HSZi-Gr

Bio

tech

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gie

-Stu

diu

m

Instru

men

telle

Bio

analy

tik

Hochschule Zittau/Görlitz

Külzufer 2, D-02763 Zittau

Labor Separation Science, H VI, R113 und Labor

Instrumentelle Analytik & Bioanalytik; H VI, R 118 ww

w.p

apa-

gey.

de

Liquid Chromatography

Solvent

Solvent

pump

plates

injector

columndetector

integrator

Alle Dinge werden zu einer Quelle der

Lust, wenn man sie liebt.

Thomas von Aquin Preis: 0,00 Euro

Praktikum Protein- und KH-Analytik

Versuche 3 und 4

V3: SEC V4: LEC

Große (Bio)moleküle (Ausschluß)Kleine Moleküle ("Einschluß")

SEC-Säule

Partikel der stationären Phase

Wiskas

1

23

1: Lactose2: Glucose3: Galactose

Prof. Dr. Manfred Gey e-mail: papa-gey@gmx.de

Versuch 3

„Größenausschlusschromatographie von Proteinen“

1. Ausgangspunkt und Zielstellung

Zur Trennung von Molekülen nach ihrer effektiven Größe dient die Größenausschlusschromatographie (SEC: Size-exclusion Chromatography, die auch als Gelfiltration (GF) bezeichnet wird.

Als stationäre Phasen kommen weitporige (ca. 100 nm) hydro-phile Materialien, die in Stahl- oder Glassäulen gefüllt sind und mit wässrigen Eluenten (i.d.R. mit Phosphatpuffern) eluiert werden, zum Einsatz. Dabei erfolgt die Trennung nach der Molekülmasse und die Elutionskurve wird i.d.R. bei einer Wellenlänge (λ) von 280 nm registriert.

Ziel des Praktikums ist, ausgewählte Standardproteine an zwei unterschiedlichen SEC-Säulen zu chromatographieren. Dabei sol-len die Retentionszeiten der Proteine gemessen sowie die Reten-tionsvolumina und Kapazitätsfaktoren KAV berechnet werden. Diese werden dann graphisch gegen die entsprechenden Loga-rithmen ihrer Molekülmassen aufgetragen.

Mit Hilfe der Substanzen 4-Aminobenzoesäure und/oder Aceton erfolgt unter identischen chromatographischen Bedingungen die Charakterisierung der Trennleistung beider SEC-Säulen durch Be-rechnung der theoretischen Bodenzahl N.

2. Kenntnis-/Methodenstand

2.1 GPC versus SEC

Erfolgt die Elution mit einem organischen Lösungsmittel, wird diese Trenntechnik als Gelpermeationschromatographie (GPC) be-zeichnet. Damit werden organische Polymere (z.B. Polyethy-lenglycole) an porösen hydrohoben Trennphasen auf Styren-Divinylbenzen-Basis chromatographiert, die jedoch für Protein-trennungen unter Erhalt ihrer biologischen Aktivität ungeeignet sind.

2 Versuch 3

Für Biopolymere (Proteine) wird die SEC-Methode bzw. Gelfil-tration (s.o.) eingesetzt. Unter den angewandten physiologischen Bedingungen sind kaum Denaturierungserscheinungen zu ver-zeichnen. Die verwendeten Phosphatpuffer enthalten meist gerin-ge Zusätze von Natriumchlorid, das zur Vermeidung möglicher Adsorptionserscheinungen der Proteine an der Trennphase dient.

2.2 Molekülmasse, Molekulargewicht, Dalton, atomare Masseneinheit

Als Molekülmasse Mr (engl. molecular mass; früher Moleku-largewicht, engl. molecular weight, MW) bezeichnet man die Summe der Atommassen aller Atome in einem Molekül. Bei Sal-zen spricht man von Formelmasse, da Salze aus Ionen aufgebaut sind.

Es wird zwischen relativer (eine Maßeinheit existiert nicht) und absoluter Molekülmasse, die in kg, g oder mg angegeben wird, unterschieden.

Dalton (Da) ist eine nach dem englischen Naturforscher John Dalton benannte, nicht SI-konforme Masseeinheit, die vor allem in der Bioanalytik/Biochemie verwendet wird und in den USA auch in der organischen Chemie als „Masseeinheit“ dient.

Das Dalton ist ein anderer Name für die atomare Massen-einheit (Einheitenzeichen: u = unit). Somit ist sie exakt gleich 1/12 der Masse des Kohenstoff-Isotops 12C und entspricht in etwa der Masse eines Wasserstoffatoms (1,6605655 · 10-27 kg).

2.3 Trennprinzip

Die Proteine werden nach der Größe ihrer relativen Molekül-massen getrennt.

Das Prinzip der Größenausschlusschromatographie von Bio-molekülen (Proteinen) wird an dem Modell in Bild 1 anschaulich dargestellt. Die Proteine werden zwischen den Poren der Trenn-phase („Gel“) und der mobilen Phase „filtriert“, d. h., kleinere Pro-teine können in die Poren eindringen und diese durchwandern.

Je kleiner die Moleküle sind, desto längere Verweilzeiten entste-hen im Porensystem, so dass sie am längsten retardiert werden und als Peaks am Ende des Chromatogramms erscheinen.

Versuch 3 3

Große (Bio)moleküle, die nicht in Partikel der stationären Phase eindringen können

kleine Moleküle, die in die Partikel der stationären Phase eindringen können und retardiert werden

Größenausschlußchromatographie

Partikel der stationären Phase

Bild 1 Prinzip der Proteintrennung mittels SEC

Große Proteine, die in die Poren nicht hineinpassen, werden aus-geschlossen (deshalb Größenausschlusschromatographie) und an den Partikeln vorbei innerhalb des Flüssigkeitsvolumens mit dem Totvolumen V0 (bzw. der Totzeit t0) eluiert. Sie erscheinen als die ersten Chromatogrammpeaks.

Zur Bestimmung der Molekülmasse eines unbekannten Proteins wird zuerst eine Standardmischung von Proteinen mit bekannten Molekülmassen auf die SEC-Säule appliziert und getrennt (Bild 2). Um zu sichern, dass die Proteine rein sind und noch keine Abbau-produkte enthalten, empfiehlt sich die Chromatographie jedes Standardproteins separat.

Aus den chromatographischen Trennungen wird für jedes Protein das Elutionsvolumen bestimmt und gegen den Logarithmus seiner entsprechenden Molekülmasse aufgetragen, wie im Bild 3 an-schaulich gezeigt wird.

Im Kurvenbereich zwischen V0 (Totvolumen) und dem Elutions-volumen des kleinsten Moleküls (Vn) erfolgt die Trennung nach Molekülmassen. Die von der „Filtration“ in den Trennporen ausge-schlossenen Proteine werden mit V0 in einem Peak eluiert. Die kleinsten Moleküle, die identisch lange Wege durch das Porensys-tem zurückgelegen, treffen in der Peakfraktion Vn zusammen.

Neben dem Elutionsvolumen wir auch häufig in der Literatur der Kapazitätsfaktor KAV angegeben.

0

0AV VV

VVKt

e

−−

=

Ve ist das Elutionsvolumen einer Standardsubstanz, Vt das Säu-lenvolumen (Dimension: 300 cm x 7,8 mm i.D.) und Vo das Totvo-lumen.

4 Versuch 3

Nach der Analyse eines unbekannten Proteins unter identischen chromatographischen Bedingungen wird aus seinem Elutionsvolu-men auf der Basis der erstellten Eichkurve die entsprechende Mo-lekülmasse ermittelt.

Die Beladbarkeit von SEC-Säulen mit einer Proteinprobe ist rela-tiv gering, da nur die Poren der stationären Phase für diesen Trenneffekt zur Verfügung stehen. Die Gelfiltration wird deshalb meist am Ende mehrstufiger chromatographischer Reinigungs-schritte zur „Feinreinigung“ von Proteinen eingesetzt (siehe auch die Beispiele in Punkt 6).

V e

Sign

al (U

V 28

0 nm

)

Proteinstandards

V 0 V 1 V n V 2

Bild 2 Prinzip der Proteintrennung mittels SEC

V e

log

MW Eichkurve

V 0 V n

V e

Sign

al (U

V 28

0 nm

)

unbekanntesProteingemisch

V 0 V x

P x

Bild 3 Prinzip der Proteintrennung mittels SEC

Versuch 3 5

3. Material und Methoden

3.1 HPLC-Apparatur-I (z.T. auch modifiziert!)

- HPLC-Pumpe: Knauer-Minipumpe, Flussrate: 0,6 ml/min, - Injektor: Rheodyne-Ventil, Injektionsvolumen: 20 µl, - Trennsäule: TSK-Säule 1 zur BioLC, - Eluent: 0,1 M Na2HPO4, 0,15 M NaCl, 0,05 % Na-Acid, - Detektor: Knauer-UV/VIS 87.00, λ=280 nm, AR: 0,08; - Schreiber: X-Y-Schreiber, Fa. Knauer.

3.2 HPLC-Apparatur-II (Merck-Hitachi-Anlage mit PC)

- Interface: Merck-Hitachi D-7000, - HPLC-Pumpe: L-7200; Flussrate: 0,6 ml/min, - Injektor: Autosampler L-7200, variable Injektion, - Trennsäule: TSK-Säule 2 zur BioLC, - Eluent: 0,1 M Na2HPO4, 0,15 M NaCl, 0,05 % Na-Acid, - Detektor: Diode Array Detector L-7450A, λ=280 nm, - Software: LaChrom - Drucker: HP Color LaserJet CP 1215.

3.3 SEC-Säulen (ggf. auch andere verfügbare Säulen!)

Die Trennsäulen zur Biochromatographie müssen sehr scho-nend behandelt werden - kein hoher Druck, kein Befall von MO!

Die Flussrate von 0,6 bis ca. 0,8 ml/min darf in keinem Fall überschritten werden! Zur Vermeidung des Befalls der empfindli-chen stationären Phase durch Mikroorganismen dient 0,05 % Natriumazid im Eluenten.

Für die Säulenlagerungen werden Flüssigkeiten/mobile Phasen mit 20% Ethanol empfohlen!

- TSK-Säule 1: G 2000 SWXL (Tosoh Bioscience), Dimension: 300 cm x 7,8 mm i.D., Partikelgröße, dp: 5 µm.

- TSK-Säule 1: G 3000 SWXL (Tosoh Bioscience), Dimension: 300 cm x 7,8 mm i.D.,

Partikelgröße, dp: 5 µm.

6 Versuch 3

3.4 Eluent-Herstellung

Zur Herstellung des Elutions-Puffers dienen entionisiertes Was-ser und gründlich gereinigte Gefäße!

Für 1 Liter werden 8,78 g NaCl (0,15 M), 14,2 g Na2HPO4 (0,1 M) und 0,05 % Natriumazid (500 mg) einzeln eingewogen.

Nach Vereinigung der Substanzen in einem 300 ml-Becherglas werden ca. 200 ml entionisiertes Wasser hinzugegeben und zur besseren Löslichkeit erfolgt eine ca. 10 minütige Behandlung im Ultraschallbad.

Die entstandene klare Lösung wir in ein größeres Becherglas überführt und auf einen Liter mit entionisiertem Wasser aufgefüllt. Mit Hilfe von verdünnter Phosphorsäurelösung erfolgt die Einstel-lung des pH-Wertes auf 6,8!

Falls vorhanden, schließt sich eine Ultrafiltration der Lösung an (Rücksprache mit dem Laborleiter). Danach wir der Elutionspuffer ca. 10 Minuten im Ultraschallbad entgast. In der HPLC-Apparatur erfolgt eine weitere kontinuierliche Entgasung mit Helium.

3.5 Proteinstandards (variabel – auch andere Firmen!)

Die Proteinstandardlösungen werden für das Praktikum zur Ver-fügung gestellt. Die Herstellung neuer Lösungen erfolgt nach ge-sonderter Anweisung durch den Laborleiter (Rücksprache).

- Als Substanz zur Ermittlung der theoretischen Bodenzahl N dient 4-Aminoazobenzol (c= 0,01 g/l, Verdünnung: 1:499 V/V, Rücksprache nehmen!). Auch Aceton ist möglich!

- Für die Erstellung der Eichgeraden stehen die folgenden Prote-instandards (Amersham Biosciences) zur Verfügung:

Proteinstandard Molekülmasse

Blue Dextran 2000.000Albumin 66.000Ovalbumin 45.000Chymotrypsinigen A 25.000Ribonuclease A 13.000Vitamin B12 1.355

- Auch andere Proteinstandards können (in Abhängigkeit der ge-genwärtigen Verfügbarkeit) für den Praktikumsversuch einge-setzt werden – bitte Rücksprache mit dem Laborleiter nehmen!

Versuch 3 7

4. Versuchsdurchführung

Die chromatographischen Trennungen und Bestimmungen wer-den an den beiden TSK-Säulen (G 2000 SWXL, G 3000 SWXL) durchgeführt.

Die ermittelten Retentionsdaten (tR, Ve, Kav) und Parameter (Trennleistungsparameter: N, H) sind zu vergleichen und zu dis-kutieren (s. Punkt 5).

4.1. Bestimmung der theoretischen Bodenzahl N

Zur Ermiitlung von N dienen 4-Aminobenzoesäure und die nach-stehende Gleichung (s. auch LV „Analytische Chemie“).

N t LH

5,54 tw

tw

= = =⎛⎝⎜

⎞⎠⎟ =

⎛⎝⎜

⎞⎠⎟R

2

2R

h

2R

b

2

16 σ

Die theoretische Trennstufenzahl N dient als Maß für die wäh-rend der Retentionszeit tR erfolgte Peakdispersion σ 2 oder auch als Quotient der Trennsäulenlänge L (cm) und der Trennstufen-höhe H (µm).

Meist wird N jedoch mit Hilfe der Retentionszeit tR und der Peakbreite in halber Höhe (wh) bestimmt (s. Bild 4).

Ermittlungen über die Peakbasisbreite (wb) sind weniger genau und bei der Versuchsauswertung nicht anzuwenden!

Peakhöhe h

a0,1

Peakbreitein halber Höhe

Peakbasisbreite wb

Tangenten

wh

0,1 h b0,1

Bild 4 Peakprofil und Kenngrößen

8 Versuch 3

Bei der chromatographischen Trennung von 4-Aminobenzoesäu-re ist zu sichern, dass der Peak am oberen Rand des Schreibers nicht anstöst und nicht zu klein wird. Außerdem ist die Schreiber-geschwindigkeit signifikant zu vergrößern (ca. 2 cm/h, Rückspra-che mit dem Laborleiter), damit sowohl die Peakbreite in halber Höhe als auch die Retentionszeit mit Hilfe eines Lineals ausge-messen werden kann.

4.2 Trennung von Proteingemischen

Ein Proteingemisch (z.B. Blue Dextran und Vitamin B12 auch als Cyanocobalmin bezeichnet, bitte Rücksprache nehmen!) wird auf beide Säulen appliziert. Die Konzentrationen werden im Praktikum bekannt bzw. festgelegt. Vergleichen Sie Retentionsdaten (tR, Ve). Peakformen und achten Sie innerhalb des Chromatogrammverlau-fes ggf. auch auf Verunreinigungen.

Deshalb schliesen sich jetzt die Trennungen der einzelnen Pro-teine in gleicher Art und Weise an.

Erst danach ist es sinnvoll, komplexe Gemische von Standard-proteinen oder Serumproteinen zu untersuchen (Rücksprache).

4.3 Trennung einzelner Proteine

Die Herstellung einzelner neuer Proteinstandarlösungen wird im Praktikum abgesprochen. Außerdem stehen verschiedene Testlö-sungen für die SEC-Trennungen bereits zu Verfügung.

4.4 Trennung von Serumproteinen

Zur Erstellung von Protein-Pattern mittels SEC-Säulen dienen humane Seren von gesunden Probanden und von Probanden mit pathologischem Befund (Absprache).

5. Versuchsauswertung

5.1 Einscannen und Beschriften der Chromatogramme (vgl. auch das Bild 5).

5.2 Vergleichen Sie die theoretischen Bodenzahlen beider Säulen.

Versuch 3 9

5.3 Erstellen Sie eine Tabelle von den vermessenen Standard-proteinen, in der die Konzentrationen, die Molekülmassen und der logarithmischen Werte davon, die Retentionszeiten, die Retentionsvolumina und die KAV-Werte enthalten sind.

5.4 Graphische Darstellung der Elutionsvolumina der Standard-proteine vs. Logarithmen der Molekülmassen für beide SEC-Säulen.

5.5 Notieren Sie alle Parameter der Versuchs-Apparaturen.

Protokolle werden generell mit Hilfe eines PC´s angefertigt; handschriftliche Ausarbeitungen werden nicht entgegengenom-men! Alternativ: Protokoll-Testate durchführen (PKT-1 ...3).

6. Vorbereitung auf das Testat (bzw. PKT; + VL)

6.1 Definieren Sie die Begriffe Molekülmasse, Molekulargewicht, Dalton, atomare Masseeinheit.

6.2 Welche Unterschiede bestehen zwischen SEC und GPC?

6.3 Erklären Sie das Prinzip der SEC.

6.4 Wie werden Eichgeraden mit Standardproteinen erstellt?

6.5 Nennen Sie Gemeinsamkeiten und Unterschiede zwischen SEC und SDS-PAGE.

6.6 Welche weiteren biochromatographischen Methoden kennen Sie und welcher Trennmechanismus liegt zu Grunde?

6.7 Weitere/konkretere Schwerpunkte in der VL!

7. Informationsquellen

- Vorlesung Analytische Chemie (AC), Chromatographie. - Vorlesung Instrumentelle Bioanalytik (IBA), Biochroma-

tographie. - Vorlesung Protein- und Kohlenhydrat-Analytik(PKA),

und Biochromatographie. - Praktikum PKA – Versuch 2 „SDS-PAGE“ - Buch IA und BA, Springer-Verlag 2008

Seiten: 91-99, 129-134.

10 Versuch 3

8. Ausgewählte Ergebnisse

In Bild 5 ist die SEC-Trennung eines Proteingemisches – zu-sammengesetzt aus 6 Proteinstandards – dargestellt Es erfolgt weitestgehend Basislinientrennung zwischen den Komponenten.

Bild 6 zeigt die SEC-Trennung des Rohpräparates einer thermo-stabilen Protease mit Protein- und Aktivitätskurve. Die Zusam-mensetzung der Proteinfraktion ist noch sehr komplex. Als „Ver-unreinigungen“ werden vor allem Proteine des niedermolekularen Bereichs registriert. Die Hauptenzymaktivität liegt in der Fraktion zwischen der 28. und 29. Minute.

Nach erneuter SEC-Trennung dieser Fraktion (Rechromatogra-phie) unter identischen Elutionsbedingungen resultiert das in Bild 7 dargestellte Chromatogramm.

Durch Vergleich mit den Elutionsvolumina der Proteinstandards konnte eine Molekülmasse um 17 000 abgeschätzt werden.

Eine exaktere Bestimmung von Mr sowie die Reinheitsprüfung der Enzymfraktion erfolgt jedoch in der Regel mittels SDS-PAGE (vgl. Versuch 2). Die genaueste Methode zur Ermittlung der Mole-külmassen ist heutzutage die MALDI-MS (s. LV PKA).

Zeit (min) 0 10 20 30

1

2

3

4

5 6

-Säule: BIO-SIL TSK-250, 600 × 7,5 mm i.D.;

-mobile Phase: 0,05 M Na2SO4 + 0,02 M NaH2PO4, pH = 6,8;

-Flussrate: 0,9 ml/min;

-Vordruck: 3,2 Mpa;

-Detektion: UV, 280 nm;

-Empfindlichkeit: 5;

-Injektionsvolumen: 20 µl.

Bild 5 Chromatogramm einer Proteinstandardmischung 1: Thyroglobulin ( Mr = 660 000)

2: IgG (150 000)

3: Ovalbumin (43 000)

4: Myoglobin (17 000)

5: Cyanocobalmin (1 355)

6: DNA-Alanin (255)

Versuch 3 11

0 10 20 30 40 50Zeit (min)

PU /

ml

0

2

4Protease-aktivität

Protein-kurve

Bild 6 Chromatogramm mit Aktivitätskurve des Rohextraktes ei-ner thermostabilen Protease

Säule: BIO-SIL TSK-250, 600 × 7,5 mm i.D.; mobile Phase: 0,05 M Na2SO4 + 0,02 M NaH2PO4, pH = 6,8, Flussrate: 0,7 ml/min, Vordruck: 2,5 MPa, Detektion: UV, 280 nm, Empfindlichkeit: 5, Injektionsvolumen: 200 µl.

Protease-aktivität

PU /

ml

0

1

2

3

26 27 28 29 30 31

Zeit (min)

Protein-peak

Bild 7 Chromatogramm der „Rechromatographie“ der zwischen der 28. und 29. Minute isolierten Protease-Fraktion.

12 Versuch 3

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Versuch 3 13

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14 Versuch 4

Versuch 4

”Enzymatische Hydrolyse von Lactose in Milch“

1. Ausgangspunkt und Zielstellung

Kuhmilch enthält das dimere Kohlenhydrat Lactose zu einem An-teil von ca. 5%. Diesen Milchzucker vertragen vor allem Südlän-der nur wenig (Lactoseintoleranz, LIT), was durch Blähungen und Durchfall anzeigt wird.

Die Lactose kann demzufolge im Dünndarm auf Grund fehlen-der Enzyme (Lactase) nicht in die resorbierbaren Zucker Glucose und Galactose gespalten werden.

Probanden mit Lactoseintoleranz fügen deshalb den Milchpro-dukten Lactase hinzu, um aus Milchzuker (Laktose) verträgliche monomere Zucker zu erhalten.

Ziel des Versuches ist, Lactose enzymatisch in Abhängigkeit der Temperatur und Zeit (Anleitungen erfolgen im Praktikum!) zu hydrolysieren und sowohl den Ausgangszucker als auch die ent-stehenden Monosaccharide (Glucose, Galactose) qualitativ und quantitativ mittels Liganden-Austausch-Chromatographie (LEC) zu analysieren. Außerdem sind weitere Produkte („Katzenmilch“) und die aus eigener Haltung stammende Milch zu untersuchen.

2. Kenntnis-/Methodenstand

2.1 Lactose

Sie gehört wie Maltose und Saccharose zu den dimeren Koh-lenhydraten und wird durch Enzyme wie Lactase (Mensch) bzw. ß-Galactosidase (Bakterien) in Galactose und Glucose (s. Bild 1) ge-spalten.

Im Lactosemolekül sind diese beiden Zucker durch eine ß-1,4 glycosidische Bindung miteinander verknüpft.

Man unterscheidet auch zwischen α- und ß-Lactose; eine Gleich-gewichtslösung von Lactose enthält bei 25 °C etwa zu 38% der α-Lactose und zu 68% die ß-Form. Diese ist süßer und noch leich-ter in Wasser löslich, wogegen beide Formen in absolutem Alko-hol, Ether und Chloroform unlöslich sind.

Versuch 4 15

O

OH HH

OHH

HH

CH2OH

O

HO O

OH HH

OHH

H

CH2OH

OHHO

OH HH

OHH

HH

CH2OH

O

HO O

OH HH

OHH

H

CH2OH

OHH

O

OH HH

OHH

HH

CH2OH

HO O

OH HH

OHH

H

CH2OH

OHHOHO

OH HH

OHH

HH

CH2OH

HO O

OH HH

OHH

HHO

CH2OH

OHH

Lactase

Lactose

Galactose Glucose

ß-Galactosidase+ H2O

Bild 1 Enzymatische Hydrolyse von Lactose

2.2 Kohlenhydratverdauung

Der größte Teil der mit der Nahrung aufgenommenen Kohlen-hydrate besteht aus dem Polysaccharid Stärke. Die restlichen Kohlenhydrate setzen sich zusammen aus tierischem Glykogen, Disacchariden - wie z.B. Saccharose (Rohrzucker) und Lactose (Milchzucker) - und Monosacchariden, wie Glucose (Trauben-zucker), Galactose und Fructose (Fruchtzucker).

Mit Hilfe der im Mundspeichel enthaltenen α-Amylase (Ptyalin) beginnt die Kohlenhydratverdauung bereits im Mund, wobei Stär-ke in kleine Bruchstücke (Oligosaccharide, Disaccharide) enzyma-tisch gespalten wird.

Im Dünndarm wird die Verdauung der Kohlenhydrate in Gegen-wart einer weiteren α-Amylase (Pankreasamylase) und zahlrei-cher anderer zuckerspaltender Enzyme aus der Dünndarm-schleimhaut (Glykosidasen, Disaccharidasen) fortgesetzt (s. Bild 2).

16 Versuch 4

q

Speichelamylase

Monosaccharide

Zwölffinger-darm(Duodenum)

Bauchspeicheldrüse(Pancreas)

Speiseröhre (Oesophagus)

Magen(Gaster)

Kohlenhydrate

Pancreasamylase

Pfortader Leber (Hepar)

Disaccha-ridosen:Maltase,Lactase

Bild 2 Übersicht zur Kohlenhydratverdauung

Nach Spaltung durch Disaccharidasen (Maltase, Lactase, Sac-charidase) werden die Endprodukte der Kohlenhydratverdauung, die Monosaccharide (z.B. Glucose, Galactose, Fructose), schließ-lich über aktive und passive Transportmechanismen in die Dünn-darmepithelzellen aufgenommen (resorbiert), um von dort ins Blut und weiter zur Leber zu gelangen.

Häufig fehlen bestimmte Enzyme, wie z. B. die Lactase, was zur Folge hat, dass Milchzucker (Lactose) nicht aufgespalten und so-mit auch nicht resorbiert werden kann (Lactoseintoleranz, LIT).

2.3 Milch und Lactoseintoleranz

Milch von Haustieren dient seit ca. 10 000 Jahren als wertvolle Nahrungsquelle. Sie enthält Wasser, Proteine, Fette, Milchzucker, Mineralstoffe und Vitamine.

Während die Proteine (z.B. Caseine, Lactalbumin und Lacto-globin) als Aminosäurelieferanten für den Aufbau von körper-eigenen Eiweißen dienen, sind Fette und Milchzucker (Lactose) Energiequellen für den menschlichen Körper. Calcium wird zum Aufbau von Zähnen und Knochen benötigt; die Vitamine A, B1, B2, C, D und E schützen vor oxidativen Schädigungen und sind Bau-steine von Enzymen.

Tabelle 1 gibt einen Überblick zu den Inhaltsstoffen (W: Was-ser, P: Proteine, F: Fette, Lac: Lactose, MS: Mineralstoffe) der Milch unterschiedlicher Provenienz.

Versuch 4 17

Art W P F Lac MS

Mensch 87,6 1,2 4,1 6,9 0,2

Kuh 87,5 3,1 3,8 4,8 0,8

Schaf 82,7 5,3 6,3 4,9 0,9

Ziege 86,6 3,6 4,2 4,8 0,8

Pferd 90,0 2,2 1,5 5,9 0,4

Rentier 63,0 10,3 22,5 2,5 ?

Tabelle 1: Inhaltsstoffe verschiedener Milcharten [in %].

Verdauungsprobleme entstehen dann, wenn keine oder nur sehr wenig Lactase zur enzymatischen Spaltung der Lactose in Glucose und Galactose im Darm (s.o.) vorhanden ist. Das Disaccharid bin-det Wasser, welches deshalb vom Körper nicht resorbiert wird; Durchfälle sind die Folge.

Andererseits utilisieren Bakterien der Darmflora die Lactose z.T. zu Kohlendioxid, wodurch zusätzliche Blähungen entstehen.

Südeuropäer und Afrikaner stellen die Bildung von Lactase im Darm nach dem Säuglingsalter ein. Sie zeigen deshalb eine Lac-toseintoleranz mit den erwähnten Effekten.

Bemühungen in den vergangenen Jahrzehnten, den Menschen in den Ländern der Dritten Welt u.a. mit Milchpulver zu helfen, sind demzufolge aus heutiger Sicht wenig sinnvoll.

Vitamin D als Bestandteil der Milch spielt z.B. beim Aufbau der Knochen eine wichtige Rolle und kann im Körper bei Anwesenheit von ausreichend Licht selbst gebildet werden. Im dunklen Nor-den Europas ist im Laufe der Evolution dagegen bei den Menschen eine Lactoseverträglichkeit (Toleranz) entstanden.

Vitamin D-Produktion bei Lichtmangel – ist eingeschränkt.

2.4 Ligandenaustauschchromatographie

Die chromatographische Analyse des dimeren Kohlenhydrates Lactose und der monomeren Zucker (Glucose, Galactose) erfolgt mit Ligandenaustauschchromatographie (LEC: ligand exchange chromatography). Dazu dienen HPLC-Apparaturen (s. 3.1, 3.2).

Das chromatographische Prinzip der LEC-Methode (s. auch In-strumentelle Analytik und Bioanalytik, S. 125/126) basiert auf der Trennung der Zucker an der stationären Phase Styrol-Divivyl-benzol (engl.: styrene-divinylbenzene; s. Bild 3).

18 Versuch 4

CH

Styren

CH

CH

CH2 CH2

CH2

CH

CHDivinylbenzen

CH2 CH

CH2 CH

CH2

CH2

CH2 CH CH2

CH2 CH CH2

Styren-Divinylbenzen-Polymer

Bild 3 Styrene-divinylbenzene („Styrol-Divinylbenzol“); S-DVB

Das Trenmaterial ist sulfoniert und mit Kalzium (Ca2+) als Coun-terionen belegt (Bild 4).

S-DVB

S-DVB

SO3-

SO3-

Ca2+H2OH2O

H2O hydrophile WW

OH-Lactose

OH-Glucose

OH-Galactose

Bild 4 S-DVB mit Kalziumionen belegt

Die Selektivität wird durch das Metall-Kation und die Stabilität der komplex-koordinativen Bindung zwischen Metall und Mono- bzw. Disaccharid bestimmt. Die Phase lässt sich regenerativ mit unterschiedlichen Metallionen beladen. Sie ist weitestgehend druckstabil, langlebig und sehr selektiv.

H2O

Eluent/mo-bile Phase

Pumpe Injektor

Meß-küvette

Vergleichs-küvette

offen (purge)

Ofe

n (8

5°C

)

Tre

nn

säu

le

H2O H2O

ΔRI = 0

S[BIE]

tR [min]

Basislinie

Bild 5 RI-Detektion (Situation 1)

Versuch 4 19

H2O

Eluent/mo-bile Phase

Pumpe Injektor

Meß-küvette

Ofe

n (8

5°C

)

Tre

nn

säu

le

H2OVergleichs-

küvettegeschlossen

H2O+ Zucker

ΔRI > 0S[BIE]

tR [min]

Peak

Bild 6 RI-Detektion (Situation 2)

3. Material und Methoden

3.1 HPLC-Apparatur-A

- LDC Milton Roy Pumpe, Rheodyne-Ventil (Volumen: 20µl), - Trennsäule mit Thermostat (Temperatur: 88 °C), - RI- Detektor Bischoff 8110, - x-y-Schreiber, i.d.R. 24 cm/h, - Trennsäule: 200 x 3 mm i.d., - stationäre Phase: Aminex, - mobile Phase: entionisiertes Wasser.

3.2 HPLC-Apparatur-B

- Merck Hitachi Pumpe L-6000A, - Rheodyne-Ventil (Volumen: 20µl), - Trennsäule mit Thermostat (Temperatur: 85 °C), - Merck Hitachi RI- Detektor L-7490, - x-y-Schreiber (W+W Recorder 1100), - Trennsäule: 300 x 8 mm i.d., - stationäre Phase: Aminex, - mobile Phase: entionisiertes Wasser.

20 Versuch 4

3.3 Zubehör (s. Vorbereitungsplatz)

- Lactose, Glucose, Galactose, - Lactasetabletten, - 5ml-, 10ml-, 50ml-, 100 ml-Kolben, - Spatel, Wägepapier, Trichter, Becherglässer, - Dosierspritzen (500 µl u.a.), - Analysenwaage (s. Spektroskopie-Labor), - Wasserbad.

4. Versuchsdurchführung

A: Herstellung der Testlösungen (z.T. modifiziert)

Es werden Testgemische für Lactose, Glucose und Galactose mit einer Konzentration von jeweils 1g Zucker /L (hochreines Wasser) hergestellt (Stammlösungen). Als Gefäße dienen 50ml-Kolben. Zum Auffüllen der Kolben bis zum Eichstrich werden mit Wasser gefüllte Bechergläser und 500µl-Dosierspritzen eingesetzt.

Zur Herstellung von Verdünnungen ist es günstig, wenn der Maßkolben zuerst mit entionisiertem Wasser bis zum Eichstrich aufgefüllt wird. Danach soll so viel Wasser aus dem Kolben mittels Dosierspritze entnommen werden, wie anschließend an Stammlö-sung bzw. Probelösung (z.B. Milch) zur Realisierung der entspre-chenden Verdünnung hinzugefügt werden muss.

B: Ermittlung der Retentionszeiten und Peakhöhen

Zur Ermittlung der Retentionszeiten und Peakhöhen werden die 3 Stammlösungen 1:4 V/V verdünnt und einzeln chromato-graphiert. Wenn genügend Zeit ist, sollen Doppel- oder Dreifach-bestimmungen erfolgen.

C: Hestellung der Milchlösungen

Milchlösungen (Kuhmilch, Wiskas, u.a.) werden mit entioni-siertem Wasser im Verhältnis 1:100 V/V verdünnt (z.B. 500 µl Milch in 50 ml Wasser, 250 µl/25 ml) und in die Chromatographie-Apparatur appliziert.

Neue Optimierungen dafür sind permanent – bitte Rücksprache mit dem Laborleiter nehmen!

Versuch 4 21

D: Kinetik der enzymatischen Hydrolyse von Lactose

In Abhängigkeit der Temperatur und Zeit (Festlegungen werden im Praktikum getroffen) erfolgt nach Zugabe von Lactase-Kapseln (Anzahl, Herkunft der Kapseln wird im Praktikum festgelegt) zu 80 ml Milch die enzymatische Spaltung der Lactose.

Zu den ausgewählten Zeiten bei entsprechender Temperatur werden 500 µl (s.o.) entnommen und in einem 50 ml-Kolben mit entionisiertem Wasser gut gemischt. Danach erfolgt die chroma-tographische Analyse.

5. Versuchsauswertung (Absprache)

a) Die Konzentrationen der identifizierten Kohlenhydrate in Kuh- und Katzenmilch werden quantitativ bestimmt (Peakhöhen, Konzentration der Testlösung, Dreisatz).

b) Die Konzentrationen an Lactose, Glucose, Galactose sind eben-falls in den Proben des enzymatischen Abbaus zu ermitteln und graphisch darzustellen.

c) Mindestens 1 Chromatogramm mit entsprechender Beschrif-tung und den verwendeten Parametern ist einzufügen (Scannen ist im Labor möglich, vgl. z.B. auch Bild 7).

Protokolle werden generell mit Hilfe eines PC´s angefertigt; handschriftliche Ausarbeitungen werden nicht entgegengenom-men!

6. Vorbereitung auf das Testat

6.1 Wie erfolgt die enzymatische Spaltung von Lactose?

6.2 Beschreiben Sie den prinzipiellen Aufbau der Messplätze.

6.3 Was versteht man unter Ligandenaustauschchromatographie (LEC)? Beschreiben Sie das Trennprinzip in einzelnen Schritten!

6.4 Was ist Lactoseintoleranz (LIT)?

6.5 Welche Beschwerden treten bei LIT auf und warum?

22 Versuch 4

7. Informationsquellen

- Vorlesung Analytische Chemie (AC), Chromatographie. - Vorlesung Instrumentelle Bioanalytik (IBA), Biochroma-

tographie. - Vorlesung Protein- und Kohlenhydrat-Analytik (PKA),

Biochromatographie. - http://www.papa-gey.de/publikationen/publ.pdf - Buch IA und BA, Springer-Verlag 2008, 125-126.

8. Ausgewählte Ergebnisse

Das Bild 7 zeigt die chromatographische Trennung von Lactose, Glucose und Galactose.

1: Lactose2: Glucose3: Galactose

1

23

Sta

rt

Bild 7 Testchromatogramm von Kohlenhydraten

Säule: Polyspher-Zucker-Säule, 300 x 7,8 mm i.D.,mob.Phase: Wasser, Temperatur: 85 °C,Flow: 0,4 ml/min, Vordruck: 52 bar,RI-Detektion: 8 x 10-6 BIE (Brechungs-Index-Einheiten),Schreiber-Speed: 24cm/h,Injektionsvolumen: 5 µL, Verdünnung: 1:400V/V (250µL Milch auf 100mL Wasser).

Versuch 4 23

Kuhmilch

Lactose

Wiskas

1

23 1: Lactose

2: Glucose3: Galactose

Analyse von Lactose, Glucose und Galactose in Milchprodukten

Bild 8 Analyse von Lactose in Milch (rechts) und der Zucker in Katzenmilch (links: Wiskas).

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24 Versuch 4

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