Leonard KaczmarekLeonard Kaczmarek

Oktober 2006,Oktober 2006,

nature review nature review neuroscienceneuroscience

Non-conducting functions Non-conducting functions ofof

voltage-gated ion channelsvoltage-gated ion channels

Einführung :Einführung :

Grundlagen für das Verständnis leitender

Funktionen von spannungsabhängigen

Ionenkanälen

• Klassifizierung von IonenkanälenKlassifizierung von Ionenkanälen

• GatingGating

• AktionspotentialAktionspotential

• Alternatives GatingAlternatives Gating

IonenkanäleIonenkanäle

Kationenkanäle: hohe Selektivität (Namen!)Kationenkanäle: hohe Selektivität (Namen!)

Anionenkanäle: geringe SelektivitätAnionenkanäle: geringe Selektivität

Gating Gating

spannungsabhängig (präsynaptisch)spannungsabhängig (präsynaptisch)

ligandenabhängig (postsynaptisch)ligandenabhängig (postsynaptisch)

Klassifizierung von Ionenkanälen

GatingGating

• 2 Zustände von Ionenkanälen: offen 2 Zustände von Ionenkanälen: offen u. geschlossenu. geschlossen

• Energie für Konformationsänderung Energie für Konformationsänderung stammt bei den spannungsabh. stammt bei den spannungsabh. Kanälen aus der Änderung der Kanälen aus der Änderung der MembranspannungMembranspannung

• Kaskade von Kaskade von KonformationsänderungenKonformationsänderungen

Aktivierung <-> Aktivierung <-> DeaktivierungDeaktivierung

1.1. Übertragung der Energie auf Übertragung der Energie auf Spannungssensor des Spannungssensor des KanalsKanals

2.2. Bewegung des Sensors im Bewegung des Sensors im elektrischen Feldelektrischen Feld

3.3. Konsequenz: weitere Konsequenz: weitere Konformationsänderungen Konformationsänderungen im Kanalim Kanal

Resultat: Öffnung der PoreResultat: Öffnung der Pore

In NaIn Navv-Kanälen geschieht dies in weniger als einer Millisekunde, -Kanälen geschieht dies in weniger als einer Millisekunde, bei Kbei Kvv-Kanälen dauert es deutlich länger: 10 bis ungefähr 70 ms.-Kanälen dauert es deutlich länger: 10 bis ungefähr 70 ms.

Kanalinaktivierung (N-Typ)Kanalinaktivierung (N-Typ)

• bei Nabei Navv-Kanälen und bei einigen K-Kanälen und bei einigen Kvv--Kanälen (A-Typ-Kanäle)Kanälen (A-Typ-Kanäle)

• führt zur Unterbrechung des Ionenstromsführt zur Unterbrechung des Ionenstroms• Innerhalb weniger Millisekunden nach Innerhalb weniger Millisekunden nach

AktivierungAktivierung

Weitere MechanismenWeitere Mechanismen

C-Typ-Inaktivierung:C-Typ-Inaktivierung:- Beruht auf Beruht auf

Konformationsänderungen im Konformationsänderungen im Bereich des SelektivitätsfiltersBereich des Selektivitätsfilters

- unabh. aber beschleunigt durch N-unabh. aber beschleunigt durch N-Typ-InaktivierungTyp-Inaktivierung

- besonders langsame Rückreaktionbesonders langsame Rückreaktion

RuhepotentialRuhepotential

• Nahe beim Gleichgewichtspotential für Nahe beim Gleichgewichtspotential für Kalium: -70 mVKalium: -70 mV

• Leitfähigkeit für Kalium über KLeitfähigkeit für Kalium über Kirir-Kanäle oder -Kanäle oder 2-P-Domänen Kaliumkanäle sichergestellt2-P-Domänen Kaliumkanäle sichergestellt

AktionspotentialAktionspotential

I: InitiationsphaseI: Initiationsphase

II: DepolarisationII: Depolarisation

IIa: AufstrichIIa: Aufstrich

IIb: OvershootIIb: Overshoot

III: RepolarisationIII: Repolarisation

IV: Nachhyperpolarisation IV: Nachhyperpolarisation

Transiente Änderung des Membranpotentials, Transiente Änderung des Membranpotentials, ausgelöst durch einen Reiz, der die Zelle über ausgelöst durch einen Reiz, der die Zelle über einen Schwellenwert hinaus depolarisiert.einen Schwellenwert hinaus depolarisiert.

DepolarisationDepolarisation• Stimulus depolarisiert Membranpotential Stimulus depolarisiert Membranpotential

bis zum Schwellenwertbis zum Schwellenwert

• Spannungsabhängige Natriumkanäle (NaSpannungsabhängige Natriumkanäle (Navv) ) öffnen sich, Naöffnen sich, Na++ strömt in die Zelle strömt in die Zelle

• KKirir-Kanäle (o. Ä.) werden inaktiviert-Kanäle (o. Ä.) werden inaktiviert

RepolarisationRepolarisation

• Inaktivierung der NaInaktivierung der Navv-Kanäle-Kanäle

• Öffnen der KÖffnen der Kvv-Kanäle-Kanäle

NachhyperpolarisationNachhyperpolarisation

• CaCa2+2+-abhängige -abhängige KaliumkanäleKaliumkanäle

• Konzentration wird Konzentration wird mit der Zeit gesenktmit der Zeit gesenkt

alternatives Gatingalternatives Gating

Ionenkanäle können durch versch. Ionenkanäle können durch versch. Signale geöffnet bzw. verschlossen Signale geöffnet bzw. verschlossen werden:werden:

- intrazelluläre Messengerintrazelluläre Messenger- ProteineProteine- mechanische Spannungmechanische Spannung- Wärme/KälteWärme/Kälte- kleinmolekulare Porenblockerkleinmolekulare Porenblocker

Intrazelluläre MessengerIntrazelluläre Messenger

• ATP an 2-Segment-Kalium-Kanälen (A)ATP an 2-Segment-Kalium-Kanälen (A)• cAMP und cGMP an HCN- und CNG-Kanälen (B)cAMP und cGMP an HCN- und CNG-Kanälen (B)

Andere über: pH, oder CaAndere über: pH, oder Ca2+2+

HCN-KanäleHCN-Kanäle

• nicht-selektive Kationenkanälenicht-selektive Kationenkanäle

• verantwortlich für Iverantwortlich für Ihh-Strom-Strom

• Langzeitbahnung der synapt. Antworten, Langzeitbahnung der synapt. Antworten, Ausschüttung von Neurotransmittern Ausschüttung von Neurotransmittern über mehrere Stundenüber mehrere Stunden

• Initiieren LangzeitbahnungInitiieren Langzeitbahnung

physikalische Faktorenphysikalische Faktoren

• Umgebungsqualitäten (Kälte, Wäreme, Umgebungsqualitäten (Kälte, Wäreme, mechanische Zugkraft und Osmolarität) mechanische Zugkraft und Osmolarität) können in Kanalgating umgesetzt können in Kanalgating umgesetzt werden.werden.

-> hierfür verantwortlich: TRP-Kanäle-> hierfür verantwortlich: TRP-Kanäle

Nichtleitende Funktionen Nichtleitende Funktionen

spannungsabhängiger Ionenkanäle spannungsabhängiger Ionenkanäle

GliederungGliederung- Einführung: altes und neues Verständnis

- Kaliumkanäle

- Natriumkanäle

- Calciumkanäle

- TRP – Kanäle

- Nichtleitende Funktionen von Ionenkanälen und Krankheiten

- Fazit

- primäre Funktion spannungsabhängiger Ionenkanäle: Erzeugung verschiedener Typen von Feuermustern für Informationsprozessierung und motorische Outputs

- Modulierbarkeit (enzymatisch) ermöglicht Anpassung elek- trischer Eigenschaften des Neurons an die Inputsituation

Diese Modulation wird üblicherweise als einseitiger Prozess betrachtet, bei welchem die Ionenkanäle als passive Elemente verändert werden

Einführung: altes und neues Verständnis

- aktuell (bis Okt. 2006) :

Hinweise auf direkte Beeinflussung biochemischer Ereignisse in Zellen durch Ionenkanäle ohne (direkte) Notwendigkeit der leitenden Funktion als Ionenkanal

- direkte Aktivierung von Enzymen intrazellulärer Signalwege

- Funktion als Adhäsionsmoleküle oder Komponenten des Cytoskelettes

- Regulation der Expression bestimmter Gene

methodische Grundlagen und Ergebnisse zitierter Studien :

- Deletion (/Knockout) / Überexpression / Transfektion verändert Zelleigenschaften auf Arten, die nicht durch bloße Veränderung der Erregbarkeit erklärt werden können

- Untersuchungen mit nichtleitenden Mutanten

gleiche Effekte

- vom Ionenfluss unabhängige Funktionen bestimmter Untereinheiten gefunden

Kaliumkanäle

-erhöhte Expression / Aktivität in Tumorzellen

Hinweis auf Zell-regulative Funktionen

- Transfektion in Gliazellen / nicht- neuronale Zellen :

Initiierung / Beschleunigung der Zellproliferation

These: direkter Einfluss auf cytoplasmatische und nukleare Signalwege

Kv10.1 K+ - Kanal (EAG)

- bisher als weitgehend typisch für synaptische Enden von Neuronen betrachtet

- Drosophila melanogaster mit eag – knockout :

Habituation und assoziatives Lernen verändert

Besondere Eigenschaften der cytoplasmatischen Domänen:

- Drosophila: EAG bindet eine Kinase (CaMKII; α- UE), was zu deren konstitutiver Aktivierung führt

- (C)- Terminus : nuclear localization signal

- (N) – Terminus: PAS – Domäne (bei anderen Proteinen regulativer Einfluss auf Transkription und Proteinkinase Aktivität)

Beteiligung des Spannungssensors an regulativen Einflüssen:

- Beeinflussung der Aktivität des Signalweges der Mitogen-aktivierten Proteinkinase (MAPK)

- Transfektionsexperimente mit Fibro- / Myoblasten:

Erhöhung von Zelldichte und DNA –Synthese unter

gesteigerter Aktivität der p38 MAPK; unabhängig von der Leitfähigkeit des EAG, aber abhängig von Gating – Zustand des Kanals !

Einfluss des Gatingzustandes auf regulative Funktionen des EAG - Kanals

- Verwendung von Mutanten, bei welchen die Spannungsab- hängigkeit der Aktivierung in den Bereich negativer Potentiale verlagert ist

Kanal dauerhaft geöffnet

- Folge : Blockade des proliferativen Effekts

EAG Kanal muss sich zur Aktivierung der p38MAPK im geschlossenen Zustand befinden [Beleg für die Unabhängigkeit des Effekts vom Ionenfluss !]

Kv1.3 - Kanal- u.a. im Hippocampus und bulbus olfactorius exprimiert

- besondere Eigenschaft: zeigt bei wiederholter Depolarisation kumulative Inaktivierung (K+ - Kanäle: Repolarisation )

zeitliche Ausdehnung von AP; erhöhte Erregbarkeit bei wiederholter Stimulation des Neurons

Effekte der Aktivität des KV1.3 – Kanals auf Zellproliferation

-in Transfektionsexperimenten vom Ionenstrom durch den Kanal abhängig gewesen ! (Porenmutanten /K+-Ionophore)

-In vivo – Hinweise : neben Beeinflussung des Membranpo- tentials und K+ - Strom weitere Aspekte relevant

- deutlich erhöhte Level von Signalmolekülen im bulbus olfactorius

Experimente mit Kv1.3 knockout - Mäusen

- niedrigere Konzentrationsschwelle für das Entdecken von Duftstoffen

- erhöhte Fähigkeit zur Unterscheidung verschiedener Duftstoffe

- diese Effekte traten nicht beim Eliminieren anderer K+ - Kanäle auf Ursache nicht auf bloße Veränderung der Membran- erregbarkeit beschränkt

möglicher Mechanismus des spannungsunabhängigen Effektes :

- Kv1.3 in intakten Zellen eng mit β – Integrinen assoziiert

- diese regulieren Zell –Zell- Interaktionen, Zellwachstum und -überleben

- spezifische Kv1.3 – Blocker heben die Assoziation mit Integrinen auf

Kv1.3 – Aktivität trägt vermutlich direkt zur Integrin – Regulation bei

Koordination neuronaler Erregbarkeit

- Koordination der Expression von Genen für Kanäle bis dato ungeklärt

aktuelle Studien :

- Expressionslevel von Kv4 – Kanälen beeinflusst Expression eines anderen Kanals; dieser Effekt könnte vom Ionenfluss unabhängig sein

- genauer Mechanismus noch unklar

Enzymatische Aktivität der β – Untereinheiten von Kv - Kanälen

- neben Assoziation von Kinasen (EAG;α- UE) häufig Bindung zusätzlicher Untereinheiten gefunden

- einige dieser zusätzlichen UE zeigen enzymatische Aktivität

- möglicherweise vermitteln sie einige der Effekte von K+ - Kanälen auf zelluläre Signalwege

Bsp.: Familie des K+ - Channel interacting protein (KChIP1-4)

- direkte Bindung an Kv4 α – UE, welche schnell inaktivierende A-Typ Kaliumauswärtsströme erzeugen

Beeinflussung von Amplitude und Kinetik der Kv4 – Inaktivierung durch KChIP1-4

- ferner Funktion als Ca2+ -bindende Regulatoren von Presenilinen (membranintegrale Spaltenzyme) und Ca2+ - abhängige Transkriptionsfaktoren

Zusammenfassung: nichtleitende Funktionen von K+ - Kanälen

- direkter Einfluss auf cytoplasmatische und nukleare Signalwege

- Effekte auf Signalübertragung können z.B. vom Gatingzustand abhängen

- Effekte beeinflussen perzeptuelle / kognitive Fähigkeiten durch Regulation verschiedener zellulärer Prozesse und können darüber hinaus Ausbruch von Krankheiten begünstigen

Na+ - Kanäle

Na+ - Kanal β – Untereinheiten als Adhäsionsmoleküle

- CAMs (Cell Adhesion Molecules) mit kurzem cytoplasma- tischem C – Terminus und langen extrazellulären Domänen

-vermitteln Zell – Zell – Adhäsion durch homo- oder hetero- typische Interaktionen und Interaktionen mit Molekülen der extrazellulären Matrix

- an der cytoplasmatischen Seite Bindung an Proteine, welche ihrerseits mit dem Cytoskelett verbunden sind (Ankyrin G undB)

β – Untereinheiten ermöglichen Na+ - Kanälen eine physikalische Verbindung des Cytoskeletts mit der Oberfläche von Nachbarzellen

- vermutlich trägt diese Interaktion zur Ausbildung von Axonhügeln und Ranvier´schen Schnürringen bei (hohe Dichte von Na+ - Kanälen)

- β1 – Untereinheiten können das Wachstum von Neuriten bei dissoziierten Neuronen stimulieren

- β2 – Untereinheiten dagegen können die Länge von Neuriten durch einen Effekt reduzieren, der durch α- oder β1- Unter- einheiten aufgehoben werden kann

Einflüsse der Untereinheiten auf das Wachstum von Neuriten

nicht- leitende Funktionen von Na+ - Kanälen könnten wichtige organisatorische Elemente der neuronalen Entwicklung sein

Regulation von β –Untereinheiten der Na+ - Kanäle via Spaltung

- β –Untereinheiten werden kontinuierlich durch proteolytische Spaltung umgesetzt

- möglicherweise reguliert Spaltung der extrazellulären und anschließend der (C) – terminalen Domäne die Beteiligung der β2 – Untereinheit an Prozessen der Zelladhäsion und -migration

CaCa2+2+-Kanäle-Kanäle

• CaCa2+2+-Kanäle wohl am engsten -Kanäle wohl am engsten verschränkt mit zellulären verschränkt mit zellulären EreignissenEreignissen

• Wie kann es sein, dass versch. Wie kann es sein, dass versch. Wege der Wege der Konzentrationserhöhung von Konzentrationserhöhung von CaCa2+2+, verschiedene Effekte auf , verschiedene Effekte auf die Zelleigenschaften haben?die Zelleigenschaften haben?

• Beispiel: Aktivierung des CaBeispiel: Aktivierung des Ca2+2+--Einstroms durch L-Typ CaEinstroms durch L-Typ Ca2+2+--Kanäle der CaKanäle der Cavv-Familie, aktiviert -Familie, aktiviert die MAPK-ERK-Signalkaskade. die MAPK-ERK-Signalkaskade. Dadurch wird CREB, ein Dadurch wird CREB, ein Transkriptions-faktor aktiviert.Transkriptions-faktor aktiviert.

• elektromech. Kopplung in elektromech. Kopplung in SkelettmuskelzellenSkelettmuskelzellen

• Signal unabhängig vom IonenflussSignal unabhängig vom Ionenfluss• phys. Verbindung des Caphys. Verbindung des Ca2+2+-Kanals mit -Kanals mit

Ryanodin-RezeptorRyanodin-Rezeptor

-> Reaktion als Kanal, aber auch als -> Reaktion als Kanal, aber auch als Spannungssensor für Ryanodin-RezeptorSpannungssensor für Ryanodin-Rezeptor

• außerdem: Verbindung zwischen Caaußerdem: Verbindung zwischen Ca2+2+--Kanälen und dem Exocytose-KomplexKanälen und dem Exocytose-Komplex

• Interaktion mit SNARE-ProteinenInteraktion mit SNARE-Proteinen

-> enge Verbindung zwischen Vesikeln -> enge Verbindung zwischen Vesikeln und den Kanälenund den Kanälen

• Hinweise, dass die physikalische Verbindung Hinweise, dass die physikalische Verbindung Informationen über den Zustand der Kanäle Informationen über den Zustand der Kanäle zur release site übertragen kannzur release site übertragen kann

• Ausschüttung von Neurotransmittern Ausschüttung von Neurotransmittern unabhängig vom Caunabhängig vom Ca2+2+-Einstrom -Einstrom

• Depolarisation der Membran führt zur Depolarisation der Membran führt zur Konformationsänderung im Kanal und einer Konformationsänderung im Kanal und einer Änderung der Aktivität der SNARE-ProteineÄnderung der Aktivität der SNARE-Proteine

• Effekt kann verhindert werden durch Effekt kann verhindert werden durch intrazelluläre Blockade der Bindung zwischen intrazelluläre Blockade der Bindung zwischen CaCavv2.1-Kanälen und den SNARE-Proteinen2.1-Kanälen und den SNARE-Proteinen

TRP-KanäleTRP-Kanäle

• nicht-selektive Kationenkanälenicht-selektive Kationenkanäle• Einstellung des Ruhemembranpotentials, Einstellung des Ruhemembranpotentials,

regulieren Konzentrationen von Caregulieren Konzentrationen von Ca2+2+ und und MgMg2+2+ in Neuronen und anderen Zellen in Neuronen und anderen Zellen

• Überexpression in KrebszellenÜberexpression in Krebszellen

• TRP-Kanäle sind eingeteilt in sechs TRP-Kanäle sind eingeteilt in sechs UnterfamilienUnterfamilien

• TRPP1 & 2 unterdrücken TRPP1 & 2 unterdrücken ZellproliferationZellproliferation

• In TRPM gibt es längere cytoplasmat. In TRPM gibt es längere cytoplasmat. C-terminale Domänen als in den C-terminale Domänen als in den anderen Unterfamilienanderen Unterfamilien

Proteinkinaseaktivität bei TRPM6 & Proteinkinaseaktivität bei TRPM6 & 7 (einzige Kanäle mit enzymatischer 7 (einzige Kanäle mit enzymatischer Aktivität in einer porenbildenden Aktivität in einer porenbildenden --UE)UE)

Nichtleitende Funktionen von Ionenkanälen und Krankheiten

- Mutationen an Genen bestimmter Ionenkanäle können über Veränderung der nichtleitenen Funktionen zu Veränderungen der Intrazellulären Signalwege… führen

diese führen schließlich zu Veränderungen in der Organisation des Nervensystems

- Beispiele: Chorea Huntington (Na+ - Kanäle), Schizophrenie (K+ - Kanäle)

FazitFazit

- Verständnis von nichtleitenden Funktionen spannungsab- hängiger Ionenkanäle und deren Bedeutung immer noch begrenzt

- trotz einiger klarer Beispiele insbesondere Kopplung an Signalwege noch unklar

- konzeptionelles Problem:

In vielen Fällen könnte ein Ionenfluss für den biotischen Effekt nötig sein

- Funktionen nichtleitender Eigenschaften von Ionenkanälen könnten die Vielzahl an Genen (beachte ferner posttran- skriptionale Modifikationen) für Ionenkanalproteine, die Vielzahl von Kanälen mit geringen elektrischen Eigen- schaften und das hohe Maß an Konservierung der Gene erklären