Labortechniken (2)

Realtime PCR – Quantitative PCR

Prinzip:Nachweis der PCR-Produktein Echtzeit und Quantifizierunganhand eines fluoreszentenReporters

Material:wie bei der konventionellen PCRaber zusätzlich eine Sonde(Taqman probe)

R Q

R=Reporter, Q=Quencher

Taq-PolymeraseSynthese- und Nuklease-Einheit

Labortechniken (2)

Funktionsweise der Hydrolyse-Sonden

1. die synthetische Einheit der Taq-Polymerasesynthetisiert den Gegenstrang

2. die Taq-Polymerase stößt auf die Sonde, dieanschließend durch die Nuklease-Einheit derTaq-Polymerase hydrolysiert wird

3. durch die räumliche Trennung von Reporterund Quencher entsteht ein Fluoreszenzsignal,das proportional zu der Menge an PCR-Produktzunimmt

Labortechniken (2)

exponientiell

linear

Plateau

konv

enti

onel

le P

CR

Rea

ltim

e-P

CR

Amplifikationskurve (linear – linear)

Labortechniken (2)

Amplifikationskurve (linear – log)

threshold (Schwellenwert)

threshold cycle Ct (Zyklus, beidem die Amplifikationskurveden Schwellenwert kreuzt)

Labortechniken (2)

106 105 104 103 102Anzahl Moleküle

Amplifikationskurve (linear – log)Standards

Labortechniken (2)

Standardgerade (Ct vs. log c0)

Effektivität = 10(-1/slope)-1(100% Eff. bei einer Steigung von -3,34)

Ct = m log(c) + b

c = 10(Ct-b)/m

Labortechniken (2)

Bericht (Report)

Labortechniken (2)

7300 Realtime PCR System

Labortechniken (2)

7300 Realtime PCR System - Schublade

Labortechniken (2)

Pyrosequencing-Reaktion (1)

1. PCR mit einem biotinyliertem Primer

2. Denaturierung des PCR-Amplifikates

3. Binden des biotinylierten DNA-Stranges an Streptavidin-Kügelchen

Kügelchen

Biotin

Biotin

Biotin

StreptavidinSequenzierungsprimer

Labortechniken (2)

Pyrosequencing-Reaktion (2)

Labortechniken (2)

Film ab!

Labortechniken (2)

PyroMark ID

Labortechniken (2)

PyroMark ID - Cartridgehalterung

Labortechniken (2)

PyroMark ID – Einheit für Mikrotiterplatte

Mikrosatellitenanalyse

Genom

„Viele höhere Organismen besitzen während der Hauptphase ihrer Entwicklung einen diploiden Chromosomensatz, d.h. die Zellen enthalten jedes Chromosom in zweifacher Ausfertigung (eines von jedem Elternteil). Dabei handelt es sich in der Regel nicht um identische Kopien: Zwar passen beide hinsichtlich Form, Struktur und der Abfolge der Genorte genau zueinander - darum spricht man von homologen (gleichartigen) Chromosomen – die Gene selbst jedoch können in verschiedenen Ausführungen (Allelen) vorliegen.“

Kodierende/ nicht kodierende Bereiche

Mikrosatelliten• nicht kodierende, repetitive DNA-Sequenzen

(Bsp.: CACACACACA)

• wiederholter Abschnitt: 2-6 Basenpaare

• Anzahl der Wiederholungen= stark variabel (hohe Mutationsrate):

- Beeinflussung der Gesamtlänge des MS- geeignet als Genmarker

Anwendung

• Vaterschaftsnachweis, Bestimmungdes Verwandtschaftsgrades

• Kopplungsanalyse

• Genomkartierung, u.a.

Beispiel: Vaterschaftsnachweis

Primer• Suche nach einem MS im Genom• flankierende Sequenzen beidseits des MS= Primer• einmalig an diesem einen Locus=> funktionieren für jedes Individuum

einer Spezies

forward- Primer

GATCTCTCTCTGTCTTATCTACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACAGAGCTTTGGCCCTCCGAAGAGTTCTCTCAGGGCTAAGAAAGGACGAGGTTGATGTCTGAACACCTAACAAAGCGTAACCTCGTCCTTTCTTAGCC

reverse-Primer

Verfahren

1. Der DNA- Abschnitt, der den MS enthält, wird mittels PCR amplifiziert (Primer)

2. Die Größe des Amplifikats hängt ab von der Anzahl der Wdh. innerhalb des MS

3. Das Amplifikat wird auf ein Gel aufgetragen und eine Gelelektrophorese durchgeführt (Auftrennung der DNA-Fragmente nach Größe)

4. Normalerweise: 2 Allele für alle MS gibt es einen Unterschied i.d. Anzahl der Wiederholungen zwischen diesen beiden Allelen, erscheinen 2 separate Banden auf dem Gel

In vitro- Ergebnisse

Multiplex- PCR Längenstandard

Null- Allel

heterozygot

homozygot

QTL- Analyse

• Phänotyp: Zusammenspiel verschiedener Gene

• unterschiedlich starker Einfluß der jeweiligen Gene

• Ziel: Identifikation der Gene mit möglichst großem Einfluß

• Beispiel Krankheitsresistenz: Phänotyp= resistente/ empfindliche Tiere

Rolle der Mikrosatelliten bei der QTL-Analyse

Klärung des Erbganges:

Taucht ein Mikrosatellit stets bei Tieren mit einem bestimmten Phänotyp auf, ist davon auszugehen, daß ein für diesen Phänotyp verantwortliches Gen gemeinsam mit dem Mikrosatellit vererbt wird (Kopplung)

Da Lokalisation der Mikrosatelliten bekannt =>

ungefähre Lokalisation des relevanten Gens auf dem Chromosom

Prüfung:

Welche Gene liegen in diesem Bereich des Chromosoms?

Vielen Dank für die Aufmerksamkeit!