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Klinische Wirksamkeit, Pharmakologie und Analytik von Bryophyllum pinnatum Originaldokument gespeichert auf dem Dokumentenserver der Universität Basel edoc.unibas.ch Dieses Werk ist unter dem Vertrag „Creative Commons Namensnennung-Keine kommerzielle Nutzung-Keine Bearbeitung 2.5 Schweiz“ lizenziert. Die vollständige Lizenz kann unter creativecommons.org/licences/by-nc-nd/2.5/ch eingesehen werden. Inauguraldissertation zur Erlangung der Würde eines Doktors der Philosophie vorgelegt der Philosophisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät der Universität Basel von Regula Wächter aus Sulz, Gemeinde Laufenburg AG Zürich, 2011

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Klinische Wirksamkeit, Pharmakologie und Analytik von Bryophyllum pinnatum

Originaldokument gespeichert auf dem Dokumentenserver der Universität Basel edoc.unibas.ch

Dieses Werk ist unter dem Vertrag „Creative Commons Namensnennung-Keine kommerzielle Nutzung-Keine Bearbeitung 2.5 Schweiz“ lizenziert. Die vollständige

Lizenz kann unter creativecommons.org/licences/by-nc-nd/2.5/ch

eingesehen werden.

Inauguraldissertation zur

Erlangung der Würde eines Doktors der Philosophie vorgelegt der

Philosophisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät der Universität Basel

von

Regula Wächter

aus Sulz, Gemeinde Laufenburg AG

Zürich, 2011

2

3

Genehmigt von der Philosophisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät

auf Antrag von

Herrn Prof. Dr. Matthias Hamburger

Herrn Prof. Dr. Kurt Hersberger

Frau Prof. Dr. Ursula von Mandach

Herrn Prof. Dr. Rudolf Brenneisen

Basel, den 22. Juni 2010

Herr Prof. Dr. Eberhard Parlow

Dekan der Philosophisch-

Naturwissenschaftlichen Fakultät

4

ALLES IN EINEM UND AUS EINEM GLAUBTE ICH MIT AUGEN ZU SEHEN.

J.W. VON GOETHE

Bryophyllum calycinum, Tafel aus der Erstbeschreibung von 1805 (http://de.wikipedia.org/wiki/brutblätter)

5

Inhaltsverzeichnis

1 ZUSAMMENFASSUNG ................................................................................................... 8

2 EINLEITUNG .................................................................................................................. 10

2.1 Frühgeburt ................................................................................................................... 10 2.1.1 Frühgeburtenrate .................................................................................................. 11 2.1.2 Risikofaktoren ....................................................................................................... 11 2.1.3 Probleme des frühgeborenen Kindes .................................................................... 13

2.2 Beurteilung der drohenden Frühgeburt ........................................................................ 14 2.2.1 Myometrium .......................................................................................................... 14 2.2.2 Wehen ................................................................................................................... 15 2.2.3 Blasensprung ........................................................................................................ 15 2.2.4 Vaginale Infektion.................................................................................................. 16 2.2.5 Fetus ..................................................................................................................... 16

2.3 Tokolytika .................................................................................................................... 16 2.3.1 β-Sympathomimetika ............................................................................................ 16 2.3.2 Oxytozinrezeptorantagonisten .............................................................................. 17 2.3.3 Kalzium-Antagonisten ........................................................................................... 17 2.3.4 Magnesium ........................................................................................................... 19 2.3.5 Nicht steroidale Antiphlogistika (NSAR) ................................................................ 20 2.3.6 NO-Donatoren ....................................................................................................... 21

2.4 Fetale Lungenreifungsinduktion ................................................................................... 21

2.5 Bryophyllum pinnatum ................................................................................................. 22 2.5.1 Geschichte ............................................................................................................ 22 2.5.2 Anthroposophische Charakterisierung .................................................................. 24 2.5.3 Botanik .................................................................................................................. 25 2.5.4 Therapeutische Anwendungen in der anthroposophischen Medizin ..................... 27

2.6 Die glatte Muskulatur des Uterus ................................................................................. 29

2.7 Ziel der Arbeit .............................................................................................................. 29

3 MATERIAL UND METHODEN ....................................................................................... 30

3.1 Klinische Studie ........................................................................................................... 30 3.1.1 Prüfung durch Ethikkommission; Notifizierung durch Arzneimittelbehörde (Swissmedic) .................................................................................................................. 30 3.1.2 Patientinnenkollektiv ............................................................................................. 30 3.1.3 Randomisierung .................................................................................................... 31 3.1.4 Studienmedikation ................................................................................................. 32 3.1.5 Ablauf der Studie .................................................................................................. 33 3.1.6 Herkunft der Patientinnendaten ............................................................................ 36 3.1.7 Schulung der Ärzte................................................................................................ 36

6

3.1.8 Monitoring ............................................................................................................. 36 3.1.9 Statistische Methoden ........................................................................................... 36

3.2 Pharmakologie ............................................................................................................. 38 3.2.1 Patientinnenkollektiv ............................................................................................. 38 3.2.2 Myometrium .......................................................................................................... 38 3.2.3 Der Myograph ....................................................................................................... 40 3.2.4 Auswertung der Myogramme ................................................................................ 44 3.2.5 Statistische Methoden ........................................................................................... 45

3.3 Analytik ........................................................................................................................ 46 3.3.1 Bryophyllum pinnatum-Presssaft .......................................................................... 46 3.3.2 Hochleistungs-Flüssigchromatographie (HPLC) ................................................... 47 3.3.3 Mitteldruck-Flüssigchromatographie (MPLC) ........................................................ 50 3.3.4 Dünnschichtchromatographie (DC) ....................................................................... 52 3.3.5 Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie (HPLC-MS) ................................. 53 3.3.6 Bryophyllum pinnatum-Presssaft zur Verdrängung von Flunitrazepam am GABAA-Rezeptor ............................................................................................................ 54 3.3.7 Bindungsaffinität von Bryophyllum pinnatum zur GABA-binding site des GABAA-Rezeptors .......................................................................................................... 56

4 RESULTATE .................................................................................................................. 58

4.1 Klinische Studie ........................................................................................................... 58 4.1.1 Swissmedic ........................................................................................................... 58 4.1.2 Ausgewählte Parameter aus dem CRF ................................................................. 58

4.2. In-vitro-Experimente ................................................................................................... 71 4.2.1 Patientinnenkollektiv ............................................................................................. 71 4.2.2 Amplitude .............................................................................................................. 71 4.2.3 Fläche unter der Kurve .......................................................................................... 75 4.2.4 Frequenz ............................................................................................................... 78 4.2.5 Vergleich von Presssaft und Fraktionen 2, 4 und 12 mit Kontrollen ...................... 81 4.2.6 Vergleich Presssaft mit Fraktion 4......................................................................... 82 4.2.7 Statistik ................................................................................................................. 84

4.3 Analytik ........................................................................................................................ 85 4.3.1 HPLC .................................................................................................................... 85 4.3.2 MPLC .................................................................................................................. 101 4.3.3 DC ....................................................................................................................... 102 4.3.4 HPLC-MS ............................................................................................................ 104 4.3.5 Verdrängung von Flunitrazepam am GABAA-Rezeptor durch Bryophyllum pinnatum Presssaft ...................................................................................................... 105 4.3.6 Bindungsaffinität von Bryophyllum pinnatum zur GABA-binding site des GABAA-Rezeptors ........................................................................................................ 105

5 DISKUSSION ............................................................................................................... 106

5.1 Klinische Studie ......................................................................................................... 106

5.2 Pharmakologie ........................................................................................................... 110

7

5.3 Analytik ...................................................................................................................... 112

6 ANHANG ...................................................................................................................... 115

A. Patientinneninformation und Einverständniserklärung Klinische Studie ...................... 115

B. Case Report Form klinische Studie ............................................................................. 123

C. Case Report Form klinischen Studie ab März 2009 .................................................... 157

D. Verwendete Testpräparationen und Chemikalien ....................................................... 183

E. Zusammensetzung der verwendeten Lösungen ......................................................... 185

F. Einstellungen des Massenspektrometers (HPLC-MS) ................................................ 186

G. Tabellen zur Deskriptiven Statistik der Klinischen Studie ........................................... 187

H. Begleitmedikation ........................................................................................................ 195

I. Tabellen zur Deskriptiven Statistik Myometriumstreifen ............................................... 198

J. Tabellen zu den Mixed Model Analysen der Kontraktilitätsversuche am Myometriumstreifen in vitro .............................................................................................. 207

K. DAD-UV-Spektren aus Rotationsverdampfermethode ................................................ 211

L. HPLC-Chromatogramm des ethanolischen Bryophyllum pinnatum-Extraktes ............. 212

M. HPLC-Chromatogramm der Kautabletten mit 50% Bryophyllum pinnatum-Presssaft.......................................................................................................................... 215

N. HPLC-Chromatogramm der EtOH-Mazeration von Bryophyllum daigremontianum .... 216

O. Resultate aus der Literaturrecherche über Inhaltsstoffe ............................................. 218

P. Lebenslauf Regula Wächter ........................................................................................ 223

7 LITERATURVERZEICHNIS ......................................................................................... 225

8 DANKE ......................................................................................................................... 230

8

1 Zusammenfassung

Eines der grössten Probleme der modernen Geburtshilfe stellt trotz grosser

Bemühungen in den letzten Jahren immer noch die vorzeitige Wehentätigkeit und die

mit ihr verbundene drohende Frühgeburt dar. Es wird stets nach neuen

Möglichkeiten gesucht, diese zu verhindern und die Risikofaktoren auszuschalten.

Vorzeitige Wehen werden symptomatisch mittels medikamentöser Wehenhemmung

= Tokolyse behandelt. Mit Nifedipin, das zur Tokolyse weltweit im off-label verwendet

wird, steht eine orale Applikation zur Verfügung, die, wenn immer möglich, aus

Gründen der Vereinfachung einer intravenösen Tokolyse vorgezogen wird.

In der anthroposophischen Medizin werden zur Tokolyse seit ca. 30 Jahren

Präparate verwendet, die Auszüge der Pflanze Bryophyllum pinnatum enthalten und

in der Schweiz als anthroposophische Heilmittel gehandelt werden, im engeren Sinn

aber Phytotherapeutika darstellen. Das Nebenwirkungspotenzial dieser

Phytotherapeutika ist sehr klein.

Der direkte Vergleich zu einem synthetisch hergestellten Tokolytikum wurde nun mit

der klinischen Studie „Bryophyllum pinnatum versus Nifedipin zur Behandlung

vorzeitiger Wehentätigkeit“ gezogen. An einem Patientinnenkollektiv von knapp 30

Patientinnen konnte eine gleichwertige Wirkung zur Hemmung der vorzeitigen

Wehentätigkeit bezüglich der Hauptzielparameter gezeigt werden.

Der Presssaft von Bryophyllum pinnatum, aus dem die Kautabletten für die klinische

Studie hergestellt werden, wurde gleichzeitig in-vitro an Myometriumstreifen von

Patientinnen getestet, die sich einer Sectio caesarea am Termin unterzogen und der

Forschung ein Stück Gewebe ihres Uterus zur Verfügung stellten. Dabei konnte

gezeigt werden, dass der Presssaft und Fraktionen davon sehr wohl in der Lage

sind, Kontraktionen dieses potenten Muskelgewebes zu hemmen.

Um die Fraktionen für die Myometriumstreifenexperimente zu erhalten, wurde der

Presssaft lyophilisiert und anschliessend mittels Mitteldruck-Flüssigchromatographie

9

(MPLC) aufgetrennt. Als stationäre Phase zur Chromatographie wurde Sephadex

LH-20 eingesetzt. Das Monitoring der Fraktionen erfolgte mittels

Dünnschichtchromatographie (DC). Die Fraktionen wurden anschliessend

entsprechend vereinigt und eingeengt.

Der Presssaft, sowie 3 Fraktionen davon wurden mittels Hochleistungs-

Flüssigchromatographie (HPLC) aufgetrennt. Anhand der Diodenarray-UV-Spektren

(DAD-UV) wurden einzelne Peaks der Fingerprint-Profile den jeweiligen

Substanzklassen (Flavonoide, Bufadienolidderivate oder Zimtsäuren) zugeordnet.

Bevor mittels Massenspektrometrie (HPLC-MS) versucht wurde, einzelne Peaks

aufgrund ihrer Massenspektren Stoffen zuzuordnen, wurde eine Literatursuche zur

Bestimmung der bereits in Bryophyllum pinnatum bekannten Inhaltsstoffe

durchgeführt.

10

2 Einleitung

Vorzeitige Wehentätigkeit und die mit ihr eng verbundene drohende Frühgeburt

stellen die grössten Probleme der modernen Geburtshilfe dar. Oft sind vorzeitige

Wehen der Auslöser für eine Frühgeburt.

2.1 Frühgeburt

Die Frühgeburt ist als Geburt vor Vollendung der 37. Schwangerschaftswoche (SSW)

post menstruationem (≤37.0 SSW) bzw. als eine Tragzeit von weniger als 259 Tagen

post menstruationem definiert (1).

Die neugeborenen Kinder werden nach Schwangerschaftsalter und Gewicht

klassiert:

Schwangerschaftsalter (Wochen)

Frühgeburt >32.0-≤37.0

Frühe Frühgeburt >28.0-≤32.0

Sehr frühe Frühgeburt >25.0-≤28.0

Frühgeburt an der Grenze zur Lebensfähigkeit ≤25.0

(2).

Gewicht (g)

Untergewichtiges Neugeborenes (Low Birth Weight, LBW) <2500

Sehr untergewichtiges Neugeborenes (Very Low Birth Weight, VLBW) <1500

Extrem untergewichtiges Neugeborenes (Extremely Low Birth Weight, ELBW)<1000

(3)

Die Überlebenschancen der Frühgeborenen nehmen mit zunehmendem

Gestationsalter und zunehmendem Geburtsgewicht zu.

11

2.1.1 Frühgeburtenrate

In den westlichen Ländern beträgt die Frühgeburtenrate 5-10%, in der Schweiz

derzeit 9%. Davon werden 1-2% der Kinder vor der 32. SSW und 0.2% vor der 28.

SSW (bzw. mit einem Kindsgewicht <1000 g) geboren, also dann, wenn die

perinatale Morbidität und Mortalität besonders gross sind. Diese Zahl bleibt trotz

grosser Bemühungen in den westlichen Nationen konstant. Eine Erklärung dafür

basiert unter anderem auf der Zunahme der artifiziellen Schwangerschaften, die per

se und in ihrer Methodik mit einer erhöhten Rate von Mehrlingsschwangerschaften

verbunden sind (4).

2.1.2 Risikofaktoren

Diverse mütterliche und fetale Risikofaktoren bringen ein erhöhtes Frühgeburtsrisiko

mit sich. Für einige der folgenden Risikofaktoren gibt es bereits Therapieoptionen:

Der wichtigste Risikofaktor ist das Alter der Frau. Ist die Schwangere jünger als 18

Jahre oder älter als 40 Jahre, ist das Risiko für eine Frühgeburt erhöht. Ebenso

bilden Mehrlingsschwangerschaft, Zervixinsuffizienz, Uterusanomalien,

Plazentalokalisations- und –durchblutungsstörungen, sowie Plazenta prävia,

rezidivierende Blutungen während der aktuellen Schwangerschaft, Präeklampsie,

Polyhydramnion und HELLP Risikofaktoren für eine Frühgeburt.

Besteht bei einer Patientin bereits eine positive Frühgeburtenanamnese, ist diese ein

Risikofaktor für weitere Frühgeburten. Bereits nach einer Frühgeburt beträgt das

Wiederholungsrisiko 20%.

Eine eher seltene aber oft schwerwiegend verlaufende Erkrankung ist die

Schwangerschaftscholestase, deren Ursachen unbekannt sind, die jedoch mit einem

erheblichen Frühgeburtsrisiko und einer erhöhten Rate an intrauterinem fetalem Tod

einhergeht.

Ein Risikofaktor sind ebenfalls vaginale Infektionen. Diese können aszendieren und

führen häufig zu Zystitiden, Pyelonephritiden und vorzeitigem Blasensprung. Daher

ist es wichtig, dass sie frühzeitig erkannt und behandelt werden.

12

Sehr verbreitete Risikofaktoren sind die Anämie in der Schwangerschaft, sowie

Drogen- und Nikotinabusus, welche erhebliche Schäden verursachen können.

Auch Fehlfunktionen der Schilddrüse führen zu einer erhöhten Frühgeburtsrate,

wobei eine Hyperthyreose meist auf einen Morbus Basedow zurückzuführen ist und

eine autoantikörperbedingte Genese hat.

Die häufigste Ursache für eine Hypothyreose ist eine Autoimmunthyreoiditis (M.

Hashimoto). Auch diese führt zu einer erhöhten Frühgeburtsrate.

Ca. 1% aller Schwangeren hat eine vorbestehende Herzerkrankung. Je nach

Schweregrad der mütterlichen Erkrankung steigt das Risiko der chronischen

Mangelversorgung und damit der intrauterinen Wachstumsretardierung und der

Frühgeburt.

Bei Asthmatikerinnen mit schlecht eingestellter Medikation ist die Frühgeburtsrate

erhöht.

Untergewicht der Schwangeren, niedriger sozio-ökonomischer Status der Frau oder

systemische Erkrankungen der Mutter und ihre Folgen können ebenfalls zu

vorzeitiger Wehentätigkeit und einer Frühgeburt des Kindes führen.

Wie in Tabelle 1 ersichtlich ist, gibt es viele mögliche Komplikationen und trotz

jahrelanger Bemühungen sind fast keine befriedigenden Therapiemöglichkeiten

vorhanden. Die bisher eingeführten Screeningtests bieten keine effiziente

Prophylaxe. Einzig auf den Risikofaktor Mehrlingsschwangerschaft kann in der

Sterilitätsbehandlung Einfluss genommen werden. Als Therapieoption bleibt meist

nur die Tertiärprophylaxe Tokolyse mit Lungenreifungsinduktion (LRI) sowie die

Verlegung in ein Perinatalzentrum (3).

13

Tabelle 1. Risikofaktoren für eine Frühgeburt Maternal Alter Positive Frühgeburtsanamnese Mehrlingsschwangerschaft Zervixinsuffizienz Uterusanomalien Plazentalokalisations- und –durchblutungsstörungen Polyhydramnion Schwangerschaftscholestase Vaginale Infekte Zystitis und Pyelonephritis Anämie Drogenabusus (Nikotin u. a.) Hyperthyreose und Hypothyreose Vorbestehende Herzerkrankungen Asthma Fetal Fehlbildungen mit Hydramnion

2.1.3 Probleme des frühgeborenen Kindes

Die häufigsten gesundheitlichen Probleme, unter denen Frühgeborene leiden, sind

pulmonale Komplikationen, zerebrale Probleme sowie intraventrikuläre Blutungen,

Herz-Kreislauf-Probleme, Sepsis und Sehstörungen. Daraus können auch

Langzeitschäden hervorgehen.

14

2.2 Beurteilung der drohenden Frühgeburt

2.2.1 Myometrium

Der Uterus ist ein Hohlorgan und besteht aus drei Schichten. Von aussen nach innen

sind dies der Peritonealüberzug (Perimetrium), der Wandanteil aus glatter Muskulatur

(Myometrium) und die Schleimhaut (Endometrium). Den Hauptteil der Uteruswand

bildet das Myometrium, das aus Bündeln spiralig angeordneter glatter Muskelzellen

aufgebaut ist. Es ist im Bereich des Fundus und des oberen Korpusabschnittes stark

ausgeprägt.

Der gravide Uterus nimmt dem Wachstum des Feten entsprechend stark an Grösse

zu. Hierbei nehmen Zahl und Grösse der glatten Muskelzellen zu und das Gewicht

der Gebärmutter steigt dabei von ca. 60 g auf ca. 1 kg an (5).

Abb. 1. Schematisches Bild eines humanen Uterus mit den verschiedenen Wandschichten Perimetrium, Myometrium und Endometrium.

15

2.2.2 Wehen

Uterine Kontraktionen lassen sich mittels Kardiotokographie (CTG) aufzeichnen. Für

die Aufzeichnung von Amplitude und Fläche der Kontraktionen sind einige äussere

Bedingungen wie Straffheit des mit der Elektrode verbundenen Gurtes, Dicke der

Bauchdecke (Fettgewebe), Position der Schwangeren (Lage), körperliche Aktivität,

aber auch individuelle Faktoren wie u.a. der Kreislauf der Schwangeren oder Fieber

verantwortlich (2). Das CTG erlaubt keine Aussage über die Schwere (Kraft) der

Kontraktionen, hingegen schon über deren Häufigkeit (Frequenz).

Von Wehen spricht man, wenn schmerzhafte, palpable, länger als 30 Sekunden

dauernde und häufiger als 3 Mal pro 30 Minuten auftretende uterine Kontraktionen

vorhanden sind und damit eine Zervixverkürzung und/oder -eröffnung erreicht wird

bzw. verbunden ist (6). Uterine Kontraktionen ohne Zervixeinwirkung sind keine

Wehen. Um herauszufinden, ob es sich um Wehen handelt oder nicht, bedarf es

demnach der Beurteilung des Zervixzustandes. Die Zervix kann digital oder, in jedem

Fall besser, sonographisch (Vaginalultraschall) beurteilt werden (2).

Wehen, die sich vor 37.0 SSW manifestieren, sind vorzeitige Wehen und bedeuten

eine drohende Frühgeburt. Eine Untersuchung des Zervixzustandes hilft, das Risiko

einer Frühgeburt abzuschätzen. Mit zunehmender Zervixverkürzung steigt das

Frühgeburtenrisiko (7). Eine Zervixlänge von <25 mm gilt vor der 32. SSW als

verkürzt.

2.2.3 Blasensprung

Mittels eines Festphasen-Immunoassays (QuikCheck® Ffn, CYTYC, Lausanne,

Schweiz), wird die Anwesenheit von fetalem Fibronektin an der Zervix

ausgeschlossen. Dieser Test hat einen hohen negativen aber einen tiefen positiven

Prädiktivwert, wonach bei einem negativen Testergebnis mit hoher

Wahrscheinlichkeit eine Geburt innerhalb der folgenden 14 Tage ausgeschlossen

werden kann (8).

16

2.2.4 Vaginale Infektion

Da vaginale Infektionen aszendieren und damit eine Frühgeburt auslösen können,

müssen sie ausgeschlossen bzw. therapiert werden. Dazu wird das Vaginalmilieu

nativ und mikrobiologisch untersucht.

2.2.5 Fetus

Der Zustand des Feten (Fehlbildungen u.a.) und die Anzahl der Feten werden mittels

Dopplersonographie bestimmt.

2.3 Tokolytika

2.3.1 β-Sympathomimetika

Ihre uterusrelaxierende Wirkung wird über myometriale, membranständige, β-

adrenerge Rezeptoren vermittelt. In Europa verwendete Arzneistoffe dieser Gruppe

sind Fenoterol (Partusisten®, in der Schweiz ausser Handel) und Hexoprenalin

(Gynipral®).

Wirksamkeit und Sicherheit der β-Sympathomimetika ist mit randomisierten und (da

früher noch möglich) sogar placebokontrollierten Studien nachgewiesen (9).

Beschriebene Nebenwirkungen für die Mutter sind Palpitationen, Tremor, Übelkeit,

Kopfschmerzen und Thoraxschmerzen.

Zu den schweren maternalen Nebenwirkungen gehören Herzrhythmusstörungen und

Lungenödeme (10). Prädisponierende Faktoren sind unkontrollierte übermässige

Hydratation, gleichzeitige Präeklampsie oder LRI, Bluttransfusion,

Mehrlingsschwangerschaften und maternale Herzerkrankungen. Die Substanzen

dieser Arzneistoffgruppe wirken diabetogen (11). Da β-Sympathomimetika die

Plazentaschranke passieren, sind die Nebenwirkungen für den Feten vergleichbar

mit denen der Mutter.

17

Die Kontraindikationen ergeben sich aus den Nebenwirkungen: Maternale

Herzerkrankungen, Hypertonie, Hyperthyreose und schwere Anämie. Eine relative

Kontraindikation besteht bei Diabetes der Mutter.

2.3.2 Oxytozinrezeptorantagonisten

Atosiban (Tractocile®) ist ein kompetitiver, nicht selektiver Antagonist des Oxytozin-

und des Arginin-Vasopressin-Rezeptors und unterdrückt deshalb oxytozininduzierte

Kontraktionen. Die Wirksamkeit der Oxytozinrezeptorantagonisten ist in

randomisierten Studien nachgewiesen (12, 13).

Die Food and Drug Administration (FDA) hat die Zulassung von Atosiban in den USA

jedoch abgelehnt, da sich in einer Studie ein Trend zu einer höheren Rate an

neonataler Sterblichkeit in der Atosibangruppe ergab (14).

Nebenwirkungen für die Mutter sind Palpitationen, Tachykardie, Hypotonie, Übelkeit,

Erbrechen und Kopfschmerzen, wobei diese aber nicht häufiger sind als jene der

Placebogruppe. Schwerere Nebenwirkungen wurden unter Therapie ausschliesslich

mit Atosiban bisher nicht beschrieben.

Kontraindiziert ist Atosiban nur bei bekannter Überempfindlichkeit. Eine Therapie mit

dem Oxytozinrezeptorantagonisten ist jedoch sehr kostenintensiv (in der Schweiz:

1000 CHF pro Behandlungszyklus).

2.3.3 Kalzium-Antagonisten

Die Kalzium-Antagonisten werden hier etwas ausführlicher erklärt, da sie später Teil

der klinischen Studie sind.

Wirkungsmechanismus Der Kalzium-Antagonist Nifedipin (Adalat®) blockiert direkt den Influx und fördert den

Efflux von Kalziumionen durch die Zellmembran. Er blockiert zudem die Freisetzung

von intrazellulärem Kalzium aus dem endoplasmatischen Retikulum (ER). Die daraus

resultierende Abnahme von intrazellulärem, freiem Kalzium führt zur Hemmung der

Phosphorylierung des Enzyms Myosinkinase und letztlich zu einer Hemmung der

Kontraktilität. Diese Wirkungen kommen zum Tragen in der Herzmuskelzelle, in den

18

glatten Muskelzellen der Koronararterien und der peripheren Widerstandsgefässe

sowie bei höheren Dosen in den Zellen des Reizbildungs- und Reizleitungssystems.

Nifedipin wirkt daher antihypertensiv und antianginös. Der gleiche Mechanismus

wirkt auch in der glatten Muskelzelle des Uterus, weshalb Nifedipin in der

Schwangerschaft als effizientes Tokolytikum verwendet wird (15).

Anwendung als Tokolytikum Weltweit ist nur die Indikation mit den Wirkungen am Herzen bzw. an den Gefässen

registriert. Die Tokolyse mit Nifedipin wird im sogenannten off–label-use

durchgeführt. Trotzdem wird Nifedipin in Europa und in den USA als Tokolytikum

aufgeführt und sogar empfohlen. In den „Recommendations on preterm labor” des

American College of Obstetricians and Gynecologists (ACOG) wird kein first-line-

Tokolytikum aufgeführt. Die American Academy of Family Physicians gibt eine Liste

der erhältlichen Tokolytika heraus und nennt dabei ohne Einschränkungen auch

Nifedipin (16). Die World Health Organisation (WHO) empfiehlt in ihrer Reproductive

Health Library (RHL) Kalziumantagonisten als first-line-Tokolytika in

Entwicklungsländern (17).

Es existieren mehrere randomisierte Untersuchungen zur Therapie vorzeitiger

Wehen mit Nifedipin vs. andere Tokolytika (v. a. Ritodrin). In einer Metaanalyse, die

12 solcher Studien umfasst (18), wurden Kalziumantagonisten im Vergleich zu β-

Sympathomimetika als günstig eingestuft. In ihrer Metaanalyse von 2001 kommen

Tsatsaris et al. zum Schluss, dass, unter Berücksichtigung des neonatalen

Outcomes, Nifedipin effektiver sei als β-Sympathomimetika und deshalb als first-line-

Tokolytikum gewählt werden sollte (19). Die im BJOG 2003 erschienene

Metaanalyse von Nifedipin versus Atosiban zeigt gar eine höhere Effektivität von

Nifedipin vs. Atosiban bei vorzeitiger Wehentätigkeit (20). Untersuchungen zur

tokolytischen Wirksamkeit von Nifedipin vs. Placebo fehlen und werden aufgrund der

fehlenden ethischen Grundlage wohl kaum je durchgeführt (15).

Dosierung Ein von Papatsonis et al. 1997 propagiertes Dosierungsschema legt innerhalb der

ersten Stunde 40 mg Nifedipin als Kaukapseln vor und im Anschluss daran eine

Erhaltungsdosis von bis max. 160 mg Nifedipin/Tag in Form von slow-release-

Tabletten (Adalat® CR) (21). In zwei Studien wurden unerwünschte Nebenwirkungen

19

vorwiegend in der Aufsättigungsphase beobachtet (22, 23). Es ist zu erwägen, ob in

Zukunft die Aufsättigung weggelassen oder deren Dosierung reduziert werden soll. In

denselben Studien zeigte eine Erhaltungsdosis mit dem langwirksamen Präparat

Adalat® CR in einer Dosis von 90 mg/Tag (alle 12 Stunden einmal 30 mg bzw. 60 mg

im Wechsel) eine sehr gute Verträglichkeit und eine gute tokolytische Wirksamkeit

(22, 23). Ebenso konnte in keinem Fall beim Feten oder Neugeborenen unter diesen

Dosen bzw. den resultierenden Blutspiegeln von Nifedipin unerwünschte Wirkungen

festgestellt werden. Diese Dosierungen können somit als tokolytische Tagesdosis

empfohlen werden (15).

Unerwünschte Wirkungen (UAW) bei der Tokolyse Die maternalen UAW entsprechen der antihypertensiven Wirkung von Nifedipin,

welches den mittleren arteriellen Blutdruck durch eine Relaxation der glatten Muskeln

der Arteriolen senkt. Dies kann einen Anstieg der Herzfrequenz zur Folge haben. Die

Blutdrucksenkung ist dosisabhängig und vor allem in der Aufsättigungsphase zu

beobachten (22). Diese UAW sind bei normotensiven Patientinnen grundsätzlich

geringer als bei hypertensiven (24) und weitaus weniger schwerwiegend als die

Nebenwirkungen unter β-Sympathomimetika (25). Es können dosisabhängig auch

Übelkeit, Flush, Kopfschmerz und Palpitationen auftreten.

Aus den bisher publizierten Studien ergeben sich keine Hinweise für eine teratogene

Potenz oder eine bedeutsame Einschränkung der uteroplazentaren Perfusion (26). In

einer Kasuistik wurde eine schwere maternale Hypotonie mit konstruktivem Tod des

Feten beschrieben, nachdem Nifedipin gekaut worden war und der Wirkstoff dadurch

sehr rasch verfügbar wurde.

Kontraindiziert ist Nifedipin bei Hypersensitivität, linksventrikulärer Dysfunktion,

koronarer Herzerkrankung, kongestiven Herzfehlern oder Hypotonie der Mutter.

2.3.4 Magnesium

Magnesium ist für den Menschen ein Spurenelement und wird normalerweise durch

die tägliche Nahrung in Mengen von 10-20 mmol/d aufgenommen. Es wirkt als

Kofaktor vieler Enzyme. In der Herzmuskelzelle und der uterinen glatten Muskelzelle

sind diese Enzyme ATPasen, die für den Kalziumausstrom aus dem Zytosol sorgen

und die als Substrat Magnesium komplex an Adenosin 5’-triphosphat (ATP)

20

gebunden (MG-ATP) benötigen. Magnesiumsalze werden daher therapeutisch und

prophylaktisch zur Tokolyse und bei diversen schwangerschaftsinduzierten

Hypertonieformen wie Präeklampsie eingesetzt.

Zur oralen Anwendung eignen sich die resorbierbaren Salze organischer Säuren wie

Magnesiumzitrat, -aspartat, -chlorid oder -laktat.

Zur intravenösen (i.v.) Gabe wird vorwiegend Magnesiumsulfat verwendet.

Tokolytisch wirksam wird Magnesium in einer Plasmakonzentration von 1.5 mmol/l,

was 4 mmol Magnesium pro Stunde entspricht (27). Wie prospektive Studien gezeigt

haben, erhöht die Therapie mit Magnesium das Gestationsalter nicht stärker als eine

Therapie mit dem β-Sympathomimetikum Ritodrin (28). Als Nebenwirkungen der

Magnesiumtherapie sind Bradykardie, Vasodilatation mit Blutdruckabfall, Schwindel

und Übelkeit zu erwarten. In höheren Dosen ist sogar mit steigender Atemdepression

und Arrhythmien zu rechnen, weshalb diese Therapie ein Dauermonitoring der

Mutter und insbesondere der mütterlichen Atemfrequenz verlangt. Nebenwirkungen

für den Feten sind vor allem die Erhöhung der kindlichen Mortalität wenn sehr hohe

Dosen angewendet werden (29). In niedrigerer Dosierung (kumulativ max. 28 g

Magnesiumsulfat) zeigte der „Australasian collaborative trial of Magnesium sulphate“

allerdings einen neuroprotektiven Effekt von Magnesiumsulfat auf das fetale

Zentralnervensystem, ohne die kindliche Mortalität signifikant zu beeinflussen (30).

Kontraindikationen für die i.v.-Anwendung von Magnesium sind Myasthenia gravis

und kongenitaler AV-Block, wobei renale Erkrankungen und Zustand nach

Myokardinfarkt der Mutter als relative Kontraindikationen gelten (3, 31).

2.3.5 Nicht steroidale Antiphlogistika (NSAR)

NSAR, wie zum Beispiel Indomethacin (Indocid®), werden in speziellen Fällen als

orale Tokolytika angewandt. NSAR inhibieren Cyclooxygenaseenzyme, die für die

Synthese von Prostaglandinen verantwortlich sind. Ihre Wirksamkeit gegenüber

Placebo ist nachgewiesen (32). Die beobachteten Nebenwirkungen sind unter

Beachtung der Kontraindikationen und bei kurzer Behandlungsdauer für die Mutter

gering, bei den Feten kann es zur intermittierenden fetalen Oligurie führen.

Bei einer Anwendung >48 Std. sind persisitierende fetale Anurie, renale

mikrozystische Läsionen und neonatale Todesfälle beschrieben. Bei Applikation von

Indomethacin über mehr als 48 Std. nach 32 SSW muss in 20-50% der Fälle mit

21

einer Konstriktion bzw. einem vorzeitigen Verschluss des Ductus arteriosus Botalli

gerechnet werden (33). Ebenso wurde eine Erhöhung des Risikos für eine

nekrotisierende Enterokolitis als weitere fetale bzw. neonatale Komplikation

beobachtet (34).

Kontraindiziert sind NSAR bei Überempfindlichkeit gegenüber dem Wirkstoff, Magen-

Darm-Ulcera, medikamenteninduziertem Asthma, hämatologischen, renalen oder

hepatischen Dysfunktionen.

2.3.6 NO-Donatoren

Nitroglycerin wirkt als Stickstoffmonoxid-Donator (NO-Donator) und führt zu

Muskelrelaxation (35). Momentan ist diese transdermale Möglichkeit der Tokolyse

noch nicht zugelassen. Eine Aussage bezüglich Wirksamkeit gegenüber Placebo ist

noch nicht möglich, es gibt aber bereits wenige Daten, die auf diese neue,

nebenwirkungsärmere Therapiemöglichkeit hoffen lassen (36). Die Nebenwirkungen

sind gering bis mittel. Als Nebenwirkungen werden erhebliche Kopfschmerzen und

(ähnlich wie bei Nifedipin) die Gefahr der arteriellen Hypotension beschrieben. Ob

und in welchem Mass fetale Nebenwirkungen auftreten, ist noch nicht bekannt.

NO-Donatoren sind kontraindiziert bei bestehender Migräne, ausgeprägter

Hypotonie, orthostatischen Kreislaufregulationsstörungen und maternalen

Herzerkrankungen.

2.4 Fetale Lungenreifungsinduktion

Während der Tokolyse vor der 34. SSW wird den Schwangeren am UniversitätsSpital

Zürich meist routinemässig ein Zyklus des Glucokortikoids Betamethasonacetat (2

Mal 12 mg i.v. im Abstand von 24 Std.) verabreicht, um die Reifung der fetalen

Lungen zu induzieren. Damit wird ein signifikant verbessertes neonatales Outcome

bewirkt, mit Verringerung des Risikos für Atemnotsyndrom, neonatalen Tod und

intraventrikuläre Hirnblutung (6).

Nach 34.0 SSW werden Geburtsbestrebungen nicht mehr aufgehalten, da die

kindliche Prognose gut ist.

22

2.5 Bryophyllum pinnatum

Bryophyllum pinnatum wurde als phytotherapeutisches Tokolytikum bisher beinahe

ausschliesslich in Kliniken mit anthroposophisch erweiterter Medizin verwendet.

Verabreicht wird ein wässriger Auszug von Bryophyllum pinnatum-Blättern als 5%ige

Verdünnung zur i.v.-Anwendung (Ampullen 5% zu 10 ml, Weleda AG, Arlesheim,

Schweiz) oder der Presssaft in einem 50%igen Laktosegranulat zur oralen Gabe

(Kautabletten, Weleda). Daneben stehen zur oralen Applikation auch der

alkoholische Auszug als 33%ige Tropfen (Urtinktur 33%, Weleda) und die Rh Dilution

(Weleda) zur Verfügung. Diese Arzneimittel sind Phytotherapeutika und werden nach

anthroposophischen Verfahren hergestellt. Gemäss anthroposophischer

Menschenkenntnis wird mit diesen Arzneimitteln die Gesundheit gefördert und nicht

primär die Krankheit bekämpft. Ältere und neuere klinische Beobachtungen zur i.v.-

und oralen Anwendung zur Tokolyse bestätigen eine gute Wirksamkeit und eine

hohe Verträglichkeit (37-39). In einer in–vitro-Untersuchung wurde zudem der

relaxierende Effekt von Bryophyllum pinnatum (wässriger Auszug) vs. Fenoterol

sowohl auf spontane als auch auf mit Oxytozin stimulierte Kontraktionen bestätigt

(25). Auch der Vergleich zwischen der tokolytischen Wirksamkeit von Bryophyllum

pinnatum-Präparaten und β-Sympathomimetika bei einer neueren retrospektiven

Untersuchung zeigte, dass Bryophyllum pinnatum bei vergleichbarer Wirksamkeit

erheblich weniger Nebenwirkungen hervorruft (40).

2.5.1 Geschichte

Die ursprünglich in Madagaskar beheimatete Spezies Bryophyllum pinnatum ist seit

gut 200 Jahren in Europa bekannt und dokumentiert. Die Pflanze wurde 1786 zum

ersten Mal in der „Encyclopédie méthodique“ erwähnt. Der französische

Naturforscher Jean-Baptiste Lamarck (1744-1829) hat die Pflanze als

schmerzlindernd, wundheilend und erfrischend bezeichnet.

Johann Wolfgang von Goethe erwähnte Bryophyllum zum ersten Mal am 28. Oktober

1818 in seinem Tagebuch. „Vorwärts und rückwärts ist die Pflanze immer nur Blatt“,

23

schrieb Goethe über die Pflanze, in der er eine Illustration seiner Idee der Urpflanze

sah.

Er zog sich aus den Brutknospen viele Generationen von Bryophyllum heran. Weil er

sich so intensiv mit Bryophyllum beschäftigt hat, wird sie zu Ehren des Dichterfürsten

und Botanikers oft als Goethepflanze bezeichnet (41).

In der anthroposophisch erweiterten Medizin taucht Bryophyllum im Jahr 1921

erstmals auf. Rudolf Steiner empfahl sie für die Behandlung von Hysterie (42).

Aufgrund seiner beruhigenden Wirkung wird Bryophyllum auch als pflanzliches

Valium bezeichnet und kommt als Mittel bei Unruhezuständen aller Art,

Einschlafstörungen und bei hyperkinetischen Kindern zur Anwendung. Daneben wird

die Pflanze aber auch als Zusatz in entzündungshemmenden Crèmes verwendet.

Seit 1970 wird Bryophyllum pinnatum in Krankenhäusern mit anthroposophisch

erweiterter Medizin routinemässig zur Behandlung vorzeitiger Wehentätigkeit

verwendet. Federführend dabei wirkte der damals am Gemeinschaftskrankenhaus

Herdecke (Deutschland) amtierende Chefarzt der Klinik für Geburtshilfe, Dr. Werner

Hassauer (37).

In einer retrospektiven klinischen Studie wurde 1979 bis 1984 die Wirkung von

Bryophyllum pinnatum mit derjenigen des konventionellen Wehenhemmers Fenoterol

verglichen. Im Vergleich mit der Fachliteratur über Fenoterol zeigte die Behandlung

mit Bryophyllum pinnatum ein vergleichbar gutes Resultat und es wurden bisher

keine subjektiven oder objektiven Nebenwirkungen dokumentiert (39).

In einer weiteren retrospektiven Studie wurden mit Bryophyllum behandelte

Patientinnen der anthroposophischen Kliniken Paracelsus-Spital Richterswil,

Filderklinik Stuttgart und Gemeinschaftskrankenhaus Herdecke mit Patientinnen

verglichen, die im UniversitätsSpital Zürich eine konventionelle Therapie mit

synthetischen β-Sympathomimetika bekommen hatten. Dafür wurden 67 Paare von

schwangeren Frauen gebildet, die wegen frühzeitiger Wehentätigkeit behandelt

wurden und die sich bezüglich Alter der Patientin und des Ungeborenen, Anzahl

bisheriger Kinder und Schwangerschaften, Muttermunddilatation,

Kontraktionsfrequenz, vorzeitigem Blasensprung und anderer relevanter Faktoren

nicht signifikant unterschieden. Dabei waren Verlängerung der Schwangerschaft,

Alter der Neugeborenen bei Geburt und die Anzahl Spitalaufenthaltstage vor und

nach der Geburt sehr ähnlich. Der Gesundheitszustand der Neugeborenen war in der

Bryophyllum pinnatum-Gruppe gleich oder besser. Eindeutig geringer war in der

24

Bryophyllum pinnatum-Gruppe die Zahl der unerwünschten Nebenwirkungen. Zu

berücksichtigen sind bei diesen Ergebnissen allerdings die verschiedenen Konzepte,

mit denen die Patientinnen behandelt wurden und die sozioökonomisch

unterschiedlichen Voraussetzungen der Patientinnen (40).

In einer in–vitro-Studie wurde Bryophyllum pinnatum im Vergleich zu einem

herkömmlichen β-Sympathomimetikum (Fenoterol) an humaner Uterusmuskulatur

getestet. Der Effekt von Bryophyllum pinnatum bzw. Fenoterol wurde innerhalb eines

breiten Konzentrationsbereichs sowohl auf spontane, als auch auf oxytozin-

induzierte Kontraktionen untersucht. Bei Proben von 14 Patientinnen wurden mit

Bryophyllum pinnatum spontane Kontraktionen konzentrationsabhängig gehemmt.

Die in-vitro erhobenen Daten rechtfertigen weitere in-vivo- und in-vitro-Experimente

mit grösseren Kollektiven (25).

In Europa werden Bryophyllum pinnatum-Präparationen weiterhin praktisch exklusiv

in der anthroposophischen Medizin verwendet (41, 43).

2.5.2 Anthroposophische Charakterisierung

Im anthroposophischen Fachterminus wird die Wirkung der Pflanze so erklärt (41):

Das Astralische (d.h. der Blütenbereich) ist bei Bryophyllum mit dem Ätherischen

(d.h. dem Blattbereich) verwoben. Deshalb kommt es da zur Anwendung, wo der zu

starken Trennung von Ätherleib (physiologisch) und Astralleib (seelisch)

entgegengewirkt werden muss.

Bryophyullum pinnatum hat die seltene Fähigkeit, aus den Kerben eines zu Boden

gefallenen Blattes Brutknospen zu treiben, die sich nach einiger Zeit vom Mutterblatt

lösen und zu neuen Pflanzen heranwachsen können (= vegetative Vermehrung).

Kurz vor der Blüte kann dieser Vorgang auch schon an der Pflanze selber

stattfinden. Fast aus jedem Teil der Pflanze kann sich unter günstigen Bedingungen

eine neue Pflanze bilden. Damit nimmt Bryophyllum pinnatum schon im Blattbereich

die Art der Reproduktion voraus, die andere Pflanzen erst in der Frucht- und

Samenbildung entwickeln. Im Blatt finden sich leicht rötlich-violette Muster, die durch

Anthocyane gebildet werden, eine Farbsubstanz, die normalerweise in Blüten

vorkommt. Daran und an der Tatsache, dass Bryophyllum pinnatum nur sehr selten

und unter speziellen Bedingungen blüht, kann man erkennen, dass die

Blütenbildungstendenz in den Blattbereich verschoben ist.

25

Die kleinen Pflänzchen am Blattrand haben dagegen samenartigen Charakter. Das

Blatt enthält in sich selbst eigentlich die ganze Pflanze, wenn auch nur

andeutungsweise sichtbar (44).

Mit der verfrühten Reproduktionskraft geht das verzögerte Element des embryonal

Ungestalteten, die Quellkraft des Sprosses bewahrende Sukkulenz und die

entsprechend kaum metamorphosenhaft fortschreitende Blattform einher. Durch

diese eigenartige Verbindung im mittleren Blattbereich von ausgeprägten keimhaften

Vitalkräften mit den sich abschliessenden und neuveranlagenden

Reproduktionskräften weist die Pflanze Eigenschaften auf, die therapeutisch genutzt

werden können.

Was sich als Naturprozess in dieser Verbindung ausdrückt, hat seine Entsprechung

zu pathologisch seelisch-geistigen Prozessen im Menschen, die unbeherrschte

Stoffwechselprozesse in der unteren Organisation bedingen. Wenn Kräfte des

Stoffwechsel-Gliedmassensystems nicht vom ganzen Organismus ergriffen und

verwandelt werden, sondern sich als verselbständigte Willens- und Phantasiekräfte

als Hyperaktivitäts- und Entzündungsprozesse manifestieren, dann kann

Bryophyllum pinnatum diesem Krankheitsprozess entgegen wirken. Die Pflanze

übernimmt für das zu starke Selbständigwerden von Bildekräften gleichsam den

Krankheitsprozess im unteren Stoffwechselbereich des Menschen, so dass eine

Entlastung der gestörten Kräftebereiche erreicht wird und der Organismus insgesamt

wieder sein normales Gleichgewicht findet.

Als Pflanzenpräparat, vor allem als Blattpräparat spricht Bryophyllum pinnatum

besonders den Seelenleib der rhythmischen Organisation an, wodurch dieser in

seiner Durchdringung und vollen Eingliederung der Stoffwechselprozesse gefördert

werden kann (44).

2.5.3 Botanik

Botanische Einordnung

Der Name der unscheinbaren Pflanze Bryophyllum pinnatum bedeutet bryo = ich

keime und phyllum = Blatt. Bryophyllum pinnatum gehört in die Ordnung

Saxifragales, zur Familie der Crassulaceae (Dickblattgewächse), in die Gattung der

26

Kalanchoë, zur Sektion Bryophyllum. Als Synonyme des Namens Bryophyllum

pinnatum fungieren folgende Namen:

- Kalanchoë pinnata (Lamarck) Persoon

- Crassula pinnata (Linné) 1782

- Cotyledon pinnata (Lamarck) 1786

- Vereia pinnata (Lamarck) Sprengel 1825

- Bryophyllum pinnatum (Lamarck) Oken 1841

- Bryophyllum calycinum (Salisburg) 1805

- Cotyledon calycina (Salisburg) Roth 1821

(45).

In unseren Breitengraden ist etwa die Hauswurz (Sempervivum) ein Vertreter der

Crassulaceae. Andere deutsche Namen für Bryophyllum pinnatum sind: Brutblatt,

Keimzumpe, Triebpflanze, Sprossblatt, Lebenszweig oder Kindlipflanze.

Natürlich kommen verschiedene Bryophyllum-Arten in Madagaskar, im tropischen

Afrika, gemässigten Asien, Australien, Neuseeland, Westindien, Makronesien,

Galapagos, Melanesien, Polynesien und Hawaii vor, wobei jeweils verschiedene

Arten der Gattung vertreten sind (46, 47). Sie werden dort von der einheimischen

Bevölkerung seit langer Zeit traditionell als Arzneidroge gegen allerlei Beschwerden

wie Wunden, Insektenbisse, Furunkel und Prellungen eingesetzt (25, 48).

Crassulacean acid metabolism (CAM) Bryophyllum pinnatum besitzt den für die Familie der Crassulaceae typischen

Crassulacean acid metabolism, was die Bezeichnung für den einzigartigen diurnalen

Säurerhythmus ist und eine Variante des C4-Dicarbonsäureweges darstellt (49). Die

Pflanzen speichern nachts bei geöffneten Stomata CO2 in Form von Malat, um es

tagsüber wieder freizusetzen und in Ribulose-1,5-bisphosphat einzubauen. So

können diese Pflanzen am Tag trotz geschlossener Spaltöffnungen Photosynthese

betreiben (50).

27

Bekannte Inhaltsstoffe

Diverse Inhaltsstoffe von Bryophyllum pinnatum sind bereits bekannt und wurden

zum Teil schon isoliert: Flavonoide (51, 52) und deren Glykoside, denen vor allem

eine antiparasitische Wirkung zugesagt wird (53-56). Über die enhaltenen Phenole

berichten Gaind et al. (57), ebenso beschrieben sind organische Säuren (58).

Die Inhaltsstoffe mit dem vermutlich höchsten toxikologischen Potenzial sind jedoch

die beschriebenen Bufadienolide (59). Diese haben am C-17 des Pregnangerüstes

den ungesättigten 6-gliedrigen Lactonring, der die Herzwirksamkeit ausmacht. Nach

dem Genuss der Blüten von Bryophyllum pinnatum (-Mazerat) zeigten Kälber nebst

einer Wirkung am Herzen eine Lähmung der Kaumuskulatur. Yamagishi et al. und

Supratman et al. isolierten und identifizierten diverse Bufadienolide aus Bryophyllum

pinnatum (60, 61).

2.5.4 Therapeutische Anwendungen in der anthroposophischen Medizin

- Kindliche Hysterie

- Erethismus

- Logorrhoe

- Somnolie

- Nervöse Entzugserscheinungen

- Obstipation

- Sexuelle Reizzustände

- Psychische Erregungszustände

- Unterbindung vorzeitiger Wehen

Gemäss der anthroposophischen Menschen- und Naturerkenntnis werden

Bryophyllum pinnatum-Präparate angewendet bei Anfälligkeit für besondere Formen

von funktionellen Störungen und bei rezidivierenden Entzündungen im Bereich des

Stoffwechselsystems, bei vorzeitiger Wehentätigkeit, bei Schmerzzuständen bei

vitaler Schwäche, bei Unruhe- und seelischen Ausnahmezuständen und dadurch

bedingten Schlafstörungen (62).

Dosierung und Anwendungshäufigkeit variieren stark und werden in der Regel dem

Einzelfall individuell angepasst. Die Entscheidung, ob in der Indikation der

28

vorzeitigen Wehentätigkeit eine orale Verabreichung in Frage kommt oder nicht,

hängt natürlich primär von der Intensität der Wehen und vom Muttermundbefund ab.

Normalerweise wird bei einer Pulverapplikation, die 50% Trituratio mit Laktose

enthält, alle 2 Std. 1 Messerspitze eingenommen (bei akuten Wehen alle 30 Minuten,

bis maximal 8 Messerspitzen täglich). Die Tabletten, die ein Granulat enthalten,

welches aus 50% Presssaft an Laktose besteht, werden zerkaut (bis 8 Kautabletten

täglich).

Bryophyllum pinnatum hat zudem eine leicht sedierende Komponente, welche die

wehenhemmende Wirkung unterstützt.

29

2.6 Die glatte Muskulatur des Uterus

Die Muskulatur des Uterus ist, wie bei anderen Hohlorganen, aus glatten

Muskelzellen aufgebaut. Das Membranpotenzial der glatten Muskulatur ist meist

nicht stabil, sondern ändert sich rhythmisch mit niedriger Frequenz und Amplitude.

Überschreitet die langsame Erregungswelle bei der Depolarisation ein bestimmtes

Schwellenpotenzial, so werden Salven von Aktionspotenzialen ausgelöst, deren

Anzahl und Frequenz umso höher ist, je ausgeprägter die spontane langsame

Depolarisierung ist. Je mehr solcher Salven auftreten, desto länger hält die

Kontraktion an. Eine Kontraktion wird schliesslich durch den Einstrom von Kalzium

ausgelöst.

Die Muskelzellen depolarisieren spontan und die Erregung breitet sich über die gap-

junctions über den ganzen Muskelverband aus. Kurz vor der Geburt erhöht sich die

Anzahl der gap-junctions in der Uterusmuskulatur, um die Erregung des ganzen

Organs zu ermöglichen (5, 63).

2.7 Ziel der Arbeit

Die vorliegende Arbeit fokussiert auf drei Schwerpunkte:

1. Klinische Wirksamkeit: In einer klinischen Studie an schwangeren

Akutpatientinnen soll gezeigt werden, wie und ob sich Bryophyllum pinnatum oral

(Kautabletten Bryophyllum 50%, Weleda) als Alternative zu einer Standardtherapie

(Nifedipin) bei vorzeitiger Wehentätigkeit eignet.

2. Pharmakologie: In-vitro-Untersuchungen an Myometriumstreifen sollen die

Wirkung des Presssaftes von Bryophyllum pinnatum und Fraktionen davon auf die

humane Gebärmuttermuskulatur charakterisieren.

3. Analytik: Der Presssaft von Bryophyllum pinnatum-Blättern soll chemisch-

analytisch bezüglich Inhaltsstoffen und deren Charakterisierung untersucht werden.

Es interessieren dabei v.a. die in der Literatur bereits beschriebenen Inhaltsstoffe

Bufadienolide (59), Flavonoide (51), organische Säuren (58), Zucker, Alkane,

Alkaloide, Wachse und Pektine.

30

3 Material und Methoden

3.1 Klinische Studie

Die klinische Studie wurde unter dem Titel „Bryophyllum pinnatum versus Nifedipin

zur Behandlung der vorzeitigen Wehentätigkeit“ an der Klinik für Geburtshilfe am

UniversitätsSpital Zürich (USZ) durchgeführt.

3.1.1 Prüfung durch Ethikkommission; Notifizierung durch Arzneimittelbehörde (Swissmedic)

Patientinneninformation und Einwilligungserklärung, sowie Datenerhebungsbogen

(Case Report Form, CRF), (Anhänge A, B, C) wurden der kantonalen

Ethikkommission des Kantons Zürich (KEK) und der Swissmedic zur Notifizierung

vorgelegt und von diesen genehmigt. Die im Zusammenhang mit der Swissmedic-

Inspektion geforderten Adaptationen der Studienunterlagen (CRF, Anhang C) nach

GCP-Konformität wurden ebenfalls der KEK und Swissmedic vorgelegt.

3.1.2 Patientinnenkollektiv

Gemäss Poweranalyse, die vor Beginn der Studie durchgeführt wurde, sollten 140

Patientinnen (70 pro Testpräparat) in die prospektive, kontrollierte, randomisierte

Studie aufgenommen werden. In die Studie wurden schwangere Frauen

aufgenommen, für die alle folgenden Einschlusskriterien zutrafen:

-Einlingsschwangerschaft

-Aufnahme in den Gebärsaal zur stationären oder ambulanten Aufsättigung mit

Nifedipin zur Tokolyse bei vorzeitigen Kontraktionen

-Gestationsalter <34+1 SSW

-Bishop-Score <5

-Negativer Fibronektintest

31

Schwangere, für die eines oder mehrere der folgenden Ausschlusskriterien

zutrafen, wurden nicht für die Studie rekrutiert:

-Mehrlingsschwangerschaften

-Gestationsalter > 34.0 SSW

-Bishop-Score ≥5

-Positiver Fibronektintest

-Vaginale Blutung, die eine Tokolyse kontraindizierte

-Sonstige Kontraindikationen für Nifedipin

-Schwere, mit der Studienmedikation interferierende Erkrankung

-Drogenabusus

-Teilnahme an einer Prüfung von Medikamenten in den letzten 4 Wochen vor

Studieneinschluss

Patientinnen, die alle Einschlusskriterien erfüllten und alle Ausschlusskriterien nicht

erfüllten wurden durch den behandelnden Arzt über die Hintergründe und die

Durchführung der Studie aufgeklärt und nach dem Lesen der Patientinneninformation

und der Beantwortung allfälliger Fragen gaben diese ihr schriftliches Einverständnis

zur Teilnahme an der Studie.

3.1.3 Randomisierung

Die Kantonsapotheke Zürich hat die Patientinnen mit dem

Randomisierungsprogramm Randlist Version 1.0 (DatInf GmbH, Tübingen,

Deutschland) randomisiert. Die beiden Gruppen Nifedipin bzw. Bryophyllum

pinnatum wurden jeweils zu Blöcken mit je zehn Patientinnen randomisiert.

32

3.1.4 Studienmedikation

Folgende Arzneimittel wurden für die klinische Studie verwendet:

Tabelle 2. Genaue Bezeichnungen und Chargen der Studienmedikation Medikament Charge Bryophyllum pinnatum-Kautabletten 50% 170,6 mg (Succus ex Bryophyllum), (Weleda)

220708bs 220806bs 100909bs 260508bs

Nifedipin Mepha® 10 mg Kapseln 0850177 0650400 0950132

Adalat CR® 30 mg Bayer bzw. Adalat CR®

60 mg Bayer 100909as 220708as 260508as 220806as

Die Studie verglich die Testmedikation Bryophyllum pinnatum-50% Kautabletten

(Weleda) mit der momentanen Standardmedikation Nifedipin (Nifedipin Mepha®,

Mepha Pharma AG, Aesch, Schweiz und Adalat CR®, Bayer AG, Zürich, Schweiz)

zur Behandlung vorzeitiger Wehentätigkeit am UniversitätsSpital Zürich (USZ). Eine

Gruppe der Studienpatientinnen erhielt also in der ersten Behandlungsstunde jeweils

4 Kautabletten Bryophyllum pinnatum 50% alle 15 Minuten, dann alle 6 Stunden

erneut 2 Kautabletten.

Die Patientinnen der anderen Gruppe erhielten Nifedipin Mepha®-Kapseln 10 mg

(alle 15 Minuten eine Kapsel zum Zerbeissen) und 1.25 Std. nach Start eine Tablette

Adalat CR® 60 mg. In der Folge wurden während 48 Stunden jeweils

abwechslungsweise Adalat CR® 60 mg und Adalat CR® 30 mg alle 12 Std.

eingenommen (= 90 mg/24 Std.).

Nach 49 Std. ab Start der Einnahme der Medikation wurde der Entscheid gefällt, wie

die Patientin weiterbehandelt werden sollte.

Die Medikamente wurden in der Kantonsapotheke Zürich nach folgendem Schema

(Tabelle 3) für jede Patientin verpackt:

33

Tabelle 3. Abpackschema der Medikamte für die Bryophyllum pinnatum-, bzw. die Nifedipingruppe Zeitdauer Phase der

Studie Bryophyllum pinnatum-Gruppe

Nifedipin-Gruppe

49 h (2 Tage) Phase 1 (1. Set) 4+16 = 20 Tabletten

4 x Nifedipin® 10 mg 3 x Adalat® CR 60 mg 2 x Adalat® CR 30 mg

10 Tage Phase 2 (1. Set) 4 Tbl./Tag = 40 Tbl. 10 x Adalat® CR 60 mg 10 x Adalat® CR 30 mg

10 Tage Phase 2 (2. Set) 4 Tbl./Tag = 40 Tbl. 10 x Adalat® CR 60 mg 10 x Adalat® CR 30 mg

3.1.5 Ablauf der Studie

Eintritt/Baseline Zur Baseline-Untersuchung erschienen die Patientinnen notfallmässig, entweder

nach Einweisung durch den privaten Gynäkologen, wegen Portioverkürzung oder

aufgrund persistierender Kontraktionen. Die für die Studie rekrutierten Frauen waren

vorgesehen für eine ambulante oder stationäre Behandlung ihrer vorzeitigen

Wehentätigkeit durch Aufsättigung und Therapie mit Adalat® in der Klinik für

Geburtshilfe des USZ.

Es erfolgte eine Erhebung der demographischen Daten, eine allgemeine Anamnese,

eine geburtshilfliche Anamnese und eine Untersuchung zum allgemeinen

Gesundheitszustand der Patientinnen.

Während 30 Min. wurde ein CTG aufgezeichnet und die Anzahl Kontraktionen pro

Std. wurden erhoben.

Mittels einer digitalen und meist zusätzlich einer sonographischen Untersuchung

wurde anhand von Tabelle 4 der Bishop-Score ermittelt, der Auskunft gibt über den

Zervixzustand.

Tabelle 4. Punkteschema zum Ermitteln des Bishop-Scores Punkte 0 1 2 3 Portiolänge 2 cm 1cm 0.5 cm verstrichen Portiokonsistenz derb mittelweich weich weich Portiolage sakral mediosacral zentriert zentriert Muttermunddilatation zu 1-2 cm 3-4 cm >4 cm Höhenstand vorangehender Kindsteil

3 cm über Interspinallinie

2 cm über Interspinallinie

Kopf eingetreten

weiteres Tiefertreten

34

Für jeden Parameter wird der Zustand erhoben (horizontal). Die Werte werden

vertikal addiert, so dass eine Summe zwischen 0 und 15 erreicht wird.

Einschlusskriterium für die Studie war ein Bishop-Score von <5.

Der Blutdruck wurde nach Riva-Rocci gemessen und zusätzlich der Puls bestimmt.

Es erfolgte eine hämatologische Untersuchung, bestehend aus Hämoglobin- und

Hämatokritbestimmung, Erythrozyten-, Thrombozyten- und Leukozytenzählung,

Bestimmung von MCV (Mittleres Volumen der einzelnen Erythrozyten), MCH

(Hämoglobingehalt der einzelnen Erythrozyten), MCHC (Mittlere korpuskuläre

Hämoglobinkonzentration; Hämoglobinkonzentration aller zellulären Bestandteile im

Blut), C-Reaktives Protein (CRP), Alaninaminotransferase (ALT) und

Aspartataminotransferase (AST). Um das Erfüllen der Einschlusskriterien festzustellen, wurde routinemässig bei jeder

Patientin ein Fibronektintest (QuikCheck® Ffn, CYTYC, Lausanne, Schweiz), sowie

ein vaginaler Abstrich für die Bestimmung der Bakterienzusammensetzung des

Vaginalinhalts durchgeführt.

Es wurden Daten zur aktuellen Schwangerschaft erhoben und die aktuelle

Begleitmedikation, sowie jene bis 4 Wochen vor Einschluss in die Studie ermittelt.

Nach dieser Eintrittsuntersuchung wurde den Patientinnen die randomisierte

Studienmedikation gemäss Einnahmeschema (Anhang A) verabreicht.

Untersuchung 1 (0-1.0 Std.) Messung von Blutdruck und Puls, sowie Aufzeichnen von unerwünschten

Ereignissen und Erfassen eventueller Wechsel in der Begleitmedikation.

Untersuchung 2 (4.0 Std.) Während 30 Min. wurde ein CTG aufgezeichnet und die Anzahl Kontraktionen pro

Std. erhoben.

Als Hauptzielparameter wurde folgendes im Studienprotokoll festgelegt: Es gilt als

Erfolg, wenn eine Patientin vier Stunden nach Beginn der Studienbehandlung „ruhig“

oder „unruhig mit Bishop-Score <5“ war. „Ruhig“ bedeutet eine Abnahme der Zahl

der Kontraktionen pro Std. seit Beginn der Studienbehandlung. „Unruhig“ bedeutet,

dass eine Patientin gleich viele oder mehr Kontraktionen/Std. aufwies als vor

Behandlungsbeginn.

35

Das Ergebnis von Patientinnen, die nach vier Std. „unruhig“ waren und einen Bishop-

Score von 5 oder mehr aufwiesen, wurde als Misserfolg gewertet.

Blutdruck und Puls wurden gemessen.

Es wurden allfällige unerwünschte Ereignisse protokolliert und die Begleitmedikation

festgehalten.

Die Verträglichkeit des Studienmedikaments für die Patientin wurde festgehalten.

Untersuchung 3 (49.0 Std.) 49 Std. nach der ersten Applikation der Studienmedikamente gab es eine weitere

Untersuchung. (Neuer CRF: Es wurde noch eine Untersuchung nach 25 Stunden

eingeschoben, bei welcher ebenfalls Blutdruck, Puls, unerwünschte Ereignisse,

Begleitmedikation und Verträglichkeit registriert wurden).

Nebst Blutdruck- und Pulsmessung wurde wiederum Blut für eine hämatologische

Untersuchung entnommen.

Es wurden erneut ein vaginaler Abstrich und ein Fibronektintest durchgeführt.

Unerwünschte Ereignisse, Begleitmedikation und Verträglichkeit der

Studienmedikation wurden protokolliert.

Untersuchung 4 (Wochenbett) Die letzte Untersuchung zum Gesundheitszustand der Patientin und des

Neugeborenen wurde 24 Std. nach der Geburt bzw. bei Entlassung der Patientin

nach Hause (neuer CRF) durchgeführt. Blutdruck und Puls wurden bestimmt.

Es wurden Daten zum Verlauf der Schwangerschaft seit der Untersuchung 3

erhoben, unerwünschte Ereignisse aufgezeichnet und die Begleitmedikation erfasst.

Daten zur Geburt und zum Neugeborenenzustand (Gewicht, Länge, APGAR-Score)

wurden protokolliert und der Verlauf des Wochenbetts wurde festgehalten.

Wenn eine Patientin nach Untersuchung 3 bis zur Geburt noch Medikamente zur

Tokolyse erhalten hat, wurde hier die Dosierung protokolliert. Auch die

Begleitmedikation wurde erfasst. Ein allfälliger vorzeitiger Ausstieg aus der Studie

wurde ebenfalls protokolliert.

36

3.1.6 Herkunft der Patientinnendaten Die bei Eintritt in unsere Klinik in jedem Fall erhobenen Daten zur Demographie

wurden aus der Krankengeschichte übernommen. Alle für die Studie erhobenen

Daten sind entweder in der Krankengeschichte (Papierform), im Kliniksystem Perinat,

im OB TraceVue-Web (Koninklijke Philips Electronics N.V.) oder im System des

UniversitätsSpitals Zürich KISIM zu finden. Diese wurden in die entsprechenden

CRFs übertragen.

3.1.7 Schulung der Ärzte

Die behandelnden Ärzte wurden gemäss ICH Guideline for Good Clinical Practice

(1.5.96 The European Agency for the Evaluation of Medicinal Products, EMEA) über

Kapitel 4.8 und 4.11 und über die Verordnung über klinische Versuche mit Heilmitteln

(VKlin, Schweizerisches Heilmittelgesetz, HMG, 812.214.2) geschult und erhielten

jeweils eine persönliche Einführung in den Ablauf der Studie.

3.1.8 Monitoring

Das regelmässige Monitoring der Studie erfolgte durch Frau Dr. A.-P. Simões-Wüst

(Forschungsleiterin Paracelsusspital, Richterswil, Schweiz).

3.1.9 Statistische Methoden

Alle Daten wurden in EXCEL codiert und mit SPSS Version 16 analysiert. Die

Ergebnisse der Analysen mit einem p-Wert kleiner als 0.05 (5%) wurden als

statistisch signifikant interpretiert.

Um zu untersuchen, ob die erhobenen Daten normalverteilt sind, wurde ein

Kolmogorov-Smirnov-Test durchgeführt.

Es wurden mittels deskriptiver Statistik der erhobenen quantitativen Merkmale die

Mittelwerte, Standardabweichungen (SA), sowie beobachtete Anzahlen mit den

entsprechenden relativen Häufigkeiten berechnet.

37

Ein t-Test für zwei unabhängige Stichproben wurde angewandt, um die Unterschiede

in den quantitativen Merkmalen und den beobachteten Anzahlen zwischen den

beiden Behandlungsgruppen Nifedipin und Bryophyllum pinnatum zu untersuchen.

Bei der Analyse der qualitativen Merkmale in Abhängigkeit vom Behandlungsfaktor

(Nifedipin/Bryophyllum pinnatum) wurde ein Chi2-Test (bzw. ein exakter Test nach

Fisher) angewendet.

Für die Analyse der Dauer Eintrittsuntersuchung bis Geburt in Tagen in Abhängigkeit

vom Behandlungsfaktor (Nifedipin/Bryophyllum pinnatum), korrigiert für das

Gestationsalter, wurde eine Covarianzanalyse durchgeführt.

Für die Analyse des APGAR-Score nach 1, 5 und 10 Minuten, in Abhängigkeit vom

Behandlungsfaktor (Nifedipin/Bryophyllum pinnatum), korrigiert für das

Gestationsalter, wurden die ordinalen logistischen Regressionen angewandt.

Um einen Unterschied zwischen Eintrittsuntersuchung und Untersuchung 2 in Bezug

auf die Anzahl der Kontraktionen und den Bishop-Score in jeder Behandlungsgruppe

separat herauszufinden, wurde ein t-Test für eine Stichprobe aus den Differenzen

berechnet. Dies entspricht einem gepaarten t-Test. Das entsprechende 95%-

Vertrauensintervall (VI) für die mittlere Differenz wurde ermittelt.

Um einen Unterschied zwischen Eintrittsuntersuchung und Untersuchung 3 in Bezug

auf die Anzahl Leukozyten, die Anzahl Thrombozyten, AST, ALT, CRP, Blutdruck

(BD) und Puls in jeder Behandlungsgruppe separat herauszufinden, wurde ein

gepaarter t-Test durchgeführt.

Um einen Unterschied zwischen Eintrittsuntersuchung und Untersuchung 1, bzw.

zwischen Baseline-Untersuchung und Wochenbett-Untersuchung in Bezug auf BD

und Puls in jeder Behandlungsgruppe separat herauszufinden, wurde ein gepaarter t-

Test durchgeführt.

Um einen Unterschied zwischen Eintrittsuntersuchung und Wochenbett-

Untersuchung in Bezug auf eine behandlungsbedürftige Anämie in jeder

Behandlungsgruppe separat herauszufinden, wurde ein MC Nemar-Test

durchgeführt.

Um herauszufinden, ob ein Unterschied in der Wirkung der Behandlungen auf die

mittlere Verringerung der Anzahl der Kontraktionen bzw. die Veränderung des

Bishop-Score zwischen Eintrittsuntersuchung und Untersuchung 2 vorhanden ist,

wurde ein t-Test für zwei unabhängige Stichproben angewandt.

38

Ein Chi2-Test wurde angewandt um die Unterschiede in den Häufigkeiten der

verabreichten Begleitmedikation zwischen den Behandlungsfaktoren

(Nifedipin/Bryophyllum pinnatum) und den verschiedenen Medikamenten-Gruppen

zu entdecken.

3.2 Pharmakologie

Es wurden in-vitro-Experimente an Myometriumstreifen durchgeführt, um die

kontraktionshemmende Wirkung des Presssaftes von Bryophyllum pinnatum und

Fraktionen davon auf die humane Gebärmuttermuskulatur am Geburtstermin zu

untersuchen.

3.2.1 Patientinnenkollektiv

Das für die Versuche verwendete Gewebe wurde während primären Sectiones

caesareae aus der Uterotomie entnommen, sodass für die Patientinnen keine

zusätzlichen Narben und Schmerzen entstanden. Dafür wurde jeweils am Vorabend

der Sectio caesarea eine schriftliche Einverständniserklärung der Patientinnen

eingeholt.

Es wurde ausschliesslich Myometrium von Einlingsschwangerschaften entnommen.

Die Teilnehmerinnen durften zudem in den 2 Wochen vor der Sectio caesarea keine

Tokolyse erhalten haben und mussten einen negativen HIV-Test ausweisen.

3.2.2 Myometrium

Das Myometriumprobenstück war jeweils ca. 5x1x1 cm gross. Dieses wurde sofort

nach Entnahme in Ringerlösung (Zusammensetzung Anhang E) gelegt und ins Labor

transportiert, wo es mittels einer feinen, geraden, spitzen Schere in Streifen (ca.

15x2x1 mm) geschnitten wurde. Obwohl Uterusmuskulatur grundsätzlich zu

Kontraktionen in allen Richtungen fähig ist, wurde jeweils mit der Längsrichtung der

Muskelfasern geschnitten, da die Kontraktionen erfahrungsgemäss so am besten

abzuleiten sind.

39

Abb. 2. Aus der Uterotomie entnommenes, frisches Myometriumstück (ca. 5x1x1 cm) in Krebslösung.

Abb. 3. Mit einer feinen, geraden, spitzen Schere wird eine glatte und frische Oberfläche zur besseren Präparation der Versuchsstreifen geschnitten.

Abb. 4. Die grobe anatomische Pinzette hält einen präparierten Myometriumstreifen ca. 15x2x1 mm.

40

Abb. 5. Die vier für ein Experiment vorbereiteten Myometriumstreifen liegen in Krebslösung zum Einspannen bereit.

3.2.3 Der Myograph

Mittels Myograph DMT800MS (Muscle Strip Myograph System, DMT, Dänemark,

Lieferant ADInstruments GmbH, Spechbach, Deutschland) wurden die Kontraktionen

der präparierten und eingespannten Myometriumstreifen aufgenommen und mittels

Transducer (Power Lab 4/30) auf den Computer übertragen, wo sie mit der Software

Chart 5, Lab Chart Pro dargestellt werden konnten. Der Myograph besteht aus einem

Block mit vier unabhängigen aufgesetzten Messkammern aus Aluminium (Abb. 6-8).

Die Vertiefungen sind mit rostfreiem Stahl ausgekleidet und haben je 7 ml Inhalt.

Diese Vertiefungen waren jeweils während des Versuchs mit Krebslösung (pH =

7.40) (Zusammensetzung Anhang E) gefüllt. Eine Heizung mit Thermostat garantiert

eine konstante Versuchstemperatur von 37.0°C in den Versuchskammern. In jeder

dieser Myographkammern befinden sich 2 Haltevorrichtungen, mit welchen der

Myometriumstreifen eingespannt und festgeschraubt wurde. Die eine Seite ist fest

montiert und mit einer Mikrometerschraube versehen, um eine gute Startspannung

des Muskelgewebes einzustellen, damit die vom Muskelgewebe vollzogenen

Kontraktionen überhaupt aufgezeichnet werden können. Die andere Haltevorrichtung

ist mit dem Transducer verbunden und nimmt die Kontraktionen auf, um sie an

diesen weiterzuleiten. Von dort werden die gemessenen Kräfte an den Computer

weitergeleitet und mittels Chart 5 als Kontraktionen dargestellt.

41

Durch einen kleinen Plastikschlauch an der Halterung der Mikrometerschraube kann

kontinuierlich Oxycarbon (95% Sauerstoff, 5% Kohlendioxid, Pangas, Dagmarsellen,

Schweiz) in die Myographkammer geleitet werden.

Abb. 6. Der Myograph mit 4 Kammern zur Messung der Muskelkontraktionen. An der rechten Seite jeder Kammer ist der Plastikschlauch für die Gaszufuhr zu erkennen.

Abb. 7. Leere Myographkammer, rechts das Anschlusskabel zum Myographen (Datenübertragung an den Transducer). Links ist das schwarze Ende der Mikrometerschraube sichtbar, mit welcher die Spannung des Muskelgewebes eingestellt wird.

Abb. 8. Nahaufnahme einer Myographkammer mit links bereits eingespann- tem Muskelstreifen. Rechts ist die Halteplatte zur Seite geschoben, damit sichtbar ist, wie der Muskel aufliegt. Die Kammer ist mit Krebslösung gefüllt.

42

Nachdem die Muskelstreifen eingespannt und die mit Krebslösung gefüllte Kammer

regelmässig mit Oxycarbon versorgt wurde, musste gewartet werden, bis die

Myometriumstreifen regelmässig kontrahierten. Dazu wurde jeweils von Auge

abgeschätzt, ab wann die Fläche unter der Kontraktionskurve (AUC) von Kontraktion

zu Kontraktion gleich blieb. Die verdunstete Krebslösung wurde stets aufgefüllt. Nach

5 regelmässigen Kontraktionen eines Muskelstreifens wurden 2 μl (experimentell

ermittelt) der jeweiligen Kontroll- oder Testlösung der Krebslösung in der

Myographkammer mittels Pipette Pipetman (Gilson) zugegeben. Als Testlösungen

wurden sowohl der Presssaft aus Bryophyllum pinnatum filtriert (Faltenfilter No 5951/2

Schleicher und Schuell AG, Feldbach, Schweiz), als auch die Fraktionen 2, 4, und 12

aus der MPLC-Fraktionierung (Kap. 3.3.3), verwendet. Alle Lösungen wurden in

ihren Anfangskonzentrationen, das heisst Presssaft, Fraktion 2 (100 mg/ml), Fraktion

4 (100 mg/ml), Fraktion 12 (100 mg/ml) und je als 10%ige, 5%ige, 2%ige und 1%ige

Lösung in DMSO (99.9%, Sigma, St. Louis, Lieferant Sigma-Aldrich, Schweiz)

verwendet. Als Kontrolllösung diente Krebslösung, die in der gleichen Menge

zugegeben wurde. Tabelle 5 zeigt eine Übersicht der verwendeten Lösungen.

Tabelle 5. Die verwendeten Kontroll- und Testlösungen Lösung Konzentration Krebslösung unverdünnt Presssaft Bryophyllum pinnatum unverdünnt Presssaft Bryophyllum pinnatum 10% Presssaft Bryophyllum pinnatum 5% Presssaft Bryophyllum pinnatum 2% Presssaft Bryophyllum pinnatum 1% Fraktion 2 unverdünnt Fraktion 2 10% Fraktion 2 5% Fraktion 2 2% Fraktion 2 1% Fraktion 4 unverdünnt Fraktion 4 10% Fraktion 4 5% Fraktion 4 2% Fraktion 4 1% Fraktion 12 unverdünnt Fraktion 12 10% Fraktion 12 5% Fraktion 12 2% Fraktion 12 1%

43

Abb. 9. Myometriumstreifen während des Experiments. Auf der x-Achse (Zeitachse Std.) ist ersichtlich, dass der Streifen nach ca. 1.25 Std. zu kontrahieren begann und nach 2 Std. 35 Min. die ersten 5 regelmässigen Kontraktionen abgeschlossen hatte und die erste Zugabe der Testlösung (hier B/3 BP 2 μl, d. h. Presssaft aus Bryophyllum pinnatum) erfolgte. Die Kraft, mit der der Muskelstreifen kontrahiert ist auf der y-Achse in g angegeben.

Nach jeweils 5 weiteren Kontraktionen erfolgte eine erneute Zugabe der gleichen

Testlösung. Bei jedem Myometriumstreifen wurde diese Zugabe wiederholt, bis er

nicht mehr aufzeichenbar kontrahierte.

Abb. 10. Gleicher Myometriumstreifen wie oben: Mit jeder Probenzugabe (siehe 4, 9, 15, 21 und 27) abnehmende Kontraktionen, welche bei diesem Experiment nach ca. 5 Std. nicht mehr aufzeichenbar waren.

Um sicherzustellen, dass die Muskelzellen nicht zerstört oder bloss ermüdet sind und

aus diesem Grund aufhören zu kontrahieren, sondern die Kontraktionen effektiv

gehemmt sind, wurde nach 1 Std. Latenzzeit ohne Kontraktionen die Krebslösung

entfernt, der Myometriumstreifen 3 Mal mit Krebslösung gewaschen und

anschliessend die Versuchskammer mit frischer Krebslösung gefüllt und erneute

Kontraktionen abgewartet.

Abb. 11. Latenzzeit von 1 Std. (zwischen 5:00:00 Std. und 6:00:00 Std.). Bei 41 wurde der Streifen 3 Mal mit Krebslösung gewaschen und die Versuchskammer mit frischer Krebslösung gefüllt. Bei 6 Std. 17 Min. ist ersichtlich, dass der Muskelstreifen erneut zu kontrahieren begann. Bei „stop“ wurde dieser Versuch beendet.

44

Nach jedem Versuch wurden die Kammern des Myographen mit 8%iger Essigsäure

und anschliessend mit destilliertem Wasser gereinigt.

3.2.4 Auswertung der Myogramme

Die mittels Chart 5 aufgezeichneten Myogramme wurden für Amplitude, AUC und

Kontraktionsfrequenz ausgewertet.

Abb. 12. Peak (Kontraktion) eines Myometriumstreifens mit der Zeitachse (x-Achse) und der gemessenen Kraft in g (y-Achse). Als AUC wurde jeweils die Fläche unter der Kurve bis zur Baseline gemessen und als Amplitude die Distanz zwischen Baseline und dem höchsten Punkt des Peaks.

Da sich jedes Gewebe anders verhält, nur die natürlich entstandenen Kontraktionen

gemessen wurden und auf jegliche kontraktionsanregenden Stoffe verzichtet wurde,

konnten nicht die absolut gemessenen Amplituden und AUCs für die Auswertung der

Daten verwendet werden. Die Mittelwerte der ersten fünf regelmässigen

Kontraktionen jedes Myometriumstreifens wurden jeweils als 100% gesetzt. Von den

darauf folgenden fünf Kontraktionen wurde jeweils der Mittelwert berechnet und

dieser in Prozent des Ausgangswerts angegeben. Die so gewonnenen relativen

Werte der einzelnen Muskelstreifen konnten miteinander verglichen werden.

Baseline

Amplitude

Fläche

45

Um die Frequenz der Muskelkontraktionen zu bestimmen, wurde die Zeit anfangs der

ersten Kontraktion eines Fünfer-Blocks bis zum Ende der fünften Kontraktion

gemessen, durch fünf geteilt und in Kontraktionen pro Min. ausgerechnet. Hier wurde

ebenfalls der Wert des ersten Fünfer-Blocks als 100% gesetzt und die folgenden

Frequenzen in Prozent des Ausgangswerts ausgedrückt.

3.2.5 Statistische Methoden

Mittels deskriptiver Statistiken der demographischen Variablen wurden die

gemessenen Daten analysiert. Es wurden die Mittelwerte und die SA, sowie

beobachtete Anzahlen mit den entsprechenden Häufigkeiten berechnet.

Die prozentualen Veränderungen in Amplitude, AUC und Frequenz gegenüber den

Ausgangswerten wurden berechnet. Bei jeder Behandlung und bei jeder Zugabe

wurde der Mittelwert der prozentualen Veränderungen zusammen mit dem

entsprechenden 95%-VI angegeben. Diejenigen 95%-VI, die den Wert 100% nicht

enthielten, wiesen darauf hin, dass auf dem Signifikanzniveau von 5% ein

Unterschied zwischen dem Anfangswert und dem gemessenen Wert nach einer

Zugabe bestand.

Lineare gemischte Modelle wurden angewandt, um die Tatsache zu berücksichtigen,

dass eine Probe bei verschiedenen Zugaben gemessen wurde. Somit sind die

longitudinalen Beobachtungen innerhalb der gleichen Probe voneinander abhängig.

Innerhalb der gleichen Behandlungsart (Kontrolle mit Krebslösung, Presssaft,

Fraktion 2, Fraktion 4 oder Fraktion 12) wurde der Einfluss der verschiedenen

Konzentrationen (unverdünnt, 10%-, 5%-, 2%-, 1%- Verdünnung) und der Zugaben

auf die prozentualen Veränderungen von Amplitude, AUC und Frequenz untersucht.

Dabei wurde die Wechselwirkung zwischen Konzentration und Zugabe

mitberücksichtigt.

Ferner wurde der Unterschied zwischen Presssaft und Fraktion 4 innerhalb jeder

Konzentration separat auf die prozentualen Veränderungen in Amplitude, AUC und

Frequenz mit jeder Zugabe analysiert.

Der Unterschied der Wirkung zwischen Kontrolle und Presssaft bzw. Fraktion 2,

Fraktion 4 und Fraktion 12 jeweils unverdünnt separat auf die prozentualen

Veränderungen in Amplitude, AUC und Frequenz mit jeder Zugabe wurde analysiert.

46

Um festzustellen, ob die gewonnen Daten normalverteilt sind, wurde der

Kolmogorov-Smirnov-Test verwendet.

3.3 Analytik

3.3.1 Bryophyllum pinnatum-Presssaft

Der in dieser Arbeit verwendete Presssaft von Bryophyllum pinnatum wurde aus in

Brasilien kultivierten und dort sofort nach der Ernte gefrorenen Pflanzen in der

Schweiz durch mechanisches Abpressen gewonnen (Bryophyllum pinnatum-

Presssaft folium rec 26.3.2007, Weleda). Aus einem g frischer Pflanze resultierten

580 mg Presssaft.

Bis 2006 wurde zur Qualitätskontrolle des Presssaftes von Bryophyllum pinnatum

eine in der Firma Weleda entwickelte Methode verwendet. Diese Methode wurde

optimiert und aufgrund der tiefen Anteile an Bufadienoliden in den Rohextrakten

wurde zur Probenvorbereitung eine Festphasen-Extraktion durchgeführt. Diese

diente dazu, polare Substanzen wie Flavonoide oder Zimtsäurederivate abzutrennen

und die Bufadienolide zur besseren Detektierbarkeit mittels Diodenarraydetektor

(DAD) anzureichern (64).

In der vorliegenden Arbeit sollte die Methode so angepasst werden, dass eine

chemische Analyse möglichst vieler Bestandteile des Presssaftes eine Art

chromatographisches Profiling bzw. Fingerprinting möglich und keine oder nur sehr

wenig Probenvorbereitung notwendig war.

Abb. 13.Bryophyllum pinnatum-Presssaft. Links: filtriert; rechts: unfiltriert.

47

3.3.2 Hochleistungs-Flüssigchromatographie (HPLC) Die Hochleistungs-Flüssigchromatographie (High Performance Liquid

Chromatography, HPLC) ist eine chromatographische Methode, bei der die

stationäre Phase in Form einer Säule vorliegt. Die Bewegung der mobilen Phase

erfolgt durch Pumpen, welche Drücke von >40 bis 400 bar aufwenden müssen, um

den Widerstand der stationären Phase zu überwinden.

Meistens werden in der analytischen HPLC Säulen verwendet, die aus speziellem,

innen völlig glattpoliertem Chrom-Nickel-Molybdän-Stahl bestehen. Die Durchmesser

betragen 2-5 mm und sie sind 5-25 cm lang.

Als stationäre Phase enthalten Säule und Vorsäule Kieselgel, das mit

Octadecylgruppen derivatisiert ist. Durch mehrere Derivatisierungsschritte erhält die

Oberfläche eine Bedeckung mit lipophilen Alkylgruppen. Diese stationäre Phase

zeichnet sich aus durch gute Stabilität auch im niedrigen pH-Bereich. Moderne

Umkehrphasen zeichnen sich aus durch hohe Trennleistung und hohe

Peaksymmetrie aufgrund kleiner Partikelgrössen (typischerweise 3-5 μm) und hoher

Packungsdichte.

Die aufzutragende Probe muss sich jeweils in der mobilen Phase lösen und vor dem

Einspritzen ins Gerät filtriert werden. Die HPLC kann zur Trennung und qualitativen

Analytik, als auch zur quantitativen Analytik eingesetzt werden.

Als Ergebnis der Trennung wird im HPLC-Chromatogramm die Intensität des

Detektorsignals in Abhängigkeit von der Zeit registriert.

Mit dem korrekten Einsatz eines internen Standards können Fehlerquellen bei der

Probenvorbereitung und der Analyse minimiert werden. Der interne Standard muss

allen Eich- und Messlösungen in gleicher Konzentration zugegeben werden. Interne

Standards müssen sich möglichst gleich verhalten wie die zu bestimmenden

Komponenten. Zudem sollten sie möglichst in der Mitte des Chromatogramms oder

in der Nähe des interessierenden Peaks eluiert werden und eher nicht ganz zu

Beginn oder ganz am Ende der Trennung.

Einzelne Peaks können genauer charakterisiert werden, indem die UV/VIS-Spektren

analysiert und mit jenen von zu erwartenden Stoffen verglichen werden. Dazu wird

der Diodenarray-Detektor (DAD) verwendet.

Hier wird sichtbares und UV-Licht durch die Probe geschickt und dessen Energie von

bestimmten organischen Molekülen teilweise absorbiert und regt π- und n-

48

Elektronen an. Die durch graphische Auftragung der Lichtabsorption gegen die

Wellenlänge erhaltenen Absorptionsspektren des sichtbaren und UV-Bereichs

dienen der qualitativen und quantitativen Analyse von Arzneistoffen.

Die Methode der HPLC hat den Vorteil, dass sie praktisch universell einsetzbar ist.

Deshalb ist sie heute die am meisten genutzte Trennmethode in der

pharmazeutischen Analytik (65-69).

Abb. 14. Agilent 1100 HPLC-System mit Autosampler, Kapillarpum- pen und Diodenarray-Detektor, sowie Lösungsmittelhalterung, Ent- gaser und Computer zur Datenverarbeitung.

Damit die im Presssaft vorhandenen Inhaltsstoffe entsprechenden Substanzklassen

oder sogar einzelnen Stoffgruppen zugeordnet werden können, wurden als interne

Standards Hesperidin (für Flavonoide) und Bufalin (für Bufadienolide) verwendet.

Abb. 15. Strukturformel von Hesperidin (Hesperetin 7-rhamnoglucosid) als interner Standard für im Presssaft vorhandene Flavonoide und Flavonoidglykoside (70).

49

Abb. 16. Strukturformel von Bufalin (3β,14-Dihydroxy-5β,20(22)-bufadienolid, 5β,20(22)-Bufadienolid-3β,14-diol)(71).

Es wurde eine Lösung von genau 0.2 mg/ml Hesperidin (Abb. 15; H-5254

Hesperetin 7-rhamnoglucosid, Sigma-Aldrich) in MeOH (Methanol G Chromasolv

34885, Sigma) hergestellt = Interne Standard-Lösung 1 (I.S.-1).

Eine Lösung von genau 0.2 mg/ml Bufalin (Abb. 16; Calbiochem, Lieferant Roth AG,

Arlesheim, Schweiz) in MeOH wurde hergestellt = Interne Standard-Lösung 2 (I.S.-

2).

Es wurden 1 ml I.S.-1, 0.5 ml I.S.-2 und 2.15 ml filtrierter Presssaft (B/3 BP 26.3.07

Weleda) in ein Reagenzglas pipettiert und anschliessend mittels

Stickstoffevaporation (Turbo Vap LV Evaporator, Zymark) das MeOH entfernt. Die

Probe wurde über Nacht bei -20°C gefroren und während 88 h lyophilisiert (Lyolab A,

LSL Secfroid AG, Aclens, Schweiz).

Das weisse Lyophilisat wurde in 1 ml MeOH aufgenommen, 10 min im Ultraschallbad

behandelt und nach Filtration (8804C-RC-4 Cronus Filter, Infochroma) mittels HPLC

unter den unten genannten Bedingungen analysiert. Die Proben wurden bei -20°C

gelagert.

Alternativ wurde die Lyophilisation durch eine Stickstoff-Evaporation oder durch

Einengen am Rotationsverdampfer (Büchi B480, 30°C, 40 mbar) ersetzt.

Alle HPLC-Analysen wurden mittels eines Agilent Series 1100 HPLC-Gerätes

durchgeführt (Agilent, Waldbronn, Deutschland). Dieses besteht im Wesentlichen

aus einer Kapillarpumpe (CapPump B1376a), einem Diodenarray-Detektor (DAD

50

G1315b), einem Autosampler und einem PC zur Datenverarbeitung (Abb. 14). Zur

Trennung wurde eine Waters sun Fire C18 Säule (150 mm x 3 mm i. d. 3.5 µm

Partikelgrösse) mit Vorsäule (Waters sun Fire C18 3 x 20 mm, Waters, Baden-

Dättwil, Schweiz) verwendet.

Die mobile Phase setzte sich zusammen aus

A: 0.1% Ameisensäure

Herstellung: 999 ml H2O ultrapur (18.2 MΩ, ELGA Purelab ultra genetic,

Labtec AG, Wohlen, Schweiz) und 1 ml Ameisensäure (98-100%, pro analysi,

Merck, Darmstadt, Deutschland)

B: Acetonitril (Acetonitrile Chromasolv 34851, Sigma-Aldrich, Buchs, Schweiz).

Die Chromatographie erfolgte mittels linearem Gradienten 0-30 min 5-100% B in A.

Der Fluss betrug 500 µl/min bei 25°C. Es wurden die DAD-Spektren bei 298 nm

aufgenommen und 190-400 nm gespeichert.

3.3.3 Mitteldruck-Flüssigchromatographie (MPLC)

Beim Verfahren der MPLC werden Drücke von ca. 10-40 bar angewandt. Das Prinzip

der chromatographischen Trennung von Substanzen ist das gleiche wie bei der

HPLC.

Um möglichst wenig Inhaltsstoffe des Presssaftes zu verlieren, wurde dieser nicht

filtriert.

Es wurden 1829 g Presssaft von Bryophyllum pinnatum lyophilisiert und 78.9 g

Lyophilisat erhalten. Diese wurden in MeOH aufgeschlemmt und filtriert (Faltenfilter

Schleicher und Schuell AG, Feldbach, Schweiz).

Der Rückstand wurde 3 Mal mit MeOH gewaschen, alle MeOH-Fraktionen vereinigt

und mittels Rotationsverdampfer eingeengt. Es wurden 5.93 g einer dickflüssigen,

leicht braunen Masse erhalten. Diese wurde in 10 ml MeOH gelöst.

Sephadex LH-20 Als stationäre Phase für die MPLC-Trennung diente Sephadex LH-20. Das ist ein

aufgereihtes, vernetztes Dextran mit Partikelgrössen von 25-100 µm. Die daran

gebundenen Hydroxypropylgruppen ergeben stationäre Phasen mit sowohl

51

hydrophilem als auch lipophilem Charakter. Das Material quillt in Wasser und einigen

organischen Lösungsmitteln etwa auf das 4-fache seines Volumens.

Über Nacht wurde Sephadex LH-20 in MeOH im Überschuss in einem separaten

Gefäss quellen gelassen und mittels eines Füllreservoirs in die

Chromatographiesäulen gefüllt.

Mittels einer Büchi-Apparatur, bestehend aus 3 Glassäulen C-690 100 x 25 mm, 2

Pump-Modulen C-605, Pump-Manager C-615 und Fraction-Collector C-660 (Abb. 17)

wurde die Lösung fraktioniert.

Das Totvolumen der Säule betrug 800 ml, weshalb das Sammeln der Fraktionen mit

5 Std. 20 Min. Latenzzeit nach Probenaufgabe gestartet wurde. Als mobile Phase

wurde MeOH verwendet. Pro Sammelfraktion wurde während 6 Min. (Flussrate 2.5

ml/Min.) gesammelt, wobei der Maximaldruck der Pumpen 2.5 bar nicht übersteigen

durfte.

Abb. 17. Anlage zur Trennung des Presssaf-

tes von Bryophyllum pinnatum mittels Sepha- dex LH-20. Im Hintergrund die Trennsäulen, im Vordergrund die Büchi-Apparatur mit Pumpen und Fraktionensammler.

52

3.3.4 Dünnschichtchromatographie (DC) Die DC dient zur Trennung sowie zur qualitativen und quantitativen Analyse von

Substanzen. Als stationäre Phasen dienen Feststoffe oder an Feststoffe adsorbierte

Flüssigkeiten, als mobile Phasen werden Flüssigkeiten verwendet. Die Trennung

erfolgt je nach stationärer Phase durch Adsorption und/oder Verteilung.

Die Analysensubstanz wird als Lösung auf eine Zone am unteren Rand der Platte

aufgetragen und die Platte in eine Entwicklungskammer gestellt, die die mobile

Phase enthält. Die zu untersuchenden Substanzen werden unterschiedlich weit

transportiert. Ihre Position auf der DC-Platte wird durch ihren Retardierungsfaktor

(RF-Wert) beschrieben (65).

Phasemobilen der Front undStart zwischen EntfernungsitionSubstanzpo undStart zwischen Entfernung

F Wert-R =

Die erhaltenen Sammelfraktionen aus der MPLC-Trennung wurden mittels DC-

Monitoring (Alugram RP-18 W/UV254 5x20 cm, Macherey und Nagel, Düren,

Deutschland und HPTLC-Fertigplatten Kieselgel 60 F254 für Nano-DC, Merck,

Darmstadt, Deutschland) verglichen, entsprechend vereinigt und mittels

Rotationsverdampfer eingeengt und anschliessend gewogen.

Für die DC wurden jeweils auf 2 DC-Platten 5-10 μl der nicht einrotierten Fraktion

aufgetragen und über eine Laufstrecke von 10 cm mit folgenden mobilen Phasen

aufgetrennt:

1. Dichlormethan (DCM)

2. MeOH-EtOAc (1:3, v/v)

53

3.3.5 Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie (HPLC-MS)

Um einzelne Substanzen im Presssaft und in den mit MPLC hergestellten Fraktionen

zu identifizieren, wurde das Verfahren der Massenspektrometrie angewandt. Dabei

wird ein Strahl mit ionisierten Teilchen eines Analyten durch ein elektrisches Feld

beschleunigt und nach den verschiedenen Massen/Ladungsverhältnissen

aufgetrennt.

Da organische Substanzen und somit komplexe Stoffgemische untersucht werden

sollten, wurden die Proben mittels HPLC aufgetrennt, bevor sie dem

Massenspektrometer zugeführt wurden.

Der Eluent aus dem HPLC wurde mit einem Elektronenspray-Ionisator ionisiert (72)

und in die Gasphase überführt, bevor dann der Teilchenstrahl im Vakuum über eine

Transferkapillare zum Massenspektrometer geleitet wurde.

Abb. 18. Schematische Darstellung HPLC-MS.

Mittels HPLC-MS wurden der Presssaft aus Bryophyllum pinnatum und dessen

Fraktionen 2, 4 und 12 aus der Sephadex-Trennung untersucht. Dazu wurde ein

Agilent 1100 HPLC-Gerät und LCQ Thermo Fischer (Pharmakognosie, UniGE)

verwendet. Die HPLC-Bedingungen entsprachen den obengenannten HPLC-DAD-

Bedingungen.

Die genauen Einstellungen des Massenspektrometers sind in Anhang F aufgeführt.

Es wurde eine systematische Literatursuche mittels Scifinder® nach bekannten

chemischen Strukturen und bisher bereits isolierten Inhaltsstoffen in Bryophyllum

pinnatum durchgeführt.

HPLC Elektronenspray-Ionisator Massenspektrometer

54

3.3.6 Bryophyllum pinnatum-Presssaft zur Verdrängung von Flunitrazepam am GABAA-Rezeptor Der folgende Versuch wurde am Institut für Biochemie und molekulare Medizin der

Universität Bern (Gruppe Prof. Dr. E. Sigel) durchgeführt.

Um die Bindungs-Eigenschaften und so eine mögliche Wirkungsweise des

Presssaftes aus Bryophyllum pinnatum besser zu verstehen, wurde ein Versuch zur

Verdrängung von Flunitrazepam an den GABA-Bindungsstellen des GABAA-

Rezeptors durchgeführt.

Flunitrazepam ist ein Benzodiazepin, das seine Verwendung vor allem als

Schlafmittel findet. Es bindet an die Benzodiazepin-Bindungsstelle am GABAA-

Rezeptor, was eine verstärkte GABAerge Hemmung zur Folge hat (73).

Dazu wurden 500 μl Kuhhirnmembran homogenisiert (Glas/Teflon-Homogenisator,

10x auf und ab) und 3000 μl Kpi-Puffer (Phosphat-Puffer (10 mM KH2PO4, 100 mM

KCl, 0.1 mM K-EDTA, pH 7.4)) zugefügt.

Es wurden 7 Lösungen zu je 340 μl Membranhomogenisat aliquotiert (Nummern 1-

7).

Die Stammlösung (Presssaft aus Bryophyllum pinnatum) hatte einen Gehalt von 40

mg/ml.

1) 101 μl Kpi-Puffer + 10 μl Pflanzenextrakt (Endkonzentration 100 μg/ml)

2) 90 μl Kpi-Puffer + 10 μl (1) (Endkonzentration 10 μg/ml)

3) 90 μl Kpi-Puffer + 10 μl (3) (Endkonzentration 1 μg/ml)

4) 30 μl Kpi + 1 μl Pflanzenextrakt (Endkonzentration 30 μg/ml)

5) 90 μl Kpi + 10 μl (4) (Endkonzentration 3 μg/ml)

Eine Lösung mit 144 nM [3H]fluni ([3H]Flunitrazepam) wurde vorbereitet

(Endkonzentration 4 nM).

55

Tabelle 6. Pipettierschema des Versuchs zur Verdrängung von Flunitrazepam am GABAA-Rezeptor Aliquot Stammlösung Kpi [3H] Flunitrazepam Flunitrazepam1)Nicht spezifisch

- 10 μl 10 μl 1.5 μl (5 mM)

2) Total - 10 μl 10 μl - 3) 100 μg/ml 10 μl (1) - 10 μl - 4) 30 μg/ml 10 μl (4) - 10 μl - 5) 10 μg/ml 10 μl (2) - 10 μl - 6) 3 μg/ml 10 μl (5) - 10 μl - 7) 1 μg/ml 10 μl (3) - 10 μl -

Als erstes wurde die Stammlösung zugegeben und 15 Min. später [3H]Flunitrazepam.

Die Aliquots wurden für 1 Std. auf Eis inkubiert.

Die Endproteinkonzentration betrug 0.1 bis 1 mg Protein/ml. Die Gesamtbindung

wurde bei 4 nM [3H] Flunitrazepam gemessen. Die unspezifische Bindung wurde in

Gegenwart von 21 µM nicht markiertem Flunitrazepam bestimmt. Die Membranen

wurden mittels Schnellfiltration über GF/C-Filter gesammelt, die zuvor mit Kpi-Puffer

getränkt wurden. Nach dreimaligem Waschen mit je 5 ml Kpi-Puffer wurde die auf

dem Filter verbleibende Radioaktivität mittels Flüssig-Scintillation (Packard Tri carb

2100 TR) gemessen.

56

3.3.7 Bindungsaffinität von Bryophyllum pinnatum zur GABA-binding site des GABAA-Rezeptors

Das folgende Experiment wurde durch die Firma Vitaplant AG, Witterswil, Schweiz

durchgeführt.

Damit wurde die Bindungsaffinität des Presssaftes aus Bryophyllum pinnatum an die

GABA-Bindungsstelle des GABAA-Rezeptors untersucht.

Der Presssaft aus Bryophyllum pinnatum (Weleda) wurde bei -20° C gelagert,

Aliquots wurden bei 4° C gelagert. Das Trockengewicht des Presssaftes betrug 43.8

mg/ml.

Das Testgemisch und die Kontrolle wurden für 60 Min. inkubiert, es wurden jeweils

n=3 Versuche mit den Konzentrationen 3, 10, 30, 100 μg/ml durchgeführt. Das

verwendete Modell war das GABAA-Rezeptormodell mit Rattencerebellum. Als

Radioligand wurde 3H-Muscimol verwendet.

Für die Gewinnung des Rattencerebellums wurden eingefrorene Rattengehirne in

Cerebellum und Kortex getrennt. Die Cerebelli wurden in Zentrifugenröhrchen

eingewogen und auf Eis während 5-10 Min. aufgetaut. 15-20 ml eiskalter Sucrose-

Tris-Puffer wurden beigefügt und die Mischung für weitere 10-15 Min. auf Eis

gelagert. Ein Proteaseinhibitor Gemisch wurde zugefügt, auf Eis homogenisiert und

bei 1200 g und 4° C für 10 Min. zentrifugiert. Der flüssige Überstand mit den

Rezeptoren wurde in ein kaltes Ultrazentrifugenröhrchen gegeben und auf Eis gelegt.

Das Pellet wurde nochmals extrahiert, um den Anteil an Rezeptor zu erhöhen. Die

beiden Überstände wurden vereint.

Zur Aufreinigung wurde bei 40000 g und 4° C für 20 Min. zentrifugiert. Der Überstand

wurde verworfen und zum Rückstand eiskalter Sucrose-Tris Puffer (50 mM, pH 7.4)

gegeben und schnell homogenisiert. Diese Aufreinigung wurde 3 Mal wiederholt. Das

verbliebene Pellet wurde in Tris Puffer homogenisiert, die Proteinkonzentration

wurde mittels BCA (bicinchonic acid) protein assay kit und dazu passenden

Lösungen gemessen.

Die an den Rezeptor gebundene Fraktion wurde mittels Filtration mit

Glasfaserfiltermatten isoliert. Die an den Rezeptor gebundene Menge des

57

Radioliganden wurde mittels Tri-Carb 1900 TR Flüssigszintillationsmessung

(Packard, USA) bestimmt.

Gesamtbindung (TB): Inkubation des Radioliganden mit dem

Rezeptor.

Nicht spezifische Bindung (NSB): Inkubation mit grosser Menge des nicht

radioaktiven Liganden, des Radioliganden

und des Rezeptors.

Spezifische Bindung (SB): (SB)= (TB)-(NSB)

Kompetitive Bindung (CB): Inkubation des Presssaftes mit Radioligand

und Rezeptor in verschiedenen

Konzentrationen.

Nicht spezifische kompetitive Bindung

(NSCB): Inkubation mit hoher Konzentration des nicht

radioaktiv markierten Liganden, dem

Presssaft bei verschiedenen

Konzentrationen, dem Radioliganden und

dem Rezeptor.

Spezifische kompetitive Bindung: (SCB) = (CB) - (NSCB)

Spezifische Bindung des Radioliganden

in Gegenwart des Presssaftes: =(SCB)/(SB) x 100%

58

4 Resultate

4.1 Klinische Studie

4.1.1 Swissmedic

Die klinische Studie „Bryophyllum pinnatum versus Nifedipin zur Behandlung der

vorzeitigen Wehentätigkeit“ wurde am 23.9.2008 durch Swissmedic inspiziert.

Aufgrund des Inspektionsberichtes wurden an Studiendesign, CRF und praktischer

Ausführung der Studie einige Adaptationen vorgenommen. Diese wurden von

Swissmedic geprüft und positiv bewertet. Nach einem damit verbundenen

Unterbruch konnte die Studie am 10. März 2009 wieder aufgenommen werden. Zur

Auswertung gelangen in dieser Arbeit die bei allen Patientinnen erhobenen

Parameter.

4.1.2 Ausgewählte Parameter aus dem CRF

Eine ausführliche Auflistung der erfassten Parameter der klinischen Studie ist in

Anhang F zu finden. Nachfolgend sind die für einen Therapieerfolg entscheidendsten

Parameter separat ausgewertet. Als signifikant gelten p-Werte ≤ 0.05.

Es konnten zwischen Dezember 2006 und November 2009 n=27 Patientinnen in die

Studie eingeschlossen werden. 14 davon wurden für die Bryophyllum pinnatum-

Gruppe, 13 Patientinnen für die Nifedipin-Gruppe randomisiert.

Eine Patientin aus der Nifedipingruppe hat aus persönlichen Gründen die Teilnahme

zurückgezogen und ist ab der Untersuchung 3 nicht mehr in den aufgeführten Daten

enthalten.

Folgende Parameter sind bei allen Patientinnen in beiden Gruppen (100%)

gleichermassen charakterisiert (Tabelle 7): Einschlusskriterien vorhanden (z.B.

59

Fibronektintest negativ, vorzeitiger Blasensprung fehlend), keine Totgeburten und

Spätaborte in der Anamnese der Studienpatientinnen. Bei keiner der in die Studie

eingeschlossenen Frauen wurde eine Intrauterine Wachstumsretardierung (IUGR)

oder eine Plazenta praevia festgestellt. Bei allen Patientinnen konnte bei der

Eintrittsuntersuchung ein bakteriologischer Vaginalabstrich durchgeführt werden.

Anlässlich der Wochenbettuntersuchung wurde bei keiner Patientin ein

Harnwegsinfekt, eine Subinvolutio uteri, eine Endometritis, eine Mastitis oder andere

Komplikationen festgestellt.

Tabelle 7. Parameter die bei 100% der Patientinnen zutrafen

Bryophyllum pinnatum Nifedipin Baseline Spätabort-Anamnese nein 14 (100%) 13 (100%)IUGR-Anamnese nein 14 (100%) 13 (100%)Plazenta praevia nein 14 (100%) 13 (100%)Fibronektin negativ 14 (100%) 13 (100%)Wochenbettuntersuchung Harnwegsinfekt nein 14 (100%) 12 (100%)Subinvolutio uteri nein 14 (100%) 12 (100%)Endometritis nein 14 (100%) 12 (100%)Mastitis nein 14 (100%) 12 (100%)Andere Komplikationen nein 14 (100%) 12 (100%)Werte: n(%)

4.1.2.1 Bishop-Score und Anzahl Kontraktionen

Bishop-Score Gemäss Studienprotokoll besteht ein Erfolg nach 4 Std. , wenn die Patientin 4 Std.

nach Beginn der Studienbehandlung „ruhig“ oder „unruhig mit einem Bishop-Score

<5“ ist. „Ruhig“ bedeutet, dass eine Patientin gleich viele oder weniger

Kontraktionen/Std. aufweist als vor Behandlungsbeginn.

Misserfolg besteht bei den Patientinnen, die nach 4 Std. „unruhig“ sind und einen

Bishop-Score von 5 oder mehr Punkten aufweisen.

Es gibt keinen Unterschied zwischen Eintrittsuntersuchung und Untersuchung 2 in

Bezug auf den Bishop-Score und zwar beträgt für die Bryophyllum pinnatum-Gruppe

(p=0.636) die mittlere Veränderung 0.15 mit 95%-VI (-0.53, 0.84) und für die

Nifedipingruppe (p=0.429) beträgt die mittlere Veränderung -0.25 mit 95%-VI (-0.92,

60

0.42). Es konnte kein Unterschied in der Wirkung der Behandlungen auf die mittlere

Veränderung des Bishop-Score zwischen Eintrittsuntersuchung und Untersuchung 2

(p=0.37) gefunden werden (Tabelle 8).

Anzahl Kontraktionen Es gibt einen Abfall der Anzahl Kontraktionen zwischen Eintrittsuntersuchung und

Untersuchung 2 und zwar beträgt für Bryophyllum pinnatum (p=0.019) der mittlere

Abfall 5.1 (Kontraktionen pro Std.) mit 95%-VI (0.9, 9.2) und für Nifedipin (p=0.011)

beträgt der mittlere Abfall 4.5 (Kontraktionen pro Std.) mit 95%-VI (1.2, 7.8).

Es konnte kein Unterschied in der Wirkung der Behandlung auf die Verringerung der

Anzahl der Kontraktionen zwischen Eintrittsuntersuchung und Untersuchung 2

(p=0.819) gefunden werden (Tabelle 8).

Tabelle 8. CTG und Bishop-Score der Studienpatientinnen bei Eintritt (Baseline) und nach 4 Std. Behandlung (Untersuchung 2) Bryophyllum pinnatum Nifedipin Baseline CTG (Kontraktionen/Std.) 9.6 ± 5.6 7.7 ± 5.9Bishop-Score 2.1 ± 1.2 1.4 ± 1.3Untersuchung 2 CTG (Kontraktionen/Std.) 4.5 ± 4.2 3.8 ± 3.2Bishop-Score 2.1 ± 1.3 1.3 ± 0.8Werte: Mittelwert ± SA

4.1.2.2 Hämatologische Untersuchung

Leukozyten- und Thrombozytenzählung Sowohl bei der Eintrittsuntersuchung, als auch in der Untersuchung 3 wurden im Blut

der Patientinnen die Anzahl Leukozyten und Thrombozyten bestimmt. Die beiden

Werte zeigen sich nicht unterschiedlich zwischen den beiden Gruppen und auch

nicht zwischen der ersten und zweiten Bestimmung in jeder Gruppe separat (Tabelle

9).

Bestimmung AST und ALT Die Leberparameter ALT und AST wurden ebenfalls zweimal (bei der

Eintrittsuntersuchung und bei Untersuchung 3) bei jeder Patientin bestimmt. Die

61

Werte der ALT unterscheiden sich nicht zwischen den Gruppen und auch nicht

zwischen den beiden Messungen jeder Gruppe separat. Die Werte der AST haben in

der Nifedipingruppe die Tendenz (p=0.089) zu Sinken von der ersten zur zweiten

Messung. In der Bryophyllum pinnatum-Gruppe und zwischen den Gruppen gibt es

keine signifikanten Unterschiede (Tabelle 9).

CRP Das CRP wird in der Leber synthetisiert. Seine Serumkonzentration kann bei

bakteriellen sowie nichtinfektiösen, entzündlichen und nekrotisierenden Prozessen

infolge einer gesteigerten und wahrscheinlich durch humorale Faktoren stimulierten

Synthese innerhalb von Stunden bis zum 1000fachen ansteigen.

Die Messungen des CRP erfolgten bei der Eintrittsuntersuchung vor der ersten

Applikation der Studienmedikation und in Untersuchung 3. Es konnte bei beiden

Untersuchungen weder zwischen den Gruppen (Bryophyllum pinnatum bzw.

Nifedipin), noch innerhalb jeder Gruppe zwischen der ersten und zweiten

Bestimmung des CRP ein Unterschied gefunden werden (Tabelle 9).

Tabelle 9. Hämatologische Parameter bei Eintritt (Baseline) und nach 49 Std. (Untersuchung 3)

Bryophyllum pinnatum Nifedipin Baseline Leukozyten (1E3/µl) 11.7 ± 2.5 10.8 ± 2.6 Thrombozyten (1E3/µl) 278 ± 59.3 251 ± 35.4 AST (U/l) 19.7 ± 4.9 23.9 ± 4.3 ALT (U/l) 18.9 ± 12.9 16.7 ± 6.5 CRP (mg/l) 5.3 ± 4.8 10.1 ± 11.8 Untersuchung 3 Leukozyten (1E3/µl) 12.2 ± 3.3 11.1 ± 3.8 Thrombozyten (1E3/µl) 271 ± 54 253 ± 39 AST (U/l) 20.9 ± 8.3 22.3 ± 4.9 ALT (U/l) 19.1 ± 10.2 16.2 ± 5.6 CRP (mg/l) 6.6 ± 5.2 8.4 ± 4.1 Werte: Mittelwert ± SA

62

4.1.2.3 Allgemeine Bakteriologie

Der bei Eintritt und bei Untersuchung 3 durchgeführte Vaginalabstrich wurde

allgemein bakteriologisch untersucht.

In Bezug auf das Vorhandensein einer normalen Vaginalflora gab es zwischen den

beiden Studiengruppen keinen Unterschied, weder bei der Eintrittsuntersuchung,

noch 49 Std. nach Studienbeginn, bei Untersuchung 3.

In der Bryophyllum pinnatum-Gruppe war kein Unterschied festzustellen zwischen

den Resultaten der beiden Untersuchungen. In der Nifedipingruppe gab es eine

Tendenz (p=0.054) zu weniger normaler Vaginalflora bei der Untersuchung 3 im

Vergleich zur Baseline-Untersuchung (Tabelle 10).

Tabelle 10. Befunde der bakteriologischen Kultur der normalen Vaginalflora, aus dem Vaginalabstrich vorgenommen bei Eintritt (Baseline) und bei 49 Std. (Untersuchung 3)

Bryophyllum pinnatum Nifedipin Baseline Normale Vaginalflora Kultur keine 9 (64.3%) 6 (46.2%)Normale Vaginalflora Kultur vereinzelt 0 1 (7.7%)Normale Vaginalflora Kultur mässig 3 (21.4%) 3 (23.1%)Normale Vaginalflora Kultur reichlich 2 (14.3%) 3 (23.1%)Untersuchung 3 Normale Vaginalflora Kultur keine 5 (35.7%) 10 (83.3%)Normale Vaginalflora Kultur vereinzelt 1 (7.1%) 0Normale Vaginalflora Kultur mässig 5 (35.7%) 0Normale Vaginalflora Kultur reichlich 3 (21.4%) 2 (16.7%)Werte: n (%)

63

4.1.2.4 Fibronektintest

Der Test auf fetales Fibronektin war bei allen rekrutierten Frauen zu Beginn der

Studie gemäss den Einschlusskriterien negativ. Bei der Untersuchung 3 war der Test

bei einer Patientin der Bryophyllum pinnatum-Gruppe positiv (7.1%). Alle anderen

wiesen wiederum einen negativen Fibronektintest auf (Tabelle 11).

Tabelle 11. Resultate der Fibronektintests vorgenommen bei Eintritt (Baseline) und bei 49 Std. (Untersuchung 3)

Bryophyllum pinnatum Nifedipin Baseline Fibronektin negativ 14 (100%) 13 (100%)Fibronektin positiv 0 0Fibronektintest nicht durchgeführt 0 0Untersuchung 3 Fibronektin negativ 13 (92.9%) 11 (91.7%)Fibronektin positiv 1 (7.1%) 0Fibronektintest nicht durchgeführt 0 1 (8.3%)Werte: n (%)

64

4.1.2.5 Blutdruck- und Pulsmessung

In Bezug auf die systolischen und diastolischen Blutdruckwerte und die zeitgleich

gemessenen Pulswerte der Studienpatientinnen wurden jeweils die Werte der

Untersuchung 2, 3 und jene der Wochenbettuntersuchung mit den Werten der

Eintrittsuntersuchung verglichen (Tabelle 12).

Zwischen Baselineuntersuchung und Untersuchung 2 stiegen die systolischen

Blutdruckwerte der Bryophyllum pinnatum-Gruppe an (p=0.018). Ebenso stiegen in

der Bryophyllum pinnatum-Gruppe die diastolischen Blutdruckwerte zwischen Eintritt

und Untersuchung 2 an (p=0.004).

Alle anderen Vergleiche zwischen den Studiengruppen und zwischen den einzelnen

Untersuchungen in jeder Studiengruppe separat zeigten keine signifikanten

Unterschiede.

Tabelle 12. Blutdruckwerte (mm Hg) und Pulsfrequenz (n/Min.) bei Eintritt, bei Untersuchung 1, 2 und 3 sowie bei der Wochenbettuntersuchung

Bryophyllum pinnatum Nifedipin Baseline Blutdruck systolisch 110 ± 10.3 111 ± 13.6Blutdruck diastolisch 59 ± 10.6 63 ± 11.1Puls 79 ± 7.8 81 ± 14.4Untersuchung 1 Blutdruck systolisch 108 ± 10.6 104 ± 7.5Blutdruck diastolisch 66 ± 11.7 58 ± 11.6Puls 80 ± 10.6 89 ± 13.3Untersuchung 2 Blutdruck systolisch 111 ± 9.3 111 ± 15.7Blutdruck diastolisch 66 ± 7.6 66 ± 16.5Puls 78 ± 13.8 87 ± 8.4Untersuchung 3 Blutdruck systolisch 108 ± 11.6 107 ± 9.3Blutdruck diastolisch 62 ± 10.8 63 ± 3.5Puls 85 ± 15.2 82 ±7.6 Wochenbettuntersuchung Blutdruck systolisch 115 ± 8.1 110 ± 11.0Blutdruck diastolisch 70 ± 7.9 64 ± 13.0Puls 73 ± 14.9 76 ± 10.9Werte: Mittelwert ± SA

65

4.1.2.6 Tokolyse zwischen Untersuchung 3 und Geburt

Die beiden folgenden Tabellen zeigen, welche Patientinnen wie lange welche

Tokolyse erhielten zwischen Untersuchung 3 und der Geburt ihres Kindes. Tabelle

13 bezieht sich auf die Patientinnen der Bryophyllum pinnatum-Gruppe, Tabelle 14

auf jene der Nifedipin-Gruppe. Gibt es in einem Feld ein n. d. , bedeutet dies, dass

die Dokumentation zu ungenau war.

Tabelle 13. Tokolytika, die zwischen Untersuchung 3 und Geburt in der Bryophyllum pinnatum-Gruppe verabreicht wurden Randomnr. Anzahl

Tage der Tokolyse

Anzahl Kautabletten Bryophyllum pinnatum

Anzahl Kapseln Nifedipin Mepha® 10 mg

Anzahl Tabletten Adalat® CR 60mg

Anzahl Tabletten Adalat® CR 30mg

Anzahl Ampullen Gynipral

3 16 81 0 0 0 0 5 17 102 0 0 0 0 6 36 192-256 0 4 0 0 9 82 36 0 146 0 010 73 110 4 1 58 011 28 84-168 0 0 0 012 62 124 0 0 0 018 n.d. 80 0 0 0 019 35 26 0 0 60 020 0 0 0 0 0 022 23 89 0 0 0 024 9 0 0 2 0 026 25 150 0 0 0 027 n.d. n.d. 0 0 0 0

66

Tabelle 14. Tokolytika, die zwischen Untersuchung 3 und Geburt in der Nifedipin-Gruppe verabreicht wurden Randomnr. Anzahl

Tage der Tokolyse

Anzahl Kapseln Nifedipin Mepha® 10 mg

Anzahl Tabletten Adalat® CR 60mg

Anzahl Tabletten Adalat® CR 30mg

Anzahl Ampullen Gynipral

1 35 0 35-70 35 0 2 80 0 14 2 576 4 76 0 95 50 18 7 0 0 0 0 0 8 32 0 4 52 013 19 0 13 27 014 0 0 0 0 015 19 0 19 19 016 0 0 19 19 017 103 0 103 103 021 n.d. 0 0 2xtäglich 023 24 0 24 24 025 0 0 0 0 0

4.1.2.7 Gestationsalter bei Geburt im Vergleich zum Studienbeginn

Die Gestationsalter der Patientinnen unterschieden sich bei Studienbeginn nicht

zwischen den beiden Gruppen. Ebenfalls unterschieden sich die Gestationsalter der

beiden Studiengruppen bei Geburt nicht voneinander.

Der Einfluss des Gestationsalters ist in beiden Behandlungsgruppen homogen (-7.2,

p<0.001) und die Interaktion zwischen der Bryophyllum pinnatum-Gruppe und dem

Gestationsalter ebenfalls (p=0.125) (Tabelle 15). Mit jeder Gestationswoche

verringert sich die Dauer im Mittel um 7.2 Tage. Es besteht kein Unterschied

zwischen Bryophyllum pinnatum und Nifedipin (p=0.368) unter Berücksichtigung des

Gestationsalters. Es gibt keine Hinweise dafür, dass Bryophyllum pinnatum die

Dauer zwischen Eintrittsuntersuchung und Geburt stärker verringert, als die

Nifedipin-Behandlung oder umgekehrt.

Tabelle 15. Das Gestationsalter bei Studienbeginn und bei Geburt (SSW) Bryophyllum pinnatum Nifedipin Baseline Gestationsalter 29.4 ± 3.2 27.8 ± 3.8Wochenbettuntersuchung Gestationsalter 38.71 ± 2.1 37.42 ± 1.7Mittelwerte ± SA

67

4.1.2.8 Geburtsmodus Die Studienpatientinnen haben entweder spontan, mittels Sectio caesarea oder

vaginal operativ entbunden. Es war kein Unterschied zwischen der Bryophyllum

pinnatum- und der Nifedipingruppe in der Häufigkeit des Geburtsmodus festzustellen

(Tabelle 16).

Tabelle 16. Geburtsmodus

Bryophyllum pinnatum Nifedipin Sectio 5 (35.7%) 8 (66.7%) spontan 8 (57.1%) 3 (25%) vaginal operativ 1 (7.1%) 1 (8.3%) Werte: n (%)

4.1.2.9 Komplikationen während der Geburt

Es war kein Unterschied zwischen den Behandlungsgruppen in Bezug auf die

Komplikationen während der Geburt festzustellen (Tabelle 17).

Tabelle 17. Komplikationen während der Geburt Bryophyllum pinnatum Nifedipin Komplikationen bei Geburt ja 3 (21.4%) 5 (41.7%)Komplikationen bei Geburt nein 11 (78.6%) 7 (58.3%)Werte: n (%)

68

4.1.2.10 Komplikationen während des Wochenbetts

Es wurden die Parameter gestörte Wundheilung (nur alter CRF), Harnwegsinfekt,

Subinvolutio uteri, Endometritis, Mastitis, putride Lochien, behandlungsbedürftige

Anämie, Stillprobleme und andere Komplikationen erhoben. Es gab keine

Unterschiede zwischen der Bryophyllum pinnatum- und der Nifedipingruppe in Bezug

auf diese Parameter (Tabelle 18).

Tabelle 18. Komplikationen während des Wochenbetts Bryophyllum pinnatum Nifedipin Gestörte Wundheilung ja 0 0Gestörte Wundheilung nein 12 (85.7%) 12 (100%)Gestörte Wundheilung (im neuen CRF nicht erhoben) 2 (14.3%) 0Harnwegsinfekt ja 0 0Harnwegsinfekt nein 14 (100%) 12 (100%)Subinvolutio uteri ja 0 0Subinvolutio uteri nein 14 (100%) 12 (100%)Putride Lochien ja 1 (7.1%) 0Putride Lochien nein 13 (92.9%) 12 (100%)Endometritis ja 0 0Endometritis nein 14 (100%) 12 (100%)Stillprobleme ja 2 (14.3%) 1 (8.3%)Stillprobleme nein 12 (85.7%) 11 (91.7%)Mastitis ja 0 0Mastitis nein 14 (100%) 12 (100%)*Behandlungsbedürftige Anämie ja 4 (28.6%) 6 (50%)*Behandlungsbedürftige Anämie nein 10 (71.4%) 6 (50%)Andere Komplikationen ja 0 0Andere Komplikationen nein 14 (100%) 12 (100%)Werte: n (%)

* Der durchgeführte Mc Nemar-Test wies keine Signifikanz auf zwischen den

Resultaten der Eintrittsuntersuchung und jenen der Wochenbettuntersuchung

bezüglich behandlungsbedürftiger Anämie für jede Gruppe separat.

69

4.1.2.11 Neugeborenenzustand

Der Zustand der Neugeborenen wird nebst Länge und Gewicht mit dem APGAR-

Score angegeben. Dieser wird jeweils 1, 5 und 10 Min. nach der Geburt erhoben.

Es wurde kein Einfluss des Gestationsalters auf den APGAR-Score (APGAR 1 Min.

p=0.136, 5 Min. p=0.325, 10 Min. p=0.98) festgestellt. Ausserdem konnten keine

Unterschiede zwischen Bryophyllum pinnatum- und Nifedipingruppe (1 Min. p=0.253,

5 Min. p=0.817, 10 Min. p=0.84) unter Berücksichtigung des Gestationsalters

gefunden werden.

Ebenso bestehen keine Unterschiede zwischen den Gruppen bezüglich Länge und

Gewicht der Neugeborenen (Tabelle 19).

Tabelle 19. Neugeborenenzustand Bryophyllum pinnatum Nifedipin Länge (cm) 49.29 ± 2.6 47.96 ± 2.8Gewicht (g) 3246 ± 580 2957 ± 478APGAR 1' 8.00 ± 0.96 8.17 ± 0.94APGAR 5' 9.07 ± 0.73 9.08 ± 0.67APGAR 10' 9.29 ± 0.47 9.25 ± 0.45Werte: Mittelwert ± SA.

4.1.2.12 Hospitalisationsdauer

Die Hospitalisationsdauer nach der Geburt betrug in der Bryophyllum pinnatum-

Gruppe 4.57 ± 1.3 Tage, was deutlich (p=0.047) kürzer ist als in der Nifedipingruppe.

Dabei betrug die mittlere Differenz zwischen den Gruppen 1.012 Tage mit einem

95% VI von (0.013, 2.011) (Tabelle 20).

Tabelle 20. Dauer der Hospitalisation vor und nach der Geburt Bryophyllum pinnatum Nifedipin Hospitalisation ante partum (Tage) 9.36 ± 9.7 10.42 ± 20.5Hospitalisation post partum (Tage) 4.57 ± 1.3 5.58 ± 1.2Werte: Mittelwer ± SA.

70

4.1.2.13 Begleitmedikation

Die zusätzlich zur Studienmedikation verabreichten Medikamente wurden ebenfalls

erhoben und gemäss ATC-Code (74) gruppiert (Anhang H).

Es wurden keine Unterschiede in den Häufigkeiten der verabreichten Medikamente

zwischen den Behandlungsgruppen Bryophyllum pinnatum und Nifedipin (p=0.877)

gefunden.

4.1.2.14 Unerwünschte Ereignisse

Während der Dauer der Studie wurden keine unerwünschten Ereignisse

dokumentiert, die den Studienmedikationen zuzuschreiben wären.

4.1.2.15 Normalverteilung der Daten

Der durchgeführte Kolmogorov-Smirnov-Test (alle p>0.159) ergab eine

Normalverteilung aller in der klinischen Studie erhobenen Daten.

71

4.2. In-vitro-Experimente

4.2.1 Patientinnenkollektiv

Es wurde eine deskriptive Statistik des Patientinnenkollektivs erstellt (Tabelle 21).

Tabelle 21. Charakterisierung der Patientinnen (n=50), die einen Myometrium- streifen zur Verfügung stellten Alter (Jahre) 32.80 ±5.80 Gestationsalter bei Sectio (Wochen) 38.13 ± 0.69 Gravidität (n) 2.38 ± 1.40 Parität (n) 1.86 ± 0.73 Sectioart primär 50 (100%) Sectio 24 (48%) Resectio 22 (44%) Reresectio 3 (6%) Rereresectio 1(2%) Werte: Mittelwert ± SA bzw. n (%)

4.2.2 Amplitude

Die Zugabe von Bryophyllum pinnatum-Lösungen (Presssaft, Fraktionen) führt zu

einer Abnahme der Amplitude der Muskelkontraktion. In der Gruppe der

Kontrollexperimente sinkt die Amplitude zwar bei der dritten Zugabe ab, um sich aber

nach der 4. Zugabe zu stabilisieren. Es kann keine kontinuierliche Abnahme

verzeichnet werden.

Sämtliche Werte (Mittelwerte der prozentualen Veränderungen der Amplituden

gegenüber dem Ausgangswert mit den entsprechenden 95%-VI) sind tabellarisch im

Anhang I (Tabelle A) aufgelistet. Jene 95%-VI, die den Wert 100% nicht enthalten,

weisen auf eine signifikante Veränderung der Amplitude nach einer Zugabe

gegenüber dem Ausgangswert hin. Signifikante Veränderungen der Amplitude

gegenüber dem Ausgangswert sind blau markiert.

Nachfolgend sind die Resultate der Kontrollexperimente (Abb. 19) und der

Experimente mit unverdünntem Bryophyllum pinnatum-Presssaft (Abb. 20) sowie

jene mit den unverdünnten Fraktionen (Abb. 21-23) graphisch dargestellt. Die

Mediane der prozentualen Veränderungen der Amplituden gegenüber dem

72

Ausgangswert mit den 25%- und 75%-Werten und die Minimal- und Maximalwerte

sind aufgeführt.

73

Abb. 19. Verlauf der Amplitude der Muskelstreifen-Kontraktionen in Prozent des Aus- gangswertes (y-Achse); Anzahl der Zugaben (x-Achse); (Median, 25%- und 75%- Werte, Minimal- und Maximalwerte) unter kontinuierlicher Zugabe von jeweils 2 µl Krebslösung (Kontrollen).

Abb. 20. Verlauf der Amplitude der Muskelstreifenkontraktionen in Prozent des Ausgangs- wertes (y-Achse); (Median, 25%- und 75%-Werte, Minimal- und Maximalwerte) unter konti- nuierlicher Zugabe von jeweils 2 µl Presssaft unverdünnt, jeweils 2 µl (Tabelle A, Anhang I).

74

Abb. 21. Verlauf der Amplitude der Muskelstreifenkontraktionen in Prozent des Ausgangs- wertes (y-Achse); (Median, 25%- und 75%-Werte, Minimal- und Maximalwerte) unter konti- nuierlicher Zugabe von jeweils 2 µl Fraktion 2 unverdünnt (vermutlich Bufadienolide).

Abb. 22. Verlauf der Amplitude der Muskelstreifenkontraktionen in Prozent des Ausgangs- wertes (y-Achse); (Median, 25%- und 75%-Werte, Minimal- und Maximalwerte) unter konti- nuierlicher Zugabe von jeweils 2 µl Fraktion 4 (vermutlich Flavonoide).

75

Abb. 23. Verlauf der Amplitude der Muskelstreifenkontraktionen in Prozent des Ausgangs- wertes (y-Achse); (Median, 25%- und 75%-Werte, Minimal- und Maximalwerte) unter konti- nuierlicher Zugabe von jeweils 2 µl Fraktion 12 (vermutlich Zimtsäurederivate).

4.2.3 Fläche unter der Kurve

Die Zugabe von Bryophyllum pinnatum-Lösungen (Presssaft, Fraktionen) führt zu

einer Abnahme der AUC der Muskelkontraktion nach der fünften Zugabe. In der

Gruppe der Kontrollexperimente sinkt die AUC zwar ab, stabilisiert sich dann aber

wieder. Es kann keine kontinuierliche Abnahme festgestellt werden.

Sämtliche Werte (Mittelwerte der prozentualen Veränderungen der AUCs gegenüber

dem Ausgangswert mit den entsprechenden 95%-VI) sind tabellarisch im Anhang I

(Tabelle B) aufgelistet. Jene 95%-VI, die den Wert 100% nicht enthalten, weisen auf

eine signifikante Veränderung der AUC nach einer Zugabe gegenüber dem

Ausgangswert hin. Signifikante Veränderungen der AUC gegenüber dem

Ausgangswert sind blau markiert.

Nachfolgend sind die Resultate der Kontrollexperimente (Abb. 24) und der

Experimente mit unverdünntem Bryophyllum pinnatum-Presssaft (Abb. 25) sowie

jene mit den unverdünnten Fraktionen (Abb. 26-28) graphisch dargestellt. Die

Mediane der prozentualen Veränderungen der AUC gegenüber dem Ausgangswert

mit den 25%- und 75%-Werten und die Minimal- und Maximalwerte sind aufgeführt.

76

Abb. 24. Verlauf der AUC der Muskelstreifenkontraktionen in Prozent des Ausgangs- wertes (y-Achse); (Median, 25%- und 75%-Werte, Minimal- und Maximalwerte) unter konti- nuierlicher Zugabe von jeweils 2 µl Krebslösung (Kontrolle).

Abb. 25. Verlauf der AUC der Muskelstreifenkontraktionen in Prozent des Ausgangs- wertes (y-Achse); (Median, 25%- und 75%-Werte, Minimal- und Maximalwerte) unter konti- nuierlicher Zugabe von jeweils 2 µl Bryophyllum pinnatum-Pressaft unverdünnt.

77

Abb. 26. Verlauf der AUC der Muskelstreifenkontraktionen in Prozent des Ausgangs- wertes (y-Achse); (Median, 25%- und 75%-Werte, Minimal- und Maximalwerte) unter konti- nuierlicher Zugabe von jeweils 2 µl Fraktion 2 (vermutlich Bufadienolide) unverdünnt.

Abb. 27. Verlauf der AUC der Muskelstreifenkontraktionen in Prozent des Ausgangs- wertes (y-Achse); (Median, 25%- und 75%-Werte, Minimal- und Maximalwerte) unter konti- nuierlicher Zugabe von jeweils 2 µl Fraktion 4 (vermutlich Flavonoide) unverdünnt.

78

Abb. 28. Verlauf der AUC der Muskelstreifenkontraktionen in Prozent des Ausgangs- wertes (y-Achse); (Median, 25%- und 75%-Werte, Minimal- und Maximalwerte) unter konti- nuierlicher Zugabe von jeweils 2 µl Fraktion 12 (vermutlich Zimtsäurederivate) unverdünnt.

4.2.4 Frequenz

Die Zugabe von Bryophyllum pinnatum-Lösungen (Presssaft, Fraktionen) führt zu

einer Zunahme der Frequenzen der Muskelkontraktionen. Die gemessenen

Frequenzen steigen über den Ausgangswert 100% an. Auch die Frequenz der

Kontrollen steigt im zeitlichen Verlauf kurz an, sinkt jedoch nach 2 Zugaben wieder

ab.

Sämtliche Werte (Mittelwerte der prozentualen Veränderungen der Frequenzen

gegenüber dem Ausgangswert mit den entsprechenden 95%-VI) sind tabellarisch im

Anhang I (Tabelle C) aufgelistet. Jene 95%-VI, die den Wert 100% nicht enthalten,

weisen auf eine signifikante Veränderung der Frequenz nach einer Zugabe

gegenüber dem Ausgangswert hin. Signifikante Veränderungen der Frequenz

gegenüber dem Ausgangswert sind blau markiert.

Nachfolgend sind die Resultate der Kontrollexperimente (Abb. 29) und der

Experimente mit unverdünntem Bryophyllum pinnatum-Presssaft (Abb. 30) sowie

jene mit den unverdünnten Fraktionen (Abb. 31-33) graphisch dargestellt. Die

Mediane der prozentualen Veränderungen der Frequenz gegenüber dem

79

Ausgangswert mit den 25%- und 75%-Werten und die Minimal- und Maximalwerte

sind aufgeführt.

Abb. 29. Verlauf der Frequenz der Muskelstreifenkontraktionen in Prozent des Ausgangs- wertes (y-Achse); (Median, 25%- und 75%-Werte, Minimal- und Maximalwerte) unter konti- nuierlicher Zugabe von jeweils 2 µl Krebslösung (Kontrolle).

Abb. 30. Verlauf der Frequenz der Muskelstreifenkontraktionen in Prozent des Ausgangs- wertes (y-Achse); (Median, 25%- und 75%-Werte, Minimal- und Maximalwerte) unter konti- nuierlicher Zugabe von jeweils 2 µl Presssaft.

80

Abb. 31. Verlauf der Frequenz der Muskelstreifenkontraktionen in Prozent des Ausgangs- wertes (y-Achse); (Median, 25%- und 75%-Werte, Minimal- und Maximalwerte) unter konti- nuierlicher Zugabe von jeweils 2 µl Fraktion 2 (vermutlich Bufadienolide).

Abb. 32. Verlauf der Frequenz der Muskelstreifenkontraktionen in Prozent des Ausgangswertes (y-Achse); (Median, 25%- und 75%-Werte, Minimal- und Maximalwerte) unter kontinuierlicher Zugabe von jeweils 2 µl Fraktion 4 (vermutlich Flavonoide).

81

Abb. 33. Verlauf der Frequenz der Muskelstreifenkontraktionen in Prozent des Ausgangs- wertes (y-Achse); (Median, 25% und 75%-Werte, Minimal- und Maximalwerte) unter konti- nuierlicher Zugabe von jeweils 2 µl Fraktion 12 (vermutlich Zimtsäurederivate).

4.2.5 Vergleich von Presssaft und Fraktionen 2, 4 und 12 mit Kontrollen

Tabelle D (Anhang J) zeigt die Mixed Models Statistik über die Resultate der

Experimente mit den unverdünnten Fraktionen 2, 4 und 12 sowie Presssaft

verglichen mit jenen der Kontrollstreifen.

Der unverdünnte Presssaft von Bryophyllum pinnatum zeigt eine grössere Wirkung

bezüglich Amplitude (p=0.02), AUC (p=0.042) und Frequenz (p<0.001) im Vergleich

zu den Kontrollen. (Tabelle 22).

Vergleicht man die Ergebnisse der Experimente mit Krebslösung als Kontrolle mit

jenen der Fraktion 2, ist bei Amplitude und AUC kein Unterschied in den Wirkungen

zu erkennen (Tabelle 22). Fraktion 2 lässt die Frequenz im Vergleich zur Kontrolle

(p=0.002) ansteigen. Das mittlere Niveau der Frequenzen ist aber bei den Kontrollen

und den mit Fraktion 2 behandelten Muskelstreifen nicht unterschiedlich.

Die Amplituden der mit Fraktion 4 behandelten Muskelstreifen werden im Vergleich

zu jenen der Kontrollstreifen grundsätzlich kleiner (p=0.044), jedoch passiert dies

82

nicht schneller als bei den Kontrollstreifen. Die Frequenz steigt jedoch signifikant

(p<0.001) steiler an, wenn die Myometriumstreifen mit Fraktion 4 behandelt werden

(Tabelle 22).

Die Fraktion 12 bewirkt gegenüber der Kontrolle keine Veränderung auf Amplitude

und AUC. Die Frequenz steigt im zeitlichen Verlauf an (p=0.013) (Tabelle 22).

Tabelle 22. Vergleich der Resultate der Kontrollstreifen mit den Streifen, die mit Presssaft und den unverdünnten Fraktionen 2, 4 und 12 behandelt wurden. Die signifikanten Werte sind blau unterlegt Parameter Ampl.

Proz. Fläche

Proz Freq.

Proz

Presssaft unverdünnt

beta std error

p-Wert

beta std error

p-Wert beta std error

p-Wert

Einfluss des zeitlichen Verlaufs (Kontrolle*Presssaft)

-4.9 2.09 0.02 -5.5 2.62 0.042 47.96 4.07 <0.001

Fraktion 2 unverdünnt

Einfluss des zeitlichen Verlaufs (Kontrolle*F2)

-3.6 1.88 0.056 -4.4 2.25 0.056 38.1 12.08 0.002

Fraktion 4 unverdünnt

Einfluss des zeitlichen Verlaufs (Kontrolle*F4) -3.4 2.33 0.155 -3.1 3.21 0.345 181.5 21.85 <0.001Fraktion 12 unverdünnt

Einfluss des zeitlichen Verlaufs (Kontrolle*F12)

-2.9 1.70 0.094 -5.4 2.74 0.053 18.7 7.34 0.013

4.2.6 Vergleich Presssaft mit Fraktion 4

In Tabelle E (Anhang J) wird die Wirkung des Presssafts mit jener von Fraktion 4 für

verschiedene Konzentrationen verglichen. Blau unterlegt sind diejenigen Werte, die

signifikant grösser bzw. kleiner sind als die Ausgangswerte, deren Behandlung also

eine Wirkung zeigte.

Ebenso wurde untersucht, welchen Einfluss nur die Zugabe einer Testlösung hat.

Gegenüber den jeweiligen unverdünnten Lösungen sind bei der Frequenz alle

anderen weniger schnell gestiegen, was auch der deskriptiven Statistik entspricht.

Bei Amplitude und AUC hat die Zugabe keinen signifikanten Effekt (Tabelle 23).

83

Die Amplituden der mit der unverdünnten Fraktion 4 behandelten

Muskelstreifenkontraktionen sinken jeweils mit jeder Zugabe um 10.7% (p<0.001).

Sie sind bei den geringeren Konzentrationen von der unverdünnten Gabe nicht

unterscheidbar. Die mittlere Amplitude in Prozent ist bei der Behandlung mit der

unverdünnten Fraktion am kleinsten 71.1% (p<0.001). Bei allen anderen

Konzentrationen ist die mittlere Amplitude höher.

Im zeitlichen Verlauf (Fraktion 4 (F4 x Zugabe)) (p=0.139) zwischen Presssaft und

Fraktion 4 in Bezug auf die AUC wurden keine Unterschiede gefunden. Das mittlere

Niveau der AUC in Prozent des Ausgangswerts liegt bei den mit Fraktion 4

behandelten Muskelstreifen 30% tiefer als bei den mit Presssaft behandelten

(p=0.001).

Die Frequenzen der mit der unverdünnten Fraktion 4 behandelten Muskelstreifen

steigen mit jeder Zugabe um 185.2% (p<0.001) an. Die niedrigeren Konzentrationen

machen diese Wirkung faktisch zunichte (p<0.001). Auch das mittlere Niveau der

prozentualen Frequenzen ist bei den unverdünnten Behandlungen am höchsten

(p<0.001) und wird durch die geringeren Konzentrationen nichtig gemacht.

Es konnte zudem ein Unterschied im zeitlichen Verlauf (F4 x Zugabe) (p<0.001)

zwischen Presssaft und Fraktion 4 gefunden werden. Unter Behandlung mit Fraktion

4 steigt die Frequenz 131% schneller an als unter der Behandlung mit Presssaft. Das

mittlere Niveau der prozentualen Frequenzen liegt 423.7% höher als bei den mit

Presssaft behandelten (p=0.001). Somit hat Fraktion 4 eine viel ausgeprägtere

Wirkung auf die Frequenzen der Myometriumstreifen als der Bryophyllum pinnatum-

Presssaft (Tabelle 23).

84

Tabelle 23. Vergleich der Behandlungen mit Presssaft und Fraktion 4 in verschiedenen Konzentrationen Parameter Ampl.

Proz Fläche

Proz Freq.

Proz.

unverdünnt beta std error

p-Wert beta std error

p-Wert beta std error

p-Wert

Achsenabschnitt 95.00 5.57 <0.001 76.00 5.62 <0.001 17.00 88.81 0.850F4 -24.10 8.42 0.007 -30.00 8.42 0.001 423.70 129.50 0.005Zugabe -11.70 0.96 <0.001 -10.40 0.89 <0.001 54.10 10.25 <0.001Einfluss des zeitlichen Verlaufs (F4*Z)

1.40 1.67 0.389 2.30 1.55 0.139 131.00 17.91 <0.001

10% Achsenabschnitt 121.30 10.51 <0.001 114.40 11.73 <0.001 86.20 22.27 0.001F4 -7.20 15.10 0.640 -7.30 16.88 0.671 -56.60 32.94 0.097Zugabe -10.50 0.72 <0.001 -10.60 0.86 <0.001 7.50 2.57 0.004Einfluss des zeitlichen Verlaufs (F4*Z)

-1.50 1.24 0.238 -1.16 1.48 0.279 23.80 4.45 <0.001

5% Achsenabschnitt 103.40 11.15 <0.001 89.90 11.51 <0.001 76.00 31.89 0.020F4 15.50 14.62 0.302 16.30 15.35 0.304 -19.30 38.74 0.620Zugabe -18.20 2.63 <0.001 -17.30 2.41 <0.001 17.00 10.10 0.096Einfluss des zeitlichen Verlaufs (F4*Z)

5.90 2.76 0.035 5.10 2.53 0.047 11.10 10.58 0.300

2% Achsenabschnitt 119.90 11.67 <0.001 101.10 10.68 <0.001 33.30 45.98 0.480F4 -25.10 16.52 0.154 -18.20 15.12 0.252 99.80 65.15 0.146Zugabe -11.40 0.67 <0.001 -10.60 0.65 <0.001 35.50 3.76 <0.001Einfluss des zeitlichen Verlaufs (F4*Z)

3.00 0.99 0.003 2.20 0.95 0.020 -28.70 5.50 <0.001

1% Achsenabschnitt 118.70 8.05 <0.001 111.20 11.12 <0.001 18.20 38.29 0.640F4 -1.30 12.33 0.920 7.00 17.25 0.690 -82.40 60.28 0.183Zugabe -9.10 0.62 <0.001 -9.50 0.94 <0.001 32.40 3.50 <0.001Einfluss des zeitlichen Verlaufs (F4*Z)

-5.40 1.83 0.004 -6.10 2.74 0.029 41.70 10.16 <0.001

4.2.7 Statistik

Der Kolmogorov-Smirnov-Test zeigte eine Normalverteilung der ermittelten Daten.

85

4.3 Analytik

4.3.1 HPLC Es wurden von Bryophyllum pinnatum-Presssaft diejenigen HPLC-Profile miteinander

verglichen, deren Probenvorbereitungen sich unterschieden.

Die HPLC-Profile des Bryophyllum pinnatum-Presssafts sind nachfolgend zuerst

ohne und anschliessend mit Zugabe der internen Standards Hesperidin und Bufalin

aufgezeigt. Sämtliche bei 298 nm detektierbaren Peaks, bei denen durch manuelle

Integration die Retentionszeiten sowie DAD-Spektren im Bereich 190-400 nm

zugeordnet werden konnten. Die einzelnen Peaks sind nummeriert.

86

min0 2 4 6 8 10 12 14 16

mAU

0

50

100

150

200

250

300

DAD1 A, Sig=298,8 Ref=550,100 (R9051301\R9051303.D)

1.4

70

1.9

33 2

.083

2.2

56 2

.450

2.6

69 2

.863

2.9

91 3.4

95

4.0

79 4

.309

4.8

70

5.3

10

5.8

62 6.1

41

6.4

51 6

.607 6.8

58 7

.012

7.1

98 7

.300

7.4

68 7

.559

7.6

81

7.9

91

8.3

28 8

.541

8.6

79

9.0

63

9.4

64 9

.633

9.7

18 9

.927

10.

175

10.

334

10.

522

10.

721

10.

930

11.

052

11.

215

11.

528

11.

696

11.

948

12.

126

12.

285

12.

512

12.

844

13.

034

13.

292

13.

412

13.

516

13.

625

13.

926

14.

289

14.

878

Bryophyllum pinnatumPress Juice without I.S., „BPJ“Lyophilized/RW

HPLC conditions (SOP):

Sunfire (Waters) C18, 3.5 mm, 150 x 3 mm + guardcolumnA = 0.1% formic acid; B = acetonitrile0-30 min, 5-100% B in A, linear gradient; 500 mL/min; 25°C10 mL inj.DAD 190-400 nmRun 1, 0-18 min

Analyzed 130509/RW+PMManual integration 180509/PM

22

24

1381

4

5

6 79

1011 1215 16 18

1920

21

25

27

28

2930

37

41

42

43

44

45

4636

31

38

4847

333435 39

492 173 14

2326

3240

5051 52 53

min14 16 18 20 22 24 26 28

mAU

-10

0

10

20

30

40

DAD1 A, Sig=298,8 Ref=550,100 (R9051301\R9051303.D)

14.

289

Area

: 25.1

277

14.

878

Area

: 2.10

236

15.

257

Area

: 10.7

704

16.

073

Area

: 4.68

699

16.

556

Area

: 6.71

224

17.

103

Area

: 6.53

845

18.

043

23.

531

5253

55 56 5754

Bryophyllum pinnatumPress Juice without I.S., „BPJ“

Abb. 34. HPLC-Chromatogramm in zwei Teilen nach Probenaufbereitung des Bryophyllum pinnatum-Presssaftes mit Lyophilisation, ohne interne Standards, nach Standard-HPLC-Bedingungen.

87

min0 2 4 6 8 10 12 14 16

mAU

0

50

100

150

200

250

300

DAD1 A, Sig=298,8 Ref=550,100 (P190509\TESTGE_V.D)

1.3

08 1

.391

1.5

87 1

.753

2.3

94

2.7

30

4.1

43

4.8

09

5.7

34

6.2

91

6.6

06 7.1

82 7

.412

7.5

46

7.8

45 8

.012

8.2

43 8

.490

8.8

47 9.2

18

9.5

33 9

.731

10.

074

10.

185

10.

487

10.

712

10.

936

11.

052

11.

223 11.

390

11.

496

11.

662

11.

806

11.

918

12.

228

12.

577

12.

794

13.

238

13.

353

13.

469

13.

602 1

3.73

2

14.

077

14.

493

15.

553

15.

816

16.

156

16.

366

16.

786

17.

769

1

5

28

37

41

42

43

45

46

38

47

26

4050

1.1

I.S.‐1 (Hesperidin)Bryophyllum pinnatum

Press Juice with I.S., „BPJ+IS“Lyophilized/RW

Analyzed 200509/RW+PMManual integration 200509/PM

min14 16 18 20 22 24 26 28

mAU

-10

0

10

20

30

40

DAD1 A, Sig=298,8 Ref=550,100 (P190509\TESTGE_V.D)

14.

077

14.

493

15.

553

15.

816

16.

156

16.

366

16.

786

17.

769

18.

276

19.

304

19.

537

19.

916

20.

816

20.

975

23.

993

I.S.‐2 (Bufalin)

Bryophyllum pinnatumPress Juice with I.S., „BPJ+IS“Lyophilized/RW

Analyzed 200509/RW+PMManual integration 200509/PM

Abb. 35. HPLC-Chromatogramm in zwei Teilen des Bryophyllum pinnatum-Presssaftes mit den zugefügten internen Standards Hesperidin (I.S.-1) und Bufalin (I.S.-2). Die Probenaufarbeitung war hier ebenfalls Lyophilisation.

88

Die DAD-UV-Spektren aller nummerierten Peaks sind nachfolgend aufgeführt. Die

Nummern der Peaks in den Chromatogrammen der Fraktionen entsprechen den

Peaks in den Chromatogrammen des Presssaftes.

nm200 225 250 275 300 325 350 375

mAU

0

200

400

600

800

1000

DAD1, 1.470 (1162 mAU, - ) of R9051303.D

1

nm200 225 250 275 300 325 350 375

mAU

0

5

10

15

20

25

30

35

40

DAD1, 1.930 (42.3 mAU, - ) of R9051303.D

2

nm200 225 250 275 300 325 350 375

mAU

-100

-80

-60

-40

-20

0

DAD1, 2.083 (118 mAU,Apx) of R9051303.D

3

nm200 225 250 275 300 325 350 375

mAU

0

50

100

150

200

250

300

350

400

450

DAD1, 2.256 (451 mAU,Apx) of R9051303.D

4

nm200 225 250 275 300 325 350 375

mAU

0

200

400

600

800

1000

DAD1, 2.450 (1067 mAU, - ) of R9051303.D

5

nm200 225 250 275 300 325 350 375

mAU

0

10

20

30

40

50

DAD1, 2.670 (55.4 mAU,Apx) of R9051303.D

6

nm200 225 250 275 300 325 350 375

mAU

0

10

20

30

40

50

60

DAD1, 2.863 (63.5 mAU,Apx) of R9051303.D

7

Bryophyllum pinnatumPress Juice „BPJ“0-30 minAnalyzed 130509/RW+PM180509DAD 200509/PM

nm200 225 250 275 300 325 350 375

mAU

0

20

40

60

80

100

120

DAD1, 3.496 (119 mAU,Apx) of R9051303.D

9

nm200 225 250 275 300 325 350 375

mAU

0

20

40

60

80

100

120

140

160

DAD1, 4.076 (159 mAU, - ) of R9051303.D

10

nm200 225 250 275 300 325 350 375

mAU

0

20

40

60

80

100

120

140

160

DAD1, 4.310 (174 mAU,Apx) of R9051303.D

11

nm200 225 250 275 300 325 350 375

mAU

0

20

40

60

80

100

120

DAD1, 4.870 (123 mAU,Apx) of R9051303.D

12

nm200 225 250 275 300 325 350 375

mAU

0

10

20

30

40

50

60

70

DAD1, 5.316 (71.2 mAU, - ) of R9051303.D

13

nm200 225 250 275 300 325 350 375

mAU

0

5

10

15

20

25

30

35

40

DAD1, 5.863 (45.3 mAU,Apx) of R9051303.D

14

nm200 225 250 275 300 325 350 375

mAU

0

25

50

75

100

125

150

175

DAD1, 6.143 (184 mAU,Apx) of R9051303.D

15

nm200 225 250 275 300 325 350 375

mAU

0

200

400

600

800

1000

1200

DAD1, 2.990 (1383 mAU, - ) of R9051303.D

8

Abb. 36. DAD-UV-Spektren der Peaks Nr. 1-15 aus dem Profiling des Presssaftes aus Bryophyllum pinnatum.

89

nm200 225 250 275 300 325 350 375

mAU

0

5

10

15

20

25

30

35

40

DAD1, 6.610 (44.9 mAU,Apx) of R9051303.D

17

nm200 225 250 275 300 325 350 375

mAU

0

10

20

30

40

50

60

70

80

DAD1, 6.856 (87.3 mAU, - ) of R9051303.D

18

nm200 225 250 275 300 325 350 375

mAU

-10

-5

0

5

10

15

20

DAD1, 7.010 (30.6 mAU, - ) of R9051303.D

19

nm200 225 250 275 300 325 350 375

mAU

-20

-15

-10

-5

0

5

10

15

DAD1, 7.197 (39.0 mAU, - ) of R9051303.D

20

nm200 225 250 275 300 325 350 375

mAU

0

5

10

15

20

25

30

DAD1, 7.297 (37.3 mAU, - ) of R9051303.D

21

nm200 225 250 275 300 325 350 375

mAU

0

5

10

15

20

25

30

35

40

DAD1, 7.470 (42.8 mAU,Apx) of R9051303.D

22

nm200 225 250 275 300 325 350 375

mAU

0

20

40

60

80

100

120

DAD1, 7.556 (127 mAU, - ) of R9051303.D

23

nm200 225 250 275 300 325 350 375

mAU

0

50

100

150

200

250

300

DAD1, 6.450 (313 mAU, - ) of R9051303.D

16

nm200 225 250 275 300 325 350 375

mAU

0

20

40

60

80

DAD1, 7.990 (92.3 mAU, - ) of R9051303.D

25

nm200 225 250 275 300 325 350 375

mAU

-10

0

10

20

30

40

50

60

DAD1, 8.330 (69.5 mAU,Apx) of R9051303.D

26

nm200 225 250 275 300 325 350 375

mAU

0

50

100

150

200

DAD1, 8.543 (243 mAU,Apx) of R9051303.D

27

nm200 225 250 275 300 325 350 375

mAU

0

50

100

150

200

250

DAD1, 9.063 (288 mAU,Apx) of R9051303.D

29

nm200 225 250 275 300 325 350 375

mAU

0

50

100

150

200

250

300

350

400

DAD1, 9.463 (420 mAU, - ) of R9051303.D

30

nm200 225 250 275 300 325 350 375

mAU

-20

0

20

40

60

80

DAD1, 9.637 (112 mAU,Apx) of R9051303.D

31

nm200 225 250 275 300 325 350 375

mAU

-30

-20

-10

0

10

20

30

40

DAD1, 8.676 (74.7 mAU, - ) of R9051303.D

28

nm200 225 250 275 300 325 350 375

mAU

-20

-10

0

10

20

30

40

DAD1, 7.683 (58.2 mAU,Apx) of R9051303.D

24

Abb. 37. DAD-UV-Spektren der Peaks Nr. 16-31 aus dem Profiling des Presssaftes aus Bryophyllum pinnatum.

90

nm200 225 250 275 300 325 350 375

mAU

-40

-20

0

20

40

60

80

DAD1, 10.177 (142 mAU,Apx) of R9051303.D

34

nm200 225 250 275 300 325 350 375

mAU

-60

-40

-20

0

20

40

60

80

DAD1, 10.337 (142 mAU,Apx) of R9051303.D

35

nm200 225 250 275 300 325 350 375

mAU

-60

-40

-20

0

20

40

60

80

DAD1, 10.523 (158 mAU,Apx) of R9051303.D

36

nm200 225 250 275 300 325 350 375

mAU

0

50

100

150

200

250

300

DAD1, 10.723 (331 mAU,Apx) of R9051303.D

37

nm200 225 250 275 300 325 350 375

mAU

0

50

100

150

200

250

300

350

DAD1, 10.930 (361 mAU, - ) of R9051303.D

38

nm200 225 250 275 300 325 350 375

mAU

-60

-40

-20

0

20

40

60

80

100

DAD1, 11.050 (161 mAU, - ) of R9051303.D

39

nm200 225 250 275 300 325 350 375

mAU

-20

0

20

40

60

80

100

DAD1, 9.930 (126 mAU,Apx) of R9051303.D

33

nm200 225 250 275 300 325 350 375

mAU

-20

0

20

40

60

80

DAD1, 9.717 (122 mAU, - ) of R9051303.D

32

nm200 225 250 275 300 325 350 375

mAU

0

50

100

150

200

250

DAD1, 11.697 (277 mAU,Apx) of R9051303.D

42

nm200 225 250 275 300 325 350 375

mAU

0

100

200

300

400

500

DAD1, 11.950 (479 mAU,Apx) of R9051303.D

43

nm200 225 250 275 300 325 350 375

mAU

-150

-125

-100

-75

-50

-25

0

25

50

DAD1, 12.123 (206 mAU, - ) of R9051303.D

44

nm200 225 250 275 300 325 350 375

mAU

0

20

40

60

80

100

120

140

DAD1, 12.283 (146 mAU, - ) of R9051303.D

45

nm200 225 250 275 300 325 350 375

mAU

-175

-150

-125

-100

-75

-50

-25

0

25

50

DAD1, 12.510 (216 mAU, - ) of R9051303.D

46

nm200 225 250 275 300 325 350 375

mAU

-150

-125

-100

-75

-50

-25

0

25

50

DAD1, 12.843 (209 mAU,Apx) of R9051303.D

47

nm200 225 250 275 300 325 350 375

mAU

0

500

1000

1500

2000

DAD1, 11.530 (2277 mAU,Apx) of R9051303.D

41

nm200 225 250 275 300 325 350 375

mAU

-100

-80

-60

-40

-20

0

20

40

60

DAD1, 11.217 (178 mAU,Apx) of R9051303.D

40

Abb. 38. DAD-UV-Spektren der Peaks Nr. 32-47 aus dem Profiling des Presssaftes aus Bryophyllum pinnatum.

91

nm200 225 250 275 300 325 350 375

mAU

-200

-150

-100

-50

0

DAD1, 13.410 (250 mAU, - ) of R9051303.D

49

nm200 225 250 275 300 325 350 375

mAU

-200

-150

-100

-50

0

DAD1, 13.623 (244 mAU, - ) of R9051303.D

50

nm200 225 250 275 300 325 350 375

mAU

-250

-200

-150

-100

-50

0

DAD1, 13.923 (268 mAU, - ) of R9051303.D

51

nm200 225 250 275 300 325 350 375

mAU

-200

-150

-100

-50

0

DAD1, 14.290 (243 mAU,Apx) of R9051303.D

52

nm200 225 250 275 300 325 350 375

mAU

-300

-250

-200

-150

-100

-50

0

DAD1, 14.876 (319 mAU, - ) of R9051303.D

53

nm200 225 250 275 300 325 350 375

mAU

-300

-250

-200

-150

-100

-50

0

DAD1, 15.257 (342 mAU,Apx) of R9051303.D

54

nm200 225 250 275 300 325 350 375

mAU

-400

-350

-300

-250

-200

-150

-100

-50

0

DAD1, 17.103 (430 mAU, - ) of R9051303.D

55

nm200 225 250 275 300 325 350 375

mAU

-200

-150

-100

-50

0

DAD1, 13.037 (239 mAU,Apx) of R9051303.D

48

nm200 225 250 275 300 325 350 375

mAU

-700

-600

-500

-400

-300

-200

-100

0

DAD1, 23.530 (675 mAU,Apx) of R9051303.D

57

nm200 225 250 275 300 325 350 375

mAU

0

250

500

750

1000

1250

1500

1750

2000

DAD1, 11.904 (2138 mAU,Apx) of TESTGE_5.D

I.S.-1 Hesperidin

nm200 225 250 275 300 325 350 375

mAU

0

200

400

600

800

1000

DAD1, 18.491 (1074 mAU,Apx) of TESTGE_5.D

I.S.-2 Bufalin

nm200 225 250 275 300 325 350 375

mAU

-400

-300

-200

-100

0

DAD1, 18.043 (461 mAU,Apx) of R9051303.D

56

Abb. 39. DAD-UV-Spektren der nummerierten Peaks Nr. 48-57 und der internen Standards Hesperidin und Bufalin.

Die Spektren der Peaks 21, 22 und 23 weisen Maxima um 225 und 300 nm auf, was

ein Hinweis auf Bufadienolide sein könnte (siehe Bufalin). Ebenso gibt es diese

Maxima bei den Peaks Nr. 26, 29 und 30. Die Peaks Nr. 41-43 weisen drei Maxima

in den DAD-UV-Spektren auf und zeigen ein für Flavonoide typisches Spektrum

(siehe Hesperidin).

92

Die nach der Fraktionierung mit Sephadex LH-20 erhaltenen Fraktionen (Fraktionen

2, 4 und 12) wurden ebenfalls mit der gleichen HPLC-Methode analysiert.

Bufadienolid-Fraktion (Fraktion 2) Das Chromatogramm der Fraktion 2 weist einige angereicherte Peaks (Nr. 50-54.3)

im Retentionsbereich von 13-16 Min. auf. Die DAD-Spektren, soweit interpretierbar,

lassen mit Maxima bei 225 und 300 nm Bufadienolidderivate vermuten.

min0 5 10 15 20 25 30 35

mAU

-10

0

10

20

30

40

50

DAD1 A, Sig=298,8 Ref=550,100 (R9030501\R9030503.D)

1.7

97 1

.963

3.3

05

8.9

48 9

.072

9.2

28 9

.304

9.6

28 9

.881

10.

125

10.

270

10.

475

10.

655

10.

929

11.

244

11.

474

11.

693

11.

866

11.

988

12.

218

12.

635 1

2.81

9 1

2.93

0 1

3.13

7 1

3.26

2 1

3.42

9 1

3.52

0 1

3.69

5 1

3.86

4 1

4.00

9 1

4.27

2 1

4.46

4 1

4.59

4 1

4.81

1 1

5.06

0 1

5.17

5 1

5.32

4 1

5.72

2 1

5.96

8 1

6.36

1 1

6.55

3

17.

603

18.

881

20.

467

21.

692

22.

190

25.

850

27.

262

27.

710

28.

127

28.

781

29.

057

29.

254

29.

609

30.

232

30.

866

31.

091 3

1.27

6 3

1.47

8 3

1.91

2 3

2.03

6 3

2.32

1

32.

982

33.

373

33.

952

34.

584

34.

839 3

5.07

0 3

5.67

4

36.

485

50

51

52.1

52.2

54.1

54.2

54.3

55.156.1

56.2

57.1

57.2

Bryophyllum pinnatumFraction 2, bufadienolides, „F2“

Analyzed 060309/RW

Abb. 40. HPLC-Chromatogramm der Fraktion 2.

93

nm200 225 250 275 300 325 350 375

mAU

0

100

200

300

400

DAD1, 13.693 (496 mAU, - ) of R9030503.D

nm200 225 250 275 300 325 350 375

mAU

-100

0

100

200

300

DAD1, 14.006 (529 mAU, - ) of R9030503.D

nm200 225 250 275 300 325 350 375

mAU

-100

0

100

200

300

400

DAD1, 14.466 (556 mAU,Apx) of R9030503.D

nm200 225 250 275 300 325 350 375

mAU

-200

-100

0

100

200

300

DAD1, 14.593 (580 mAU, - ) of R9030503.D

nm200 225 250 275 300 325 350 375

mAU

-200

-100

0

100

200

300

400

DAD1, 15.326 (683 mAU,Apx) of R9030503.D

nm200 225 250 275 300 325 350 375

mAU

-200

-100

0

100

200

300

400

500

DAD1, 15.720 (752 mAU, - ) of R9030503.D

nm200 225 250 275 300 325 350 375

mAU

0

200

400

600

800

DAD1, 16.553 (1003 mAU,Apx) of R9030503.D

nm200 225 250 275 300 325 350 375

mAU

-200

0

200

400

600

800

1000

DAD1, 21.693 (1400 mAU,Apx) of R9030503.D

50 51 52.1 52.2

54.1 54.2 54.3 56.1

nm200 225 250 275 300 325 350 375

mAU

-400

-200

0

200

400

600

800

1000

DAD1, 22.193 (1454 mAU,Apx) of R9030503.D

nm200 225 250 275 300 325 350 375

mAU

-800

-600

-400

-200

0

200

400

600

800

DAD1, 30.233 (1578 mAU,Apx) of R9030503.D

nm200 225 250 275 300 325 350 375

mAU

-200

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

DAD1, 33.953 (1670 mAU,Apx) of R9030503.D

56.2 57.1 57.2

Abb. 41. DAD-UV-Spektren der in der vorherigen Abb. (Chromatogramm der Fraktion 2) nummerierten Peaks.

94

Flavonoid-Fraktion (Fraktion 4) Fraktion 4 zeigt deutliche Peaks zwischen 10 und 13 Min. Aufgrund der DAD-UV-

Spektren sind es vermutlich Flavonoidderivate (2-3 Maxima bei 215-225, 285, 330

nm; vgl. Kämpferol, Hesperidin).

min0 2 4 6 8 10 12 14 16

mAU

-10

0

10

20

30

40

50

DAD1 A, Sig=298,8 Ref=550,100 (R9030601\R9030602.D)

1.3

00 1

.593

1.7

56

2.1

98 2

.472

3.1

43

6.0

45 6

.261

6.4

10 6

.665

6.7

62 7

.007

7.1

80

7.5

24 7

.763

8.0

84

8.6

03 8

.775

8.9

70

9.2

86

9.6

51

9.9

68

10.

308

10.

702

11.

014

11.

170

11.

269

11.

477

11.

637

11.

886

12.

164

12.

279

12.

404

12.

504

12.

906 1

3.13

2 1

3.24

2 1

3.37

5 1

3.49

4 1

3.74

4 1

3.94

6

14.

255

14.

743

15.

122

15.

222

15.

589

16.

171

16.

428

16.

556

17.

196

41

27

2223

29

30

38

Bryophyllum pinnatumFraction 4, flavonoids, „F4“

Analyzed 060309/RW

Abb. 42. HPLC-Chromatogramm der Fraktion 4 mit den auffallenden, wahrscheinlich Flavonoiden zuzuordnenden Peaks Nr. 22, 23 und 27.

nm200 225 250 275 300 325 350 375

mAU

0

20

40

60

80

100

DAD1, 7.521 (108 mAU, - ) of R9030602.D

nm200 225 250 275 300 325 350 375

mAU

0

20

40

60

80

100

120

140

DAD1, 7.761 (146 mAU, - ) of R9030602.D

nm200 225 250 275 300 325 350 375

mAU

0

25

50

75

100

125

150

175

DAD1, 8.774 (194 mAU, - ) of R9030602.D

22 23 27

Abb. 43. DAD-UV-Spektren der Peaks Nr. 22, 23 und 27 mit 2-3 Maxima bei 215-225, 285, 300nm.

95

Zimtsäurederivate-Fraktion (Fraktion 12) Fraktion 12 zeigt zwischen 8 und 9 Min. eine Peakanreicherung. Die 3 mit dem

Chromatogramm der lyophilisierten Probe übereinstimmenden Peaks weisen 2 UV-

Maxima bei 225 bzw. 235 nm auf und könnten somit zur Stoffklasse der

Zimtsäurederivate gehören.

min0 2 4 6 8 10 12 14 16

mAU

-10

0

10

20

30

40

50

DAD1 A, Sig=298,8 Ref=550,100 (R9030601\R9030603.D)

1.7

80 2.5

36

3.0

97

7.9

00

8.3

00

9.0

45

9.4

27

9.8

45

10.

278

10.

525

10.

997

11.

269

11.

472

11.

624

11.

948

12.

053

12.

258

12.

498

12.

765

13.

539

13.

997

14.

748 1

6.03

8 1

6.29

1 1

6.39

8 1

6.60

9

17.

010

17.

412

26

29

30

Bryophyllum pinnatumFraction 12, cinnamic acid deriv., „F12“

Analyzed 060309/RW

Abb. 44. HPLC-Chromatogramm der Fraktion 12 mit drei auffälligen Peaks (Nr. 26, 29 und 30).

nm200 225 250 275 300 325 350 375

mAU

-10

-5

0

5

10

15

20

25

DAD1, 8.303 (36.2 mAU,Apx) of R9030603.D

nm200 225 250 275 300 325 350 375

mAU

-40

-30

-20

-10

0

10

DAD1, 9.044 (55.6 mAU,Apx) of R9030603.D

nm200 225 250 275 300 325 350 375

mAU

-30

-20

-10

0

10

20

DAD1, 9.423 (52.4 mAU, - ) of R9030603.D

26

2930

Abb. 45. DAD-UV-Spektren der oben erwähnten Peaks, deren Maxima bei 225 und 325 nm Zimtsäurederivate vermuten lassen.

96

Um die Probenaufarbeitung schonender zu gestalten, wurden zudem andere

Methoden erarbeitet, deren HPLC-Chromatogramme anschliessend aufgeführt sind.

Dazu wurde die Lyophilisation durch Evaporation mittels Stickstoff (N2) ersetzt. Dabei

wurde ersichtlich, dass das HPLC-Chromatogramm nach der Probenaufarbeitung mit

Lyophilisation wesentlich mehr Peaks und grössere Peakflächen der einzelnen

Peaks aufweist als nach der N2-Evaporation. Die Peaks Nr. 29 und 30 sind sehr viel

grösser bei der Lyophilisationsmethode, als bei der N2-Evaporation. Es ist

gleichzeitig keine Abnahme anderer Peaks feststellbar, was eher auf eine

Anreicherung gewisser Substanzen und nicht auf entstandene Zersetzungsprodukte

hindeutet.

Als zweite Alternativmethode wurde der Bryophyllum pinnatum-Presssaft mittels

Rotationsverdampfer (Rotavap) evaporiert. Hier ergeben sich im HPLC-

Chromatogramm grössere Peakflächen als nach der N2-Evaporation. Auffällig sind

vor allem die Peaks Nr. 21, 23, 27, 29 und 30, die aufgrund ihrer DAD-UV-Spektren

vermutlich Flavonoide sind (Anhang K).

97

min0 2 4 6 8 10 12 14 16

mAU

0

50

100

150

200

250

300

DAD1 A, Sig=298,8 Ref=550,100 (R9051301\R9051303.D)

1.4

70

1.9

33 2

.083

2.2

56 2

.450

2.6

69 2

.863

2.9

91 3.4

95

4.0

79 4

.309

4.8

70

5.3

10

5.8

62 6.1

41

6.4

51 6

.607 6.8

58 7

.012

7.1

98 7

.300

7.4

68 7

.559

7.6

81

7.9

91

8.3

28 8

.541

8.6

79

9.0

63

9.4

64 9

.633

9.7

18 9

.927

10.

175

10.

334

10.

522

10.

721

10.

930

11.

052

11.

215

11.

528

11.

696

11.

948

12.

126

12.

285

12.

512

12.

844

13.

034

13.

292

13.

412

13.

516

13.

625

13.

926

14.

289

14.

878

Bryophyllum pinnatumPress Juice without I.S., „BPJ“Lyophilized/RW

HPLC conditions (SOP):

Sunfire (Waters) C18, 3.5 mm, 150 x 3 mm + guardcolumnA = 0.1% formic acid; B = acetonitrile0-30 min, 5-100% B in A, linear gradient; 500 mL/min; 25°C10 mL inj.DAD 190-400 nmRun 1, 0-18 min

Analyzed 130509/RW+PMManual integration 180509/PM

22

24

1381

4

5

6 79

1011 1215 16 18

1920

21

25

27

28

2930

37

41

42

43

44

45

4636

31

38

4847

333435 39

492 173 14

2326

3240

5051 52 53

min14 16 18 20 22 24 26 28

mAU

-10

0

10

20

30

40

DAD1 A, Sig=298,8 Ref=550,100 (R9051301\R9051303.D)

14.

289

Area

: 25.1

277

14.

878

Area

: 2.10

236

15.

257

Area

: 10.7

704

16.

073

Area

: 4.68

699

16.

556

Area

: 6.71

224

17.

103

Area

: 6.53

845

18.

043

23.

531

5253

55 56 5754

Bryophyllum pinnatumPress Juice without I.S., „BPJ“

Abb. 46. HPLC-Chromatogramm nach Probenaufbereitung des Bryophyllum pinnatum-Presssaftes mit Lyophilisation.

98

min0 2 4 6 8 10 12 14 16

mAU

-10

0

10

20

30

40

50

DAD1 A, Sig=298,8 Ref=550,100 (300709\BPJ.D)

1.3

71 1

.519

1.6

08 1

.770

2.4

10

2.6

86 2

.919

5.1

81

6.0

14

6.3

84

6.8

24 7

.078

7.3

87 7.5

69

8.0

00

8.3

48 8

.582

8.8

00 9

.065 9.4

11

9.8

49 9

.962 1

0.16

3 1

0.28

0 1

0.51

8 1

0.62

1 1

0.82

1 11.

048

11.

422

11.

602

11.

767

12.

030

12.

328

12.

458

12.

772 1

2.90

2

13.

310

13.

403

13.

517

14.

148

17.

820

5

41

42

43

45

47

50

37

38

40

2930

27

2821

23

?

Bryophyllum pinnatumPress Juice „BPJ“N2 pasteur pip.

Analyzed 300709/SG

min14 16 18 20 22 24 26 28

mAU

-10

0

10

20

30

40

50

DAD1 A, Sig=298,8 Ref=550,100 (300709\BPJ.D)

14.

148

17.

820

Bryophyllum pinnatumPress Juice „BPJ“N2 pasteur pip.

Analyzed 300709/SG

Abb. 47. HPLC-Chromatogramm des Presssaftes von Bryophyllum pinnatum, der mittels N2-Evaporation aufgearbeitet wurde.

99

min0 2 4 6 8 10 12 14 16

mAU

-10

0

10

20

30

40

50

DAD1 A, Sig=298,8 Ref=550,100 (050809\B3BPROT.D)

1.3

22 1

.510

1.5

98 1

.757

2.1

78

2.5

62 2

.659

2.8

85

3.5

64 3

.724

4.1

88

4.7

05

5.0

43

5.9

94 6.2

32 6

.421

6.7

07 6.8

99

7.2

06 7

.420

7.5

90 7

.708

7.8

34 7

.969

8.1

98 8

.327

8.5

86 8

.787

9.3

50

9.6

78

10.

123

10.2

41 1

0.38

6 1

0.48

0 10.

594

10.

787

11.

013

11.

401

11.

564

11.

733

11.

992

12.

290

12.

417

12.

563

12.

858

13.

243

13.

529

13.

642

14.

123

16.

927

17.

791

Bryophyllum pinnatumPress Juice „BPJ“Rotavap

Analyzed 050809/SG 5

21

23

27

28

29

30

34

35

37

38

40

414243 45

46 47

4950

52

min14 16 18 20 22 24 26 28

mAU

-10

0

10

20

30

40

50

DAD1 A, Sig=298,8 Ref=550,100 (050809\B3BPROT.D)

14.

123

16.

927

17.

791

21.

048

21.

496

22.

890 2

3.46

5

27.

617

27.

724

Abb. 48. HPLC-Chromatogramm des Presssaftes von Bryophyllum pinnatum, der mittels Rotationsverdampfer-Methode aufgearbeitet wurde.

100

Zur besseren Übersicht über die verschiedenen Präparationen von Bryophyllum

pinnatum wurden deren HPLC-Chromatogramme ebenfalls miteinander verglichen.

Dabei wird ersichtlich, dass im ethanolischen (EtOH-) Extrakt von Bryophyllum

pinnatum gegenüber dem Presssaft viel mehr Peaks vorhanden sind. Dies, weil unter

anderem im hydrophilen Presssaft weniger lipophile Inhaltsstoffe, z.B. Aglyka, als im

ethanolischen Extrakt vorhanden sind. So sind die Flavonoid-Aglyka Quercetin (Peak

Nr. 53) und Kämpferol (Peak Nr. 58) nur im EtOH-Extrakt nachweisbar (Anhang L).

Viele Peaks mit Retentionszeiten zwischen 10 und 16 Min. weisen für Flavonoide

typische DAD-UV-Spektren auf.

Die in der klinischen Studie verwendeten Tabletten wurden ebenfalls nach der

Rotationsverdampfer-Methode aufgearbeitet und mit der gleichen HPLC-Methode

chromatographiert. Dieses wurde mit dem Chromatogramm des Presssaftes

verglichen (Anhang M). Die Peaks mit Retentionszeiten bis 10 Min. sind viel kleiner

bzw. teilweise nicht existent. Die DAD-UV-Spektren der Peaks mit Retentionszeiten

zwischen 10 und 14 Min. sind nicht sehr aussagekräftig.

Werden die Chromatogramme von verschiedenen Präparationen von Bryophyllum

pinnatum mit denjenigen von Bryophyllum daigremontianum (EtOH-Mazeration),

einer anderen Pflanze der gleichen Familie, die in der anthroposophischen Medizin

ebenfalls verwendet wird, verglichen, gibt es diverse Unterschiede im HPLC-Profil

(Anhang N): Bryophyllum daigremontianum zeigt im Retetionsbereich von 10-13 Min.

weniger Peaks und bei 17.8 Min. einen zusätzlichen Peak. Das DAD-UV-Spektrum

weist Maxima bei 225 und 300 nm auf (Vergleich I.S. Bufalin), was auf ein

Bufadienolid-Derivat hindeutet.

101

4.3.2 MPLC

Bryophyllum pinnatum Presssaft 1828.6 g

Lyophilisieren

Lyophilisat

80.6 g

F 1: 92.8 mg

Referenz 1.7 g

78.9 g in MeOH gelöst und filtriert, Rückstand 3 mal mit MeOH gewaschen, einrotiert

5.9 g in 15 ml MeOH gelöst und mittels Sephadex getrennt

F 2: 307.7 mg F 3: 806.7 mg F 4: 3197 mg F 5: 72.4 mg F 6: 30.3 mg

F 7: 126.5 mg F 8: 217.3 mg F 9: 33.5 mg F 10: 70.0 mg F 11: 16.5 mg F 12: 55.1 mg

F 13: 56.4 mg F 14: 38.2 mg

Fraktionen (F):

Abb. 49. Trennungsschema ausgehend vom Presssaft über Lyophilisation und Trennung mit Sephadex LH-20 (MPLC) bis zur Vereinigung der Fraktionen. Die einzelnen Fraktionen sind mit F und der entsprechenden Zahl angegeben, Ausbeute in mg.

102

Fraktion 4 war diejenige mit der grössten Ausbeute. Eine Übersicht aller Fraktionen

und deren Ausbeuten gibt Tabelle 24.

Tabelle 24. Die resultierten Mengen der Fraktionen Fraktion 1 92.8 mgFraktion 2 307.7 mgFraktion 3 806.7 mgFraktion 4 3197 mgFraktion 5 72.4 mgFraktion 6 30.3 mgFraktion 7 126.5 mgFraktion 8 217.3 mgFraktion 9 33.5 mgFraktion 10 70.0 mgFraktion 11 16.5 mgFraktion 12 55.1 mgFraktion 13 56.4 mgFraktion 14 38.2 mg

4.3.3 DC

Monitoring der Sephadex-Fraktionen

Die einzelnen DC-Spots wurden unter dem Licht zweier Wellenlängen (λ=254 nm

bzw. λ=366 nm) markiert (Fluoreszenzlöschung bzw. Fluoreszenz), die RF-Werte

jedes Spots berechnet und entsprechend Fraktionen aus der MPLC vereinigt. Die zur

DC verwendeten mobilen Phasen waren EtOAc/MeOH (3:1; mobile Phase 1) bzw.

Dichlormethan (DCM; mob. Phase 2). Die RF-Werte der Spots jeder Fraktion sind in

der folgenden Tabelle 25 aufgeführt.

103

Tabelle 25. DC-Spots und ihre RF-Werte der Fraktionen und des Presssaftes von Bryophyllum pinnatum Fraktion (F) Spot Nr. RF-Wert Wellenlänge λ

(nm) Mobile Phase

F1 Startspot ändert Farbe je nach mobiler PhaseF2 4 0.11 366 2F3 5 0.10 254 2 6 0.90 254 2 7 0.13 366 2F4 10 0.11 254 2 11 0.24 366 2F5 12 0.17 366 2F6 15 0.20 366 2F7 17 0.23 366 2F8 20 0.25 366 2 Fraktion (F) Spot Nr. RF-Wert Wellenlänge λ

(nm) Mobile Phase

Presssaft 1 0.41 254 1 2 0.50 254 1 3 0.78 254 1F4 8 0.60 254 1 9 0.66 254 1F6 13 0.41 254 1 14 0.49 254 1F7 16 0.38 254 1F8 18 0.63 254 1 19 0.80 254 1F9 21 0.93 254 1 22 0.94 366 1F10 23 0.71 254 1 24 0.81 254 1 25 0.73 366 1F11 26 0.90 366 1F12 Startspot intensiver hellblau als alle anderen 27 0.80 366 1 28 0.90 366 1F13 29 0.88 366 1F14 30 0.93 254 1 31 0.94 366 1

104

4.3.4 HPLC-MS

Es wurde eine Literatursuche mit Scifinder gemacht und nach Kalanchoë und

Bryophyllum gesucht. Dabei lag der Fokus auf Artikeln, die einzelne Inhaltsstoffe von

Bryophyllum pinnatum und deren Massen enthielten, um einen Überblick zu erhalten,

welche Inhaltsstoffe bereits bekannt sind.

Da es für die HPLC-MS-Methode noch keine ausgereiften Bibliotheken für

Vergleichsspektren gibt, wurde eine gezielte Suche nach den Massen der aus der

Pflanze bekannten Inhaltsstoffe durchgeführt. Die in der Literatur gefundenen Stoffe

(Name, Formel, Stoffklasse und Molgewicht) sind in der Tabelle in Anhang O

zusammengestellt.

Als Inhaltsstoffe wurden Flavonoide, Bufadienolide, Säuren, Triterpene und

Phenanthrene gefunden. Die zugehörigen Molgewichte und die Referenzliteratur sind

ebenfalls in Anhang O zu finden.

In der darauffolgenden Analyse mittels HPLC-MS wurden Stoffe mit den

Molgewichten 579, 595, 563, 447, 609 und 741 gefunden.

Die Ionen mit den Masse/Ladungsverhältnissen m/z 579 ergaben Fragmente mit m/z

301, was auf Hesperetinglykoside hinwies. Jene mit m/z 595 fragmentierten zu 463,

316, 271, was auf ein Aglykon vom Typ Naringenin und als Zucker eine Pentose mit

Rhamnose, z. B. Arabinose-Rhamnose (Ara-Rha) hindeutete. Die Ionen m/z 563

ergaben Fragmente der Grösse 413, 285, 255, was auf den Aglykon-Typ Luteolin

hinwies. Hier gibt es keine Vermutung für die Natur der Zucker.

Ionen mit m/z 447 ergaben Fragmente der Masse m/z 285, was auf Aglyka des Typs

Kämpferol/Luteolin schliessen liess. Der Zucker dürfte eine Hexose, z. B. Glucose

(Glc) sein. Die Ionen m/z 741 fragmentierten zu 579, 462, 301, 271 was auf

Hesperitinglykoside hindeutete, der Aglykon-Typ war Hesperetin, der angehängte

Zucker Hexose-Pentose-Rhamnose.

Es konnten mittels HPLC-MS keine Bufadienolidderivate gefunden werden, dies

weder im Presssaft von Bryophyllum pinnatum, noch in den Fraktionen 2, 4 oder 12.

105

4.3.5 Verdrängung von Flunitrazepam am GABAA-Rezeptor durch Bryophyllum pinnatum-Presssaft

Es war weder eine Stimulation noch eine Inhibition bis 0.1 mg/ml (Endkonzentration

Presssaft) zu messen. Es konnte somit keine Verdrängung/Bindung an die GABA-

Bindungsstelle der zwei häufigsten Isoformen des GABAA-Rezeptors festgestellt

werden.

4.3.6 Bindungsaffinität von Bryophyllum pinnatum zur GABA-binding site des GABAA-Rezeptors

Die ermittelten IC50 -Werte für die GABAA-Rezeptorbindung sind:

Für Presssaft 97.6 μg/ml mit einem 95%-VI (μg/ml) von 54.1-176.2 und für die

Kontrolle GABA 57.8 nM mit einem 95%-VI (nM) von 27.0-123.8.

Diese Resultate beziehen sich auf die Bestimmung der Affinität zum Rezeptor. Es ist

hiermit noch nicht geklärt, ob es sich um einen Antagonisten oder einen Agonisten

handelt.

106

5 Diskussion

5.1 Klinische Studie

Die klinische Studie „Bryophyllum pinnatum versus Nifedipin zur Behandlung

vorzeitiger Wehentätigkeit“ sollte gemäss Poweranalyse mit 69 Patientinnen je

Gruppe durchgeführt werden. Für die vorliegende Arbeit wurden nur die Daten der

Patientinnen ausgewertet, von denen bis zum 30.11.2009 abgeschlossene CRFs

existierten. Das waren insgesamt n=27 Patientinnen. Für diese kleine Fallzahl gibt es

mehrere Gründe.

1. Im Moment des Auftretens vorzeitiger Wehentätigkeit wird die Geduld und Ruhe

einer werdenden Mutter auf die Probe gestellt. Sie meldet sich beim Arzt und es

muss rasch geholfen werden. Ist die 34. SSW noch nicht erreicht und es droht eine

Frühgeburt, muss die Schwangere an ein Zentrum überwiesen werden, wo im Notfall

auch dem Frühgeborenen angemessene medizinische Hilfe zuteil werden kann. Bei

Aufnahme wird die Schwangere untersucht und sie wird, falls für sie eine orale

Tokolyse in Frage kommt, über den off-label-use von Nifedipin zur Tokolyse

aufgeklärt. In dieser Notfallsituation, wo Angst, Hoffnung und Spannung über den

Ausgang der Schwangerschaft im Vordergrund stehen, ist es sehr schwierig und eine

zusätzliche Belastung, auch noch über die Teilnahme an einer Studie zu

entscheiden. Dennoch sind viele Schwangere froh, wenn sie genau in diesem

Moment erfahren, dass es nebst der Tokolyse mit Nifedipin, einem synthetischen

Arzneimittel, das dosisabhängig den Kreislauf der Mutter belasten kann, noch die

Möglichkeiten des natürlichen Medikamentes gibt. Mit Bryophyllum pinnatum können

sie ihre vorzeitigen Kontraktionen vermindern, ohne dabei Blutdruckabfälle

befürchten zu müssen, da das Nebenwirkungspotenzial sehr gering ist.

2. Viele Patientinnen wurden bereits mit einer intravenösen Tokolyse überwiesen,

sodass kein Spielraum für eine eventuelle Studienteilnahme bestand.

3. Manche Ärzte befürchteten, dass ein Phytotherapeutikum nicht genügend wirkt.

Diese Befürchtung kann durch das Studiendesign entkräftet werden, da bereits nach

4 Std. eine erneute Beurteilung der geburtshilflichen Situation stattfindet, wobei der

107

Bishop-Score eindeutig Auskunft gibt, ob eine (weitere) Reifung der Zervix / und oder

Öffnung des Muttermundes stattgefunden hat oder nicht. Leider war es ungebrochen

schwierig, die am UniversitätsSpital tätigen Ärztinnen und Ärzte zu motivieren, ihre

Patientinnen für die Studie zu begeistern. Inwieweit die Einstellung der Schulmedizin

gegenüber der Komplementärmedizin zum Tragen kommt, muss offen bleiben. In

Anbetracht der Tatsache, dass eine Mehrheit der Bevölkerung sich im Jahre 2009

klar für die Komplementärmedizin ausgesprochen hat, sind Studien wie diese

berechtigt und notwendig. Nur Untersuchungen, die den Anforderungen der

Behörden genügen, vermögen langfristig Effizienz und Daseinsberechtigung von

Phytotherapeutika wie Bryophyllum pinnatum-Kautabletten zu sichern.

4. Ein weiterer Punkt stellt das Kollektiv an einem Universitätsspital dar. Die

kulturellen Unterschiede zwischen den einzelnen Patientinnen spielen bei der

Patientinnen-Rekrutierung eine grosse Rolle. In vielen Familien entscheidet in der

Praxis immer noch der Mann alleine darüber, welche Medikamente seine Ehefrau

einnehmen darf und welche nicht.

5. Die von Swissmedic nach der Inspektion verlangten Modifikationen des

Studienprotokolls bedingten eine Pause von einigen Monaten, in denen nicht

rekrutiert werden konnte. Dies hatte im schnelllebigen Klinikalltag zur Folge, dass die

Studie quasi von Null wieder begonnen werden musste. Leider dauert es jeweils viel

zu lange, bis alle Beteiligten wieder daran denken, auch in der Notfallsituation der

vorzeitigen Kontraktionen an eine laufende Studie zu denken.

Innerhalb des für die Auswertung zur Verfügung stehenden Kollektivs von n=27

Patientinnen können folgende Aussagen gemacht werden:

1. Hauptzielparameter: Nach 4 Std. Behandlung ruhig; Bishop Score < 5.

Die Anzahl Kontraktionen nimmt in beiden Gruppen zwischen der Eintritts- und der 4

Stunden Untersuchung signifikant ab (Bryophyllum p=0.019, Nifedipin p=0.011). Hier

zeigt sich gemäss Studienprotokoll ein klarer Erfolg für beide Gruppen.

Der Bishop-Score verändert sich zwischen der Eintrittsuntersuchung und der 4

Stunden Untersuchung nicht signifikant; der Unterschied zwischen den Gruppen ist

ebenfalls nicht signifikant.

Die Bedingung für einen Erfolg (Hauptzielparameter) ist somit in beiden Gruppen

erfüllt.

108

2. Nebenzielparameter

Die systolischen wie auch die diastolischen Blutdruckwerte steigen in der

Bryophyllum pinnatum-Gruppe zwischen der Eintrittsuntersuchung und der 4

Stunden Untersuchung an (Systole p=0.018, Diastole p=0.004), nicht jedoch in der

Nifedipingruppe. Dies ist aber kein Nachteil, da es in der Bryophyllum pinnatum-

Gruppe keinen Anstieg in hypertone Bereiche gibt.

Im Hinblick auf Aussagen zur Verträglichkeit und Toxizität kann festgestellt werden,

dass sich die hämatologischen und hepatologischen Parameter zwischen den

Behandlungsgruppen nicht unterschieden und im Laufe der Behandlung mit den

Studienmedikamenten keine Anstiege zu verzeichnen waren. Dies lässt den Schluss

zu, dass eine Belastung der Leber als wichtigstes metabolisierendes Organ durch

keines der Studienmedikamente festzustellen ist.

Eine normale Vaginalflora kam in beiden Gruppen gleich häufig vor.

Das Gestationsalter unterschied sich zwischen den Gruppen weder bei Eintritt in die

Studie, noch zum Zeitpunkt der Geburt. Ebenfalls wurde kein Unterschied festgestellt

in der Dauer zwischen Einschluss und Geburt. Hier muss jedoch angemerkt werden,

dass einige Patientinnen zwischen der Untersuchung 3 und der Geburt zusätzlich zur

Studienmedikation Adalat oder Gynipral zur Hemmung vorzeitiger Wehentätigkeit

erhielten. Das Kollektiv von 27 Patientinnen ist zu klein, um hier eine Aussage

machen zu können über die tokolytische Wirksamkeit der beiden Präparate über 49

Stunden hinaus.

Die Geburtsmodi der Studienpatientinnen unterschieden sich nicht signifikant.

Während der Geburt gab es in keiner Gruppe mehr Komplikationen als in der

anderen.

Allgemein waren sehr wenige Komplikationen während des Wochenbetts zu

beobachten und wenn sie vorkamen, dann in beiden Gruppen gleich häufig.

Die Parameter zum Neugeborenenzustand unterschieden sich ziwschen den beiden

Gruppen nicht.

109

Die Hospitalisationsdauer post partum der Patientinnen der Bryophyllum pinnatum-

Gruppe war deutlich kürzer (p=0.047), als jene der Nifedipingruppe. Dies ist positiv

zu werten und kann vielleicht mit einer allgemein entspannteren Situation vor der

Geburt in Zusammenhang gebracht werden.

Für einen regelmässigen, in der täglichen Routine des Klinikalltags möglichen

Einsatz von Bryophyllum pinnatum als Tokolytikum ist die Durchführung einer

klinischen Studie unabdingbar. Die Studie müsste aber eine Kollektivgrösse

aufweisen, die einer zugrundeliegenden Poweranalyse entspricht (in dieser Studie

waren ursprünglich geplant n=140). Mit den Resultaten aus einer solchen klinischen

Studie könnte eine Arzneimittel-Registrierung der Bryophyllum pinnatum-

Kautabletten bei Swissmedic erreicht werden. Für eine Folgestudie müssen jedoch

die beobachteten Schwierigkeiten bei der Rekrutierung berücksichtigt werden:

-Die Rekrutierung muss in jedem Fall durch einen motivierten Oberarzt in der

Gebärabteilung aktiv unterstützt werden.

-Es ist zu überlegen, ob anstelle des off-label verwendeten Nifedipins ein anderes

Vergleichspräparat gewählt werden soll. Dabei besteht die Schwierigkeit, dass die

zur Indikation Tokolyse offiziell zugelassenen Präparate Atosiban (Tractocile®) und

Hexoprenalin (Gynipral®) nur i.v. einsetzbar sind (Gynipral® ist oral applizierbar aber

nicht effizient genug), und Bryophyllum pinnatum in einer Vergleichsstudie ebenfalls

i.v. verwendet werden müsste.

-Viele Patientinnen kommen bereits vortokolysiert ins USZ, was an der vorliegenden

Studie eine Teilnahme verunmöglichte. Es müsste daher ein Studiendesign gewählt

werden, bei dem das Studienpräparat zusätzlich zur Vortokolyse verabreicht wird

und das Vortokolytikum ausgeschlichen werden kann.

-Bei einer multizentrischen Durchführung der Studie mit Teilnahme kleinerer Spitäler,

eventuell sogar mehrerer Kantone, könnten bereits in den zuweisenden Spitälern die

Patientinnen über eine Studie informiert und rekrutiert werden.

-Es müsste eine Möglichkeit geschaffen werden, direkt bei den Patientinnen eine

Information zur Studie zu platzieren, noch ausserhalb einer Notfallsituation. Dies

könnte z.B. in Wartezimmern der Gynäkologen mittels Flyern oder durch die

Hebammen beim Geburtsvorbereitungskurs stattfinden.

-Die Schweizerische Gesellschaft für Gynäkologie und Geburtshilfe (SGGG), welche

uns bereits eine Plattform geboten hat, Bryophyllum pinnatum an ihrer Jahrestagung

110

zu präsentieren, ist aufgerufen, ihre Mitglieder aktiv zum Einsatz des

nebenwirkungsarmen Phytotherapeutikums Bryophyllum pinnatum zu animieren.

5.2 Pharmakologie

Obschon viele Patientinnen bereit waren, ein Stück ihres Myometriums zu

Forschungszwecken zur Verfügung zu stellen, waren die Gewebeproben

unterschiedlich gut verwendbar. Nach Möglichkeit wurde Gewebe von Frauen

verwendet, die das erste Mal eine Sectio caesarea erhielten. War dies nicht möglich,

musste von Fall zu Fall entschieden und ausprobiert werden, ob das zum Teil

vernarbte Gewebe noch zu messbaren Kontraktionen fähig war.

Damit die verwendeten Myometriumstreifen die richtige Grösse hatten, um im

Myographen eingespannt werden zu können, brauchte es Routine. Auch zur

Beurteilung der Güte der jeweils ersten 5 aufgezeichneten Kontraktionen eines

Myometriumstreifens bedarf es Übung.

Vergleicht man die Ergebnisse der Experimente, bei welchen Presssaft oder die

Fraktionen 2, 4 und 12 als kontraktionshemmende Präparationen zugegeben

wurden, mit jenen, die nur mit Krebslösung behandelt wurden und deshalb als

Kontrollen gelten, so fällt auf, dass die wirksamsten Testlösungen die Fraktion 4 und

der Presssaft sind. Vor allem in der unverdünnten Anwendung weisen diese beiden

Lösungen eine Wirkung sowohl gegenüber den Kontrollen, als auch gegenüber den

Fraktionen 2 und 12 auf. Im direkten Vergleich zwischen den Wirkungen von

Presssaft und Fraktion 4 zeigt sich, dass Fraktion 4 in Bezug auf die AUC sowie die

Amplitude der Kontraktionen, die im Verlauf des Experiments abnehmen und

bezüglich Frequenzsteigerung eine grössere Wirkung zeigt als der Presssaft. Dies ist

vermutlich mit einer durch die Fraktionierung erreichten Anreicherung der

wirkungsbestimmenden Stoffe zu erklären, wobei diese noch nicht identifiziert sind.

Vermutlich handelt es sich um Flavonoide.

In den verdünnten Anwendungen konnten keine konzentrationsabhängigen

Wirkungen beobachtet werden. Es kann daran liegen, dass die Lösungen zu stark

verdünnt waren und deshalb kein Effekt mehr zu messen war. Dies könnte mit

111

Experimenten verifiziert werden, die mit mehreren Verdünnungen, aber geringerer

Konzentrationsunterschiede durchgeführt werden.

Bei allen Testlösungen, die einen signifikanten Unterschied zu den Kontrollen zeigten

fällt auf, dass im Verlauf der Zugabe der Testlösungen Amplitude und AUC der

Kontraktionen abnehmen und die Frequenzen ansteigen, bevor die messbaren

Kontraktionen sistieren.

Simões et al. (75) haben festgestellt, dass der Presssaft von Bryophyllum pinnatum

einen Effekt auf mit Oxytozin stimulierte humane Myometriumzellen hat. Oxytozin

steuert bekannterweise durch einen Anstieg der intrazellulären freien

Kalziumkonzentration die uterine Kontraktion. Dabei konnte gezeigt werden, dass der

Presssaft aus Bryophyllum pinnatum den oxytozininduzierten Anstieg von Ca2+ in

den Testzellen dosisabhängig verhindert. Eine solche spezifische Wirkung würde die

seltenen und milden Nebenwirkungen einer gut wirksamen Tokolyse mit Bryophyllum

pinnatum erklären. Die in den Myometriumexperimenten gezeigten Resultate zeigen

einerseits, dass die Frequenz der Kontraktionen zunimmt, was auf weitergehende

Depolarisationen hindeutet. Andererseits nehmen Amplitude und AUC ab, was

darauf hinweisen könnte, dass die Depolarisationen am Muskel keinen Effekt mehr

erzielen, sei dies durch den oben erwähnten erniedrigten Kalziumeinstrom in die

Zellen oder durch einen anderen Mechanismus. Für die klinische Praxis ist jedoch

wichtig, dass grundsätzlich gezeigt werden konnte, dass die Kontraktionen mit

Bryophyllum pinnatum reversibel gehemmt werden können.

Die Fraktion 4 sollte noch weiter aufgetrennt werden, um einzelne Inhaltsstoffe zu

identifizieren und in anschliessenden Myometriumstreifenexperimenten ihre Wirkung

zu testen. Es wäre denkbar, einzelne Inhaltsstoffe auch auf Toxizität zu prüfen.

Hierzu bedarf es in Zukunft aber viel grösserer Mengen Presssaft und Fraktionen im

Grammbereich. Die in der vorliegenden Arbeit für die in-vitro-Experimente

verwendete Presssaft-Charge sollte unbedingt mit Chargen anderer Erntezeitpunkte

oder Anbauorte verglichen werden, um zu beobachten, ob diese den gleichen Effekt

auf die Muskelstreifen erzielen.

Sehr interessant wäre auch der Vergleich der Wirkung der Fraktionen (ev. einzelner

Inhaltsstoffe) aus Presssaft von Bryophyllum daigremontianum auf die Kontraktionen

von Myometriumstreifen.

112

5.3 Analytik

Die HPLC-DAD-Methode erlaubt ein über Monate reproduzierbares

instrumentalanalytisches Profiling („chromatographisches Fingerprinting“) von

Bryophyllum-Präparationen. Dies gewährleistet auch einen Vergleich verschiedener

Chargen und/oder Ernten von Presssaft. HPLC-DAD ist deshalb die Methode der

Wahl für die Qualitätskontrolle und den Vergleich von Bryophyllum-Präparationen

(z.B. Bryophyllum pinnatum-Presssaft), -Chargen, -Provenienzen, -Species etc. Die

Bedingungen hierfür sind natürlich gleiche Analysenbedingungen wie in Kap. 3

Material und Methoden beschrieben.

Gemäss den erhaltenen Resultaten aus den Vergleichen der verschiedenen

Probenaufarbeitungen (Lyophilisation, Rotationsverdampfer oder N2-Evaporation)

kann in Zukunft mit der weniger aufwendigen, aber trotzdem schonenden Methode

der Einengung mittels Rotationsverdampfer gearbeitet werden, alternativ eignet sich

auch die N2-Evaporation.

Mit der gewählten Methode der Standardisierung (I.S.-1 und -2) ist gewährleistet,

dass relative Retentionszeiten (RRT) berechnet und verglichen werden können.

Anhand der Peakflächen ist eine grobe Abschätzung der Konzentration relativ zur

Menge der internen Standards möglich. Angesichts der chromatographischen

Langzeitstabilität gilt dies vor allem für die Bufadienolide, da diese für die

Peakzuordnung allein nicht unbedingt nötig sind. Eventuell reicht es, nur I.S.-1

(Hesperidin) einzusetzen. I.S.-2 (Bufalin) ist kommerziell schwierig zugänglich und

zudem sehr teuer. Es ist momentan noch nicht möglich, einzelne Komponenten zu

quantifizieren, hierzu müssen zuerst Peaks (einzelne Inhaltsstoffe) identifiziert und

mittels entsprechender Standards kalibriert werden.

Anhand der Diodenarray-UV-Spektren lassen sich in den HPLC-Profilen die 3

Hauptinhaltsstoffklassen Flavonoide (Aglyka und Glykoside), Bufadienolide und

Zimtsäurederivate ansatzweise zuordnen.

Die definitive Identifikation einzelner Inhaltsstoffe des Presssaftes ist nur durch

gekoppelte massenspezifische Detektion (HPLC-DAD-MS) und/oder Isolierung mit

nachfolgender offline-Spektroskopie (MS, NMR) möglich. Dabei sind

Referenzsubstanzen (analytische Standards) sehr hilfreich, leider aber kommerziell

113

meistens nicht zugänglich. Die in der GC/MS routinemässig eingesetzten und gut

zugänglichen Datenbanken sind für HPLC-MS noch weitgehend im Aufbau begriffen.

HPLC-MS ist ausserdem sehr aufwendig, komplex und teuer und deshalb nicht für

den Routineeinsatz geeignet.

In den HPLC-MS-Messungen wurden keine Bufadienolide gefunden, weder im

Presssaft von Bryophyllum pinnatum noch in den untersuchten Fraktionen. Dies kann

einerseits bedeuten, dass keine Bufadienolide in der Probe vorhanden sind bzw.

deren Konzentration für einen Nachweis zu tief ist. Im Zusammenhang mit der

Option, Bufadienolide als Leitsubstanz für die Toxizität von Bryophyllum pinnatum-

Presssaft (bzw. deren Produkte) zu definieren, müsste das Toxizitätspotential als

sehr gering eingestuft werden.

Anderseits muss aber offen bleiben, ob das HPLC-MS-System mit entsprechender

Datenbank zwar sehr gut auf Flavonoide nicht aber auf andere Stoffklassen optimiert

ist (Ref: Dr. K. Ndjoko, Universität GE). In diesem Sinne müsste als quantitative

Leitsubstanz nicht ein Bufadienolid sondern ein Flavonoid definiert werden.

Zukünftige weitergehende Untersuchungen werden diesen Punkt klären.

Durchgeführte GC-MS-Analysen des Presssaftes von Bryophyllum pinnatum und der

Fraktionen (Meyer P. et al. unveröffentlicht) zeigen ebenfalls eine Abwesenheit der

Bufadienolide.

Das Experiment zur Verdrängung von Muscimol durch Bryophyllum pinnatum am

GABAA-Rezeptor zeigte eine IC50 von 97.6 μg/ml. Dieses Experiment lieferte jedoch

noch keine Antwort auf die Frage, ob der Bryophyllum pinnatum-Presssaft als

Agonist oder Antagonist am GABAA-Rezeptor wirkt, sondern zeigte lediglich die

Affinität zum Rezeptor.

Beim Versuch der Verdrängung von Flunitrazepam vom GABAA-Rezeptor durch den

Presssaft aus Bryophyllum pinnatum war weder Inhibition noch Stimulation zu

messen.

In jedem Fall ist hier aber zu beachten, dass, falls GABA im Presssaft

natürlicherweise enthalten wäre, die mit den angewandten Mengen (Kautablette 50%

Bryophyllum pinnatum) erzielten Konzentrationen im Körper viel zu klein wären, um

einen Effekt zu erreichen.

114

Für eine gute Qualitätskontrolle bei der Herstellung der Bryophyllum pinnatum-

Kautabletten ist im Hinblick auf eine ev. Registrierung eine gute Vergleichbarkeit der

unterschiedlichen Ernten verschiedener Orte und Zeitpunkte notwendig. Um den

Presssaft von Bryophyllum pinnatum mehrerer Chargen miteinander zu vergleichen,

sollte ein Profiling von diesen durchgeführt werden und die in der Sephadex-

Trennung erhaltenen Fraktionen noch genauer untersucht werden. Für die

Feintrennung und Isolierung im Mikrogramm- und tiefen Milligrammbereich ist

präparative HPLC nötig. Die Strukturaufklärung bedingt schliesslich den Einsatz von

Kernresonanzspektroskopie (NMR), Massenspektrometrie (MS) und

Infrarotspektroskopie (IR).

Auch hier wäre ein direkter Vergleich der beiden Spezies Bryophyllum pinnatum und

Bryophyllum daigremontianum vor allem in Bezug auf das Vorkommen von

Bufadienoliden von Interesse.

115

6 Anhang

A. Patientinneninformation und Einverständniserklärung Klinische Studie

Patientinneninformation und Einwilligungserklärung:

PATIENTINNENINFORMATION UND EINWILLIGUNGSERKLÄRUNG

PATIENTINNENINFORMATION Titel: Bryophyllum pinnatum versus Nifedipin zur Behandlung der vorzeitigen Wehentätigkeit Name des Hauptprüfers: Prof. Dr. med. R. Zimmermann, Direktor Klinik für

Geburtshilfe, Univ.Spital Zürich, 8091 Zürich

Praktisch durchführende Doktorandin: dipl. pharm. Regula Wächter Forschung Geburtshilfe, Univ.Spital Zürich, 8091 Zürich

Tel: 044/ 255 51 01 (Sekretariat Prof. R. Zimmermann); Tel Mobile 078 723 40 44 (R.

Wächter, Doktorandin)

Adresse: Klinik und Poliklinik für Geburtshilfe, Universitätsspital Zürich, 8091 Zürich

1 ZIEL Sehr geehrte Patientin

Bei Ihnen wurden vorzeitige Wehen festgestellt, weshalb eine Behandlung mit einem

wehenhemmenden Medikament notwendig ist. In den letzten 4 Jahren haben wir

dazu Präparate mit dem Wirkstoff Nifedipin verwendet. Nun möchten wir in einer

Untersuchung die Wirkung eines pflanzlichen Präparates prüfen, das den Presssaft

der Blätter von Bryophyllum (B.) pinnatum (befiedertes Brutblatt) enthält. B. pinnatum

wurde bisher in Kliniken mit anthroposophisch erweiterter Medizin zur Behandlung

vorzeitiger Wehentätigkeit eingesetzt und zeigte dort eine gute Wirksamkeit und

hohe Verträglichkeit. Wir haben unsererseits die Eigenschaften von B. pinnatum in

116

zwei vorangegangenen Untersuchungen bestätigen können (1. Hemmung der

Gebärmuttermuskel-Kontraktionen und 2. rückblickende Beurteilung der klinischen

Wirksamkeit und Verträglichkeit).

Das Ziel der vorliegenden Untersuchung ist, in einer vorausblickenden

Studienanordnung die Wirksamkeit und Verträglichkeit einer medikamentösen

Wehenhemmung mit B. pinnatum im Vergleich zum herkömmlichen Nifedipin

während 49 Stunden zu prüfen. Die Zuordnung zu der Gruppe Nifedipin bzw. der

Gruppe Bryophyllum erfolgt nach dem Zufallsprinzip. Nifedipin wird als Kapseln

(Nifedipin-Mepha®) 10 mg bzw. als Tabletten (Adalat CR® von Bayer) 30 und 60 mg

verabreicht. Bryophyllum wird als Tabletten (Bryophyllum Tabletten à 350 mg von

Weleda) entsprechend 170 mg Bryophyllum Frischpflanze gegeben. Das

Dosierungsschema mit den Studienpräparaten richtet sich nach unseren bisherigen

Erfahrungen/Anwendungen (siehe 3. Ablauf der Studie). Nach der 4.

Behandlungsstunde wird aufgrund Ihres Befindens und der Anzahl Kontraktionen auf

dem Wehenschreiber (CTG) die Wirksamkeit des Präparates beurteilt. Zeigt sich

eine Verbesserung des Zustandes, wird mit dem begonnenen Wirkstoff

weitergefahren; zeigt sich keine Veränderung oder eine Verschlechterung wird

vaginal untersucht und je nach Befund auf ein anderes Präparat gewechselt. Bei

gleich gebliebenem Befund wird auf das Präparat der anderen Studiengruppe

gewechselt, bei Verschlechterung des Befundes wird mit einem Präparat ausserhalb

der Studie weiterbehandelt (mit Gynipral® oder mit Tractocile®). Nach der

vollendeten 49. Stunde wird je nach klinischer Situation und Ihrem Wunsch über die

Art der Weiterbehandlung diskutiert.

Zur weiteren Beurteilung der Wirksamkeit dienen uns das Blutbild und die

Prüfung des Scheidenabstrichs auf Bakterien, die wir vor Beginn der Studie und

zusätzlich am Ende der Studie durchführen sowie Daten zur Entbindungsart, zum

Zustand des Neugeborenen und zum Wochenbettverlauf.

Die Verträglichkeit wird anhand von Blutdruck, Puls und mittels eines

Fragebogens erhoben, der während der Studie in einem Interview ausgefüllt wird.

2 BEGRÜNDUNG DER STUDIE

Mit der vorliegenden Untersuchung versuchen wir herauszufinden, ob sich

Bryophyllum pinnatum eignet, um eine vorzeitige Wehentätigkeit möglichst

wirkungsvoll und mit geringen Nebenwirkungen zu behandeln.

117

3 ABLAUF DER STUDIE

• Während der ganzen Studiendauer werden Sie von Ihrem/Ihrer behandelnden

Arzt/Ärztin betreut.

• In einem gemeinsamen Gespräch mit dem/der behandelnden Arzt/Ärztin

werden Sie rechtzeitig über die Studie aufgeklärt und haben so Gelegenheit,

ausreichend Fragen zu stellen. Wenn Sie sich eine Teilnahme überlegt haben

und damit einverstanden sind, werden Sie die Einverständniserklärung

unterschreiben.

• Liegt das Einverständnis vor, werden Sie nach dem Zufallsprinzip einer der

beiden Studiengruppen zugeordnet.

• 1. Blutentnahme und 1. Abstrich der Scheidenwand erfolgen.

• Beginn der medikamentösen Therapie (siehe Anhang) :

• Beurteilung der Wirkung 4 Std. nach der 1. Medikamenteneinnahme aufgrund des geburtshilflichen Befundes:

Wirkung gut (=Verbesserung des Zustandes): Weiterbehandlung mit

Medikament der zugeteilten Gruppe bis zur 49. Stunde.

Wirkung mittelmässig (gleich gebliebener Zustand): Wechseln auf Medikament

der nicht zugeteilten Gruppe. Weiterbehandlung gemäss dortigem

Dosierungsschema beginnend bei 0 Std. und Ende bei total 49 Std. nach erster

(ursprünglicher) Medikamenteneinnahme.

Wirkung ungenügend (=Verschlechterung des Zustandes): Weiterbehandlung

mit Nicht-Studienpräparaten. Der behandelnde Arzt/die behandelnde Ärztin

entscheidet über das geeignete Präparat.

• 2. Blutentnahme und 2. Abstrich der Scheidenwand unmittelbar nach der

Medikamenteneinnahme bei 49 Std. erfolgen.

• Ende der Studie: Nach der 2. Blutentnahme bzw. dem 2. Scheidenabstrich bei

49 Std. Ihr behandelnder Arzt/Ihre behandelnde Ärztin entscheidet zusammen

mit Ihnen über die Art der Weiterbehandlung.

4 MÖGLICHE NEBENWIRKUNGEN UND RISIKEN

• Zu den häufigsten Beschwerden bei Nifedipin zählen Kopfschmerzen und

Schwindel, wobei das Ausmass bei der in der Studie vorgesehenen Dosierung

gemäss unseren Erfahrungen sehr gering sein dürfte. Mit Bryophyllum pinnatum

118

wurden bisher extrem selten Nebenwirkungen festgestellt; dabei wurde ebenfalls

v.a. über Kopfschmerzen und Schwindel geklagt. Zu erwähnen ist, dass diese

Nebenwirkungen unabhängig vom Präparat im Zusammenhang mit der

vorzeitigen Wehentätigkeit bzw. der speziellen Hormonlage stehen kann.

• Bei unzureichender Wirkung eines der Studienpräparate nach 4 Stunden

entscheidet Ihr behandelnder Arzt/Ihre behandelnde Ärztin aufgrund des

geburtshilflichen Befundes, mit welchem Medikament bzw. Dosierungsschema

Sie weiterbehandelt werden.

5 VORTEILE

• Die Teilnahme bringt für Sie keine direkten Vorteile. Das Behandlungskonzept

innerhalb der Studie entspricht unserem standardisierten Vorgehen bei

Patientinnen mit vorzeitiger Wehentätigkeit (siehe Punkt 10). Mit Ihrer

Teilnahme leisten Sie jedoch einen wichtigen Beitrag, die Sicherheit der

Behandlung vorzeitiger Wehentätigkeit mittels eines allopathischen

(chemischen) und eines pflanzlichen Arzneimittels genauer zu beurteilen zu

können.

6 VERTRAULICHKEIT

• Alle im Rahmen der Studie anfallenden Daten werden in anonymisierter Form

(nur Initialen ohne Namensnennung) weitergegeben. Der Prüfarzt sowie

sämtliche an der Studie beteiligten Personen unterliegen der

Verschwiegenheitsverpflichtung.

• Der abschliessende Studienbericht kann veröffentlicht werden. Auch dabei bleibt

die Vertraulichkeit der persönlichen Daten gewährleistet. Die Beachtung des

Datenschutzes ist in vollem Umfang sichergestellt.

7 VERSICHERUNG

Sollten Sie bzw. Ihr (ungeborenes) Kind im Rahmen dieser Studie irgendwelche

Schäden erleiden, ersetzt Ihnen der Sponsor dieser Studie (Firma Weleda,

Arlesheim) diese Schäden. Zu diesem Zweck hat Weleda eine Versicherung bei den

Winterthur Versicherungen abgeschlossen (Police Nr. 14.040.908/ZRH). Stellen Sie

während oder nach dem klinischen Versuch gesundheitliche Probleme oder andere

Schäden fest, so wenden Sie sich bitte an den Hauptprüfer (Prof. R. Zimmermann).

119

Sie wissen über die geltende Gesetzgebung Bescheid, verfügt über die

entsprechenden Unterlagen und wird für Sie die notwendigen Schritte einleiten.

8 KOSTEN Durch die Teilnahme an dieser Studie entstehen Ihnen und Ihrer Krankenkasse

keine Kosten.

9 FREIWILLIGE TEILNAHME Ihre Teilnahme an der Studie ist freiwillig, kann aber nur erfolgen, wenn Sie in den

letzten 4 Wochen nicht an einer anderen klinischen Studie zur Erforschung eines

Medikamentes oder einer Behandlungsmethode teilgenommen haben. Sie können

jederzeit und ohne Vorbehalte die Teilnahme zurückziehen. Dadurch entstehen

Ihnen keine Nachteile in der Weiterbehandlung.

10 ANDERE BEHANDLUNGSMÖGLICHKEITEN Die Behandlung mit Nifedipin (Nifedipin-Mepha® bzw. Adalat CR® ), wie wir sie für

eine der beiden Gruppen in der Studie vorgesehen haben, entspricht unserer

Standardbehandlung, die wir als erste Wahl bei jeder Patientin ausserhalb der

Studie anwenden würden. Das für jede Studienpatientin beschriebene Vorgehen

(Beurteilung der Wirksamkeit nach 4 Std., eventueller Wechsel der Behandlung)

entspricht ebenfalls dem Standardverfahren.

11 NEUE ERKENNTISSE AUS DER STUDIE Neue Erkenntnisse über die Wirksamkeit und Sicherheit der Studienmedikamente

werden wir Ihnen umgehend mitteilen. Sie haben auch danach jederzeit die

Möglichkeit, Ihre Einverständniserklärung zurückzuziehen, ohne dass Ihnen

Nachteile in der Weiterbehandlung entstehen.

12 ZUSÄTZLICHE INFORMATIONEN Unsere Doktorandin sowie der Prüfarzt, deren Adressen und Telefonnummern Sie

auf der ersten Seite finden, können Ihnen jederzeit zusätzliche Informationen geben

120

13 ANHANG

Dosierungsschema Nifedipin Gruppe:

0-1.0 Std..: alle 15. Min. eine Kapsel Nifedipin-Mepha 10

mg (also total 4 Kapseln).

1 Std. 15 Min.: 1 Tablette Adalat CR 60 mg

13.0 Std.: 1 Tablette Adalat CR 30 mg

25.0 Std.: 1 Tablette Adalat CR 60 mg

37.0 Std.: 1 Tablette Adalat CR 30 mg

49.0 Std.: 1 Tablette Adalat CR 60 mg

Dosierungsschema Bryophyllum Gruppe:

0-1.0 Std.: alle 15 Min. eine Tablette Bryophyllum Weleda

170 mg (also total 4 Tabletten)

7.0 Std.: 2 Tabletten Bryophyllum Weleda 170 mg

Alle weiteren 6 Std.

bis 49.0 Std.: 2 Tabletten Bryophyllum Weleda 170 mg

121

1. Original vom Prüfarzt 15 Jahre archivieren

2. Kopie der Patientin mitgeben

EINWILLIGUNGSERKLÄRUNG von

Name:..........................................................

Vorname.....................................................

(Patientin)

Geburtsdatum (TT/MM/JJ):……/……/…../

zur Teilnahme an der Studie Bryophyllum pinnatum versus Nifedipin zur Behandlung der vorzeitigen Wehentätigkeit

1. Ich habe die von Herrn / Frau Dr. ........................................

unternommene Aufklärung über Art, Durchführung sowie Risiken der betreffenden

Studie verstanden und ich hatte die Möglichkeit, Fragen zu stellen. Ferner hatte

ich die Gelegenheit, die studienspezifische Patienteninformation in Ruhe

durchzulesen und dazu allfällige Fragen zu stellen. Die von mir gestellten Fragen

wurden vollumfänglich beantwortet. Ich konnte mir genügend Zeit nehmen, bevor

ich meine Entscheidung zur Teilnahme an der Prüfung getroffen habe.

2. Für den Fall des Auftretens einer Schäden infolge meiner Teilnahme an der

Prüfung besteht im Rahmen der Versicherungsbedingungen ein

Versicherungsschutz.

3. Die Teilnahme ist freiwillig. Sie haben jederzeit die Möglichkeit, die Studie

abzubrechen, ohne dass Ihnen Nachteile in der Weiterbehandlung entstehen.

4. Neue Erkenntnisse über die Wirksamkeit und Sicherheit der Studienmedikamente

werden wir Ihnen umgehend mitteilen. Sie habe auch danach die Möglichkeit,

Ihre Einverständniserklärung zurückzuziehen

5. Eine Kopie dieser Einwilligungserklärung habe ich erhalten. Eine schriftliche

Patientinneninformation datiert vom 30.01.09 wurde mir ausgehändigt.

6. Im Rahmen der Studie werden meine Daten/Krankheitsdaten anonymisiert

aufgezeichnet und zur Auswertung den Auftraggebern der Studie zur Verfügung

gestellt. Zur Ueberprüfung der ordnungsgemässen Durchführung der Studie bin

ich einverstanden, dass inländische Behörden Einblick in die Daten nehmen.

122

7. Ich erkläre mich damit einverstanden, dass die dargelegte Studie einschliesslich

der notwendigen ärztlichen Untersuchungen an mir durchgeführt wird und ich

stimme der Aufzeichnung meiner Daten / Krankheitsdaten sowie der

Einsichtnahme in meine Krankenakte in der oben beschriebenen Form zu.

.........................................................

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Datum Unterschrift Patientin

Wichtig: muss von der Patientin ausgefüllt werden Ich habe die Patientin über Art, Zweck und Risiken dieser klinischen Prüfung

unterrichtet.

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Datum Unterschrift Prüfarzt

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B. Case Report Form klinische Studie

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C. Case Report Form klinischen Studie ab März 2009

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D. Verwendete Testpräparationen und Chemikalien

Alkoholischer Auszug 30% G/G (Schwäbisch Gmünd) Urtinktur F141-05 Herstellung 31.1.06 Art. Nr. 82144500 (interne Bezeichnung: D/1 BP) Fermentierter wässriger Auszug (Schwäbisch Gmünd) Rh 056-05 Herstellung 28.10.05 Art Nr. 890295500 Kalanchoë pinnata, Fol. Rec. 1:1,1 F145-05 Art. Nr. 19215600 (interne Bezeichnung: D/2 BP) Mazeratio Bryophyllum daigremontiana Folia 50%, Ethanol ca. 20% (m/m) 50921-01 Herstellung 21.9.05 (interne Bezeichnung: CH/1 BD) Pulver Bryophyllum daigremontiana Folia 33% mit Laktose 61206-02 Herstellung 6.12.06 (interne Bezeichnung: CH/2 BD) Bryophyllum Rh Urtinktur (Folium) Rh 048-04 25.8.04 Art. Nr. 89029500 (interne Bezeichnung: D/3 BP) Weleda Bryophyllum 50% Pulvis 1332/05 Art. Nr. 01002905A (interne Bezeichnung: B/1 BP) Bryophyllum 50%Trituratio 5061 (interne Bezeichnung: D/4 BP) Bryophyllum 33% Pulver 50919-A1 (interne Bezeichnung: CH/3 BD) Bryophyllum Tabletten 50% 60412 Art Nr. 101109 (interne Bezeichnung: B/2 BP) Presssaft Folium rec. Herstellung 26.3.07 (interne Bezeichnung: B/3 BP) Bryophyllum Fol. Rec. Presssaft Herstellung 18.9.07 (interne Bezeichnung: D/5 BP) Bryophyllum 1:1, 1 Folium Aqua ad injectabilia 07-F00160 Herstellung 21.9.07 Art. Nr. 19500900 (interne Bezeichnung: D/6 BP) Bryophyllum daigremontana Herstellung 22.10.07 (interne Bezeichnung: CH/4 BD) DMSO (D8418, Dimethyl sulfoxide, for molecular biology, >99.9%, Sigma, USA) NaCl, Art. Nr. A2942, AppliChem, Darmstadt, Deutschland NaHCO3, Art. Nr. 1.06329, Merck, Darmstadt, Deutschland KCl, Art. Nr. 4936, Merck, Darmstadt, Deutschland KH2PO4, Art. Nr. 4873, Merck, Darmstadt, Deutschland CaCl2, Art. Nr. 21079, Fluka Chemie, Buchs, Schweiz

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MgSO4, Art. Nr. 5886, Merck, Darmstadt, Deutschland D(+)-Glucose wasserfrei, Art. Nr. 49138, Fluka Chemie, Buchs Schweiz EDTA (Ethylendiamintetraacetat), Art. Nr. E-5134, Sigma-Aldrich, Steinheim Deutschland Ringerfundin, B.Braun, Sempach, Schweiz Oxycarbon med., O2/CO2 95/5, PanGas, Dagmarsellen, Schweiz Dichlormethan, Sigma-Aldrich, Buchs, Schweiz MeOH, Chromasolv, Sigma-Aldrich, Buchs, Schweiz EtOAc, Sigma-Aldrich, Buchs, Schweiz

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E. Zusammensetzung der verwendeten Lösungen

Zusammensetzung der Krebslösung:

NaCl 118 mmol/l Mw: 58.44 g/mol

NaHCO3 24.9 mmol/l Mw: 84.01 g/mol

KCl 4.7 mmol/l Mw: 74.56 g/mol

KH2PO4 1.24 mmol/l Mw: 136.09 g/mol

CaCl2 2.48 mmol/l Mw: 110.99 g/mol

MgSO4 1.21 mmol/l Mw: 246.48 g/mol

Glucose 10.0 mmol/l Mw: 180.16 g/mol

EDTA 0.034 mmol/l Mw: 372.2 g/mol

pH-Wert 7.4 (wenn nötig eingestellt mit 1 N HCl- oder 10 M NaOH-Lösungen)

Lagerung im Kühlschrank.

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Zusammensetzung Ringerfundin B. Braun (B. Braun Medical SA, Sempach,

Schweiz):

Na+ 140 mmol/l

K+ 4.0 mmol/l

Ca2+ 2.5 mmol/l

Mg2+ 1.0 mmol/l

Malat- 5.0 mmol/l

Acetat 24.0 mmol/l

Cl- 127.0 mmol/l

Steril, pyrogenfrei

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F. Einstellungen des Massenspektrometers (HPLC-MS) BPJISMS1 Segment: 1 Capillary Temp (°C) 250.00 APCI Vaporizer Temp (°C) 0.00 AGC On AGC Off Ion time (ms) 5.00 Sheath Gas Flow 70.00 Aux Gas Flow 0.00 Source Type ESI Injection Waveforms Type 2 Positive Polarity Source Voltage (kV) 3.00 Source Current (uA) 80.00 Capillary Voltage (V) 33.00 Tube Lens Offset (V) 20.00 Multipole RF Amplifier (Vp-p) 400.00 Multipole 1 Offset (V) -3.00 Multipole 2 Offset (V) -7.00 InterMultipole Lens Voltage (V) -16.00 Trap DC Offset Voltage (V) -10.00 Zoom Micro Scans 5 Zoom AGC Target 10000000.00 Zoom Max Ion Time (ms) 50.00 Full Micro Scans 3 Full AGC Target 50000000.00 Full Max Ion Time (ms) 200.00 SIM Micro Scans 5 SIM AGC Target 20000000.00 SIM Max Ion Time (ms) 200.00 MSn Micro Scans 3 MSn AGC Target 20000000.00 BPJ_neg1 Segment: 1 Capillary Temp (°C) 200.00 APCI Vaporizer Temp (°C) 0.00 AGC On AGC Off Ion time (ms) 5.00 Sheath Gas Flow 70.00 Aux Gas Flow 0.00 Source Type ESI Injection Waveforms Type 2 Positive Polarity Source Voltage (kV) 0.00 Source Current (uA) 5.00 Capillary Voltage (V) 33.00 Tube Lens Offset (V) 20.00 Multipole RF Amplifier (Vp-p) 850.00 Multipole 1 Offset (V) -2.00 Multipole 2 Offset (V) -12.50 InterMultipole Lens Voltage (V) -16.00 Trap DC Offset Voltage (V) -10.00 Zoom Micro Scans 5 Zoom AGC Target 10000000.00 Zoom Max Ion Time (ms) 50.00 Full Micro Scans 3 Full AGC Target 50000000.00 Full Max Ion Time (ms) 200.00 SIM Micro Scans 5 SIM AGC Target 20000000.00 SIM Max Ion Time (ms) 200.00 MSn Micro Scans 3 MSn AGC Target 20000000.00

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G. Tabellen zur Deskriptiven Statistik der Klinischen Studie

Tabelle E. Resultate der deskriptiven Statistik der erhobenen Parameter der klinischen Studie „Bryophyllum pinnatum versus Nifedipin zur Behandlung vorzeitiger Wehentätigkeit“. Aufgeführt sind jeweils die Mittelwerte mit ihren Standardabweichungen und Anzahlen mit den entsprechenden Prozentzahlen. Für alle hier aufgeführten Parameter wurde die Bonforoni-Korrektur berücksichtigt und es gelten daher p-Werte <0.005 als signifikant.

Klinische Studie Charakteristik des Patientinnenkollektivs

Nifedipin Bryophyllum pinnatum

Baseline/Eintritt Alter der Mutter bei Einschluss (J) 30.85 ± 5.4 32.86 ± 5.4Grösse der Mutter (cm) 164 ± 7.7 166 ± 7.1Gewicht der Mutter bei Einschluss (kg) 71.4 ± 10.9 68.3 ± 9.1Gewicht der Mutter vor der Schwangerschaft (kg) 62.2 ± 10.0 57.7± 8.0Gewichtszunahme bis zum Einschluss (kg) 9.2 ± 4.7 10.6 ±3.9BMI vor der Schwangerschaft (kg/m2) 23.3 ± 5.2 21.0 ± 3.2Herkunft der Patientinnen Schweiz 2 (15.4%) 3 (21.4%)Türkei 2 (15.4%) 0Asien 1 (7.7%) 2 (14.3%)Sonstiges Europa 2 (15.4%) 1 (7.1%)Länder des ehemaligen Jugoslawien 4 (30.8%) 3 (21.4%)Süd-/Mittelamerika 1 (7.7%) 2 (14.3%)Afrika 1 (7.7%) 0Naher Osten 0 1 (7.1%)weiss (neuer CRF) 0 2 (14.3%)Anzahl Mutterschaften keine 8 (61.5%) 8 (57.1%)1 4 (30.8%) 4 (28.6%)2 1 (7.7%) 1 (7.1%)3 0 1 (7.1%)Anzahl Lebendgeburten keine 8 (61.5%) 8 (57.1%)1 4 (30.8%) 4 (28.6%)2 1 (7.7%) 1 (7.1%)3 0 1 (7.1%)Anzahl Interruptiones keine 13 (100%) 12 (85.7%)1 0 1 (7.1%)

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2 0 1 (7.1%)Frühaborte 0 12 (92.3%) 9 (64.3%)1 0 5 (35.7%)2 1 (7.7%) 0Spätaborte 0 13 (100%) 14 (100%)Frühgeburtsanamnese ja 1 (7.7%) 1 (7.1%)nein 12 (92.3%) 13 (92.9%)IUGR-Anamnese ja 0 0nein 13 (100%) 14 (100%)Blutungen ja 2 (15.4%) 1 (7.1%)nein 11(84.6%) 13 (92.9%)Vorzeitiger Blasensprung ja 0 0nein 13 (100%) 14 (100%)Amnioninfektsyndrom ja 0 0nein 13 (100%) 14 (100%)Plazenta prävia ja 0 0nein 13 (100%) 14 (100%)Behandlungsbedürftige Anämie ja 1 (7.7%) 3 (21.4%)nein 12 (92.3%) 11 (78.6%)Gestationsalter bei Einschluss (Wochen) 27.8 ± 3.8 29.4 ± 3.2CTG bei Einschluss (Kontraktionen/h) 7.7 ± 5.9 9.6 ± 5.6Bishop Score bei Einschluss 1.4 ± 1.3 2.1 ± 1.2Fibronektin negativ 13 (100%) 14 (100%)Fibronektin positiv 0 0Fibronektintest nicht durchgeführt 0 0Bakteriologischer Vaginalabstrich ja 12 (100%) 14 (100%)Bakteriologischer Vaginalabstrich nein 0 0Ergebnisse des bakteriologischen Vaginalabstrichs Epithelzellen gram direkt keine 0 0Epithelzellen gram direkt vereinzelt 6 (46.2%) 5 (35.7%)Epithelzellen gram direkt mässig 2 (15.4%) 3 (21.4%)Epithelzellen gram direkt reichlich 5 (38.5%) 6 (42.9%)Leukozyten gram direkt keine 1 (7.7%) 2 (14.3%)Leukozyten gram direkt vereinzelt 8 (61.5%) 7 (50%)Leukozyten gram direkt mässig 1 (7.7%) 2 (14.3%)Leukozyten gram direkt reichlich 3 (23.1%) 3 (21.4%)Lactobacillus sp gram direkt keine 0 2 (14.3%)Lactobacillus sp gram direkt vereinzelt 0 0Lactobacillus sp gram direkt mässig 6 (46.2%) 6 (42.9%)Lactobacillus sp gram direkt reichlich 7 (53.8%) 6 (42.9%)

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Gramlabile Stäbchen direkt keine 12 (92.3%) 13 (92.9%)Gramlabile Stäbchen direkt vereinzelt 0 0Gramlabile Stäbchen direkt mässig 1 (7.7%) 0Gramlabile Stäbchen direkt reichlich 0 1 (7.1%)Grampositive Kokken keine 0 0Grampositive Kokken vereinzelt 0 0Grampositive Kokken mässig 0 0Grampositive Kokken reichlich 0 0Grampositive Kokken in Ketten direkt keine 13 (100%) 13 (92.9%)Grampositive Kokken in Ketten direkt vereinzelt 0 1 (7.1%)Grampositive Kokken in Ketten direkt mässig 0 0Grampositive Kokken in Ketten direkt reichlich 0 0Grampositive Kokken in Haufen keine 0 0Grampositive Kokken in Haufen vereinzelt 0 0Grampositive Kokken in Haufen mässig 0 0Grampositive Kokken in Haufen reichlich 0 0Grampositive Stäbchen direkt keine 13 (100%) 13 (92.9%)Grampositive Stäbchen direkt vereinzelt 0 0Grampositive Stäbchen direkt mässig 0 1 (7.1%)Grampositive Stäbchen direkt reichlich 0 0Normale Vaginalflora Kultur keine 6 (46.2%) 9 (64.3%)Normale Vaginalflora Kultur vereinzelt 1 (7.7%) 0Normale Vaginalflora Kultur mässig 3 (23.1%) 3 (21.4%)Normale Vaginalflora Kultur reichlich 3 (23.1%) 2 (14.3%)Hefezellen direkt keine 0 0Hefezellen direkt vereinzelt 0 0Hefezellen direkt mässig 0 0Hefezellen direkt reichlich 0 0Gramnegative Stäbchen keine 0 0Gramnegative Stäbchen vereinzelt 0 0Gramnegative Stäbchen mässig 0 0Gramnegative Stäbchen reichlich 0 0Pseudohyphen keine 0 0Pseudohyphen vereinzelt 0 0Pseudohyphen mässig 0 0Pseudohyphen reichlich 0 0Lactobacillus sp Kultur keine 12 (92.3%) 13 (92.9%)Lactobacillus sp Kultur vereinzelt 0 0Lactobacillus sp Kultur mässig 1 (7.7%) 0Lactobacillus sp Kultur reichlich 0 1 (7.1%)Enterobacter aerogenes Kultur keine 0 0Enterobacter aerogenes Kultur vereinzelt 0 0Enterobacter aerogenes Kultur mässig 0 0Enterobacter aerogenes Kultur reichlich 0 0Enterococcus sp Kultur keine 0 0Enterococcus sp Kultur vereinzelt 0 0Enterococcus sp Kultur mässig 0 0Enterococcus sp Kultur reichlich 0 0E. coli Kultur keine 13 (100%) 13 (92.9%)

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E. coli Kultur vereinzelt 0 0E. coli Kultur mässig 0 1 (7.1%)E. coli Kultur reichlich 0 0Aerobe Mischflora keine 13 (100%) 13 (92.9%)Aerobe Mischflora vereinzelt 0 0Aerobe Mischflora mässig 0 1 (7.1%)Aerobe Mischflora reichlich 0 0Staphylococcus Koagulase neg. Kultur keine 12 (92.3%) 14 (100%)Staphylococcus Koagulase neg. Kultur vereinzelt 1 (7.7%) 0Staphylococcus Koagulase neg. Kultur mässig 0 0Staphylococcus Koagulase neg. Kultur reichlich 0 0Coryneforme Bakterien Kultur keine 12 (92.3%) 14 (100%)Coryneforme Bakterien Kultur vereinzelt 1 (7.7%) 0Coryneforme Bakterien Kultur mässig 0 0Coryneforme Bakterien Kultur reichlich 0 0Candida albicans keine 0 0Candida albicans vereinzelt 0 0Candida albicans mässig 0 0Candida albicans reichlich 0 0β-hämolysierende Streptokokken Gruppe B keine 12 (92.3%) 11 (78.6%)β-hämolysierende Streptokokken Gruppe B nach Anreicherung vorhanden 0 0β-hämolysierende Streptokokken Gruppe B vereinzelt 0 2 (14.3%)β-hämolysierende Streptokokken Gruppe B mässig 1 (7.7%) 0β-hämolysierende Streptokokken Gruppe B reichlich 0 1 (7.1%)Hefen Kultur keine 12 (92.3%) 13 (92.9%)Hefen Kultur vereinzelt 1 (7.7%) 1 (7.1%)Hefen Kultur mässig 0 0Hefen Kultur reichlich 0 0Klebsiella pneumoniae keine 0 0Klebsiella pneumoniae vereinzelt 0 0Klebsiella pneumoniae mässig 0 0Klebsiella pneumoniae reichlich 0 0Blutdruck systolisch 111 ± 13.6 110 ± 10.3Blutdruck diastolisch 63 ± 11.1 59 ± 10.6Puls 81 ± 14.4 79 ± 7.8Hämoglobin (g/dl) 11.9 ± 0.9 11.9 ±1.1Hämatokrit (%) 33.9 ± 2.6 33.9 ± 3.1Erythrocyten (1E6/µl) 3.8 ± 0.2 3.9 ± 0.3MCV (fl) 88.3 ± 3.6 88.0 ± 6.3MCH (pg) 31.1 ± 1.4 30.9 ± 2.5MCHC (g/dl) 35.2 ± 0.8 35.1 ± 0.8Leukozyten (1E3/µl) 10.8 ± 2.6 11.7 ± 2.5Thrombozyten (1E3/µl) 251 ± 35.4 278 ± 59.3AST (U/l) 23.9 ± 4.3 19.7 ± 4.9

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ALT (U/l) 16.7 ± 6.5 18.9 ± 12.9CRP (mg/l) 10.1 ± 11.8 5.3 ± 4.8Untersuchung 2 (0-1.0 Stunde) Blutdruck systolisch 104 ± 7.5 108 ± 10.6Blutdruck diastolisch 58 ± 11.6 66 ± 11.7Puls 89 ± 13.3 80 ± 10.6CTG (Kontraktionen/h) 3.8 ± 3.2 4.5 ± 4.2Bishop Score 1.3 ± 0.8 2.1 ± 1.3Untersuchung 3 (4.0 Stunden) Blutdruck systolisch 111 ± 15.7 111 ± 9.3Blutdruck diastolisch 66 ± 16.5 66 ± 7.6Puls 87 ± 8.4 78 ± 13.8Verträglichkeit der Therapie mässig 3 (25%) 0Verträglichkeit der Therapie gut 8 (66.7%) 5 (35.7%)Verträglichkeit der Therapie sehr gut 1 (8.3%) 9 (64.3%)Weiterbehandlung nach 4 h ja 12 (92.3%) 12 (85.7%)Weiterbehandlung nach 4 h nein 1 (7.7%) 0Therapiewechsel auf Nifedipin nach 4 h 0 2 (14.3%)Untersuchung 4 (49 Stunden) Fibronektin negativ 11 (91.7%) 13 (92.9%)Fibronektin positiv 0 1 (7.1%)Fibronektintest nicht durchgeführt 1 (8.3%) 0Bakteriologischer Vaginalabstrich ja 12 (100%) 13 (92.9%)Bakteriologischer Vaginalabstrich nein 0 1 (7.1%)Ergebnisse des bakteriologischen Vaginalabstrichs Epithelzellen gram direkt keine 0 0Epithelzellen gram direkt vereinzelt 2 (16.7%) 2 (14.3%)Epithelzellen gram direkt mässig 3 (25%) 2 (14.3%)Epithelzellen gram direkt reichlich 7 (58.3%) 9 (64.3%)Leukozyten gram direkt keine 3 (25%) 4 (28.6%)Leukozyten gram direkt vereinzelt 3 (25%) 8 (57.1%)Leukozyten gram direkt mässig 5 (41.7%) 2 (14.3%)Leukozyten gram direkt reichlich 1 (8.3%) 0Lactobacillus sp gram direkt keine 1 (8.3%) 2 (14.3%)Lactobacillus sp gram direkt vereinzelt 0 0Lactobacillus sp gram direkt mässig 2 (16.7%) 5 (35.7%)Lactobacillus sp gram direkt reichlich 9 (75%) 7 (50%)Gramlabile Stäbchen direkt keine 11 (91.7%) 14 (100%)Gramlabile Stäbchen direkt vereinzelt 0 0Gramlabile Stäbchen direkt mässig 0 0Gramlabile Stäbchen direkt reichlich 1 (8.3%) 0Grampositive Kokken keine 11 (91.7%) 14 (100%)Grampositive Kokken vereinzelt 1 (8.3%) 0Grampositive Kokken mässig 0 0Grampositive Kokken reichlich 0 0Grampositive Kokken in Ketten direkt keine 10 (83.3%) 13 (92.9%)Grampositive Kokken in Ketten direkt vereinzelt 1 (8.3%) 1 (7.1%)Grampositive Kokken in Ketten direkt mässig 0 0Grampositive Kokken in Ketten direkt reichlich 1 (8.3%) 0

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Grampositive Kokken in Haufen keine 12 (100%) 13 (92.9%)Grampositive Kokken in Haufen vereinzelt 0 1 (7.1%)Grampositive Kokken in Haufen mässig 0 0Grampositive Kokken in Haufen reichlich 0 0Grampositive Stäbchen direkt keine 0 0Grampositive Stäbchen direkt vereinzelt 0 0Grampositive Stäbchen direkt mässig 0 0Grampositive Stäbchen direkt reichlich 0 0Hefezellen direkt keine 12 (100%) 13 (92.9%)Hefezellen direkt vereinzelt 0 0Hefezellen direkt mässig 0 0Hefezellen direkt reichlich 0 1 (7.1%)Gramnegative Stäbchen keine 11 (91.7%) 13 (92.9%)Gramnegative Stäbchen vereinzelt 1 (8.3%) 0Gramnegative Stäbchen mässig 0 0Gramnegative Stäbchen reichlich 0 1 (7.1%)Pseudohyphen keine 12 (100%) 13 (92.9%)Pseudohyphen vereinzelt 0 1 (7.1%)Pseudohyphen mässig 0 0Pseudohyphen reichlich 0 0Aerobe Mischflora keine 0 0Aerobe Mischflora vereinzelt 0 0Aerobe Mischflora mässig 0 0Aerobe Mischflora reichlich 0 0Lactobacillus sp Kultur keine 9 (75%) 13 (92.9%)Lactobacillus sp Kultur vereinzelt 1 (8.3%) 1 (7.1%)Lactobacillus sp Kultur mässig 0 0Lactobacillus sp Kultur reichlich 2 (16.7%) 0Enterobacter aerogenes Kultur keine 12 (100%) 13 (92.9%)Enterobacter aerogenes Kultur vereinzelt 0 0Enterobacter aerogenes Kultur mässig 0 0Enterobacter aerogenes Kultur reichlich 0 1 (7.1%)Staphylococcus Koagulase neg. Kultur keine 10 (83.3%) 13 (92.9%)Staphylococcus Koagulase neg. Kultur vereinzelt 2 (16.7%) 1 (7.1%)Staphylococcus Koagulase neg. Kultur mässig 0 0Staphylococcus Koagulase neg. Kultur reichlich 0 0Coryneforme Bakterien Kultur keine 12 (100%) 14 (100%)Coryneforme Bakterien Kultur vereinzelt 0 0Coryneforme Bakterien Kultur mässig 0 0Coryneforme Bakterien Kultur reichlich 0 0β-hämolysierende Streptokokken Gruppe B keine 11 (91.7%) 11 (78.6%)β-hämolysierende Streptokokken Gruppe B nach Anreicherung vorhanden 0 1 (7.1%)β-hämolysierende Streptokokken Gruppe B vereinzelt 0 0β-hämolysierende Streptokokken Gruppe B mässig 0 2 (14.3%)β-hämolysierende Streptokokken Gruppe B 1 (8.3%) 0

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reichlich E. coli Kultur keine 10 (83.3%) 13 (92.9%)E. coli Kultur vereinzelt 0 0E. coli Kultur mässig 1 (8.3%) 0E. coli Kultur reichlich 1 (8.3%) 1 (7.1%)Hefen Kultur keine 0 0Hefen Kultur vereinzelt 0 0Hefen Kultur mässig 0 0Hefen Kultur reichlich 0 0Enterococcus sp Kultur keine 12 (100%) 14 (100%)Enterococcus sp Kultur vereinzelt 0 0Enterococcus sp Kultur mässig 0 0Enterococcus sp Kultur reichlich 0 0Normale Vaginalflora Kultur keine 10 (83.3%) 5 (35.7%)Normale Vaginalflora Kultur vereinzelt 0 1 (7.1%)Normale Vaginalflora Kultur mässig 0 5 (35.7%)Normale Vaginalflora Kultur reichlich 2 (16.7%) 3 (21.4%)Candida albicans keine 11 (91.7%) 12 (85.7%)Candida albicans vereinzelt 1 (8.3%) 1 (7.1%)Candida albicans mässig 0 1 (7.1%)Candida albicans reichlich 0 0Klebsiella pneumoniae keine 11 (91.7%) 14 (100%)Klebsiella pneumoniae vereinzelt 0 0Klebsiella pneumoniae mässig 0 0Klebsiella pneumoniae reichlich 1 (8.3%) 0Blutdruck systolisch 107 ± 9.3 108 ± 11.6Blutdruck diastolisch 63 ± 3.5 62 ± 10.8Puls 82 ±7.6 85 ± 15.2Hämoglobin (g/dl) 11.6 ± 1.1 11.7 ± 1.4Hämatokrit (%) 32.7 ± 3.1 33.3 ± 3.7Erythrocyten (1E6/µl) 3.7 ± 0.3 3.8 ± 0.4MCV (fl) 88.4 ± 4.1 88.4 ± 5.6MCH (pg) 31.3 ± 1.7 31.0 ± 2.6MCHC (g/dl) 35.4 ± 1.2 35.1 ± 1.0Leukozyten (1E3/µl) 11.1 ± 3.8 12.2 ± 3.3Thrombozyten (1E3/µl) 253 ± 39 271 ± 54AST (U/l) 22.3 ± 4.9 20.9 ± 8.3ALT (U/l) 16.2 ± 5.6 19.1 ± 10.2CRP (mg/l) 8.4 ± 4.1 6.6 ± 5.2Verträglichkeit der Therapie gut 8 (66.7%) 5 (35.7%)Verträglichkeit der Therapie sehr gut 1 (8.3%) 9 (64.3%)Verträglichkeit der Therapie mässig 2 (16.7%) 0Verträglichkeit der Therapie schlecht 1 (8.3%) 0Untersuchung 5 (24Stunden nach Geburt/Austritt Wochenbett) Gestörte Wundheilung ja 0 0Gestörte Wundheilung nein 12 (100%) 12 (85.7%)Gestörte Wundheilung im neuen CRF nicht erhoben 0 2 (14.3%)Harnwegsinfekt ja 0 0

194

Harnwegsinfekt nein 12 (100%) 14 (100%)Subinvolutio uteri ja 0 0Subinvolutio uteri nein 12 (100%) 14 (100%)Putride Lochien ja 0 1 (7.1%)Putride Lochien nein 12 (100%) 13 (92.9%)Endometritis ja 0 0Endometritis nein 12 (100%) 14 (100%)Stillprobleme ja 1 (8.3%) 2 (14.3%)Stillprobleme nein 11 (91.7%) 12 (85.7%)Mastitis ja 0 0Mastitis nein 12 (100%) 14 (100%)Behandlungsbedürftige Anämie ja 6 (50%) 4 (28.6%)Behandlungsbedürftige Anämie nein 6 (50%) 10 (71.4%)Andere ja 0 0Andere nein 12 (100%) 14 (100%)Blutdruck systolisch 110 ± 11.0 115 ± 8.1Blutdruck diastolisch 64 ± 13.0 70 ± 7.9Puls 76 ± 10.9 73 ± 14.9Tokolysebehandlung nach 49 h durchgeführt 11 (91.7%) 12 (85.7%)Tokolysebehandlung nach 49 h keine durchgeführt 1 (8.3%) 1 (7.1%)Geburtsmodus Sectio 8 (66.7%) 5 (35.7%)spontan 3 (25%) 8 (57.1%)vaginal operativ 1 (8.3%) 1 (7.1%)Komplikationen bei Geburt ja 5 (41.7%) 3 (21.4%)Komplikationen bei Geburt nein 7 (58.3%) 11 (78.6%)Vorzeitiger Studienabbruch ja 1 (7.7%) 0Vorzeitiger Studienabbruch nein 12 (92.3%) 14 (100%)Gestationsalter bei Geburt (Wochen) 37.42 ± 1.7 38.71 ± 2.1Hospitalisation ante partum (d) 10.42 ± 20.5 9.36 ± 9.7Hospitalisation post partum (d) 5.58 ± 1.2 4.57 ± 1.3Kind Länge (cm) 47.96 ± 2.8 49.29 ± 2.6Gewicht (g) 2957 ± 478 3246 ± 580APGAR 1' 8.17 ± 0.94 8.00 ± 0.96APGAR 5' 9.08 ± 0.67 9.07 ± 0.73APGAR 10' 9.25 ± 0.45 9.29 ± 0.47Dauer Eintrittsuntersuchung bis Geburt (d) 66.25 ± 26.0 61.29 ± 29.7Dauer Eintrittsuntersuchung bis Geburt (h) 1590 ± 624 1471 ± 713

195

H. Begleitmedikation

Medikament

Bryophyllum pinnatum- Gruppe

Nifedipin-Gruppe

ATC Code

Alucol 0 2 A02 Mittel bei säurebedingten Erkrankungen Zantic 0 1 A02 Mittel bei säurebedingten Erkrankungen Antra Mups 0 1 A02 Mittel bei säurebedingten Erkrankungen Nexium 0 1 A02 Mittel bei säurebedingten Erkrankungen Cytotec 5 0 A02 Mittel bei säurebedingten Erkrankungen Flatulex 1 2 A03 Mittel bei funktionellen GI-Störungen Paspertin 4 4 A03 Mittel bei funktionellen GI-Störungen Primperan 0 1 A03 Mittel bei funktionellen GI-Störungen Buscopan 7 2 A03 Mittel bei funktionellen GI-Störungen Itinerol 2 2 A04 Antiemetika und Mittel gegen Übelkeit Bulboid 1 0 A06 Laxanzien Duphalac 0 1 A06 Laxanzien Paraffinemulsion 2 2 A06 Laxanzien Imodium 0 1 A07 Antidiarrhoika und intestinale Antiphlogistika/Antiinfektiva Perenterol 2 1 A07 Antidiarrhoika und intestinale Antiphlogistika/Antiinfektiva Kalium 0 1 A12 Mineralstoffe Magnesiocard 11 9 A12 Mineralstoffe Fragmin 10 11 B01 Antithrombotische Mittel Fraxiparine 1 1 B01 Antithrombotische Mittel Liquemin 4 6 B01 Antithrombotische Mittel Duofer fol 1 0 B03 Antianämika Ferinject 1 0 B03 Antianämika Gynotardyferon 5 8 B03 Antianämika Maltofer/Maltofer fol 2 2 B03 Antianämika Venofer 1 1 B03 Antianämika

196

Elevit 12 8 B03 Antianämika Venofundin 0 1 B05 Blutersatzmittel und Perfusionslösungen Voluven 0 2 B05 Blutersatzmittel und Perfusionslösungen Beloc Zok 1 0 C07 Beta-Adrenozeptoren-Antagonisten Clotrimazol 2 1 D01 Antimykotika zur dermatologischen Anwendung Daktarin 0 1 D01 Antimykotika zur dermatologischen Anwendung Fluomizin 2 1 G01 Gynäkologische Antiinfektiva und Antiseptika Vagihex 1 1 G01 Gynäkologische Antiinfektiva und Antiseptika Gyno Canesten 1 0 G01 Gynäkologische Antiinfektiva und Antiseptika Gynopevaryl 2 1 G01 Gynäkologische Antiinfektiva und Antiseptika Utrogestan 1 1 G03 Sexualhormone und andere Modulatoren des Genitalsystems Gynoflor 1 1 G03 Sexualhormone und andere Modulatoren des Genitalsystems Syntocinon 11 10 H01 Hypophysen- und Hypothalamushormone und Analoga Celestone 7 4 H02 Corticosteroide zur systemischen Anwendung Dexamethason 1 0 H02 Corticosteroide zur systemischen Anwendung Euthyrox 0 1 H03 Schilddrüsentherapie Augmentin 5 1 J01 Antibiotika zur systemischen Anwendung Bactrim forte 1 0 J01 Antibiotika zur systemischen Anwendung Co AmoxiMepha 1 0 J01 Antibiotika zur systemischen Anwendung Erysec 1 2 J01 Antibiotika zur systemischen Anwendung Monuril 0 1 J01 Antibiotika zur systemischen Anwendung Penicillin 1 0 J01 Antibiotika zur systemischen Anwendung Rocephin 3 4 J01 Antibiotika zur systemischen Anwendung Zinacef 0 2 J01 Antibiotika zur systemischen Anwendung Zithromax 1 0 J01 Antibiotika zur systemischen Anwendung Diflucan 1 0 J02 Antimykotika zur systemischen Anwendung Mefenacid/Ponstan 8 8 M01 Antiphlogistika und Antirheumatika Lysthenon 1 0 M03 Muskelrelaxanzien Tracrium 1 0 M03 Muskelrelaxanzien Sintenyl 2 3 N01 Anästhetika Sufenta 0 1 N01 Anästhetika

197

Bupivacain 3 4 N01 Anästhetika Carbostesin 6 8 N01 Anästhetika Disoprivan 1 0 N01 Anästhetika Etomidate 1 0 N01 Anästhetika Naropin 7 2 N01 Anästhetika Xylocain 1 0 N01 Anästhetika Dafalgan/Panadol 7 8 N02 Analgetika Fentanyl 2 4 N02 Analgetika Morphin 4 6 N02 Analgetika Perfalgan 6 7 N02 Analgetika Pethidin 1 0 N02 Analgetika Tramal/Tramadol 2 4 N02 Analgetika Tramundin 0 1 N02 Analgetika Aphenylbarbit 0 1 N03 Antiepileptika Temesta 1 2 N05 Psycholeptika Ephedrin 0 2 R03 Mittel bei obstruktiven Atemwegserkrankungen Resyl 0 1 R05 Husten- und Erkältungspräparate Resyl plus 1 1 R05 Husten- und Erkältungspräparate Fenistil 0 1 R06 Antihistaminika zur systemischen Anwendung Leucovorin 1 0 V03 Alle übrigen Therapeutischen Mittel

198

I. Tabellen zur Deskriptiven Statistik Myometriumstreifen

Tabelle A. Die deskriptive Statistik der in vitro-Tests (Myometriumstreifen-Untersuchungen) der gemessenen Amplituden. In der Spalte ganz links ist jeweils die Testlösung (Presssaft, Fraktion 2, 4, 12) bzw. Krebslösung als Kontrolle mit den jeweiligen Konzentrationen aufgeführt. Bei jeder Zugabe ist mit n=6, 5, 4 die Stichprobengrösse angegeben, die zu diesem Wert führt und deren Resultate im angegebenen Mittelwert einbezogen sind. Der Mittelwert vor der ersten Zugabe wurde als 100% definiert. Die Amplituden wurden in Gramm gemessen und in Prozent des Ausgangswerts umgerechnet. In Klammern stehen die 95%-VI. Alle Resultate, deren 95%-VI 100% nicht enthalten, unterscheiden sich signifikant von 100% und sind blau unterlegt.

Deskriptive Statistik in vitro Tests Myometriumstreifen Amplitude Zugabe 1 Zugabe 2 Zugabe 3 Zugabe 4 Zugabe 5 Zugabe 6 Zugabe 7 Zugabe 8 Zugabe 9 Zugabe 10 Zugabe 11 Zugabe 12 Zugabe 13 Presssaft n=6 n=6 n=6 n=5 n=4

unverdünnt 101 (85,117)

78 (77,89)

52 (34,70)

33 (10,56)

21 (3,38)

Presssaft n=6 n=6 n=6 n=6 n=6 n=5

10% 107 (93,122)

105 (80,131)

95 (57,134)

84 (42,127)

66 (15,117)

63 (8,118)

Presssaft n=6 n=6 n=6

5% 88 (69,108)

62 (45,79)

49 (8,91)

Presssaft n=6 n=6 n=6 n=6 n=6 n=6 n=6 n=5 n=4

2% 106 (85,127)

106 (80,132)

92 (55,129)

75 (40,110)

56 (16,95)

49 (12,86)

36 (0,72)

27 (0,70)

24 (0,79)

Presssaft n=6 n=6 n=6 n=6 n=6 n=6 n=6 n=5 n=5 n=5

1% 114 (91,137)

108 (89,127)

104 (72,137)

83 (58,109)

64 (32,97)

62 (32,92)

46 (26,67)

37 (16,58)

28 (16,40)

23 (6,40)

199

Fraktion 2 n=6 n=6 n=6 n=5 n=4 n=4 n=4 n=4 n=4 n=4 n=4 n=4

unverdünnt 111 (103,120)

110 (91,129)

97 (61,134)

90 (41,139)

71 (0,158)

55 (0,133)

43 (0,108)

28 (0,65)

19 (0,42)

16 (0,34)

11 (0,22)

10 (0,21)

Fraktion 2 n=6 n=6 n=6 n=5 n=4 n=4

10% 96 (73,119)

78 (42,114)

70 (33,107)

58 (25,92)

44 (0,103)

38 (0,99)

Fraktion 2 n=6 n=6 n=6 n=5 n=4 n=4

5% 100 (82,119)

86 (36,136)

77 (9,145)

68 (0,161)

64 (0,182)

46 (0,132)

Fraktion 2 n=6 n=6 n=6 n=6 n=6 n=6 n=5 n=4

2% 96 (78,114)

110 (86,133)

91 (61,120)

66 (26,107)

50 (21,80)

38 (8,68)

35 (5,64)

27 (8,47)

Fraktion 2 n=6 n=6 n=6 n=6 n=6 n=5

1% 108 (93,122)

89 (59,119)

62 (25,98)

53 (15,91)

41 (8,75)

33 (9,74)

Fraktion 4 n=6 n=5 n=5 n=4 n=4

unverdünnt 70 (50,90)

55 (44,67)

31 (23,38)

21 (13,29)

12 (7,17)

Fraktion 4 n=6 n=6 n=6 n=6 n=5 n=4

10% 118 (109,127)

99 (85,112)

79 (69,89)

53 (25,82)

73 (6,69)

22 (0,52)

Fraktion 4 n=6 n=6 n=6 n=6 n=6 n=6 n=5 n=4

5% 107 (95,119)

103 (84,122)

86 (55,118)

70 (29,111)

50 (12,88)

42 (3,82)

30 (3,56)

23 (0,15)

Fraktion 4 n=6 n=6 n=6 n=6 n=5 n=5 n=4

2% 97 (81,113)

84 (48,119)

67 (30,104)

59 (21,96)

48 (10,87)

33 (0,67)

37 (0,78)

Fraktion 4 n=6 n=6 n=6 n=4

1% 117 (88,146)

88 (65,110)

67 (32,101)

43 (0,92)

Fraktion 12 n=6 n=6 n=6 n=6 n=6 n=6 n=5 n=5 n=5

unverdünnt 119 (104,133)

110 (92,129)

97 (82,112)

75 (44,105)

64 (37,91)

54 (28,79)

50 (12,89)

40 (6,75)

34 (0,69)

Fraktion 12 n=6 n=6 n=6 n=6 n=6 n=5 n=5 n=5 n=5 n=5 n=4 n=4 n=4

10% 132 (91,173)

128 (69,186)

134 (59,210)

127 (52,203)

107 (26,187)

109 (25,194)

93 (8,178)

74 (1,147)

61 (1,121)

52 (0,111)

64 (0,163)

39 (0,86)

31 (0,72)

Fraktion 12 n=6 n=6 n=6 n=6 n=5 n=5 n=4 n=4 n=4

5% 119 (100,137)

115 (82,148)

106 (69,143)

91 (52,130)

82 (24,140)

65 (21,110)

47 (18,76)

36 (9,63)

28 (3,53)

200

Fraktion 12 n=6 n=6 n=6 n=6 n=5 n=4 n=4 n=4

2% 103 (93,113)

92 (68,117)

82 (56,108)

76 (53,100)

67 (43,92)

56 (31,81)

44 (26,61)

33 (20,45)

Fraktion 12 n=6 n=6 n=6 n=6 n=6 n=4 n=4

1% 126 (76,175)

146 (75,216)

124 (36,213)

127 (37,216)

101 (21,181)

133 (0,298)

80 (0,187)

Krebslösung n=5 n=4 n=4 n=4 n=4 unverdünnt (Kontrolle)

99 (90,108)

89 (70,108)

64 (52,75)

50 (33,67)

51 (0,124)

201

Tabelle B. Die deskriptive Statistik der in-vitro-Tests (Myometriumstreifen-Untersuchungen) der gemessenen AUCs. In der Spalte ganz links ist jeweils die Testlösung (Presssaft, Fraktion 2, 4, 12) bzw. Krebslösung als Kontrolle mit den jeweiligen Konzentrationen aufgeführt. Bei jeder Zugabe ist mit n=6, 5, 4 die Stichprobengrösse angegeben, die zu diesem Wert führt und deren Resultate im angegebenen Mittelwert einbezogen sind. Der Mittelwert vor der ersten Zugabe wurde als 100% definiert. Die AUCs wurden gemessen in Gramm x Sekunden und dann in Prozent des Ausgangswerts umgerechnet. In Klammern stehen die 95%-VI. Alle Resultate, deren 95%-VI 100% nicht enthalten, unterscheiden sich signifikant von 100% und sind blau unterlegt.

Deskriptive Statistik in vitro Tests Myometriumstreifen

Fläche

Zugabe 1

Zugabe 2

Zugabe 3

Zugabe 4

Zugabe 5

Zugabe 6

Zugabe 7

Zugabe 8

Zugabe 9

Zugabe 10

Zugabe 11

Zugabe 12

Zugabe 13

Presssaft n=6 n=6 n=6 n=5 n=4

unverdünnt 82 (69,95)

62 (47,77)

37 (20,54)

20 (2,38)

10 (0,22)

Presssaft n=6 n=6 n=6 n=6 n=6 n=5

10% 102 (73,130)

99 (65,133)

86 (38,133)

79 (30,128)

59 (3,115)

52 (0,114)

Presssaft n=6 n=6 n=6

5% 76 (50,102)

50 (32,68)

38 (3,73)

Presssaft n=6 n=6 n=6 n=6 n=6 n=6 n=6 n=5 n=4

2% 90 (27,112)

90 (60,119)

73 (30,116)

56 (15,97)

39 (1,76)

35 (0,72)

24 (0,55)

17 (0,50)

14 (0,54)

Presssaft n=6 n=6 n=6 n=6 n=6 n=6 n=6 n=5 n=5 n=5

1% 114 (81,148)

100 (67,132)

102 (45,159)

72 (39,105)

49 (12,87)

48 (11,86)

33 (9,56)

27 (0,56)

15 (6,24)

13 (0,30)

Fraktion 2 n=6 n=6 n=6 n=5 n=4 n=4 n=4 n=4 n=4 n=4 n=4 n=4

unverdünnt 98 (86,111)

92 (73,111)

80 (41,119)

79 (33,125)

60 (0,137)

44 (0,108)

34 (0,86)

20 (0,47)

12 (0,27)

10 (0,24)

6 (0,14)

6 (0,13)

202

Fraktion 2 n=6 n=6 n=6 n=5 n=4 n=4

10% 85 (61,108)

67 (30,103)

56 (27,85)

45 (16,73)

30 (0,80)

25 (0,73)

Fraktion 2 n=6 n=6 n=6 n=5 n=4 n=4

5% 100 (63,138)

70 (28,112)

66 (0,135)

52 (0,122)

48 (0,144)

33 (0,107)

Fraktion 2 n=6 n=6 n=6 n=6 n=6 n=6 n=5 n=4

2% 92 (77,106)

107 (82,131)

89 (51,126)

56 (18,93)

42 (9,75)

31 (2,60)

24 (0,53)

18 (0,39)

Fraktion 2 n=6 n=6 n=6 n=6 n=6 n=5

1% 127 (91,164)

96 (40,153)

66 (14,119)

46 (12,79)

33 (4,62)

19 (0,48)

Fraktion 4 n=6 n=5 n=5 n=4 n=4

unverdünnt 51 (27,74)

30 (16,44)

12 (6,18)

7 (0,14)

3 (0,7)

Fraktion 4 n=6 n=6 n=6 n=6 n=5 n=4

10% 123 (109,137)

87 (63,111)

63 (55,72)

39 (11,66)

31 (0,64)

16 (0,47)

Fraktion 4 n=6 n=6 n=6 n=6 n=6 n=6 n=5 n=4

5% 93 (72,115)

88 (59,116)

72 (33,112)

57 (11,102)

40 (0,81)

29 (0,60)

24 (0,54)

19 (0,52)

Fraktion 4 n=6 n=6 n=6 n=6 n=5 n=5 n=4

2% 86 (62,110)

74 (38,110)

58 (29,87)

44 (14,75)

34 (7,61)

20 (0,41)

23 (0,49)

Fraktion 4 n=6 n=6 n=6 n=4

1% 119 (65,173)

81 (53,110)

60 (21,99)

51 (0,152)

Fraktion 12 n=6 n=6 n=6 n=6 n=6 n=6 n=5 n=5 n=5

unverdünnt 130 (90,170)

106 (46,166)

83 (56,111)

51 (29,74)

43 (22,64)

38 (8,67)

38 (0,85)

24 (0,51)

22 (0,54)

Fraktion 12 n=6 n=6 n=6 n=6 n=6 n=5 n=5 n=5 n=5 n=5 n=4 n=4 n=4

10% 125 (75,176)

119 (53,185)

129 (32,226)

119 (39,198)

89 (3,174)

91 (3,186)

71 (0,157)

51 (0,115)

37 (0,79)

31 (0,72)

30 (0,72)

22 (0,53)

16 (0,42)

Fraktion 12 n=6 n=6 n=6 n=6 n=5 n=5 n=4 n=4 n=4

5% 122 (91,153)

121 (79,163)

115 (62,167)

81 (44,117)

74 (8,140)

40 (9,71)

28 (20,37)

20 (7,32)

14 (1,26)

Fraktion 12 n=6 n=6 n=6 n=6 n=5 n=4 n=4 n=4

2% 92 (81,102)

70 (44,96)

59 (32,85)

52 (27,77)

42 (14,70)

33 (9,57)

29 (3,55)

18 (1,34)

203

Fraktion 12 n=6 n=6 n=6 n=6 n=6 n=4 n=4

1% 121 (63,179)

145 (66,225)

120 (36,204)

122 (44,200)

121 (27,215)

154 (0,351)

71 (0,149)

Krebslösung n=5 n=4 n=4 n=4 n=4 unverdünnt (Kontrolle)

96 (81,112)

82 (52,111)

54 (45,64)

35 (11,59)

48 (0,144)

204

Tabelle C. Die deskriptive Statistik der in-vitro-Tests (Myometriumstreifen-Untersuchungen) der gemessenen Frequenzen. In der Spalte ganz links ist jeweils die Testlösung (Presssaft, Fraktion 2, 4, 12) bzw. Krebslösung als Kontrolle mit den jeweiligen Konzentrationen aufgeführt. Bei jeder Zugabe ist mit n=6, 5, 4 die Stichprobengrösse angegeben, die zu diesem Wert führt und deren Resultate im angegebenen Mittelwert einbezogen sind. Der Mittelwert vor der ersten Zugabe wurde als 100% definiert. Die Frequenz wurde als Kontraktionen pro Minute bestimmt und in Prozent des Ausgangswertes umgerechnet. In Klammern stehen die 95%-VI. Alle Resultate, deren 95%-VI 100% nicht enthalten, unterscheiden sich signifikant von 100% und sind blau unterlegt.

Deskriptive Statistik in vitro Tests Myometriumstreifen Frequenz

Zugabe 1

Zugabe 2

Zugabe 3

Zugabe 4

Zugabe 5

Zugabe 6

Zugabe 7

Zugabe 8

Zugabe 9

Zugabe 10

Zugabe 11

Zugabe 12

Zugabe 13

Presssaft n=6 n=6 n=6 n=5 n=4

unverdünnt 105 (68,124)

128 (108,148)

148 (124,172)

217 (166,269)

294 (210,378)

Presssaft n=6 n=6 n=6 n=6 n=6 n=5

10% 98 (80,116)

92 (64,121)

91 (68,114)

99 (71,126)

116 (70,163)

151 (27,276)

Presssaft n=6 n=6 n=6

5% 113 (66,160)

102 (71,133)

109 (86,132)

Presssaft n=6 n=6 n=6 n=6 n=6 n=6 n=6 n=5 n=4

2% 97 (68,125)

126 (82,170)

140 (72,209)

158 (82,235)

197 (74,320)

206 (69,342)

272 (47,496)

293 (50,536)

320 (0,651)

Presssaft n=6 n=6 n=6 n=6 n=6 n=6 n=6 n=5 n=5 n=5

1% 110 (87,133)

107 (91,124)

125 (82,169)

145 (98,192)

164 (130,198)

177 (120,235)

209 (125,293)

251 (101,400)

309 (136,482)

351 (180,522)

Fraktion 2 n=6 n=6 n=6 n=5 n=4 n=4 n=4 n=4 n=4 n=4 n=4 n=4

unverdünnt 110 (93,127)

113 (96,130)

107 (96,144)

84 (48,120)

65 (37,94)

187 (0,462)

297 (0,741)

324 (0,974)

402 (0,1010)

441 (0,1050)

531 (0,1120)

416 (127,706)

Fraktion 2 n=6 n=6 n=6 n=5 n=4 n=4

205

10% 82 (69,96)

125 (69,180)

171 (0,355)

115 (59,171)

169 (17,320)

198 (0,403)

Fraktion 2 n=6 n=6 n=6 n=5 n=4 n=4

5% 110 (62,159)

193 (44,343)

173 (47,299)

210 (0,440)

403 (0,945)

540 (0,1410)

Fraktion 2 n=6 n=6 n=6 n=6 n=6 n=6 n=5 n=4

2% 103 (77,130)

94 (70,117)

48 (65,104)

99 (64,135)

133 (33,234)

154 (0,317)

112 (75,148)

121 (81,160)

Fraktion 2 n=6 n=6 n=6 n=6 n=6 n=5

1% 94 (64,123)

90 (63,117)

162 (17,308)

154 (71,236)

145 (70,219)

284 (27,540)

Fraktion 4 n=6 n=5 n=5 n=4 n=4

unverdünnt 557 (316,797)

786 (488,1080)

1000 (611,1400)

1400 (583,2100)

1400 (848,2000)

Fraktion 4 n=6 n=6 n=6 n=6 n=5 n=4

10% 95 (74,116)

99 (80,118)

108 (78,138)

125 (98,153)

151 (90,212)

208 (65,351)

Fraktion 4 n=6 n=6 n=6 n=6 n=6 n=6 n=5 n=4

5% 128 (110,146)

129 (97,160)

137 (97,177)

152 (101,203)

182 (101,263)

222 (92,352)

194 (125,263)

220 (83,357)

Fraktion 4 n=6 n=6 n=6 n=6 n=5 n=5 n=4

2% 101 (63,139)

137 (48,226)

160 (66,253)

163 (71,256)

193 (47,339)

222 (65,378)

146 (95,196)

Fraktion 4 n=6 n=6 n=6 n=4

1% 120 (99,142)

89 (58,119)

123 (77,169)

129 (66,192)

Fraktion 12 n=6 n=6 n=6 n=6 n=6 n=6 n=5 n=5 n=5

unverdünnt 99 (68,129)

100 (65,135)

116 (69,162)

132 (64,200)

148 (82,213)

163 (72,253)

197 (87,306)

255 (75,435)

268 (42,493)

Fraktion 12 n=6 n=6 n=6 n=6 n=6 n=5 n=5 n=5 n=5 n=5 n=4 n=4 n=4

10% 118 (72,164)

129 (76,181)

135 (87,183)

129 (88,169)

175 (82,268)

198 (0,405)

247 (0,520)

283 (0,623)

228 (50,405)

255 (54,456)

384 (0,1030)

553 (0,1700)

703 (0,2300)

Fraktion 12 n=6 n=6 n=6 n=6 n=5 n=5 n=4 n=4 n=4

5% 89 (76,102)

100 (76,123)

115 (78,153)

129 (70,188)

162 (62,262)

227 (59,396)

270 (52,488)

323 (45,601)

361 (29,693)

Fraktion 12 n=6 n=6 n=6 n=6 n=5 n=4 n=4 n=4

2% 111 (92,131)

141 (95,188)

140 (90,191)

139 (114,163)

159 (99,202)

190 (80,300)

178 (111.244)

222 (104,336)

Fraktion 12 n=6 n=6 n=6 n=6 n=6 n=4 n=4

206

1% 112 (78,177)

102 (77,128)

110 (77,144)

108 (65,152)

98 (46,150)

99 (22,176)

102 (66,139)

Krebslösung n=5 n=4 n=4 n=4 n=4 unverdünnt (Kontrolle)

88 (68,109)

103 (98,107)

106 (103,109)

123 (8,238)

83 (39,126)

207

J. Tabellen zu den Mixed Model-Analysen der Kontraktilitätsversuche am Myometriumstreifen in-vitro

Tabelle D. Zeigt die Mittelwerte von Amplituden (Ampl.Proz.), AUC (FlächeProz) und Frequenz (Freq.Proz.), Standardabweichungen und p-Werte des Vergleichs der Kontrollexperimente (Krebslösung) mit Presssaft, F2, F4 und F12 jeweils alle unverdünnt. Die signifikanten Werte sind blau unterlegt. Presssaft und Fraktionen 2 (F2), 4 (F4) und 12 (F12) verglichen mit den Kontrollen

Parameter Ampl.Proz. Fläche Proz

Freq. Proz.

Presssaft unverdünnt beta

std error p-Wert beta

std error p-Wert beta std error p-Wert

Achsenabschnitt 96.5 9.48 <0.001 86.1 12.36 <0.001 83.0 15.41 <0.001Zugabe -7.0 1.68 <0.001 -5.0 2.11 0.02 5.88 3.33 0.082Kontrolle (baseline) 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 Presssaft -1.0 12.36 0.93 -9.9 16.18 0.55 -65.12 19.68 0.002Einfluss des zeitlichen Verlaufs (Kontrolle*Presssaft) -4.9 2.09 0.02 -5.5 2.62 0.042 47.96 4.07 <0.001Fraktion 2 unverdünnt Achsenabschnitt 96.7 11.84 <0.001 86.3 13.51 <0.001 85.9 70.37 0.233Zugabe -6.9 1.75 <0.001 -4.9 2.10 0.022 3.9 11.30 0.729Kontrolle (baseline) 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 Fraktion 2 unv. 25.2 15.16 0.115 17.6 17.20 0.320 -91.2 89.23 0.318Einfluss des zeitlichen Verlaufs (Kontrolle*F2) -3.6 1.88 0.056 -4.4 2.25 0.056 38.1 12.08 0.002Fraktion 4 unverdünnt Achsenabschnitt 96.5 8.86 <0.001 86.1 12.60 <0.001 85.9 109.81 0.446

208

Zugabe -7.05 1.61 <0.001 -5.1 2.21 0.026 3.7 14.97 0.808Kontrolle (baseline) 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 Fraktion 4 unv. -25.6 12.10 0.044 -39.8 17.19 0.029 354.9 149.42 0.030Einfluss des zeitlichen Verlaufs (Kontrolle*F4) -3.4 2.33 0.155 -3.1 3.21 0.345 181.5 21.85 <0.001Fraktion 12 unverdünnt Achsenabschnitt 96.7 10.52 <0.001 86.2 15.05 <0.001 85.9 44.65 0.067Zugabe -6.9 1.54 <0.001 -5.0 2.49 0.049 3.8 6.68 0.571Kontrolle (baseline) 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 Fraktion 12 unv. 24.7 13.59 0.087 28.6 19.16 0.150 -33.1 57.54 0.572Einfluss des zeitlichen Verlaufs (Kontrolle*F12) -2.9 1.70 0.094 -5.4 2.74 0.053 18.7 7.34 0.013

209

Tabelle E. Zeigt die Mittelwerte von Amplituden (Ampl.Proz.), AUC (FlächeProz.) und Frequenz (Freq.Proz.), Standardabweichungen und p-Werte des Vergleichs von Presssaft mit Fraktion 4 unverdünnt und in den Konzentrationen 10%, 5%, 2% und 1%. Die signifikanten p-Werte sind blau unterlegt.

Presssaft verglichen mit Fraktion 4 für verschiedene Konzentrationen

Parameter Ampl.Proz. Fläche Proz

Freq. Proz.

unverdünnt beta std error p-Wert beta

std error p-Wert beta std error p-Wert

Achsenabschnitt 95.00 5.57 <0.001 76.00 5.62 <0.001 17.00 88.81 0.850F4 -24.10 8.42 0.007 -30.00 8.42 0.001 423.70 129.50 0.005Pressssaft (baseline) 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 Zugabe -11.70 0.96 <0.001 -10.40 0.89 <0.001 54.10 10.25 <0.001Einfluss des zeitlichen Verlaufs (F4*Z) 1.40 1.67 0.389 2.30 1.55 0.139 131.00 17.91 <0.001Psaft*Z (baseline) 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 10% Achsenabschnitt 121.30 10.51 <0.001 114.40 11.73 <0.001 86.20 22.27 0.001F4 -7.20 15.10 0.640 -7.30 16.88 0.671 -56.60 32.94 0.097Pressssaft (baseline) 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 Zugabe -10.50 0.72 <0.001 -10.60 0.86 <0.001 7.50 2.57 0.004Einfluss des zeitlichen Verlaufs (F4*Z) -1.50 1.24 0.238 -1.16 1.48 0.279 23.80 4.45 <0.001Psaft*Z (baseline) 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 5% Achsenabschnitt 103.40 11.15 <0.001 89.90 11.51 <0.001 76.00 31.89 0.020F4 15.50 14.62 0.302 16.30 15.35 0.304 -19.30 38.74 0.620

210

Pressssaft (baseline) 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 Zugabe -18.20 2.63 <0.001 -17.30 2.41 <0.001 17.00 10.10 0.096Einfluss des zeitlichen Verlaufs (F4*Z) 5.90 2.76 0.035 5.10 2.53 0.047 11.10 10.58 0.300Psaft*Z (baseline) 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 2% Achsenabschnitt 119.90 11.67 <0.001 101.10 10.68 <0.001 33.30 45.98 0.480F4 -25.10 16.52 0.154 -18.20 15.12 0.252 99.80 65.15 0.146Pressssaft (baseline) 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 Zugabe -11.40 0.67 <0.001 -10.60 0.65 <0.001 35.50 3.76 <0.001Einfluss des zeitlichen Verlaufs (F4*Z) 3.00 0.99 0.003 2.20 0.95 0.020 -28.70 5.50 <0.001Psaft*Z (baseline) 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 1% Achsenabschnitt 118.70 8.05 <0.001 111.20 11.12 <0.001 18.20 38.29 0.640F4 -1.30 12.33 0.920 7.00 17.25 0.690 -82.40 60.28 0.183Pressssaft (baseline) 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 Zugabe -9.10 0.62 <0.001 -9.50 0.94 <0.001 32.40 3.50 <0.001Einfluss des zeitlichen Verlaufs (F4*Z) -5.40 1.83 0.004 -6.10 2.74 0.029 41.70 10.16 <0.001Psaft*Z (baseline) 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00

211

K. DAD-UV-Spektren aus Rotationsverdampfermethode

nm200 250 300 350

mAU

-80

-60

-40

-20

0

20

40

DAD1, 9.352 (131 mAU,Apx) of B

nm200 250 300 350

mAU

-40

-20

0

20

40

DAD1, 9.679 (94.9 mAU,Apx) of B

nm200 250 300 350

mAU

-30

-20

-10

0

10

DAD1, 7.419 (52.4 mAU, - ) of B3

nm200 250 300 350

mAU

-30

-20

-10

0

10

20

30

40

DAD1, 7.592 (75.5 mAU,Apx) of B

nm200 250 300 350

mAU

0

10

20

30

40

50

DAD1, 8.586 (53.1 mAU,Apx) of B

21

23

27

2930

Abb. 50. DAD-UV-Spektren der erwähnten auffälligen Peaks, die auf Flavonoide hinweisen.

212

L. HPLC-Chromatogramm des ethanolischen Bryophyllum pinnatum-Extraktes

min0 2 4 6 8 10 12 14 16

mAU

0

50

100

150

200

250

300

DAD1 A, Sig=298,8 Ref=550,100 (310709\D1BPROT.D)

1.4

30 1

.602

1.7

53 1

.974

2.2

49 2

.410

2.7

79

3.0

61 3.5

58

4.4

68

5.2

42 5

.451

5.9

93 6.4

67

6.8

12 6

.966

7.3

69 7

.553

7.6

93

7.9

82

8.5

73 8

.699

8.8

65 9

.014

9.1

63 9

.253 9.3

64

9.8

25 9

.973

10.

159

10.

288

10.

413

10.

517

10.

606

10.

812

11.

038

11.

157 1

1.25

7 1

1.43

5 1

1.58

4 1

1.75

8 1

1.85

1 1

2.01

7

12.

315

12.

440

12.

744

12.

885

13.

085

13.

307 13.

478

13.

757

13.

946

14.

111

14.

315

14.

555 1

4.82

3

15.3

14

15.

653

15.

941

16.

265

16.

536

16.

977

17.

566

17.

803

Bryophyllum pinnatumEtOH extract „D/1 BP“Rotavap

Analyzed 310709/SG

1

512

923

27

2829

30

3738

40

4143

45

46

47

53

58

min14 16 18 20 22 24 26 28

mAU

-10

0

10

20

30

40

50

DAD1 A, Sig=298,8 Ref=550,100 (310709\D1BPROT.D)

13.

946

14.

111

14.

315

14.

555

14.

823

15.

314

15.

653

15.

941

16.

265

16.

536

16.

977

17.

566

17.

803

18.

112

18.

629

20.

222

23.

831

24.

256

26.

054

26.

202

26.

775

Bryophyllum pinnatumEtOH extract „D/1 BP“Rotavap

Analyzed 310709/SG

53

58

Abb. 51. HPLC-Chromatogramm des ethanolischen Bryophyllum pinnatum-Extraktes mit den auffälligsten Peaks, die im Chromatogramm des Presssaftes auch vorhanden und hier entsprechend nummeriert sind.

213

nm200 250 300 350

mAU

0

50

100

150

200

250

*DAD1, 1.431 (269 mAU,Apx) Ref=1.264 & 2.

nm200 250 300 350

mAU

0

250

500

750

1000

1250

1500

1750

*DAD1, 1.751 (1957 mAU, - ) Ref=1.264 & 2.

nm200 250 300 350

mAU

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

*DAD1, 2.411 (1787 mAU,Apx) Ref=1.264 & 2

nm200 250 300 350

mAU

0

100

200

300

400

500

600

*DAD1, 3.557 (691 mAU,Apx) Ref=2.724 & 2

nm200 250 300 350

mAU

0

100

200

300

400

500

*DAD1, 4.471 (596 mAU,Apx) Ref=2.724 & 24

nm200 250 300 350

mAU

0

50

100

150

200

*DAD1, 5.244 (230 mAU,Apx) Ref=2.724 & 24

nm200 250 300 350

mAU

0

50

100

150

200

250

*DAD1, 6.464 (254 mAU, - ) Ref=2.724 & 24.

nm200 250 300 350

mAU

0

50

100

150

200

250

*DAD1, 6.811 (259 mAU, - ) Ref=2.724 & 24.

12

1

5 9

nm200 250 300 350

mAU

0

25

50

75

100

125

150

175

*DAD1, 7.371 (202 mAU,Apx) Ref=2.724 & 24.064 of

nm200 250 300 350

mAU

0

25

50

75

100

125

150

175

200

*DAD1, 7.551 (211 mAU, - ) Ref=2.72

nm200 250 300 350

mAU

0

50

100

150

200

250

*DAD1, 8.571 (294 mAU, - ) Ref=2.7

nm200 250 300 350

mAU

0

25

50

75

100

125

150

175

200

*DAD1, 9.011 (207 mAU, - ) Ref=2

nm200 250 300 350

mAU

0

50

100

150

200

*DAD1, 9.824 (235 mAU, - ) Ref=2.7

nm200 250 300 350

mAU

0

100

200

300

400

500

600

700

*DAD1, 10.811 (782 mAU, - ) Ref=2

nm200 250 300 350

mAU

0

100

200

300

400

500

600

700

*DAD1, 11.038 (777 mAU, - ) R

nm200 250 300 350

mAU

0

50

100

150

200

250

300

350

*DAD1, 11.258 (359 mAU,Apx)

2327 29

37 38 40

Abb.52. DAD-UV-Spektren der einzelnen Peaks im HPLC-Chromatogramm des ethanolischen Bryophyllum pinnatum-Auszuges.

214

nm200 250 300 350

mAU

0

50

100

150

200

250

300

*DAD1, 11.438 (301 mAU,Apx) Re

nm200 250 300 350

mAU

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

*DAD1, 11.584 (3760 mAU,Apx) R

nm200 250 300 350

mAU

0

100

200

300

400

500

600

700

800

*DAD1, 11.758 (801 mAU, - ) Ref=

nm200 250 300 350

mAU

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

*DAD1, 12.017 (1543 mAU,Apx) R

nm200 250 300 350

mAU

0

100

200

300

400

500

600

700

800

*DAD1, 12.318 (805 mAU,Apx) Re

nm200 250 300 350

mAU

0

50

100

150

200

250

300

*DAD1, 12.437 (324 mAU, - ) Ref=

nm200 250 300 350

mAU

0

50

100

150

200

250

*DAD1, 12.884 (255 mAU, - ) Ref=

nm200 250 300 350

mAU

0

25

50

75

100

125

150

175

*DAD1, 13.478 (199 mAU,Apx) Re

41

42 43

45 46 47

nm200 250 300 350

mAU

-25

0

25

50

75

100

125

150

*DAD1, 14.824 (199 mAU,Apx) Re

nm200 250 300 350

mAU

50

100

150

200

250

*DAD1, 16.537 (256 mAU,Apx) Re

nm200 250 300 350

mAU

-60

-40

-20

0

20

40

60

*DAD1, 17.804 (147 mAU,Apx) Re

58 Kämpferol

53 Quercetin

AbAbb. 53. DAD-UV-Spektren einzelner Peaks aus dem ethanolischen Auszug aus Bryophyllum pinnatum der Flavonoid-Referenzsubstanzen Quercetin und Kämpferol.

215

M. HPLC-Chromatogramm der Kautabletten mit 50% Bryophyllum pinnatum-Presssaft

min0 5 10 15 20 25

mAU

-4

-2

0

2

4

6

8

DAD1 A, Sig=298,8 Ref=550,100 (050809\B2BPROT.D)

1.2

81 1

.344

1.5

66 1

.697

1.8

03 2

.075

2.3

08 2

.414

2.5

17 2

.597

4.4

93

7.3

44 7

.527

8.5

41 8

.998

9.1

42

9.8

05 1

0.11

8 1

0.25

5 1

0.38

2 1

0.58

2 1

0.78

8 11.

015

11.

408

11.

574

11.

740

11.

824

12.

000

12.

295

12.

425

12.

723

12.

861

13.

258

13.

476

16.

523

16.

951

21.

493

Bryophyllum pinnatum Tablet extract , 3 tabl/25 mL EtOH, „B/2 BP“ Rotavap

Analyzed 050809/SG

Abb. 54. HPLC-Chromatogramm mit Fingerprints aus einer Probenaufarbeitung. Dazu wurden 3 Kautabletten Bryophyllum pinnatum 50% (Weleda, Arlesheim, Schweiz) in 25 ml EtOH gelöst und gemäss der Methode „Rotationsverdampfer“ aufgearbeitet.

216

N. HPLC-Chromatogramm der EtOH-Mazeration von Bryophyllum daigremontianum

min0 2 4 6 8 10 12 14 16

mAU

-10

0

10

20

30

40

50

DAD1 A, Sig=298,8 Ref=550,100 (310709\CH1BDROT.D) 1

.326

1.5

44 1

.757

1.9

81

2.5

55 2

.620

3.4

33

4.2

06

5.0

68

5.4

85 5

.800

6.2

13

6.6

46

7.4

41 7

.663

7.8

44 7

.999

8.1

75 8.3

41 8

.582

8.9

03 9

.049

9.3

10 9

.527

9.7

85 9

.984 1

0.29

6 1

0.47

9 1

0.60

0 1

0.70

7 1

0.86

0 1

0.99

4 1

1.27

4 1

1.45

0 1

1.60

3 1

1.77

1

12.

284

12.

463

12.

725

12.

889

13.

079

13.

358

13.

569

13.

660

13.

768

13.

889

13.

998

14.

137

14.

343

14.

571

14.

812

15.

026

15.

292

15.

652

15.

981

16.

232

16.

385

16.

965

17.

588

17.

805Bryophyllum daigremontianum

20% ethanolic maceratio„CH/1 BD“ Rotavap

Analyzed 310709/SG

min14 16 18 20 22 24 26 28

mA U

- 10

0

10

20

30

40

50

D A D 1 A, S ig = 298,8 R ef= 550,100 ( 310709\C H 1BD R O T .D )

13.

998

14.

137

14.

343

14.

571

14.

812

15.

026

15.

292

15.

652

15.

981

16.

232

16.

385

16.

965

17.

588

17.

805

18.

117

18.

461

18.

631

18.

885

19.

004

19.

230

20.

090

20.

369

21.

036

21.

454

22.

616

22.

887

23.

418

23.

907

24.

232

25.

435

25.

617

26.

020

26.

421

27.

584

27.

739

B ry o p h yllu m d a ig re m o ntia num 2 0 % e th a n o lic m a c e ratio „ C H /1 B D “ R o ta va p

Ana lyzed 310709/SG

Abb. 55. HPLC-Chromatogramm mit Fingerprints des ethanolischen Auszuges aus Bryophyllum daigremontianum.

217

nm200 250 300 350

mAU

-20

0

20

40

60

*DAD1, 17.806 (94.2 mAU,Apx) Re

Abb. 56. DAD-UV-Spektrum des zusätzlichen, in Bryophyllum pinnatum nicht vorkommenden Peaks. Das Spektrum lässt auf ein Bufadienolid schliessen.

218

O. Resultate aus der Literaturrecherche über Inhaltsstoffe

Die nachfolgende Tabelle zeigt die in der Literaturrecherche mittels Scifinder gefundenen Substanzen und Stoffklassen mit den entsprechenden Molgewichten und den Referenzen im Literaturverzeichnis. Substanz Formel

Stoffklasse Molgewicht (MW)

Literaturangabe

Quercitrin C21 H20 O11

Flavonoid Glykosid

448 (55)

4H-1-Benzopyran-4-one, 3-[(2-O-α-L-arabinopyranosyl-6-deoxy-α-L-mannopyranosyl)oxy]-2-(3,4-dihydroxyphenyl)-5,7-dihydroxy- C26 H28 O15

Flavonoid Glykosid

580 (55)

4H-1-Benzopyran-4-one, 3-[(2-O-α-L-arabinopyranosyl-6-deoxy-α-L-mannopyranosyl)oxy]-5,7-dihydroxy-2-(4-hydroxyphenyl)-

Flavonoid Glykosid

564 (55)

b-D-Glucopyranoside, 1-ethenylhexyl 6-O-α -L-arabinopyranosyl- C19 H34 O10

Glykosid 422 (76)

4H-1-Benzopyran-4-one, 3-[(2-O-α-L-arabinopyranosyl-6-deoxy-α-L-mannopyranosyl)oxy]-2-(3,4-dihydroxyphenyl)-5,7-dihydroxy- C26 H28 O15

Flavonoid Glykosid

580 (56)

4H-1-Benzopyran-4-one, 7-(β-D-glucopyranosyloxy)-5-hydroxy-2-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-8-methoxy- C23 H24 O12

Flavonoid Glykosid

492 (56)

4H-1-Benzopyran-4-one, 3-[(2-O-α-L-arabinopyranosyl-6-deoxy-α-L-mannopyranosyl)oxy]-5,7-dihydroxy-2-(4-hydroxyphenyl)- C26 H28 O14

Flavonoid Glykosid Kapinnatosid

564 (56)

4H-1-Benzopyran-4-one, 2-(3,4-dihydroxyphenyl)-3,5,7-trihydroxy-

Flavonoid Quercetin

302 (56)

219

C15 H10 O7 4H-1-Benzopyran-4-one, 3-[(6-deoxy-α-L-mannopyranosyl)oxy]-5,7-dihydroxy-2-(4-hydroxyphenyl)- C21 H20 O10

Flavonoid Glykosid Kämpferol Rhamnosid

432 (56)

4H-1-Benzopyran-4-one, 3-[(6-deoxy-α-L-mannopyranosyl)oxy]-2-(3,4-dihydroxyphenyl)-5,7-dihydroxy- C21 H20 O11

Flavonoid Glykosid

448 (56)

Bufa-20,22-dienolide, 3-(acetyloxy)-1,5,14-trihydroxy-19-oxo-, (1β,3β,5β)- C26 H34 O8

Bufadienolid Bersaldegenin 3 acetat

475 (77) (78) (61)

Bufa-20,22-dienolide, 1,3,5-[(1R)-ethylidynetris(oxy)]-11,14,19-trihydroxy-, (1β,3β,5β,11α)- (9CI) C26 H34 O8

Bufadienolid Bryophyllin C

475 (76) (78) (61)

Chola-20,22-dien-24-oic acid, 14,21-epoxy-1,3,5-[ethylidynetris(oxy)]-11,12-dihydroxy-19-oxo-, methyl ester, (1β,3β,5β,11α,12α,14β,22E)- (9CI) C27 H34 O9

Bufadienolid 503 (77) (78)

Bufa-20,22-dienolide, 1,3,5-[(1R)-ethylidynetris(oxy)]-14-hydroxy-19-oxo-, (1β,3β,5β)- (9CI) C26 H32 O7

Bufadienolid 457 (77) (78) (61)

Bufa-20,22-dienolide, 1-(acetyloxy)-3,5,14-trihydroxy-19-oxo-, (1β,3β,5β)- C26 H34 O8

Bufadienolid Bersaldegenin 1 acetate

475 (77) (78)

Bufa-20,22-dienolide, 1,3,5-[(1R)-ethylidynetris(oxy)]-11,14-dihydroxy-12,19-dioxo-, (1β,3β,5β,11α)- (9CI) C26 H30 O9

Bufadienolid Daigremontianin

487 (77) (78)

Bufa-20,22-dienolide, 1,3,5-[(1R)-ethylidynetris(oxy)]-11,14-dihydroxy-19-oxo-, (1β,3β,5β,11α)- C26 H32 O8

Bufadienolid Bryotoxin C

473 (77) (78)

220

Hexadecanoic acid C16 H32 O2

Säure 256 (79)

Octadecanoic acid C18 H36 O2

Säure 284 (79)

Docosanoic acid C22 H44 O2

Säure 341 (79)

Eicosanoic acid C20 H40 O2

Säure 313 (79)

Benzoic acid, 3,4,5-trihydroxy- C7 H6 O5

Säure 170 (80) (81)

4H-1-Benzopyran-4-one, 2-(3,4-dihydroxyphenyl)-5,7-dihydroxy- C15 H10 O6

Flavonoid 286 (81)

2H-1-Benzopyran-3-ol, 3,4-dihydro-2-phenyl- C15 H14 O2

(Flavonoid) 3-Flavanol

226 (81)

Benzoic acid, 4-hydroxy-3,5-dimethoxy-, (2R,3R)-3,4-dihydro-5,7-dihydroxy-2-(3,4,5-trihydroxyphenyl)-2H-1-benzopyran-3-yl ester C24 H22 O11

Flavonoid 486 (81)

Stigmast-5-en-3-ol, (3β)- C29 H50 O

Steroidderivat b-Sitosterol

415 (82)

Stigmasta-5,22-dien-3-ol, (3β,22E)- C29 H48 O

Steroidderivat b-stigmasterol

413 (82)

Ergost-5-en-3-ol, (3β,24R)- C28 H48 O

Steroidderivat 401 (82)

Ergosta-5,24(28)-dien-3-ol, (3β)- C28 H46 O

Steroidderivat Ostreasterol

399 (82)

Stigmasta-5,24(28)-dien-3-ol, (3β,24Z)- C29 H48 O

Steroidderivat 413 (82)

Stigmasta-5,25-dien-3-ol, (3β,24S)- C29 H48 O

Steroidderivat 413 (82)

Ergost-5-en-3-ol, (3β)- C28 H48 O

Steroidderivat 401 (82)

Stigmasta-7,25-dien-3-ol, (3β,5α)- C29 H48 O

Steroidderivat 413 (82)

Stigmasta-7,24(28)-dien-3-ol, (3β,5α,24Z)- C29 H48 O

Steroidderivat 413 (82)

Stigmasta-7,25-dien-3-ol, (3β,24S)- (9CI) C29 H48 O

Steroidderivat 413 (82)

221

Stigmasta-5,24-dien-3-ol, (3β)- C29 H48 O

Steroidderivat 413 (82)

Stigmasta-7,24-dien-3-ol, (3β,5α)- C29 H48 O

Steroidderivat 413 (82)

Ergosta-5,25-dien-3-ol, (3β)- C28 H46 O

Steroidderivat 399 (82)

Ergosta-5,24(28)-dien-3-ol, 25-methyl-, (3β)- (9CI) C29 H48 O

Steroidderivat 413 (82)

Stigmasta-5,25-dien-3-ol, (3β)- (9CI) C29 H48 O

Steroidderivat 413 (82)

Stigmast-25-en-3-ol, (3β,5α,24S)- C29 H50 O

Steroidderivat 415 (82)

Stigmast-24-en-3-ol, (3β,5α)- C29 H50 O

Steroidderivat 415 (82)

Ergost-24(28)-en-3-ol, 25-methyl-, (3β,5α)- (9CI) C29 H50 O

Steroidderivat 415 (82)

Bufa-20,22-dienolide, 1,3,5-[(1R)-ethylidynetris(oxy)]-11,14-dihydroxy-19-oxo-, (1β,3β,5β,11α)- C26 H32 O8

Bufadienolid Bryophyllin A Bryotoxin C

473 (83)

Bufa-20,22-dienolide, 1-(acetyloxy)-11,19-epoxy-3,5,14,19-tetrahydroxy-, (1β,3β,5β,11α,19R)- (9CI) C26 H34 O9

Bufadienolid 491 (83)

Urs-20-en-3-ol, (3β,18α,19α)- C30 H50 O

Triterpen Taraxasterol

427 (84)

Olean-12-en-3-ol, (3β)- C30 H50 O

Triterpen b-Amyrin

427 (84)

Urs-12-en-3-ol, (3β)- C30 H50 O

Triterpen a-Amyrine

427 (84)

Urs-12-en-3-ol, 3-acetate, (3β)- C32 H52 O2

Triterpen a-Amyrine-acetat

487 (84)

Olean-12-en-3-ol, 3-acetate, (3β)- C32 H52 O2

Triterpene b-Amyrin-acetate

487 (84)

Stigmast-5-ene-3,25-diol, (3β)- C29 H50 O2

Steroidderivat 431 (84)

Oleanane, (18α)- C30 H52

Triterpen 413 (84)

Phenanthrene, 2-(9-decen-1- Phenanthren 316 (84)

222

yl)- C24 H28 Phenanthrene, 2-(10-undecen-1-yl)- C25 H30

Phenanthren 331 (84)

Ursa-12,20-dien-11-one, 3-hydroxy-, (3β)- (9CI) C30 H46 O2

Triterpen 439 (84)

Cholestane-3,6,14-triol, 6-acetate, (3β,5α,6β)- (9CI) C29 H50 O4

Steroidderivat Bryophyllol

463 (84)

Ursa-9(11),19-dien-28-oic acid, 22-oxo- (9CI) C30 H44 O3

Steroidderivat Bryophyllon

453 (84)

4,7,10,12-Tricosatetraene-3,6,9-trione, 5,7-dihydroxy-, (4E,7E,10Z,12Z)- C23 H34 O5

391 (84)

Bufa-20,22-dienolide, 3-(acetyloxy)-1,5,14-trihydroxy-19-oxo-, (1β,3β,5β)- C26 H34 O8

Bufadienolid 475 (60)

Bufa-20,22-dienolide, 1,3,5-[(1R)-ethylidynetris(oxy)]-11,14-dihydroxy-19-oxo-, (1β,3β,5β,11α)- C26 H32 O8

Bufadienolid 473 (60)

223

P. Lebenslauf Regula Wächter

Personalien

Name Wächter

Vorname Regula

Titel Eidg. diplomierte Apothekerin

Geburtsdatum 1.12.1978

Geburtsort Brugg AG

Heimatort Sulz Gemeinde Laufenburg AG

Anschrift privat Habsburgerstrasse 31, 5200 Brugg

Telefon 078 723 40 44

Besuchte Schulen

1985-1990 Primarschule Brugg

1990-1994 Bezirksschule Brugg

1994-1998 Neue Kantonsschule Aarau, Maturität Typus D

Hochschulstudium

1998-2006 Studium der Pharmazie an der ETH Zürich

2002-2003 Praktikumsjahr in der City Apotheke Kuhn in Brugg

mit Assistentenprüfung für Apotheker

2006 Staatsexamen an der ETH Zürich zur

2006-2010 Doktorandin Universität Basel, Institut für

Pharmazeutische Biologie, Departement

Pharmazeutische Wissenschaften, Prof. Dr.

Matthias Hamburger; Praktische Arbeiten:

UniversitätsSpital Zürich, Forschung Geburtshilfe,

Frau Prof. Dr. Ursula von Mandach und Universität

224

Bern Departement Klinische Forschung, Prof. Dr. R.

Brenneisen.

Praktische Tätigkeit Seit 2003 Teilzeitanstellung in der Apotheke Drogerie Kuhn in

Brugg

225

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230

8 Danke

Ganz herzlich bedanke ich mich bei meinen Förderern und Betreuern Frau Prof. Dr.

U. von Mandach, Herrn Prof. Dr. R. Brenneisen und Herrn Prof. Dr. M. Hamburger für

ihren Einsatz für das Bryophyllumprojekt und die Betreuung und Unterstützung

meiner Dissertation.

Den Mitgliedern der Bryophyllum Study Group, Herrn Dr. M. Schnelle, Herrn Dr. A.

Worel, Frau Dr. Monica Mennet und Frau Dr. A.-P. Simões Wüst danke ich für die

gute Zusammenarbeit.

Herzlichen Dank an Herrn Prof. Dr. R. Zimmermann und das Team des Gebärsaals

für die gute Zusammenarbeit.

Ein spezieller Dank geht an Frau Dr. Tina Fischer für den unermüdlichen Einsatz für

unsere Studie.

Ein herzlicher Dank geht an die Mitarbeiter und die ehemaligen Mitarbeiter der

Forschungsabteilung Geburtshilfe USZ, den Informatikern der Geburtshilfe und den

Mitarbeitern der Forschungsgruppe Prof. Brenneisen an der Universität Bern für die

jahrelange gute Zusammenarbeit und Kollegschaft.

Ganz besonders danke ich Frau Alexandra Dolder Behna (Biologielaborantin) für ihre

exakte und ausdauernde Arbeit im Labor und die schöne Zeit, die wir gemeinsam

verbrachten.

Frau Dr. M. Roos vom Institut für Sozial- und Präventivmedizin danke ich für ihre

Geduld und Hilfe beim Erstellen der Statistik.

Den Herren Oberheinrich und Kierstein danke ich für die Einführung und den

tadellosen Support am Myographen.

231

Den Mitarbeitern der Kantonsapotheke Zürich, Frau J. Adank, Frau S. Buffoni und

Herrn R. Oberholzer danke ich für die gute Zusammenarbeit und die grosszügigen

Einblicke in den Betrieb.

Frau P. Erni, Frau Dr. B. Seitz, Herrn Prof. Dr. E. Sigel und Herrn B. Lüscher danke

ich für ihre geleistete Arbeit am Bryophyllumprojekt und die Hilfe.

Herzlichen Dank an das HPLC-MS-Team der Gruppe Hostettmann/Wolfender der

Universität Genf für die Zusammenarbeit.

Ganz besonders herzlich danke ich meiner Familie und Tobias für ihre

Unterstützung, Geduld und ihr Verständnis während meiner Studiums- und

Dissertationszeit.