LÍNEA EDITORIAL: NUEVA ETAPA, NUEVOS HORIZONTES
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DICIEMBRE 2016. Volumen 4
QUERATITIS POR ACANTHAMOEBA SPP. EN PACIENTE USUARIO DE LENTES DE CONTACTO
CREACIÓN DE LIBRERÍAS MEDIANTE AMPLIFICACIÓN DEL ARNr 16S PARA
CARACTERIZACIÓN DE LA MICROBIOTA
ASCARIS LUMBRICOIDES EN VIAJERO QUE REGRESA DE PERÚ
LÍNEA EDITORIAL:
NUEVA ETAPA, NUEVOS HORIZONTES
DIAGNOSTICO DE LOIASIS EN NIÑA CON EOSINOFILIA
CADENA DE CUSTODIA PARA EL PROCESAMIENTO DE ETANOL EN SUERO
Laboratory Medicine at a glance
Medicina de Laboratorio de un vistazo
VOL.4 ISSN 2444-8699
LÍNEA EDITORIAL DE NUESTRA REVISTA
Nueva etapa, nuevos horizontes
Estimados lectores,
Ya llevamos un año desde que AEBM decidió aventurarse a publicar una
revista de imágenes del Laboratorio Clínico. Laboratory Medicine at a glance publica
su cuarto volumen y ante todo queremos agradecer el apoyo y la acogida que ha
tenido dentro de nuestro ámbito. Han sido muchos los trabajos que hemos recibido y
los autores que se han volcado para hacer de ésta una revista interesante e
innovadora, que permite mostrar el lado más “visual” del Laboratorio Clínico, muchas
veces abocado a no mostrar más que cifras y unidades.
Desde su lanzamiento los profesionales del laboratorio han estado atentos para
captar esa foto que resulte atractiva y digna de compartir con sus colegas. Sin
embargo, LabMed quiere dar un paso más. Anticipamos que el próximo año nuestra
revista presentará numerosas novedades que van a constituir un giro significativo en
su forma, presentación y contenidos.
Tenemos un gran interés en ir más allá del caso clínico e introducir
esquemas, algoritmos, mapas de procesos, pictogramas… todo aquello que
cualquier profesional del laboratorio querría tener en su escritorio de ordenador,
pegado en la pared frente a su puesto de trabajo, descargado en su móvil… en
definitiva “tener a mano” para consultarlo durante el desempeño de su trabajo
cotidiano. Esa imagen que aparece en las sesiones clínicas o en las ponencias de
congresos, y que pedimos por favor al autor que nos pase porque nos parece
atractiva y práctica, ya que resume de un vistazo información que manejamos
diariamente.
DICIEMBRE 2016. Volumen 4
QUERATITIS POR ACANTHAMOEBA SPP. EN PACIENTE USUARIO DE LENTES DE CONTACTO
CREACIÓN DE LIBRERÍAS MEDIANTE AMPLIFICACIÓN DEL ARNr 16S PARA
CARACTERIZACIÓN DE LA MICROBIOTA
ASCARIS LUMBRICOIDES EN VIAJERO QUE REGRESA DE PERÚ
LÍNEA EDITORIAL:
NUEVA ETAPA, NUEVOS HORIZONTES
DIAGNOSTICO DE LOIASIS EN NIÑA CON EOSINOFILIA
CADENA DE CUSTODIA PARA EL PROCESAMIENTO DE ETANOL EN SUERO
Editores Gema María Varo Sánchez
Luis Francisco Sáenz Mateos
Joaquín Bobillo Lobato
Fecha de publicación 29 diciembre 2016
Páginas Páginas 1-2
VOLUMEN 4
LÍNEA EDITORIAL DE NUESTRA REVISTA 02
Laboratory Medicine at a glance
No queremos que LabMed sea una revista de imágenes curiosas, ojeada para pasar el tiempo, como
entretenimiento. Queremos que nuestros lectores esperen cada nueva publicación con impaciencia e ilusión,
pensando que en el siguiente número pueden encontrar aquella herramienta que les resuelva ese problema
que no consiguen solventar o les haga más fácil aquella tarea que ya se habían resignado a ejecutar de
forma más o menos tediosa y automática una y otra vez.
Esperamos que el nuevo ciclo que comenzaremos con los siguientes números de Laboratory Medicine
at a glance, supongan una nueva ilusión para nuestros lectores y un nuevo estímulo para nuestros autores.
Ánimo, esperamos ansiosos vuestros trabajos.
“La alegría de ver y entender es el más perfecto don de la naturaleza”
Albert Einstein (1879-1955)
Problemas
Visión
Imaginación
Problemas
SOLUCIONES
Empeño
Procesos
IDEAS
Trabajo
Respuestas
Conceptos
Laboratory Medicine at a glance
Medicina de Laboratorio de un vistazo
VOL.4 ISSN 2444-8699
PARASITOSIS EN UN VIAJERO QUE REGRESA DE ZONA
TROPICAL
PARASITOSIS OF A TRAVELLER RETURNING FROM A TROPICAL
ZONE
Figura 1. Examen macroscópico de adulto de Ascaris lumbricoides con extremo posterior curvado (detalle parte inferior izquierda). En la parte inferior derecha observamos huevo infértil en examen en fresco a 400 aumentos. Figure 1. Macroscopic examination of adult Ascaris lumbricoides with curved posterior end (detail lower left). Lower right part: 400X fresh examination of an unfertilized egg of Ascaris lumbricoides.
Los autores presentan una composición de The authors present an image composition in
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CREACIÓN DE LIBRERÍAS MEDIANTE AMPLIFICACIÓN DEL ARNr 16S PARA
CARACTERIZACIÓN DE LA MICROBIOTA
ASCARIS LUMBRICOIDES EN VIAJERO QUE REGRESA DE PERÚ
LÍNEA EDITORIAL:
NUEVA ETAPA, NUEVOS HORIZONTES
DIAGNOSTICO DE LOIASIS EN NIÑA CON EOSINOFILIA
CADENA DE CUSTODIA PARA EL PROCESAMIENTO DE ETANOL EN SUERO
Autores Ana de Malet Pintos-Fonseca
1
Israel Gañán Nieto2
Centro 1
Servicio de Microbiología.
Hospital Comarcal de
Valdeorras, Ourense. 2
Servicio de Inmunología.
Hospital Universitario Ramón y
Cajal, Madrid.
Fecha de publicación 29 diciembre 2016
Páginas Páginas 3-8
VOLUMEN 4
PARASITOSIS EN UN VIAJERO QUE REGRESA DE ZONA TROPICAL 04
Laboratory Medicine at a glance
imágenes en la cual, la parte inferior derecha es una
extensión de heces frescas, donde se observa a 400
aumentos un huevo alargado de unas 80x45 μm sin
membrana vitelina, con una cubierta fina muy
irregular y mamelonada, masa citoplasmática con
gránulos amorfos y refringentes identificado como un
huevo infértil de Ascaris lumbricoides. En la parte
superior de la imagen se observa en examen
macroscópico un nematodo adulto de color
ligeramente rosáceo con unos 20 cm de largo, 4 mm
de ancho y con la terminación del extremo caudal
ligeramente curvada (detalle en parte inferior
izquierda), identificado como un macho adulto de
Ascaris lumbricoides.
Ambas formas parasitarias se aíslan de un
varón de 37 años que acude en repetidas ocasiones
al Servicio de Urgencias por referir dolor abdominal
de un mes de evolución. Como dato destacable el
paciente indica viaje a una zona rural de Perú hace 4
meses con ingesta de agua no tratada.
En la exploración física se refiere abdomen
blando con dolor localizado en la zona del
hipocondrio derecho irradiado a la parte posterior.
Tras revisar la historia clínica no se observa ningún
dato destacable excepto la presencia de eosinofilia
progresiva desde la primera vez que acude al
Servicio de Urgencias (ver tabla).
La analítica en el momento del ingreso
presenta una amilasa ligeramente elevada, lipasa
normal, marcada eosinofilia y perfil hepático
ligeramente alterado.
which, the lower right is a 400X fresh stool
examination, where an elongated egg of about 80x45
μm without vitelline membrane, with a very irregular
and mamelonated thin covering and cytoplasmic
mass with amorphous and refracting granules is
showed, being identified as an infertile egg of Ascaris
lumbricoides. In the upper part of the image, an adult
nematode of slightly pinkish color, about 20 cm long,
4 mm wide and with a slightly curved caudal end (left
lower part) is presented, being identified as an adult
male of Ascaris lumbricoides.
Both parasitic forms are isolated from a 37-
year-old male who comes frequently to the
Emergency Department for abdominal referred pain
of a month of evolution. The patient indicates trip to a
rural area of Peru 4 months ago with ingestion of
untreated water.
The exploration revealed soft abdomen with
pain located in the right hipocondry radiating to the
back. Medical history don´t revealed any important
finding, except the presence of progressive
eosinophilia since the first time he came to the
Emergency Department (See table).
Admission laboratory testing revealed a slightly
elevated amylase, normal lipase, high eosinophilia
and a tiny liver function alteration.
VOLUMEN 4
PARASITOSIS EN UN VIAJERO QUE REGRESA DE ZONA TROPICAL 05
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ANÁLISIS BIOQUÍMICO EN SANGRE PERIFÉRICA
Analítica ingreso
Rango Unidades
Amilasa 135 (25-125) U/L
Lipasa 20 (8 -78) U/L
Albúmina 43 (40 - 50) g/L
Bilirrubina Total
2 (0,20 -1,20) mg/dL
AST/GOT 60 (4 - 50) U/L
ALT/GPT 44 (5 - 40) U/L
GGT 44 (10 - 50) U/L
Fosfatasa Alcalina
200 (53 - 128) U/L
Tiempo de Protrombina
15 (9,70-12,60) sg
Al día siguiente del ingreso se realiza un
estudio parasitológico en heces donde se observa un
huevo infértil de Ascaris lumbricoides.
Tras el hallazgo se inicia tratamiento con
albendazol oral 400 mg/día durante una semana. A
los siete días de ingreso, al empeorar el perfil
hepático, se decide realizar una
colangiopancreatografía retrógrada endoscópica
donde se extrae del conducto biliar un macho adulto
de Ascaris lumbricoides.
Ascaris lumbricoides es el nematodo intestinal
más frecuente en el mundo, afectando alrededor de
un billón de personas1. Presenta una elevada
prevalencia en las regiones tropicales y subtropicales
de los países subdesarrollados o en vías de
One day after admission, a parasitological
study was performed in stools, where an infertile egg
of Ascaris lumbricoides is observed.
Knowing these microbiological findings, a
treatment with oral albendazole 400 mg/day for a
week was started. After seven days of admission, to
worsen liver profile, it was performed an endoscopic
retrograde cholangiopancreatography, extracting an
adult form of Ascaris lumbricoides from bile duct.
Ascaris lumbricoides is the most common
intestinal nematode in the world, affecting around one
billion people1. It has a high prevalence in the tropical
and subtropical regions of the underdeveloped or
developing countries of Africa, Latin America and
Asia2-3.
VOLUMEN 4
PARASITOSIS EN UN VIAJERO QUE REGRESA DE ZONA TROPICAL 06
Laboratory Medicine at a glance
desarrollo de África, Latinoamérica y Asia2,3
.
La ascariasis es una parasitosis cosmopolita,
más frecuente en poblaciones con condiciones
socioeconómicas y sanitarias deficitarias1-3
. En los
países desarrollados es muy poco común, siendo los
casos documentados de población emigrante o
viajeros que regresan de zonas endémicas3. La
mayoría de los casos suelen ser asintomáticas sobre
todo en la fase larvaria y siguen un curso benigno2,
pero puede haber complicaciones cuando se
producen migraciones ectópicas, de modo que tanto
el parásito adulto como las larvas invaden los
conductos de Wirsung o biliar causando colangitis,
pancreatitis o abscesos hepáticos2. Otra
complicación, pero debida a la elevada concentración
de parásitos, es la perforación de la mucosa
intestinal pudiendo provocar peritonitis, apendicitis u
oclusión intestinal. Cuando la concentración de
helmintos se localiza en vías aéreas puede provocar
infiltrados pulmonares o asfixia por oclusión de la
tráquea1.
El período prepatente de la ascariasis es de
dos a tres meses4.
La puerta de entrada del parásito es la ingesta
directa de larvas L4 o de alimentos contaminados
con huevos embrionados. El siguiente esquema
resume el ciclo vital de Ascaris lumbricoides.
Ascariasis is a cosmopolitan parasitosis, more
frequent in populations with socioeconomic and
health deficient conditions1-2-3
. It is very rare in
developed countries, with documented cases of
migrant population or travellers returning from
endemic areas3. Most cases are usually
asymptomatic, with a good evolution especially in the
larval stage2, but may have complications when
ectopic migration occurs, so that both the adult and
larvae invade the bile or Wirsung ducts causing
cholangitis, pancreatitis or liver abscesses2. Another
complication due to the high concentration of
parasites is the perforation of the intestinal mucosa,
which may cause peritonitis, appendicitis or intestinal
obstruction. Pulmonary infiltrates or asphyxiation by
windpipe can occur when the concentration of
helminthes is located in airways1.
The prepatent period of ascariasis is two to
three months4.
The gateway of the parasite is direct ingestion
of L4 larvae or contaminated food with embryonated
eggs. The following outline summarizes the life cycle
of Ascaris lumbricoides.
VOLUMEN 4
PARASITOSIS EN UN VIAJERO QUE REGRESA DE ZONA TROPICAL 07
Laboratory Medicine at a glance
Figura 2. Ciclo de vida del Ascaris lumbricoides. Figure 2. Ascaris lumbricoides lifecycle.
Durante el pasaje larvario pulmonar se puede
desarrollar síndrome de Löffler o neumonía
eosinofílica, manifestándose con irritación, tos y
disnea5.
La presencia del parásito se puede detectar
por técnicas radiológicas2, aunque habitualmente su
identificación se hace mediante observación directa
macroscópica y microscópica de los nematodos en
fase adulta, larvaria o de los huevos4.
El tratamiento de elección es albendazol,
mebendazol o ivermectina y como alternativa
pamoato de pirantel o nitazosamida. En caso de
ascariasis biliar no complicada la eliminación
It is possible to develop Löffler syndrome or
eosinophilic pneumonia during the larval pulmonary
passage, which are showed with irritation, coughing
and breathlessness5.
Presence of helminthes can be detected by
imaging techniques2, but usually their identification is
done by direct observation of macroscopic and
microscopic nematodes in adult, larvae or eggs
phases4.
The treatment of choice is albendazole,
mebendazole or ivermectin and pyrantel pamoate or
nitazosamida alternatively. Spontaneous parasite
elimination occurs in 80% of cases of uncomplicated
VOLUMEN 4
PARASITOSIS EN UN VIAJERO QUE REGRESA DE ZONA TROPICAL 08
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espontánea del parásito ocurre hasta en 80 % de los
casos. La colangiopancreatografía está indicada
cuando se sospecha una complicación, deterioro
clínico o cuando falla el tratamiento farmacológico2.
En nuestro caso hubo que combinar el tratamiento
con albendazol y la colangiopancreatografía.
biliary ascariasis. Cholangiopancreatography is
indicated when a complication, clinical deterioration
or when drug treatment fails is suspected2. In our
case, we combined treatment with albendazole and
cholangiopancreatography.
Bibliografía/References:
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CREACIÓN DE LIBRERÍAS MEDIANTE AMPLIFICACIÓN
DEL ARN RIBOSOMAL 16S PARA LA CARACTERIZACIÓN
DE LA MICROBIOTA
LIBRARY GENERATION THROUGH RIBOSOMAL RNA 16S GENE
AMPLIFICATION FOR DETERMINING MICROBIOTA COMPOSITION
Figura 1. Esquema del proceso seguido para la creación de librerías mediante amplificación del gen del ARNr 16S. La región amplificada comprende a las regiones variables V3 y V4 y la región conservada que se encuentra entre ellas. Una primera PCR se realiza con los primers específicos V3-V4 que contienen los adaptadores para los índices Nextera XT. En una segunda PCR, se añaden los índices para introducir una combinación única para cada muestra y las secuencias P5 y P7 (que hibridan con los adaptadores de la célula de flujo del sistema MiSeq). Tras normalizar la cantidad de cada muestra que se añade al pool final, las librerías están listas para ser secuenciadas mediante MiSeq. Figure 1. Summary of the approach followed for the generation of 16S rRNA gene libraries. The amplified region comprised variable regions V3 and V4 and the conserved region between them. A first PCR was performed with specific primers for V3-V4 that contain adaptors for Nextera XT indexes. In a second PCR, a different combination of indexes for each sample and P5/P7 sequences (which hybridise with flow cell adaptor in the MiSeq system) were introduced. After normalization of the quantity of each sample that was included in the final pool, libraries were ready to be sequenced in the MiSeq system.
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CREACIÓN DE LIBRERÍAS MEDIANTE AMPLIFICACIÓN DEL ARNr 16S PARA
CARACTERIZACIÓN DE LA MICROBIOTA
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DIAGNOSTICO DE LOIASIS EN NIÑA CON EOSINOFILIA
CADENA DE CUSTODIA PARA EL PROCESAMIENTO DE ETANOL EN SUERO
Autores Emilio J. Laserna Mendieta
Marcus J. Claesson
Centro School of Microbiology and
APC Microbiome Institute,
University College Cork, Cork,
Ireland
Fecha de publicación 29 diciembre 2016
Páginas Páginas 9-13
VOLUMEN 4 CREACIÓN DE LIBRERÍAS MEDIANTE AMPLIFICACIÓN DEL ARN
RIBOSOMAL 16S PARA LA CARACTERIZACIÓN DE LA MICROBIOTA 10
Laboratory Medicine at a glance
Una gran cantidad de estudios
metagenómicos, cuyo objetivo es la determinación de
la composición bacteriana de un determinado tipo de
muestra, se han realizado mediante el análisis por
secuenciación masiva de librerías resultantes de la
amplificación por PCR del gen procariota del ARN
ribosómico (ARNr) 16S. Este gen posee una longitud
de 1542 pares de bases y está formado por nueve
regiones variables entre las que se intercalan
regiones conservadas. Son precisamente los
fragmentos resultantes de la amplificación de una o
dos regiones variables del ARNr16S las que
mayoritariamente se han empleado en la
caracterización filogenética de las diversas especies
bacterianas que constituyen la microbiota humana1.
Una de las fuentes principales de variabilidad
de este tipo de estudios, aparte del método de
extracción del ADN y de la plataforma de
secuenciación, lo constituye la elección de los
primers empleados en la amplificación del ARNr
16S2. La evaluación in silico que Klindworth y
colaboradores3 llevaron a cabo sobre este aspecto,
demostró que una pareja de primers degenerados
(es decir, que tienen en varias posiciones dos o más
bases nucleotídicas) para las regiones V3-V4
mostraba los resultados más prometedores, lo que
ha extendido su uso en posteriores trabajos (casi 300
citas a finales de septiembre de 2016).
En nuestro laboratorio hemos venido
realizando diversos proyectos encaminados a la
caracterización de la microbiota presente en
muestras humanas de heces y biopsias intestinales,
de modo que el ADN es extraído y posteriormente
amplificado en dos PCR consecutivas (Figura 2). El
objetivo es la construcción de librerías que contienen
los amplicones del gen del ARNr16S de diversas
muestras, protocolo que se esquematiza en la Figura
1. Dicho protocolo toma como referencia el método
Many metagenomic studies are aimed at
determining the bacterial composition in a specific
type of sample. This is usually performed by next-
generation sequencing analysis of the data obtained
from libraries created by PCR amplification of the
prokaryotic 16S ribosomal RNA (rRNA) gene. This
gene has a length of 1542 base pairs and it is
composed by nine variable regions and interspaced
by more conserved regions. The amplification of one
or two of these variable regions of the 16S rRNA
gene is a common approach employed in the
phylogenetic identification of hundreds of species that
are present in the human microbiota1.
One of the main sources of variation in these
sorts of studies, apart from the DNA extraction
method and the sequencing platform, is the choice of
primers used in 16S rRNA gene amplification2.
Klindworth and co-authors3 carried out an in silico
evaluation about this issue and described a couple of
degenerate primers (that is, with two or more
nucleotide bases in several positions) for regions V3-
V4 as those showing the most promising results. As a
result, these primers have been widely employed in
later studies (almost 300 cites at the end of
September 2016).
In our laboratory, we have been analysing
microbiota composition across multiple studies from
hundreds of stool and biopsy human samples. Here,
DNA was extracted from those samples and
employed for two consecutive PCR amplifications
(Figure 2). In this way and following the protocol
summarized in Figure 1, we have created libraries
that contain amplicons of the 16S rRNA gene from
several samples. This approach was based in the
method recommended by Illumina4, although some
modifications were introduced.
.
VOLUMEN 4 CREACIÓN DE LIBRERÍAS MEDIANTE AMPLIFICACIÓN DEL ARN
RIBOSOMAL 16S PARA LA CARACTERIZACIÓN DE LA MICROBIOTA 11
Laboratory Medicine at a glance
recomendado por Illumina4 aunque introduciendo
algunos cambios.
Figura 2. En la parte izquierda se puede observar el resultado de la PCR de amplificación del gen del ARNr16S en seis muestras de ADN extraído de heces humanas. Se distingue claramente una banda específica de tamaño entre 500 y 600 pares de bases. En la parte derecha, se puede visualizar el resultado de la PCR empleando los índices Nextera XT, de modo que ahora los amplicones poseen un tamaño superior a los 600 pares de bases. En ambos casos las muestras se corrieron en un gel de agarosa al 2% teñido con Midori Green (NipponGenetics). Figure 2. On the left, it is shown the PCR result for 16S rRNA gene amplification in six DNA samples from human faeces. Clear and specific bands are observed in the size range of 500-600 base pairs. On the right, it is shown the PCR result employing Nextera XT indexes, thus now amplicons have a size higher than 600 base pairs. In both cases, samples were run in a 2% agarose gel stained with Midori Green (Nippon Genetics).
El primer paso consiste en una PCR con los
primers V3-V4 a los que se les añade la secuencia
adaptadora para los índices Nextera XT de Illumina.
Así, la secuencia completa (nomenclatura IUPAC) de
los primers empleados es:
The first step consisted in a PCR with V3-V4
primers where an adaptor sequence for Nextera XT
indexes (Illumina) was added to. Thus, the complete
sequence for these primers was (IUPAC
nomenclature):
Directo (Forward):
5' TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGCCTACGGGNGGCWGCAG 3'
Reverso (Reverse):
5' GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGGACTACHVGGGTATCTAATCC 3'
VOLUMEN 4 CREACIÓN DE LIBRERÍAS MEDIANTE AMPLIFICACIÓN DEL ARN
RIBOSOMAL 16S PARA LA CARACTERIZACIÓN DE LA MICROBIOTA 12
Laboratory Medicine at a glance
Esta reacción de amplificación se realiza
usando una polimerasa de alta fidelidad (en nuestro
caso, Phusion High-Fidelity DNA polymerase
suministrada por ThermoScientific). Las condiciones
para la PCR son: 98°C durante 30 s, seguido de 25
ciclos de 98°C durante 10 s, 55°C durante 15 s y
72°C durante 20 s, con un ciclo final de 72°C durante
5 min. Los productos de la PCR son purificados
mediante bolitas magnéticas (AgencourtAMPure XP
beads, suministradas por Beckman-Coulter). A
continuación, se usan 5 µL del ADN purificado para
la segunda PCR con los primers de los índices
Nextera XT. El programa para esta PCR es el mismo
que para la PCR del 16S, con la salvedad de que
sólo se realizan 8 ciclos de amplificación. Con esta
PCR, se consigue que para cada muestra los
amplicones 16S posean una combinación de índices
única que la diferencia del resto. Tras realizar una
nueva purificación del ADN resultante, se procede a
la cuantificación de su concentración, para lo cual se
emplean métodos de alta sensibilidad para el ADN
de doble cadena como el Quant-iTPicogreen o Qubit
(suministrados por ThermoScientific). Finalmente, se
prepara un pool, es decir, se mezclan todas las
muestras en un único tubo de modo que la cantidad
de ADN sea la misma para todas ellas, y dicho pool
se diluye a una concentración adecuada para
secuenciación mediante el sistema MiSeq de
Illumina.
Los resultados de la secuenciación han de ser
procesados mediante las correspondientes
herramientas bioinformáticas para obtener la
composición bacteriana de cada muestra. Esta
metodología ha sido empleada con éxito en el
estudio sobre la comparación de microbiota en
personas tratadas a largo plazo con inhibidores de la
bomba de protones e individuos control, que mostró
cambios en la microbiota intestinal (como el ratio
This PCR reaction was performed using a
high-fidelity DNA polymerase (in our case, Phusion
High-Fidelity DNA polymerase, purchased from
Thermo Scientific). PCR conditions were: 98°C for 30
s, followed by 25 cycles of 98°C for 10 s, 55°C for 15
s and 72°C for 20 s, with a final extension step of
72°C for 5 min. PCR products were purified using
magnetic beads (Agencourt AMPure XP beads,
purchased from Beckman-Coulter). Then, 5 µL of the
purified DNA were used in the second PCR that
employed primers from Nextera XT indexes. The
program for this second PCR was the same set up for
16S rRNA PCR, only changing the amplification
cycles from 25 to 8. After this PCR, we achieved 16S
amplicons that had a different and unique
combination of indexes for every single sample. After
a new purification of the second PCR products, DNA
quantification is performed employing high sensitivity
methods for double stranded DNA, like Quant-iT
Picogreen or Qubit (both from Thermo Scientific).
Finally, we pooled all samples, which should have the
same final concentration, by mixing them in one
single tube. This pool was afterwards diluted to
achieve an adequate concentration to be sequenced
in the MiSeq system (Illumina).
Sequencing results have to be processed
using properly selected bioinformatic pipelines to get
the bacterial composition of each sample. This
methodology was successfully employed in a study
carried out in our laboratory about stool microbiota
comparison between people in long-term treatment
with proton pump inhibitors and control individuals.
The analysis of 16S rRNA gene amplicons recently
revealed changes in the colonic microbiota, as the
Firmicutes/Bacteroides ratio, associated to the long-
term prescription of these types of drugs5.
VOLUMEN 4 CREACIÓN DE LIBRERÍAS MEDIANTE AMPLIFICACIÓN DEL ARN
RIBOSOMAL 16S PARA LA CARACTERIZACIÓN DE LA MICROBIOTA 13
Laboratory Medicine at a glance
entre los filos Firmicutes/Bacteroides) asociados al
uso de estos fármacos5.
Bibliografía/References:
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Laboratory Medicine at a glance
Medicina de Laboratorio de un vistazo
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QUERATITIS POR ACANTHAMOEBA SPP. EN PACIENTE
USUARIO DE LENTES DE CONTACTO
ACANTHAMOEBA KERATITIS IN CONTACT LENS WEARER
Figura 1. Quistes de Acanthamoeba spp. Figure 1. Acanthamoeba spp. cysts
DICIEMBRE 2016. Volumen 4
QUERATITIS POR ACANTHAMOEBA SPP. EN PACIENTE USUARIO DE LENTES DE CONTACTO
CREACIÓN DE LIBRERÍAS MEDIANTE AMPLIFICACIÓN DEL ARNr 16S PARA
CARACTERIZACIÓN DE LA MICROBIOTA
ASCARIS LUMBRICOIDES EN VIAJERO QUE REGRESA DE PERÚ
LÍNEA EDITORIAL:
NUEVA ETAPA, NUEVOS HORIZONTES
DIAGNOSTICO DE LOIASIS EN NIÑA CON EOSINOFILIA
CADENA DE CUSTODIA PARA EL PROCESAMIENTO DE ETANOL EN SUERO
Autores Ana Peña Cabia1
Jorge Alfredo Pérez García2
Mª José Rodríguez Escudero2
Centro 1 Servicio de Análisis Clínicos. 2 Servicio de Microbiología
Clínica.
Hospital Virgen de la Luz.
Cuenca.
Fecha de publicación 29 diciembre 2016
Páginas Páginas 14-18
VOLUMEN 4 QUERATITIS POR ACANTHAMOEBA SPP. EN PACIENTE USUARIO
DE LENTES DE CONTACTO 15
Laboratory Medicine at a glance
La imagen corresponde a una mujer de 35 años
en estudio por presentar dolor en ojo izquierdo. Se
observan quistes de Acanthamoeba spp. examinados
a microscopio óptico (100x), en el líquido de limpieza
de las lentillas. Se utilizó la tinción azul de metileno.
Para ello, en un portaobjetos se realiza una
suspensión homogénea entre el líquido de lentillas y
el colorante. Este método permite distinguir
correctamente los diferentes protozoos basándose en
las características morfológicas de cada uno de ellos.
En el quiste de Acanthamoeba spp. se puede observar
la existencia de una doble pared celular, la externa
conocida como ectocisto, delgado y ondulado, y la
interna conocida como endocisto, de aspecto
redondeado.
Este parásito que se encuentra en el aire, tierra
y agua fue reconocido como agente patógeno ocular
en la década de los 70. Se dividen en tres grupos
según las diferencias de tamaño y características
morfológicas de los quistes. El tamaño del quiste
puede variar de 13 a 20 μm de acuerdo a la especie1.
Presenta dos estadios: una forma activa o
trofozoito y una forma latente o quiste. La formación
del quiste ocurre bajo condiciones ambientales
adversas, como la falta de alimento, cambios de
temperatura y pH. Si el quiste rompe, se libera el
parásito y esto sucede cuando las condiciones
ambientales se vuelven de nuevo favorables.
Acanthamoeba spp. puede entrar a través de los ojos,
por contacto con agua contaminada o en usuarios de
lentes de contacto2.
El diagnóstico de la infección puede realizarse
por la visión al microscopio óptico en el líquido de
limpieza de las lentillas de formas quísticas
compatibles con Acanthamoeba spp., por cultivo in
vitro en medio agar no nutritivo o agar con una baja
concentración de nutrientes en presencia de
The image belongs to a 35 year old woman with
pain in the left eye. Acanthamoeba spp. cyts can be
seen when we examine the contact lenses solution
(optical microscope 100x with methylene blue
staining). On a slide, a homogenous suspension is
made between contact lenses solution and methylene
blue. This method allows you to know the protozoa,
based on morphological characteristics. It can be
seen Acanthamoeba spp. cyst with a double cell wall.
The outside wall is called ectocisto, thin and wavy, and
inside one is called endocisto, rounded.
This parasite is found on air, land and tap water,
and it was identified as a pathogenic eye agent in the
70s. There are three groups based on cysts
morphological characteristics and size. The cyst size
is between 13-20 μm1.
This parasite exists in two forms: an active,
infective trophozoite and a dormant, environmentally
hardy cyst. The role of the cyst state is protection
against adverse environmental conditions, as lack of
food, temperature and pH’s changes. But when
conditions change, cysts are broken and the parasite
is released to the environment. Acanthamoeba spp.
can access in the eye by contaminated water or
wearing contact lenses2.
The infection is usually diagnosed seeing the
cysts in the contact lenses solution with an optical
microscope or in vitro culture with no nutritive agar
medium or low nutrients concentrations in the
presence of bacteria. Another option could be use of
the polymerase chain reaction (PCR)3.
.
VOLUMEN 4 QUERATITIS POR ACANTHAMOEBA SPP. EN PACIENTE USUARIO
DE LENTES DE CONTACTO 16
Laboratory Medicine at a glance
bacterias, y por la técnica de reacción de polimerasa
en cadena-RCP3.
Figura 2. Ciclo biológico de Acanthamoeba spp. Figure 2. Acanthamoeba’s life cycle.
En la paciente, el diagnóstico se retrasó debido
a que al principio se sospechaba de otro tipo de
infección. En la exploración física inicial se observó
úlcera corneal, celulitis y conjuntivitis. Se le pautó
tobramicina y amoxicilina-clavulánico. Al día siguiente,
se observó úlcera central de aspecto “dendritiforme”,
lesión sugerente de infección por virus herpes, por lo
que se le pautó tratamiento con aciclovir. Al mes
acudió a consulta por persistencia del dolor y ojo rojo.
En la exploración se observó edema corneal central
con “infiltrado en semiluna”, signo característico de
infección por amebas. Se cambió tratamiento a
ceftazidima, vancomicina y colirio de clorhexidina
0,02%. Por primera vez en todo el proceso se envió
una muestra al Laboratorio. Se analizó el líquido de
lavado de las lentes de contacto en el Laboratorio de
In this patient, the diagnosis was delayed
because another infection was suspected at the
beginning. Physical examination showed corneal
ulcer, cellulitis and conjunctivitis. Tobramycin and
amoxicilin-clavulanate was prescribed to the patient.
Next day, the examination showed “dendritic central
ulcer” what is associated with herpes simplex virus
infection, so acyclovir was prescribed. A month later,
she went to the hospital because she had red eye and
pain. In exploration was observed a central corneal
edema with “ring-like” infiltrate, typical sign of infection
by amoeba. So the treatment was changed to
ceftazidime and vancomycin eye drops and
chlorhexidine 0,02% eyewash. The first sample sent to
the Laboratory was the washing liquid of contact lens.
VOLUMEN 4 QUERATITIS POR ACANTHAMOEBA SPP. EN PACIENTE USUARIO
DE LENTES DE CONTACTO 17
Laboratory Medicine at a glance
Microbiología, observándose abundantes formas
quísticas de Acanthamoeba spp. que confirmaban el
diagnóstico. Se comenzó tratamiento con isetionato
de propamidina al 0,1%. La evolución no fue buena,
sufrió sobreinfecciones por hongos y bacterias, por lo
que, finalmente, se le realizó trasplante corneal, el
cual fue llevado a cabo con éxito.
Las bacterias son las principales responsables
de las infecciones derivadas del uso de lentes de
contacto. Un pequeño porcentaje de las queratitis que
producen el uso de lentillas se debe a infecciones por
hongos o protozoos4. Acanthamoeba spp. es una
familia de protozoos que en el ojo puede provocar
infección grave por queratitis con riesgo significativo
de pérdida de visión, resultado de las úlceras y
cicatrices que provocan en la córnea. La queratitis
amebiana se caracteriza por ser dolorosa e
invalidante. Los portadores de lentes de contacto son
una población con especial riesgo de padecerla, sobre
todo si se usan soluciones salinas caseras o agua
corriente para su lavado5.
Es una enfermedad difícil de diagnosticar
y tratar, ya que las manifestaciones clínicas se
confunden frecuentemente con las de queratitis
herpética, fúngica o micobacteriana. Antes de
disponer de tratamientos eficaces, la queratitis por
Acanthamoeba spp. en muchos casos derivaba en
extirpar el globo ocular. En la actualidad, esto es poco
frecuente6.
Como tratamiento de primera línea se utilizan
las diaminas y biguanidas, que son de los pocos
agentes químicos que tiene efecto sobre los quistes
de Acanthamoeba spp. Dentro de las diaminas
disponibles están el isetionato de propamidina y la
hexamidina, que afectan a la permeabilidad y
desnaturalizan enzimas y proteínas en el citoplasma.
Sin embargo, a diferencia de las biguanidas, el
Microbiology Laboratory reported cystics forms
in this sample, so Acanthamoeba spp. infection was
confirmed. Although patient was treated with
propamidine isethionate 0,1%, she had a negative
evolution, with several bacterial and fungal
superinfections. She was requested for a corneal
transplantation, with a successful result.
The bacteria are largely responsible for the
majority of contact lenses-related infections. A smaller
subset of contact lenses-related keratitis is because of
fungal or protozoal infections4. Acanthamoeba spp.
belong to a protozoal family that is a causative agent
of keratitis. Acanthamoeba keratitis is a severe eye
infection with a significant risk of vision loss due to
corneal ulceration and scarring. Wearing contact
lenses is a risk factor, especially if people use
homemade saline or tap water5.
Acanthamoeba keratitis is an invalidating and
painful disease. It’s important differential diagnosis
against herpetic, fungal or mycobacterial keratitis.
Before the appearance of optical treatments, it was
necessary the eye’s removal in some cases to resolve
the infection. Nowadays this practice is infrequent6.
Treatment is usually started with dual agents
such as diamidines (propamidine isethionate or
hexamidine, that affect the permeability and destroy
cytoplasmic enzymes and proteins) and biguanides,
because are chemical agents effectives to eliminate
Acanthamoeba spp. cysts. However, a long treatment
with diamidines could be toxic7.
When acanthamoeba keratitis is suspected or
patient has a negative evolution, it’s recommended to
order, as soon as possible, analyze the corneal
scraping or the washing liquid of contact lenses by
Microbiology Laboratory. Early diagnosis is very
important to avoid an unfavorably evolution.
VOLUMEN 4 QUERATITIS POR ACANTHAMOEBA SPP. EN PACIENTE USUARIO
DE LENTES DE CONTACTO 18
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tratamiento prolongado con diamidinas puede llegar a
ser tóxico7.
Ante la sospecha de queratitis por
Acanthamoeba spp. o ante una queratitis de evolución
tórpida, es conveniente solicitar lo antes posible el
análisis de muestras al laboratorio de Microbiología
Clínica, ya sea en muestras de raspado corneal o en
el líquido usado para la limpieza de lentillas. Como
hemos podido observar en el caso clínico descrito, un
retraso en el diagnóstico puede tener consecuencias
fatales para el paciente.
Bibliografía/References:
1. J. Castrillón, L. Orozco. Acanthamoeba spp. Como parásitos patógenos y oportunistas. Rev Chilena
Infectol. 2013; 30(2):147-155. http://www.scielo.cl/pdf/rci/v30n2/art05.pdf
2. D. Oddó. Infecciones por amebas de vida libre. Comentarios históricos, taxonomía y nomenclatura,
protozoología y cuadros anatomo-clínicos. Rev Chil Infect 2006; 23(3):200-214.
http://www.scielo.cl/pdf/rci/v23n3/art02.pdf
3. J. Pérez-Irezábal, I. Martínez, P. Isasa, J. Barrón. Queratitis por Acanthamoeba. Enferm Infecc Microbiol
Clin. 2006; 24: 46-52. http://www.elsevier.es/es-revista-enfermedades-infecciosas-microbiologia-clinica-
28-articulo-queratitis-por-acanthamoeba-13094278
4. N. Cheung, P. Nagra, K. Hammersmith. Emerging trends in contact lens-related infections. Curr Opin
Ophthalmol. 2016; 27:1-6.
5. R. Siddiqui, Y. Aqeel, N A. Khan. The use of dimethyl sulfoxide in contact lens disinfectants is a potential
preventative strategy against contracting Acanthamoeba keratitis. Contact lens and anterior eye. 2016;
article in press.
6. J.A. Abreu, J.J. Aguilar, F.J. Rodríguez, V.T. Díaz, R. González. A. Queratitis por acanthamoeba en
pacientes no portador de lentes de contacto. Arch. Soc. Canar. Oftal. 2003; 14:77-80.
http://sociedadcanariadeoftalmologia.com/wp-content/revista/revista-14/14sco13.pdf
7. F. Guisasola. Queratitis por Acanthamoeba. Análisis de casos en el Hospital Oftalmológico Santa Lucía
(2009-2010). Arch Oftal B Aires 2011; 82:25-29.
www.sao.org.ar/files/archivosoftalmologia/...82.../05queratitis_por_acanthamoeba.pdf
Laboratory Medicine at a glance Medicina de Laboratorio de un vistazo
VOL.4 ISSN 2444-8699
DIAGNOSTICO DE LOIASIS EN NIÑA CON EOSINOFILIA
DIAGNOSIS OF LOIASIS IN A GIRL WITH EOSINOPHILIA
Figura 1. Visión de la filaria en extensión del sedimento de sangre periférica teñida con May grünwald-Giemsa. Figure 1. Image of the filaria in peripheral blood sediment with May Grünwald-Giemsa quick stain.
Presentamos el caso clínico de una niña de 9 años de edad remitida a urgencias desde la consulta de su pediatra por molestias oculares. Como antecedentes familiares presenta que su madre fue diagnosticada de filariasis por Loa loa en su embarazo, aunque no refiere seguimiento posterior. El oftalmólogo de guardia no detecta ningún hallazgo patológico a nivel ocular.
Se solicita analítica al laboratorio de urgencias (bioquimica básica y hemograma). En el hemograma
We report a case of a 9-year-old girl referred to the emergency department from her primary care pediatrician for eye discomfort. Her mother was diagnosed of filariasis by Loa loa in her pregnancy, although she did not report follow-up. The ophthalmologist does not detect any pathological findings at ocular level.
Basic biochemistry and hemogram were required for emergency laboratory. Eosinophilia (1.18 x 103/µL) called attention to laboratory, and after
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LÍNEA EDITORIAL: NUEVA ETAPA, NUEVOS HORIZONTES
DIAGNOSTICO DE LOIASIS EN NIÑA CON EOSINOFILIA
CADENA DE CUSTODIA PARA EL PROCESAMIENTO DE ETANOL EN SUERO
Autores Badr Lakbakbi1 Amparo Alba Redondo1 Mª Jesús Castaño Arocas2
Centro 1Servicio de Análisis Clínicos. 2Servicio de Microbiología. Hospital Universitario y Politécnico La Fe
Fecha de publicación 29 diciembre 2016
Páginas Páginas 19-21
VOLUMEN 4
DIAGNOSTICO DE LOIASIS EN NIÑA CON EOSINOFILIA 20
Laboratory Medicine at a glance
se evidencia una eosinofilia (1.18 x 103/µL) que llama la atención al analista clínico de guardia, y tras revisión de la historia clínica y con los antecedentes maternos, decide realizar una búsqueda del parásito Loa loa. Realiza una visión del sedimento de sangre periférica al microscopio óptico y una extensión con May Grünwald-Giemsa rápida (recogida del fondo del tubo tras centrifugación), ofreciendo las imágenes y el video que se adjuntan. Se avisa al oftalmólogo de guardia con los resultados, que realiza exploración ocular en quirófano sin conseguir visualizarse el parásito. Se solicita estudio parasitológico y DNA en plasma que a los 2 días confirma la presencia de 2000 microfilarias/mL en suero y DNA por reacción en cadena de la polimerasa positivo para Loa loa.
Las filariasis son enfermedades causadas por gusanos redondos (nematodos), que pertenecen a la familia Filaroidea. La afectación de la conjuntiva ocular es característica de Loa loa. Se considera que la filariais por Loa loa es endémica de países del centro y oeste de Africa, y por tanto no suelen afectar, salvo casos importados, a la población de países desarrollados
El ciclo vital del parásito comienza por una picadura de la mosca tabánida del género Chrysops que introduce la larva en el huésped. Esta larva tarda 6-12 meses en poder producir microfilarias y se transforma en gusano adulto en 3 meses. Los gusanos se acantonan en el tejido celular subcutáneo, desde donde migran a distintas localizaciones durante el periodo diurno. Se ha descrito una alta prevalencia de loiasis en mujeres embarazadas de países de Africa Central.
Mucha gente infectada por filariais no presenta síntomas, aunque las manifestaciones más frecuentes son el ojo caliente y el edema de Calabar. El ojo caliente consiste en una inflamación de la
reviewing the medical history and maternal backgroun, decides to perform a search for the Loa loa parasite. He decided to performs a peripheral blood sediment view to optical microscopy and a quick stain with May Grünwald-Giemsa (collecting sample from the bottom of the tube after centrifugation), offering the images and video that are attached. We decided to notify the finding to the ophthalmologist, who performed ocular examination in the quirophan with sedation without being able to visualize the parasite. A parasitological study and DNA in plasma were requested and after 2 days, the presence of 2000 microfilariae/mL in serum and DNA by Loa loa positive polymerase chain reaction were reported.
Filariasis are diseases caused by nematodes, which belong to the Filaroidea family. The involvement of the ocular conjunctiva is characteristic of Loa loa. Loa loa filariasis is considered to be endemic in countries of central and western Africa, and they do not usually affect population of developed countries, except for imported cases.
Life cycle of the parasite begins with a sting of fly genus Chrysops that introduces the larva in the host. This larva takes 6-12 months to be able to produce microfilariae and turns into an adult in 3 months. The worms are confined in the subcutaneous cellular tissue, from where they migrate to different locations during the daytime period. A high prevalence of loiasis has been reported in pregnant women in Central African countries.
Many people infected by filariasis have no symptoms, although the most frequent manifestations are warm eye and the edema of Calabar. The warm eye consists of an inflammation of the ocular conjunctiva that can present edema and itching and it is caused by the passage of the worm through the
VOLUMEN 4
DIAGNOSTICO DE LOIASIS EN NIÑA CON EOSINOFILIA 21
Laboratory Medicine at a glance
conjuntiva ocular que puede presentar edema y picor y que está ocasionada por el paso del gusano a través de la conjuntiva. El edema de Calabar consiste en un edema del tejido celular subcutáneo por el paso del gusano o a sustancias secretadas por la microfilaria.
En el caso de nuestra paciente no se pudo encontrar el gusano en la conjuntiva porque probablemente ya había migrado, aunque por la eosinofilia y los antecedentes familiares se pensó en buscar el parásito Loa loa en sangre periférica. Se sospecha posible transmisión transplacentaria.
conjunctiva. Calabar edema consists of an edema of the subcutaneous cellular tissue by the passage of the worm or to substances secreted by the microfilariae.
In the case of our patient the worm could not be found in the conjunctiva because it probably had already migrated, although due to eosinophilia and family history we thought to look for the parasite Loa loa in peripheral blood. Transplacental transmission was suspected.
Figuras 2 y 3. Videos en los que se observa el gusano Loa loa con sus característicos movimientos en danza filaria. Figures 2 and 3. Videos of Loa loa warm with characteristic movements filaria dance.
Bibliografía/References: 1. Knopp S, Steinman M, Hatz C, Keiser J, Utzinger J. Nematode infections: filariases. Infect Dis Clin North
Am. 2012;26:359-81. 2. Mombo-Ngoma G, Mackanga JR, Basra A, Capan M, Manego RZ, Adegnika AA et al. Loa loa Infection
in Pregnant Women. Emerg Infect Dis. 2015;21(10):899-901. 3. Burgués-Ceballos A, Marcos MA, March GA, Juberías JR. Loiasis ocular en paciente con
hipereosinofilia crónica. Arch Soc Esp Oftalmol. 2014;89(10):411–413. 4. Cañavate C, Cuadros J, Martínez R, Martín P. El laboratorio de microbiología ante las enfermedades
parasitarias importadas. En: Cercenado E, Canton R eds. Procedimientos en Microbiología Clínica. Recomendaciones de la Sociedad Española de Enfermedades Infecciosas y Microbiología Clínica. Madrid : SEIMC; 2009.P.26-31.
VOLUMEN 4
DIAGNOSTICO DE LOIASIS EN NIÑA CON EOSINOFILIA 22
Laboratory Medicine at a glance
5. Enlace de interés: www.cdc.gov/parasites/loiasis/
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Medicina de Laboratorio de un vistazo
VOL.4 ISSN 2444-8699
CADENA DE CUSTODIA PARA EL PROCESAMIENTO DE
ETANOL EN SUERO
CUSTODY FOR THE MEASURING BLOOD ALCOHOL LEVELS
DICIEMBRE 2016. Volumen 4
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LÍNEA EDITORIAL:
NUEVA ETAPA, NUEVOS HORIZONTES
DIAGNOSTICO DE LOIASIS EN NIÑA CON EOSINOFILIA
CADENA DE CUSTODIA PARA EL PROCESAMIENTO DE ETANOL EN SUERO
Autores Daniel Párraga García
Jose Manuel Sánchez Zapardiel
Carmela Vargas Calleja
Centro Servicio de Análisis Clínicos.
Hospital Universitario Doce de
Octubre. Madrid
Fecha de publicación 29 diciembre 2016
Páginas Páginas 22-26
Figura: Mapa de procesos para la determinación de etanol en sangre con cadena de custodia. Figure: Map of processes for the measuring blood alcohol levels with chain of custody
VOLUMEN 4 CADENA DE CUSTODIA PARA EL PROCESAMIENTO DE ETANOL EN
SUERO 23
Laboratory Medicine at a glance
Las elevadas tasas de consumo de alcohol en
la sociedad actual son responsables de un gran
número de ingresos en las unidades de urgencias
tanto en atención especializada como en consultas
en atención primaria1. Este consumo de alcohol, lejos
de ser solo un importante problema médico para la
salud de los pacientes, puede tener implicaciones
jurídicas en ciertas situaciones.
Medir los niveles de alcoholemia en estos
casos debería de hacerse principalmente en dos
situaciones2:
Paciente con alteración de su nivel de
conciencia y causa incierta.
Accidentes de tráfico, traumatismos u otros
casos en los que tales muestras puedan ser
requeridas como medios de prueba en un
juicio.
La mayor parte de las unidades de urgencias
no tienen protocolos preestablecidos para el correcto
procesamiento de las muestras de etanol en sangre.
El presente trabajo muestra un ejemplo real de un
mapa de procesos (del H.U. Doce de Octubre) donde
se resumen los pasos a seguir para el correcto
análisis de una muestra de etanol de urgencia que
cumpla con los requisitos legales necesarios,
pudiendo dar un resultado legalmente válido que
sirviese como prueba en un juicio (Figura).
En el ejemplo expuesto, los servicios que
participan en el proceso son la Unidad de Politrauma
del Servicio de Medicina Intensiva y la Unidad de
Laboratorio de Urgencias del Servicio de Bioquímica.
El plan comienza con el ingreso de un paciente
donde se plantea realizar la determinación de etanol
en sangre.
The high rate of alcohol consumption in our
society is responsible for a large number of
emergency admissions in both specialized care and
primary care atention1. Alcohol consumption is not
only an important medical problem for patient heath,
but also may have legal implications in certain
situations.
Measuring blood alcohol levels should be
performed mainly in two situations2:
Patients with altered consciousness level of
unknown causes
Patients with injuries related to traffic accidents
or other causes with legal implications.
Most of the Emergency Units do not have pre-
established protocols for the correct determination of
ethanol in blood samples. This study shows an
example of the process map (Fig1) at HU 12 of
October for the correct analysis of ethanol in an
urgency blood sample that accomplish the necessary
legal requirements. This allows giving a legally valid
result that serves as an evidence in a trial.
This is a multidisciplinary work involving both
Polytrauma Unit (Intensive Care Department) and the
Emergency Laboratory Unit (Biochemistry
Department).
The process map starts with the patient
admission, when ethanol determination in blood
samples is proposed. The next steps are detailed
below:
1. Clinicians must consider urgent analysis of
blood alcohol levels in patients who show a
decreased awareness of uncertain
meaning or injuries with possible
prosecution. Once the decision has been
made the petition must be electronically
VOLUMEN 4 CADENA DE CUSTODIA PARA EL PROCESAMIENTO DE ETANOL EN
SUERO 24
Laboratory Medicine at a glance
A continuación suceden los siguientes pasos:
1. El facultativo debe plantearse la determinación
urgente de etanol si considera que el paciente
puede presentar disminución de conciencia de
significado incierto, accidentes de tráfico o
traumatismos con posible judicialización. Una
vez tomada la decisión debe realizar la
petición electrónica de forma que sus datos
queden registrados en el sistema informático.
2. Enfermería realiza la extracción de la muestra
de sangre. El personal encargado de la
extracción debe estar formado para la correcta
toma de muestra, lo cual implica no usar
ningún derivado de alcohol para limpiar la
zona del cuerpo donde se va a realizar la
extracción, así como mezclar la sangre en
tubos de extracción heparnizados durante un
minuto. Antes de enviar la muestra al
laboratorio debe indentificarla correctamente
con un código de barras y resgistrarla en el
sistema informático, quedando constancia del
responsable de la extracción y la hora en el
mismo., Esto último es muy importante ya que
el etanol se va metabolizando en sangre
periférica, de forma que un retraso en la
recogida de la muestra así como su posterior
análisis podría falsear los resultados2.
3. Llamada telefónica facultativa de la unidad de
politraumatizados a la unidad de laboratorio de
urgencias donde se informa al facultativo del
servicio de bioquímica que se va a enviar una
muestra de suero/plasma para el análisis de
etanol.
4. Recepción de la muestra por parte del
laboratorio de urgencias. El técnico
especialista de laboratorio (T.E.L.) debe
asegurarse que vienen en un sobre precintado
request, so data are recorded in the
computer system.
2. Nurses perform the extraction of the blood
sample. They must follow some
instructions, including not using any alcohol
derivative to clean the extraction area, as
well as mixing the heparinized tubes during
one minute. Before sending the blood
sample to the laboratory, they must
correctly identify it with a barcode and
register it in the computer system, so the
responsible person and time of the
extraction are recorded. Time of the
extraction is very important as ethanol is
metabolized in peripheral blood. A delay in
both the collection of the sample and its
subsequent analysis could alter the
results2.
3. Telephone call from Polytrauma Unit to the
Emergency Laboratory Unit informs the
biochemist specialist that a serum/plasma
sample has being sent for ethanol level
analysis.
4. Laboratory technicians receive the samples
and must ensure that they come in a
sealed envelope and will be delivered to
the biochemist specialist. Every person
involved must fill a form with the following
data: name, identification number, time of
receipt and delivery of the sample and
signature.
5. Blood samples are processed after
validation of the corresponding internal
quality controls by the biochemist
specialist.
6. The biochemist specialist validates the
VOLUMEN 4 CADENA DE CUSTODIA PARA EL PROCESAMIENTO DE ETANOL EN
SUERO 25
Laboratory Medicine at a glance
y se lo entregará al facultativo de bioquímica
que se encuentre en el momento en el
laboratorio. Se toman los datos de ambos
implicados (nombre, número de identificación,
hora de recepción y entrega de la muestra y
firma).
5. Se procesa la muestra de etanol tras la
validación de los correspondientes controles
internos de calidad. Estos controles deberán
ser validados por el personal facultativo.
6. Finalmente el facultativo valida la prueba en el
sistema informático del laboratorio (S.I.L.). El
informe final se emite en formato digital.
7. Una vez procesada se guardará en una
nevera automatizada donde se garantiza la
custodia de la misma durante 5 días.
Igualmente se recogen los datos del
encargado del análisis de la muestra y de la
persona que guarda la muestra en la nevera.
* Tras este periodo si ningún organismo
debidamente autorizado ha reclamado la muestra
esta se desechará automáticamente por la nevera
robotizada, finalizando la cadena de custodia.
8. Queda registrado en el S.I.L. (Sistema
Informático de Laboratorio) el resultado de la
muestra, la hora de entrada de la muestra al
analizador, la hora de la validación facultativa
y la hora de entrada de la muestra en la
nevera. SI alguien sacase la muestra de la
nevera automatizada esto también quedaría
registrado.
9. Existe un apartado de incidencias donde se
describirá cualquier circunstancia no recogida
en el protocolo, el cual deberá de ir firmado
por el facultativo responsable.
result in the laboratory informatic system
(LIS). The final report is issued in digital
format.
7. After processing the samples, they are
stored in an automated refrigerator, where
custody of the samples is guaranteed for 5
days. Likewise the data of the person who
performed the analysis and the person who
stored the sample in the refrigerator are
collected.
* After this period, if no duly authorized person
claim the blood sample, it will be automatically
discarded by the robotized refrigerator, ending the
chain of custody.
8. Both the result of the sample and the time
when the sample enters the analyzer, is
validated and is stored in the refrigerator
are recorded in the LIS. If someone
removed the sample from the automated
refrigerator, it would be also recorded.
9. Any incidences not described in the
process map must be recorded in the
correspondent section of the form and
signed by the responsible specialist.
10. After filling out the liability form, it is
scanned.
Currently, a project is being developed to
integrate the form in the LIS.
This process map summarizes how to proceed
so the result of ethanol blood levels meets the legal
requirements to be used as evidence in a trial, unlike
other determinations that are exclusive for clinical
use.
VOLUMEN 4 CADENA DE CUSTODIA PARA EL PROCESAMIENTO DE ETANOL EN
SUERO 26
Laboratory Medicine at a glance
10. Una vez completado el formulario de
responsabilidad, este se digitaliza.
Actualmente se está desarrollando un proyecto
para integrar la forma de cumplimentar el formulario
a través del S.I.L.
Este mapa de procesos recoge de forma
resumida la forma de proceder para que el resultado
de la determinación de etanol en sangre cumpla los
requisitos legales para poder usarse como prueba en
un juicio, a diferencia de otras determinaciones cuya
validez sería exclusiva para uso clínico.
Bibliografía/References:
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