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KULTIVIERUNG VON MIKROORGANISMEN

Verfahren, das Bakterien außerhalb

des natürlichen Standortes zur

Vermehrung bringt (unbelebte

Substrate oder Zellkulturen)

KULTIVIERUNG VON MIKROORGANISMEN

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Voraussetzungen für Bakterienwachstum

n Nährmedium

n Temperaturoptimum

n pH-Wert

n Sauerstoff

(aerob/anaerob)

Bakterienwachstum durch binäre Teilung

Pro Stunde = 2 Teilungen Anfangskeimzahl 1Ø 1 Stunde 4Ø 2 Stunden 16Ø 3 Stunden 64Ø 4 Stunden 256Ø 5 Stunden 1024Ø 6 Stunden 4096Ø 7 Stunden 16384Ø 8 Stunden 65536Ø 9 Stunden 262144Ø 10 Stunden 1048576Ø 11 Stunden 4194304Ø 12 Stunden 16777216Ø 13 Stunden 67108864Ø 14 Stunden 268435456Ø 15 Stunden 1073741842Ø 16 Stunden 4294967296Ø 17 Stunden 17179869184

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Identifizierung von Bakterien

n Morphologische Merkmale– Gramverhalten– Form– Größe– Kapsel– Kolonieform– Farbe

n Physiologische Merkmale– Nachweis verschiedener Enzyme (Bunte Reihe, API)

n Chemische Merkmale– Zellwand– Antigene– DNA

n Bakterien bilden auf festen Nährböden Kolonien. Man versteht

darunter mit bloßem Auge sichtbare Teilaggregationen, die infolge

einer einzelnen Bakterienzelle entstanden sind.

n Kolonien entstehen nicht nur unter Laborbedingungen (künstlichen

Bedingungen), sondern auch unter natürlichen Bedingungen auf

Substraten mit fester Oberfläche (z.B. auf Kartoffeln, Fleischwaren,

Früchten).

n Form, Struktur und Farbe der am Kolonieaufbau beteiligten Einzelzellen

bestimmen u.a. die Koloniemerkmale (Morphologie).

KULTIVIERUNG VON MIKROORGANISMEN

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KULTIVIERUNG VON MIKROORGANISMEN

n Farbe:

n Koloniegröße:

n Oberfläche:

n Konsistenz:

n Geruch:

n Profil:

n Kolonieform:

n Kolonierand:

KEIMZAHLBESTIMMUNGEN

n Verdünnungsreihen müssen angelegt werden, um bei der

späteren Kultivierung auswertbare Koloniezahlen auf dem Agar

zu erhalten.

n In der Praxis ist die dezimale Verdünnung am gebräuchlichsten.

n Zum Anlegen einer Verdünnungsreihe wird die Originalprobe

(Verdünnungsstufe 0) 1:10 verdünnt.

n 10 g auf 100 ml mit Verdünnungsflüssigkeit auffüllen,

Verdünnungsstufe 1.

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KEIMZAHLBESTIMMUNGEN

n Aus dieser Stufe wird 1 ml entnommen und zu 9 ml

Verdünnungsflüssigkeit pipettiert (Verdünnungsstufe 2).

n Nach dem Durchmischen auf dem Reagenzglasschüttler werden weitere

Dezimalverdünnungen angelegt.

n Für jede Verdünnungsstufe wird eine frische Pipette verwendet.

n Benutzte Pipetten werden in einer Desinfektionslösung abgestellt.

n Aus der zuvor hergestellten Verdünnungsreihe werden genau

abgemessene Mengen zur Anzüchtung von Mikroorganismen verwendet

(1ml für Plattengussverfahren und 0,1 ml für Oberflächenverfahren.

Stufe 0 Stufe 1 Stufe 2 Stufe 3 Stufe 4 Stufe 5 Stufe 6

6

• 1 ml einer Verdünnungsstufe wird mit einer sterilen Pipette in eine leere, sterile Petrischale eingebracht.

• Dazu gibt man ca. 10-15 ml verflüssigten und ca. 40°C warmen Agar (z. B. PCA).

• Diese beiden Lösungen werden durch kreisende Bewegungen (in Form einer 8) verteilt.

• Die verschlossene Petrischale bleibt bis zum Erstarren des Nährbodens stehen und wird anschließend mit dem Deckel nach unten bebrütet.

Plattengussverfahren

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• 0,1 ml einer Verdünnungsstufe wird mit einer sterilen Pipette auf eine fertig gegossene Agarplatte aufgebracht.

• Der Tropfen wird mit einem sterilen gebogenen Glasstab (Drigalski-Spatel) gleichmäßig auf der Platte verteilt.

• Die Petrischale wird mit dem Deckel verschlossen. • Erst wenn der Ausstrich getrocknet ist, wird die

Schale mit dem Deckel nach unten bebrütet.

Oberflächenspatelverfahren

Plattengussverfahren

Oberflächenspatelverfahren

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VERDÜNNUNGSREIHE (Gruppenbeispiel)DI

Ü4

STUFE Gesamt Keimzahl PCA, 22°C/2d

Coliforme Bakterien/E. coli CCA,37°C/ 1d

EnterokokkenKANA, 44°C/1d

S. aureusBP, 37°C/1d

0 /

1 /

2 /

3 /

4 /

Ergebnis (Mittelwert)KBE/ml

/

n Anlegen einer Verdünnungsreihe aus einer Mischkultur (0rginal Probe, 1, 2, 3, 4)n Bestimmung der Kolonie Bildende Einheiten KBE/ml einer Keimsuspension mittels

Koch'schem Plattenverfahren– Gesamtkeimzahl (OF, PCA Agar, 22°C), – E. coli und coliformen Bakterien (OF, CCA Agar, 37°C), – Enterokokken (OF, KANA Agar, 44°C), – S. aureus (OF, BP Agar, 37°C).

Gesamtkeimzahl (PCA)n Auswertung

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Coliforme, E. coli (CCA)n Auswertung

Staphylokokken (BP)n Auswertung

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Enterokokken (KANA)n Auswertung

Berechnung am Beispiel PCA

Stufe Wert

2 418 x 102 = 418 x 1023 34 x 103 = 340 x 1024 4 x 104 = 400 x 102

1158 x 102Mittelwert bilden 1158 x 102 :3 = 386x102

Ergebnis 3,9 x 104

n Auswertung