Lipid Rafts und Cavaeolae

Vorlesung Zellbiologie Huber

Plasma Membran Komposition

• Die Plasma Membran von Säugetierzellen enthält 4 Hauptklassen von Phospholipiden : •Phosphatidylcholin •Phosphatidylethanolamin •Phosphatidylserin•Sphingomyelin•Zusammen mehr als die Hälfte aller Lipide in zellulären Membranen

Phospholipide bestehen aus zwei langkettigen Fettsäuren, die über eine Esterbindung an eine kleine hydrophile Gruppe gebunden sind

Phospholipids sind amphipathisch

• Deshalb aggregieren Phospholipide nicht in Tropfenform, sondern orientieren sich spontan zu Membranen, mit den hydrophilen Gruppen nach aussen, zur wässrigen Umgebung.

• Moleküle, die mit einem Ende mit der wässrigen Umgebung interagieren und mit dem anderen Ende hydrophob sind werden als amphipathisch bezeichnet (Griechisch, “tolerant für beides”).

Plasma Membran Komposition

• Die Phospholipide sind asymmetrisch zwischen dem inneren und äußeren Bi-Layer angeordnet

Glykolipide

• Zusätzlich zu den Phospholipiden enthalten Membranen von Säugetieren Glykolipide

• Diese Glykolipide findet man hauptsächlich im äußeren Leaflet des Bilayers, mit den Kohlenhydratresten an der Zelloberfläche.

• Sie stellen aber nur einen relative geringen Anteil aller Lipde dar (~2%)

Struktur von Glykolipiden

• Zwei Kohlenwasserstoff Ketten vereinen sich zu einer polaren Kopfgruppe über ein Serin mit einem Kohlenhydratrest (zB Zucker)

Cholesterin• Zusätzlich enthalten Zellmembranen von Säugern Cholesterin.

• Cholesterin, ist ein Hauptbestandteil zellulärer Mmebranen und damit in gleichen molaren Mengen wie Pospholipide vertreten.

• Aber: Cholesterin kann nicht spontan Membranen bilden!

Cholesterin im Bilayer

• Die Cholesterinmoleküle orientieren sich im Bilayer mit ihren Hydroxylgruppen in die unmittelbare Nachbarschaft zu den polaren Kopfgruppen der Phospholipidmoleküle.

• Die starre, plattenförmige Steroidstruktur interagiert und stabilisiert dadurch teilweise jene Abschnitte der Kohlenwasserstoff-ketten, die am nächsten zu den polaren Kopfgruppen liegen.

Lipid-Zusammensetzung von Membranen

Cholesterin und Mikroviskosität

• Einflüsse von Cholesterin auf die Viskosität der Membran sind Temperaturabhängig.

• Bei höheren Temperaturen, kann Cholesterin die freie Beweglichkeit der Fettsäurenketten der Phospholipide behindern und somit den äußeren Bilayer steifer/rigider machen.

• Dadurch verändert sich auch die Zellmembran-Permeabilität für kleine Moleküle.

• Jedoch bei niedrigen Temperaturen hat Cholesterin den gegenteiligen Effekt: Durch die Interaktion mit den Fettsäurenketten der Phospholipide, kann Cholesterin Membranen vorm Einfrieren bewahren und deren Beweglichkeit/Mikro-Viskosität bewahren.

Das “Fluid Mosaic” Modell

• In Biomembranen sind nahezu alle Membranproteine lateral mobil und frei diffundierbar.

• Im“Ffluid Mosaic“ Modell, wird die Membran als zwei-dimensionales Mosaik dargestellt, das von Phospholipiden und Proteinen gebildet wird.

Lipid Rafts sind Andock- und

Interaktionsplattformen für Proteine

.…... formed by dynamic clustering of sphingolipids and cholesterol and move within the fluid bilayer, e.g. during signal transduction.

From Simons and Ikonen,

Nature 1997, 387: 569-72

raft caveola

• Sie entstehen und bestehen aus einem dynamischen Zusammenschluss von Cholesterin und Sphyngolipiden im äußeren Leaflet des Bilayers.

• Die gesättigten Kohlenwasserstoffketten der Sphyngolipide erlauben dem Cholesterin sich optimal in der äußeren Hälfte der Membran zu verankern.

• Das innere Leaflet enthält mehr Phospholipide mit gesättigten Fettsäuren und auch Cholesterin.

Rafts bilden Caveaolae

Caveolae on the plasma membrane of a human fibroblast. (A) Electron micrograph of a fibroblast in cross-section showing caveolae as deep indentations in the plasma membrane. (B) Deep-etch electron micrograph showing numerous caveolae at the cytoplasmic side of the plasma membrane.

• Caveoline:– 150 AS Membran Proteine

– Sind die Bausteine der Caveolae

– N- und C-Terminus ragen ins Zytoplasma vor = integrales und nicht transmembran Protein

– Oligomerisieren– Hydrophobes Ende steckt in der Membran

– Binden Cholesterin

Funktionen von Caveolae :

• Endozytose, Transzytose

• Signal Transduktion

• Cholesterin Transport• Pathogen Eintritt in Zellen• Potozytose

– Lipid-verankerte Membran Rezeptoren in Caveolae nehmen kleine Moleküle wie Vitamine und Lipide auf.

Methoden zur Untersuchung von Raft-

Strukturen?

Biochemische Anreicherung / Reinigung von Caveolae and Rafts

• Extraktion mit Triton-X 100 auf Eis

• Rafts and damit assoziierte Proteine werden dadurch unlöslich

• Flotation in Zucker / Optiprep Gradienten

• Das detergenz-unlösliche Material flotiert hoch, wegen des Lipidgehaltes.

Flotation and Visualisierung von Rafts

Oliferenko et al., JCB 1999

Methoden zur Untersuchung von Raft-

Strukturen?

Intracelluläres Annexin II wird von Innen an antibody-

crosslinked CD44 Microdomänen rekrutiert

Oliferenko et al., JCB 1999

Keine “Cluster” wenn Cholesterin aus

Membranen depletiert wird

CD44 annexin II merge

Oliferenko et al., JCB 1999

Immunogold und Freeze Fracture

Größere Lipid-Domänen können mittels Single Molecule Microscopy dargestellt werden• G.J. Schütz, G. Kada, V.Ph.

Pastushenko and H. Schindler EMBO J. 19 No.5 (2000) 892-901

DOPE (monounsaturated phosphoethanolamine analogue): frei diffundierbar

DMPE (saturated acyl chains): wird in Mikrodomänen fest gehalten

Rafts Visualiserung durch Atomic Force

Microscopy• Atomic force microscopy

reveals sphingomyelin rafts (orange) protruding from a dioleoylphosphatidylcholine background (black) in a mica-supported lipid bilayer. Placental alkaline phosphatase (PLAP; yellow peaks), a glycosylphosphatidylinositol-anchored protein, is shown to be almost exclusively raft-associated. Data from:

Saslowsky, D.E., et al. (2002) J. Biol. Chem. 277, 26966-26970

Oder mit Photonic Force Microscopy

• Kai Simons (Dresden, Germany) has used photonic force microscopy to measure the size of lipid rafts.

• By comparing the drag force of raft proteins (such as a GPI-anchored protein) and non-raft proteins (such as transferrin receptor) in the presence or the absence of cholesterol, he estimated the diameter of a single raft.

• The conclusion is that each raft is very small and contains a very small subset of proteins, leading to the prediction that in order to act as signalling and/or sorting devices, they need to cluster.

Raft Eigenschaften• Größe: bis zu 25±10 nm • Das entspricht ungefähr 3,500 Sphyngolipid Molekülen

• Protein Anzahl hängt vom Packungsgrad ab, wahrscheinlich gibt es um die 30 Proteine in Rafts

• Cluster mit bis zu 15 identen Molekülen wurden beschrieben

• Statistisch gesehen, können jedoch nur ein relativ kleiner Anteil aller verfügbaren Raft Proteine gleichzeitig in Rafts auch sein.

• Das wiederum könnte wichtige Auswirkung auf die prinzipiellen Mechanismen der Signalweiterleitung in und durch Rafts haben.

Raft-Typologie: Nomenklatur

Experimentelle Tools um Rafts zu zerstören:

• Cholesterol sequestration/depletion– Filipin (Antibiotic)– Pore formation (Saponin, Digitonin, Streptolysin O)

– Methyl-beta-cyclodextrin

• Cholesterol biosynthesis– Lovastatin

• Raft Stability– Exogenous Cholesterol– Exogenous Gangliosides

– Exogenous polyunsaturated fatty acids

Signal Transduktionin Lipid Rafts und

Caveolae• FCRI• T-cell Receptor• B-cell Receptor• CD44• H-ras• Integrins• eNOS

• EGF Receptor• Insulin Receptor• EphrinB1 Receptor

• Neutrophin• GDNF• Hedgehog

Wie werden Signale in Rafts induziert und

integriert?

Wie werden Signale in Rafts induziert und

integriert?

.

CD44

Lipid rafts

Der CD44 Rezeptor ist in Rafts und intergiert mit

dem Zytoskelett

out-side-in Signaltransduktion in CD44 Rafts nach Ligandenbindung

durch Hyaluronsäure (HA)?

H A

.

CD44

Lipid rafts

H A

H A

H A

?

.

H A

R ac-G D PR ac-G T P

H A

H A

H A

CD44

Annexin

II

TIAM

Bourguignon et al., 2000

lamellipodia outgrowthCytoskeletal rearrangements

HA

Okamoto et al., 1999

Oliferenko et al., JCB 2000

Rafts in Fc Rezeptor Signaltransduktion

Rafts in T-Cell Rezeptor Signaltransduktion

? Offene Fragen ?

• Wievel Arten von Rafts?• Funktion von Caveolae in Signaltransduction?

• Welche Signalwege brauchen Rafts? • Welche Proteine gehen in Rafts und warum?

• Wie werden Caveolae internalisiert• Rolle des Zytoskelettes?