MARKERDEFINITION & ANWENDUNGSMÖGLICHKEITEN

Einteilung nach Ausgangsmaterial1. Genomische DNA – nach Restriktionsverdau2. RNA – nach Umschreiben in cDNA

Einteilung nach der verwendeten Technik

1. Einsatz von Sonden2. Screen-Prinzip (in Verbindung mit selektiver PCR)

MARKER-Typen

1. PHÄNOTYP: meist unbekannte Art von

Unterschied

2. RFLP: restriction fragment length

polymorphism

3. AFLP: amplified fragment length

polymorphism

4. SSLP: simple sequence length polymorphism

5. SSR: simple sequence repeat (Mikrosatellit)

6. SNP: single nucleotide polymorphism

7. CAPS: cleaved amplified polymorphic

sequences

8. RAPD: random amplified polymorphic DNA

2. RFLP

Unterschied im Restriktionsmuster der Genome zweier Individuen

Gelanalyse

Diese unterschiedlichen Fragmente können wegen der Vielzahlder Restriktionsfragmente aber nicht „gesehen“ werden.

Zusätzliche Restriktionsschnittstelle

Mit einer Hybridisierungssonde kann man Mutationen nachweisen

Restriktionsfragment-Längenpolymorphismus

2. RFLP

2. RFLPSONDE

Sonde = DNA-Fragment aus einem Bereich des Genoms der den Polymorphismus überdeckt oder an diesen angrenzt

Autoradiogramm

2. RFLPERSTELLUNG

1. Klonierung eines beliebigen (genomischen) Fragments = Sonde

2. Restriktionsverdau genomischer DNA der beiden Individuen mit einem identischen Satz von Restriktionsenzymen

3. Gelelektrophorese und Blotten der verdauten DNAs

4. Hybridisierung des Blots mit der radioaktiv markierten Sonde

5. Autoradiographie und Identifizierung eines Restriktionsverdaus, der einen Poly-morphismus zeigt

3. AFLPamplified fragment length polymorphism

Grundsätzlich: Unterschied im Restriktionsmuster der

Genome zweier Individuen werden ausgenutzt

IM GEGENSATZ ZUM RFLP1. werden Restriktionsenzyme eingesetzt, die

neben 6 auch nur 4 bp erkennen, d.h. die durchschnittliche Fragmentlänge sinkt von ca. 4000 auf etwa 250 bp. Statt Agarosegelen werden Polyacrylamidgele Elektrophorese eingesetzt.

2. wird statt der „Sonden-Technik“ das „Display“-Prinzip verwendet, d.h. statt aller möglichen Restriktionsfragmente (16x mehr als beim RFLP) wird durch ein entsprechendes Verfahren nur eine Teilmenge der Fragmente erzeugt, deren Zahl sich bei der Gelelektrophorese gerade noch auftrennen lässt. Aus diesem Grund wird keine Sonde benötigt.

Display-Verfahren, auf DNA und RNA anwendbar

3. AFLP

3. AFLP „SPEZIFISCHE PCR“

PCR Primer 1 <——— AC GACGT GATT..

....TGTC TAA NNNNN.....NNNNN CTGCA CTAA.. ..ACAG ATT NNNNN.....NNNNN GACGT GATT..

TGTC TAA TC ———> PCR Primer 2

[MseI] [PstI]

3. AFLP „SPEZIFISCHE PCR“

Über- Anteil Genom Pflanzehang ampl. 106 bp

1 1/4 2 Bakterien 2 1/16 8 Bakterien 3 1/64 32 Hefe 4 1/256 128 Arabidopsis 5 1/1024 512 Reis 6 1/4096 2048 Zuckerrübe 7 1/16384 8192 Gerste 8 1/65536 32768 Weizen

4. SSLP simple sequence length polymorphism

- PCR-gestützte Markertechnik (display-Technik)

- Zu untersuchende Bereich wird mit sequenz-spezifischen primern

überdeckt und mittels PCR amplifiziert

- Die enstehenden Fragmente werden mit Agarose-Gel-Elektrophorese

in Gegenwart von Ethidiumbromid nach Größe aufgetrennt und

verglichen.

4. SSLP

Insertion

Autoradiogramm

Primer I

Primer I

Primer II

Primer II

(Analog Deletion)

5. SSRsimple sequence length polymorphism

Unterschiedliche Zahl von Wiederholungen einfacher Di- und Trinukeotidsequenzen

(TG)10

(TG)12

ENTSTEHUNG„Stottern“ der Polymerase bei der Replikation

VORTEILSchnelle Veränderung der Anzahl von Wiederholungen solcher Sequenzen in evolutionär kurzen Zeiträumen, d.h. auch Nutzpflanzenvarietäten zeigen noch Polymorphie

5. SSRIDENTIFIZIERUNG

1. Anlegen einer Bibliothek kurzer genomischer

Fragmente in E. coli Plasmiden

2. Übertragen der Kolonien auf

Nylonmembranen

3. Hybridisieren mit SSR-Oligonukleotiden,

wobei selbstkomplementäre Sequenzen

([CG]n und [AT]n) ausgeschlossen sind

4. Sequenzieren positiver Klone

5. Design und Synthese von PCR-Primern

6. Überprüfen, ob Polymorphie des

amplifizierten Fragmentes für die

interssierenden Varietäten vorliegt

6. SNPsingle nucleotide polymorphism

Unterschied in einem einzigen Basenpaar

A C

VORTEIL

SNPs sind häufig auch zwischen nahe verwandten

Individuen (im Humangenom ca. 0,1% aller

Basenpaare)

6. SNP

Fluorescence resonance energy trasfer (FRET)Temperaturabhängigkeit

6. SNP

Fluorescence resonance energy trasfer (FRET)Temperaturabhängigkeit

A B

C

7. CAPSCleaved amplified polymorphic sequences

AC

neue Schnittstelle

primerGenom 1Genom 2

1. PCR-Amplifizierung2. Restriktionsverdau3. Gelelektrophorese

Genom 2 Genom 1

Gelektrophorese

8. RAPDrandom amplified polymorphic DNA

Unterschiede bei der Bindung von Oligonukleotiden willkürlicher Sequenz und der daraus resultierenden unterschiedlichen Amplifizierbarkeit kurzer genomischer Fragmente

GenomIndividuum 1 GenomIndividuum 2

Gelanalyse

2. Diagnostik und Pflanzenschutz- Viroide

- Viren

- Bakterien

- Pilze

Molekulare Diagnostik und Pflanzenschutz1. Nachweis der Pathogenfreiheit für kommerzielle Zwecke

2. Absicherung der Pathogenfreiheit im Ausgangsmaterial

für Züchtungszwecke

3. Allgemeine phytosanitäre Überwachung

Ökonomische Aspekte der Methodenwahl1. Zeitaufwand, besonders Lohnkosten

2. Automatisierbarkeit

3. Materialkosten

1. Viroide

Ein Viroid ist ein infektiöses Molekül, das aus einer einzelsträngigen,

zirkulären (nur 150–400 Nukleotide) RNA besteht.

Dem Viroid fehlt vor allem die Proteinhülle eines normalen Virus. Viroide

kommen in der Natur als Krankheitserreger von Pflanzen vor

(Pflanzenpathogen).

Im Gegensatz zu Viren tragen Viroide keine Gene. Sie codieren also keine

Proteine, weshalb Viroide bei ihrer Replikation und ihrem Transport

ausschließlich auf Enzyme der Wirtspflanzen angewiesen sind. Der

Infektionsmechanismus der Viroide ist bisher unklar. Allerdings wurden

Nukleotidsequenzen in der Wirtspflanzen-DNA gefunden, die komplementär

zu den Sequenzen der Viroide sind. Hierbei wäre also denkbar, dass das

Viroid selbst als primärer Pathogenitäts-Effektor wirkt. Alternativ wird

diskutiert, dass Viroide ihre Pathogenität durch "RNA silencing" erlangen.

1. ViroideDie meisten Viroide tauchen in Kulturpflanzungen auf bzw. sind dort am

meisten verbreitet. Ein gutes Beispiel ist das

Kartoffelspindelknollen-Viroid (Abk. PSTVd),

welches Kartoffeln, Tomaten und viele andere Pflanzenarten befällt und großen wirtschaftlichen Schaden anrichtet.

1. Viroide

Molekulare Nachweismöglichkeit:

- Bereits 1981 wurde Viroid-RNA (als cDNA) in einem Vektor kloniert

und nach radioaktiver Markierung als Hybridisierungssonde verwendet.

- Ursprünglich hat die Notwendigkeit der radioaktiven Markierung

die Anwendung in breitem Massstab verhindert.

- Heute ist nicht-radiokative Markierung kein Problem mehr, der finan-

zielle Aufwand hat solche und ähnliche Methoden bisher jedoch

nicht zum Einsatz kommen lassen.

1. Viroide

Praktische Nachweismöglichkeit: bidirektionale Elektrophorese

nativ denat.

Largely internally base-paired viroid RNA

1. Viroide

Bidirektionale Gelektrophorese mit nachfolgender Silberfärbung

hat dieselbe Empfindlichkeit wie Hybridisierungstechniken

(5 ng/ g Frischgewicht),

ist jedoch wesentlich billiger.

Außerdem braucht man nicht jedesmal eine neue Sonde, wenn

Ein anderes Viroid zu bestimmen ist.

2. Viren

Hybridisierungstechniken sind möglich, auch PCR-gestützte

Methoden sind beschrieben und werden in der Forschung

verwendet. In den Großtests jedoch sind diese Methoden zu teuer.

Ein Testverfahren, dass von den Hüllproteinen der Viren Gebrauch

macht, wird hingegen wegen der geringen Kosten im Routinetest

eingesetzt.

2. Viren

Enthalten Hüllproteine, gegen die Antikörper erzeugt werdenkönnen.

2. Viren

Trübungsmessung,automatisierbar

Polyklonale Antikörper

3. BakterienSaprophytische Bakterien überdecken meist pathogene Bakterien.

Im Routinetest kann man nicht axenisch arbeiten.

3. Bakterien

Bindung der Bakterienmittels Antikörper anMagnetpartikel.

3. Bakterien

Entfernung derTargets mit einemMagneten.

Kultivierung derisolierten Bakterien.

Klassischer Nachweis.

3. Bakterien

4. Pilze

Anwendungsbeispiel:Schwarzfusskrankheit bei Cruciferen (Kreuzblütengewächse)z. B. Raps und KohlInfektion durch den Pilz Leptospaeria MaculansUnterscheidung aggressiv/ nichtaggressiv

Resitent Empfänglich

4. Pilze

Besonders erfolgreich in letzter Zeit hat sich der Einsatz von

Antikörpern gegen Komponenten der Zellwand aus Mycel und

Sporen entwickelt.

Je nach Spezifität kann man auf diese Weise gattungs- oder

artspezifische Nachweise führen.

Zunehmend gewinnen aber PCR-gestützte Methoden zum

Pilznachweis an Bedeutung.

4. Pilze

RAPD