03.06.2016

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Labormethoden der BiologieVorlesung zur Übung Zellbiologie und Physiologie

Übungswoche: „Enzyme“AG Kudla

Leiter: Oliver Batistič

� Enzymkinetik der Lactat Dehydrogenase

� Peroxidase Nachweis

� Enzymkinetik der Lactat Dehydrogenase

� Peroxidase Nachweis

Versuch

Kinetik der Lactat - Dehydrogenase

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Das Energieprofil einer chemischen Reaktion.

� Das thermodynamische Gleichgewicht einer chemischen Reaktion wird bestimmt durch die Differenz zwischen der freien Enthalpie der Reaktanden und der Produkte, ∆G.

∆G = freie Reaktionsenthalpie

∆H = Enthalpie der an der Reaktion beteiligten Stoffe

∆S = Änderung der Entropie

Exotherme

Reaktionen sollten

spontan ablaufen?

Das Energieprofil einer chemischen Reaktion.

� Um reaktionsfähig zu werden, müssen Reaktanden einen angeregten „Übergangszustand“ (transition state) durchlaufen. Deshalb erfolgt meistens keine spontane Reaktion.

Diese „Aktivierungsenergie“ EA kann z.B. thermische Energie sein

Übergangszustand Übergangszustand

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Reaktionsgeschwindigkeit als Funktionder Temperatur

Temperatur in °K

v

Arrhenius-Darstellung

1/Temperatur in (°K) -1

log(v)-E / 2.303*R

Die Reaktionsgeschwindigkeit einer chemischen Reaktion steigt exponentiell mit der Temperatur t.

Steigende Temperatur erhöht die thermische Aktivierung der Reaktanden. Daher steigt v exponentiell mit t.

Die Exponentialfunktion v versus t steigt mit der freien Enthalpie der Aktivierung („Aktivierungsenergie) einer Reaktion.

van ’t Hoff’sche Regel oder RGT Regel:chemische Reaktionen verdoppeln sichbei einem Temp.anstieg um 10K

Enzymatische Katalyse

Durch Bindung an das „aktive Zentrum“ des Enzyms werden die Reaktanden„aktiviert“.

Dadurch wird der Betrag für die thermische Aktivierung zum Erreichen des transition state geringer.

Die Katalyse beeinflusst nur die Reaktionskinetik.

Sie hat keinen Einfluss auf das thermodynamische Gleichgewicht der Reaktion.

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Enzyme beschleunigen die Geschwindigkeit einer Reaktionum das Vielfache

Orotidine 5'-monophosphate Uridine 5'-monophosphate

Das aktive Zentrum eines EnzymsDas aktive Zentrum ist eine Tasche oder Spalte am Protein, in die das Substrat gebunden wird und die Reaktion erfolgt.

Die Spezifität des Enzyms beruht auf der sterischen Passgenauigkeit zwischen aktivem Zentrum und Substrat.

Enzym und Substrat durchlaufen bei Bindung eine strukturelle Änderung

Enzymprotein

Substrat

Bindetasche;

„aktives Zentrum“

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„Induced Fit“

Substratbindung an das katalytische Zentrum löst eine reversible Protein-Konformationsänderung aus, durch die das Substrat enger ins katalytische Zentrum eingeschlossen wird (induced fit).

Das aktive Zentrum ist für den Überganszustand von S�P optimiert, Bindungen (maximalim induced fit) stellen Aktivierungs-Energie zur Verfügung

Inhibitoren ähneln v.a. dem Übergangszustand (höhere Affinität, aber ohne Umsetzung)

Zusammenfassung des Reaktionszyklus zu zwei Reaktionen:

1. Bildung des ES Komplexes;

2. „katalytischer Zerfall“ des EP Komplexes.

Bestimmung der Enzymkinetik

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Die Bildung des ES Komplexes ist schnell, aber reversible;

Der katalytische Zerfall ist somit Geschwindigkeitsbestimmend

Der „katalytischer Zerfall“ ist langsam, aber praktisch irreversibel.

Daher wird die Geschwindigkeit v der gesamte Enzymreaktion bestimmt durch:

1. die Geschwindigkeitskonstante k2

2. die Konzentration [ES].

v0 = k2 [ES]

Daher wird die Geschwindigkeit v der gesamte Enzymreaktion bestimmt durch:

1. die Geschwindigkeitskonstante k2

2. die Konzentration [ES].

Zur Bestimmung der Kinetik wird die Reaktionsgeschwindigkeitbei gleichbleibender Enzymkonzentration und unterschiedlicher Substratkonzentration zum Zeitpunkt 0 untersucht

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Bei niedrigen Substratkonzentrationen wird die Reaktionsgeschwindigkeit vdurch die Substratkonzentration [S] bestimmt � v steigt mit [S]. Die resultierende Substratsättigungsfunktion ist hyperbolisch.

Vmax wird erreicht, wenn alle Enzymproteine mit Substrat gesättigt sind („Substratsättigung“). Die Reaktionsgeschwindigkeit ist dann unabhängig von [S].

Die maximale Geschwindigkeit, Vmax, wird durch die Menge an verfügbarem Enzym [E] begrenzt.

Substratsättigungsfunktion einer Enzymreaktion

Die Michaeliskonstante KM kennzeichnet die Substratkonzentration [S], bei der 50% der Enzympopulation mit Substrat gesättigt ist.

Die Geschwindigkeit entspricht dann ½ Vmax.

Die KM drückt aus, welche Affinität das Substrat zum Enzym hat: bei hoher Affinität ist der Wert für die KM relativ klein, und umgekehrt.

Substratsättigungsfunktion einer Enzymreaktion

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Lineare Umformung der Michaelis Menten Kurve

Die Funktion eines Inhibitors lässt sich aus der Kinetik ablesen

Kompetitive Hemmung

Nicht-Kompetitive Hemmung

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Substratsättigungskurve der Lactat - Dehydrogenase (LDH)

Substratsättigungskurve der Lactat - Dehydrogenase (LDH)

Die Lactat-Dehydrogenase (LDH) katalysiert die Milchsäuregärung unter anaeroben Bedingungen.

Glykolyse

Milchsäuregärung

LDH

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Substratsättigungskurve der LDH

Pyruvat + NADH � Lactat + NAD+

Substratsättigungskurve der LDH

Pyruvat + NADH � Lactat + NAD+

∆A 340 nm

Zeit (min)

Messung:

Zeitlicher Verlauf der Extinktionszunahme

(340 nm) nach Zugabe von Lactat + NAD.

Die „Anfangsgeschwindigkeit“ (Steigung) vo, …

…. ändert sich mit der Lactatkonzentrationen

[S] (Lactatkonzentration)

vo

..

. . .

v0 = Steigung (mol NADH pro min)vo

Grundlagen zur Berechnung: Lambert-Beer Gesetz und „Optischer Test“; s. Kurswoche „Enzymatische Metabolitbestimmung“!

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Originalmessungen aus Übung

Berechnung der Kinetik

Absorptionsänderung (340 nm) / Zeit � Konzentrationsänderung / Zeit (Lambert-Beersche-Gesetzt)

Konzentration: mol/L; mmol/L?Zeit: Minuten; Sekunden?

Ziel: vmax= mol Lactat * sec-1 * mg Enzym-1

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Versuch:

Peroxidase Nachweis

Versuch:

Peroxidase Nachweis

Peroxidase Reaktion

Peroxidasen oxidieren phenolische Substrate mit H2O2:

RH2 + H2O2 � R + 2 H2O

� geringe Substratspezifität;

� große Enzymfamilie (Genfamilie) � Isoenzyme.

Peroxidase Reaktion

Peroxidasen oxidieren phenolische Substrate mit H2O2:

RH2 + H2O2 � R + 2 H2O

� geringe Substratspezifität;

� große Enzymfamilie (Genfamilie) � Isoenzyme.

Was sind Isoenzyme ?

� strukturell und funktionell ähnliche Enzyme, � Expression oft unterschiedlich reguliert

(durch unterschiedliche Promotorstruktur!),� oft unterschiedliches Targeting (unterschiedliche Signalpeptide)

Was sind Isoenzyme ?

� strukturell und funktionell ähnliche Enzyme, � Expression oft unterschiedlich reguliert

(durch unterschiedliche Promotorstruktur!),� oft unterschiedliches Targeting (unterschiedliche Signalpeptide)

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Die Oxidation eines Phenols durch die

Peroxidase führt zur Bildung eines

Phenolradikals.

Das delokalisierte ungepaarte Elektron

kann mit Resonanzstrukturen anderer

Phenole reagieren.

Phenolradikale polymerisieren spontan.

Beispiel: Lignifizierung.

Die Wirkungsweise der Peroxidase Beispiel: Phenoloxidasen

z.B. Abwehr,

Verwundung,

Xylembildung

SOD

NADPH

NADP

O2

O2.-

e-

H2O2

Peroxidase

Polymerisation

Phenole

Zellwand

NADPH Oxidase

Zusammenspiel von NADP-Oxidase und Zellwand-Peroxidasen bei Zellwand - Polymerisationen

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Anwendungsbeispiel für Peroxidasen

- Immunohistochemische Detektion von Proteinen – „Western Blot“

Meerrettich-Peroxidase mit Antikörpern gekoppelt oxidiert Luminol � Chemilumineszenz

Histochemische Aktivitätsfärbung einer Peroxidase:

Oxidation des künstlichen Substrates Tetramethyl-Benzidin

Die Färbung wird durch den „Radikalfänger“ Ascorbat (Vitamin C) gehemmt!

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Ascorbat fängt Superoxid / Wasserstoffperoxid ab. (Reduktive Entgiftung).

oxidiertes Ascorbatreduziertes Ascorbat

Elektrophoretische Trennung von (Enzym-) Proteinen im Gel

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Bildung eines Polymers mit definierter Ausschlussgröße � Molekülsieb.

Polymerisation des Gels, ausgelöst durch „Radikalstarter“ Ammonium Persulphat.

Bewegung der „nativen“ (intakten) Proteine im elektrischen Feld, entsprechend 1. ihrer Ladung,2. ihrer Größe

Native Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese (PAGE)

Native Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese

� PAGE ohne SDS!

� Proteine (Enzyme) bleiben funktionsfähig!

� Trennung der Proteine nach Größe und Ladung!

Denaturierende Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese (SDS-PAGE)

� Detergenz Dodecylsulphat (SDS) bildet eine Micelle um Proteine, nach außen einheitliche Ladungsdichte (negativ geladen);

� Proteine werden denaturiert,

� Trennung der Proteine nur nach Größe (geeignet zur Molekulargewichtsbestimmung!)

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Rettich Tabak Tabak Tabak Tabak Tomate

Stiel kl. Blatt gr. Blatt Wurzel Blatt

Aktivitätsfärbung der Peroxidase im nativen Gel

Das künstliche Substrat 4-Chlor-1-Naphtol ist reduziert farblos, oxidiert blau-schwarz.

Nachweis gewebsspezifischer Expression von Peroxidase -Isoenzymen

Viel Spaß