•Lebensmittelgewinnung und –verarbeitung: Problem der Kreuzkontamination (Listerien)

Institut für Milchhygiene, Milchtechnologie und Lebensmittelwissenschaft; Department für Nutztiere und Veterinary Public Health, Veterinärmedizinische Universität, Veterinaerplatz 1, 1210 Wien

Martin.Wagner@vetmeduni.ac.at

BfR Symposium Risken entlang von Lebensmittelwarenketten, Berlin, 18.02.2016 – 19.02.2016

Martin Wagner, Kathrin Rychli, Beatrix Stessl, Stephan Schmitz-Esser

PROMISE Protection of Consumers by Mitigation of Segregation of Expertise

Zu allererst: Danke für die Anregungen und gute Zusammenarbeit

Kontaminationswege sind multipel

Personal

Kontaktmaterialen

Wasser

Ventilation

Rohmaterial

Produkt

Packaging material

Prozessumgebungen

Dr. Martin Wagner

Wie ähnlich sind korrespondierende mikrobielle Ökosysteme (Model Abfluss)?

Dzieciol et al., 2016 Front. Microbiol.

Wieso das Thema Kreuzkontamination und Listerien?

Ausbrüche an Listeriose vorwiegend in Ländern mit differenzierter Produktionstechnologie und hohem Hygienestandard (in den letzten 5 Jahren: Österreich, Belgien, Dänemark, Schweiz, Deutschland)

Steigende Listeriose-Inzidenz in vielen EU 28 MS

Viele Zoonoseerreger haben einen Lifestyle außerhalb der Kette, der wenig erforscht ist (Trennung LMH-Ökologie)

L. monocytogenes zeigt viele Features, die ihn als Pathogen moderner Produktionssysteme vermuten lassen

Food safety violation

Contamination of food

Legal consequences

Abiotic and biotic vectors

Genetic setting

Persistencephenomenon

Habitat specific prevalence

Competiveness of food producers

Increased hygiene risk

Decreased detection probability

Mechanisms ConsequencesHazards

Food processing environment

Environment Food chain

Mikrobielle Persistenz erleichtert Kreuzkontamination

Larsen et al., 2014, Food Control

food industry equipment and

• Persistenz: Wie zu definieren?• Wie schauen Verbreitungsmodelle in Produktionsumfeldern aus?

• Sind persistente Isolate “toleranter” gegen Desinfektionsmitteln? • Sind persistente Isolate “resistenter” gegen Stressoren (zB.

Nährstofflimitation)? • Persistente Listerien und Biofilmbildung? Können Kommensalen die

Biofilmbildung stimulieren?8. Co• Persistente Isolate und Virulenz?

Review - Persistence of Listeria monocytogenes in food industry equipment and premises (Brigitte Carpentier, Olivier Cerf IJFM 145, 2011, 1-8)

Listerien sind „Klassiker“ für Kreuzkontaminationsphänomene

Muhterem-Uyar et al., 2015 Food Control

FörderbänderSlicerUtensilien

SchläucheMattenDrains

Nischen des Keimübertrags: Listeria monocytogenes

Verbreitungsschemata für Listerien in Prozessumfeldern

X = Positive =negative

S1: Disseminierte Kontamination

S2: Gerichtete Kontamination

S3: Hot Spots

S3 S2

Persistenz von L. monocytogenes: wie messen?

Wagner et al., JFP 1996

(1) (5) Kuenne et al. (2013) BMC Genetics; (2) Verghese et al. (3) Müller et al. (2014) PlosOne;  (4) El‐Hanafi et al., (2010), AEM (5) Gilmour et al. (1996) AEM. 

(1) (5) Kuenne et al. (2013) BMC Genetics; (2) Verghese et al. (3) Müller et al. (2014) PlosOne;  (4) El‐Hanafi et al., (2010), AEM (5) Gilmour et al. (1996) AEM. 

• Das PAN-GENOME von L. monocytogenes ist hoch stabil. Interessantsind hyper variable hotspots (accessory genome).

• Mobile Elemente (wie ZB comK prophage) treiben die nischen-spezifischeAdaptation, Persistenz, und Transmission bei L. monocytogenes.

Die „Gretchen“ Frage: Ist Persistenz genetisch encodiert?

Genepool bei persistierenden L. monocytogenes and L. innocua (n=30) weitgehend homolog.

Microarray data: Genetische Variationen nur in Regionen, wo Phagen insertiert sind

Biomarker für Desinfektionsmitteltoleranz: Tn6188 (und Tn554-ähnliche Transposone)

Staphylococcus lentus

Staphylococcus aureus

Listeria monocytogenes

Staphylococcus aureus

Enterococcus faecium

Sind persistente Isolate “resistenter” gegen Stressoren (zB. Nährstofflimitation)?

Drei persistierende Isolate (6179/IRE, 4423/AT, 479a/DK) und Kontrolle: exposition gegen milden Nährstofflimitierung

Stress response (secreted proteins): gemessen durch exoproteomischer Ansatz

Nährstofflimitierung führt zu Resistenz gegen alkalinen Stress

L.m. EGDe vs4423

NamA

lmo2637

Persister strains versus EGDe:8 protein spots upregulated/16 protein spots downregulated

NADPH dehydrogenase NamAHomology in Bacillus subtilis involved in oxidative stress, detoxification process. Lmo2637:

Membrane anchored lipoprotein

Können Kommensalen die Biofilmbildung von Listerien stimulieren?

Figure 5: Stainless Steel Flowcell Model

L. monocytogenes sind die schwächsten Biomasse-produzenten im Vergleich zu kälteadaptierte Species

Monokultur

Pseudomonaden fördern die L. monocytogenes Biofilmbildung (10°C; Flotation)

8,07 ±11,57% L. mono.

6,31 ±9,05% L. mono.

20,10 ±8,06% L. mono.

17,30 ±10,98% L. mono.

20,70 ±6,77% L. mono.

20,21 ±11,94% L. mono.

Persistente Genotypen und Virulenz (ST121)

L. monocytogenes MLST 121 Isolate hoch prävalent in Produktionsumfeldern (Ragon et al., 2008 Plos Pathog; Parisi et al. Food Micro, 2010; Hein et al., 2011 Appl Environ Microb.)

ST121 L. monocytogenes sind niedrig virulent in epithelialen Zellenkulturen

EGDeRO01

RO02 RO03RO04

RO05

RO06

RO07

RO08

RO09

RO10 RO11

RO12

RO13

RO14RO15

EGDeRO01RO02RO03

RO04

RO05

RO06

RO07

RO08

RO09RO10

RO11

RO12

RO13

RO14

RO15

‐5

0

5

10

15

20

25

30

0 1 2 3 4 5 6 7 8

Intracelllu

lar G

rowth Coe

ficient

Invasion efficiency, %

THP‐1Caco‐2

Strain Food source Serotype MLST ‐typeRO01 Mackerel 1/2a 20RO02 Marinated fish 1/2a 8RO03 Smoked herring 1/2a 20RO04 Raw‐ dry salami 1/2a 20RO05 Smoked salmon 1/2a 155RO06 Anchovy 1/2a 20RO07 Fish with spices 1/2a 155RO08 Smoked sprat 1/2a 20

RO09 Fish in oil with herbs 1/2a 155

RO10 Butter  1/2a 121RO11 Poultry 1/2a 121RO12 Lard 1/2a 8RO13 Herring with spices  1/2a  155RO14 Pork rind 1/2c 9RO15 Herring with spices 4b 2

Ciolacu et al., 2015 IJFM

ST121 haben truncated inlA und bapL Gene (biofilm formation)

EGDe

1 kbp

6179 inlA* lmo0435/bapL*

4423 inlA* lmo0435/bapL*

N53-1 inlA* lmo0435/bapL*

LM_1880

inlA* lmo0435/bapL*

Schmitz-Esser, 2015 Front. Microbiol.

ST 121(multiple origin): Genetischer Hintergrund ist klonal

6179 RHS protein

4423

N53-1

LM_1880

ST121 Genome zeigen Marker, die wahrscheinlich in Kompetitionsmechanismen mit anderen Bakterien

involviert sind

RHS protein

RHS protein

RHS protein

kptA codiert für eine RNA 2` phosphotransferase (WapA schneidet RNA und tRNA)

3056 bp protein 29 rearrangement hotspot repeats (Strain competition)

Take home message: Persistenz ist ein Eckstein in Listeria Kreuzkontaminationsszenarien

Sanitation inappropriate

Habourage in abiotic niches

Persistence

Sanitation approriate

Habourage in biotic niches

Erradication

Tolerance

Fitness

Abundance elevated

Poor adaption

Adaptation

Growth

Erradication

Systemic Event specific

Input Strain features Consequence Input Consequence

Low virulent Virulent RISK

Strain features

Food processing environment Food processed

Survival