K12 29,26 0,41 34,37 0,13 323 83 19 2 K13 26,44 0,18 32,37 0,45 2.101 260 78 26 K14 26,38 0,12 30,05 0,23 6.998 1.440 295 45 K15 26,84 0,08 30,16 0,19 4.647 257 274 36

132

Tabelle 28: Ergebnisse der RT-qPCR zur Messung der MDR1-Genexpression in Tumorgewebe von an malignem Lymphom erkrankten Hunden. Messdurchgang I. MW: arithmetischer Mittelwert, s: Standardabweichung


MW SD MW SD MW SD MW SD - Tumorgewebe von an Lymphom erkrankten Hunden bei Diagnosestellung -

P01 29,71 0,33 31,37 0,38 661 136 1.191 305 P02 27,61 0,33 33,44 0,23 782 161 26 4 P03 25,46 0,50 29,23 0,12 3.512 1.104 461 36 P04 30,78 0,41 30,44 0,33 90 23 204 45 P05 28,15 0,13 28,23 0,11 613 54 1.004 76 P06 28,50 0,19 30,66 0,10 487 61 197 13 P07 32,45 0,41 32,08 0,22 74 20 144 21 P08 32,17 0,24 31,11 0,04 89 13 270 7 P09 29,50 0,12 30,57 0,44 508 41 395 106 P10 31,69 0,19 31,82 0,07 64 8 128 6 P11 28,55 0,10 30,60 0,38 530 35 305 73 P12 28,77 0,20 30,95 0,13 407 56 163 15 P13 29,77 0,15 33,06 0,46 233 24 56 18 P14 33,80 0,24 30,90 0,43 21 4 153 42 P15 30,83 0,22 30,58 0,21 152 23 188 27 P16 26,95 0,11 29,34 0,43 2.238 165 878 225 P17 32,84 0,07 30,28 0,58 220 10 347 65 P18 30,81 0,57 30,51 0,35 766 315 369 86 P19 28,90 0,53 30,08 0,35 2.689 969 488 109 P20 28,08 0,04 34,02 0,12 1.354 30 24 2 P21 21,98 0,03 31,32 0,16 71.475 1.633 209 22 P22 30,37 0,14 30,83 0,25 296 27 185 19 P23 31,04 0,06 31,10 0,11 189 8 168 12 P24 27,96 0,08 30,28 0,04 1.210 70 218 7 P25 24,99 0,18 29,62 0,12 10.176 1.155 632 48 P26 30,46 0,22 29,17 0,10 217 32 470 33 P27 27,36 0,02 31,01 0,32 1.832 29 134 29 P28 28,34 0,12 30,94 0,10 1.162 90 268 19 P29 31,87 0,50 29,72 0,04 88 28 624 15 P30 32,36 0,56 30,78 0,26 44 18 163 28 P31 30,23 0,10 29,74 0,33 177 11 329 67 P32 30,55 0,10 31,72 0,86 216 14 154 16

133




P33 27,74 0,17 28,96 0,13 1.380 151 1.284 105 P34 29,91 0,20 29,81 0,25 310 38 622 111 P35 27,08 0,01 31,97 0,25 2.128 10 182 31 P36 29,70 0,19 31,79 0,85 378 47 223 109 P37 32,40 0,35 31,12 0,20 110 26 253 33 P38 27,58 0,12 29,51 0,19 1.434 117 758 105 P39 29,43 0,12 29,49 0,11 775 59 736 51 P40 29,24 0,17 29,93 0,11 480 52 585 41 P41 26,27 0,04 33,95 0,29 3.703 107 33 6 P42 30,18 0,08 28,52 0,06 309 16 1.346 56 P43 28,52 0,28 29,67 0,45 1.287 228 412 123 P44 24,32 0,03 29,04 0,18 12.297 215 1.023 119 P45 27,04 0,28 29,91 0,19 2.071 398 551 70 P46 28,42 0,08 30,29 0,84 1.606 88 274 142 P47 30,84 0,46 30,72 0,40 210 69 308 87 P48 29,63 0,03 32,13 0,44 488 11 156 49 P49 29,49 0,25 30,96 0,47 546 90 348 115 P50 32,99 0,67 30,31 0,02 79 30 463 6

- Tumorgewebe von an Lymphom erkrankten Hunden bei Rezidivausbildung - P07 31,24 0,13 30,42 0,18 68 6 367 45 P09 31,28 0,26 32,18 0,06 135 24 157 7 P11 26,94 0,08 31,40 0,39 4.030 200 1.172 281 P12 29,05 0,14 31,01 0,57 967 96 271 107 P22 31,03 0,11 32,07 0,25 178 13 120 22 P26 27,83 0,15 31,73 0,35 1.222 127 164 37 P28 27,79 0,33 31,48 0,28 1.680 359 180 34 P30 31,07 0,43 31,12 0,06 255 73 240 10 P32 27,21 0,08 31,34 0,21 1.955 97 273 39 P39 28,97 0,60 29,95 0,39 1.186 439 609 170 P42 29,91 0,21 29,13 0,06 636 87 1.126 44 P46 26,82 0,21 32,07 0,32 4.868 672 139 30

134

Tabelle 29: Ergebnisse der RT-qPCR zur Messung der MDR1-Genexpression in Tumorgewebe von an malignem Lymphom erkrankten Hunden. Messdurchgang II. MW: arithmetischer Mittelwert, s: Standardabweichung

C -Wert t Kopien pro 50 ng Gesamt-RNA MDR1 HPRT MDR1 HPRT Nr.

MW SD MW SD MW SD MW SD - Tumorgewebe von an Lymphom erkrankten Hunden bei Diagnosestellung - P01 28,56 0,93 29,38 0,26 554 114 840 132 P02 27,37 0,10 32,99 0,26 1.035 71 42 7 P03 24,99 0,09 28,88 0,24 5.032 305 654 110 P04 30,65 0,50 30,84 0,22 95 6 177 26 P05 28,32 0,19 28,17 0,16 476 60 953 103 P06 28,62 0,15 30,66 0,23 389 39 174 27 P07 32,11 0,29 31,40 0,13 36 7 104 9 P08 31,74 0,06 30,50 0,37 225 10 980 230 P09 29,11 0,15 30,78 0,39 364 36 270 70 P10 31,29 0,11 31,35 0,34 157 11 235 50 P11 28,43 0,08 29,82 0,02 1.023 49 631 8 P12 29,19 0,12 31,41 0,20 621 47 223 28 P13 29,29 0,32 31,67 0,31 1.450 315 510 100 P14 33,37 0,54 30,24 0,17 350 110 4.140 440 P15 30,17 0,02 30,26 0,24 545 8 820 121 P16 27,54 0,12 29,76 0,51 3.022 241 1.164 367 P17 30,58 0,14 30,25 0,53 229 22 346 16 P18 29,25 0,09 30,65 0,72 1.102 64 700 306 P19 27,50 0,17 29,98 0,12 1.758 185 506 40 P20 27,58 0,07 33,24 0,30 1.320 59 31 6 P21 21,32 0,07 30,37 0,23 85.060 3.858 215 32 P22 29,77 0,73 31,80 0,62 263 22 137 16 P23 30,28 0,10 31,16 0,27 242 16 234 43 P24 28,33 0,09 31,52 0,34 2,770 308 498 48 P25 25,19 0,65 29,48 0,20 10.080 521 714 92 P26 31,57 0,41 30,74 0,19 136 34 215 28 P27 28,28 0,06 31,96 0,08 2.045 85 112 7 P28 27,88 0,14 30,30 0,03 1.079 97 225 4 P29 31,42 0,36 30,05 0,02 110 28 421 5 P30 33,13 0,49 32,31 0,16 64 23 107 11 P31 31,29 0,16 30,87 0,04 255 32 242 2 P32 31,98 0,19 31,99 0,05 167 20 109 4

135



MW SD MW SD MW SD MW SD - - Tumorgewebe von an Lymphom erkrankten Hunden bei Diagnosestellung - P33 29,18 0,08 29,42 0,22 1.110 55 659 104 P34 29,92 0,21 30,55 0,13 289 29 315 0 P35 27,98 0,18 31,57 0,25 2.027 244 189 32 P36 30,02 0,10 30,26 0,28 472 31 270 50 P37 31,65 0,36 31,68 0,09 138 31 165 10 P38 27,66 0,14 29,79 0,05 1.493 138 498 19 P39 29,41 0,16 29,74 0,04 579 57 583 12 P40 29,15 0,18 30,46 0,16 527 64 321 33 P41 27,06 0,19 34,44 0,10 5.358 672 36 2 P42 30,73 0,06 29,23 0,15 245 10 814 84 P43 28,17 0,04 30,17 0,12 1.154 26 452 35 P44 24,57 0,74 27,44 0,29 18.472 7.649 1.802 328 P45 28,56 0,12 30,98 0,63 1.534 119 360 158 P46 28,97 0,13 31,26 0,43 1.133 103 247 68 P47 30,34 0,11 30,05 0,29 333 24 252 192 P48 30,29 0,16 30,14 0,48 348 38 157 42 P49* 30,24 0,22 29,88 0,35 724 112 420 156 P50 32,82 0,32 29,38 0,06 86 17 462 19

- - Tumorgewebe von an Lymphom erkrankten Hunden bei Rezidivausbildung - P07 31,45 0,32 29,79 0,27 111 26 309 56 P09 32,59 0,38 33,08 0,85 270 70 350 165 P11 26,85 0,21 30,29 0,41 1.298 185 408 118 P12 29,05 0,10 30,56 0,47 998 66 376 106 P22 30,80 0,09 31,90 0,18 244 15 121 15 P26 29,40 0,31 31,85 0,19 803 174 157 19 P28 27,71 0,17 30,78 0,18 2.676 301 390 46 P30 30,99 0,27 31,09 0,23 137 24 133 21 P32 28,07 0,10 31,15 0,18 1.865 122 236 30 P39 28,41 0,09 28,53 0,13 1.625 92 825 73 P42 30,61 0,27 29,12 0,18 571 98 843 100 P46 26,28 0,27 30,98 0,20 6.841 1.289 156 21

136

Tabelle 30: Ergebnisse der RT-qPCR zur Messung der MRP1-Genexpression in unverändertem Leber- und Lymphknotengewebe. Messdurchgang I. MW: arithmetischer Mittelwert, s: Standardabweichung

Ct-Wert Kopien pro 50 ng Gesamt-RNA MRP1 HPRT MRP1 HPRT Nr.

MW SD MW SD MW SD MW SD - Lebergewebe - K1 31,74 0,17 32,99 0,65 679 76 42 20 K2 30,41 0,26 32,34 0,25 1.692 317 62 10 K3 31,30 0,12 31,96 0,06 917 79 80 3 K4 29,69 0,08 31,62 0,30 2.750 133 103 22 K5 30,45 0,20 32,14 0,33 1.641 219 72 17 K6 29,38 0,15 32,64 0,35 5.024 487 117 28 K10 31,24 0,15 33,62 0,41 2.637 237 84 23 K11 30,32 0,13 31,30 0,21 3.911 332 249 34 K12 32,57 0,52 34,33 0,06 944 309 32 1 K13 28,60 0,46 30,64 0,07 6.049 1.922 359 16 K16 29,32 0,29 31,68 0,26 7.452 1.251 194 36 K17 32,02 0,17 32,52 0,53 2.282 239 161 60 K18 31,49 0,18 31,86 0,24 1.843 216 171 28 K19 31,45 0,52 31,61 0,37 1.953 611 205 47

- Lymphknotengewebe - K1 25,85 0,24 29,25 0,01 48.305 7,474 380 2 K2 27,67 0,61 31,24 0,06 11.455 4.130 241 9 K3 27,04 0,19 30,00 0,39 32.597 4.420 244 60 K4 25,72 0,70 29,74 0,05 43.973 17.694 268 12 K5 25,66 0,12 29,80 0,23 43.100 3.443 357 56 K6 26,09 0,15 31,14 0,28 78.087 7.432 293 52 K7 25,46 0,12 30,92 0,27 71.247 5.840 358 62 K8 25,93 0,10 30,06 0,17 25.680 1.880 337 38 K9 / LMD 26,13 0,08 30,56 0,31 51.530 8.150 326 123 K9 / LMS 26,17 0,29 31,27 0,17 30.147 5.846 238 26 K9 / LCSD 25,20 0,10 31,42 0,27 57.373 3.639 216 36 K9 / LCSS 24,95 0,16 21,24 0,03 67.933 7.337 241 4 K9 / LPD 0,11 27,76 0,34 31,22 20.337 4.458 103 8 K9 / LPS 24,98 0,07 31,24 0,03 66.040 2.786 241 4 K9 / LJ1 25,14 0,16 30,73 0,18 60.013 6.273 341 38 K9 / LJ2 25,98 0,11 31,38 0,30 34.003 2.539 222 44 K10 0,58 221 27,44 0,22 30,70 27.027 4.116 577 K11 26,19 0,24 31,38 0,35 67.707 9.812 350 80 K12 29,58 0,11 33,68 0,43 6.377 481 75 19 K13 26,12 0,16 30,32 0,13 65.130 6.746 709 62 K14 26,21 0,08 30,75 0,09 61.073 3.225 530 32 K15 26,90 0,21 31,32 0,16 38.840 5.333 361 39

137

Tabelle : Ergebnisse der RT-qPCR zur Messung der MRP1-Genexpression in unverändertenmLeber- und Lymphknotengewebe. Messdurchgang II. MW: arithmetischer Mittelwert, s: Standardabweichung

31


MW SD MW SD MW SD MW SD - Lebergewebe - K1 30,48 0,21 32,05 0,17 3.306 450 159 18 K2 29,74 0,17 31,15 0,22 6.460 715 163 22 K3 31,73 0,17 31,32 0,21 1.850 198 146 21 K4 29,70 0,16 31,20 0,21 6.625 719 157 21 K5 31,77 0,12 34,20 0,23 3.065 250 152 22 K6 31,10 0,37 32,95 0,12 27.29 630 50 4 K10 30,55 0,06 32,22 0,15 5.894 237 190 18 K11 30,70 0,29 31,53 0,06 5.426 995 296 12 K12 31,05 0,22 33,70 0,59 4.305 611 76 31 K13 30,42 0,14 30,03 0,14 4.455 395 369 35 K16 30,26 0,13 32,89 0,21 4.055 366 125 17 K17 31,74 0,33 33,59 0,40 1.529 319 79 21 K18 31,65 0,17 32,69 0,33 1.605 189 144 32 K19 31,33 0,23 32,63 0,07 1.988 307 148 7

- Lymphknotengewebe - K1 26,69 0,25 29,36 0,03 45.562 7.346 528 8 K2 28,56 0,27 31,95 0,12 11.985 2.108 169 13 K3 26,11 0,12 31,04 0,04 31.480 2.672 151 4 K4 26,78 0,07 31,09 0,01 76.660 3.691 1.137 11 K5 25,26 0,05 29,86 0,04 113.100 8.890 674 19 K6 26,20 0,05 30,37 0,14 61.750 1.949 272 24 K7 25,65 0,28 30,52 0,16 83.453 15.313 437 46 K8 26,58 0,29 29,70 0,14 45.590 9.017 295 30 K9 / LMD 26,35 0,25 30,14 0,55 40.910 8.259 206 9 K9 / LMS 25,99 0,15 29,05 0,21 64.797 6.319 636 85 K9 / LCSD 25,37 0,11 31,34 0,26 38.007 2.867 141 25 K9 / LCSS 25,86 0,11 30,39 0,21 70.520 4.785 265 38 K9 / LPD 25,71 0,02 31,70 0,05 40.017 1.055 163 19 K9 / LPS 26,01 0,24 31,53 0,11 65.380 10.600 223 16 K9 / LJ1 25,55 0,19 30,90 0,46 33.710 4.270 196 64 K9 / LJ2 26,65 0,07 29,96 0,30 42.253 1.906 352 72 K10 28,62 0,57 31,85 0,63 19.487 7.576 307 119 K11 26,10 0,49 31,38 0,23 74.110 21.185 349 52 K12 30,55 0,36 33,30 0,33 6.042 1.306 94 19 K13 26,65 0,39 29,93 0,13 76.140 17.955 851 73 K14 26,41 0,14 30,77 0,40 87.403 7.974 501 132 K15 27,05 0,27 31,01 0,35 57.907 9.727 424 103

138

Tabelle 32: Ergebnisse der RT-qPCR zur Messung der MRP1-Genexpression in Tumorgewebe von an malignem Lymphom erkrankten Hunden. Messdurchgang I. MW: arithmetischer Mittelwert, s: Standardabweichung

Ct -Wert Kopien pro 50 ng Gesamt-RNA MRP1 HPRT MRP1 HPRT Nr.

MW SD MW SD MW SD MW SD - Tumorgewebe von an Lymphom erkrankten Hunden bei Diagnosestellung - P01 28,90 0,36 30,55 0,06 36.667 9.092 226 9 P02 31,10 0,10 34,33 0,60 8.257 540 28 12 P03 32,08 0,02 29,07 0,06 5.232 53 627 25 P04 27,93 0,15 29,86 0,20 81.733 8.250 369 53 P05 29,90 0,29 29,48 0,18 18.477 3.805 659 79 P06 27,72 0,27 30,38 0,19 134.533 24.075 338 17 P07 23,49 0,01 31,21 0,16 172.500 424 282 30 P08 28,61 0,36 31,39 0,03 207.225 48.620 925 15 P09 24,23 0,12 29,89 0,44 54.883 4.550 218 70 P10 25,19 0,01 33,23 0,13 135.600 1.153 69 6 P11 27,13 0,49 31,03 0,18 62.967 9.935 286 14 P12 25,47 0,13 31,53 0,29 23.350 2.153 69 13 P13 33,34 0,45 32,41 0,10 9.560 2.580 470 30 P14 28,84 0,26 32,21 0,21 61.985 10.035 1.020 135 P15 25,78 0,15 32,59 0,23 90.563 9.459 108 17 P16 27,14 0,13 30,75 0,07 118.533 10.904 198 9 P17 26,76 0,21 30,36 0,23 153.833 20.733 260 37 P18 28,18 0,64 31,66 0,16 120.394 51.472 310 85 P19 25,79 0,11 28,94 0,12 114.533 8.456 849 69 P20 30,30 0,21 33,55 0,41 14.083 1.918 31 8 P21 29,75 0,60 31,25 0,12 10.650 3.868 141 12 P22 26,19 0,15 31,92 0,28 116.067 11.545 242 43 P23 24,66 0,12 30,98 0,06 20.462 1.650 100 4 P24 33,82 0,31 31,03 0,36 3.340 674 342 42 P25 30,03 0,62 30,63 0,24 8.865 3.883 217 35 P26 24,89 0,33 32,11 0,30 137.767 33.201 152 33 P27 24,64 0,10 30,17 0,38 463.300 29.816 589 154 P28 27,04 0,13 32,10 0,08 49.783 4.274 104 6 P29 25,35 0,11 32,00 0,37 117.300 8.106 237 60 P30 26,27 0,05 32,40 0,14 82.723 2.565 86 8 P31 24,26 0,25 32,46 0,34 237.000 36.626 175 41 P32 28,23 0,13 32,46 0,41 30.907 2.759 194 25

139

Tabelle 32 Fortsetzung:



P33 24,82 0,25 29,29 0,11 179.167 27.339 1.003 78 P34 28,93 0,21 30,66 0,34 7.905 1.103 421 99 P35 26,01 0,22 31,01 0,11 107.937 16.448 498 36

25,27 0,11 30,56 0,18 26.797 2.013 134 16 P37 24,30 0,03 31,95 0,45 54.093 915 200 67 P38 26,67 0,07 30,37 0,20 62.913 2.642 452 59 P39 23,63 0,21 30,63 0,22 80.900 10.310 458 40 P40 26,50 0,22 31,52 0,20 62.780 16.025 213 27 P41 26,12 0,15 33,35 0,25 30.006 2.990 38 6 P42 25,80 0,08 30,70 0,16 91.493 4.591 639 61 P43 25,96 0,37 31,19 0,36 113.347 29.387 449 107 P44 25,95 0,12 29,48 0,19 92.313 7.028 489 61 P45 29,02 0,37 30,93 0,19 61.670 2.426 312 38 P46 24,50 0,16 30,77 0,28 212.600 21.180 631 110 P47 24,46 0,21 31,69 0,43 355.967 48.850 284 84 P48 25,91 0,10 31,85 0,49 138.667 9.226 257 85 P49* 25,77 0,12 30,66 0,41 158.200 15.027 555 158 P50 28,65 0,11 29,50 0,18 35.433 2.610 804 108

- Tumorgewebe von an Lymphom erkrankten Hunden bei Rezidivausbildung - P07 24,38 0,06 30,14 0,17 132.500 5.200 364 49 P09 27,54 0,23 32,94 0,50 48.706 17.785 365 120 P11 24,06 0,73 30,79 0,30 187.100 14.234 448 33 P12 25,15 0,05 32,08 0,12 138.933 4.479 267 21 P22 27,85 0,25 33,73 1,26 138.567 25.576 543 62 P26 24,72 0,17 32,69 0,40 132.700 15.650 145 41 P28 25,52 0,22 31,65 0,57 87.490 14.059 217 76 P30 25,19 0,34 31,03 0,10 112.613 23.217 252 16 P32 28,08 0,03 31,12 0,07 17.013 290 237 11 P39 25,92 0,33 29,04 0,16 127.467 24.953 1.095 119 P42 23,91 0,50 30,00 0,23 321.200 111.061 1043 156 P46 24,99 0,15 31,76 0,22 154.00 15.012 330 46

P36

140

Tabelle 33: Ergebnisse der RT-qPCR zur Messung der MRP1-Genexpression in Tumorgewebe von an malignem Lymphom erkrankten Hunden. Messdurchgang II. MW: arithmetischer Mittelwert, s: Standardabweichung



P01 28,33 0,19 30,04 0,34 88.277 10.975 409 97 P02 32,40 0,06 33,85 0,31 5.536 214 31 7 P03 31,15 0,08 30,27 0,17 6.795 336 470 20 P04 28,01 0,87 31,44 0,22 60.590 27.997 204 31 P05 30,94 0,32 3.357 29,58 0,26 15.147 554 92 P06 28,00 0,02 32,12 0,10 19.217 309 146 9 P07 23,93 0,01 30,03 0,44 66.730 750 198 58 P08 29,84 0,74 32,47 0,07 121.550 35.205 390 15 P09 23,85 0,10 31,13 0,12 135.200 8.854 295 24 P10 25,66 0,20 31,27 0,36 542.450 73.893 178 43 P11 25,84 0,14 30,58 0,48 80.707 7.285 340 115 P12 24,96 0,21 32,13 0,11 63.307 8.903 150 11 P13 33,33 0,59 32,40 0,14 13.835 4745 455 40 P14 30,66 0,53 32,37 0,29 33.115 10.665 900 170 P15 25,15 0,17 31,08 0,30 174.567 18.733 208 43 P16 26,63 0,08 30,41 0,11 209.933 11.949 340 23 P17 26,77 0,12 30,58 0,20 191.667 14.840 306 41 P18 26,69 0,17 31,23 0,51 246.000 26.794 598 184 P19 27,61 0,07 29,31 0,18 110.533 5.254 711 85 P20 29,90 0,07 35,75 0,49 8.559 2.989 14 5 P21 29,84 0,16 31,61 0,20 16.343 1.736 182 23 P22 24,46 0,01 30,02 0,17 137.350 1.768 415 47 P23 26,21 0,13 32,39 0,31 49.227 4.201 175 36 P24 33,46 0,05 32,34 0,50 2.944 90 230 74 P25 29,34 0,50 29,05 0,26 33.167 9.901 640 115 P26 23,98 0,18 30,44 0,23 381.367 46.165 315 49 P27 25,25 0,07 32,05 0,13 35.153 1.500 152 5 P28 26,91 0,12 31,37 0,09 114.283 9.456 213 12 P29 25,28 0,30 30,39 0,07 118.410 23.201 371 17 P30 25,68 0,07 32,18 0,15 89.560 4.327 115 11 P31 24,99 0,15 31,61 0,06 194.533 19.176 145 4 P32 28,01 0,10 32,92 0,10 14.883 942 121 8

141

Tabelle 33 Fortsetzung:


MW SD MW SD MW SD MW SD - Tumorgewebe von an Lymphom erkrankten Hunden bei Diagnosestellung - P33 24,79 0,30 29,25 0,17 141.067 33.497 935 102 P34 29,02 0,39 30,83 0,36 12.021 3.196 363 81 P35 24,37 0,14 240 30,09 1,32 50.120 4.615 203 P36 26,48 0,27 32,63 0,33 41.380 7.667 149 35 P37 24,05 0,27 31,57 0,06 33.220 5.517 119 5 P38 26,44 0,23 30,59 0,25 81.747 12.390 660 110 P39 23,72 0,05 29,84 0,31 41.187 1.412 387 85 P40 24,61 0,01 30,62 0,92 164.600 849 482 275 P41 26,23 0,08 34,72 0,30 20.124 7.978 28 6 P42 25,32 0,16 29,32 0,41 141.636 14.512 716 306 P43 27,45 0,57 32,25 0,64 39.550 15.411 137 57 P44 26,89 0,32 30,18 0,03 94.990 21.859 571 12 P45 29,02 0,37 30,93 0,19 99.077 24.643 294 63 P46 24,35 0,15 31,10 0,03 196.100 2.687 303 7 P47 23,75 0,52 31,71 0,36 404.867 132.873 219 97 P48 24,78 0,06 31,67 0,19 176.167 6.615 349 41 P49 25,39 0,29 31,19 0,40 137.300 15.136 451 112 P50 30,68 0,30 29,86 0,21 12.820 2.503 495 67

- Tumorgewebe von an Lymphom erkrankten Hunden bei Rezidivausbildung - P07 23,07 0,06 30,58 0,32 230.100 8.883 437 99 P09 26,27 0,15 33,21 0,29 128.465 1.257 365 70 P11 25,15 0,18 29,76 0,35 79.673 9.167 484 106 P12 23,99 0,27 30,79 0,35 124.133 23.674 380 91 P22 25,83 0,28 32,75 0,32 146.767 25.891 141 31 P26 24,02 0,12 30,97 0,06 237.067 18.499 261 10 P28 25,07 0,09 32,14 0,14 149.967 10.563 238 21 P30 26,22 0,02 32,94 0,34 34.813 490 54 12 P32 28,81 0,21 32,42 0,47 21.207 2.762 177 50 P39 26,36 0,38 29,40 0,43 101.860 23.946 686 179 P42 24,66 0,13 29,46 0,15 312.567 26.931 1.209 106 P46 25,88 0,27 32,11 0,01 68.030 12.577 149 5

142

Tabelle : Ergebnisse der RT-qPCR zur Messung der MRP2-Genexpression in unverändertem Leber- und Lymphknotengewebe. Messdurchgang I und II. MW: arithmetischer Mittelwert, s: Standardabweichung

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MW SD MW SD MW SD MW SD - Lebergewebe – Messung I K1 25,58 0,11 32,64 0,63 6.474 463 97 38 K2 25,02 0,06 28,59 0,28 9.350 351 1.305 240 K3 24,69 0,21 31,61 0,34 11.663 1.499 184 39 K4 25,08 0,21 27,70 0,22 8.981 1.196 2.310 340 K5 26,23 0,19 32,03 0,31 4.250 528 139 30 K6 25,25 0,11 32,04 0,32 8.029 592 138 28 K10 27,56 0,17 33,26 0,32 2.826 304 120 26 K11 27,86 0,22 32,21 0,15 2.052 291 160 15 K12 30,01 0,11 35,11 0,40 503 37 25 6 K13 28,59 0,03 31,33 0,25 1.439 23 414 66 K16 26,17 0,17 32,73 0,46 4.280 469 111 30 K17 28,07 0,02 32,19 0,22 927 12 87 13 K18 26,45 0,05 32,09 0,05 2.745 82 92 3 K19 27,52 0,14 32,37 0,19 1.793 160 137 16

- Lebergewebe – Messung II K1 26,32 0,18 32,71 0,13 4.397 493 114 10 K2 25,56 0,17 28,74 0,29 7.177 818 1.526 295 K3 25,29 0,05 31,79 0,33 8.500 242 210 42 K4 25,91 0,10 28,20 0,15 5.697 380 2.146 213 K5 27,06 0,06 32,13 0,13 2.705 90 167 14 K6 26,03 0,17 32,18 0,18 5.282 564 162 19 K10 26,83 0,21 32,34 0,29 2.810 369 140 28 K11 26,76 0,31 32,06 0,43 2.950 594 171 49 K12 27,75 0,15 33,79 0,18 2.492 240 84 9 K13 27,81 0,10 32,81 0,19 1.487 100 196 23 K16 26,38 0,10 31,26 0,10 4.700 289 178 11 K17 27,89 0,04 32,00 0,46 1.773 51 113 34 K18 27,14 0,08 31,73 0,55 2.884 151 136 44 K19 27,68 0,20 31,44 0,78 2.045 253 171 77

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Danksagung

Mein besonderer Dank gilt Herrn Prof. Dr. I. Nolte für die Überlassung des interessanten

Themas, für die jederzeit gewährte Hilfe und fachliche Unterstützung bei der Erstellung der

Arbeit.

Weiterhin bedanke ich mich bei den Mitgliedern meiner Betreuungsgruppe, Herrn Prof. Dr.

W. Löscher und Herrn Prof. Dr. J. Bullerdiek, für die konstruktiven Gespräche im Rahmen

des Ph.D.-Studiums.

Herrn Prof. Dr. A. Gruber aus dem Institut für Pathologie möchte ich für die Einweisung in

die molekularbiologischen Techniken, die Bereitstellung des Arbeitsplatzes im Institut für

Pathologie und die jederzeit gewährte fachliche Unterstützung danken. Darüber hinaus ein

herzliches Dankeschön an die Mitarbeiter des Institutes für Pathologie für die freundliche

Atmosphäre im Labor.

Ein besonderes Dankeschön gebührt Frau N. Eberle und Frau I. Buitenduif aus der Klinik

für kleine Haustiere für die Hilfsbereitschaft bei der Probenentnahme.

Herrn Dr. G. v. Samson-Himmelstjerna aus dem Institut für Parasitologie danke ich für die

Erstellung der Primerseqenzen für die RT-qPCR und die Nutzung des Mx 4000.

Vielen Dank an Frau Prof. Dr. Günzel-Apel aus dem Institut für Reproduktionsmedizin und

Herrn Dr. C. Epe aus dem Institut für Parasitologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover

sowie an Herrn Dr. M. Mengel aus dem Institut für Pathologie der Medizinischen Hochschule

Hannover für die Überlassung der Kontrollgewebe.

Frau PD Dr. M.-L. Enss und Frau S. Faber danke ich für die Betreuung während des

Ph.D.-Studiums.

Zuletzt ein ganz herzliches Dankeschön an meine Eltern für ihre uneingeschränkte

Unterstützung sowie ihr stets entgegengebrachtes Vertrauen.

Klinische Relevanz der MDR1-, MRP1- und MRP2-Genexpression ...

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