Lepisosteus oculatus - staff.uni-mainz.de FII... · Einleitung _____ - 2 - 1.2 Das Cytoskelett der...

Johannes Gutenberg Universität Mainz

Fachbereich Biologie

Institut für Zoologie

Abteilung 2: Molekulare Tierphysiologie

Arbeitsgruppe Prof. Dr. Jürgen Markl

Betreuer: Dr. Michael Schaffeld

Protokoll zum FII-Praktikum vom 06.03. – 07.04.2006

zum Thema:

Gewebsspezifische Intermediärfilamentexpression bei

Lepisosteus oculatus.

Inhaltsverzeichnis

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Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung ..........................................................................................................................1

1.1 Der Stammbaum der Wirbeltiere ..............................................................................1 1.2 Das Cytoskelett der Vertebratenzelle .......................................................................2 1.3 Bildung und Klassen der Intermediärfilamente .........................................................2 1.4 Das Versuchstier: Lepisosteus osseus.....................................................................3

1.4.1 Systematische Einordnung ...................................................................................4 1.4.2 Verwendetes Versuchsmaterial ............................................................................4

1.5 Ziel des Praktikums ..................................................................................................4 2 Material und Methoden .....................................................................................................6

2.1 Antikörper .................................................................................................................6 2.1.1 Antikörper gegen Keratine ....................................................................................6 2.1.2 Antikörper gegen Vimentin und Desmin ...............................................................6 2.1.3 Sekundärantikörper ..............................................................................................6

2.2 Immunfluoreszenzmikroskopie .................................................................................7 2.2.1 Herstellung der Gefrierschnitte .............................................................................7 2.2.2 Inkubation mit Antikörpern und Einbettung...........................................................7 2.2.3 Mikroskopie...........................................................................................................8

2.3 IF-Präparation...........................................................................................................8 2.4 SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (eindimensional)...........................................9 2.5 2 D Elektrophorese.................................................................................................12

2.5.1 1. Dimension: Isoelektrische Fokussierung ........................................................12 2.5.2 Zweite Dimension: SDS-PAGE...........................................................................14

2.6 Western Blot ...........................................................................................................14 2.7 Färbung der Blots mit Antikörpern (Immunoblot)....................................................16

3 Ergebnisse ......................................................................................................................18 3.1 Immunfluoreszensmikroskopie ...............................................................................18

3.1.1 Fettgewebe .........................................................................................................18 3.1.2 Verdauungstrakt .................................................................................................19 3.1.3 Flosse .................................................................................................................22 3.1.4 Kieme..................................................................................................................23 3.1.5 Herz ....................................................................................................................24 3.1.6 Haut ....................................................................................................................25 3.1.7 Leber und Gallenblase........................................................................................26 3.1.8 Milz .....................................................................................................................28 3.1.9 Geruchsorgan .....................................................................................................29

3.2 Biochemische Methoden ........................................................................................31

Inhaltsverzeichnis

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3.2.1 Konzentrationsbestimmung der IF-Präparate anhand von SDS-Gelektrophorese

31 3.2.2 2D–Gelelektrophorese........................................................................................32 3.2.3 Immunoblots .......................................................................................................34

4 Diskussion.......................................................................................................................41 5 Literatur ...........................................................................................................................44

Einleitung

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1 Einleitung

1.1 Der Stammbaum der Wirbeltiere

Am Anfang der Wirbeltierevolution steht die Aufspaltung in die Agnatha, die kieferlosen

Wirbeltiere, und die Gnathostomata, die einen Kieferapparat besitzen. Zu den Agnatha zählt

man die Schleimaale (Myxinoida) und die Neunaugen (Petromyzonta). Die Agnatha bilden

keine monophyltische Gruppe. Dem gegenüber stehen die monophyletischen,

kiefertragenden Gnathostomata, die über zwei Extremitätenpaare verfügen. Im Stammbaum

der Gnathostomata spalten sich als erstes die Knorpelfische (Chondrichthyes) ab. Danach

kommt es zur Abspaltung der Strahlenflosser (Actinopterygii), der Quastenflosser

(Crossopterygii) und der Lungenfische (Dipnoi). Die letzten drei Klassen werden als

Knochenfische (Osteichthyes) den Knorpelfischen gegenüber gestellt. Die restlichen

Gnathostomata gehören zu den Tetrapoda. Zu Ihnen gehören die Lurche (Amphibia) und die

Amnioten. Letztere umfassen die Säugetiere (Mammalia), Schildkröten (Testudines),

Lepidosauria (Echsen, Schlangen und Brückenechsen), Krokodile (Crocodylia) und die Vögel

(Aves).

Abb. 1: Stammbaum der Wirbeltiere

Einleitung

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1.2 Das Cytoskelett der Vertebratenzelle

Für die mechanische Stabilität, Motilität und Formgebung der Vertebratenzelle ist das

Cytoskelett verantwortlich. Es besteht aus drei Typen von Filamenten, nämlich den

Aktinfilamenten (Ø 4-6 nm), den Mikrotubuli (Ø 20-25 nm) und den Intermediärfilamenten

(IF), die mit einem Durchmesser von 8-16 nm zwischen den beiden anderen Typen liegen.

Die Aktinfilamente sind Polymere, die aus globulären α-, β- und γ-Monomeren aufgebaut

sind. Sie unterliegen in den Zellen einem stetigen Auf- und Abbau und sind für Bewegungs-

und Transportvorgänge wie Zellmotilität, Kontraktion, Zelladhäsion und Stofftransporte

zuständig. Die Mikrotubuli werden aus den globulären α- und β-Tubulinmonomeren

aufgebaut und sind in der Zelle meist mit Kinesinen und Dyneinen assoziiert. Auch sie

dienen in erster Linie den Transport- und Bewegungsvorgängen der Zelle, wie zum Beispiel

dem Transport von Organellen oder der Bewegung von Cilien.

Die Intermediärfilamente sind Dimere und werden aus vielen verschiedenen α-helikalen

Monomeren gebildet. Sie zeigen im Gegensatz zu den anderen Filamenttypen eine hohe

Diversität. Ihre Expression ist gewebsspezifisch und abhängig von der Zelldifferenzierung.

Das Netzwerk der Intermediärfilamente durchzieht die ganze Zelle vom Zellkern bis zur

Cytoplasmamembran und dient sowohl der Zellstabilität und Formgebung als auch der

Zugfestigkeit der Zelle. Außerdem interagieren die Intermediärfilamente mit den

Desmosomen, verschiedenen Proteinen und cytoplasmatischen Strukturen und sind

wahrscheinlich auch an Signaltransduktionsprozessen beteiligt.

1.3 Bildung und Klassen der Intermediärfilamente

Zur Bildung der Intermediärfilamente lagern sich zwei helicale

Intermediärfilamentproteinmonomere parallel zusammen und bilden ein superhelicales

„coiled-coil“ Dimer. Danach lagern sich zwei Dimere leicht versetzt zu einem Tetramer

zusammen. Aus mehreren Tetrameren bilden sich die Protofilamente, die wiederum zu

Protofibrillen aggregieren. Abschließend lagern sich zwei bis sechs Protofibrillen zu einem

Intermediärfilament zusammen.

Die Intermediärfilamente werden bei den Vertebraten aufgrund von Sequenzähnlichkeiten

ihrer DNA in sechs verschiedene Klassen eingeteilt:

I. Keratine

II. Keratine

III. Desmin, Vimentin, Peripherin, Saures Gliafilament Protein (GFAP), Plasticin

IV. Neurofilament (NF) Proteine

V. Lamine (Gruppen A,B und C)

VI. Nestin

Einleitung

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Die Gruppen I und II der Intermediärfilamente werden von den Keratinen gebildet und sind

die größten Gruppen. Die Intermediärfilamentheterodimere werden stets durch

Zusammenlagerung von einem Typ I Keratin mit einem Typ II Keratin gebildet. Eine weitere

Unterteilung der Gruppen I und II wird durch die gewebsspezifische Expression der Keratine

möglich. Keratine, die in Zellen einschichtiger Epithelien vorkommen (z.B. Darmmukosa),

werden als „S“-Keratine bezeichnet, während solche, die in mehrschichtigen Epithelien wie

der Epidermis vorkommen, „E“-Keratine genannt werden. Damit wird eine weitere

Aufgliederung der Typen I und II in IS, IE, IIS und IIE möglich.

Die Typ III Intermediärfilamentproteine bilden im Gegensatz zu den Keratinen fast

ausschließlich Homodimere. Desmin ist für die Stabilität der Muskelzellen verantwortlich und

findet sich dementsprechend ausschließlich im Muskelgewebe. Vimentin findet sich fast

ausschließlich in mesenchymalen Zellen und ist typisch für z.B. Endothelzellen.

Da die Versuche des Praktikums sich ausschließlich mit den Typen I, II und III der

Intermediärfilamente beschäftig haben, werden die Typen IV – VI hier nicht weiter erläutert.

1.4 Das Versuchstier: Lepisosteus osseus

Der gefleckte Knochenhecht (Lepisosteus

oculatus) gehört zu der sehr ursprünglichen

Familie der Lepisosteidae (Knochenhechte oder

Kaimanfische), die sich im Laufe der Evolution

schon sehr früh von den Knochenfischen

abgespalten haben. Heute existieren nur noch

acht verschiedene Arten. Die Gestalt der

Knochenhechte ist schlank und langgestreckt.

Sie verfügen über eine lange Schnauze aus

kräftigen, mit vielen Zähnen besetzten, Kiefern.

Der Körper ist mit rautenförmigen sich nicht

überlappenden Schuppen bedeckt, die durch eine schmelzartige Substanz verstärkt werden.

Die Schuppenschicht bildet einen harten Panzer, der den Körper schützt. Die

Knochenhechte sind Raubfische und unauffällig grünlich-silbrig gefärbt. Sie besitzen eine

Schwimmblase, die als lungenähnliches Hilfsorgan für die Atmung ausgebildet ist. Ein

Überleben der Fische in fast völlig ausgetrockneten Gewässern wird so ermöglicht. Der

gefleckte Knochenhecht ist ausschließlich in Florida und in den Tieflandgebieten Georgias

verbreitet. Er wird bis zu 180 cm lang und 30 kg schwer.

Abb. 2: Lepisosteus oculatus

Einleitung

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1.4.1 Systematische Einordnung

Abteilung: Bilateralia

Unterabteilung: Deuterostomia

Stamm: Chordata

Unterstamm: Gnathostomata

Klasse: Knochenfische (Osteichthyes)

Unterklasse: Strahlenflosser (Actinopterygii)

Überordnung: Knochenganoiden (Holostei)

Familie: Lepisosteidae

Gattung: Lepisosteus

Art: oculatus

1.4.2 Verwendetes Versuchsmaterial

Im Vorfeld wurde ein Tier getötet und direkt präpariert. Die Gewebeproben wurden

entnommen und separat bei -80°C eingefroren. Sowohl für die biochemischen Versuche als

auch für die Immunfluoreszensmikroskopie wurden die bei -80°C gelagerten Gewebestücke

verwendet.

1.5 Ziel des Praktikums

Die terrestrischen Tetrapoden exprimieren Keratine (Typ I und II) ausschließlich in

epithelialen Geweben. In mesenchymalen Geweben übernimmt das Typ III IF Vimentin die

Bildung des IF-Netzes. Das Typ III IF Desmin ist ausschließlich in Muskelzellen lokalisiert.

Bei Teleosteern findet man die Typ I und II Keratine nicht nur in den Epithelien, sondern

auch in mesenchymalen Zellen. Dafür ist das Vimentin nur noch auf wenige Zelltypen

beschränkt. Dieses besondere Expressionsmuster der Intermediärfilamente ist nur bei den

Knochenfischen zu finden. Unklar ist allerdings, wann in der Evolution der Knochenfische

diese Art der Intermediärfilament Expression entstanden ist. Um diese Frage zu klären,

wurden verschiedene Tierklassen auf ihre IF-Expression untersucht. Beim Neunauge

(Petromyzonta), das im Stammbaum der Vertebraten basal steht, findet man eine ähnliche

Expression wie bei den Tetrapoden. Keratine sind epithelial ausgeprägt und Vimentin findet

sich in mesenchymalen Geweben. Der Flösselhecht (Flössler; Polypterii), der zu den

Strahlenflossern gehört, stellt eine ursprüngliche Ordnung der Knochenfische dar. Auch bei

ihm ist das Expressionsmuster der Keratine wie bei den terrestrischen Tetrapoden

Einleitung

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ausgeprägt. Des Weiteren wurde ein Stör (Knorpelganoiden; Chondrostei) untersucht, bei

dem im mesenchymalen Gewebe wahrscheinlich eine Coexpression von Keratinen und

Vimentin vorliegt (Haberkamp, 2002).

Da aber bisher immer noch keine definitive Übergangsform zwischen der Keratinexpression

der Teleosteer und der der restlichen Vertebraten gefunden werden konnte, wird jetzt mit

dem Knochenhecht (Neuflosser; Neopterygii) ein sehr ursprünglicher Vertreter der

Knochenfische auf seine gewebsspezifische IF-Expression hin untersucht. Eventuell kann

die Analyse der mesenchymalen IF-Expression beim Knochenhecht bei der Klärung der

Frage nach der Entstehung der speziellen Teleosteer IF- Expression helfen.

Im Praktikum wurden verschiedene Gewebe des Knochenhechtes mit

immunfluoreszensmikroskopischen und biochemischen Methoden auf ihre IF-Expression hin

untersucht. Der Fokus wurde dabei auf die IF der Typen I, II und III gelegt.

Abb. 3: Stammbaum der Strahlenflosser (Actinopterygii)

Material und Methode

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2 Material und Methoden Änderungen zu den hier beschriebenen Methoden werden im Kapitel 3 direkt unter den

entsprechenden Ergebnissen angegeben.

2.1 Antikörper

2.1.1 Antikörper gegen Keratine

Antikörper Subklasse Antigen

164,4 mK / IgG 1 xK 1/8

68,4 mK / IgG 1 xK 18

C04 mK / IgG 1 hK 18

GPT5 Meerschweinchen S-Keratine

79,14 mK / IgG 1 xK 1/8

K19 mK / IgG 1 hK 19

2.1.2 Antikörper gegen Vimentin und Desmin

Antikörper Subklasse Antigen

14,13 mK / IgG1 Xenopus Vimentin

XV1-4 Meerschweinchen Xenopus Vimentin

D33 mK / IgG1 Human Desmin

DES Rabbit IgG1 Huhn Desmin

2.1.3 Sekundärantikörper

Antikörper

Ziege-anti-Maus Texas Red

Ziege-anti-Maus Cy2

Ziege-anti-Maus Alkalische Phosphatase

Maus-anti-Rabbit Texas Red

Ziege-anti-Meerschweinchen Texas Red

Ziege-anti-Meerschweinchen Alkalische Phosphatase


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2.2 Indirekte Immunfluoreszenzmikroskopie

2.2.1 Herstellung der Gefrierschnitte

Die Gewebe, die bei -80°C in Isopentan gelagert wurden, werden am Gefriermikrotom in

5µm dicke Objekte geschnitten und auf vorher mit Petrolether gereinigte Objektträger

überführt. Die Objektträger werden mit dem Versuchstier, dem Gewebe und dem Datum des

Schnittes beschriftet. Später erfolgt zusätzlich die Beschriftung mit dem verwendeten

Antikörper.

Die Schnitte werden nun für mindestens eine Stunde oder sogar über Nacht getrocknet.

2.2.2 Inkubation mit Antikörpern und Einbettung

Die Schnitte werden danach in eiskaltem Aceton für 10 Minuten fixiert und getrocknet.

Danach werden sie eine Stunde mit dem Primärantikörper inkubiert, der zuvor in PBS

entsprechend verdünnt wurde. Je Objekt werden ungefähr 25 µl Antikörper eingesetzt. Die

Inkubation erfolgt in einer feuchten Kammer.

Die Objekte werden danach dreimal für 5 Minuten in PBS gewaschen.

Der Sekundärantikörper wird 1:200 verdünnt, mit Höchstfarbstoff („DAPI“) 1:1000 versetzt

und für 3 Minuten zentrifugiert. Je Objekt werden ungefähr 25 µl Antikörper eingesetzt und

für eine Stunde inkubiert.

Danach erfolgen drei fünfminütige Waschschritte in PBS. Die Objekte werden eine Minute in

destilliertem Wasser gewaschen und danach für 5 Minuten in 100% Ethanol entwässert. Die

Schnitte werden getrocknet und mit Elvanol unter einem Deckglas eingebettet.

Petrolether

Aceton

PBS (Phosphate Buffered Saline) 140 mM NaCl

2,7 mM KCl

8,1 mM Na2HPO4 x 2 H2O

1,5 mM KH2PO4

100% Ethanol

Antikörper siehe Kapitel 2.1

Elvanol


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2.2.3 Mikroskopie

Die Objekte wurden mit dem Fluoreszenzmikroskop von Leitz mit einer 250 fachen

Vergrößerung unter Ölimmersion betrachtet. Es wurden Phasenkontrast- und

Fluoreszenzaufnahmen gemacht, wobei letztere unter Zuhilfenahme einer

Quecksilberhöchstdrucklampe gemacht wurden. Das Photographieren erfolgte über eine

Digitalkamera von Leitz, deren Bilder direkt auf Festplatte gespeichert wurden. Die

Belichtungszeit wird für die unterschiedlichen Bilder individuell gewählt, bleibt jedoch für die

entsprechenden Aufnahmenarten mit wenigen Ausnahmen gleich.

2.3 IF-Präparation

Für die Präparation der Intermediärfilamente werden ca. 1cm2 große Gewebestücke

verwendet, die bei -80°C in Isopentan gelagert wurden.

Da sich Intermediärfilamente nicht in nicht-ionischen Detergenzien, z.B. Triton X 100, lösen

und zudem eine schlechte Löslichkeit in Hochsalzpuffern aufweisen, können diese

Eigenschaften genutzt werden, um sie von den restlichen Gewebebestandteilen zu trennen

und somit aufzureinigen. Die Zugabe von Proteasehemmstoffen zu den Puffern

gewährleistet, dass die Proteine nicht verdaut werden. Auch das ständige Arbeiten auf Eis

verhindert einen Abbau der Filamente.

Das PMSF wird erst kurz vor dem Gebrauch des jeweiligen Puffers zugesetzt. Es werden 7,5

µl/ml Puffer eingesetzt, so dass die Endkonzentration des PMSF 2 mM beträgt.

Das Gewebestück wird in 10 ml gekühlten Niedrigsalzpuffer gegeben und mit einem

Ultraturax homogenisiert. Das Homogenisat wird für 10 Minuten mit 15.000rpm bei 4°C in der

Ultrazentrifuge zentrifugiert.

Der Überstand wird verworfen und das Sediment in 10 ml gekühltem Hochsalzpuffer

aufgenommen und mit dem Ultraturax homogenisiert.

Nach einem weiteren Zentrifugationsschritt (siehe oben) wird das Sediment wiederum in 10

ml gekühltem Hochsalzpuffer aufgenommen, homogenisiert und erneut zentrifugiert. Der

Überstand wird dekantiert, das Sediment in 1 ml TE aufgenommen und in ein 2 ml

Reaktionsgefäß überführt, in das zuvor 1ml TE-Puffer vorgelegt wurde. Es wird nun in einer

vorgekühlten Tischzentrifuge (4°C) mit 13.200rpm für 5 Minuten zentrifugiert. Dieser

Waschschritt wird insgesamt dreimal durchgeführt und das Pellet in 100-200 µl Lysis A

Puffer mit DTT aufgenommen, gevortext und bei -20°C eingefroren.

Niedrigsalzpuffer (10ml) 150 mM NaCl

10 mM Tris/Cl (pH 7,2)

5 mM EDTA

1% Triton X 100


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+ Leupeptin (0,8µl/ml)

+ 2 M Benzamidin (0,5µl/ml)

+ Pepstatin (0,7µl/ml)

Hochsalzpuffer (20ml) 1,5 M KCl

10 mM Tris/Cl (pH 7,2)

5 mM EDTA

1% Triton X 100

+ 16µl Leupeptin

+ 10µl Benzamidin (2 M)

+ 14µl Pepstatin

TE-Puffer (Tris/EDTA; 12ml) 10 mM Tris/Cl (pH 7,2)

5 mM EDTA

+9,6 µl Leupeptin

+ 6µl Benzamidin (2 M)

+ 8,4µl Pepstatin

PMSF (Phenylmethansulfonylfluorid) 66 mg/ml Ethanol (100%)

Lysis A mit DTT 9,5 M Harnstoff

2% Nonidet

25 mM DTT

0,8% Ampholine pH 4-6


0,4% Ampholine 3,5 – 10

25 mM DTT (Dithioteitrol)

Geräte:

Ultraturax

Ultrazentrifuge gekühlt auf 4°C

Tischzentrifuge gekühlt auf 4°C

2.4 SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (eindimensional)

Bei der eindimensionalen SDS-Gelelektrophorese wird eine vertikale Elektrophoresekammer

verwendet. Bei der Gelektrophorese werden die Proteine nach ihrer Größe aufgetrennt.


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Große Proteine wandern wegen der netzartigen Struktur des Polyacrylamids langsamer als

kleine. Zur Bestimmung der Molekülgröße wird in eine Tasche des Gels ein Marker mit

Proteinen bestückt, deren Größe bekannt ist. Somit ist eine Charakterisierung der Banden

der restlichen Proben anhand der Molekülgrößen der Markerproteine möglich. Bei der

Herstellung der Gele wird zuerst das Trenngel hergestellt. APS und TEMED werden erst

kurz vor dem Gießen des Gels zu dem Trenngelpuffer zugegeben. Die mit 0,5%-iger

Agarose und Klebeband abgedichteten Glaskammern werden bis ca. 1,5 cm unter dem

oberen Rand befüllt und das Trenngel mit 100% Ethanol überschichtet (gerade Oberfläche).

Nach Polymerisation wird das Ethanol mit destilliertem H2O entfernt. Danach wird das

Sammelgel gegossen, bei dessen Herstellung APS und TEMED wiederum kurz vor dem

Gießen zugegeben werden. Der Taschenkamm wird danach direkt eingesteckt. Der Kamm

sowie das Klebeband werden erst kurz vor Gebrauch der Gele vorsichtig entfernt und das

Sammelgel mit destilliertem Wasser gespült.

Die Proben werden vor dem Gebrauch gevortext und danach zentrifugiert. Vom Überstand

wird die benötigte Menge mit der Pipette entnommen und mit der gleichen Menge an 2x

Denaturierungspuffer versetzt. Die Proben werden für 5 Minuten auf dem Heizblock bei 95°C

denaturiert, wobei darauf zu achten ist, das in den Deckel des Reaktionsgefäßes vorher ein

Loch gestochen wurde.

Das Gel wird in die Gelkammer eingesetzt und die Kammer mit Elektrophoresepuffer befüllt,

so dass das komplette Gel mit Puffer bedeckt ist. Die Proben werden nun mit einer Pipette in

die Taschen gespritzt. Außerdem wird in eine Tasche der Marker SDS6H gegeben, um

später anhand der Molekülgröße die Banden der Intermediärfilamente zu bestimmen. Die

Elektrophorese wird gestartet. Pro Gel wird für 15 Minuten eine Stromstärke von 15 mA

angelegt und danach auf 25 mA erhöht.

Nachdem der Denaturierungspuffer aus dem Gel gelaufen ist, wird die Elektrophorese

gestoppt, das Gel ausgebaut und die Glasplatten getrennt. Dem Gel wird die rechte untere

Ecke entfernt und das Gel unter ständigem Schütteln für mindestens drei Stunden in

Coomassie-Färbelösung gelegt. Danach kann mit Coomassie-Entfärbelösung die Entfärbung

begonnen werden. Die Entfärbelösung wird oft gewechselt und das Gel für die restliche

Entfärbung in Essigsäure aufbewahrt. Das Ergebnis wird durch eine Photographie

festgehalten.

4x Sammelgelpuffer 0,5 M Tris/HCl (pH 6,8)

0,4% SDS)

Sammelgel ml 4x Sammelgelpuffer

ml Rotiphorese Gel 30 Acrylamidlösung


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µl Ammoniumpersulfat (APS 10%)

µl TEMED(N,N,N´,N´- Tetramethylenethlyendiamin)

ml H2O

4x Trenngelpuffer 1,5 M Tris/HCl (pH 8,8)

0,4% SDS

Trenngel 4x Trenngelpuffer

ml Rotiphorese Gel 30 Acrylamidlsg.

µl APS (10%)

µlTEMED

ml H2O

Denaturierungspuffer (2x)

Elektrophoresepuffer 23 mM Tris

190 mM Glycin

0,2% SDS

SDS6H-Marker Myosion (200.000 Da)

β-Galactosidase (116.000 Da)

Phosphorylase B (97.000 Da)

Rinderserumalbumin (BSA) (66.000 Da)

Ovalbumin, (45.000 Da)

Carbonic anhydrase (29.000 Da)

Coomassie-Färbelösung 0,1% Coomassie Brilliant Blue R250

40% Methanol

7,5% Essigsäure

Coomassie Entfärber 20% Isopropanol

7,5 % Essigsäure (60%)

7,5%-ige Essigsäure

Gelkammer (vertikal)

Netzgerät

Heizblock


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2.5 2 D Elektrophorese

2.5.1 1. Dimension: Isoelektrische Fokussierung

Für die Isoelektrische Fokussierung (1. Dimension) wird die Eigenschaft von Proteinen

ausgenutzt, dass sie über einen Isoelektrischen Punkt (IP) verfügen. Durch zwei

verschiedene Puffer entsteht bei der Isoelektrischen Fokussierung ein stabiler pH-Gradient.

Die Proteine werden durch ihre Nettoladung soweit zur Anode transportiert bis sie ihren IP

erreicht haben. Dort ist ihre Nettoladung „null“, sie wandern nicht weiter und sind somit

fokussiert.

Zur Herstellung der Rundgele werden dünne Glasröhrchen mit einem Fokussierungsgel

gefüllt. Die Glasröhrchen werden dafür unten mit Parafilm abgedichtet und dann das Gel mit

einer Pasteurpipette in die Röhrchen gefüllt und mit destilliertem Wasser überschichtet und

oben ebenfalls mit Parafilm abgedichtet.

Bei der Herstellung des Gels ist zu beachten, dass vor der Zugabe der Ampholine der

Harnstoff bei schwacher Hitzezufuhr vollständig gelöst sein sollte. Die Zugabe von APS und

TEMED erfolgt erst kurz vor dem Gießen.

Die Gele werden dann für 5 Stunden in den Trockenschrank (35°C) gestellt (Polymerisation).

Vor Gebrauch wird der Parafilm entfernt, das Wasser abgegossen und das Gel mit Hilfe

einer Einwegspritze ca. 0,5 cm herausgedrückt und abgeschnitten. Das Gel wird unten mit

Gaze und einem Gummiring abgedichtet und in die Halterung der Gelkammer eingesetzt.

5-20 µl Probe werden mit 2 µl BSA und 1 µl Aktin (beide dienen als Marker) versetzt und

dann mit Lysis A auf 80 µl aufgefüllt. Die Proben werden nun in die Röhrchen pipettiert und

eine Spatelspitze Harnstoff zugegeben. Auf die Proben werden 20 µl Lysis K gegeben und

dann mit Kathodenpuffer bis zum Rand aufgefüllt.

Die gesamte Gelkammer wird mit 0,5%iger Agarose abgedichtet. Danach wird die Kammer

mit Kathoden- und Anodenpuffer befüllt.

Die Gelkammer wird an das Netzgerät angeschlossen und die isoelektrische Fokussierung

vorerst für 10 Minuten mit einer Spannung von 200 V gestartet. Danach wird die Spannung

für weitere 10 Minuten auf 300 V und dann über Nacht auf 400 V erhöht.

Nach Beendigung der isoelektrischen Fokussierung werden die Gele mit Hilfe der

Einwegspritze aus dem Glasöhrchen gedrückt. Dabei ist darauf zu achten, dass das saure

Ende (unteres Ende) zuerst herausgedrückt wird und dann im Uhrzeigersinn abgelegt wird.

Die Rundgele werden für 20 Minuten in O-Puffer äquilibriert, um den Harnstoff und das NP-

40 zu entfernen. Danach werden die Gele entweder bei -20°C eingefroren oder direkt die 2.

Dimension gestartet.


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Rundgele (Fokussierungsgele) 5,7 g Harnstoff

1,33 ml 30% 2D-Acrylamid

2 ml 10 % NP-40 Lösung

2 ml H2O

0,2 ml Ampholine pH 4-6

0,2 ml Ampholine pH 5-7

0,1 ml Ampholine ph 3,5-10

10 µl APS

7 µl Temed

Lysis A-Puffer 9,5 M Harnstoff

2% Nonidet

25 mM DTT



0,4% Ampholine 3,5 – 10

Lysis K-Puffer 6 M Harnstoff

5% Nonidet 40

1% Ampholine 3,5 – 10

Harnstoff

Anodenpuffer 10 mM H3PO4

Kathodenpuffer 20 mM NaOH

O-Puffer 60 mM Tris/HCl

2% SDS

20 mM DTT

10% Glycerin

Markerproteine: Aktin aus Kaninchenmuskel (42.000 Da)

Rinderserumalbumin (BSA; 66.000 Da)

Gelkammer

Netzteil

0,5%ige Agarose


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2.5.2 Zweite Dimension: SDS-PAGE

Die Zusammensetzung der Gele, der Aufbau, sowie das Prinzip der SDS-PAGE wurde in

Kapitel 2.3 beschrieben. Allerdings wurden hier größere Gele benutzt und das Sammelgel

ohne Kamm gegossen. Das Sammelgel reicht bis zum Rand des Schliffs.

Die Rundgele der ersten Dimension werden mit dem basischen Ende links aufgelegt und

dann auf die gesamte Länge ausgerollt. Zur Entfernung der Luftblasen und zur Bestimmung

der Lauffront wird das Rundgel mit O-Puffer-Agarose unterschichtet. Die Gelkammer wird mit

Elektrophoresepuffer gefüllt und die Elektrophorese gestartet. Vorerst erfolgt die

Elektrophorese für 40 Minuten bei einer Stromstärke von 20 mA / Gel und wird danach auf

eine Stromstärke von 40 mA / Gel gesteigert, bis das Bromphenolblau der O-Puffer-Agarose

das Gel durchlaufen hat.

Die Elektrophorese wird danach gestoppt, die Gele freigelegt und die rechte Ecke zur

Kennzeichnung entfernt. Danach wird das Gel in Coomassie-Färbelösung gefärbt (siehe

Kapitel 2.3) oder die Proteine durch Western Blotting auf eine Nitrocellulosemembran

übertragen.

Elektrophoresepuffer 23 mM Tris

190 mM Glycin

0,2% SDS

O-Puffer-Agarose 1% Agarose in O-Puffer

Spatelspitze Bromphenolblau je 40 ml Lösung

Sammelgel siehe Kapitel 2.3

Trenngel siehe Kapitel 2.3

Netzteil

Gelkammer

2.6 Western Blot

Beim hier angewandten Naßblotverfahren werden die Proteine elektrisch auf eine

Nitrocellulosemembran übertragen.

Die SDS-Gele werden vor dem Blot für 20 Minuten in Transferpuffer äquilibriert. Der

Blotaufbau ist in Abbildung 4 aufgezeigt.


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Abb. 4: Aufbau Western Blot

Beim Aufbau ist darauf zu achten, dass die Nitrocellulose auf die Seite der Anode gestellt

wird. Die Schwämme, das Whatman-Papier sowie die Nitrocellulose werden zuvor in

Transferpuffer eingelegt. Bei der Positionierung des Gels ist auf die richtige Seite zu achten.

Der gesamte Aufbau wird in die Blotkammer gestellt, welche dann mit Transferpuffer

aufgefüllt wird. Zudem wird vorher ein Rührfisch in der Kammer platziert.

Die Blotkammer wird im Kühlraum an das Netzgerät angeschlossen und auf einen

Magnetrührer gestellt. Der Transfer erfolgt über Nacht bei einer Stromstärke von 300 mA,

wobei die Stromstärke anfangs alle 5 Minuten in Schritten von 100 mA gesteigert wurde.

Am folgenden Tag wird die Blotkammer abgebaut, der Blot kurz mit destilliertem Wasser

gespült und danach in Ponceau S-Lösung fünf Minuten reversibel gefärbt. Der Blot wird

danach mit destilliertem Wasser gewaschen, bis nur noch die Spots eindeutig gefärbt sind.

Der Blot wird nun an der Luft getrocknet und die Anordnung der Spots durch Abzeichnen

unter Verwendung einer Leuchtplatte festgehalten.

Transferpuffer (pH 8,8) 25 mM Borsäure

2 mM EDTA

Whatman papier

Nitrocellulose

Schwämme

Blotkammer

Netzteil


__________________________________________________________________________

- 16 -

2.7 Färbung der Blots mit Antikörpern (Immunoblot)

Die Proteine der Blots können durch Antikörper gefärbt werden. Die mit Ponceau S gefärbten

und abgezeichneten Blots werden vor der Färbung 1 Stunde in 10% Milchpulver blockiert.

Zur Blockierung werden außerdem auch TBST oder 5% Milchpulver eingesetzt. Dadurch

wird gewährleistet, dass alle Bindungsstellen der Nitrocellulosemembran gesättigt sind und

der Primärantikörper nicht an der Membran, sondern spezifisch an den entsprechenden

Intermediärfilamenten bindet. Danach wird der Blot mit dem Primärantikörper in Plastik

eingeschweißt und über Nacht im Kühlraum inkubiert. Die Konzentration des Antikörpers ist

von Antikörper zu Antikörper verschieden.

Am folgenden Tag wird der Blot dreimal für 15 Minuten in TBST gewaschen und danach für

1 Stunde mit dem entsprechenden Sekundärantikörper inkubiert. Der Sekundärantikörper

(Anti-Maus bzw. Anti-Meerschwein; siehe Kapitel 2.1) bindet spezifisch an den

Primärantikörper. Er ist zudem mit einer Alkalischen Phosphatase gekoppelt, die die spätere

Farbreaktion katalysiert.

Nach der Inkubation werden die drei Waschschritte mit TBST wiederholt.

Die Blots werden danach mit einer entsprechenden Menge an Substratlösung bedeckt und 2

bis 22 Minuten inkubiert. Die Färbung wird durch das Waschen in destilliertem Wasser

gestoppt. Die Zeit der Inkubation wird so gewählt, dass spezifische Spots angefärbt werden,

jedoch die Hintergrundfärbung so gering wie möglich bleibt. Die Färbung beruht darauf, dass

das BCIP durch die Alkalische Phosphatase zu einem blauen Farbstoff umgesetzt wird. NBT

dient der Reaktion als Katalysator.

Die Färbung der Antikörper wird photographisch und zeichnerisch festgehalten.

TBST (Tris-Buffered Saline + 1% Tween 20) 10 mM Tris/HCl (pH 8,0)

150 mM NaCl

0,1% Tween 20

AP-Puffer (Alkalische Phosphatase-Puffer) 0,1 M Tris

0,1 M NaCl

0,05 M MgCl2

Blockierungspuffer 10% Milchpulver in TBST

BCIP-Lösung 50 mg/ml BCIP in 100%

(5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphat-p-Toluidinsalz) Dimethylformamid


__________________________________________________________________________

- 17 -

NBT-Lösung 50 mg/ml NBT in 70% Dimethylformamid (p-Nitrobluetetrazoliumchlorid)

Substrat-Lösung 3,3 µl BCIP / ml AP-Puffer

6,6 µl NBT / ml AP-Puffer

Ergebnisse

__________________________________________________________________________

- 18 -

3 Ergebnisse

3.1 Immunfluoreszensmikroskopie

Um die gewebsspezifische Expression der Intermediärfilamente zu analysieren, werden

Gefrierschnitte der bei -80°C gelagerten Gewebepräparate mit der indirekten

Immunfluoreszensmikroskopie untersucht. Es werden sowohl Einzel- als auch

Doppelfärbungen mit den unter 2.1 aufgeführten Antikörpern durchgeführt.

3.1.1 Fettgewebe

Beim Fettgewebe wirde sowohl eine Doppelfluoreszensfärbung mit den Antikörpern 14,13

(anti Xenopus Vimentin) und GPT5 (anti S-Keratine; 1:100) als auch eine einfache

Fluoreszensfärbung mit C04 (anti K18 (human); 1:10) durchgeführt.

Das Fettgewebe ist eine Form des Bindegewebes, das aus Fettzellen (Adipocyten)

aufgebaut ist. Die Fettzellen sind von Intermediärfilamenten umsponnen, um sie zusammen

und in Form zu halten. Durch dieses Bindegewebsnetz werden sie in Fettläppchen

zusammengefasst. Fettgewebe ist immer gut mit Blutgefäßen versorgt.

Abb. 5: Immunfluoreszensmikroskopische Aufnahmen des Fettgewebes

(a) GPT5 als Primärantikörper; Anfärbung der S-Keratine; (b) 14,13 als Primärantikörper; Anfärbung des Vimentins; (c) Anfärbung der Zellkerne mit DAPI (gelb); (d) Gewebe im Phasenkontrast

a b

c d

Ergebnisse

__________________________________________________________________________

- 19 -

Das Bindegewebsnetz um die Fettzellen herum wird sowohl durch 14,13 als auch durch

GPT5 eindeutig angefärbt. Dementsprechend sind sowohl Keratine als auch Vimentin im

mesenchymalen Bindegewebe zu finden.

Auch der für humanes K18 spezifische Antikörper C04 färbt eindeutig das Bindegewebe an.

In den Abbildung 5c und 6b ist zudem zu erkennen, das das Bindegewebsnetz sehr zellreich

ist.

3.1.2 Verdauungstrakt

Verschiedene Abschnitte des Verdauungstraktes von Lepisosteus werden mit keratin- bzw.

vimentinspezifischen Antikörpern angefärbt. Gefrierschnitte des Oesophagus werden mit

C04 (1:10), GPT5 (1:100), XV2 (1:50) und 14.13 inkubiert. Der Mitteldarm wird mit XV2

(1:50) und der Enddarm mit C04 (1:10) untersucht.

ddddddddddddddddddd

Abb. 7: Immunfluoreszensmikroskopische Aufnahmen des Enddarms

(a) C04 als Primärantikörper; Anfärbung von hK18; (b) Anfärbung der Zellkerne mit DAPI; (c) Gewebe im Phasenkontrast

Bei den Schnitten des Enddarmes kann keine spezifische Färbung durch den Antikörper C04

festgestellt werden. C04 ist spezifisch für das Keratin K18, das in einschichtigen Epithelien

a b c

a b c

Abb. 6: Immunfluoreszensmikroskopische Aufnahmen des Fettgewebes


Ergebnisse

__________________________________________________________________________

- 20 -

vorkommt, und kann daher das mehrschichtige, ektodermale Enddarmepithel auch nicht

anfärben.

Abb. 8: Immunfluoreszensmikroskopische Aufnahmen des Mitteldarms

(a) XV2 als Primärantikörper; Anfärbung von xVimentin; (b) Anfärbung der Zellkerne mit DAPI; (c) Gewebe im Phasenkontrast

Die entodermale Auskleidung des Mitteldarmes wird durch den vimetinspezifischen

Antikörper XV2 markiert. Allerdings ist die Färbung (Bild 8a) nicht eindeutig.

a b c

Abb. 9: Immunfluoreszensmikroskopische Aufnahmen des Oesophagus


(a’) XV2 als Primärantikörper; Anfärbung von xVimentin; (b’) Anfärbung der Zellkerne mit DAPI; (c’) Gewebe im Phasenkontrast

a b c

a’ b' c'

Ergebnisse

__________________________________________________________________________

- 21 -

Der Oesophagus zeigt von außen nach innen einen vierschichtigen Wandaufbau aus

Adventitia (Bindegewebsschicht), Muscularis (Muskelschicht), lockerem Bindegewebe und

der Mucosa (Schleimhautschicht). Die Mucosa, die aus unverhorntem Plattenepithel besteht,

wird sowohl durch GPT5 als auch durch C04 (1:10) angefärbt. Die submucöse

Bindegewebsschicht und vor allem die äußere Adventita werden durch GPT5, 14.13, C04

und XV2 angefärbt. Dementsprechend findet man im mesodermalen Bindegewebe sowohl

Keratine als auch Vimentin. Die Muskelschicht wird von keinem der Antikörper markiert.

Abb. 10: Immunfluoreszensmikroskopische Aufnahmen des Oesophagus


a b

c d

Ergebnisse

__________________________________________________________________________

- 22 -

3.1.3 Flosse

Gefrierschnitte der Flosse werden mit den Antikörpern C04 (1:10), 68.4, XV2 (1:50) und XV4

(1:50) untersucht.

Abb. 11: Immunfluoreszensmikroskopische Aufnahmen der Flosse



a b c

a' b' c'

Abb. 12: Immunfluoreszensmikroskopische Aufnahmen der Flosse


a b

c d

Ergebnisse

__________________________________________________________________________

- 23 -

Die Knochenfische besitzen knöcherne Flossenstrahlen, die entweder als Hart- oder

Weichstrahlen ausgebildet sein können. Während die Hartstrahlen aus einem Teil bestehen,

setzen sich die Weichstrahlen aus zwei Hälften zusammen. Die knöchernen Flossenstrahlen

sind von einer bindegewebigen und daher mesodermalen Hülle, dem Periost, umgeben.

Das Periost wird sowohl durch GPT5 als auch durch XV2 eindeutig angefärbt. Demnach sind

sowohl Keratine als auch Vimentin im Periost enthalten. C04 färbt das Periost nicht an, dass

demnach kein K18 enthält. Durch 14.13 wird sowohl das Periost als auch das den

Flossenstrahl umgebende Bindegewebe angefärbt.

3.1.4 Kieme

Die Kieme wird mit dem hK18-spezifischen Antikörper C04 (1:10) und dem xVimentin-

spezifischen Antikörper XV2 (1:50) untersucht.

Das untersuchte Kiemenblättchen wird durch C04 nicht markiert. Demnach ist in der Kieme

kein K18 enthalten. Das grundsätzliche Fehlen von Keratinen in der Kieme kann aber nicht

ausgeschlossen werden, da mit dem eingesetzten Antikörper ausschließlich auf die

Anwesenheit von K18 getestet wurde. XV2 führt zu einer eindeutigen Markierung, die

wahrscheinlich auf die vielen mesodermalen Blutgefäße der Kieme zurückgeht.

Abb. 13: Immunfluoreszensmikroskopische Aufnahmen der Kieme



a b c

a' b' c'

Ergebnisse

__________________________________________________________________________

- 24 -

3.1.5 Herz

Schnitte des Herzens werden mit dem Antikörper C04 (1:10) in Einzel- und mit GPT5 (1:100)

in 14.13 als Doppelfluoreszens untersucht.

Das Herz ist aus verschiedenen Schichten aufgebaut. Außen befindet sich der Herzbeutel,

das Perikard, das als bindegewebige Hülle das Herz umschließt. Danach folgen die

eigentlichen drei Schichten des Herzens: das Epikard, das muskulöse Myokard und das

epitheliale Endokard. In Abbildung 14a kann man erkennen, dass die innerste Herzschicht

durch C04 spezifisch markiert wird. Da es sich bei der innersten Herzschicht um ein

einfaches Epithel handelt, ist die Markierung durch den für K18 spezifischen Antikörper

nachvollziehbar. In der Doppelfluoreszens wird die äußerste Schicht des Herzens sowohl

Abb. 14: Immunfluoreszensmikroskopische Aufnahmen des Herzens


a b c

Abb. 15: Immunfluoreszensmikroskopische Aufnahmen des Herzens


a b

c d

Ergebnisse

__________________________________________________________________________

- 25 -

durch GPT5 als auch durch 14.13 angefärbt. Bei der äußersten Herzschicht handelt es sich

um das Perikard, das bindgewebig und mesodermalen Ursprungs ist. Man kann also davon

ausgehen, dass im Perikard sowohl Keratine als auch Vimentin enthalten sind.

3.1.6 Haut

Schnitte von Haut ohne Schuppen werden mit folgenden Antikörpern untersucht: 14.13, 68.4,

79.14, 164.4 und XV2 (1:50, 1:100, 1:300). Des Weiteren wird eine

Doppelfluoreszensfärbung von Haut mit Schuppen mit GPT5 (1:100) in 14.13 durchgeführt.

Die Untersuchung von Haut ohne Schuppen zeigt keine Markierung durch die Antikörper

14.13 und XV2. Ebenso ist nach Inkubation mit C04 (1:10) und 79.14 keine Färbung zu

erkennen.

Die Färbung mit dem Antikörper 164.4 verläuft einmal positiv und einmal negativ. Daher ist

im Bezug auf diesen Antikörper keine eindeutige Aussage möglich. Die einzige positive

Reaktion bringt der Antikörper 68.4 (Abb.:16).

Die Haut der Fische besteht im Allgemeinen aus zwei Schichten: der bindegewebigen

Lederhaut, die auch die Schuppen beinhaltet und der schleimdrüsenhaltigen Oberhaut.

Abb. 16: Immunfluoreszensmikroskopische Aufnahmen der Haut ohne Schuppen

(a) 68,4 als Primärantikörper; Anfärbung von hK18; (b) Anfärbung der Zellkerne mit DAPI; (c) Gewebe im Phasenkontrast

Abb. 17: Immunfluoreszensmikroskopische Aufnahmen der Haut mit Schuppen

(a) GPT5 als Primärantikörper; Anfärbung der S-Keratine; (b) 14,13 als Primärantikörper; Anfärbung des Vimentins; (d) Gewebe im Phasenkontrast

a b c

a b c

Ergebnisse

__________________________________________________________________________

- 26 -

Durch den S-keratinspezifischen Antikörper GPT5 wird die äußerste Hautschicht angefärbt.

Der vimentinspezifische Antikörper 14.13 färbt eine weiter unten liegende Hautschicht an, bei

der es sich um die Lederhaut handeln könnte. Eine genaue Abgrenzung der gefärbten

Schichten ist jedoch nicht möglich. Durch 14.13 wird außerdem das Gewebe unter den

beiden Hautschichten angefärbt. Auch hier handelt es sich wahrscheinlich um Bindegewebe.

3.1.7 Leber und Gallenblase

Die Leber wird mit den Antikörpern C04 (1:10) und XV2 (1:50) angefärbt. Des Weiteren

werden Doppelfluoreszensfärbungen mit GPT5 (1:100) in 14.13 und XV4 (1:50) in 68.4

durchgeführt.

Durch den K18-spezifischen Antikörper C04 wird das Leberparenchym nicht angefärbt. Der

vimentinspezifische Antikörper XV2 führt zu einer recht deutlichen Markierung des

bindegewebsreichen Lebergewebes. Dementsprechend ist das Intermediärfilament Vimentin

in der Leber vorhanden.

Abb. 18: Immunfluoreszensmikroskopische Aufnahmen der Leber



a b c

a' b' c'

Ergebnisse

__________________________________________________________________________

- 27 -

GPT5 führt zu einer sehr deutlichen Markierung des Lebergewebes. Man kann daher davon

ausgehen, dass Keratine in der Leber vorhanden sind. Der Antikörper 14.13 führt nur zu

einer relativ schwachen aber dennoch erkennbaren Anfärbung des Lebergewebes.

Zusammen mit dem Ergebnis der XV2 Färbung dient die 14.13 Färbung zur Bestätigung des

Vorhandenseins von Vimentin in der Leber.

Abb. 19: Immunfluoreszensmikroskopische Aufnahmen der Leber


a b

c d

Abb. 20: Immunfluoreszensmikroskopische Aufnahmen der Gallenblase

(a) XV4 als Primärantikörper; Anfärbung von Vimentin; (b) 68,4 als Primärantikörper; Anfärbung von hK18; (c) Anfärbung der Zellkerne mit DAPI (weiß); (d) Gewebe im Phasenkontrast

a b

c d

Ergebnisse

__________________________________________________________________________

- 28 -

Die Wand der Gallenblase besteht aus einer inneren Tunica mucosa und einer Tunica

muscularis. Die Schleimhautschicht setzt sich aus einem einschichtigen, hochprismatischen

Epithel zusammen und bildet Falten. Die Muskelschicht besteht aus glatten Muskelzellen.

Der Antikörper XV4 führt nur zu einer sehr schwachen Anfärbung des Gewebes. Eine etwas

deutlichere Färbung findet man nahe unter der Schleimhautschicht. Dabei handelt es sich

vermutlich um die bindegewebige Lamina propria, die zwischen der Schleimhaut und der

Muskelschicht liegt. Die Falten der Schleimhaut werden durch den Antikörper 68.4 sehr

kräftig angefärbt. Da die Schleimhaut aus einem einschichtigen Epithel besteht und der

verwendete Antikörper spezifisch für das in einschichtigen Epithelien vorkommende K18 ist,

kann man die Färbung leicht erklären.

3.1.8 Milz

Gefrierschnitte der Milz werden mit den Antikörpern C04 (1:10) und 68.4 + XV4 (1:50)

untersucht.

Abb. 21: Doppelfluoreszensaufnahme der Gallenblase

Die grüne Färbung beruht auf dem K18-spezifischen Antikörper 68.4, während die rote Färbung auf dem vimentinspezifischen Antikörper XV4 beruht.

Abb. 22: Immunfluoreszensmikroskopische Aufnahmen der Milz


a b c

Ergebnisse

__________________________________________________________________________

- 29 -

Durch den K18-spezifischen Antikörper C04 wird die äußere Schicht der Milz relativ

eindeutig angefärbt. Dabei könnte es sich um die epithelbedeckte Milzkapsel handeln.

In der Doppelfluoreszens zeigen beide eingesetzten Antikörper eine deutliche Markierung

der bindegewebigen Milzkapsel. Demnach sind auch hier im mesenchymalen Bindegewebe

sowohl Keratine als auch Vimentin vorhanden. Der Kapselbereich ist auch in der

Zellkernfärbung (Abb. 23c) gut zu erkennen. Das Milzparenchym enthält viele Blutgefäße

und Bindegewebszüge. Auch hier ist eine Färbung durch beide Antikörper zu erkennen,

wobei die Markierung durch 68.4 überwiegt.

3.1.9 Geruchsorgan

Das Geruchsorgan von Lepisosteus, das aus einem paarigen Sack besteht, wird mit den

Antikörpern C04 (1:10) und 68.4 + XV4 (1:50) untersucht. Es ist innen von einem

mehrschichtigen, tief gefalteten Riechepithel ausgekleidet.

Abb. 23: Immunfluoreszensmikroskopische Aufnahmen der Milz

(a) XV4 als Primärantikörper; Anfärbung des Vimentins; (b) 68,4 als Primärantikörper; Anfärbung von xK18; (c) Anfärbung der Zellkerne mit DAPI (gelb); (d) Gewebe im Phasenkontrast

a b

c d

Ergebnisse

__________________________________________________________________________

- 30 -

Durch den Antikörper C04 kann keine Markierung des Gewebes erreicht werden. Der K18-

spezifische Antikörper 68.4 färbt eine Randschicht des olfaktorischen Organs an. Durch XV4

wird hingegen das innere Gewebe angefärbt.

Abb. 24: Immunfluoreszensmikroskopische Aufnahmen des Geruchsorgans

(a) XV4 als Primärantikörper; Anfärbung des Vimentins; (b) 68,4 als Primärantikörper; Anfärbung von xK18; (c) Anfärbung der Zellkerne mit DAPI (gelb); (d) Gewebe im Phasenkontrast

Abb. 25: Doppelfluoreszensaufnahme des Geruchsorgans

Die grüne Färbung beruht auf dem K18-spezifischen Antikörper 68.4, während die rote Färbung auf dem vimentinspezifischen Antikörper XV4 beruht.

a b

c d

Ergebnisse

__________________________________________________________________________

- 31 -

3.2 Biochemische Methoden

3.2.1 Konzentrationsbestimmung der IF-Präparate mit der SDS-Gelektrophorese

Die durch die IF-Präparation (siehe Kapitel 2.3) aufgereinigten Gewebe werden, wie in

Kapitel 2.4 beschrieben, auf ein Gel aufgetragen und die Gelelektrophorese durchgeführt.

Das in Abbildung 26 dargestellte Gel zeigt die Ergebnisse von Haut- und Muskelproben. Bei

den Banden, die zwischen 66.000 Da und 45.000 Da zu erkennen sind, handelt es sich mit

großer Wahrscheinlichkeit um Intermediärfilamente (ca. 53.000 – 57.000 Da). Die Banden

sind jedoch sehr schwach gefärbt. Durch die Intensität der Färbung und den Vergleich mit

anderen Gelen kann eine ungefähre Konzentration der aufgereinigten Proben bestimmt

werden. Dies ist wichtig, um bei weiterführenden Versuchen, wie z.B. 2D-Gelelektrophorese,

eine geeignete Menge an Probe einzusetzen.

Abb. 26: Konzentrationsbestimmung der IF-Präparate mit Hilfe eines SDS-Gels von Haut und Muskel

SDS6H ist der Marker, anhand dessen die Banden der IF-Filamente charakterisiert werden könnnen. Die Konzentrationsbestimmung erfolgt durch Vergleiche mit anderen Gelen anhand der Intensität der Färbung.

In Abbildung 27 ist das Gel einer Hautprobe gezeigt. In diesem Beispiel sind die Banden

zwischen 45.000 und 66.000 Da besser zu erkennen. Die Konzentration der Probe scheint

höher zu sein als die der Proben in Abbildung 26.

Ergebnisse

__________________________________________________________________________

- 32 -

Abb. 27: Konzentrationsbestimmung der IF-Präparate mit Hilfe eines SDS-Gels der Haut

SDS6H ist der Marker, anhand dessen die Banden der IF-Filamente charakterisiert werden könnnen. Die Konzentrationsbestimmung erfolgt durch Vergleiche mit anderen Gelen anhand der Intensität der Färbung.

3.2.2 2D–Gelelektrophorese

Nach der IF-Präparation (Kapitel 2.3) wird eine zweidimensionale Gelektrophorese, wie in

Kapitel 2.5 beschrieben, durchgeführt und die Gele mit Coomassie-Färbelösung gefärbt. Das

Gel zeigt eindeutig die Spots vom Marker BSA (B). Außerdem sind die Typ I Keratine (I) und

Typ II Keratine (II) zu erkennen. Eine weitere Zuordnung der Spots zu bestimmten Keratinen

ist hier nicht möglich. Auch ist der Marker Aktin nicht zu erkennen, der sich unterhalb der Typ

I Keratine befinden müsste.

Abb. 28: 2D-Gelelektrophorese der Haut (Coomassiefärbung)

Ergebnisse

__________________________________________________________________________

- 33 -

Die Färbung des Körperwandgels zeigt ähnlich wie das Gel der Haut den Marker BSA (B)

und die Typ I und Typ II Keratine (I, II). Zusätzlich treten hier weitere Spots auf, die als

Desmine charakterisiert wurden (D). Auch tritt hier eine Färbung des zweiten Markers Aktin

auf (A).

Bei dem gefärbten Gel in Abb. 30 ist zu erkennen, dass hier nur die Marker, BSA und Aktin,

sowie die Desmine eindeutig gefärbt sind. Keratine des Typ I und Typ II können hier nicht

identifiziert werden

Abb. 30: 2D-Gelelektrophorese von Muskelgewebe (Coomassiefärbung)

Abb. 29: 2D-Gelelektrophorese der Körperwand (Coomassiefärbung)

Ergebnisse

__________________________________________________________________________

- 34 -

3.2.3 Immunoblots

IF-Präparate (2.3) verschiedener Gewebe werden mit der 2D-Gelelektrophorese (2.5)

aufgetrennt und anschließend die Proteine auf eine Nitrocellulosemembran geblottet (2.6).

Die Blots werden mit dem wasserlöslichen Proteinfarbstoff Ponceau S reversibel gefärbt,

getrocknet und bis zur weiteren Verwendung zwischen Filterpapier gelagert. Im Folgenden

werden die Blots mit verschiedenen keratin- oder vimentinspezifischen Antikörpern inkubiert

und über eine Alkalische-Phosphatase-Reaktion angefärbt (2.7).

Um die größtmögliche Spezifität des Primärantikörpers zu gewährleisten, wird im Vorfeld die

optimale Konzentration für den Einsatz des jeweiligen Antikörpers ermittelt. Dazu werden

Minigele von den entsprechenden Geweben angefertigt, diese geblottet und mit Ponceau S

angefärbt. Aus den jeweiligen Proteinbanden der Blots werden anhand der entsprechenden

Banden des Markers SDS6H die Stücke herausgeschnitten, die die Intermediärfilamente

enthalten. Diese Blotstücke werden mit unterschiedlichen Konzentrationen des

Primärantikörpers inkubiert und wie unter 2.7 beschrieben gefärbt. Die

Antikörperkonzentration, bei der wenig Hintergrundfärbung und möglichst nur eine spezifisch

gefärbte Bande auftrat, wird dann für die Immunoblots der 2D-Gele verwendet.

3.2.3.1 Körperwand

Die Blots der 2D-Gele der Körperwand werden wie beschrieben mit dem Proteinfarbstoff

Ponceau S gefärbt.

Abb. 31: 2D-Blot der Körperwand mit Ponceau S gefärbt

BSA (B) und Aktin (A) kennzeichnen die Marker; Die Keratine liegen zwischen den Markern und sind mit den Typen I und II gekennzeichnet. Desmin und Vimentin liegen zwischen den Typ I und II Keratinen, sind aber nicht sicher zuzuordnen.

Ergebnisse

__________________________________________________________________________

- 35 -

Bei der Antikörperinkubation der Blots werden verschiedene Primärantikörper eingesetzt. Zur

Keratinmarkierung werden eingesetzt: C04 (hK18; 1:100) und K19 (K19; 1:100). Als

Antikörper gegen Vimentin kamen 14.13 (1:10), XV2 (1:12.000), und XV4 (1:12.000) zum

Einsatz. Um Desmin zu identifizieren wurde D33 (1:100)verwendet.

Abb. 32: Immunoblots der Körperwand mit anti-Keratin Primärantikörpern

(a) C04 als Primärantikörper; (a’) Zeichnung des Blots vor (schwarz) und nach (rot) der Inkubation

(b) K19 als Primärantikörper; (b’) Zeichnung des Blots vor (schwarz) und nach (rot) der Inkubation

Durch den Antikörper C04 konnte bereits kurz nach der Substratzugabe eine deutliche

Färbung der mit I markierten Spots beobachtet werden (Abb. 32 a). Bei den restlichen

Färbungen handelt es sich um Hintergrundreaktionen als Folge einer zu langen Inkubation

mit der Substratlösung. Da der Antikörper C04 gegen K18 gerichtet ist, ist davon

auszugehen, dass es sich bei den markierten Spots um das Typ I Keratin K18 handelt. Mit

dem Antikörper K19 konnte keine eindeutige Anfärbung des Blots erreicht werden. Da die

komplette Fläche der Membran verschieden stark eingefärbt wird, ist von einer

unspezifischen Hintergrundfärbung auszugehen.

a a'

b b'

Ergebnisse

__________________________________________________________________________

- 36 -

Abb. 33: Immunoblots der Körperwand mit anti-Vimentin Primärantikörpern

(a-d) Blots mit den Primärantikörpern 14,13 (a), XV2 (b, c) und XV4 (d);

(a’-d’) Zeichnungen der entsprechenden Blots vor (schwarz) und nach (rot) der Inkubation

a a'

b b'

c c'

d d'

Ergebnisse

__________________________________________________________________________

- 37 -

Durch 14,13 wird unmittelbar nach der Substratzugabe ein Spot angefärbt, der ziemlich

sicher als Vimentin zu identifizieren ist. XV2 färbt im ersten Versuch sowohl Vimentin als

auch Typ I Keratine an, die im Vergleich mit anderen Blots den K18 Spots zugeordnet

werden konnen. Im zweiten Versuch färbt XV2 allerdings nur Vimentin an, so dass eine

Aussage über die Spezifität des Antikörpers aufgrund der unterschiedlichen Ergebnisse sehr

wage ist. Mit dem Antikörper XV4 werden bei der Körperwand drei Spots angefärbt. Dabei

handelt es sich wahrscheinlich um Desmin und Vimentin. Da der Vimentin Spot jedoch

später als die Desmin Spots auftrat, kann es sich hier auch schon um eine

Hintergrundfärbung handeln.

Abb. 34: Immunoblots der Körperwand mit anti-Desmin Primärantikörper

(a) D33 als Primärantikörper; (a’) Zeichnung des Blots vor (schwarz) und nach (rot) der Inkubation

Der anti-Desmin Antikörper D33 führt zu einer unspezifischen Färbung der gesamten

Membran. Daher kann auch keine eindeutige Aussage über eine spezifische Färbung des

Antikörpers gemacht werden. Der in der Zeichnung 34 a’ rot markierte Spot ist auf dem Blot

am stärksten gefärbt. Da dieser Spot aber auch erst mit den anderen Färbereaktionen

auftrat, handelt es sich hier sehr wahrscheinlich um eine Hintergrundfärbung.

3.2.3.2 Muskel

In Abbildung 35 ist eine Ponceau-Färbung eines Muskelblots gezeigt.

a a'

Ergebnisse

__________________________________________________________________________

- 38 -

Abb. 35: Ponceau-Färbung eines Muskelblots

In diesem Blot sind die beiden Marker Aktin (A) und BSA (B) zu erkennen. Außerdem ist in der Mitte des Blots eine schwache Färbung zweier Spots zu erkennen, bei denen es sich um Desmin (D) handelt.

Die Muskelblots werden mit verschiedenen Antikörpern gefärbt, die für Desmine, Keratine

oder Vimentine spezifisch sind.

Abb. 36: Immunoblot des Muskels mit dem Vimentinantikörper XV4

(a) XV4 als Primärantikörper; (a´) Zeichnung des Blots vor (schwarz) und nach (rot) der Inkubation

Wie in der Abbildung 36a zu erkennen ist, färbt XV4 (1:12.000) beim Muskel spezifisch die

Desminspots an. Nach erheblich längerer Inkubation mit der Substratlösung wird zusätzlich

ein weiterer Spot sichtbar, bei dem es sich, durch Vergleich mit anderen Blots, um Vimentin

handelt. Dieser wurde auch in der Zeichnung festgehalten (34 a´).

a a´

Ergebnisse

__________________________________________________________________________

- 39 -

Abb. 37: Immunoblot des Muskels mit dem Keratinantikörper GTP5

(a) GPT 5 als Primärantikörper; (a´) Zeichnung des Blots vor (schwarz) und nach (rot) der Inkubation

GPT5 (1:3000) färbt spezifisch Keratine an. Wie in Abbildung 37 zu erkennen ist, sind die

Keratine des Typ I und Typ II gefärbt. Es treten erst spät (Hintergrundfärbung) weitere Spots

auf, deren Färbung allerdings nicht spezifisch zu sein scheint.

Abb. 38: Immunoblot des Muskels mit dem Desminantikörper D33

(a) D33 als Primärantikörper; (a´) Zeichnung des Blots vor (schwarz) und nach (rot) der Inkubation

Der Desminantikörper D33 (1:100) zeigt keine spezifische Färbung auf. Obwohl im Muskel

Desmine auftreten und diese auch in der Abbildung 38a´ zu erkennen sind, werden diese

durch D33 nicht markiert.

3.2.3.3 Flosse

Ein 2D-Blot des Flossengewebes wird mit dem vimentinspezifischen Antikörper XV4

(1:12.000) inkubiert.

a a´

a a´

Ergebnisse

__________________________________________________________________________

- 40 -

Abb. 39: Immunoblots der Flosse mit anti-Vimentin Primärantikörper

(a) XV4 als Primärantikörper; (a’) Zeichnung des Blots vor (schwarz) und nach (rot) der Inkubation

Der Einsatz des Primärantikörpers XV4 führt bei dem Blot der Flosse zu keinem spezifischen

Färbeergebnis. Die in der Zeichnung rot markierten Stellen sind im Blot am stärksten gefärbt,

treten aber erst sehr spät mit der allgemeinen Hintergrundfärbung der Membran auf.

3.2.3.4 Haut

Der Blot eines 2D-Geles der Haut wird mit dem vimentinspezifischen Antikörper XV4

(1:12.000) untersucht.

Abb. 40: Immunoblots der Haut mit anti-Vimentin Primärantikörper

(a) XV4 als Primärantikörper; (a’) Zeichnung des Blots vor (schwarz) und nach (rot) der Inkubation

Der Antikörper XV4 führt bei der Haut ohne Schuppen zu keiner spezifischen Markierung.

Auf dem Blot ist die leichte Färbung des Markers Aktin zu erkennen. Daher können die

leichten Farbschatten auf dem Blot als Hintergrundfärbung gewertet werden.

a a'

a a'

Diskussion

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- 41 -

4 Diskussion Wie in der Einleitung bereits beschrieben wurde, ist das Expressionmuster der

Intermediärfilamente der Strahlenflosser (Actinopterygii) sehr unterschiedlich. Die Flössler

weisen, genauso wie die Neunaugen aber auch die höheren Tetrapoden Keratine in

epithelialen Geweben und Vimentin in mesenchymalen Geweben auf, während die echten

Knochenfische in beiden Geweben hauptsächlich Keratine exprimieren. Untersuchungen am

Stör (Acipenser baeri), der zu den Knorpelganoiden gehört, haben erstmals gezeigt, dass in

mesenchymalem Gewebe mit ziemlicher Sicherheit eine Coexpression von Vimentin und

Keratinen auftritt (Haberkamp, 2002).

Als ein weiteres Bindeglied zwischen den Stören und den echten Knochenfischen wird der

Knochenhecht (Lepisosteus oculatus) als Vertreter der Neopterygii untersucht.

Erste Ergebnisse weisen darauf hin, dass in mesenchymalen Gewebe neben dem Vimentin

auch Keratine zu finden sind. Somit scheint das Expressionsmuster dem der Störe zu ähneln

und eine Übergangsform zum Expressionsmuster der echten Knochenfische darzustellen.

Durch Immunoblots mit verschiedenen Geweben und Antikörpern wird die Spezifität der

Antikörper untersucht. Die Zuordnung der gefärbten Proteinspots zu den

Intermediärfilamenttypen wird durch Vergleiche mit den vorangegangen Untersuchungen

ermöglicht. Es hat sich gezeigt, dass der vimentinspezifische Antikörper XV2 bei

Immunoblots der Körperwand unterschiedliche Ergebnisse zeigt. Einerseits kommt es zu

einer ausschließlichen Färbung des Vimentins (Abb. 33 c), andererseits werden neben

Vimentin auch Typ I Keratine angefärbt (Abb.33 b).

Der Antikörper XV4 scheint in den Blots der Körperwand und des Muskels sowohl Desmin

als auch Vimentin anzufärben (Abb. 33 d und Abb. 36 a).

Die durch die Immunoblots festgestellten Färbungen der Antikörper müssen bei der

Betrachtung der immunfluoreszensmikroskopischen Ergebnisse berücksichtigt werden.

Immunfluoreszensmikroskopische Untersuchungen haben aufgezeigt, dass die

mesenchymale Bindegewebsmatrix des Fettgewebes sowohl Keratine als auch Vimentin

enthält. Durch den S-keratinspezifischen Antikörper GPT5 und dem vimentinspezifischen

Antikörper 14,13 wird das IF-Netz zwischen den Fettzellen eindeutig markiert (siehe

Abbildung 5). Auch durch den Antikörper C04 wird die Vermutung bekräftigt, dass im

Bindegewebe Keratine exprimiert werden (Abb. 6).

Die äußere Bindegewebsschicht des Oesophagus kann sowohl durch keratin- als auch

vimentinspezifische Antikörper angefärbt werden (XV2, C04, GPT5 und 14,13; Abb. 9 und

Diskussion

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Abb. 10). Auch die submucöse Bindegewebsschicht scheint sowohl Keratine als auch

Vimentin zu enthalten.

In der Knochenhaut der Flosse können wiederum Vimentin als auch Keratine durch die

Antikörper 14,13, GPT5 und XV2 markiert werden (Abb. 11 und Abb. 12). Die Knochenhaut,

Periost, ist mesodermalen Ursprungs.

Das untersuchte Kiemenblättchen wird durch C04 nicht markiert. Demnach ist in der Kieme

vermutlich kein K18 enthalten. Das grundsätzliche Fehlen von Keratinen in der Kieme kann

aber nicht ausgeschlossen werden, da mit dem eingesetzten Antikörper ausschließlich auf

die Anwesenheit von K18 getestet wird. XV2 markiert die mesodermalen Blutgefäße der

Kieme (Abb. 13).

Beim Herz zeigt auch die bindegewebige Hülle eine Doppelexpression, die durch die

Färbung mit GPT5 und 14,13 in Abbildung 15 dargestellt wird.

Die bindegewebs- und blutgefäßreiche Leber wird durch den K18-spezifischen Anitkörper

C04 nicht markiert. Dagegen tritt eine Färbung mit GPT5 auf. Auch durch XV2 und 14,13

(beide gegen Vimentin) wird eine Färbung des Lebergewebes erreicht. Bei Schnitten, in

denen auch Bereiche der Gallenblase zu erkennen sind, kann eine eindeutige Färbung der

Lamina propria der Gallenblase sowohl mit XV4 und 68,4 nachgewiesen werden (Abb. 20).

Auch die innere Schicht der Gallengänge, die ebenfalls mesodermalen Ursprungs ist, scheint

eine Coexpression von Vimentin und Keratin aufzuweisen.

Die bindegewebige Milzkapsel zeigt ebenso wie das Milzparenchym eine Markierung durch

XV4 und 68,4 (Abb. 22). Dies ist ein weiterer Anhaltspunkt für eine mesodermale

Coexpression von Vimentin und Keratin.

Die Ergebnisse der Untersuchungen der Haut weichen vom bisher beobachteten

Expressionmuster der Intermediärfilamente ab. Hier kommt es durch den keratinspezifischen

Antiköper GPT5 zu einer Anfärbung der Epidermis. Der vimentinspezifische Antikörper 14,13

färbt die Dermis und das darunter liegende Bindegewebe an. Bei der Haut ist demnach keine

Doppelexpression von Keratin und Vimentin im Bindegewebe zu erkennen.

Fazit:

Die bisherigen Versuche zeigen, dass im mesenchymalen Gewebe des Knochenhechtes

sowohl Keratine als auch Vimentin exprimiert werden. Demnach liegt hier ähnlich wie beim

Stör eine Doppelexpression der Typ I, II und III Intermediärfilamente vor. Bei der

Untersuchung der Haut stellt sich heraus, dass hier vermutlich keine Doppelexpression

vorliegt. Dies könnte darauf hinweisen, dass die Doppelexpression gewebsspezifsch

ausgeprägt ist. Das Expressionsmuster der Intermediärfilmanente des Knochenhechts kann

sich also als Übergangsform zwischen der Intermediärfilamentexpression der Teleosteer und

der der höheren Tetrapoden erweisen.

Diskussion

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Um eine genaue, detaillierte Aussage treffen zu können, sind jedoch weitere Versuche

zwingend erforderlich. Es wäre angebracht die Gewebe mit weiteren Antikörpern zu

analysieren und weiterführende Untersuchungen mit anderen Methoden durchzuführen.

Ein weiterführender Schritt wäre es auch einen Vertreter der Kahlhechtartigen, die eine

Schwestergruppe der echten Knochenfische darstellen, auf das Expressionsmuster der

Intermediärfilamente hin zu untersuchen.

Literatur

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3.Auflage

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